Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические и равновесные параметры взаимодействия лигандов с клеточными рецепторами в условиях неравновесного и кооперативного связывания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гуревич, Константин Георгиевич, Москва

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ

На правах рукописи

ГУРЕВИЧ Константин Георгиевич

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РАВНОВЕСНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ С КЛЕТОЧНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В УСЛОВИЯХ НЕРАВНОВЕСНОГО И КООПЕРАТИВНОГО СВЯЗЫВАНИЯ

03.00.04-Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1999

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии Научного центра психического здоровья РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор A.A.Зозуля

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор С.Д.Варфоломеев Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В.Поройков доктор химических наук, профессор Е.С.Чухрай

Ведущая организация: Институт биохимии РАМ им.А.Н.Баха

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БАС — боковой амиотрофический склероз кл — клетка (клеток)

ЛРВ — лиганд-рецепторное взаимодействие

ОР — опиоидные рецепторы

СКО — среднеквадратичное отклонение

РРМ — радиорецепторный метод

ФРН — фактор роста нервов

DAGO- [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5]-энкефалин DADLE - [D-Ala2,D-Leu5]-энкефалин GTP - гуанозинтрифосфат ■

Содержание

Введение 7

Глава 1. Основные модели лиганд-рецепторного взаимодействия. Дискриминация моделей рецепторного связывания 11

1.1.Основные модели лиганд-рецепторного

взаимодействия 12

1.1.1.Простейшая модель лиганд-рецепторного взаимодействия 12

1.1.2.Взаимодействие одного лиганда с несколькими типами мест связывания 13

1.1.3.Взаимодействие нескольких лигандов с одним

типом рецепторов 15

1.1.4.Кооперативное лиганд-рецепторное взаимодействие 19

1.1.5.Более сложные модели лиганд-рецепторного взаимодействия 2 0

1.1.6.Диффузия лиганда. Модель биофазы 21

1.2.Графические методы определения концентрации рецепторов и их аффинности 22

1.2.1.Анализ результатов кинетических экспериментов 22

1.2.2.Распределение ошибок по связыванию и диссоциации 23

1.2.3.Разграничение процессов рецепции, транспорта

и деградации лигандов 2 5

1.2.4.Применение методов преобразования координат для анализа результатов кинетических

экспериментов 29

1.2.5.Анализ результатов экспериментов по связыванию

в равновесных условиях 3 0

1.2.б.Определение аффинности рецепторов 34

1.3.Применение методов оптимизации для определения параметров связывания и дискриминации моделей

лиганд-рецепторного взаимодействия 35

Рисунки и таблицы к главе 1 40

Глава 2. Определение условий применения методов оптимизации для определения концентрации рецепторов и их аффинности 49

2.1.Описание кинетики лиганд-рецепторного взаимодействия вероятностными методами 50

2.1.1.Простейшая схема лиганд-рецепторного взаимодействия 50

2.1.2.Процесс диссоциации лиганд-рецепторных комплексов 54

2.1.3.Взаимодействие двух типов лигандов с одним рецептором 55

2.1.4.Кооперативное лиганд-рецепторное взаимодействие 56

2.1.5.Изменение концентрации рецепторов за счет процессов интернализации, деградации рецепторов, синтеза рецепторов de novo и включения вновь синтезированных рецепторов в ци-топлазматическую мембрану 57

2.2.Обсуждение вероятностного подхода к описанию

лиганд-рецепторного взаимодействия 58

Рисунки к главе 2 63

Глава 3. Анализ взаимодействия фактора роста нервов

с тромбоцитами человека 67

3.1.Фактор роста нервов и его рецепторы 67

3.2.Краткая характеристика экспериментальных данных, использованных для оптимизации параметров

модели 7 0

3.3.Применение математического моделирования для анализа взаимодействия фактора роста нервов

с тромбоцитами человека 71

Рисунки и таблица к главе 3 77

Глава 4. Анализ взаимодействия мет-энкефалина с

лимфоцитами человека 83

4.1.Опиоидные рецепторы 83

4.1.1.Гетерогенность опиоидных рецепторов и их классификация 83

4.1.2.Биохимические свойства и структура

опиоидных рецепторов 85

4.1.3.Опиоидные рецепторы иммуннокомпетентных

клеток 87

4.2.Краткая характеристика экспериментальных данных, использованных для оптимизации параметров

модели 89

4.3.Применение математического моделирования для анализа взаимодействия мет-энкефалина с лимфоцитами человека 91

4.3.1.Дискриминация числа мест связывания 91

4.3.2.Дискриминация между моделями кооперативного и некооперативного связывания мет-энкефалина 92

4.3.3.Определение параметров связывания мет-энкефалина

лимфоцитами человека 93

4.3.4.Сравнение данных,, полученных на целых клетках

и на лимфоцитарных мембранах 95

Рисунки и таблицы к главе 4 99

Глава 5. Применение программы РЕЦЕПТОР для анализа

других рецепторных систем 110

Рисунок и таблица к главе 5 113

Заключение 116

Выводы 123

Список использованной литературы 124

Приложение 150

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Исследования последних лет показали, что изменение концентрации рецепторов и их аффинности существенно для патогенеза многих хронических заболеваний (Сергеев и соавт., 199 6). Поэтому изучение свойств рецепторов , в первую очередь концентрации и аффинности, является насущной клинической и биологической проблемой. Знание свойств рецепторов во многих случаях позволяет точнее понимать этиологию и патогенез ряда заболеваний и патологических состояний, оптимизировать их лечение и профилактику.

Показано, что концентрация рецепторов и их сродство к лигандам определяют лекарственную толерантность и гиперчувствительность (Creese, 1978; Сергеев, Шимановский, 1987). Доказано, что свойства рецепторов являются существенным фактором, определяющим биологический ответ клетки (Кантор, Шиммел, 1984).

Однако концентрация рецепторов и их аффинность не являются постоянными величинами. С течением времени in vivo и in vitro могут происходить процессы интернализации, десин-тетизации рецепторов, синтеза рецепторов de novo и включения вновь синтезированных рецепторов в цитоплазматическую мембрану клетки (Альберте и соавт., 1994). Аффинность рецепторов может изменяться за счет процессов ингибирования и реингибирования (Rabizadeh et al., 1993). Поэтому в эксперименте и в клинике часто возникает необходимость систематического изучения концентрации и свойств рецепторов.

Одним из способов, позволяющим систематически определять концентрацию рецепторов и их аффинность, является ра-диорецепторный метод (РРМ). Из-за простоты реализации этот способ нашел широкое применение как в эксперименте, так и в

клинике (Чард, 1981; Зайцев и соавт., 1985). В настоящее время разработаны методы анализа результатов радиорецептор-ных исследований при условии равновесного некооперативного лиганд-рецепторного взаимодействия (JIPB) и лишь для таких лиганд-рецепторных систем, как: "один лиганд—один рецептор", "один лиганд—два рецептора", "два лиганда—один рецептор" (Варфоломеев и соавт., 1985; Зайцев и соавт. 1993).

Наибольшие сложности наблюдаются при интерпретации результатов исследований с учетом наличия процессов ферментативного разрушения, транспорта лигандов или их фрагментов, а также при невозможности достигнуть равновесных условий. Кроме того, целый ряд рецепторов, например, опиоидных, является гетерогенной популяцией (Pasternak, Snyder, 1975; Minami, Satoh, 1995), что осложняет интерпретацию результатов радиорецепторных исследований. Интерпретация результатов радиорецепторных исследований также затруднена при изучении эффектов действия малых и сверхмалых доз биологически активных веществ (Сазанов, Зайцев, 1992). Таким образом, многие из разработанных ранее способов интерпретации полученных с помощью РРМ результатов оказываются неприменимыми для ряда реальных рецепторных систем.

Поэтому целью настоящей работы была разработка и применение метода определения концентрации рецепторов и их аффинности при кооперативном и (или) неравновесном характере ЛРВ.

Для достижения заданных целей в процессе исследования последовательно решались следующие задачи:

1.Разработка метода определения концентрации рецепторов и их аффинности при наличии кооперативного ЛРВ или при отсутствии равновесия в системе "лиганд-рецептор".

2.Нахождение условий применения разработанного метода определения концентрации рецепторов и их аффинности.

3.Применение разработанного метода для анализа взаимодействия фактора роста нервов с тромбоцитами периферической крови человека и мет-энкефалина с лимфоцитами периферической крови человека.

4.Исследование возможности применения метода для анализа других рецепторных систем.

Научная новизна. Предложен метод определения концентрации и аффинности рецепторов по результатам радиорецеп-торных исследований при отсутствии равновесия в системе ли-ганд-рецептор и кооперативного связывания. Для решения данной задачи были использованы методы оптимизации. Показано, что для нелинейных систем, описывающих ЛРВ, наилучшим методом оптимизации является метод сопряженных градиентов. Разработаны критерии выбора стохастической или детерминистической модели ЛРВ. Предложены методы описания кинетики ЛРВ при действии малых и сверхмалых доз биологически активных веществ.

Практическая значимость результатов работы. Наиболее существенным результатом работы, имеющим практическое значение для специалистов, занимающихся рецепторными исследованиями, является разработка и автоматизация метода, который позволяет определять концентрацию и аффинность клеточных рецепторов при кооперативном связывании, гетерогенности мест связывания или отсутствии равновесия в системе "лиганд-рецептор". Определены условия применения разработанного метода. Данный метод может также применяться для определения параметров связывания в таких системах, как "фермент-субстрат", "антиген-антитело", "белок-переносчик— гормон" и т.д. Кроме того, в работе предложены кинетические методы описания взаимодействия единичных молекул рецептора с единичными молекулами лиганда, которые наблюдаются при действии малых и сверхмалых доз биологически активных ве-

ществ на биологические объекты.

Внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований внедрены в работу Научного центра психического здоровья РАМН, МГУ им. М.В.Ломоносова, Российского государственного медицинского университета, Московского медицинского стоматологического университета.

Апробация диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на Symposium on AIDS, drugs of abuse and neuroim-mune Axis, San Diego (California), 1995, международной конференции "Ломоносов-9911 (Москва), совместных семинарах кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В. Ломоносова и отдела биокинетики Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского; на' семинарах, кафедры медицинской и биологической кибернетики Российского Государственного Медицинского Университета, межлабораторной конференции Научного центра психического здоровья РАМН, Российского государственного медицинского университета и МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и подано в печать 8 работ, из них 1 книга.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и пяти глав, каждая из которых содержит краткий обзор аспектов рассматриваемой проблемы, результаты собственных исследований и их обсуждение. Завершают диссертацию заключение, выводы и список литературы, включающий 7 8 отечественных и 142 иностранный источник. Диссертация выполнена на 152 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками и б таблицами.

Глава 1. Основные модели лиганд-рецепторного взаимодействия. Дискриминация моделей рецепторного связывания

Все математические модели лиганд-рецепторного взаимодействия можно разделить на детерминистические (детерминисткие) и стохастические (вероятностные). Первый тип моделей применим в тех случаях, когда разброс между опытами, проводимыми в параллелях не велик и поведение системы «лиганд—рецептор» определяется средними значениями. При помощи детерминистических моделей описывают воспроизводимые эксперименты, т.е. те эксперименты, в которых при одинаковых условиях проведения наблюдается один и тот же результат с точностью до погрешности измерения, наблюдения, вычисления и т.д.

Применение стохастических моделей (гл. 2) более оправдано в случаях, когда поведение системы не определяется поведением средних значений, т.е. является непредсказуемым по отношению к средним величинам . Стохастические модели также применимы для описания невоспроизводимых эффектов ЛРВ, когда, при одних и тех же условиях проведения эксперимента независимо от каких-либо внешних воздействий эффекты могут наблюдаться или не наблюдаться. Кроме того, стохастические модели применимы для описания ЛРВ при относительно малом времени взаимодействия лиганда с рецептором.

Как будет показано ниже, детерминистические и стохастические модели ЛРВ позволяют получить сходные уравнения для математического ожидания количеств связанного с рецептором лиганда. Однако помимо математического ожидания, стохастические модели позволяют априорно оценить дисперсию количества связанного лиганда (гл.2).

1.1. Основные модели лиганд-рецепторного взаимодействия

1.1.1. Простейшая модель лиганд-рецепторного взаимодействия . Для того, чтобы вывести уравнение рецепторного связывания, ЛРВ описывают при помощи схем. Простейшую схему можно записать следующим образом (Варфоломеев, Зайцев, Мевх, 1985) :

Ку

Ь+КоЕЬ, (1.1)

где Ь- лиганд, Я- рецептор, КЬ- лиганд-рецепторный комплекс, к+1,к_х- константы скоростей образования и распада лиганд-рецепторных комплексов (ассоциации и диссоциации, прямой и обратной реакции).

Запишем закон действующих масс для схемы (1.1), учитывая, что [/?] = - [/?£] ([/?£>]- начальная концентрация рецепторов) :

4Ж1

ул = кшц - *-№] = Кх\т\ц - {кт+• (1 • 2)

Заметим, что уравнение (1.2) называют еще уравнением Ленгмюра. В условиях избытка начальной концентрации лиганда по отношению к начальной концентрации рецепторов решение уравнения (1.2) легко получить с помощью преобразований Ла-пласса (Бронштейн, Семендяев, 1986):

\т = а - ехркомх]+к,)]) , (1.з)

где Ш = к_х / к+1 - константа диссоциации лиганд-рецепторного комплекса.

Если равновесие рецепторного связывания достигнуто, то уравнение (1.3) записывается следующим образом:

гКП_ШШ п ,м

При концентрации лиганда много меньшей концентрации рецепторов решение уравнения (1.2) также может быть получено с помощью преобразований Лапласа:

[RL] = (1 - exp [~t(k+l[Ro] + к,)]) .

Очевидно, что этот случай с точностью до обозначений совпадает со случаем избытка начальной концентрации лиганда по отношению к концентрации рецепторов.

При концентрации лиганда, соизмеримой с концентрацией рецепторов, уравнение (1.2) является нелинейным дифференциальным уравнением. Его решение может быть получено с помощью поиска корней правой части. После того как корни правой части найдены, уравнение (1.2) легко преобразуется в уравнение с разделяющимися переменными. Подобный метод решения был впервые описан ранее (Гуревич, 1997). Однако для более сложных моделей JIPB данный метод не применим. Поэтому в дальнейшем мы будем предполагать наличие избытка концентрации лиганда по отношению к концентрации рецепторов.

Предположение об избытке концентрации лиганда по отношению к концентрации рецепторов является вполне оправданным с биохимической и физиологической точки зрения. Действительно, в большинстве опытов, проводимых in vitro, стараются соблюдать условия [Lo]»[i?o], так как при этом облегчается интерпретация результатов экспериментов (Чард, 1981; Варфоломеев, Зайцев, 1982). Кроме того, данное условие выполняется для большинства нейромедиаторных систем при их нормальном функционировании (Ашмарин, 1997).

1.1.2. Взаимодействие одного лиганда с. несколькими типами мест связывания. Как мы уже отмечали ранее, схема (1.1) описывает простейший случай ЛРВ. Более сложным является взаимодействие лиганда с п типами независимых мест связыва-

ния (1 номер типа мест связывания):

_

ДДХ,/= . (1.1')

Закон действующих масс для схемы (1.1') записывается

так:

¿[Ж;] , , _

При избытке начальной концентрации лиганда по отношению к начальной концентрации рецепторов схема (1.1') описывается п уравнениями типа уравнения (1.3):

ЩЦ = щ^щ(1 - ехр[-Г(*+1ДХ] + к_ь)]),Щ = кук^ =

Суммарное количество связанного лиганда йаходится по формуле:

1=1

Наиболее интересный случай взаимодействия лиганда с п местами связывания наблюдается при наличии неспецифического связывания. Обычно неспецифическое взаимодействие определяется процессами взаимодействия лиганда с мембранами клеток, деградации (ферментативного разрушения) лиганда, внутриклеточного транспорта лиганда и его фрагментов и т.д. Для неспецифического связывания характерно наличие большого числа мест связывания с малым сродством. Поэтому Кс.1№СП»[£] , где Кётсп- равновесная константа неспецифического связывания. Тогда при наличии неспецифического связывания суммарная концентрация связанного лиганда в условиях равновесия находится по формуле:

гдап .уШ.М

Величину [Ко> ] / КИ^ принято называть константой не-

спе