Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Математические модели связывания и рецептор-опосредованного эндоцитоза факторов роста

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Математические модели связывания и рецептор-опосредованного эндоцитоза факторов роста"

Р Г Б ОД

1 О Г."П Г'-. .

РОССИЙСКАЯ АКЛ'ДШИЯ 11АУК . ' ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им.акад! Н.Н.Семенова

% ■ ■ ' На правах рукописи

Г.

Людмила Робертовна БОРИСОВА

МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ СВЯЗЫВА1ШЯ И РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВА1ПЮГО ЭИДОЦИТОЗА ФАКТОРОВ РОСТА

03.00.03 -биофизика

ЛВТ-ОРЕФЕРАТ диссертации но соискание ученой степени кандидата Физико-математических наук

МОСКВА.- 1ЭЭ4

Рябого виполнена в Отделе кинетики химических к биологических процессов Института химкчиской Фиуики им,акал. II.II.Семенова РЛН.

Паучннй руководитель: ,

доктор физико-математичо оких ныу к, член-корреспондент Академии -Естественных Наук . В.Л.КУЗНЕЦОВ

I

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Горбачева Л.Б.

доктор физико-математических наук Романюха Л.Л.

Ведущая организация: Московский Физико-технический институт.

. Защита состоится "^7" -Т ■ г' в часов на ' ' заседании специализированного совета Д. 003.20.07 в Институте'. химической физики РЛН по адресу: Москва, ул.Косыгина, 4.. ■;.

С диссертацией можно ознакомиться в Оиблиотоке'Института химической физики РАН.

Автореферат разослан 12. 139Уг.

Ученый секретарь ! специализированного совета кандидат химических наук ; . М.Л.Смотряева

. I !•

ОИЩЛЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОга !

Актуальность теми. Одной из центральных проблем клеточной •

биологии является проблема клеточного цикла. В последние годи |

было установлено, что существуют вещества 'белковой природы, 1

способные специфически стимулировать синтез ДШС'и деление >

клеток. Эти вещества получили название факторов роста, факторы :

роста, связываясь со своими рецепторами на мембране клетки,, в !

процессе рецептор-опосредованного эндоцитоза (РОЭ) поступают ,• { внугрь ее. Именно ути процессы индуцируют пролиферацию и .' ^

дкф1)еренцировку клеток. Одним из основных факторов роста / |

является эпидермальннй фактор роста (ЭФР), специфический' | рецептор которого присутствует в различных клетках и тканях; ' ;

включае клетки роговицн, хрусталика, фибробластов. сосудистого . I

эндотелия. Среди факторов роста клеток иммунной системы !

выделяются интерлейкин-й (ИЛ-2) и интерлейкин-4 (ИЛ-4). ИЛ-2 ! является основным фактором роста 'Г-лимфоцитов, натуральных • •'

киллеров; кроме того, он активирует В-лимфоциты и,.". I

моноцитн/макрофаги. МЛ-4 - фактор роста В-лимфоцитов, •' •

производимый определенной субпопуляцией Т-димфоцитов к ' ■ !

нейтрофилами, также регулирует пролиферацию '1'-димф;цитов. !

.1С моменту начала наших исследований (1985 г.) V !

исследование кинетики связывания и РОЭ факторов роста носило, >

Фрагментарный (в основном качественный) характер. ■ Била | построена одна математическая модель, связывания и РОЭ , ЭФР ' { [сехгпЬгу, по1ля.1, 1981). До яастояиш'о времени не существует математических,моделей РОЭ интерлейкинов. Поэтому детальный количественный »наши» о использованием математических моделей позволит' ря«ии*|'ь количественную теорию сминшш и РОЭ факторов ]>.к1та клеткой и подробно иуучить механизм» утих процессов, а также Л] «докапай. ил роль в регуляции клеточной

активности. !

Цель и задачи исследования. Целью, работа -является ! конструирование математических моделей связывания и РОО

факторов роста клетками для того, чтобы I) корректно описать ! совокупность, экспериментальных данных по кинетике связывания и

РОЭ основных факторов роста, таких как роста (Э<1>Р), ИЛ-2. ИЛ-4

у

и 2) для того, чтобы ■. изучить кинетические -особенности связывания и РОЭ Факторов [«ста и их возможную роль в регуляции деления клеток. Для выполнении наставленной пели работы были сформулировэш следующие задачи:

г. Построить и теоретически исследовать' модель _ РОЭ двухвалентных' лигандов и учетом рециклирования мембранных рецепторов в клетке.

2. Дать математическое описание и анализ опытных данных но эндоцитозу ЭФР, э также определять параметры моделей РОЭ ЭФР.

3. Построить модели РОЭ факторов роста клетками, которые описывали Он процесс поступления этих факторов роста после предварительного связывания факторов роста с клетками на холоде 1п уШ-о. Проанализировать эксперименты по РОЭ ИЛ-3 и ИЛ-4 по данной модели.

4. С помощью методов математического моделирования исследовать кинетику связывания и РОЭ факторов роста клетками при физиологических условиях. Дать анализ акспериментов по РОЭ Ш1-2 и Ш1-4 лимфопитами по модели. Определить параметры модели.

5'!Сконструировать и численно исследовать математическую модель первого клеточного цикла лимфоцитов, в которой переход клеток из с, - в 5- фазу клеточного цикла опосредуется связыванием и РОЭ ИЛ-2 лимфоцитами.

Научная новизна . Впервые при использовании большого фактического материала построена серия математических компартментах моделей связывания и РОЭ факторов роста, которая позволила корректно описать совокупность экспериментальных данных по кинетике моделируемых процессов. Предложена математическая модель транспорта в клетку двухвалентных лигандов с учетом рециклирования мембранных рецепторов. Установлено соотношение между параметрами РОЭ, при котором концентрация внутриклеточных лиганд-рецепторных комплексов максимальна. Предложены условия постановки эксперимента для отличия транспорта в клетку одно- и двухвалентных лигандов.

Построенные математические модели . связывания и рецептор-опосредованного эндоцитоза ключевых Факторов роста, (ЭФР, ИЛ-2, МЛ-4) теоретически описывают зкспчриментальные

данные по кинетике РОЭ этих Факторов роста. Предложенная нами математическая модель связывания и РОЭ ЭФР минимально трансформиррванннми клетками ЗТЗ в отличие от предложенной ранее модели пе\Га)>г\, vajsi, 1 за-i содержит вдвое меньше 1герам«троВ| не противоречит другим экспериментам по ' РОЭ ЭФР этими же клетками. Иа нашей модели следует предсказание о возможности сбрасывания с мембраны' клетки в среду Ф>актор-рецепторннх комплексов, когорте может быть проверено экспериментально. •

Для обширного набора экспериментальных' данных впервые, получены .доказательства, что на' клеточкой поверхности лимфоцитов существуют две формы рецепторов к факторам роста лимфоцитов - интерлейкина-3 и интерлейкина-4, различающихся в скоростях процесса зндо- и экзоцитоза и которые могут быть связаны с переносом различных сигналов в клетку.

Впервые постронна и исследована математическая модель связывания и. РОЭ МЛ-2 и ИЛ-4 лимфоцитами. Из расчетов "по этой модели (следует, что предсказываемые две формы рецепторов к ИЛ-2 и ИЛ-4 могут обратимо переходить друг в друга.

Построена новая математическая модель первого клеточного цикла лимфоцитов, переход из cj - в s-фазу которого опосредуется 'ввязыванием и РОЭ ил-З Т-лимфоцитами. Численно исследована модель аутокринного размножения Т-лимфоцитов in vitro , а также иоследов.чна роль рецептор-опосредованного эндоиитоза ИЛ-2' на. динамику клеток в к-От* клеточно-го цикла.

Научно-практическая значимость диссертационной работы обусловлена возможностью применения полученных в ней результатов в дальнейших теоретических и практических исследованиях клеточного цикла, контролируемого ростовыми фклсгорами. , Практическая значимость вывода относительно существовании на клеточной поверхности лимфоцитов двух форм punemvipoy к мтерлейкнну-З и иитерлейкину-4, различавшихся в скоростях нроцчссиш'л интерлойкинов и клетку, заключается в предсказании условий для ' -постановки эксперимента по установлению ;-..ТИХ peUttHTypilllX структур, которые могут быть связаны с переносом в клетку различных сигналов.

Предложена методика проведения экспериментов по изучению роли процессинга факторов роста в делении клеток, которая . следует из численного исследования предложенной нелинейной / модели первого митотического деления"лимфоцитов.

. Апробация работы. Материалы диссертационной ~ -работы, доложены на 2-ом 'Всесоюзном семинаре " Математические и вычислительные методы в биологии" (Пущине, 1987 ); • 1-ом Всесоюзном'совещании " Биофизика рака" (Черноголовка, 1937 . ), Международном рабочем совещании "Математические модели , в иммунологии и медицине "(Киев, ' 193Э ), Втором'Международном ' симпозиуме ;"Цитокины и факторы роста при раке" (Мюнхен,

(Германия), 1993) Комбинированном семинаре 8-1'о междунохюдного ; совещания по:лимфэкинам и 4-го международного совещания-но . цитокинам'(Осака (Япония),, 19ЭЗ), Международной конкуренции по применению' диФ1«ренциэлышх уравнений в биологии и индустрии (Кларемонт (США), 1994). Кроме того материалы диссертации докладывались на семинарах по математической иммунобиофизике ИХФТАН, на конкурсе молодых ученых отдела кинетики химических ,и-биологических процессов ИХФ РАН (1993 год), а также на конкурсе публикаций за 1993 год этого же отдела.' I.*.1V Публикации. Результаты выполненных исследований опубликованы в десяти работах. '.■, ". Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, шести глав , выводов и списка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 15 таблицы. Список цитируемой литературы состоит из 174 названий, из них 26 на русском и Л 48 на иностранных языках.

■' Основные положения.'выносимые на защиту.

.' I. Основанная на анализе математических моделей система доказательств того, что на поверхности лимфоцитов, не зависимо от аффинности и субъединичной организации рецептора, существуют ,' две (формы рецепторов к ростовым факторам ИЛ-2 и ИЛ-4. различающиеся по скорости РОЗ.

,2. Объяснение нелинейных закономерностей РОЭ в условиях взаимодействия рецепторов с двухвалентными лигандами, мри наличии нескольких путей реценч'ор-опосредонанного зндо- и

экаоцитоза нормальными и опухолевыми клетками. '.■. : '

3. Теоретический анализ кинетических закономерностей клеточного цикла лимфоцитов, контролируемого ИЛ-2.. ,

Содержании работы. Во введении к диссертации обоснована актуальность темы исследования,-Формулированы основные задачи, исследования. I) нем' также отражен« научная новизна и научно-практическая значимость работы.г ,

Первая 1\нава содержит обзор экспериментальных данных,касающихся лиганд-рецепторного взаимодействий в РОЭ. а также известные ранее математические модели этих процессов. Приведен» данные литературы о некоторых ключевых факторах, роста' и их рецепторах (эпидермальный фактор роста, ИЛ-2 И' ИЛ-4).-Сформулированы задачи исследования. . • :' ,

Во 2-ой главе построена и проанализирована математическая модель рецептор-опосредованного эндоцитоза двухвалентных лигандов в клетку с учетом рециклирования их мембранных -рецепторов, а также сформулированы условия проведения , кинетических экспериментов, позволяющих отличить транспорт бивалентных молекул в клетку от транспорта одновалентных молекул. , : , '

Модель имеет вид: ' ;. ■;

. ' (I) . '

СЫ±

«1-р)

Где 1с ^, к.,, .к,, кгчк,. к.3, к,, к,, кА. -

кинетические константы. '•■,

Согласно (I) лигаид (1.1 обратимо связывается о рецептором [и], образуя комплекс г»Ы», к' кото|х-.му затем присоединяется еще один рецептор. Комплекс [тл]п поглощается клеткой вследствие образования зндосом, затем внутриклеточный комплекс [гап]!

распадается, лиганд [Ш переносится ь лизосомн, где деградирует, а две молекулн рецептора с вероятностью р возвращаются на мембрану или о-вероятностью (1-р)--подвергаются деградации (['в)*). Для многих рецепторов показаны интернализсшии и рециклинг рецепторов в отсутствие лиганда . Рецепторы, попавшие в клетку таким путем, обозначим [и)'т. Поскольку времена жизни рецепторов как правило значительно больше, чем период, их рециклирования и характерные времена приведения экспериментов по РОЭ, то в модели не учитываются процессы синтеза рецепторов или их естественной гибели.

В соответствии со схемой (I)-кинетика процесса описывается системой уравнений

.][п]/<ц = (1!Ь]0 - к, [и][Ь] * 2к_, [ньп)я - к2Ш[))],}„ +

• ¿Кви^АЫ- = кг[ь)[й] - к_г1яь]0 + 2к_я[йыив - к2[п]'[пь]3 , <ЩШ,,/сП = к2[К)[1!Ь]0 - (к^+гк ^) [КЬЧ]д ,

(г)

d [HLRJ 4/cIt = к3 [RLR]3 - к^ [RLlUj

d[R]./dt = к'^р [RLR]. - KjWj , d[R] ¡üt = 2k4(l-p)[l!/JR]i , (][R]il/<lt = k| [II] - k:t[R]n , dfbJjVclt = k^ [ПЫ!] ^ - k6[L)1

При этом для общего количества рецепторов t«]o справедливо равенство

[Rjo = [Jl] + [K)¡ + [R]jj + [LR]a +2[RM]e+ 2[1(Ы1] ^ [Rj* .

Ha pwo.L представлена зависимость концентрации внутриклеточных лиганд-рецепторных комплексов от дозы .одно- и двухвалентного лигзнда, рассчитанная численно по уравнениям

(2). Дано объяснение сложных (бимодальных и «-образных) зависимостей кривых типа "доза-эффект" биологической активности клетки, инициированной ростовыми факторами. 11а основании полученных результатов сделан вывод,, что связывание рецепторов бивалентным лиганлом, Х'етерогенность рецепторов, их способность

к рециклированию могут составлять механизм, регулирующий ' различные Функции клетки, включая пролиферацию, адгезию, диФТвреншчювку.

(Щ

-ыкш ; V

11 ■

I .,:,■',

Рис.1. Зависимость накопления комплексов [Г!ья)1 (I) или, [пь]1 (?■) внутри клетки от начальной концентрации лиганда (к1[ь]0); •■ для модели (I): [1?(1]=1; 2.^=0,23 мин-1, к3=о,<1б мин"1, к_г«о,о9 мин-1, 2к ,.-=о,оо1 мин-1, и,[Г! ] =о, 1 я мин-1, 1<',=к'=0; значение

"■л с о -г -,1 а

><, [ио изменяли в пределах КГ'-Ю-"' о , параметры для модели . ВЧЯТЫ ИЗ рйботн ЯсЬмтЧг ol.nl.,19П1.

В глине 3 ¡¡[«анализированы мксперименти по кинетике рецептор-опосредованного яндопитоза апидермального Доктора роста нормальными и ноопластическими клетками. Получены оценки параметров рннчптор-опосредованного зндоцитоза эпидермэльного фактора роста.

приведена математическая модель POO упидчрмального Фактора роста минимально трансформированными 'клетками линии зтз.

Простейшая модель п|.юцесса 1-4)0 следующая :

L+R

[LR1

0(1—г)

U.RJ,

(3)

[ЬЛЗ- ,

. он ».

где ь - лиганд (ЭФР ) ; н ч рецептор ; [ы?]„. [и»], п комплексы на поверхности- клетки, внутри и вне клетки, соответственно; параметры к(, к_(, к( , к-м) константы скоростей связывания, зндоиитоза и сбрасывания с мембраны в .среду (шеддинга) комплексов, соответственно.

Выражение 9а-т) - ступенчатая функция Хзвисайда: 0(I-т) =о при ит, ' и ва-т) = 1 при 1> т . Предполагаем, что сбрасывание лиганд-рецепторнцх комплексов с мембраны' клетки происходит 1 спустя некоторое время после их образования. Время т принято, близким ко времени образования на Мембране максимального количества связанных комплексов { при ,37°С с учетом процесса интернализации комплексов ). Рассчитанная по данной ' модели

равновесная •

':. скорость интернализации ЭФР ^=0,095 мин-1, 'константа диссоциации к=к_1А1=1,67-Ю9 М."'

Принципиальным в предлагаемой модели . (з) является . предположение о наличии шеддинга комплексов ЭФР-редаптор с клеточной мембраны. Это важное предсказание модели- может быть проверено в детальном кинетическом эксперименте. • :.. " В п.3.2 приведена математическая модель РОЭ эпидермального фактора роста клетками эпидермоидного рака Л431:

1

4,

•»R + I,

(lib)

П

(RL)

1»

(4)

/

где ;)- поток вновь синтезированных рецепторов, а- константа скорости их гибели, кх-констэнта рециклирования рецепторов ЭФР'. на мембрану клетки. Осталыше параметры описаны в модели; (3), Определены кинетические параметры РОЭ эпидермального. фактора роста клетками А431: к1п-о,(Ч5 мин"1, кх=о,о51 мин-1, 1;-~-к_1Лг=1,6-10" мТ'из сравнения констант РОЭ ЭФР клетками линий ЗТЗ и А431 видим, что сродство (к) рецептора к ЭФР на опухолевых клетках А431 на порядок меньше , , чем на. 'минимально • трансформированных клетках -ЗТЗ, а скорость эндоцитоза■. ЭФР клетками А43Т снижена в 2. раза по сравнению с клетками ЗТЗ..' ;

В п.3.3 приведен анализ экспериментов по рецептор-опосредованному эндоцитозу моноклональннх антител ;к : ЭФР /, нормальными фибробластами по математической модели (5):

J; •*'.'','.

R + Ь 1Kb) (RD* (Rl>) (5) ' . ' '

К р • In

I - <

■ '•■■ out ' ;

В модели (5) константа к2 характеризует переход лпганд-рецепто-ных комплексов на мембране клетки гшгв зону окаймленных . ямок ш*, откуда они поступают внутрь клетки (mi . или "могут ■ ; " сбрасываться о 'клеточной поверхности <RM0 t .По модели' хорошо описываются эксперименты по РОЭ мойоклонэльных антител. Так как РОЭ эпидермального фактора роста и моноклональннх антител к' нему описываются одной моделью (5), то моноклоналыше антитела могут служить зондами в изучении механизмов РОЭ эпидермального фактора роста. ' .

Таким образом, несмотря на более чем десятикратное различие в молекулярной массе-ЭФР и МонАт, кинетика РОЭ характеризуется одними и теми же этапами. Следовательно, для реализации биологического эффекта (в частности, синтеза ДШС) необходимы i высокое сродство между лигандоми рецептором и высокая окорость протекания каждого' из этапов РОЭ, а молекулярная масса не существенна. Из представлении: результатов можно предположить ,

/

что относительно высокая скорость протекания каждого из этапов РОЭ позволяем клетке генерировать коротко живущий сигнал, индуцируиций пролиферацию.

В последующи^ главах большое внимание уделено процессам, происходящим в клетке с лиганд-роцопторными комплексами, после образования их на клеточной поверхности (процоссингу).

Р главе 4 представлена модель процосоингэ лигакд-рецептор-ных комплексов клетками после предварительного связывания лиганда с клетками на холоде. Модель основана на предположении о наличии 'на клеточной поверхности двух форм лиганд-ре шторных комплексов, которые с разной скоростью процессируются клетками.. Схема модели имеет вид:

На схеме (6) переменные хд и х2 обозначают концентрации ЛРК на поверхности клетки для первого и второго путей процессинга лиганда соответственно; х3- концентрацию ЛРК внутри клетки; х4~ . концентрацию фрагментов лиганда в среде . после деградации его в лизосомах,; . х -концентрацию лиганда и/или ЛРК, спонтанно сбрасываемых с поверхности ' клетки; параметры' , 1=1,5 - неотрицательные константы с размерностью мин"1.

Выражение Ои-т) описано выше. Система дифференциальных уравнений, соответствующая схеме (6), и точное ее решение, а также методика первого этапа оценки параметров данной модели по точному решению представлены в п.4.2, 4.3.

По модели (6)' были проанализированы данные по ро це птор-опо сре дов а иному эндо- и гжчоцитооу интерлейкшю-2 (основного фактора роста Т-лимЯюцитов) различными клеточными линиями. •

Модель с хорошей точностью (рис.2) описывает все кинетические кривне процессинга ИЛ-2, в том число двухфазную кривую, характеризующую очистку клеточной поверхности от метки. (Заметим, что на ркс.йе представлены теоретические кривые,

рассчитанные в простейшем случае наличия на- мембране клетки одной (формы рецептора (х,). В этом случае экспериментальные данные ипз! 1 описываются неудовлетворительно.)

0,5

СО 410

е

60 МО

мин

Рис.?.. ИнтернАнпзация МЛ-2 В- и Т- клетками. Сплошные 'линии представляют собой теоретические кривие, рассчитанные по математической модели, и показывают относительное содержание метки нм клеточной поверхности (I), внутри клетки (2) и в среде (3). Экспериментальные данные получены в работах П'иЗН -о с. л ]., 1986; Тал»к-а в1.а1., 15П«) на клетках линии-якмб-4 (а), • лимфоцитах;, выделенных из периферической крови (б) и клетках линии ть-Пог (в)'при 37"о. а также клетках ¿шнии 'тьт-глп при 37, 27° (г. д, соответственно).' Па рис»а (е) показаны теоретически« крикио, рассчитанные в • простейшем случае образования одной формы лтчтд-ринеиторных. комплексов на поверхности клеток ов, выделенных из периферической

08148725

крови (х ). .

Проведен количественный анализ ■ широкого . набора экспериментальных данных по кинетике процессинга ИЛ'-З- разными клетками . Вычислены кинетические параметры и соотношение между "медленными" и "быстрыми" формами цепей рецептора к ИЛ-2. Результаты представлены в таблЛ.

Таблица I. Значения параметров модели'(6) процессинга ИЛ-2 В-ЛКМ^ОЦИТЭМИ (ЛИНИЯ 2КК64), Т-ЛКМГ/ОЦИТаМИ (ЛПК.ТЬНог, IЬТУап, 27, 37'с), тоансфэктными {мбробластами (ь«рь, ьруо, , ■

траноТйктштмй лимфоцитами (са^, лр8, Ei.f3.i3, ларю), клетками при наличии мутаций в генах Р- (г-7, д-15, н-1, .'>25, зт-7) и

Г-ЦОПИ (Ь«тМ0-5, Ьа|3гбя-6)

1 параметры Клеточные ■ линии■ ■I к 1 ■ мин ■Л к Р т, МИН

5 К V 6 4 1 0, 048 1 0 1 0 1 0 1 0,015 1 1 0, 9 •

ЛПК 0, 09 0 0 0 0,014 25 0, 76

ТЬНог 0, 1 0 0 0 0, 009 30 о, 83

1ЬТУап, .17° С 0 , 0С5 0 0 0 0, 017 25 о, Й 9

I ЬТ \'ан, 2 7° С 0, 037 0 0 0 0, 0065 60 0, 75

.ТыГ, 0 0 0, 5 0,02 - - о, 8

п 0 1, 42 0 - - о. 87

,708 о , о " 0, , 007 0,057 0,00.3 0, 017 30 о, 7 5

ЕЬр13 0, 23 0, , 003 0, 029 0,01 0, 01 30 0, 8

1ру9 0, 11 0 0, 286 0,0074 0, 007 10 о, 52

.Тар 10 о, 0Й 0, 0Й9 0 0 0, 02 40 6 5

Ь«РУ4 0, 14 0 0,093 0,013 0, 007 30'' о, 67

Т-1 0, 13 0, 0127 0 0 0,0185 0 0, 5

А - 3 5 . 0, 2 0,0123 0 0 0, 0187 10 0. 5

II-4 ( 0, 14 0,012 о' 0 0, 01 0 0, 56

2-25 0, 126 0, .007 0 0 0, 01 0 о, 5 4

ЗТ-7 • 0, 16 0, 019 0 0 0, 021 15 0, 8

5 0,13 0, ,007 0 , 27 0 0,004 30 83

Ьарубв- 1 6 0,055 0, 0085 0, 06 0 0, 013 30 - 0,58

Из анализа результатов, представленных в таблЛ,■ следует,

что дли разных тиков клеток, неуависисо от аффинности и форм цепей ИЛ-ЯР, нм клеточной поверхности существует от ЬО до лигмнд-рецепторннх комплексов, быстро процессируемых клеткой. Понижение температур» от 37"С до ?.7"о не меняет ато «соотношение. Таким образом, полученные результаты укаанваот • на существование клеточной поверхности но крайней мере двух: ' конфирмационных, состояний или субнопулнц'пй низко-, умеренно-, .псевдовысоко и высокоафГинннх Ш1-ЗР, которые могут быть связаны с переносом различных сигналов в клетку -

В главе 5 приведен анализ по модели (6) (глава 4)" экспериментов по кинетике рецептор-опосредованного экдо- и экзоцитоза многофункционального - фактора гемопоэза интерлейкинз-4 В- и Т-лшфоцитами. Для , рецептора " интерлейкина-4, также как и для рецептора ИЛ-Я, существуют две-Формы.одна из которых практически не поглощается клеткой за время проведения эксперименту по РОЭ (доля быстро ' ■ щюцессируемнх клеткой лиганд-реценторных комплексов составляет 80%). В этой главе представлена математическая модель связывания и процессинга ИЛ-4 Т-' и В-лимфэцитами с учетом наличия на мембране клетки двух форм рецепторов, одна из! которых не поступает внутрь клетки.

Кинетическая схема связывания и процессинга имеет вид:

i

R + L

J

Ф R*

4. X,

Где я - концентрация ИЛ-4Р V на поверхности клетки; ■

к*- концентрация слущенных (7) и/или спонтанно интернади-зирушихся рецепторов; $ и « описаны в модели (4); * -6сI-Т) 1/м'МИн; т мин"';

Остальные обозначения как в модели (6)..

Система дифференциальных уравнений, соответствующая схеме (7), и точное ее решение при i;i(=i;4¿0-приведены в и.5.Я. &.3. Модель (7) нелинейная. В и.5.4 'приведено качественное

исследование и построены фазовые портреты модели.

Модель (7) •имеет ненулевое устойчивое стационарное ряшнние. ;>1'о решение для и х* ( в условиях избытка . лиганда, 1,=г,(( =(.'оп5 1) имн(гт вид:

V' иса)' V ХГ 'У^'У'

где а=к -ии к. )/(*-,+ .

14 7 4?

Фазовый портрет этой модели, построенный при константах, характеризующих связывание и процоссинг интерлейкина-4, ¡несчитанных нами но модели (7) (п.5.5), приведен на рис.п.

кривой (I.) приведены в тексте. Параметр п7=0Д мин-' для кривой (.?.). Легальные параметры как для кривой (I). п()-5€00 молекул/кл

Па фазовом портрете показана зависимость х2 от при разных ииаченинк константы Уу (¡рассчитанная при условии избытка лиганда >. В,случае большой'величины к7 переменная хг имеет один .-локальный минимум до того как она достигнет стационарного иначннин. Такого минимума нет, если к? мало. Эти особенности траекторий мо^.но проверить экспериментально.

и и.5.5 приведено численное моделирование кинетики связывания-и процессинга ИЛ—1 лимфоцитами (bovcntii.ii, 1988) по модели (7). Получено удовлетворительное .согласование с экспериментом, определены кинетические константы моделируемых процессов( :К>6 молекул/(клетку<мин). «=0, к4=0,07 мин"', кц--0, кл-'3,3-10" (М'МИнГ1, 1г7-0,04 мин"1 , ^=.-0,013 мин"1 >:в =0,014 мин-1, к^-О.О'ХО мин"1 ).

Согласно модели (7) лиганд обратимо связывается со свободным рецептором на клеточной поверхности, после чего "первичный" лиганд-рецепторный комплекс (х4) обратимо переходит во второе состояние (ха). Такие состояния ЛИС на клеточкой ' поверхности могут появляться в результате конфирмационных переходов рецептора после первичного связывания- с лигондом. ' Возможно, что после такого перехода рецептор не поступает внутрь клетки. Переход из первого во второе состояния ЛРК может быть обусловлен взаимодействием ЛРК друг с другом или молекул "третьего" типа, которые содержатся в .свободном состоянии на поверхности.■ Такими молекулами могут .быть белки покрытых впадин, другие рецепторные молекулы , ЛРК другого цитокина Кроме того, по модели (7) проанализированы эксперименты по связыванию и процессингу ИЛ-Й Т-клетками. Получено • удовлетворительное соответствие теории ' экспериментальным данным. ■ Определены кинетические константы.

Па основе численного ' моделирования РОЭ ИЛ-2 и ИЛ-4 (гл.<1, 5) можно сделать вывод, что быстрые и медленные (формы рецепторов к цитокинам и пути процессинга ЛРК клетками после их связывания с рецептором - достаточно универсальное явление в Физиологии клетки.

Р/ главе С представлена математическая модель первого клеточного цикла лимфоцитов (до 20 ч) под действием процессинга интерлейкина-2 9 клетках. Модель существенно нелинейна, так как переход лимфоцитов из фазы 0-о в Фазу 5 клеточного цикла описывается Функцией с насыщением. Эта функция характеризует накопление внутриклеточных • комплексов ИЛ-2-рецептор внутри клетки.

Систем;-» диФФшренпиальннх уравнений математической

модели движения лимфоцитов по клеточному циклу, под действием ИЛ-2 имеет вид: '

Ох ílt <1\-01 dx <11 dx ílt-(lx ' (11

l-A(l)Xt ,

2-AíDx,-.MSlx^-iACDx^ ,

• =a(2)x2- (д(3)*дк+д (4) )x,( ,

4 =ЛО)*ЛК*Х.-A(S)X„ ,

.1 4

(1 X ' <lt (lx (lt (lx . (11 dx (11

л — A (6) x — A (7) x x A (fí) x

А О I «•

=a (9) x -л (7)x x i л (0) х- ,

.4 6 i M

«=А{7)ХАХ7-(Л(8)+Л(10))ХЙ

f=A(lO)xi4-A(1l)xí(,

я=л(5).\ ,

<1x, ,

о -л (11) x

Где . *г. *3. *,< *ff - количество клеток в фазах клеточного' , цикла«?,, g. , с ., s, с-,+м соответственно. Параметры A(i) (i ; от I до 5) - кинетические константы с размерностью 1/чос. • . В Фазах в1А и cf ь происходит экспрессия ИЛ-2 и рецептора к нему, соответственно. Эти фазы обратимы. Переменные x¿, хт, хр,

*,о --концентрации ИЛ-2 в среде, свободных ИЛ-2Р, комплексов (1<1Л72-ИЛ-2РГнз поверхности клетки, комплексов (ИЛ-2.-ИЛ-2Р) внутри клетки и в'среде после деградации ИЛ-2 в лизосомах,' соответственно. Параметры A(i) (1 от 6 до II) - константы, характеризующие производство ИЛ-2 в (liase с( , связывание. ИЛ-2 с ИЛ-2Р на поверхности клетки, диссоциацию lUbZ от поверхности клетки, производство ИЛ-2Р в состоянии интернализацим и

деградацию ЛР1С в клетке, соответственно. Будем считать, что. Функция перехода лимфоцитов (лк) из Фазы ъ4 ь в S зависит от накопления фактор-рецепторных комплексов внутри клетки и имеет ■гиперболический вид : aíc=*v/í*^• aíi2)), где Л(12) - параметр модели.

На основании численного моделирования проанализировано влияние параметров лиганд-репепторного взаимодействия (скорости биосинтеза ИЛ-2 и высокоаффинного рецептора к ИЛ-2, скорости

взаимодействия утих макромолекул на клеточной" поверхности'.; а также скоросткй интерн,члнзации и деградации лиганя-рецепторннх комплексов в клетке) на динамику клеток в 5-фазе клеточного цикла. Показано, что увеличение указанных параметров1 (для константы деградации внутриклеточных комплексов- уменьшение) , увеличивает величину максимума накопления клеток. в"г-фазе и',, уменьшает' время достижения этох'о максимума. Построены фазовые' портреты, отражающие .зависимость концентрации рецепторана • клетке от концентрации ИЛ-2 в среде при ' разных .-соотношениях . между концентрациями М-2 и рецептора и разком времени появления этих молекул в клеточном цикле (рис.4). Из рис.4 видно, -что' ; данные фазовые портреты качественно различаются между ; собой. Предложены условия для ' постановки ' экспериментов по изучению влияния процеооинга ИЛ-2 в лимфоцитах на клеточный цикл. ;

моле кул/кле тку ,11'' ■ -

... а г- - ' •

Гооо

С- 1X0 -1500 о 1

450 900, о 25-00 .,5О0 :

5~000

10 ООО

О 1250.

молекул/клетку

Рис. Ч. '

Зависимость концентрации, рнцентогюв к. ИЛ-?- на клетке' 'от. концентпмции ИЛ-?. , рассчитанная по модели- (У) при а) а(0-2500 , • л(У)--З(.'О') ммлику.||/(Ю1'Час): '" б) л(0")-"&00 , л(£>)--3000 м''1Лукул/(кл'НчО ( синтез рецептора в клетке предшествует'

синтезу интерлвйкина-3); в) а (0=2500 , л(9)--1000 молекул/(кл-час); г) л(С)=2500 , л(9)-3000' М0лекул/(кл'4ас) (синтез ИЛ-2 предшествует синтезу рецептора); д) л(0-3500 , л(9)=1000 молекул/(кл -час); 1 е) л(6>=3500 л(9)*3000

молекул/(юм час) (в условиях одновременного производства лимфоцитами ИЛ-2 и высокоаф|.шного рецептора к нему). Остальные константы, имеют реалистическое значение и приведены в главе 0.

БЫВ О ЛЫ

1.Разработана математическая , модель рецептор-опосредованного эндоциточа двухвалентных лигандов с учетом рециклирования' их мембранных рецепторов, которая позволяет прогнозировать "накопление лиганд-рецепторннх комплексов -, в

,/ клетке в зависимости от дозы двухвалентного лиган.ца и объясняет сложные (ы-образные, бимодальные) дозовне зависимости биологической актив/гости клетки, обусловленные , пгоцоссами эндоцитоза. Предложены условия для проведения экспериментов, позволявших отличить транспорт в клетку одно- и двухвалентных лигандов.

2.Созданы математические -модели процесса рецептор-опосредованного - эндонитозо эпидермальпого iIb.ikvoj.vj роста нормальными, минимально трансформированными и опухолевыми клетками. По результатам, численных расчетов по моделям предсказано явление сбрасывания лиганд-рецепторннх комплексов с клетки в среду. ■ Из сравнения результатов у>асчета с • экспериментальными данными следует, что на опухолевых клетках замедлены процессы связывания и эндоцитоза эпидермального фактора роста. Показано наличие рециклирования на клеточную поверхность внутриклеточных диганд-реиепторных комплексов.

Так как эндоцитоз эпидермального. Фактора гюста и М0НО1СЛ0НМ./П.Ш1Х антител к ого /.адюнтору описываются одной и той же математической моделью, то моноклональные антитела могут бить биими.митиками в изучении механизмов п действии нпидчрмального фактора роста.

З.Пз анализа экспериментальных данных по кинетике .ироцессинга

!

интерлейкина-2 и интерлейкмна-4 по предложенной математической модели следует, что на клеточной поверхности лимфжитов существуют две ф.>рмн рецепторов к интерлейкину-2 и штрл*Лкину-4, причем длн интерлейкина-2 покачано, что соотношение между рецептурными структурами, участвующими в нервом ("быстром")'и втором ("медленном") пути процессинга, не зависит от количества высокоаффинных рецепторов- на, клеточной поверхности! а также от ¡форм- цепей ИЛ-ЗР, представленных на мембране, и изменений в аминокислотной последовательности о- и т- цепи ИД-2Р. Понижение температуры от 37НС до 27"0 не меняет это соотношение.

•4. Разработана математическая модель связывания и мнтернализации клеткой лиганда, основанная на предположении, что на клеточной поверхности существуют две формы рецептора,- о разной скоростью участвующие в процессинге лигад-рецепторннх комплексов в клетки. И* расчетов по зтой модели следует, что предсказнвмемне две ф:>рмн рецепторов 1С интерлейкину-3 и ;..интерлеПкину-4 на клеточной поверхности могут после 1 связывания с лигандом обратимо переходить друг в друга. 5. В работе обосновывается принципиальная возможность теоретического исследования влияния параметров лиганд-рецепторного взаимодействия на неточный пнкл лимфоцитов.' Из теоретического анализа кинетических закономерностей производства интерлейкинз-2 и его внсокоЫфинного рецептора на стадиях клеточного цикла следуют условия проведении эксперимента о целью уточнения и расширения математической модели клеточного цикла лимфоцитов.-

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1.Кузнецов Б.Л.,Алехина Л.Р. Моноклональнне антитела как зонды в изучении механизмов рецептор-опосредованного эндоцитоза. Моделирование1 процесса интернализации клеткой зпидермального Фактора ]юста на ЭВМ.// . Биотехнология.юо7.т.з. № 6. (;ли-1%.

2. Кузнецов Н. А. , Алехина .Д. Р. Кинетика рецептор-оиосредокмнного »ндоцигогш зыидермального фактора роста норммльными и опухолевыми клетками.// Тез. 1-Всесоюз. раб.

"биофизика рака". Чсрногмлйвка. líWV. с 83. 3.. Кузнецов' 13. Л. , Алехина Л. 'Р.,. Математическая ' модель динамики эндоцитоза и рециклирования мембранных рецепторов. // Тез. докл.. II воеооюэн. конф. "Матем. и вычи'сл,методы в биологии •• Биомолекулярные системы". Пущино. 1987. С. 130-131. 4. Кузнецов 13. Л. , Алехина JI. Р. Математическая модель транспорта макромолекул и рециклирования их мембранных компонентов в клетке'. // Биофизика. 1990. Т. 35. С. 2Э7-30Х. ö. Кузнецов D. А: , Борисова Л. Р. Анализ кинетики интернализации и сбрасывания интерлейкина-3 с поверхности клеток, имеющих рецепторы различной аффинности. // Биомембраны. 1994. Т.Н. к 5. С. 508-580.

6. Кузнецов В. А. , Борисова Л. Р., 'Борисов Д.М. Кинетика связывания и процчссияга , интерлейкина-4 ' лимфоцитами. Математическая модель, и оценка параметров.// Биомчмбраны. 1994. Т.II1. N в.С. G47-659.

7.Алехина Л.Р., Кузнецов В.А. Анализ экспериментов по кинетике рециклирования рецепторов эсиалогликонротеинов на основе — математической модели.// Биофизика. 1990. Т.35. Вьш.1. С.89-91.

O.Kiiznotsov V.A. .lloriuova b.R. Nal liorna t Leal modelling of processing of growth factor and spcclflc monoclonal mil I lioil I on to growth factor roeeptore.// Abstract In Math.Modeling In Immunol, and' Medicine (Kiev: Akndemiya Nauk llkr SSR) 1989. P. 35.

9.Kuznelsov V.A.", Dorlcova b.R. Klncl'lc analysis of the heterogeneity of intcrleukiii-2 processing by the a-, py- ami «Л^-cliaina of IL-,2' receptor*.// Lymphokine and cytokine research. 1993. V.12. (í D. P.400.

10. Kuznctnoc V.A., Dorisova h.R, Ccalco Jn.I, An.ilyuIя of Ulnotico audi tli'.'niiodyiianilc.'i of i:u II- to-ccl 1 adheul'Jii in llio cytotoxic react Ion ol iminiino'lyiiiphocyle.// Abstract In Mathematical Modeling in Immunol <xj у ami Medic I lie (Kiev: Akademiya N'auk Ukr ÍJSR) 19Я9.Г.36.

J