Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомотипические слияния ранних эндосом: роль белка слияний ЕЕА1 и цитоскелета

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Гомотипические слияния ранних эндосом: роль белка слияний ЕЕА1 и цитоскелета"

На правах рукописи

005057662

ЗЛОБИНД Мария Владимировна

П

ГОМОТИПИЧЕСКИЕ СЛИЯНИЯ РАННИХ ЭНДОСОМ: РОЛЬ БЕЛКА СЛИЯНИЙ ЕЕА1 И ЦИТОСКЕЛЕТА

03.03.04- Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 АПР 2513

Санкт-Петербург 2013

005057662

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Корнилова Елена Сергеевна

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Снигиревская Екатерина Сергеевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор

Надеждина Елена Сергеевна

Институт белка РАН, Пущино

Ведущая организация: Факультет фундаментальной медицины

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 12 апреля 2013 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064,

Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Электронный адрес: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru.

Факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «_?_» марта 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста (EGF) вовлечён в регуляцию множества клеточных событий, включая передачу сигнала, клеточную миграцию, апоптоз и др. Нарушения процесса зндоцитоза способны приводить к развитию тяжелых патологий (Coursodon, Dvorak, 2012; Wolff et al., 2011). Именно поэтому на протяжении нескольких десятилетий рецептор-опосредованный эндоцитоз EGF привлекает внимание множества исследователей. В общем виде этот процесс начинается на цитоплазматической мембране, где происходит связывание лиганда с его рецептором, димеризация EGF-рецепторных комплексов и активация тирозинкиназы (ТК), локализованной в цитоплазматическом домене рецептора.

Активированные EGF-рецепторные комплексы скапливаются в окаймлённых клатрином ямках, которые после отшнуровывания от мембраны превращаются в так называемые ранние эндосомы. В большинстве случаев рецептор вступает на путь лизосомной деградации. Считается общепринятым, что EGF-рецепторные комплексы доставляются в лизосомы и в конечном итоге там деградируют (Huotari, Helenius, 2011). Необходимым условием взаимодействия с лизосомами является попадание грузов в поздние эндосомы - крупные пузырьки мультивезикулярной морфологии, или мультивезикулярные тела (МВТ). Поздние эндосомы возникают из ранних в ходе процесса, названного созреванием и связанного с постепенным изменением липидно-белкового состава эндосом. Это происходит как за счет рециклирования части эндосомной мембраны обратно в плазматическую, так и слияния эндосомы с везикулами, несущими вновь синтезированные грузы из транс-сети аппарата Гольджи. Доказано, что грузы, направляемые на деградацию, скапливаются в доменах эндосомы, обогащенных липидом Р1(3)Р, на основе которого далее формируются инвагинации, приводящие к формированию внутренних пузырьков (Hurley et al., 2010).

Для формирования зрелых МВТ с множеством внутренних пузырьков требуется существенное увеличение площади поверхности мембраны, что происходит благодаря многочисленным слияниям ранних эндосом друг с другом. Такие слияния одинаковых по мембранному составу везикул называются гомотипическими, в отличие от гетеротипических, в которых участвуют везикулы, происходящие из разных компартментов. В результате зрелые поздние эндосомы взаимодействуют с лизосомами, а груз, попавший во внутренние пузырьки МВТ, деградирует (Luzio et al., 2000). Очевидно, процесс слияния эндосом чрезвьнайно важен для правильного хода всего процесса. Кроме того, характерной чертой эндоцитозного пути является перемещение эндосом с периферии в околоядерную область, где локализовано большинство лизосом (Gao et al., 2010).

Таким образом, основными визуализируемыми событиями, происходящими в ходе эндоцитоза, являются слияния и перемещение эндосом. В настоящее время выявлено множество компонентов, регулирующих эти процессы. По современным представлениям вновь сформированные эндосомы сливаются напрямую друг с другом. В начале процесса на эндосому из цитоплазмы рекрутируются факторы дистанционного взаимодействия (tethers), которые узнают мембрану-мишень и заякоривают везикулы на расстоянии около 25 нм друг от друга (Gillingham, Munro, 2003). Это заякоривание в свою очередь позволяет вступить в игру входящим в состав мембраны белкам комплекса SNARE, которые сближают контактирующие везикулы до 5-10 нм, что в результате приводит к реорганизации бислоёв и, следовательно, слиянию везикул (Jahn, Scheller, 2006). Ключевым участником этого процесса является малая ГТФаза Rab5. Интересно, что Rab5 переходит в ГТФ-связанную форму при активации рецептора EGF. Активированная таким образом Rab5 рекрутирует Р13-киназу Vps34, которая формирует в мембране эндосомы PI(3)P-обогащенный участок (Platta, Stenmark, 2011). Полагают, что наличие этих двух компонентов создаёт основу для рекрутирования из цитоплазмы белка дистанционного взаимодействия ЕЕА1 (Early Endosomal Autoantigen 1), имеющего на С-терминальном конце домен связывания с Rab5 и FYVE-домен, который обеспечивает присоединение ЕЕА1 к Р1(3)Р-обогащённому участку мембраны (Simonsen et al., 1998).

Параллельно со слияниями везикул в ходе эндоцитоза происходит их перемещение в околоядерную область. После формирования ранние эндосомы переносятся с помощью «+»-концевых белков на динеин-динактиновый комплекс, связанный с микротрубочками (МТ) (Valetti et al., 1999). Снабжённые мотором эндосомы получают возможность перемещаться по МТ, организованным в большинстве типов клеток в радиальную систему с центром схождения в околоядерной области. Широко распространены представления о том, что эндосомы, используя МТ как рельсы, могут равномерно и однонаправленно перемещаться в эту

область. Основные данные, позволившие сформировать такие представления, получены с помощью подходов, в которых анализировали иммунофлуоресцентные изображения фиксированных клеток на разных стадиях эндоцитоза (Karylowski et al., 2004). Однако следует иметь в виду, что при этом мы наблюдаем лишь результирующую всех событий, которые происходили до момента фиксации.

Несмотря на обилие исследований в области регуляции эндоцитоза, существует ряд парадоксов, которые невозможно объяснить с точки зрения господствующих ныне представлений. Так, например, если эндосома действительно перемещается равномерно по МТ в направлении околоядерной области с помощью мотора динеина, то, даже учитывая его низкую процессивность, время перемещения должно занимать 510 мин (Kural et al., 2005), однако в реальности этот процесс занимает 30-60 мин. Неизвестно, с чем связано подобное замедление. Кроме того, анализ динамики количества эндосом на фиксированных препаратах показывает, что если, как это принято считать, слияния идут попарно, в ходе эндоцитоза за 60 мин происходит лишь 5-6 раундов слияний. Однако считается, что практически сразу после формирования ранних эндосом на них рекрутируются все вспомогательные белки, регулирующие слияния (Binder, Holzhütter, 2012). Остается неясным, с чем связано такое малое количество слияний и какого рода может быть сигнал, который заставляет эндосомы сливаться только в «разрешенные» моменты времени? Непонятно также, как скоординированы процессы слияния и перемещения в ходе эндоцитоза.

Основным постулатом теории слияния ранних эндосом является представление о том, что ключевой белок, обеспечивающий специфичность слияния ранних эндосом, ЕЕА1, ассоциируется с вновь сформированной эндосомой за счет рекрутирования из цитоплазмы. Однако как наши собственные, так и данные некоторых групп показывают, что вопреки существующим представлениям белок ЕЕА1 даже в условиях дефицита сывороточных факторов, стимулирующих эндоцитоз, выявляется в интактных клетках не в цитоплазме, а в составе везикул (Wilson et al., 2000). Многие авторы рассматривают их как эндосомы, сформировавшиеся до стимуляции эндоцитоза рецептора EGF или друшх используемых ими лигандов (Lawe et al., 2002), и продолжают считать, что именно цитоплазматический ЕЕА1 играет ключевую роль в новых раундах эндоцитоза. Все эти противоречия не находят до сих пор адекватного объяснения и позволяют предполагать, что организация и координация процессов слияния и перемещения эндосом в клетке в ходе эндоцитоза осуществляются способом, отличным от общепринятых представлений. Целью данной работы являлось выяснение механизмов слияния ранних эндосом и определение роли белка ЕЕА1 и цитоскелета в этом процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Описать поведение везикул, обогащенных аутоантигеном ранних эндосом ЕЕА1, при стимуляции эндоцитоза EGF-рецепторных комплексов и исследовать динамику взаимодействия ЕЕА1-везикул и рецептор-содержащих эндосом.

2. Охарактеризовать популяцию везикул, содержащих ЕЕА1.

3. Выявить роль цитоскелета в процессе ЕЕА1-зависимого слияния ранних эндосом.

4. Проанализировать в режиме реального времени процесс перемещения эндосом по МТ и их слияний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гомотопические слияния ранних эндосом происходят не напрямую, а опосредуются везикулами, обогащенными белком ЕЕА1.

2. ЕЕА1-зависимые слияния включают несколько последовательных стадий, связанных с формированием гибридных органелл со сложной доменной организацией, причём заключительной стадией является выделение (сегрегация) ЕЕА1-обогащенных доменов из гибридной эндосомы, содержащей рецептор EGF, и восстановление исходного пула ЕЕА1-везикул.

3. Одновременно с процессом ЕЕА1-зависимого укрупнения происходит и созревание эндосом (формирование мультивезикулярных тел).

4. Микротрубочки представляют собой необходимую платформу для слияний эндосом, тогда как актиновые структуры вовлечены в процесс сегрегации доменов гибридных везикул на более поздних стадиях эндоцитоза.

5. Микротрубочки в клетке представляют собой лабильную густую сеть, которая может как выполнять роль рельсов при мотор-зависимом перемещении эндосом, так и, напротив, затруднять это движение в силу пространственных ограничений. Характер перемещения эндосом и процессы их взаимодействий и слияний существенно отличаются от представлений, составленных на основе

анализа изображений фиксированных клеток. Можно говорить о том, что микротрубочки играют

модулирующую роль в регуляции процессов эндоцитоза.

Научная новизна работы

Данные, полученные в нашей работе, показывают, что гомотипическое слияние ранних эндосом происходит не напрямую за счет рекрутирования из цитоплазмы белка ЕЕА1, а опосредуются предсуществующими везикулами, обогащенными ЕЕА1. Таким образом, впервые сформулирована гипотеза о формировании гибридных ранних эндосом, что позволяет по-новому взглянуть на процесс биогенеза эндосомных компартментов. Впервые охарактеризованы субпопуляции ЕЕА1-положительных везикул. Впервые описаны стадии формирования гибридных органелл и продемонстрирована ведущая роль микротрубочек в оркестровке процессов слияния и сегрегации гибридных эндосом. Прижизненный анализ слияний и перемещений эндосом также значительно обновляет существующие в настоящее время представления о механизмах, обеспечивающих временную и пространственную динамику эндоцитоза.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты диссертации вносят существенный вклад в представления о том, как организованы и скоординированы процессы везикулярного транспорта. Понимание механизмов, лежащих в основе такого важного процесса, как эндоцитоз рецептора EGF, способного генерировать различные сигналы в зависимости от степени созревания рецептор-содержащих эндосом, могут быть полезны при выборе мишеней воздействия, поиске новых подходов при разработке терапевтических средств для лечения многих патологий, связанных с нарушениями работы EGF-рецепторной системы. Полученные результаты могут использоваться в материалах курсов по внутриклеточному транспорту.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи ситала (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), международной конференции ESF-EMBO symposium "Cell polarity and membrane traffic- (Испания, 2009), Международной конференции "Modem Microscopy Techniques in Biology and Medicine" (Санкт-Петербург 2009), II конференции молодых учёных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), международной конференции ESF-EMBO conference "Emergent Properties of the Cytoskeleton" (Испания, 2010), I всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет». (Санкт-Петербург, 2011), III конференции молодых учёных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012) и на III Съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург (2012).

Объём и структура диссертации

Диссертация включает введение, обзор литературы, постановку задачи, описание материалов и методов, результгцы исследования, их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий Z<?J наименований. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и проиллюстрированы /у рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток. В работе использовали клетки карциномы шейки матки человека HeLa, полученные из Европейской коллекции клеточных культур. Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-a-тубулин под контролем низкоэффективного промотора, - HeLaH5-1, любезно предоставлены О.В. Микитась (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова, РАМН, Москва), клетки эндотелия аорты свиньи (РАЕ АН), трансфицированные ппазмидой, кодирующей рецептор EGF, слитый с зеленым флуоресцирующим белком, получены от А.Д. Соркина (Питтсбургский университет, США). Клетки линии HeLa культивировали в среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия) с добавлением 8% фетапьной сыворотхи (РАА, Австрия) при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02. Клетки линии HeLa Н5-1 и РАЕ АН культивировали в аналогичных условиях в среде с добавлением антибиотика генетицина (G418) (Mediatechnic, США) в конечной концентрации 500 нг/мл. Клетки растили до 50-70% монослоя. Для экспериментов с иммунофлуоресцентным окрашиванием клетки выращивали на покровных стёклах размером 10x10 мм, помещенных в

чашки Петри. Для прижизненных съемок производили посев клеток на закрывающиеся камеры с тонким стеклянным дном (NunclonSurface, Дания).

Лиганды и их производные. В работе использовали рекомбинантный EGF (Sigma-Aldrich, США), рекомбинантный TGFa (R&B Systems Inc., США), в концентрации 50 нг/мл. В работе использовали квантовые точки (QDs) на основе SeCd, покрытые ПЭГ и функционализированные стрептавидином, с пиками эмиссии в зеленой (QD565) и красной (QD655) областях спектра (Invitrogen, Англия). Комплексы EGF-QDs формировали в инкубационной среде ДМЕМ, содержащей 0.1% БСА и 20 мМ HEPES, pH 7.4 (среда А). Для этого смешивали раствор биотинилированного EGF (Invitrogen, Англия), в концентрации 4 нМ, с раствором QDs, в концентрации 1 нМ, затем смесь инкубировали в пробирке в течение 30 мин при 4 °С, при постоянном покачивании.

Антитела. Для специфического выявления рецептора EGF использовали поликлональные антитела кролика, узнающие экстраклеточный домен рецептора EGF человека (Cell Signaling, США), малые ГТФазы Rab5 и Rab7 (Cell Signaling, США) в разведении 1:100. Монокпональные мышиные антитела (Mab) против а-тубулина и ацетилированного тубулина (Sigma-Aldrich, США) использовали в разведении 1:2000. Mab, узнающие ЕЕА1 (Transduction Lab, США), использовали в разведении 1:1000, а узнающие LAMP1 (Abeam, Англия) - в разведении 1:200. В качестве вторых антител использовали конъюгаты GAR-Alexa Fluor 568, GAM-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Англия), GAM-СуЗ (Jackson, США) в разведении 1:500. Антитела разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7.4), содержащем 1% БСА.

Стимуляция эндоцитоза. Исследование динамики эндоцитоза проводили в соответствии с двумя протоколами. В протоколе с предварительным связыванием лиганд инкубировали с клетками 60 мин при 4 °С для достижения равновесного связывания лиганда с рецепторами. После трехкратной отмывки PBS от несвязавшегося ростового фактора эндоцитоз стимулировали переводом клеток в несодержащую лиганда среду А (37 °С) на указанное время. При импульсной загрузке (второй протокол) лиганд добавляли непосредственно к клеткам, инкубируемым в среде А при 37 °С на 5 мин («пульс»). После трехкратной отмывки несвязавшегося лиганда теплым (37 °С) раствором PBS клетки переводили в среду А той же температуры, не содержащую лиганда, на указанное время. Эту же схему использовали для введения комплексов EGF, меченного квантовыми точками QD565 и QD655.

Обработка клеток ингибиторами и агентами, воздействующими на цитоскелет. Вортманнин (Sigma-Aldrich, США), ингибитор PI3K I и III класса, добавляли к клеткам в концентрации 100 нМ за 30 мин до добавления лиганда. Все дальнейшие инкубации (в том числе стимуляцию эндоцитоза) проводили при постоянном присутствии ингибиторов в инкубационной среде.

Для деполимеризации МТ клетки инкубировали в течение 30 мин при 37 °С в среде А, содержащей нокодазол (Sigma-Aldrich) в концентрации 20 мкМ, а для разборки актиновых микрофиламентов - цитохалазин Д (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 10 мкМ. Для разборки обоих типов цитоскелета использовали среду А, содержащую и нокодазол, и цитохалазин Д в указанных выше концентрациях. Все дальнейшие инкубации (в том числе стимуляцию эвдоцитоза) проводили при постоянном присутствии агентов в рабочей среде.

Электрофорез и иммуноблотинг. Электрофоретическое разделение белков лизата проводили в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в модификации Лэммли. Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocol (Amersham, Швеция). Для усиления сигнала использовали систему ECL (Amersham, Швеция).

Фракционирование в градиенте Перколла проводили по методу, описанному ранее (Корнилова и др., 1987). Этот метод позволяет разделить лизосомы (1-2-я фракции со дна пробирки), поздние эндосомы (3-6-я фракции) и частично перекрывающиеся с ними ранние эндосомы (4-8-я фракции). После выравнивания фракций по белку их смешивали с 5-кратным буфером Лэммли и проводили электрофорез и иммуноблоттинг, как описано выше.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. После окончания инкубации покровные стекла переносили в пластиковые чашки диаметром 35 мм, дважды промывали PBS, после чего фиксировали либо 4%-ным раствором формалина (Sigma-Aldrich, США) в PBS при комнатной температуре, либо фиксатором Г-Ф (PBS, содержащим 3% формалина, 0.25% Triton Х-100, 0.2% глутаральдегида) в течение 15 мин при 37 °С. После формалиновой фиксации клетки промывали 5 раз по 3 мин раствором PBS и обрабатывали 15 мин при комнатной температуре раствором PBS, содержащим 0.5% Тритон Х-100. После фиксации фиксатором Г-Ф клетки промывали 2 раза по 10 мин раствором PBS. Неспецифическое окрашивание блокировали инкубацией в PBS, содержащем 1% БСА, в течение 30 мин при комнатной температуре. С первыми AT клеш инкубировали ночь при 4 °С. Далее промывали 3 раза по 5 мин раствором PBS, содержащим 0.1% Tween-20 (BioRad, США). Инкубацию со вторыми AT проводили 30 мин при комнатной температуре в темноте. Потом промывали, как описано выше.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Распределение флуоресцентно меченых белков в клетках изучали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SL TCS SP5 (Zeiss, Германия). Использовали иммерсионные масляные объективы с увеличением 100.0x1.40 и 63.0x1.32. Зеленую флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (488 нм), красную - He-Ne лазером (543 нм). Флуоресценцию на разных длинах волн сканировали раздельно с помощью программы Leica Confocal Software. Плоскость сканирования

выбирали ниже ядра или в нижней его части, т.е. там, где локализуется основная масса эндосом и МТ в хорошо распластанных клетках HeLa и РАЕ АН. В отдельных случаях получали серии оптических срезов с шагом по оси Z в 500 нм (проекции максимальной яркости) для контроля адекватности результатов, получаемых при анализе одного среза.

Прижизненные наблюдения проводили с помощью Leica TCS SP5 (Zeiss, Германия) с использованием термостатируемой камеры. Регистрировали одиночные и серийные оптические срезы после стимуляции эндоцигоза в клетках. При съёмке в режиме реального времени (XYT) для основного массива изображений выбирали разрешение 1024x1024 пикселей, частоту сканирования 400-700 Гц. Интервал между съёмкой кадров составлял 1.5-3 с. Серии XYZ по оси Z состояли из 10-20 оптических срезов с шагом 0.5 мкм. Проводили 2- или 3-кратное усреднение по линиям.

Для съёмки с помощью «гибридной оптической системы» фотокамеру Салоп IXUS 950IS устанавливали с помощью штатива на окуляр конфокального микроскопа Leica TCS SP5. При этом флуоресценцию QDs и GFP-тубулина возбуждали источником УФ (люминисцентная лампа) с использованием фильтра 13. В данном случае, частота видеонабпюдения составила 30 кадров в секунду, а разрешение полученных изображений 600x480 пикселей. В процессе съемки использовали иммерсионный масляный объектив с увеличением 100.0x1.40.

Анализ и обработка изображений. Полученные изображения обрабатывали с помощью программ Leica Confocal Software (Zeiss, Германия) и ImageJ 1.40g (National Institute of Health, США).

Для оценки степени кластеризации везикул рассчитывали отношение площади целой клетки к площади, занятой везикулами, используя параметр «Area» функции «Measure» в программе ImageJ. Полученное отношение обозначали коэффициентом кластеризации Dclust, значение которого прямо пропорционально степени кластеризации.

Для оценки степени ацетилирования МТ использовали параметр «Area fraction» функции «Measure» в программе ImageJ. При этом рассчитывали отношение доли площади клетки, занятой сигналом с ацетилированного тубулина, к доле площади клетки, занятой сигналом с тотального а-тубулина при установленном пороговом значении интенсивности 70.

Для оценки колокализации использовали плагин JACoP для программы ImageJ (Boite, Cordeiieres, 2006). В расчёт брали коэффициент Мандерса М1, отражающий долю пикселей с красным сигналом, содержащих и зеленый сигнал, по отношению к общему сигналу с красного канала (Manders et al., 1993), и долю совпадений (число везикул с зелёной и красной флуоресценцией, нормированное на число везикул фасного цвета).

Оценку количества везикул на клетку и определение их кажущихся размеров проводили с помощью функции «Analyze particles», устанавливая соответствие между размером изображения, выраженным в пикселях, и его линейным размером с использованием функции «Set Scale». Затем выставляли пороговое значение интенсивности, исходя из максимального соответствия между исходным и обработанным (бинаризованным) компьютерным изображением.

Видеофайлы и анимированные изображения формата GIF создавали из серий изображений, полученных с помощью лазерной конфокальной микроскопии в результате обработки в программе ImageJ.

Для регистрации координат эндосом в пространстве и времени и построения их треков использовался плагин для ImageJ «Manual Tracker» (Fabrice Cordeli, Institut Curie, Orsay (France))

Математическая обработка данных по перемещению эндосом. Смещение эндосом во времени рассчитывалось по формуле: S=V(Xj-x¡)2-^yj-y¡)2, где x¡; y¡ — координаты эндосомы в момент времени t, a x¡; y¡ — координаты эндосомы в момент времени tj. Скорость перемещения везикул рассчитывалась как отношение величины смещения (S) в микронах к величине временного интервала (At= tj-t¡) в секундах V=S/Ât При анализе направленных перемещений координаты эндосом пересчитывались с целью переориентации их к центру схождения МТ.

Статистическая обработка данных. Каждый эксперимент проводили не менее 3 раз. Данные обрабатывали с использованием пакета анализа программы Microsoft Excel. В экспериментах по иммунофлуоресценции для анализа выбирали клетки с максимальной степенью распластывания, на краю или вне островков монослоя. Представленные изображения были характерны для большинства клеток в данных условиях. Для каждой временной точки просматривали от трёх до семи полей (15-30 клеток). На гистограммах указаны средние значения по результатам не менее 10 измерений -Ч- доверительный интервал (95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ЕЕА1-везикулы выявляются в клетках до стимуляции эндоцигоза. 5 настоящее время распространено представление о том, что ЕЕА1 до стимуляции эндоцитоза локализуется в цитоплазме и рекрутируется на мембрану эндосом при активации малой ГТФазы Rab5 вскоре после формирования первичной эндосомы с грузом. Предполагается, что основная роль ЕЕА1 состоит в узнавании и дистанционном заякоривании гомотипичных ранних эндосом на первой стадии слияния, чем обеспечивается возможность формирования SNARE-комплексов, опосредующих дальнейшее сближение мембран в процессе слияния. В силу этих представлений ЕЕА1 широко используется как маркер ранних эндосом. Оказалось,

однако, что этот белок и до стимуляции эндоцитоза (когда неакгивированный рецептор ЕвР находится только на плазматической мембране) выявляется в составе везикул (рис. 1), локализованных преимущественно в околоядерной области. При разрушении МТ нокодазолом ЕЕА1-везикулы уменьшаются в размерах и перераспределяются по всей клетке (рис. 2а). Таким образом, околоядерное позиционирование ЕЕА1-везикул поддерживается МТ.

Как уже упоминалось, ЕЕА1 способен связываться с мембраной эндосом за счёт Р13Р-обогащенных доменов. Вортманнин, подавляя активность Р13-киназы \Zps34, приводит к ликвидации этих доменов. 5 таких условиях мы наблюдаем резкое уменьшение размеров и яркости ЕЕА1-пузырьков и существенное повышение светимости цитоплазмы (рис. 26, 2в). Этот факт подтверждает, что подавляющее количество ЕЕА1 даже в отсутствие эндоцитоза локализовано в основном на мембранах везикул, а не в цитоплазме.

2. Поведение рецептор-содержащих эндосом и ЕЕА1-везикул при стимуляции эндоцитоза скоординировано. Если проследить судьбу этих везикул после стимуляции эндоцитоза, выясняется, что изменение локализации, размеров ЕЕА1-везикул, а также их числа происходит скоординированно с изменениями этих же параметров рецептор-содержащих эндосом. Действительно, уже на стадии предварительного связывания околоядерный пул ЕЕА1 рассыпается, а размеры ЕЕА1-везикул уменьшаются. Аналогичный эффект наблюдается и при импульсной стимуляции эндоцитоза, не связанной с разборкой МТ при холодовой инкубации. Часть везикул перераспределяется в подмембранное пространство и локализуется в непосредственной близости к зонам, обогащенным рецептором. Через 5-15 мин после стимуляции эндоцитоза мелкие ЕЕА1-везикулы, так же как и мелкие рецептор-содержащие зндосомы, локализуются преимущественно в подмембранной области (рис.3, 15'), однако часть ЕЕА1-везикул выявляется и в околоядерной области. К 30 минутам ЕЕА1-везикулы укрупняются и перераспределяются по направлению к ОЯО. Эндосомы также увеличиваются в размерах и смещаются от периферии к центру (кластеризуются). Количество и тех, и других везикул уменьшается (рис.3, 30'). Через 60 мин после стимуляции и ЕЕА1-везикулы, и рецептор-содержащие эндосомы выявляются в основном в ОЯО, при этом в большинстве экспериментов эндосомы либо не изменяют размеров, либо даже несколько уменьшаются, а количество их снижается (рис. 3, 60'). Этот факт, по-видимому, связан с тем, что после 30 минут, наряду с продолжающимися слияниями, начинается формирование МВТ за счёт инвагинаций внешней мембраны эндосомы, в результате её видимая площадь может уменьшаться. На более поздних этапах количество рецептор-содержащих везикул падает до минимума (несколько штук на клетку), что отражает доставку и последующую деградацию Е6Р-рецепторных комплексов в лизосомах, тогда как характер локализации ЕЕА1-везикул возвращается к исходному. Количественный анализ размеров и числа ЕЕА1-везикул и эндосом, а также степени их кластеризации в ходе эндоцитоза подтвердил, что, несмотря на то, что эти параметры не совпадают по абсолютному значению, характер их изменений сходен на промежутке от 15 до 60 мин (рис. 4).

3. ЕЕА1-везикулы колокапизуются с эндосомами на определённых стадиях эндоцитоза, формируя гибридные везикулы. Проанализировав динамику колокализации белков ЕЕА1 и ЕбРЯ, мы обнаружили, что часть ЕЕА1-везикул, преимущественно мелких, до стимуляции эндоцитоза локализованы непосредственно под мембраной, однако не колокализуются с рецептором. Стимуляция эндоцитоза переводом в среду температурой 37 °С приводит к резкому возрастанию колокализации, достигающей максимума через 30 мин, когда до 50% сипнала, соответствующего рецептору, совпадает с сигналом с ЕЕА1. К 60 мин колокализация снижается, практически исчезая к 90 мин.

При изучении совмещённых изображений с разных каналов мы выявили следующие характерные для каждого этапа эндоцитоза картины взаимодействия ЕЕА1- и рецептор-содержащих эндосом. На ранних стадиях (5-15 мин) выявляются всё еще относительно мелкие структуры, демонстрирующие желтую окраску, которую обычно трактуют как результат колокализации двух белков. Однако значительная доля везикул очевидно состоит из двух частей (содержащих рецептор и ЕЕА1-положительных), располагающихся рядом (рис. 56, 15'). Размер этих структур находится ниже уровня разрешения световой микроскопии (200 нм), поэтому мы не можем с уверенностью определить, имеем ли мы дело с двумя заякоренными, «спаренными» везикулами или со слившейся везикулой, ограниченной единой мембраной с четкой двухдоменной организацией. Однако, поскольку на более поздних стадиях эндоцитоза выявляются укрупненные везикулы, чья мембрана достоверно содержит несколько рецептор- и ЕЕА1 -положительных доменов (рис 56, 30'),

Рис. 1. ЕЕА1 выявляется на везикулах в интактных клетках НеЬа, инкубировавшихся в условиях дефицита ростовых факторов в течение 12 часов. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ЕЕА1. красная - ЕвРЯ.

контроль

нокодазол

вортманнин

ЕЕА1 .• -'.Л Юмкм .>* •-Л'-,1.:*

а-тубулйн к Ж Ш-і 10 МКМ 3

I

30 20 10 0

■ контроль ШШІ

■ вортманнин

ш

цитоплазма

везикулы

Рис. 2. Разборка МТ под действием нокодазола приводит к уменьшению размера ЕЕА1-везикул и их перераспределению к периферии клетки, а инкубация с вортманнином вызывает уход ЕЕА1 с везикул и его перераспределение в цитоплазму.

Иммунофлуоресцентное окрашивание (а. б): зелёная флуоресценция - ЕЕА1: красная - а-тубулин. синяя - ЭАР1. в -оценка содержания ЕЁА1 в цитоплазме и на везикулах при действии вортманнина, по оси ординат - среднее значение оптической плотности.

Рис. 3. Совместное перераспределение ЕЕА1-везикул и эндосом после стимуляции эндоцитоза.

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ЕЕА1. красная - ЕСЗРЯ.

можно утверждать, что первичные зндосомы и ЕЕА1-везикулы после начального контакта формируют гибридные зндосомы в результате слияния. Такие гибридные структуры затем могут сливаться как друг с другом, так, возможно, и с отдельными EGFR-содержащими, и с ЕЕА1-положительными везикулами. Через 30 мин после стимуляции эндоцитоза мы наблюдали дальнейшее укрупнение структур, содержащих и ЕЕА1, и рецепторную часть, причём форма и взаимное расположение доменов могла быть очень сложной. Диаметр таких везикул, как правило, достигает 1 мкм. Выявлялись и ещё более крупные структуры (до 4 мкм), в которых ЕЕА1 и рецептор были локализованы и внутри, и снаружи (рис. 56, 30'). Анализ фиксированных препаратов показывает, что гибридные структуры диаметром до 1 мкм, представляют собой пузырьки, объединённые одной мембраной с чётко определяемыми ЕЕА1- и рецептор-содержащими доменами, различным образом ориентированными по отношению друг к другу. На оптическом срезе их форма близка к форме круга. Однако более крупные структуры имеют в большинстве своём неправильную форму. Можно было бы предполагать, что такая неправильная форма поддерживается с помощью некоего специального механизма, однако с наибольшей вероятностью такие структуры могут представлять несколько гибридных эндосом, достапшх максимально возможного размера, заякоренных, но не объединённых общей мембраной.

Позднее (через 60-90 мин после стимуляции эндоцитоза) коэффициент колокализации значительно снижался (рис. 5а), и мы наблюдали отдельно существующие зндосомы и ЕЕА1-везикулы (рис. 56, 60'), расположенные рядом, но практически не перекрывающиеся. Таким образом, можно говорить о том, что на определённом этапе созревания эндосом при превращении ранних в поздние происходит исключение ЕЕА1-позитивных доменов мембраны ГИбрВДНОЙ зндосомы, при этом внутренние пузырьки остаются внутри зндосомы, органиченной рецептор-содержащей мембраной. В результате рецептор-содержащие зндосомы после сегрегации завершают процесс созревания в поздние зндосомы, становясь компетентными для взаимодействия с лизосомами, и восстанавливается пул независимых ЕЕА1-позитивных везикул, готовых вступить в ифу в следующем раунде стимуляции эндоцитоза.

4. На стадии максимальной колокализации ЕЕА1 и EGFR происходит формирование агрегатов эндосом.

Частично пролить свет на природу укрупнённых структур неправильной формы помогли прижизненные эксперименты, проведенные по схеме «pulse-chase-pulse", в которых эндоцитоз стимулировали при 37 °С добавлением EGF, меченным квантовыми точками (QD) с разными пиками эмиссий. В течение первых 5 мин клетки интернализовали EGF-рецепторные комплексы, связанные с QD565, которые затем отмывались. В результате формировались «зелёные» зндосомы. Через 5 мин после этого к клеткам добавляли EGF, связанный с QD655, что приводило к формированию «красных» эндосом. Зндосомы, формирующиеся через такой промежуток времени, являются гомотипическими, и способны сливаться друг с другом, что подтверждается появлением жёлтых эндосом. Именно такие везикулы мы наблюдали уже через 5 мин после окончания второго пульса. К 30 мин часть слившихся везикул формировала более сложные структуры неправильной формы с несколькими максимумами интенсивности флуоресценции EGF-QDs, которые соответствовали центрам везикул (рис. 6а). Съёмка в реальном времени показала, что эти структуры вели себя как агрегаты взаимозаякоренных круглых везикул: перемещаясь в пространстве как одно целое, они, тем не менее, меняли взаимное расположение максимумов интенсивности и общую форму (рис. 66), при этом отдельные везикулы могли покидать агрегат или присоединяться к нему.

Удобной моделью для проверки наших предположений являются клетки РАЕ All, экспрессирующие рецептор EGF, к С-терминапьному концу которого был пришит GFP (Carter, Sorkin, 1998). Необходимо отметить, что в этих клетках нарушено формирование мультивезикулярных эндосом, по-видимому, из-за GFP-тэга, который пришит к регуляторному домену белка, обеспечивающего нормальное прохождение процесса созревания эндосом. В результате оверэкспрессии конструкции также наблюдается постоянная интернализация и рециклирование неактивированного рецептора. Однако характер поведения ранних эндосом и ЕЕА1-везикул в этих клетках не отличался от того, что мы обнаружили на клетках HeLa. Тем не менее, поскольку формирование внутренних пузырьков из рецептор-содержащих доменов в этих клетках нарушено, мы наблюдали аномально крупные полые зндосомы, ограниченные мембраной, окрашенной GFP. Наличие таких крупных везикул (до 2.5-3 мкм в диаметре) позволило увидеть, что ЕЕА1 действительно формирует отдельные домены, характерные для гибридных эндосом (рис. 6г). Интересно, что при достижении гибридными везикулами размеров порядка 2.5 мкм в диаметре они начинают собираться в агрегаты, состоящие из 3-8 отдельных заякоренных друг с другом везикул. Эти агрегаты отчётливо

енение числа везикул

п EGFR dEEAI

^ Изменение объема везикул

Динамика кластеризации везикул □ EGFR

Рис. 4. Изменение размера, количества и кластеризации эндосом и ЕЕА1-везикул в ходе эндоцитоза. По

оси ординат указано число везикул на клетку (а), объем, куб. мкм (б). 0с1иэ1 (в): по оси абсцисс указано время (мин) после стимуляции эндоцитоза.

Колокализация EGFR и

ЕЕА1 в ходе эндоцитоза

0.5 п

15 30 45 60 75 90

Рис. 5. Динамика колокализации ЕЕА1 и ЕвРР. (а) Количественная оценка степени колокапизации по оси ординат - доля совпадений, по оси абсцисс - время (мин) после стимуляции эндоцитоза. (б) Структуры, образуемые ЕЕА1-везикулами и эндосомами на разных стадиях эндоцитоза - двойное иммунофлуоресцентное окрашивание ЕЕА1 - зелёная флуоресценция. ЕйРИ-красная

Рис. 6. Агрегаты эндосом. сформированных в клетках HeLa и РАЕ АН через 30' после стимуляции эндоцитоза. В клетках HeLa эндоцитоз стимулирован по схеме "pulse-chase-pulse" с помощью EGF связанного с QD565 (1 пульс) и QD655 (2 пульс): зелёная флуоресценция - QD565. красная флуоресценция QD655 (а), треки отдельных эндосом (центров яркости) в составе агрегата (б). В клетках РАЕ All агрегаты эндосом (в), отдельная эндосома (г), зелёная флуоресценция - GFP-EGFR, иммунофлуоресцентное окрашивание ЕЕА1 - красная флуоресценция, стрелками обозначены домены ЕЕА1.

выявляются как при прижизненной съёмке, так и на фиксированных препаратах (рис. 6в). Интересно, что везикулы в таких скоплениях прилегали друг к другу ЕЕА1-обогащенными доменами, а прижизненный анализ показал, что агрегаты формировали только эндосомы, содержащие EGF-QDs комплексы. Это может означать, (1) что агрегаты формировались из везикул, содержащих только активированный рецептор, и (2) что именно ЕЕА1-домен служит платформой, обеспечивающей заякоривание эндосом перед слиянием. Таким образом, сложные структуры, которые мы наблюдаем на фиксированных препаратах после стимуляции эндоцитоза, с наибольшей вероятностью являются агрегатами, формирующимися на определённой стадии процесса и характерными для разных типов клеток. Формирование агрегатов также свидетельствует о существовании механизма, контролирующего предельно допустимый размер гибридных эндосом, по достижению которого слияния блокируются, несмотря на продолжающееся заякоривание.

5. Характеристика ЕЕА1-позитивных везикул. При анализе изображений клеток, окрашенных антителами на ЕЕА1, бросается в глаза наличие двух типов везикул. Один представлен яркими, как правило, крупными, пузырьками, локализованными в ОЯО, тогда как другой состоит из мелких везикул с низким уровнем яркости. Количественный анализ числа, размеров и локализации двух популяций ЕЕА1 -везикул позволяет предполагать, что основную роль в поддержании слияний играют именно крупные, сильно декорированные белком ЕЕА1 везикулы.

В соответствии с существующими представлениями, ЕЕА1 не является трансмембранным белком, но имеет в своём составе два расположенных рядом домена, за счёт которых он может связываться с мембраной, RBD- и FYVE-домены. Переход малой ГТФазы Rab5 в активированное, ГТФ-связанное состояние, приводит к рекрутированию Rab5 на мембрану, привлечение туда же из цитоплазмы Р13-киназы Vps34 и возникновение Р13Р-обогащенного домена. В результате ЕЕА1 получает возможность использовать оба домена, так как RBD-домен отвечает за связывание с активированным Rab5, а FYVE-домен обеспечивает встраивание белка в Р1(3)Р-обогащенные участки мембраны (Lawe et al., 2002).

При анализе совместной локализации белков ЕЕА1 и Rab5 выяснилось, что степень колокализации этих белков при оценке доли совпадений была довольно высока, достигая 50%, и значимо не изменялась при стимуляции эндоцитоза рецептора EGF (рис. 7). Интересно, что активация EGFR способствует появлению ГТФ-связанного Rab5 на эндосомах (Tall et al., 2001). Важно подчеркнуть, что в клетках при этом выявлялись ЕЕА1-везикулы, не несущие Rab5, ЕЕА1-везикулы, содержащие Rab5, а также ВаЬ5-ггазитивные везикулы, не связанные с ЕЕА1. При подсчёте соотношения мелких и крупных ЕЕА1-везикул, ассоциированных с Rab5, оказалось, что именно крупные везикулы преимущественно содержат эту малую ГТФазу.

Контрольные клетки содержали в условиях дефицита ростовых факторов для минимизации конститутивного эндоцитоза. Однако в свете вышеизложенного ассоциация ЕЕА1 с мембранами везикул в этом случае должна свидетельствовать о наличии на этих везикулах активированных Rab5 и Vps34. Для того, чтобы это проверить, мы проанализировали распределение ЕЕА1 после обработки клеток ингибитором Pl(3)-киназы, вортманнином. Оказалось, что при таком воздействии практически весь ЕЕА1 выявляется в основном в цитоплазме, оптическая плотность которой существенно повышается (тогда как в контроле сигнал, опосредуемый ЕЕА1, в цитоплазме практически не детектируется), и в небольшом количестве очень мелких везикул (рис. 26). Этот факт подтверждает, что основной вклад в связь ЕЕА1 с мембраной осуществляется за счёт ассоциации FYVE-домена с PI(3)P, и позволяет предположить, что Rab5 на ЕЕА1-везикулах активирован. Механизм этой активации неясен.

Анализируя ход эндоцитоза в присутствии вортманнина (ингибитора Vps34), мы обнаружили, что основная доля белка ЕЕА1 выявляется в цитоплазме и лишь незначительная доля остаётся ассоциированной с небольшим количеством мелких везикул. При этом часть ЕЕА1-везикул через 15 мин после стимуляции эндоцитоза всё-таки локализуются совместно с формирующимися эндосомами, в составе двудоменных структур. Затем, через 30 мин возникают укрупнённые эндосомы, при этом ЕЕА1 в них выявляется в виде точечных доменов гораздо меньшего размера, чем в необработанных вортманнином клетках. В дальнейшем размер этих доменов незначительно увеличивается, что свидетельствует об участии мелких ЕЕА1-везикул в слияниях даже в отсутствие активности Р13-киназы. При этом общий размер ЕЕА1-содержащих структур возрастает за счёт увеличения доли рецептор-содержащего домена (рис.8), в частности, в связи с тем, что при действии вортманнина не формируются внутренние пузырьки мультивезикулярных тел (Железнова и др., 2001). Сегрегация эндосом и ЕЕА1-структур при действии вортманнина замедлена по сравнению с контрольной: даже через 90 минут после стимуляции эндоцитоза в

клетках выявляются гибридные эндосомы. По всей видимости, связывание ЕЕА1 с мембраной в этом случае обеспечивалось за счёт ЯЕЮ-домена, который взаимодействовал с активированным РаЬ5 на мембране эндосом. Это совпадает с данными о том, что повышенная экспрессия активированного ЯаЬ5 позволяет преодолеть отсутствие связывания ЕЕА1 через РУУЕ-домен (Ьаи^е е( а1., 2000). В нашем случае можно предполагать, что возможность ассоциации ЕЕА1 с мембраной в присутствии вортманнина поддерживается за счёт активации Р?аЬ5 рецептором ЕвР на эндосоме.

6. Роль цитоскелета в процессе эндоцитоза. В настоящее время имеется большое количество данных, подтверждающих участие МТ и моторных белков в перемещении эндосом от периферии клетки к околоядерной области в процессе эндоцитоза (боойэоп е( а1., 1997). Этот факт был подтвержден ранее и в нашей лаборатории. В частности, мы наблюдали, что эндосомы после стимуляции эндоцитоза в клетках локализуются на МТ, а при деполимеризации МТ нокодазолом не кластеризуются, что отражает отсутствие направленною перемещения к ОЯО. Таким образом, их роль в передвижении эндосом несомненна. Однако, как упоминалось ранее, если считать динеин-зависимое перемещение эндосомы по МТ равномерным, время её перемещения в околоядерную область должно занимать 5—10 мин (Кига! е1 а1„ 2005); тем не менее на это требуется от 30 до 60 минут. Этот факт свидетельствует, во-первых, о том, что перемещения по МТ носят более сложный характер. Во-вторых, можно предполагать, что участие МТ в эндоцитозе не ограничивается ролью «рельсов». Действительно, мы наблюдали, что в отсутствие МТ ЕЕА1-везикулы не только «рассыпаются» по клетке, но и уменьшаются в размерах, т.е. фрагментируются (рис. 2а). Следовательно, нельзя исключать участие МТ в регуляции процессов слияния везикул.

6.1. Микротрубочки как платформа для слияний ранних эндосом. Для проверки этой гипотезы мы проанализировали влияние нокодазола на формирование гибридных эндосом. Оказалось, что при разборке МТ наряду с отсутствием перемещений мы наблюдаем замедление слияний в процессе эндоцитоза. Самый первый этап слияния только что сформированной эндосомы с ЕЕА1-везикулой, то есть образование двудоменной структуры, происходит, как и в контрольных клетках. Однако ни формирование укрупнённых мультидоменных эндосом, ни сборка агрегатов не наблюдаются на протяжении всего времени эксперимента. Не происходит также и сегрегация ЕЕА1-обогащённых и рецептор-содержащих доменов (рис. 9). В результате степень колокализации ЕйРР и ЕЕА1 незначительно увеличивается при стимуляции эндоцитоза и остаётся неизменной в течение всего эксперимента за счёт присутствия двудоменных структур (рис. 10а). Мы проанализировали колокализацию ЕвЯ-содержащих структур с маркером, характерным для поздних эндосом и лизосом (1_атр1). Оказалось, что если в контроле колокапизация с 1АМР1-позитивными структурами постоянно повышается, то в отсутствие МТ уровень колокализации остаётся неизменно низким (рис. 106), не превышая базального уровня. Это позволяет говорить о том, что в отсутствие МТ происходит только первый этап слияний, и эндосомы в дальнейшем не созревают.

6.2. Роль ацетилирования МТ в процессе эндоцитоза. Известно, что МТ в клетках различаются по динамике своего плюс-конца. Высокодинамичные МТ постоянно претерпевают сборку/разборку с плюс-конца с периодом полужизни 5-15 мин, тогда как время полужизни стабильных МТ может составлять до нескольких часов (БахЬп е( а1., 1984; бипс^гееп е1 а!., 1994). Механизм стабилизации МТ не вполне ясен, но в соответствии с одним из предположений существенную роль в этом процессе может играть ацетилирование МТ - ковапентное присоединение ацетильного остатка к лизину 40 а-тубулина. Не исключено, однако, что высокий уровень ацетилирования является лишь следствием стабилизации. В любом случае уровень ацетилирования широко используют в качестве маркера стабильности МТ. Важно подчеркнуть, что картина ацетилирования МТ в клетке является результатом баланса работы ферментов ацетилтрансферазы и деацетилазы НОАС6 (21Ьегтап е( а1., 2009). Ингибирование деацетилазы НОАС6 приводит к полному ацетилированию всех МТ в клетке.

Оказалось, что в клетках Не1_а уровень ацетилирования МТ изменяется при стимуляции эндоцитоза. На начальных этапах эндоцитоза, когда должны происходить основные перемещения и слияния ранних эндосом за счёт ЕЕА1-везикул, ацетилированных МТ мало и эндосомы ассоциированы с неацетилированными, то есть высокодинамичными МТ (рис. 11а, 15'). Затем уровень ацетилирования возрастает, и через 60 мин большая часть МТ в околоядерной области уже ацетилирована. Именно там и локализуются поздние эндосомы (рис. 11а, 60'). Далее ацетилирование идёт на спад (рис. 116). На основании сравнения динамики ацетилирования МТ и взаимодействия ЕЕА1 с рецептор-содержащими эндосомами можно предполагать, что именно ацетилированные стабильные МТ являются платформой для сегрегации

а

V •

Рис. 7. Колокализация ЕЕА1 с КаЬ5 в интактных клетках. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ЕЕА1. красная - Р!аЬ5, окрашивание 0АР1 -синяя флуоресценция (а): динамика колокализации при стимуляции эндоцитоза: по оси ординат - доля совпадений, по оси абсцисс - время мин (б).

контроль вортманнин

маг

* ф <1 # ^ .1 Рис. 8. Формирование гибридных везикул в присутствии вортманнина через 60' после стимуляции эндоцитоза. Двойное иммуннофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ЕЕА1, красная - ЕС^Я. Стрелками обозначены ЕЕА1-домены.

15' 10 мкм < • 5 мкм

60' ЕЙ • « • - • .ч * • Ч • ф

нокодазол

15' "' 10 мкм » . • / .7 • » 5 мкм

6 О' .V. ..2 ' •• • • • і

нокодазола. Приведены совмещённые изображения. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. зелёная флуоресценция - ЕЕА1. красная - ЕвЯЯ_

Колокализация ЕйРІ? и ЕЕА1

Колокализация ЕЄРР и І.АМР1

15

30

45

60

Рис. 10. Влияние нокодазола на созревание эндосом. Динамика колокализации ЕЄРК ЕЕА1 (а) и маркера лизосом 1АМР1 (б) в контроле и при добавлении нокодазола. По оси ординат - коэффициент Мандерса. по оси абсцисс - время (мин), после стимуляции эндоцитоза.

ЕЕА1-везикул и созревающих эндосом и далее поддерживают гомотипические слияния поздних эндосом и их взаимодействие с лизосомами.

Как выяснилось, начало повышения уровня ацетипирования МТ совпадает со снижением фосфорилирования по тирозину рецептора ЕСР (рис. 11 в), что может свидетельствовать в пользу существования связи между двумя процессами. Одним из подходов для проверки этого предположения может быть сравнение динамики ацетилирования при стимуляции эндоцитоза двумя нативными лигандами рецептора ЕСР - ЕСР и ТС Ра. Последний, в отличие от ЕСР, вызывает преимущественное рециклирование рецептора, вследствие чего тот не достигает лизосом (рис. 12а). Кроме того, из-за ранней диссоциации ТвРа-и рецептора фосфорилирование последнего снижается гораздо быстрее, чем при действии ЭФР. Мы обнаружили, что уровень ацетипирования при действии ТвРа повышается в значительно меньшей степени, чем при стимуляции ЕСР (рис. 126). По-видимому, сигнал, приводящий к увеличению степени ацетилирования МТ, может генерироваться на эндосоме, достигшей определённой степени зрелости. Действительно, в последнее время в литературе появляются сообщения о регуляторной связи между рецептором ЕСР и НЮАСб. Так, была обнаружена обратная корреляция между скоростью деградации рецептора ЕСР и деацетилазной активностью. В клетках с уменьшенным с помощью э^МА-трансфекции количеством ШАС6 рецептор ЭФР также деградировал быстрее (ОепЬе е1 а1., 2009, ¿ао е{ а1., 2010). Однако конкретный механизм такого влияния до сих пор обсуждается.

6.3. Участие актиновых филаментов в процессах слияния в ходе эндоцитоза. Для оценки роли актиновых филаментов в регуляции слияния ранних эндосом клетки обрабатывали агентом, приводящим к деполимеризации актина, цитохалазином Д. В этом случае мы наблюдали образование укрупненных структур, в которых выявлялся и ЕСРК и ЕЕА1 уже через 15 мин после стимуляции эндоцитоза. Однако через 60 мин такие структуры достигали аномальных размеров (рис. 13а). При этом в таких структурах практически невозможно выделить центры яркости, что ставит вопрос о том формируются ли в отсутствие актиновых микрофиламентов (МФ) описанные ранее агрегаты. Существенная сегрегация доменов не наблюдалась даже через 90 мин после стимуляции эндоцитоза. Эти данные позволяют предполагать, что актиновые структуры обеспечивают выделение ЕЕА1-доменов из гибридных эндосом. Интересно, что степень колокализации ЕЕА1 и ЕвРИ в отсутствие актиновых филаментов была сравнима с контрольной и незначительно снижалась через 60-90 мин после стимуляции эндоцитоза, превышая, тем не менее, контрольные значения (рис. 136). Это согласуется с данными, полученными при исследовании эндоцитоза и характера колокализации рецептора трансферрина и рецептора ЭФР в присутствии латринкулина В (ОЬэбЫ е! а1., 2011). Когда актиновые филаменты были разобраны, рецептор ЭФР оставался колокализованным с рецептором трансферрина до 25 мин после стимуляции эндоцитоза, тогда как в контрольных клетках эти рецепторы выявлялись в разных компартментах. При этом влияния разборки актиновых филаментов на ранние стадии эндоцитоза и формирование ранних эндосом обнаружено не было. Авторы заключают, что актиновые филаменты участвуют в формировании и сегрегации рециклирующего тубулярного домена с везикулярной частью эндосомы. В нашем случае в результате сегрегации формировались везикулярные структуры, однако вполне возможно, что частично аномальное укрупнение гибридных эндосом на ранних стадиях обеспечивается и за счет подавления рециклирования части мембраны. Суммируя наши результаты и данные других авторов (йиггЬасЬ е( а1„ 1996; ОЬаэЫ е( а1„ 2011), можно предполагать, что на ранних стадиях актиновые филаменты вовлечены в сегрегацию рециклирующих доменов, тогда как на поздних они критичны для выделения ЕЕА1-доменов и сегрегации ЕЕА1-везикул и рецептор-содержащих эндосом.

Что же будет происходить, если разобрать в клетке и микротрубочки, и актиновые микрофиламенты? Оказалось, что при совместном действии цитохалазина Д и нокодазола эндосомы оставались на этапе формирования двудоменных структур, как при действии только нокодазола (рис. 9). Интересно, что характер изменения степени колокализации ЕЕА1 и ЕвРК был таким же (рис. 13а), то есть ни слияний, ни сегрегации двудоменных структур в отсутствие МТ и МФ не происходит.

Таким образом, роль МТ как платформы, необходимой для поддержания слияний с образованием мультидоменных структур, является первичной, тогда как актиновые микрофиламенты, участвующие в сегрегации и, возможно, в «запрете» слияний, вступают в игру уже после того, как эти слияния произошли и эндосомы достигли определенного размера. Интересно, что ЕЕА1-зависимые слияния поддерживаются в основном динамичными МТ, а процессы сегрегации ЕЕА1-везикул и ранних эндосом, дальнейшего созревания и слияния поздних эндосом происходят на стабильных околоядерных МТ.

' - .л - - 7 \

;. Л: ■ v л

Без ЭФР 20 мкм 15'

60' > * у.. И

О 15' 30'

60' 90' WB:

pEGFR яш — Ac-a-Tub . ^ а-Гиб + + EGF

Рис. 11. Изменение степени ацетилирования МТ при стимуляции эндоцитоза. Совместная локализация эндосом и ацетилированных МТ на раннем и позднем этапе эндоцитоза: двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ацетилированный а-тубулин. красная флуоресценция - ЕвРИ (а). Иммунофлуоресцентное окрашивание: красная флуоресценция - ацетилированный а-тубулин (б). Динамика фосфорилирования рецептора ЭФР и ацетилирования а-тубулина после стимуляции эндоцитоза (в).

WB: EGFR +EGF

170kDa —

+TGFa

170kDa —

Lys

Lys

LE

ЕЕ

LE

ЕЕ

Рис. 12. Динамика ацетилирования МТ при стимуляции эндоцитоза EGF и TGFa. Распределение рецептора EGF в градиенте Перколла через 60 мин после стимуляции эндоцитоза EGF и TGFa: Lys -лизосомальная фракция, LE-фракция поздних эндосом. ЕЕ-фракция ранних эндосом (а); изменение уровня ацетилирования МТ при стимуляции эндоцитоза EGF и TGFa: по оси ординат - отношение площади, занимаемой в клетке ацетилированным туоулином. к площади клетки, по оси абсцисс - время после стимуляции эндоцитоза. мин (б)

ЦитД

Нок+ЦитД

60' 60" >■ » ' '

в ч '» у ■ ' " '

/ \ / 10 мкм 10 мкм \

/ \ 1 ./Г* \

« # « » ' V

5 мкм • ♦ ■ * ■ * * • m « •

^локализация "контроль и

EGFR и ЕЕА1 -Цитохалазин

■ нокодазол

■ нокодазол+цитохалазин

15 30

60 90

Рис. 13. Колокализация ЕЕА1 и EGFR при действии агентов, разрушающих МТ и МФ. Образование гибридных везикул при действии цитохалазина Д (цит Д) и при совместном действии нокодазола и цитохалазина Д (нок+цитД) через 60' после стимуляции эндоцитоза. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: зелёная флуоресценция - ЕЕА1 красная - ЕйРР (а) Динамика колокализации ЕбРЯ и ЕЕА1 при стимуляции эндоцитоза в контроле и с разобранными МТ. МФ или и МТ, и МФ: по оси ординат - коэффициент Мандерса. по оси абсцисс - время (мин) после стимуляции эццоцитоза (б).

7. Прижизненные исследования процесса эндоцитоза в клетках.

Как мы уже упоминали выше, львиную долю информации о процессе эндоцитоза исследователи получают с использованием подходов, в которых анализируют иммунофлуоресцентные изображения фиксированных клеток (Karylowski et al., 2004). В нашем исследовании также в основном использовался такой подход. Однако на некоторые вопросы невозможно ответить без прижизненного анализа процессов, протекающих в клетке. Для таких наблюдений необходимо выбрать удобные флуоресцентные маркеры, а также подобрать микроскопическую технику, позволяющую получать изображения с высоким разрешением и частотой. В нашем распоряжении имелись уже упоминавшиеся клетки РАЕ АН, в которых экспрессирован рецептор EGF с GFP-тэгом. Несмотря на то, что процессы созревания эндосом в этих клетках нарушены, процессы слияния и перемещения протекают в них, как в клетках с нативным рецептором. Использование EGF, меченных QD, позволяет следить за судьбой эндосом, содержащих ЭФР-рецепторные комплексы. Высокие фотостабильность и квантовый выход QD делают возможным наблюдение в течение длительного времени в том числе за везикулами, содержащими низкое количество метки. Узкие пики эмиссии позволяют использовать одновременно несколько лигандов. Кроме того, для изучения перемещения по МТ оказалось очень удобным использовать клетки HeLa, в которых был экспрессирован химерный белок GFP-a-тубулин с низким уровнем экспрессии, - HeLa Н5-1. Анализ показал, что в этих клетках уровень ацетилирования МТ в контроле и его изменение при стимуляции эндоцитоза не отличался от наблюдаемого в нетрансфицированных клетках. Это позволяет нам считать, что динамические свойства МТ в клетках HeLa Н5-1 сравнимы с таковыми в клетках HeLa с нативным тубулином.

В качестве технического средства для наблюдений был использован лазерный сканирующий микроскоп, который позволял наблюдать за процессами в узком оптическом слое, однако частота кадров при такой съемке не превышала 1 кадра в 1,5-2 с. Для повышения частоты получений изображений мы воспользовались цифровой камерой, которая позволяет получать 30 кадров в секунду. При этом мы теряли «конфокальность» и линейное разрешение, однако использование именно такой системы позволило нам зарегистрировать чрезвычайно быстрые перемещения эндосом, а также детектировать группы координированно перемещающихся эндосом, образующих агрегаты.

7.1. Анализ перемещения эндосом по МТ. При анализе перемещений эндосом на фиксированных препаратах создаётся впечатление, что эндосомы транслоцируются в оклоядерную область по радиально расположенным МТ однонаправленно, равномерно и очень медленно. Действительно, время, необходимое для перемещения эндосомы от периферии клетки к ЦОМТ, на расстояние 10-30 мкм, составляет 30-60 мин. Однако известно, что средняя скорость мотора динеина, с помощью которого эндосома перемещается по МТ, составляет от 1,7 до 8 мкм/с (Kural et al., 2005; Nan et al., 2008). Используя традиционные подходы, объяснить это противоречие невозможно. Прижизненные исследования в клетках линии HeLaH5-1 показали, что система МТ представляет собой густую, запуганную трёхмерную сеть с высокой степенью локальной подвижности, несмотря на сохранение радиальной организации. Существенно, что МТ, колеблясь, могут изменять взаимное расположение в пространстве, уменьшая или увеличивая расстояния между соседними участками МТ случайным образом. Такая запутанная сеть может не столько способствовать перемещению эндосом, сколько создавать препятствия на их пути. Кроме того, поскольку МТ могут существенно искривляться, направление движения от минус-конца к плюс-концу не всегда совпадает с направлением от периферии к центру организации МТ. Проанализировав характер передвижения в такой сети эндосом, содержащих EGF-QD, мы обнаружили, что везикулы действительно используют МТ как рельсы, но при этом одинаковые по степени зрелости эндосомы могут перемещаться по одному и тому же пучку МТ в разных направлениях (рис. 14), а также изменять направление движения под любым углом, перескакивая с одной МТ на другую (рис. 15а). Кроме того, поскольку пересекающиеся МТ часто формируют «ячейки», эндосомы могут попадать в них и совершать там хаотичные движения, покрывающие относительно небольшую площадь (рис. 156). Мы наблюдали также , что эндосома, связанная с МТ, может резко менять своё положение в пространстве, оставаясь связанной с изгибающимся или перемещающимся участком самой МТ. Таким образом, характер перемещения эндосом по МТ далеко не так однороден, как представлялся при оценке фиксированных препаратов. Проанализировав перемещения эндосом в реальном времени, мы выделили два типа: быстрые направленные пробеги (со скоростью выше 0,3 мкм/с, что соответствует динеин-зависимым перемещениям; King, Schroer, 2000) и хаотичное ненаправленное движение в пределах небольшой области (треки таких частиц представлены на рис. 15). Оказалось, что через 10-

30 мин после стимуляции эндоцитоза доля времени, в течение которого эндосомы совершали быстрые направленные перемещения, была значительно выше таковой на более поздних стадиях, однако не превышала 7% времени наблюдения за эндосомой (7 мин). Важно подчеркнуть, что даже эти быстрые перемещения на дальние расстояния (>10 мкм) не всегда были направлены в сторону околоядерной области (рис. 15а). Тем не менее, поскольку движение эндосом определяется минус-концевым мотором динеином, в результате мы наблюдаем кластеризацию эндосом в ОЯО, однако время, затрачиваемое на достижение этой области, существенно возрастает по сравнению с ситуацией, в которой эндосома равномерно и беспрепятственно перемещается по прямой МТ.

В условиях деполимеризации МТ ни быстрых перемещений, ни хаотичных движений в пределах ограниченной области не наблюдалось. Эндосомы «топтались» на месте в примембранной области.

Повышение частоты получения изображений до 30 кадров в секунду позволило нам детектировать очень быстрые (2 мкм/с) перемещения эндосом при стимуляции эндоцитоза в клетках HeLa. Кроме того, при такой частоте съемки оказалось, что эндосомы перемещались на дальние расстояния в 2 раза чаще (27% быстрых перемещений по сравнению с 13% при конфокальной съёмке), а треки передвижения эндосом были более детализированы.

7.2. Прижизненные наблюдения за слияниями эндосом. Изучение фиксированных препаратов не даёт нам ответа на вопрос, каким образом соотносятся процессы слияния и перемещения эндосом. На основе количественной оценки фиксированных препаратов мы можем судить о слияниях лишь по изменению количества и кажущегося размера эндосом, выявляемых при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток. Такой анализ показывает, что через 15 мин после стимуляции эндоцитоза в клетке в среднем наблюдается 80-100 эндосом, тогда как через 60—90 мин остаётся 6-8 (рис. 4). Таким образом, за всё время эксперимента происходит всего 3-4 попарных слияния. Это позволяет предполагать, что существуют какие-то определенные условия или моменты времени, когда слияния «разрешены», тогда как в остальное время они «запрещены». Учитывая существующие представления о регуляции слияний, все компоненты фьюзогенной машинерии должны наличествовать на мембране ранней эндосомы (Jozic, 2012). Однако в рамках этой парадигмы трудно представить механизм подобной регуляции.

Наблюдая за процессом эндоцитоза в реальном времени в клетках РАЕ All, мы обнаружили, что характер перемещения эндосом в этих клетках сходен с таковым в клетках HeLa, экспрессирующих GFP-a-тубулин. Оказалось, что слияния происходят в основном между одинаковыми по размеру эндосомами преимущественно тогда, когда они вовлечены в хаотичное движение по ограниченной области (рис. 16) Однако слияния могли происходить и в результате быстрого направленного перемещения, при этом в «пробеге» участвовала мелкая эндосома, поглощавшаяся крупной, относительно неподвижной везикулой. Важно подчеркнуть, что количество контактов эндосом было на порядок больше, чем следует из подсчета уменьшения числа эндосом, полученного из анализа фиксированных препаратов. Оказалось, что большая часть контактов не заканчивалась слиянием. Интересно, что даже если в результате сближения и контакта не происходило полное слияние эндосом, довольно часто наблюдался обмен частью материала. В некоторых случаях при формировании контакта из одной эндосомы к другой вытягивалась тубула, образованная мембраной одной из везикул, участвующих в слиянии.

Таким образом, даже наличие готовой к слиянию машинерии не является гарантией того, что процесс слияния везикул дойдет до конца. В этом смысле можно говорить о том, что разрешенные слияния носят вероятностный характер, что справедливо и для перемещений.

Использование EGF, меченного QD565 и QD655 по схеме «pulse-chase-pulse», позволило проанализировать динамику слияний по увеличению числа эндосом с желтой флуоресценцией. Несмотря на то, что этот подход дает заниженную частоту слияний, количество детектируемых жёлтых везикул увеличивалось со временем. Оказалось также, что при стимуляции эндоцитоза в присутствии нокодазола в течение 30 мин наблюдались лишь единичные везикулы, содержащие оба маркера. Это ещё раз подтверждает зависимость слияния гомотипических ранних эндосом от присутствия интактных МТ в клетке.

Подводя итог, можно сказать, что слияния гомотипических ранних эндосом так же, как и их перемещения, носят вероятностный характер. Далеко не каждый контакт эндосом заканчивается их слиянием, однако может происходить частичная передача материала от одной эндосомы к другой. Контактов и слияний везикул в клетке значительно больше, чем это представляется при анализе фиксированных препаратов. Причины, снижающие эффективность слияний не вполне ясны, однако можно сделать

Ос 3 мкм Зс / 6с Ajfff У1 9с / /

12 с / Ж 15 с & Jt\ 18 с Л / 21 с . / t"

Рис. 14. Передвижение эндосом вдоль прямого участка МТ. Красный цвет - ЕСР-СЮ655: серый -искусственно окрашенный (ВРР-тубулин. Обозначено время после начала съёмки. Стрелками разного цвета показано направление движения двух эндосом.

\ |

■Й

О рш 25

Рис. 15. Характер перемещения эндосом на разных стадиях эндоцитоза. Представлены результирующие треки перемещения эндосом в интервале 30-37 мин после стимуляции эндоцитоза (а): 40-47 мин после запуска эндоцитоза.

I I

• ' Ой* * > ■ ■ 5 мкм Ю'<* ■ 0 15с* Ж • • 20. с • 25 с4* ж • 35 с" -ф* • • • • \

45 .с«» 1 , • 60 с* -V - 70 с 80 с' •. V 85 с • « • ♦ • ' 90 с " f' * • • « •

Рис. 16. Слияние эндосом в клетках РАЕ All в ходе эндоцитоза, стимулированного QD655-EGF. Красная флуоресценция - эндосомы с QD655-EGF. зелёная - GFP-EGFR Обозначено время после начала съёмки. Стрелками обозначены сливающиеся эндосомы.

некоторые предположения. Во-первых, может происходить нарушение заякоривания уже сблизившихся эндосом в результате случайного изменения положения МТ, с которыми они связаны. Во-вторых, до сих пор неизвестно, с каким именно доменом на мембране-мишени (ЕЕА1-обогащенным или рецептор-содержащим) предпочитает связываться внешний, N-концевой участок ЕЕА1, сидящего на везикуле-партнёре. Очевидно, существенную роль может играть взаимное расположение доменов двух гибридных везикул, готовых к слиянию, и их «неправильная» взаимная ориентация в момент контакта может препятствовать слиянию.

На основании полученных данных мы предлагаем следующую схему организации и координации процессов слияния эндосом в клетке в ходе эндоцитоза, в которой везикулы, обогащенные ЕЕА1, выступают в роли посредников, предоставляющих свою мембрану в качестве платформы для слияний эндосом, содержащих фуз (рис. 16).

Выводы

1. ЕЕА1, белок, регулирующий первую стадию гомотопического слияния эндосом (заякоривание, или tethering), не рекрутируется из цитоплазмы на мембрану эндосом, формирующихся при стимуляции эндоцитоза, а локализован преимущественно на мембране предсуществующих в клетке везикул.

2. Ранние эндосомы, содержащие рецептор EGF, сливаются не напрямую, а опосредованно через формирование гибридных органелп с ЕЕА1-везикулами. Гибридные органеллы поддерживают доменную структуру.

3. Формирование гибридных эндосом проходит через ряд последовательных стадий, завершающихся сегрегацией ЕЕА1-содержащих везикул и мультивезикулярных рецепгор-содержащих эндосом. В результате исходный пул ЕЕА1-везикул восстанавливается. Процесс слияний, опосредуемых ЕЕА1-везикулами, и последующая сегрегация необходимы для созревания эндосом.

4. Несмотря на снижение ассоциации ЕЕА1 с мембраной и уменьшение размеров ЕЕА1-везикул при подавлении активности Р13-киназы под действием вортманнина, ЕЕА1-везикулы сохраняют способность формировать гибридные органеллы.

5. Микротрубочки не только обеспечивают перемещения эндосом, но и поддерживают слияния гибридных органелп, тогда как актиновые микрофиламенты необходимы для их сегрегации.

6. Густая подвижная сеть МТ может как обеспечивать, так и затруднять линейные перемещения эндосом. Эндосома в результате перемещается с периферии в околоядерную область, т.к. общий суммарный вектор динеин-зависимых перемещений направлен к центру организации МТ, однако время, затрачиваемое на этот процесс, оказывается весьма значительным. В целом, роль микротрубочек в организации перемещений эндосом можно охарактеризовать как модулирующую.

7. Контакты между везикулами происходят постоянно, однако наиболее часто они оказываются безрезультатными, но могут также заканчиваться частичным обменом материала. Полное слияние является более редким событием.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зпобина М.В., Харченко М.В., Латкин Д.С. Корнилова Е.С. Ацетилирование микротрубочек в ходе эндоцитоза рецептора эпидермального фактора роста (с-ЕгЬВ1) в интерфазных клетках линии HeLa. Цитология. 2010; 52(6): 46В-476.

2. Злобина М.В., Харченко М.В., Корнилова Е.С. Применение полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) в исследовании эндоцитоза лиганд-рецепторных комплексов. 2009. Рецепция и внутриклеточная сигнализация (сборник статей), С. 714-718.

3. Харченко М.В., Злобина М.В., Корнилова Е.С. Реорганизация тубулинового цитоскелета под действием эпидермального фактора роста связана с промежуточными фипаментами и созреванием эндосом. 2009. Рецепция и внутриклеточная сигнализация (сборник статей), С. 100-104.

4. Харченко М.В., Злобина М.В., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. Характер реорганизации радиальной системы микротрубочек в клетках HeLa с различной динамикой эндоцитоза. Тезисы докладов и сообщений, представленные на II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург (16-19 октября). 2007. Цитология. 49 (9): 803.

5. Kornilova E.S., Zlobina M.V., Kharchento M.V. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. 33rd FEBS Congress. 2008. Abstracts: 253.

6. Zlobina M., Kharchenko M., Kornilova E. Asymmetry of microtubules remodeling during EGF receptor endocytosis in

20

Рис. 16. Действующая и предлагаемая схемы организации и координации процессов слияния эндосом в клетке в ходе эндоцитоза. МТ - микротрубочки. МФ - актиновые микрофиламенты

HeLa cells. 2009. Abstracts of ESF-EMBO symposium "Cell polarity and membrane traffic": 127.

7. Zlobina M4 Kharchenko M., Kornilova E. Microtubule acetyiation during endocytosis of EGF in HeLa cells. Abstracts of International conference "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", Санкт-Петербург (9-10 ноября). 2009. Program book: 32.

8. Злобина M.B., Харченко M.B., Латкин Д.С., Корнилова Е.С. Изменение свойств микротрубочек в ходе эндоцитоза лиганд-рецелторных комплексов в интерфазных клетках HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на Школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цигоскелета и путей передачи сигнала, Санкт-Петербург (17-18 ноября). 2009. Цитология. 52(3): 260.

9. Злобина М.В., Харченко М.В., Корнилова Е.С. Эндоцитоз нативных лигандов рецептора сЕгМ, ЭФР и ТФРа вызывает ацеталирование микротрубочек. Тезисы II конференции молодых учёных Института цитологии РАН (15-16 февраля). 2010. Цитология. 52(6): 496.

10. Шкляева М.А., Стеблянко Ю.Ю., Корнилова Е.С., Злобина М.В. Влияние ингибиторов PD98059 и U0126 на изменение свойств микротрубочек в ходе эндоцитоза лиганд-рецелторных комплексов в клетках HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на I всероссийскую конференцию «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет». 2011. Цитология. 53(9): 720-721.

11. Злобина М.В., Корнилова Е.С. Внутриклеточная судьба рецептора коррелирует с динамикой ацетилирования микротрубочек в клетках HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на I всероссийскую конференцию «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет». 2011. Цитология. 53(9): 703.

12. Злобина М.В., Стеблянко Ю.Ю., Корнилова ЕС. Институт цитологии РАН. Участие рецептора ЭФР в регуляции ацетилирования микротрубочек в ходе эндоцитоза. Тезисы III конференции молодых учёных Института цитологии РАН (15-16 мая). 2012. Цитология. 54(4): 341-342.

Список цитированной литературы Железноеа Н.Н, Никольский Н.Н., Корнилова ЕС. 2001. Цитология. 43 (2): 156-165. Корнилова Е.С., СоркинАД., Никольский Н.Н. 1SS7. Цитология. 29(8): 904-910. Binder В., Holzhûtter H.-G. 2012. Cell biochemistry and biophysics, 63(1), 59-71. Boite S., Cordelières F.P. 2006. Journal of microscopy, 224(Pt 3), 213-232. Carter R.E, Sorkin A. 1998. The Journal of biological chemistry, 273(52), 35000-35007. Coursodon C.F., Dvorak В. 2011 Current opinion in pediatrics, 24(2), 160-164. Deribe Y.L, Wild P., Chandrashaker A., Curak J, Schmidt M.H.H., Kalaidzidis Y, Milutinovic N., Kratchmarova /, Buerkle L, Fetchko M., Schmidt P, Kittanakom S., Brown K.R., Jurisica I., Blagoev В., Zerial M, Stagljar U Dikic I. 2009. Science signaling, 2(102), ra84. Dunbach A., Louvard D, Coudrier E. 1996. Journal of cell science, 109( Pt 2), 457-465. Gao Y., Hubbert C.C, Yao T.-P. 2010. The Journal of biological chemistry, 285(15), 11219-26. Gillingham AK, Uunro S. 2001 Biochimica et biophysica acta, 1641(2-3), 71-65. Goodson H.V., Valetti C, Kreis T.E 1997. Current opinion in cell biology, 9(1), 18-28. Gundersen G.G., Kim I., Chapin C.J. 1994. Journal of cell science, 107(Pt 3), 645-659. Huotarl J, HeleniusA. 2011. The EMBO journal, 30(17), 3481-3500. Hurley J.H., Boura E, Carlson L A., Rôzycki В. 2010. Cell, 143(6), 875-887. Jahn R, Scheiler RH. 2006. Nature reviews. Molecular cell biology, 7(9), 631-643. Jozic /., Sallba S.C., Barbieri MA 2012. Archives of biochemistry and biophysics, 525(1), 16-24. Karylowski O, ZelgererA, Cohen A, McGraw T.E 2004. Molecular biology of the cell, 15(2), 870-882. King S.J., Schroer ТА 2000. Nature cell biology, 2(1), 20-24. /Сига/ C„ Kim H, Syed S., Goshima G„ Gelfand V.I., Selvin P.R. 2005. Science (New York, N.Y.), 308(5727), 1469-1472. Lawe D.C., Chanta /4, Merithew E, Dumas J, Cairington №, Fogarty K, Lifshitz L, Tuft Я, Lambright D., Corvera S. 2002. The Journal of biological chemistry, 277(10), 8611-8617. Lawe D.C. Part/ V., Heller-hamson R, Lambright D., Corvera, S. 2000. The Journal of Biological Chemistry, 275(5), 3699-3705. Luzio J.Pn Rous B„ Bright N.. Pryor P.R, Mullock В. H., Piper R. C. 2000. Journal of cell science, 113(Pt 9), 15151524. Manders EMM., Visser A. E, Koppen Д, De Leeuw W.C., Van Liere R., Brakenhoff G J, Van Driel R. 2003. Chromosome research: an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology, 11(5), 537-547. Nan X., Sims PA, Xie X.S. 2008. Chemphyschem: a European journal of chemical physics and physical chemistry, 9(5), 707-71Z Ohashi E, Tanabe K, Henmi У., Mesaki K, Kobayashi Y, Takei К 2011. PloS one, 6(5), e19942. Platta H.W., Stenmark H. 2011. Current opinion in cell biology, 23(4), 393-403. Saxton W.M., Stemple D.L, Leslie R.J, Salmon ED., Zavortink M, Mcintosh J.R. 1984. The Journal of cell biology, 99(6), 2175-2186. SimonsenA, Lippé R, Christoforidis S, GaullierJ. M., BrechA, Callaghan J., TohB.H., Murphy C., Zerial M„ Stenmark H. 1998. Nature, 394(6692), 494-498. Valetti C„ Wetzel D.M, Schrader M, Hasbani M.J., G ill S.R., Kreis Т.Е., Schroer TA 1999. Molecular biology of the cell, 10(12), 4107-4120. Wilson J.M., De Hoop M., Zora N„ Toh B.H., Dott C.G., Parton R.G. 2000. Molecular biology of the cell, 11(8), 2657-2671. Wolff M., TetzlaffK, Nivens M.C., Schneider F-J., Jung B, Hohlfeld J., Heilker R. 2011. Experimental cell research, 317(1), 42-50. Zilberman Y., Ballestrem C, Carramusa L, Mazitschek R, Khochbin S., BershadskyA 2009. Journal of Ceil Science, 122 (Pt 19), 3531-3541.

Подписано в печать 05.03.2013 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 109

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Злобина, Мария Владимировна, Санкт-Петербург

Институт цитологии РАН

На правах рукописи

Мария Владимировна

ЗЛОБИНА

ГОМОТИПИЧЕСКИЕ СЛИЯНИЯ РАННИХ ЭНДОСОМ: РОЛЬ БЕЖА СЛИЯНИЙ ЕЕА1 И ЦИТОСКЕЛЕТА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор бИ0Л0ГИЧЄ™т™ waw

Корнилова Елена Сергеевна

Санкт-Петербург

2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 5

1. ВВЕДЕНИЕ 6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1. Везикулярный транспорт 10

2.2. Регуляторные компоненты основных стадий транспортного процесса 12

2.2.1. Малые ГТФазы и их эффекторы 12

2.2.2. Окаймления 13

2.2.3. ЯаЬ-белки и их эффекторы 18

2.2.4. Б^ЛЯЕ-система 19

2.3. Общая характеристика эндоцитозного пути 23

2.3.1. Типы эндоцитоза, пути интернализации, основные компартменты эндоцитозного пути 23

2.3.2. Основные гипотезы организации эндоцитозного пути 25

2.4. Основные механизмы и белки, организующие эндоцитозный путь 29

2.4.1. Механизм слияния ранних эндосом 31

2.4.2. Белки и белковые комплексы, определяющие вступление грузов на путь деградации (ЕБСЯТ). Физиологический смысл формирования внутренних пузырьков МВ 33

2.5. Участие цитоскелета в эндоцитозе 36

2.5.1. Типы цитоскелета 36

2.5.1.1. Актиновыемикрофиламенты (МФ) 36

2.5.1.2. Промежуточные филаменты (ПФ) 38

2.5.1.3. Микротрубочки 38

2.5.1.3.1. Белки, ассоциированные с МТ 40

2.5.1.3.2. Посттрансляционные модификации тубулина 41

2.5.2. Роль цитоскелета в позиционировании органелл 44

2.5.3. Роль цитоскелета как средства перемещения. Моторы, ассоциированные с МТ 45

2.5.3.1. Кинезины 46

2.5.3.2. Динеины 47

2.5.3.3. Подходы, используемые для определения скоростей

моторных белков 48

2.6. Регуляция эндоцитоза ЕСЕ-рецепторных комплексов 51

2.6.1. Рецептор ЕСР, структура, функция 51

2.6.2. Механизмы регуляции эндоцитоза рецепторов ЕСР 52

2.7. Эндоцитоз и сигнализация 55

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57

3.1. Культивирование клеток 57

3.2. Лиганды и их производные 57

3.3. Антитела 58

3.4. Стимуляция эндоцитоза 58

3.5. Обработка клеток ингибиторами и агентами, воздействующими на цитоскелет 58

3.6. Электрофорез и иммуноблотинг 59

3.7. Фракционирование в градиенте Перколла 59

3.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 59

3.9. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 59

3.10. Анализ и обработка изображений 60

3.11. Математическая обработка данных по перемещению эндосом 61

3.12. Статистическая обработка данных 62

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 63

4.1.ЕЕА1 везикулы выявляются в клетках до стимуляции эндоцитоза 63

4.2. Поведение рецептор-содержащих эндосом и ЕЕА1-везикул при стимуляции эндоцитоза скоординировано 63

4.3. ЕЕА1-везикулы колокализуются с эндосомами на определённых стадиях эндоцитоза, формируя «гибридные» везикулы 65

4.4. На стадии максимальной колокализации ЕЕА1 и ЕСЕЫ происходит формирование агрегатов эндосом 67

4.5. Характеристика ЕЕА1-позитивных везикул 71

4.6. Роль цитоскелета в процессе эдоцитоза 74

4.7. Микротрубочки как платформа для слияний ранних эндосом 77

4.8. Роль ацетилирования МТ в процессе эндоцитоза 77

3

4.9. Участие актиновых филаментов в процессах слияния в ходе эндоцитоза 80 4.11 Разработка методов прижизненного наблюдения 80

4.10. Прижизненные исследования процесса эндоцитоза в клетках 84

4.10.1. Анализ перемещения эндосом по МТ 84

4.10.2. Прижизненные наблюдения за слияниями эндосом 87

5. ОБСУЖДЕНИЕ 92

6. ВЫВОДЫ 100

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

8. БЛАГОДАРНОСТИ 115

Список сокращений

АО -аминокислотные остатки AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

МВТ - мультивезикулярное тело

МВЭ - мультивезикулярные эндосомы

МТ - микротрубочки

МФ - актиновые микрофиламенты

ОЯ - окаймленная ямка

ОЯО - околоядерная область

ПМ - плазматическая мембрана

ПФ - промежуточные филаменты

РЭ - ранние эндосомы

ЦОМТ - центр организации микротрубочек

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

AAA-domein - ATPases Associated with cell Activities

AP - Adaptor Proteins

COP - coat protein

ECL - Enhanced Chemiluminescence

ECV - endocomal carrier vesicles

EEA1 - Early Endosome Antigen 1

EGF - Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста)

EGFR - EGF Receptor (рецептор ЭФР)

ER - endoplasmic reticulum

ERGIC - ER-Golgi intermediate compartment

ESCRT - endosomal sorting complex required for transport

FYVE - Fab 1, YOTB, Vac 1 and EEA1 (zinc finger domain)

GAP - GTPase-activating protein

GEF - Guanin-nucleotide Exchange Factor

GFP - green fluoresceTe protein

GGA - Golgi-associated, gamma adaptin

MAP - microtubule associated protein

NSF - N-ethylmaleimide-sensitive factor

РАЕ - Porcine aortic endothelial cells

PH - Pleckstrin Homology

PRD - Proline Rich Domain

PX - rhox Homology

RBD - Raf-like Ras-binding domain

SH - Src Homology

SNAP - soluble NSF attachment protein SNARE - SNAP receptor SNX - Sorting nexins

TGN - trans Golgi network (транс-Гольджи-сеть)

TK - тирозин-киназа

UIM - ubiquitin interacting motif

DMEM - Dulbecco modified medium

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

QDs - квантовые точки

1. ВВЕДЕНИЕ

Эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста (EGF) вовлечён в регуляцию множества клеточных событий, включая передачу сигнала, клеточную миграцию, апоптоз и др. Нарушения процесса эндоцитоза способны приводить к развитию тяжелых патологий (Coursodon, Dvorak, 2012; Wolff et al., 2011). Именно поэтому на протяжении нескольких десятилетий рецептор-опосредованный эндоцитоз EGF привлекает внимание множества исследователей. В общем виде этот процесс начинается на цитоплазматической мембране, где происходит связывание лиганда с его рецептором, димеризация EGF-рецепторных комплексов и активация тирозинкиназы (ТК), локализованной в цитоплазматическом домене рецептора.

Активированные EGF-рецепторные комплексы скапливаются в окаймлённых клатрином ямках, которые после отшнуровывания от мембраны превращаются в так называемые ранние эндосомы. В большинстве случаев рецептор вступает на путь лизосомной деградации. Считается общепринятым, что EGF-рецепторные комплексы доставляются в лизосомы и в конечном итоге там деградируют (Huotari, Helenius, 2011). Необходимым условием взаимодействия с лизосомами является попадание грузов в поздние эндосомы - крупные пузырьки мультивезикулярной морфологии, или мультивезикулярные тела (МВТ). Поздние эндосомы возникают из ранних в ходе процесса, названного созреванием и связанного с постепенным изменением липидно-белкового состава эндосом. Это происходит как за счет рециклирования части эндосомной мембраны обратно в плазматическую, так и слияния эндосомы с везикулами, несущими вновь синтезированные грузы из транссети аппарата Гольджи. Доказано, что грузы, направляемые на деградацию, скапливаются в доменах эндосомы, обогащенных липидом Р1(3)Р, на основе которого далее формируются инвагинации, приводящие к формированию внутренних пузырьков (Hurley et al., 2010).

Для формирования зрелых МВТ с множеством внутренних пузырьков требуется существенное увеличение площади поверхности мембраны, что происходит благодаря многочисленным слияниям ранних эндосом друг с другом. Такие слияния одинаковых по мембранному составу везикул называются гомотипическими, в отличие от гетеротипических, в которых участвуют везикулы, происходящие из разных компартментов. В результате зрелые поздние эндосомы взаимодействуют с лизосомами, а груз, попавший во внутренние пузырьки МВТ, деградирует (Luzio et al., 2000). Очевидно, процесс слияния эндосом чрезвычайно важен для правильного хода всего процесса. Кроме того, характерной чертой эндоцитозного пути является перемещение эндосом с периферии в околоядерную область, где локализовано большинство лизосом (Gao et al., 2010).

Таким образом, основными визуализируемыми событиями, происходящими в ходе эндоцитоза, являются слияния и перемещение эндосом. В настоящее время выявлено множество компонентов, регулирующих эти процессы. По современным представлениям вновь сформированные эндосомы сливаются напрямую друг с другом. В начале процесса на эндосому из цитоплазмы рекрутируются факторы дистанционного взаимодействия (tethers), которые узнают мембрану-мишень и заякоривают везикулы на расстоянии около 25 нм друг от друга (Gillingham, Munro, 2003). Это заякоривание в свою очередь позволяет вступить в игру входящим в состав мембраны белкам комплекса SNARE, которые сближают контактирующие

везикулы до 5-10 нм, что в результате приводит к реорганизации бислоёв и, следовательно, слиянию везикул (Jahn, Scheller, 2006). Ключевым участником этого процесса является малая ГТФаза Rab5. Интересно, что Rab5 переходит в ГТФ-связанную форму при активации рецептора EGF. Активированная таким образом Rab5 рекрутирует Р13-киназу Vps34, которая формирует в мембране эндосомы Р1(3)Р-обогащенный участок (Platta, Stenmark, 2011). Полагают, что наличие этих двух компонентов создаёт основу для рекрутирования из цитоплазмы белка дистанционного взаимодействия ЕЕА1 (Early Endosomal Autoantigen 1), имеющего на С-терминальном конце домен связывания с Rab5 и FYVE-домен, который обеспечивает присоединение ЕЕА1 к Р1(3)Р-обогащённому участку мембраны (Simonsen et al., 1998).

Параллельно со слияниями везикул в ходе эндоцитоза происходит их перемещение в околоядерную область. После формирования ранние эндосомы переносятся с помощью «+»-концевых белков на динеин-динактиновый комплекс, связанный с микротрубочками (МТ) (Valetti et al., 1999). Снабжённые мотором эндосомы получают возможность перемещаться по МТ, организованным в большинстве типов клеток в радиальную систему с центром схождения в околоядерной области. Широко распространены представления о том, что эндосомы, используя МТ как рельсы, могут равномерно и однонаправленно перемещаться в эту область. Основные данные, позволившие сформировать такие представления, получены с помощью подходов, в которых анализировали иммунофлуоресцентные изображения фиксированных клеток на разных стадиях эндоцитоза (Karylowski et al., 2004). Однако следует иметь в виду, что при этом мы наблюдаем лишь результирующую всех событий, которые происходили до момента фиксации.

Несмотря на обилие исследований в области регуляции эндоцитоза, существует ряд парадоксов, которые невозможно объяснить с точки зрения господствующих ныне представлений. Так, например, если эндосома действительно перемещается равномерно по МТ в направлении околоядерной области с помощью мотора динеина, то, даже учитывая его низкую процессивность, время перемещения должно занимать 5-10 мин (Kural et al., 2005), однако в реальности этот процесс занимает 30-60 мин. Неизвестно, с чем связано подобное замедление. Кроме того, анализ динамики количества эндосом на фиксированных препаратах показывает, что если, как это принято считать, слияния идут попарно, в ходе эндоцитоза за 60 мин происходит лишь 5-6 раундов слияний. Однако считается, что практически сразу после формирования ранних эндосом на них рекрутируются все вспомогательные белки, регулирующие слияния (Binder, Holzhiitter, 2012). Остается неясным, с чем связано такое малое количество слияний и какого рода может быть сигнал, который заставляет эндосомы сливаться только в «разрешенные» моменты времени? Непонятно также, как скоординированы процессы слияния и перемещения в ходе эндоцитоза.

Основным постулатом теории слияния ранних эндосом является представление о том, что ключевой белок, обеспечивающий специфичность слияния ранних эндосом, ЕЕА1, ассоциируется с вновь сформированной эндосомой за счет рекрутирования из цитоплазмы. Однако как наши собственные, так и данные некоторых групп показывают, что вопреки существующим представлениям белок ЕЕА1 даже в условиях дефицита сывороточных факторов, стимулирующих эндоцитоз, выявляется в интактных клетках не в цитоплазме, а в составе везикул

(Wilson et al., 2000). Многие авторы рассматривают их как эндосомы, сформировавшиеся до стимуляции эндоцитоза рецептора EGF или других используемых ими лигандов (Lawe et al., 2002), и продолжают считать, что именно цитоплазматический ЕЕА1 играет ключевую роль в новых раундах эндоцитоза. Все эти противоречия не находят до сих пор адекватного объяснения и позволяют предполагать, что организация и координация процессов слияния и перемещения эндосом в клетке в ходе эндоцитоза осуществляются способом, отличным от общепринятых представлений.

Целью данной работы являлось выяснение механизмов слияния ранних эндосом и определение роли белка ЕЕА1 и цитоскелета в этом процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Описать поведение везикул, обогащенных аутоантигеном ранних эндосом ЕЕА1, при стимуляции эндоцитоза EGF-рецепторных комплексов и исследовать динамику взаимодействия ЕЕА1 -везикул и рецептор-содержащих эндосом.

2. Охарактеризовать популяцию везикул, содержащих ЕЕА1.

3. Выявить роль цитоскелета в процессе ЕЕА1-зависимого слияния ранних эндосом.

4. Проанализировать в режиме реального времени процесс перемещения эндосом по МТ и их слияний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гомотипические слияния ранних эндосом происходят не напрямую, а опосредуются везикулами, обогащенными белком ЕЕА1.

2. ЕЕА1-зависимые слияния включают несколько последовательных стадий, связанных с формированием гибридных органелл со сложной доменной организацией, причём заключительной стадией является выделение (сегрегация) ЕЕ AI -обогащенных доменов из гибридной эндосомы, содержащей рецептор EGF, и восстановление исходного пула ЕЕА1-везикул.

3. Одновременно с процессом ЕЕА1-зависимого укрупнения происходит и созревание эндосом (формирование мультивезикулярных тел).

4. Микротрубочки представляют собой необходимую платформу для слияний эндосом, тогда как актиновые структуры вовлечены в процесс сегрегации доменов гибридных везикул на более поздних стадиях эндоцитоза.

5. Микротрубочки в клетке представляют собой лабильную густую сеть, которая может как выполнять роль рельсов при мотор-зависимом перемещении эндосом, так и, напротив, затруднять это движение в силу пространственных ограничений. Характер перемещения эндосом и процессы их взаимодействий и слияний существенно отличаются от представлений, составленных на основе анализа изображений фиксированных клеток. Можно говорить о том, что микротрубочки играют модулирующую роль в регуляции процессов эндоцитоза.

I

Научная новизна работы

Данные, полученные в нашей работе, показывают, что гомотипическое слияние ранних эндосом происходит не напрямую за счет рекрутирования из

цитоплазмы белка ЕЕА1, а опосредуются пред существующими везикулами, обогащенными ЕЕА1. Таким образом, впервые сформулирована гипотеза о формировании гибридных ранних эндосом, что позволяет по-новому взглянуть на процесс биогенеза эндосомных компартментов. Впервые охарактеризованы субпопуляции ЕЕА1-положительных везикул. Впервые описаны стадии формирования гибридных органелл и продемонстрирована ведущая роль микротрубочек в оркестровке процессов слияния и сегрегации гибридных эндосом. Прижизненный анализ слияний и перемещений эндосом также значительно обновляет существующие в настоящее время представления о механизмах, обеспечивающих временную и пространственную динамику эндоцитоза.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Везикулярный транспорт.

Основным предметом настоящего исследования являются некоторые аспекты регуляции везикулярного транспорта, процесса, привлекавшего пристальное внимание исследователей в течение последних 30 лет. В результате в этой области уже к концу 90-х годов сложились основные представления относительно механизмов формирования транспортных пузырьков, регуляции слияния мембран, переноса пузырьков от одного компартмента к другому. Однако в последние годы интерес к этим проблемам вновь возрождается, поскольку достижения клеточной биологии позволяют говорить о том, что везикулярный транспорт в гораздо большей степени вовлечён в процессы регуляции и интеграции внутриклеточных событий, чем представлялось ранее.

В связи с этим мы сочли необходимым дать краткий обзор существующих представлений о том, как регулируется везикулярный транспорт и каковы основные проблемы, связанные, в частности, с таким транспортным путём, как эндоцитозный.

Под везикулярным транспортом подразумевают перенос макромолекул от одного компартмента к другому с помощью мембранных везикул. Молекулами-грузами (или карго) могут быть мембранные или мембранно-связанные белки и липиды, тогда как белки и липиды, характерные для определенного компартмента, называются резидентными.

Основные функции везикулярного транспорта состоят в высокоточной доставке грузов в пункты их конечного назначения. Механизмы регуляции везикулярного транспорта достаточно консервативны у всех эукариот, поскольку этот процесс является одним из базовых, необходимых для биогенеза внутриклеточных компартментов и поддержания постоянного специфического для каждого компартмента состава мембран, делающего возможным выполнение функций, свойственных каждому компартменту. Кроме того, везикулярный транспорт является критичным для реализации ряда функций организма в целом, поскольку участвует в коммуникациях между клетками, внутриклеточной сигнализации и т.д. Такие важные процессы, как синаптическая передача или фагоцитоз, были бы невозможны без везикулярного транспорта. К настоящему времени накопилось множество