Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Динамика микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки"
На правах рукописи УДК.581.176:581.8:576.35
Шамина Наталия Владимировна
ДИНАМИКА МИКРОТРУБОЧКОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ХОДЕ ДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Новосибирск 2004
Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории ультраструктуры клетки, г. Новосибирск.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук,
профессор
Высоцкая Л. В.
Новосибирский государственный университет
Доктор биологических наук,
лрофессор
Богданов Ю. Ф.
Институт общей генетики РАН. Москва
Доктор биологических наук,
профессор
Захаров И. К.
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет
Защита диссертации состоится 2004 г. на утреннем
заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10. Тел. (3832) 33-31-17, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. FAX: (3832) 33-12-78
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан <5~2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Груздев А.Д.
Актуальность проблемы. Фундаментальным биологическим процессом, осуществляемым цитоскелетом, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно своим изменяющимся функциям на каждой стадии деления. Растительная клетка отличается от животной многообразием структур цитоскелета, сменяющих друг друга в ходе клеточного цикла. Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (Goddard et al., 1994). В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. В клетках высших цветковых растений центросома не идентифицирована в качестве морфологической структуры. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов деления эукариотной клетки была предложена еще Т. Бовери (Boveri, 1901) и активно поддержана Д. Мэзия. Мэзия предложил для растительной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, линейно соединенных между собой гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомной структуры в растительной клетке - дело будущего и зависит от развития методов цитологического анализа (Mazia, 1987). Существует противоположная точка зрения на регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых (МТ) пучков в различные конфигурации посредством активности ассоциированных с ними белков (Smirnova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.
Согласно современным представлениям, для регуляции динамики цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: микротрубочкоорганизующие центры (МТОЦ), - служащие в качестве затравки для полимеризации микротрубочек. В животных клетках МТОЦ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений МТОЦ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1993). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют собой важнейшую нерешенную проблему в клеточной биологии (Маге, 1997; Baluska et al., 1998).
Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и гипотезой самосборки, актуальной является задача детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. До сих пор это не было сделано по причине деполимеризации микротрубочкового цитоскелета на некоторых переходных стадиях цикла.
Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.
Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма информативный способ решения разнообразных задач клдтПЧНПЙ К
сожалению, до сих пор использование моЬс^^гижэдтлЗДНДвфй в
. 1 библиотека 1
цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993, Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект - изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или к апомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999). Третий аспект использования клеточных аномалий для решения цитологических задач - анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних,- предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et al., 1997; Binarova et al., 1998)
Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрытые в норме. Полностью нарушая или искажая взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают роль этих структур в таком взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалий используется в анализе Заранее предсказать, какую именно новую информацию удастся получить в результате такого анализа, невозможно. Может быть, поэтому этот подход до сих пор не используется в изучении структурного аспекта внутриклеточных процессов. Тем не менее, он имеет ряд существенных достоинств, главные из которых — высокая эффективность, методическая простота, а также возможность получить информацию, недоступную для других цитологических методов исследования. Мы назвалиэтотподход морфологическойдиссекцией.
Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны (десятки микрон в диаметре), легко доступны, многочисленны, синхронизованы по стадиям деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений могут быть получены в большом количестве. Нарушениями мейотического деления характеризуются отдаленные гибриды, аллоплазматики, гаплоиды, полиплоиды, анеуплоиды и, конечно же, обширная коллекция мейотических мутантов, известная у высших растений (Kaul, 1988). Легкая асинхронность между мейоцитами по длине пыльника позволяет проследить кратковременные переходные этапы каждой стадии мейотического деления. В настоящее время для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки в качестве модели используются клетки различных типов протопласты, эндосперм, меристематические вакуолизированные и лишенные вакуолей, дифференцирующиеся и так далее. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью. Цикл цитоскелета в ходе мейотического деления МКП практически не отличается от такового в митотическом делении бесстеночных клеток, например, эндосперма - классической модели для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки (Smirnova, Bajer, 1998).
Главные переходные стадии перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки не были описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологичском уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукариотной клетки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических основ регуляции цикла микротрубочкового цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие морфологически идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне.
Для выполнения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки, а именно:
- создать обширную коллекцию аномалий различной этиологии по мобильным стадиям мейотического деления у различных видов однодольных и двудольных растений, учитывая существующие различия в ходе мейотического деления у видов с последовательным и одновременным цитокинезом;
- разработать варианты методов визуализации микротрубочкового цитоскелета - как традиционных, так и иммуноокрашивания,-оптимапьных для работы с материнскими клетками пыльцы и адекватных поставленным задачам.
2. Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований со всеми переходными стадиями.
3. Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.
4. Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет - для выяснения цитоскелетых механизмов мейотической реституции.
5. На основе полученных данных составить каталог аномалий веретена деления растительной клетки
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований: морфологическая диссекция, представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке впервые представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. Впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных центральных и кинетохорных фибрилл веретена. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Предложена модель временной регуляции
цитокинеза. Впервые описаны 13 цитоскелетных механизмов мейотической реституции у видов однодольных и двудольных растений. Описаны 24 новые аномалии анастрального веретена в дополнение к 3, известным ранее в литературе. Внесен существенный вклад в понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.
Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как естественная полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения и апомиксис. Составленный каталог аномалий растительного веретена деления, подавляющую часть которого составляют аномалии, описанные впервые, представляет большую ценность при анализе морфологического фенотипа мейотических мутаций, особенно у сложных для цитологического анализа объектов, таких, например, как арабидопсис. Полученные в настоящей работе сведения о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки используются для чтения лекций по цитологии и цитогенетике в Новосибирском и Санкт-Петербургском государственных университетах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Когрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гг, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г.), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на I Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 200з), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Публикации. По теме работы опубликовано 24 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы,
6 глав результатов исследований, обсуждение результатов, заключение и
перспективы, выводы и список литературы. Работа изложена на 278 страницах машинописного текста, содержит 30 сводных рисунков, 28 схем и 1 таблицу. Список литературы включает 423 источника.
Материал и методы
Таблица 1. Формы с аномальным мейозом, использованные для выявления нарушений цикла цитоскелета в делении материнских клеток пыльцы.
Отдаленные гибоиды злаков F1 Фоомы с аномальным мейозом v
Triticum aestivum х Elytrigia elongatum: Иртышанка 10 х №15 Кормовая 128 х №15; СП718х№15 E.elongatum к T.aestivum: №15 х Лютесценс 132 Triticum durum х Bytrigia elongatum: Алмаз х №15; Алтайка х №15 Алтайская нива х №15 Triticum dicoccum х Е. elongatum (Г.М. Серкжов, ОмГАУ) Triticum aestivum х A. glaucum: АНК26-А х №260-8; АНК260-А х №257-7; АНК9 х №257-7; АНК9 х №52-3; АНК15 х №257-7 Новосибирская 67 х №13-1 Новосибирская 67 х №20 Новосибирская 67 х №52-3 Новосибирская 67 х №260-8 Новосибирская 67 х №257-7) Апьбидум 114 х №3 (A M. Орлова, ИЦиГСО РАН) СП718х№7 (Г.М. Серюков, ОмГАУ) Т. aestivum с. Саратовская 29 х S. cereale с Онохойская (АИ.Щапова, ИЦиГ СО РАН) T.palmovae xT.aestivumc.Tnp\e Dirk; Т. fenvginea х S. cereale, с. Онохойская (Н.П. Гончаров, ИциГ) Мейотические мутации v видов видов двудольных растений
Линия СОАН-112 Beta vulgaris (С.Г. Вепрев, ИЦиГСО РАН). Линия В-24 Beta vulgaris (С. И. Малецкий, ИЦиГСО РАН). Гаплоиды Brassica juncea Rajat. (Я. Кестерс, PRI, Нидерланды). Medicago sativa от 4п до 8п (Е. В.Дейнеко, ИЦиГ СО РАН). Клоны картофеля Solanum tuberosum L. CD1015, CD1045, СЕ 10, ВЕ62, ВЕ1050,{ М. Раманна, WUR); RH95-237-03, RH95-237-06, RH95-237-14; RH95-273-20; RH96-2013-03, HZ94DTA, НЕ096-959, 96-2013 (P.XeTTeH„WUR, Нидерланды). Трансгенные стерильные клоны катофеля S. tuberosum CD29.14, CD29.21;CD29.22,CD29.23, CD29.26, CR29.09.CR29.10.CR29.18, CR29.19, В92.7015.НВ29-12, НВ29.17, R29.02, R29.03.R29.10,Х12.02,Х12.04,6486.0 4 .(К. Хейтинг, WUR, Нидерланды). Трансгенные стерильные линии Nicotiana tabacum Res47, Res73, Res79, Res91, 10.8, 121.57, 121.83, 121.86,121.92,- (ЕВ. Дейнеко. ИЦиГ) Аллотриплоиды S. tuberosum x L esculentum x L pennellii (X. ван Экк, WUR, Нидерланды) Естественный апомикт Arabis holboelli (К. Бутелье .PRI, Нид-ды) Межвидовые гибриды картофеля F1: Solanum tuberosum с. Kathadin х Solanum fure}a\ Solanum tuberosum с. Chippewa x Solanum fureja, (K. Коничелла, Неапол. ун-т, Италия). Томатно-картофельные гибриды L Esculentum х S. tuberosum . , Lesculentum х S. commersonii (Д. Хайхен, WUR, Нидерланды) Мейотические мутанты v видов
однодольных растений ms28, divergent spindle (dv), me/025, pam1, ms43 Zea mays - (ВИР им. Н.И. Вавилова); meiW Seeale cereale -<С.П. Соснихина, С-Петербургский Университет). Прочие сЬоомы Моносомная линия пшеницы Triticum aestivum L. с. Мильтурум 553 по хромосоме 1А (А.Н. Жарков, (СибНИИСХоз, Омск). Аллоплазмат. линия СуАНКИА [Т. astivum с. Новосибирская 67 х S.cereale, (С.Ф. Коваль, ИЦиГ) Триплоиды вороньего глаза Paris quadrifolia (А.А Козлова, ТГУ) Гаплоиды Zea mays в различных линиях (Э.Р. Забирова, КНИИСХ)
двудольных растений ms3, ms2, as1, as2, as3, as4, as5, as7, dsyl, dsy3 Pisum sativum, c. Dippes Gelbe Victoria (Nordic Gene Bank, Ainarp, Швеция), as6 L esculentum (X. де Йонг, WUR)
В скобках поименованы авторы коллекций, любезно предоставившие материал для исследования
Всего нами изучено 254 различных генотипа с аномальным мейозом, а также их дикий тип или родительские формы. Материал охватывает 19 видов однодольных и двудольных растений, относящихся к 7 семействам
Методы исследования. Для цитологического анализа материнских клеток пыльцы (МКП) применяли все известные в настоящее время методы визуализации цитоскелета традиционные (по Навашину, оптика Номарского), иммуноокрашивание на а- и р- тубулин и электронную микроскопию Во всех трех группах методов нами были разработаны варианты, оптимальные для работы с МКП
Результаты
Вариабельность и консервативность цикла цитоскелета в мейозе высших растений
В исследованных 254 различных генотипах с аномальным мейозом нами было обнаружено 39 типов аномалий цикла цитоскелета и сопряженных с ним процессов карио- и цитокинеза
Два основных препятствия в изучении цикла цитоскелета в ходе деления растительной клетки - это отсутствие морфологически идентифицируемых центросомальных структур и деполимеризация цитоскелета на некоторых переходных стадиях цикла, в результате чего он становится недоступен для наблюдения. Деполимеризация происходит главным образом в профазе - ранней прометафазе, когда осуществляются важнейшие процессы перехода от интерфазной конфигурации цитоскелета к веретену деления. С этой точки зрения большой удачей оказалось обнаружение в исследованном материале форм, в которых деполимеризации цитоскелета на этих стадиях не происходит. Мы назвали эти формы девиантными Под девиацией мы подразумеваем такое отклонение от дикого типа, при котором изменяются некоторые характеристики изучаемого процесса, но сам процесс происходит нормально, то есть формируются, сменяют друг друга и нормально функционируют все системные структуры цитоскелета, и деление клетки происходит само по себе нормально. По нашим данным, этот девиантный путь может осуществляться спонтанно в небольшой части МКП в мейозе тех видов, у которых преобладает деполимеризация цитоскелета в профазе. Девиация цикла цитоскелета, заключающаяся в отсутствии его деполимеризации в профазе/прометафазе, весьма характерна для мейотического деления в МКП отдаленных гибридов первого поколения- она наблюдалась в 100% МКП в 40 изученных нами различных генотипах ППГ F1. Кроме того, мы обнаружили, что цикл цитоскелета без деполимеризации в профазе/прометафазе осуществляется в 100% МКП в мейозе дикого типа у пырея удлиненного (Bytrigia elongatum). Девиации являются ценным инструментом цитологического исследования, поскольку прямо, а не косвенно выявляют неизвестные характеристики изучаемого процесса Ранее такой материал для анализа цикла цитоскелета не использовался
Детальный цитологический анализ нормального, девиантного и множества аномальных вариантов цикла цитоскелета в изученном материале показал высокую консервативность этого процесса в мейозе у высших растений Во всех проанализированных нами фенотипах цитоскелет проходит (или проходит частично в блокирующих аномалиях) единообразную последовательность перестроек из одной системы в другую Подавляющее большинство аномалий
цикла цитоскелета встречаются в мейозе у различных видов и форм, что показано в таблице 2.
Таблица 2. Количество генотипов с определенными аномалиями цитоскелетного цикла, выявленное в различных группах исследованных растений. В столбце «прочие» объединены трансгенные, полиплоидные, анеуплоидные, аплоплазматические, гибридные растения, а также линии и клоны.
Фенотип Пшенично-пырейные гибриды П ® 3 X — У л I § ■и а Мутанты Гаплоиды Прочие* фенотип X >5 О О. л ¿С £ ? х о. 11 Пшенично-ржаные гибриды Р1 Мутанты Гаплоиды I Прочие*
Девиация <50%МКП 43 4 7 1 17 Разомкнутое веретено 2 2
Блок перемещения радиальных пучков цитоскелета 2 Нарушение пространствен ной организации фрагмолласта 1 5
Автономное перинуклеарное кольцо 2 1 Дивергентное веретено 11 3 2 1 8
Прямой тангенциальный пучок в профазе 1 Митотическое веретено в мейозе 3 1
Деформированное перинуклеарное кольцо 2 Гипертрофиров энное веретено 3 2
Общее кольцо 5 3 3 Автономное веретено 5 1
Слившиеся кольца 1 Отсутствие клеточной пластинки 7 1 1
Нарушение входа МТ в зону бывшего ядра 2 Чрезмерный цитокине з 1 1 1
Сохранение перинуклеарного кольца на более поздних стадиях деления 4 «Комета», монополярое расхождение хромосом в биполярном веретене 3 1 1 1
С-образное веретено 52 6 7 4 5 Нарушение движения фрагмолласта 1 1
Б-образное веретено 12 3 2 5 Диады с деформацией 1
дочерних мембран
Комбинированное веретено 3 1 1 Туннельный цитокинез 9 4 2
Отсутствие кинетохорных МТ 4 1 2 2 Отсутствие фрагмопласта 4 2 1
Нарушение формирования центральных фибрилл веретена 2 2 1 1 Полиаркальное или многополюсное веретено 7 2 3 6
Автономный конус 2 Разомкнутый фрагмогшаст 2 2 1
Мойополярное веретено 2 1 2 1 Мини-веретена 3 1
Хаотическое веретено 4 2 1 Кольцевое веретено 3 1
Радиальное веретено 1 Дезориентация веретен(а) 1 3 36
Дезинтегрированн ое веретено 1 1 Неполный цитокинез 37 6 7 4 14
Динамика цитоскелета в мейотической профазе.
В ходе цитоскелетного цикла профаза является промежуточной стадией при преходе от интерфазной конфигурации микротрубочковых (МТ) пучков к прометафазной. Изучение поведения цитоскелета в профазе осложняется тем, что как в растительных, так и в животных клетках цитоскелет на этой стадии деполимеризуется Однако если в животных клетках ход цикла цитоскелета в этот момент можно проследить, наблюдая поведение центросомных структур (центриолей), организующих цитоскелет, то растительная клетка их лишена. Поэтому механизм перехода МТ цитоскелета от интерфазной конфигурации к прометафазной неизвестен Мы обнаружили, что иногда в МКП наблюдается иной путь прохождения цитоскелетом профазы, при котором деполимеризации микротрубочек цитоскелета не происходит, и он остается доступным для цитологического анализа
Согласно нашим наблюдениям, в ходе девиантной профазы микротрубочки ретикулярного цитоскелета, ранее отходившие в цитоплазму от всей площади поверхности ядерной оболочки, в поздней профазе распространяются от довольно узкой кольцевой меридиональной (относительно оси будущего деления) области на поверхности ядерной оболочки. Форма пучков также изменяется они становятся выпрямленными. В результате этих изменений цитоскелет принимает вид плоской радиальной системы прямых микротрубочковых пучков, в виде спиц колеса, лежащей в плоскости будущего деления Затем радиальный цитоскелет постепенно замещается изогнутыми пучками микротрубочек, окружающими ядро в меридиональной плоскости относительно оси будущего деления Промежуточным этапом этого процесса является одновременное присутствие в клетке радиальных и тангенциальных пучков, а также МТ пучков промежуточной ориентации В ходе этого процесса можно наблюдать смещение пучков микротрубочек из радиального в тангенциальное положение Сформированная система перинуклеарных микротрубочек в мейотическом делении представляет собой плоское кольцо, ориентированное меридионально относительно оси будущего
деления. Пучки МТ, образующие кольцо, изогнуты. Ни одно из многих сотен проанализированных нами колец в девиантном мейозе у различных видов и форм высших растений не имело точек конвергенции микротрубочек. У всего множества проанализированных нами форм с девиантным мейозом (табл.2) перестройки цитоскелета в профазе происходили по описанной схеме (ретикулярный цитоскелет - радиальный цитоскелет - перинуклеарное кольцо), единообразно и без вариаций. См. рис. 1.
Рисунок 1. Перинуклеарные цитоскелетные кольца в профазе I мейоза у различных видов Solanacea. Микротрубочки визуализированы методом иммуноокрашивания а)- на а-тубулин; б, в)- на ß-тубулин.
а)-заключительные стадии формирования кольца в профазе I в МКП картофеля Solanum tuberosum, сорт Катаден; б) - сформированное перинуклеарное кольцо в МКП дикого типа томата Lycopersocon escuientum, с. Черри; в)- перинуклеарные кольца в профазе II в МКП томата Lesculentum, с. Черри.
Исследуя линии с аномальным мейозом, мы обнаружили ряд нарушений процесса динамики цитоскелета в профазе: 1) блок перестройки радиального цитоскелета в перинуклеарное кольцо (ППГ № 9-00 Triticum aestivum L SP-718 x Agropyron glaucum; ППГ № 83-4 T.aestivum ANK9 x A.glaucum). 2) формирование автономного кольца микротрубочек, отделенного от ядра (ППГ№№14-2 и 14-4 Т. aestivum ,с. Новосибирская 67 х A. glaucum № 13-1), 3) прямой тангенциальный пучок МТ вместо околоядерного кольца (ППГ № 13-1 Т. aestivum L с. Альбидум х A. glaucum); 4) общее перинуклеарное кольцо в многоядерных МКП однодольных видов (мутация рат1 Zea mays, ППГ № 16-5 (Г. aestivum 1_.сорт Иртышанка 10 х Elytrigia elongatum; ППГ № 1-99 Е. elongatumx T. aestivum, с. Лютесценс; формы с цитомиксисом); 5) слияние перинуклеарных колец в фенотипе «слившиеся веретёна» (клон СЕЮ картофеля S. tuberosum), 6) деформированные перинуклеарные кольца (ППГ F1 № 22-2 Triticum aestivum с Кормовая 128 х Elytrigia elongatum; ППГТ1 №16-3, Т. aestivum с. Иртышанка х Е. elongatum) что позволило расчленить его на отдельные этапы и события, а также выявить некоторые его характеристики. Аномалии 2 и 4 указывают на независимость перестроек цитоскелета в профазе от дифференциальной активности МТОЦ ядерной оболочки и подтверждают наблюдаемый в норме механизм формирования перинуклеарного кольца как процесс перемещения в цитоплазме стабильных МТ пучков. Аномалии 1 и 3 являются результатом блока обнаруженных нами в норме процессов: перемещения МТ пучков из радиального положения в тангенциальное и изгиба МТ в составе перинуклеарного кольца. Аномалия 5 наглядно демонстрирует, что перинуклеарное кольцо обладает собственной динамикой и способностью к активным морфологическим преобразованиям, ведущим к консолидации цитоскелета и генетического материала. Аномалия 6
демонстрирует нарушение изменения профиля МТ пучков при формировании кольца.
Необходимо отметить, что наши исследования цикла цитоскелета в фенотипах с деполимеризацией МТ в профазе показали наличие очень тонкого кольцевого меридионального перинуклеарного антитубулинового окрашивания в поздней профазе, сохранявшегося вплоть до распада ядерной оболочки. Это не удивительно, поскольку деполимеризация МТ представляет собой их укорочение по направлению к (-)-концам, то есть от периферии к ядру. В некоторых МКП, где деполимеризация Мт была замедлена, можно было наблюдать формирование плоской радиальной системы МТ, которая предшествует формированию кольца в девиантных клетках. Это указывает на общий принцип перестроек цитоскелета в профазе нормальных и девиантных клеток. На это же указывает спонтанное появление девиантных МКП в пыльниках с МКП обычного фенотипа. Сохранение очень тонкого перинуклеарного кольцевого окрашивания в поздней профазе было описано ранее в мКп баклажана (Traas et at., 1989). Однако деполимеризация цитоскелета, происходящая в профазе мейоза у этого объекта, не дает возможности связать эту фигуру с предыдущей и последующей цитоскелетными структурами. Поэтому авторы никак не обсуждали это наблюдение, и впоследствии оно было забыто.
Динамика цитоскелета в прометафазе. Построение анастрального веретена деления.
Прометафаза отделяется от профазы таким значимым морфологическим событием, как распад ядерной оболочки. В результате этого цитоскелет получает возможность контакта с хромосомами в процессе построения веретена деления. В девиантных клетках переход от профазной конфигурации к веретену возможно проследить, поскольку МТ достаточно длинны для визуального наблюдения. Цикл цитоскелета в этом случае предстает непрерывным процессом пространственных перемещений МТ пучков.
Ранняя прометафаза. После (или в процессе) распада ядерной оболочки перинуклеарное кольцо разделяется на отдельные пучки микротрубочек, которые выпрямляются и занимают тангенциальное положение по отношению к зоне бывшего ядра. Наблюдая сотни синхронизованных клеток на одном препарате, можно видеть, как МТ бывшего перинуклеарного кольца постепенно перемещаются в цитоплазме и входят в зону бывшего ядра. На этой стадии прометафазная фигура цитоскелета представляет собой хаотичную сеть из перекрещивающихся пучков МТ. Период цитоскелетного цикла от распада перинуклеарного кольца до формирования хаотичной фигуры мы назвали ранней прометафазой. Ее основные процессы, наблюдаемые в девиантной норме: 1) разделение кольца на отдельные пучки МТ, 2) выпрямление МТ пучков, 3) их поворот и вход в зону бывшего ядра с формированием хаотичной фигуры. Этот процесс консервативен и наблюдался во всех изученных нами девиантных формах различных видов и форм высших растений (см. табл. 2).
Нам удалось выделить ряд аномалий по процессам ранней прометафазы, подтверждающих приведенные выше наблюдения:
1) В 20% МКП ППГ F1 № 9-3 (Triticum. aestivum L, с. Новосибирская 67 х Agropyron glaucum; № 2-2 и 2-5 Т. durum с. Алтайская Нива х £ elongatum) происходит нарушение разборки перинуклеарного кольца и сохранение его на
стадии метафазы вплоть до телофазы. Сегрегация хромосом и цитокинез полностью блокированы.
2) При нормальной «разборке» кольца и нарушении выпрямления его МТ формируются изогнутые С-, S-образные, . а также комбинированные, сформированные из изогнутых и прямых пучков МТ, веретёна. Искривление веретена является массовой аномалией асинаптического мейоза и наблюдается в 80% изученных нами отдаленных гибридов 1 поколения, а также у всех синаптических мутантов и гаплоидов. В мКП меймутанта ms28 (Zea mays) изогнутые веретена формируются на фоне полного синапсиса хромосом.
3) В мейозе у ППГ F1 № 5-5 (Т. aestivum , с. ANK9 х A. glaucum 52-3; № 9-4 Т. aestivum с. Новосибирская 67 х A. glaucum) блокирована последняя стадия ранней прометафазы: вход цитоскелета в ядро. Кольцо теряет целостность, разделяется на отдельные пучки МТ, которые распрямляются, но не перемещаются в цитоплазме. Тангенциально ориентированные прямые пучки МТ окружают зону бывшего ядра и сохраняют это расположение вплоть до телофазы. Веретено не строится, карио- и цитокинез полностью блокированы. Перечисленные аномалии являются результатом блока основных процессов ранней прометафазы.
Средняя прометафаза. Переориентация МТ перинуклеарного кольца и перемещение их в область расположения хромосом автоматически создает хаотическую цитоскелетную фигуру, состоящую из множества ориентированных случайным образом МТ пучков. Мы выделили хаотическую стадию в особую подстадию прометафазы и назвали ее средней прометафазой по причине ее значительной продленности по сравнению с прочими. Происходящие в этот период процессы не были ранее описаны. A priori можно предположить, что в это время происходит взаимодействие МТ с кинетохорами хромосом. Действительно, в ряде фенотипов с продленной хаотической стадией мы наблюдали, что хромосомы в этот период несут полностью сформированные, противоположно направленные кинетохорные пучки МТ. Это представляет собой важнейший этап формирования элементов биполярного веретена - формирование биполярных кинетохорных фибрилл, у которых (+)-концы МТ находятся в центре фибриллы, на кинетохорах, а (-)-концы МТ - на концах фибриллы.
Наши данные свидетельствуют также о том, что в средней прометафазе формируются и биполярные центральные фибриллы веретена, представляющие собой результат соединения (+)-концами двух свободных МТ пучков. На это указывает ход прометафазы в мейозе у пПг F1 № 27-1 (Г. aestivum с. Саратовская 29 х A. glaucum; ППГ № 5-1 T.aestivum ANK9 х A.glaucum 257-7; ППГ № 5-98 7. durum с. Алтайка х Е. elongatum; у пшенично.-ржаной аллоплазматической линии CyANK9A), где блокировано формирование кинетохорных фибрилл. В этих фенотипах хаотическая фигура в средней прометафазе состоит из длинных МТ пучков, сравнимых по длине с длиной метафазного веретена. На десятках синхронизованных клеток на каждом препарате на этой стадии можно наблюдать постепенную ориентацию этих целостных МТ пучков вдоль оси деления и формирования из них биполярной системы веретена деления. Хромосомы из веретена исключены. Конвергенция фибрилл на полюсах указывает на то, (-)-концы МТ находятся на их концах, то есть что они являются биполярными. В телофазе на экваторе такого веретена строится клеточная пластинка, что доказывает присутствие в этой области (+)-концов МТ, то есть также биполярность этих фибрилл.
При одновременном нарушении формирования биполярных кинетохорных и биполярных центральных фибрилл веретена формируются монополярные веретена, морфологически представляющие собой полуверетено. В материнских клетках пыльцы (МКП) пшенично-пырейного гибрида F1 № 30-2 (Triticum aestivum с. Кормовая 128 х Elytrigia elongatum ) цикл цитоскелета происходит в виде девиантной нормы в профазе (формирование перинуклеарного кольца МТ) и ранней прометафазе (формирование хаотической фигуры). На стадии метафазы 1 вместо биполярного веретена формируется монополярное в виде конуса. Биполярные кинетохорные фибриллы в этом случае не формируются по причине унивалентного состояния хромосом (каждая хромосома несет только один кинетохор), а биполярные центральные фибриллы не формируются из-за нарушения соединения (+)-концов свободных МТ пучков. На то, что эта аномалия (блок соединения +-концов ) характерна для этого фенотипа, указывает присутствие в части МКП этого гибрида так называемых разомкнутых веретен: биполярных, но с торчащими в стороны свободными пучками МТ. Такие веретена формируются либо в результате появления в клетке одного-двух бивалентов и формирования на них биполярных кинетохорных фибрилл, либо за счет соединения (+)-концами части свободных МТ пучков.
Объединение монополярных кинетохорных фибрилл (унивалент с одним пучком МТ) и свободных МТ пучков в единую систему и конвергенция их (-)-концов приводит к формированию цитоскелетной фигуры в виде конуса. (-)-Концы Мт находятся на вершине конуса, а (+)-концы свободных МТ и хромосомы - в его основании. Движения хромосом и цитокинеза в таком веретене не происходит.
В делящейся растительной клетке монополярное веретено было описано нами впервые. Монополярные веретена описаны нами также в гаплоидах сарептской горчицы, где цикл цитоскелета происходит с деполимеризацией МТ в профазе/ранней прометафазе, а также в гаплоидах кукурузы. В ППГ № 45-11 Т. durum с. Алтайская Нива х A. glaucum и в ПРГ T.aestivum с. Саратовская 29 х S.cereale с. Онохойская монополярные веретена имеют вид звезды (моноастера).
Поздняя прометафаза. В дальнейшем ходе прометафазы хаотичный набор сформировавшихся в средней прометафазе биполярных фибрилл постепенно ориентируется вдоль оси будущего деления. Это можно наблюдать непосредственно. В результате этих перемещений хромосомы оказываются на экваторе и образуют метафазную пластинку. Последний этап прометафазы -конвергенция концов фибрилл в одну точку и формирование полюсов биполярного веретена. Период от хаотичной фигуры до биполярного веретена деления называется поздней прометафазой. В норме ее процессы происходят быстро и слитно, так что трудно выяснить их механизмы. Предполагают, что формирование биполярной системы цитоскелета из хаотичной происходит в результате процесса латеральной ассоциации МТ пучков (Franklin, Cande, 1999); завершающим процессом поздней прометафазы является конвергенция МТ на полюсах (Staiger, Cande, 1990;1991).
Нами впервые показано, что в формировании биполярного веретена в поздней прометафазе принимают участие полностью сформированные в средней прометафазе биполярные элементы веретена - центральные и кинетохорные фибриллы. Анализ составленной нами коллекции аномалий поздней прометафазы выявил дополнительный процесс формирования биполярного веретена: ориентацию фибрилл вдоль оси деления. На это указывает аномалия «дезинтегрированное веретено» в фенотипе мейотического мутанта теИО ржи и серии клонов картофеля RH95. В этих фенотипах в 100% МКП формирование биполярного веретена из хаотической фигуры происходит без латеральной
ассоциации фибрилл. Возможно, этот процесс осуществляется параллельно с латеральной ассоциацией и также приводит к формированию биполярной системы цитоскелета из хаотической. На осуществление в поздней профазе еще одного, не описанного ранее процесса, который можно назвать консолидацией веретена, указывает аномалия «радиальное веретено» в фенотипе мейотического мутанта oV (Zea mays). При этом из хаотической фигуры сформированных биполярных фибрилл при одновременном нарушении их латеральной ассоциации, конвергенции и ориентации вдоль оси деления формируется оригинальное аномальное веретено в виде розетки. При блоке всех процессов поздней прометафазы метафазное веретено имеет вид хаотической фигуры. Эта аномалия была описана нами в фенотипе мейотического мутанта ms3 (Pisum sativum), в мутантной линии СО АН-112 сахарной свеклы {Beta vulgaris) и у ряда отдаленных гибридов злаков.
Динамика цитоскелета в телофазе. Формирование фрагмопласта и цитокинез.
Детальный цитологический анализ процессов перестроек МТ цитоскелета на стадии телофазы в обоих мейотических делениях МКП у различных видов однодольных растений (последовательный цитокинез) в норме и при аномалиях показал, что для построения клеточной пластинки и осуществления цитокинеза у них в качестве фибриллярной системы фрагмопласта утилизуются центральные фибриллы веретена деления, которые окружают растущий край клеточной пластинки и осуществляют вместе с ней центробежное движение. Подтверждением этому служат также аномалии цитокинеза: «S-фрагмопласт» и «автономное веретено». В первом из этих фенотипов фрагмопласт в МКП с S-образным веретеном также имеет S-образную форму. Во втором цитокинез происходит на экваторе веретена, лишенного хромосом, без каких-либо изменений его формы и структуры. Аномалия «пустой фрагмопласт», обнаруженная нами в 8 различных генотипах отдаленных гибридов злаков и в гаплоидах кукурузы, демонстрирует центробежное движение центральных фибрилл веретена в цитокинезе в отсутствие клеточной пластинки. Это указывает на активную роль цитоскелета в данном процессе и опровергает существующее представление о том, что причиной центробежного движения фрагмопласта служит центробежный рост клеточной пластинки. Нами показано также, что в ходе цитокинеза фибриллы центрального веретена меняют профиль от прямого к изогнутому.
На основании этих данных, а также данных литературы нами предложена модель центробежного движения фрагмопласта. Этот механизм представлен нами как модификация механизма удлинения центрального веретена в В-анафазе в клетках животных и низших эукариот. Как известно, это удлинение происходит за счет присоединения димеров тубулина к (+)-концам МТ в области их перекрывания на экваторе, а также за счет взаимного скольжения противоположно направленных МТ в составе центрального веретена. Предложенная модель центробежного движения фрагмопласта основывается на наших данных о том, что
1) фибриллярная система фрагмопласта представляет собой систему фибрилл центрального веретена;
2) она активно движется центробежно за счет собственных механизмов;
3) фибриллы центрального веретена в ходе центробежного движения изгибаются.
Модель основывается также на данных литературы, согласно которым
1) в зону перекрывания (+)-концов Мт пучков на экваторе фрагмопласта происходит активное встраивание димеров тубулина (Vantard et al., 1990;Zangetal., 1990) и
2) во фрагмопласте обнаруживается присутствие моторных белков, вызывающих взаимное скольжение антипараллельных МТ (Asada et al., 1997).
Мы полагаем, что центробежное движение фибрилл фрагмопласта происходит в результате сочетания двух процессов: их удлинения и изгиба. Удлинение происходит за счет присоединения димеров тубулина к (+)-концам МТ в зоне их перекрывания и взаимного скольжения противоположно направленных МТ. Изгиб может регулироваться активностью МТ-ассоциированных белков. В результате этого точка перекрывания (+)-концов МТ каждой фибриллы может перемещаться центробежно. Поскольку в эту точку происходит транспорт мембранных пузырьков клеточной пластинки, перемещение этих точек у всей совокупности фибрилл фрагмопласта обеспечивает центробежный рост клеточной пластинки.
На основании анализа таких обнаруженных нами аномалий цитокинеза у однодольных, как «чрезмерный цитокинез», «блок слияния пластосом», «добавочный цитокинез», «преждевременный цитокинез», «неполный цитокинез», «туннельный цитокинез» предложена модель временной регуляции процесса последовательного цитокинеза в мейозе у высших растений. Согласно этой модели, сигналом к прекращению основных процессов цитокинеза (центробежного движения фибрилл фрагмопласта и синтеза мембранных пузырьков клеточной пластинки) является формирование дочерних клеточных мембран или их фрагментов при соприкосновении клеточной пластинки с мембраной материнской клетки (см. рис.2).
Рисунок 2. Схема временной регуляции процессов цитокинеза. Пластосомы = мембранные пузырьки клеточной пластинки
Анализ динамики цитоскелета на стадии телофазы в мейозе у видов двудольных растений показал, что принципиальных отличий цикла цитоскелета на этой стадии от такового в МКП однодольных нет. Роль фрагмопласта в мейозе у двудольных выполняют фибриллы центрального веретена и радиального интерфазного цитоскелета. Фибриллы фрагмопласта в результате заполняют всю цитоплазму и не совершают центробежного движения в ходе построения клеточной пластинки (неподвижный фрагмоппаст). Отсутствие цитокинеза после первого мейотического деления в МКП у двудольных обусловлено блоком формирования клеточной пластинки в этот период; формирование же фрагмопласта происходит без нарушений.
Из вышеизложенного следует, что в мейозе у высших растений в цикле цитоскелета не формируется такой специальной системной структуры цитоскелета, как фрагмопласт, а его функцию выполняют другие системные структуры цитоскелета (веретено деления и радиальный цитоскелет).
Переход от фрагмопласта к интерфазному радиальному цитоскелету.
Согласно нашим наблюдениям, в МКП у видов однодольных и двудольных растений формирование радиального интерфазного цитоскелета происходит в поздней телофазе от полюсных районов веретена и позднее - от оболочки дочерних ядер. Фибриллы фрагмопласта (бывшего центрального веретена) у однодольных могут включаться в состав радиального цитоскелета, а могут деполимеризоваться после формирования мембран дочерних клеток, Консервация или деполимеризация Мт фрагмопласта может наблюдаться в различных МКП одного и того же пыльника и представляет собой девиацию цитоскелетного цикла на этой стадии. В МКП видов двудольных растений роль фрагмопласта играют пучки радиального цитоскелета, которые и остаются в статусе интерфазного цитоскелета после формирования дочерних клеточных мембран.
В исследованном материале мы выделили ряд аномалий процесса перехода к интерфазному цитоскелету: 1) блок разделения (+)-концов МТ фрагмопласта в результате неполного цитокинеза ; 2) блок разделения (+)-концов фрагмопласта при полном цитокинезе; 3) нарушение формирования радиальной системы цитоскелета; 4) радиальный цитоскелет в клетках с микроядрами. Эти аномалии указывают на то, что переход от фрагмопласта к радиальному цитоскелету включает специальный процесс разделения (+)-концов МТ фрагмопласта, который не происходит автоматически при формировании дочерних мембран и может быть нарушен. Важнейшей характеристикой этой стадии является то, что она - единственная в цикле, когда происходит полимеризация новых микротрубочек на новых МТОЦ оболочек дочерних ядер или даже микроядер. Фактически, эта стадия аналогична стадии удвоения центросом в клетках животных и низших эукариот. Именно на этой стадии происходит, так сказать, «умножение цитоскелета». Осуществляется оно, безусловно, за счет увеличения числа МТОЦ, но когда и как происходит умножение этих последних - остается неизвестным.
Аномалии цикла цитоскелета, приводящие к мейотической реституции.
Мейотическая реституция - это процесс формирования нередуцированных и просто 2п гамет, происходящий чаще всего благодаря аномалиям карио - и цитокинеза. Поскольку и сегрегация дочерних геномов, и их автономизация осуществляются цитоскелетом, нам удалось описать ряд его аномалий, приводящих к мейотической реституции. По своим механизмам они подразделяются на три группы: 1) формирование реституционных ядер; 2) объединение дочерних геномов; 3) консолидация структур цитоскелета.
Формирование реституционных ядер, согласно нашим данным, является результатом полного блока пространственного разделения дочерних геномов. Мы обнаружили 5 аномалий цикла цитоскелета, приводящих к формированию реституционных ядер. Это описанные выше блок реориентации радиального цитоскелета, консервация перинуклеарного кольца, блок входа МТ в зону бывшего ядра, блок формирования кинетохорных МТ и монополярное веретено. Формирование реституционных ядер происходит, таким образом, в результате резких нарушений аппарата сегрегации - веретена деления.
Объединение дочерних геномов как реституционный процесс происходит после сегрегации дочерних геномов, то есть после их разделения в пространстве и формирования вокруг них ядерной оболочки. После этого в результате нарушения структур цитоскелета может происходить возвратное сближение дочерних ядер в общей цитоплазме. Причиной этого являются нарушения структур, осуществляющих автономизацию дочерних геномов, то есть структур цитокинеза. Вследствие этого дочерние ядра сближаются в общей цитоплазме, и в следующем делении, после распада ядерных оболочек, оба дочерних генома включаются в одно общее веретено деления. В результате сегрегации формируются ядра с удвоенным числом хромосом. «Слияния» оболочек сближенных дочерних ядер и формирования за счет этого реституционного ядра мы никогда не неблюдали. Согласно нашим данным, сближение ядер в общей цитоплазме может происходить вследствие аномалий поддерживающих структур цитоскелета: центральных фибрилл веретена и интерзональной системы МТ. Сближение дочерних ядер на полюсах С-образного веретена описано нами в мейозе ПРГ F1 (7. aestivum с. Саратовская 29 х S. cereale. Аномалия формирования интерзональной цитоскелетной структуры в интеркинезе у двудольных, приводящая к сближению дочерних ядер - в мейозе мутанта ps (Beta vulgaris). Сближение дочерних ядер наблюдается в телофазе у однодольных видов при отсутствии клеточной пластинки в результате смещения к периферии центральных фибрилл веретена в ходе центробежного движения фрагмопласта. Спонтанное сближение дочерних ядер в общей цитоплазме в профазе II (стадия перинуклеарных колец) мы наблюдали в мейозе у клонов картофеля RH95 -продуцентов 2п гамет. Аномалий цикла МТ цитоскелета на этой стадии в этом фенотипе нами обнаружено не было. Механизм этого процесса остается неизвестным.
Консолидация структур цитоскелета, как свидетельствуютнаши данные, также приводит к объединению сегрегировавших дочерних геномов и, соответственно, к мейотической реституции. В 50% МКП клона картофеля СЕЮ в профазе II происходит спонтанное сближение дочерних ядер со сформированными перинуклеарными цитоскелетными кольцами. После сближения ядер вплотную кольца размыкаются и сливаются, образуя одно общее
перинуклеарное кольцо вокруг обоих ядер. После распада ядерной оболочки из общей перинуклеарной цитоскелетной системы формируется общее веретено деления. В 100% МКП меймутанта as6 томата в средней прометафазе II происходит сближение и слияние в центре клетки цитоскелетных хаотических фигур. Никаких иных аномалий МТ цитоскелета в этом фенотипе не наблюдается.
Наши исследования цикла цитоскелета в мейозе форм - продуцентов 2п гамет - позволили выявить 13 не описанных ранее аномалий, приводящих к мейотической реституции в МКП видов однодольных и двудольных растений. До этого анализа в литературе была описана лишь одна аномалия цитоскелета, приводящая к мейотической реституции (Оепиа1Со в! а1., 1998). Ниже представлен перечень обнаруженных нами цитоскелетных механизмов мейотической реституции, то есть тех аномалий цикла цитоскелета, которые к ней приводят.
1. Нарушение формирования перинуклеарной системы цитоскелета (блок цитоскелета в радиальной конфигурации) (Шамина и др., 2003а).
2. Нарушение распада перинуклеарного цитоскелетного кольца (Шамина и др., 20036).
3. Нарушение входа цитоскелета в зону бывшего ядра (Шамина и др., 20036).
4. Одновременное нарушение формирования биполярных центральных и кинетохорных фибрилл веретена деления (монополярное веретено) (БИатнпа е! а1., 2003).
5. Блок формирования кинетохорных МТ (БИатнпа е! а!., 1999).
6. Сближение дочерних ядер на полюсах изогнутого веретена (Шамина, Козырева, 1995).
7. Отсутствие клеточной пластинки (БИатнпа е! а1., 1999).
8. Нарушение формирования биполярного веретена в поздней анафазе (хаотическое и нон-полярное веретена) (БИатПа е! а1., 2000).
9. Нарушение полимеризации микротрубочек интерзональной системы цитоскелета (у видов двудольных растений) (Эогодоуа е! а1., 1999).
10. Нарушение структуры интерзональной системы цитоскелета (блок соединения + концов МТ).
11. Спонтанное сближение дочерних ядер в профазе II у видов двудольных растений.
12. Слияние перинуклеарных колец (СопюеНа е! а1., 2003).
13. Сближение и консолидация хаотических прометафазных фигур цитоскелета.
Каталог аномалий мейотического веретена высших растений.
В исследованном материале мы обнаружили 24 не известные ранее аномалии веретена деления растительной клетки, описали их морфогенез и представили в виде каталога, расположив по порядку проявления аномальных событий в ходе цитоскелетного цикла. В каталог включены также 3 аномалии веретена, описанные ранее в литературе (С-веретено, полиаркальное, дивергентное). Морфогенез этих веретен также описан нами впервые. Подавляющее большинство представленных в каталоге аномальных веретен было описано нами в мейозе различных видов и форм как однодольных, так и двудольных растений, что указывает на консервативность цикла микротрубочкового цитоскелета в ходе мейотического деления растительной клетки. Это свидетельствует также об универсальности данного каталога. На рис. . 3 представлены схемы аномальных веретен на стадии метафазы I.
Рисунок 3. Каталог аномалий мейотического веретена деления растительной клетки На рисунке представлена 21 обнаруженная нами новая аномалия и 3 описанные ранее в литературе. На схемах пучки микротрубочек обозначены линиями, хромосомы - маленькими прямоугольниками; обозначены также (+) и (-)-концы микротрубочек.
1. Кольцевое веретено. Результат соединения хромосом с МТ, блокированными в конфигурации профазной перинуклеарной системы (кольца). Такое «веретено» не имеет полюсов, биполярных фибрилл и не способно к перемещению хромосом. Если перинуклеарное кольцо размыкается, возникает разновидность кольцевого веретена — спиральное, в виде завитка Причина аномалии - полный или частичный блок дезинтеграции околоядерного кольца. При полном блоке хромосомы в кольцо не встраиваются, но иногда могут скользить по нему за счет взаимодействия плеч с пучками МТ.
2. С-сбразное веретено. Фибриллы этого веретена состоят из дугообразно
изогнутых МТ пучков, соединенных (+)-концами, а (-)- концы которых находятся в cis-положении. Движение хромосом не нарушено, цитокинез асимметричен, телофазные группы хромосом смещены Причина аномалии - изгиб МТ пучков из-за нарушения выпрямления МТ околоядерного кольца.
3. S-образное веретено. Фибриллы веретена состоят из дугообразных МТ пучков, (-)-концы которых находятся в frans-положении. Сопоставление двух аномалий -С- и S-образных веретен - указывает на то, что изгиб МТ пучков возник на стадии ранней прометафазы.
4. D-образное веретено. Возникает в том случае, когда выпрямляется лишь часть МТ пучков, составлявших околоядерное кольцо. Комбинация прямых и изогнутых биполярных пучков С-формы при их коориентации в теле веретена и двух общих точках конвергенции (-)-концов. D-веретено является причиной неожиданного результата сегрегации хромосом: в две телофазные группы из двух различных метафазных пластинок.
5. Y-образное веретено. Также представляет собой результат комбинации прямых и С-образных биполярных фибрилл, но с одной общей точкой конвергенции (-)-концов. В результате сегрегации формируются три телофазные группы хромосом из одной метафазной пластинки
6. N-образное веретено. Комбинация двух прямых и одного S-пучка. Сегрегация хромосом биполярная
7. Т-образное веретено. Сложная комбинация из одного прямого пучка и двух С-образных. Служит причиной трехполюсной сегрегации хромосом; цитокинез идет только в экваториальной зоне прямого пучка.
8. Монополярное коническое веретено. Фактически является полуверетеном, поскольку состоит из «половинок» биполярных фибрилл. Половины центральных фибрилл конвергированы (-)-концами на единственном полюсе и обращены свободными расходящимися (+)-концами наружу. Хромосомы по разным причинам несут только одну кинетохорную фибриллу; последние конвергируют (-)-концами на полюсе и имеют одинаковую длину с половинками центральных фибрилл, так что хромосомы находятся в области расположения (+)-концов свободных МТ, в зоне веретена, противоположной полюсу (условный экватор). Движения хромосом в анафазе не происходит, цитокинез блокирован. Продукт деления - монада с реституционнным ядром. Причина аномалии -
одновременное нарушение формирования биполярных фибрилл веретена, как центральных, так и кинетохорных.
9. Монополярное радиальное веретено (моноастер). Принцип строения и причины формирования те же, что и у монополярного конуса, за исключением того, что единственный полюс веретена более «развернут», и веретено имеет вид звезды, то есть пучки МТ распространяются от центра конвергенции по радиусам Два других важных отличия - аномальная ориентация (перпендикулярно оси деления) и формирование микроядер вместо одного реституционного ядра.
10. Автономный конус. Монополярное веретено без хромосом. Формируется при одновременном нарушении соединения (+)-концов МТ и присоединения их к кинетохорам на фоне нормальных коориентации пучков и конвергенции (-)-концов
11. Разомкнутое веретено. Биполярное веретено с центральными фибриллами смешанного состава: как биполярными, так и «половинками», т.е. свободными МТ пучками, не соединенными (+)-концами друг с другом. Свободные пучки конвергируют (-)-концами на полюсах, а их (+)-концы торчат наружу и перекрещиваются в области экватора. Кинетохорные фибриллы также могут быть биполярными или одиночными. Анафазное движение хромосом в таком веретене блокировано. Причина аномалии - в блоке формирования части биполярных центральных фибрилл веретена.
12. Веретено с дополнительным полуверетеном. Возникает в случае объединения свободных МТ пучков, не способных соединиться (+)-концами, в автономное полуверетено. Оно может отходить от основного биполярного веретена в произвольном месте, иногда включает в себя хромосомы. Причина -частичный блок соединения (+)-концов.
13. Хаотичное веретено. Представляет собой набор хаотично ориентированных биполярных фибрилл веретена: центральных и кинетохорных. Последние могут не быть биполярными. Конфигурация нормальной средней прометафазы. Причина аномалии - блок ориентации фибрилл веретена вдоль оси будущего деления, коориентации фибрилл в теле веретена и конвергенции (-)-концов. Анафазное движение хромосом и цитокинез блокированы.
14. Диаметральное нонполярное веретено. Структура, возникающая при равномерном расположении биполярных фибрилл веретена по линиям диаметра клетки, так что хромосомы с противоположно направленными кинетохорными пучками, а также области перекрывания (+)-концов в центральных фибриллах оказываются в центральной точке клетки, а (-)-концы - как бы на поверхности сферы в кортикальной зоне цитоплазмы. Резко аномальная фигура веретена, в которой район полюса в виде сферы окружает район экватора, превратившийся в точку. Причина аномалии - одновременное нарушение ориентации биполярных фибрилл вдоль оси деления и конвергенции (-)-концов. Регулярная структура в виде помпона, свойственная этому веретену, возникает благодаря тому, что процесс коориентации фибрилл в теле веретена не нарушен.
15. Дезинтегрированное веретено. Состоит из биполярных фибрилл, не строго ориентированных вдоль оси деления, не конвергированных на полюсах и расположенных под углом друг к другу, то есть не "ориентированных взаимно параллельно. Фенотип мутанта meiW у ржи, также в мКп клона ЯН95 картофеля. Анафазное движение хромосом и цитокинез происходят нормально, нарушена структура телофазных групп хромосом. Причина аномалии - нарушение коориентации фибрилл в теле веретена и блок конвергенции (-)-концов МТ..
16. Полиаркальное, или мультиполярное, веретено. Описано в литературе в мейозе у отдаленных гибридов (Wilson, 1928). Имеет вид объемной звезды с несколькими «лучами» - полуверетенами. Состоит из биполярных фибрилл, конвергированных на этих нескольких полюсах. Анафазное движение хромосом и цитокинез осуществляются нормально между всеми полюсами. Является также распространенной промежуточной конфигурацией нормальной прометафазы. Причина аномалии - нарушение ориентации сформированных биполярных фибрилл веретена (как кинетохорных, так и центральных) вдоль оси деления.
17. Биполярное веретено без хромосом (автономное веретено). Биполярное веретено, состоящее из одних центральных фибрилл. Формируется либо при полном блоке построения кинетохорных МТ, либо при недоступности хромосом для цитоскелета (блок распада ядерной оболочки). Способно осуществлять перемещение хромосом, по-видимому, за счет взаимодействия с их плечами.
18. Сферическое веретено. Аномально расширенное биполярное веретено с нормальными полюсами; пропорции настолько изменены, что выглядит шарообразным. Количество микротрубочек в веретене по сравнению с нормой не увеличено, но наблюдается нарушние «чистой зоны» и присутствие в теле веретена органелл периферической цитоплазмы, что указывает на нарушение внутренней структуры тела веретена. Причина - нарушение коориентации фибрилл на фоне нормальной конвергенции (-)-концов МТ.
19. 'Комета": биполярный конус. Характерная фигура, напоминающая комету, проявляется в телофазе в результате монополярного расхождения лишенных кинетохорных фибрилл хромосом в биполярном дивергентном рыхлом веретене. В телофазе веретено представляет собой конус с хромосомами на вершине, т. е. асимметричное биполярное веретено, у которого один полюс (с хромосомами) конвергирован, а второй - дивергентный. При формировании мини-веретена на полюсе располагаются две сближенные группы хромосом («двухголовая комета»). Цитокинез идет нормально на экваторе «конуса», преобразующегося затем во фрагмопласт. Причина аномалии - отсутствие кинетохорных фибрилл и конвергенции (-)-концов, а также атипичная сегрегация хромосом (скольжение плеч вдоль фибрилл веретена). Аномалия довольно распространенная.
20. Бочонкообразное веретено. Формируются изредка в МКП отдаленных гибридов первого поколения, а также в 100% МКП у полиплоидов с высоким уровнем плоидности (наши наблюдения мейоза в октаплоидах люцерны Medicago sativa). Типичное митотическое цилиндрическое (barrel-shaped) веретено с широкими полюсами. Интересно сравнить, что в МКП мутанта ameiotic (Zea mays), где мейоз заменен митозом, формируются типичные мейотические (pointed) веретена (Palmer, 1971).
21. Дивергентное веретено. Впервые описано в 1940 г. Кларком (Clark, 1940) в фенотипе мутанта кукурузы divergent spindle. Представляет собой биполярное веретено с параллельно коориентированными фибриллами и неконвергированными полюсными районами. Анафазное движение и цитокинез в норме, структура телофазных групп хромосом нарушена (микроядра). Причина аномалии - блок конвергенции (-)-концов МТ пучков. Вариантом фенотипа этой мутации, проявляющимся при изменении фототемпературного режима, является нонполярное диаметральное веретено.
22. «Фонтан». Дивергентное веретено с нарушением коориентации фибрилл и конвергенции (-)-концов. Вариант фенотипа мутации divergent spindle (Zea mays). Состоит из С-образных фибрилл.
23. Дивергентное С-веретено. Причина аномалии - одновременное нарушение выпрямления МТ пучков и их конвергенции на полюсах. Наблюдается довольно часто в фенотипе ППГ Р1 и в гаплоидах кукурузы.
24. Мини-веретена. Формируются изредка в случае пространственной разобщенности цитоскелета и хромосом. Нам не удалось установить их происхождение: формируются ли их микротрубочки хромосомами, околохромосомным пространством или эти МТ транспортируются из других областей цитоплазмы. Образуются в случае нарушения разборки околоядерного кольца или при формировании автономного веретена без кинетохорных фибрилл. Представляют собой крошечные биполярные веретена с присоединенными хромосомами, конвергированными полюсами, ориентированы произвольно. Разделяют хромосомы на две хорошо различимые телофазные группы, лежащие вплотную бок о бок. Фрагмопласт и клеточная пластинка также строятся в этом мини-веретене. Мини-веретена бывают моно- и триполярными. Хромосомы на схеме не обозначены.
Обсуждение
Наши наблюдения цикла микротрубочкового цитоскелета в мейотическом делении клеток высших растений показали, что этот процесс является консервативным. Обычный и девиантный циклы цитоскелета происходят в МКП всех изученных нами видов и форм высших растений в неизменном виде; аномальные фенотипы универсальны.
Результаты, полученные при изучении цитоскелетного цикла как в ходе нормального мейоза, так и посредством морфологической диссекции с использованием широкого спектра аномалий, позволили впервые представить динамику МТ в делении растительной клетки в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса. На схеме на рис. 4 представлены сводные результаты наших исследований. Этапы, описанные ранее в литературе, на схеме обозначены.
Согласно нашим данным, интерфазный ретикулярный цитоскелет в средней/поздней профазе преобразуется в систему радиальных пучков, ориентированных в плоскости будущего деления (1). Одновременно с этим пучки МТ, ранее волнистые, выпрямляются. Затем происходит их поворот на 90° и ориентация по касательной к поверхности ядерной оболочки (2 и 3). После этого пучки МТ изгибаются, опоясывая ядро, коориентируются и формируют перинуклеарную профазную систему в виде меридионально ориентированного кольца (4). После распада ядерной оболочки или одновременно с ним кольцо распадается на отдельные пучки МТ (5), которые вновь выпрямляются (6) и входят в зону бывшего ядра (7). Начинается хаотическая стадия прометафазы, сравнительно длительная, во время которой происходит соединение (+)-концов микротрубочковых пучков с кинетохорами хромосом и друг с другом, то есть происходит формирование кинетохорных и центральных биполярных фибрилл веретена (8 и 9). Сформированные биполярные фибриллы в поздней прометафазе поворачиваются и ориентируются вдоль оси будущего деления (10). Затем (или одновременно с этим) они коориентируются параллельно (11), конвергируют (-)-концами (12) и формируют метафазное веретено. В анафазе кинетохорные пучки МТ деполимеризуются (13, 13а), и веретено в ранней телофазе состоит из полюсных районов с телофазными группами хромосом и центральных фибрилл, идущих от полюса к полюсу. В ранней телофазе в мейозе у видов однодольных растений на экваторе телофазного веретена закладывается клеточная пластинка и формируется фрагмопласт путем перераспределения в
пространстве центральных фибрилл веретена, которые перемещаются и окружают растущий край клеточной пластинки (14). После этого начинается центробежное движение фрагмопласта (15). В мейозе у двудольных в телофазе I клеточная пластинка не формируется, а происходит массовая полимеризация МТ пучков от полюсных районов веретена по направлению к экватору (14а) и формирование интерзональной цитоскелетной системы (15а), которая играет роль интерфазного цитоскелета в интеркинезе. В профазе II вокруг ядер формируются перинуклеарные кольца; у двудольных это сопровождается частичной деполимеризацией интерзональной системы и укорочением пучков МТ в ее составе. После формирования веретена и его функции в анафазе-телофазе II реформация радиального интерфазного цитоскелета у однодольных происходит, как и в первом мейотическом делении, за счет включения в его состав фибрилл центрального веретена и новосинтезированных МТ, а у двудольных она представляет собой фибриллы неподвижного фрагмопласта. Таким образом, завершение цитоскелетного цикла в мейотическом делении происходит как за счет перемещения МТ пучков (центробежное движение фрагмопласта), так и за счет полимеризации МТ заново от полюсных районов веретена в виде компенсации деполимеризации цитоскелета в анафазе.
Согласно нашим данным, в МКП фрагмопласт как самостоятельная структура не строится, а для осуществления цитокинеза используется центральное веретено (у однодольных видов) или радиальный цитоскелет (у двудольных). Профазную перинуклеарную систему в виде околоядерного кольца микротрубочек также можно отнести к системным структурам цитоскелета лишь условно, так как ее функция в мейотическом делении пока не установлена. Тем не менее, высокая степень структурной организации кольца, его специальная ориентация относительно оси деления, собственная динамика, о чем свидетельствует феномен активного слияния колец, а также измененный относительно предыдущей и последующей структур профиль составляющих кольцо МТ пучков (изгиб) заставляют предполагать, что перинуклеарное кольцо играет в мейозе более значимую роль, чем быть просто промежуточной конфигурацией цитоскелета при построении веретена деления.
Таким образом, цитоскелет в мейозе как у однодольных, так и у двудольных видов проходит единообразный цикл, состоящий из следующих основных этапов: 1) формирование перинуклеарного кольца из радиального цитоскелета, 2) формирование веретена деления из перинуклеарного кольца, 3) полимеризация de novo МТ радиального цитоскелета. Резкие морфологические различия между последовательным и одновременным цитокинезом в мейозе у однодольных и двудольных видов объясняется, согласно нашим данным, лишь различием во времени синтеза мембранных пузырьков клеточной пластинки в том и в другом случае.
Анализ цикла цитоскелета посредством морфологической диссекции позволил выявить не только его основные и промежуточные стадии, но также те морфологические механизмы, которые лежат в основе этих перестроек. Наши результаты показывают, что процесс перехода МТ цитоскелета из одной системы в другую в растительном мейозе осуществляется посредством двух основных механизмов: перемещением стабильных микротрубочковых пучков в пространстве клеточной цитоплазмы и деполимеризацией/реполимеризацией МТ. Эти процессы мы определяем как основные, поскольку они: 1) осуществляются при переходе цитоскелета от одной системной структуры к другой, 2) необходимы при формировании всех системных цитоскелетных структур в ходе клеточного деления; 3) не зависят друг от друга и от второстепенных процессов перестройки МТ систем.
Рисунок 4. Схема цикла микротрубочкового цитоскелета в первом мейотическом делении МКП видов однодольных и двудольных растений. Этапы 1-13 происходят единообразно у видов однодольных и двудольных растений. Этапы 1315 обозначают стадии от метафазы I до интеркинеза в мейозэ у видов однодольных растений; 13а-15а - соответствующие стадии в мейозе у двудольных.. Этапы, описанные в литературе, подчеркнуты. Пучки МТ обозначены линиями, хромосомы - прямоугольниками; положение (+) и (-^-концов МТ указано.
К второстепенным мы относим процессы, необходимые для окончательного формирования отдельных системных структур после того, как произошел переход (реориентация) цитоскелета от предыдущей структуры к последующей: латеральную коориентацию МТ пучков, взаимодействие концов МТ (перекрывание, конвергенция), взаимное скольжение антипараллельных МТ, изменение профиля МТ пучков (изгиб - выпрямление) и т.п.
Основные морфологические механизмы цикла цитоскелета.
1. Перемещение в цитоплазме стабильных пучков МТ. На то, что переходы от одной цитоскелетной структуры к другой в мейоцитах растений осуществляются посредством перемещения в цитоплазме стабильных МТ пучков, указывают наши данные о формировании автономной перинуклеарной системы при ацентрическом положении ядра, о формировании общего перинуклеарного кольца в многоядерных клетках, о построении веретена деления (вход МТ в зону ядра, выход из хаотической стадии). Результатом таких перемещений является переориентация МТ пучков с поворотом на 180° при переходе от радиального интерфазного цитоскелета к веретену деления. Он происходит в два этапа: на 90° до распада ядерной оболочки (в профазе) и на 90° после (в прометафазе). Результатом первого этапа переориентации является формирование перинуклеарной системы, результатом второго - хаотичная стадия прометафазы с формированием биполярных фибрилл. А общим итогом - перемещение (+)-концов микротрубочковых пучков из кортикальной зоны цитоплазмы в центр клетки для прикрепления к кинетохорам хромосом. Кроме этого кардинального процесса передвижение стабильных пучков МТ в пространстве клетки происходит в поздней прометафазе при построении биполярного веретена (выход из хаотической стадии).
Молекулярные механизмы, осуществляющие такие перемещения, неизвестны. На этот счет имеются противоречивые данные о роли актина в осуществлении перемещения МТ пучков и целых веретен в ходе дифференцировки соматических клеток (Hepler, Jackson, 1974; Wymer et al., 1998). Наши данные ставят под сомнение предположение о том, что переход от хаотичной стадии прометафазы к биполярному веретену деления осуществляется за счет латеральных взаимодействий фибрилл строящегося веретена (Smirnova, Bajer, 1998; Franklin, Cande, 1999). Мы наблюдали, что в процессе перемещений каждый пучок МТ ведет себя независимо от остальных. На это же указывает фенотип «дезинтегрированное веретено» у мутанта теИО у ржи и клона картофеля RH95. Эти данные можно интерпретировать также как свидетельство того, что формирование биполярного веретена осуществляется за счет двух независимых механизмов: латеральной ассоциации фибрилл и ориентации фибрилл вдоль оси деления.
2. Полимеризация/деполимеризация МТ. В клетках эукариот, содержащих центросому, переориентация микротрубочек и переход их из одной конфигурации в другую осуществляется путем полной деполимеризации МТ предыдущей цитоскелетной системы и реполимеризации их на новых МТОЦ. В бесцентросомных клетках высших растений на определенных стадиях деления деполимеризация /реполимеризация МТ также происходит, причем, по нашим данным, на различных стадиях она может носить обязательный или необязательный характер. Обязательной для правильного осуществления
деления клетки является деполимеризация кинетохорных МТ в ходе их укорочения в анафазе. Вслед за этим в телофазе происходит реполимеризация МТ от полюсных районов веретена, а в интеркинезе - от поверхности ядерной оболочки. Массовая деполимеризация Мт цитоскелета в делящейся растительной клетке происходит в профазе. Однако на этой стадии, в отличие от анафазы, деполимеризация не является обязательной и может не происходить без ущерба для процесса деления клетки и хода цитоскелетного цикла. Согласно нашим данным, в мейотической профазе деполимеризация МТ происходит не полностью, так что тонкое кольцевое перинуклеарное окрашивание на тубулин сохраняется вплоть до распада ядерной оболочки. Очевидно, что переориентируя МТ пучки в профазе, клетка может оперировать как длинными, так и короткими пучками, поворачивая их либо целиком, либо в виде коротких проксимальных относительно ядра отрезков. В зависимости от этого и перинуклеарная система может иметь вид или широкого развитого кольца, или весьма узкого. Во втором случае реполимеризация МТ (их удлинение) наступает после распада ядерной оболочки, в период формирования хаотической фигуры.
Мы относим процесс деполимеризации/реполимеризации МТ к основным процессам динамики цитоскелета в растительной клетке, поскольку он является главным при формировании такой системной структуры цитоскелета, как радиальные интерфазные пучки. Это естественно, так как в череде делений клетки количество МТОЦ должно умножаться, и число МТ в каждом цикле деления должно пополняться. Такое «пополнение» происходит в телофазе -интеркинезе за счет дополнительных синтезов МТ радиального цитоскелета. В следующем цикле деления, согласно нашим данным, перестройки цитоскелета осуществляются за счет перемещения стабильных МТ пучков, так что для построения последующей структуры цитоскелета используются МТ, входившие в состав предыдущей. Затем происходит полимеризация новых МТ на новых МТОЦ в телофазе/интеркинезе, и цикл завершается.
Второстепенные процессы динамики МТ цитоскелета в ходе деления растительной клетки.
После реориентации и пространственного перемещения МТ пучков при переходе от одной системной структуры цитоскелета к другой происходит собственно формирование этих структур за счет дополнительных процессов, которые мы называем второстепенными, или вспомогательными. Это латеральная коориентация МТ пучков, дезинтеграция предыдущей структуры, взаимодействие концов МТ (перекрывание (+)-концов, конвергенция (-)-концов), взаимное скольжение антипараллельных МТ, изменение профиля МТ пучков, т. е. их изгиб или выпрямление. Согласно нашим наблюдениям аномальных фенотипов, эти процессы осуществляются независимо друг от друга.
Динамика цитоскелета и проблема центросомы растительной клетки.
Кардинальным свойством микротрубочек как морфологических структур является то, что для их формирования необходимы специальные «затравки»: микротрубочкоорганизующие центры, МТОЦ. Клетка не может создавать микротрубочки в любой точке цитоплазмы, но лишь там, где находятся МТОЦ. Таким образом, динамика цитоскелета определяется ими. МТОЦ соединены с (-)-концами микротрубочек. В клетках животных и низших эукариот МТОЦ консолидированы в специальных структурах : центросомах, - претерпевающих собственный цикл в ходе деления клетки. Смысл этого цикла в том, что центросомы выполняют роль полюсных организаторов веретена, и для выполнения этой функции должны удвоиться и разойтись. В клетках высших
растений таких структур нет, а местом локализации МТОЦ является ядерная оболочка, исчезающая на мобильных стадиях клеточного цикла. Поэтому проблема регуляции динамики цитоскелета на уровне морфологических структур остается в этом случае до сих пор не решенной. В животной клетке, содержащей морфологически оформленную центросому, в ходе деления существуют лишь две системные цитоскелетные структуры: радиальные пучки и веретено. Делящаяся растительная клетка в силу своих морфологических особенностей (жесткая клеточная стенка) проходит более сложный цитоскелетный цикл с формированием большего числа весьма разнообразных цитоскелетных структур (кортикальные спирали, препрофазный пучок, радиальные пучки, веретено деления и фрагмопласт). Очевидно, что консолидация МТОЦ в оформленной центросоме ограничивало бы число вариантов структур цитоскелета, формирование и развитие которых такая центросома могла бы регулировать. Она эффективна только при формировании биполярного веретена. Поэтому становится понятной точка зрения, согласно которой цикл оформленной центросомы (например, центриолярной в животных клетках) считается редуцированным вариантом более сложного цикла (Эохвеу, 2001). Гипотезу такого цикла диффузной, или «гибкой», центросомы выдвинул Мэзия (М^а, 1987). Он постулировал, что в эукариотной клетке центросома представляет собой совокупность дискретных МТОЦ, соединенных между собой линейно некоей гипотетической структурой, которая может изменять свою конформацию. В зависимости от этого изменяется расположение соединенных с ней МТОЦ и, соответственно, пространственное расположение и ориентация микротрубочковых систем, полимеризующихся от этих МТОЦ.
В каком соотношении с этой гипотезой находятся результаты нашей работы и каким образом выявленные нами детали динамики микротрубочкового цитоскелета вскрывают механизмы регуляции этой динамики? Функцией гибкой центросомы в гипотезе Мэзия является полимеризация и переориентация микротрубочек. Обнаруженный нами поворот радиальных МТ в тангенциальное положение в МКП в профазе и формирование перинуклеарной системы может быть результатом переориентации МТОЦ, расположенных на ядерной оболочке и соединенных с МТ, и отсутствие деполимеризации МТ визуализирует этот процесс. Тем не менее, наши данные указывают на то, что переориентироваться способны и свободные пучки МТ, отделенные от МТОЦ, например, при формировании циркулярных МТ структур в периферической цитоплазме. Возможно, что в процессе поворота одновременно участвуют два механизма, либо они представляют собой два возможных пути. Итак, первый поворот радиальных пучков может происходить в результате поворота их МТОЦ на ядерной оболочке. После ее распада дальнейший поворот МТОЦ, соединенных с длинными или предельно укороченными МТ, происходит за счет неизвестного механизма. Вряд ли это может быть взаимодействие МТ, поскольку в результате формируется хаотическая фигура. Процессы как первого (в профазе), так и второго (после распада ядерной оболочки) поворотов не противоречат гипотезе Мэзия об ориентирующей активности «гибкой» центросомы. Гипотетическая линейная структура, соединяющая МТОЦ, может изменять их ориентацию при изменении своей конформации.
Однако в серьезное противоречие с гипотезой Мэзия приходят наши данные относительно механизмов формирования веретена деления. Согласно логике происходящего, удвоенные материнская и дочерняя центросомы, играющие роль полюсных организаторов веретена, должны разойтись в пространстве до того, как цитоскелет вступит в контакт с кинетохорами хромосом.
В противном случав существует опасность монополюсного присоединения хромосом и биполюсного - одного кинетохора. В поздней профазе вплоть до распада ядерной оболочки цитоскелет организован в перинуклеарную кольцевую структуру. Никаких признаков его биполяризации не наблюдается ни в норме, ни в аномалиях. Описанный нами непрерывный ход процесса перестроек цитоскелета на стадии построения веретена из перинуклеарного кольца предполагает присутствие в этих (и промежуточных) структурах и гибкой центросомы, если она существует. Можно предположить, что биполяризация существует в виде двух полуколец, составляющих одно целое. Гибкая центросома каждого полукольца, изменяя конформацию, может служить в этом случае одним полюсным организатором веретена. Этому противоречат наши данные о формировании биполярных веретен при сближении ядер и слиянии перинуклеарных колец. Мы никогда не наблюдали в этом случае формирования многополюсных веретен, и это исключает присутствие четырех центросом, как это предполагалось бы по гипотезе Мэзия. На это же указывает описанное нами формирование биполярных веретен при слиянии хаотических прометафазных фигур в фенотипе fused spindles. Кроме того, мы никогда не наблюдали аномальных структур цитоскелета в поздней профазе и ранней/средней прометафазе в фенотипах с монополярными веретенами. В животных клетках монополярные веретена формируются в результате отсутствия пространственного разделения центросомальных структур. Если в МКП гибкая центросома существует, и, согласно нашим данным, имеет в профазе форму кольца, то в фенотипах с монополярными веретенами вместо перинуклеарного кольца должно формироваться полукольцо, но этого никогда не наблюдалось.
Таким образом, наши результаты не укладываются в гипотезу Мэзия о гибкой центросоме растительной клетки. Гораздо проще предположить в этом случае автономность МТ пучков и их перемещение за счет внешнего ориентирующего механизма (ток цитоплазмы, моторные белки в кортексе, латеральная ассоциация пучков и т.п.).
Согласно нашим данным, элементарной и независимой единицей процесса перестроек МТ цитоскелета в делении растительной клетки является индивидуальный микротрубочковый пучок (или индивидуальная микротрубочка) как длинная, так и укороченная. Визуализировать укороченные МТ в виде «затравок» современными методами исследования не удается; они становятся доступными для наблюдения лишь при условии удлинения, или когда они создают ассоциации. Так, в профазе митоза в эндоспэрме африканской лилии гемантус предельно укороченные пучки МТ конвергируют своими (-)-концами и визуализируются в результате как миниатюрные конусы на поверхности ядерной оболочки. Смирнова и Байер обозначили их как центры конвергенции микротрубочек (МТСС) и приписывают им ключевую роль в динамике цитоскелета в ходе растительного митоза (Smirnova, Bajer, 1994). Например, в профазе происходит переориентация МТСС на 180°, так что вершина конуса, т. е. (-)-концы МТ, ориентируются по направлению к периферии клетки, а (+)-концы, соответственно, внутрь ядра. Механизм этой переориентации неизвестен. При сопоставлении этих данных с нашими можно сказать, что процесс переориентации в профазе митоза гемантуса происходит по такой же схеме, как в мейозе, но с некоторыми отличиями. Во-первых, полный поворот осуществляется до распада ядерной оболочки, тогда как в мейозе он происходит на 90° в профазе и еще на 90° в прометафазе. В митозе «затравки» организованы в конусы за счет конвергенции (-)-концов, в мейозе они формируют организованную кольцевую структуру. Можно сказать, что в мейозе МТ перемещаются по отдельности, независимо друг от друга, а в митозе - группами, объединенными в МТСС.
Однако, согласно нашим данным, конвергенция (-)- концов МТ не препятствует их перемещениям в цитоплазме: в ходе формирования биполярного веретена отдельные пучки МТ поворачиваются и ориентируются вдоль оси веретена так же, как и организованные в «конусы» дополнительные полюса прометафазных полиаркальных веретен. Так что конвергенция укороченных МТ в МТСС вряд ли является решающим качеством для осуществления динамики цитоскелета, элементом которой может являться (и является в мейозе) отдельный МТ пучок, как длинный, так и укороченный (аналог МТОЦ).
Проведенный нами широкий скрининг аномалий цитоскелетного цикла не выявил фенотипов, которые можно было бы отнести к результату нарушения центросомального цикла. В животных клетках это монополярные (блок удвоения или расхождения центросом) и мультиполярные (дополнительные циклы удвоения центросом) веретена. В растительной клетке нам впервые удалось обнаружить монополярные веретена в мейозе ряда форм, но детальный анализ процесса их формирования и сопутствующих аномалий (разомкнутые веретена) указывает на иной механизм их морфогенеза, нежели блок удвоения (или расхождения) центросом. Мультиполярные (полиаркальные) веретена в растительной клетке известны, но их неизменная встречаемость, согласно нашим данным, в нормальной прометафазе мейоза дикого типа указывает на девиацию нормального процесса, но не на аномалию. Иными словами, полиаркальные веретена у растений не могут считаться доказательством нарушения цикла гипотетической центросомы в растительной клетке.
Таким образом, наши данные указывают на то, что динамика микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки определяется активностью множества дискретных МТОЦ, осуществляющих полимеризацию/деполимеризацию МТ, а построение микротрубочковых систем различной конфигурации может происходить за счет внешних сил, приложенных к этим МТОЦ на поверхности ядерной оболочки, а в ее отсутствие - к ассоциированным с МТОЦ микротрубочкам. Наши данные противоречат гипотезе о присутствии центросомальной структуры в МКП высших растений.
Перспективы. Разработанный подход к изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований - морфологическая диссекция - оказался весьма информативным при анализе цикла микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки. Мы также получили предварительные обнадеживающие результаты, демонстрирующие эффективность этого подхода для анализа циклов других внутриклеточных структур, например, хромосомного цикла и цикла ядерной оболочки. Многообещающим, по нашим предварительным данным, является этот подход также для изучения процессов перемещения хромосом в мейотическом ядре на стадии профазы I, в период синапсиса гомологичных хромосом.
Выявленные на морфологическом уровне механизмы перестроек цитоскелета позволяют сделать обоснованные предположения о молекулярных механизмах этих перестроек и целенаправленно вести их поиск. Это в первую очередь касается описанного нами процесса перемещения стабильных МТ пучков в пространстве клеточной цитоплазмы, происходящего за счет внешних приложенных к микротрубочкам сил. Первый кандидат на роль такого агента -актиновый кортикальный слой мейоцита.
Выводы
1. Разработан и применен к изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований у высших растений новый подход, заключающийся в анализе возможно большего числа аномалий данного процесса.
2. Проведено детальное изучение цикла микротрубочкового цитоскелета в нормальном и аномальном мейозе у гибридных, мутантных, анеуплоидных, гаплоидных, полиплоидных и трансгенных форм высших цветковых растений, охватывающих 19 видов, относящихся к 7 семействам однодольных и двудольных растений. Цикл цитоскелета в делении растительной клетки впервые представлен как полная, непрерывная и замкнутая цепь морфологических внутриклеточных преобразований, характеризующаяся высокой консервативностью.
3. Описаны и исследованы промежуточные стадии переходов цитоскелета между основными этапами мейотического деления растительной клетки:
3.1. В профазе цитоскелет проходит плоскостную реориентацию, тангенциальную ориентацию и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца.
3.2. В ранней прометафазе происходит дезинтеграция перинуклеарного кольца, выпрямление его микротрубочковых пучков и вход их в зону бывшего ядра с формированием хаотичной фигуры цитоскелета
3 3 В средней прометафазе, или хаотической стадии, происходит формирование биполярных фибрилл веретена - центральных и кинетохорных.
3 4В поздней прометафазе происходит ориентация биполярных фибрилл вдоль оси будущего деления за счет внешнего по отношению к цитоскелету механизма и окончательное формирование веретена деления за счет процессов самосборки элементов цитоскелета
3.5 В телофазе у видов однодольных растений фибриллы центрального веретена утилизуются в качестве системы фибрилл подвижного фрагмопласта. Предложена модель его центробежного движения и вскрыты закономерности временной регуляции процессов последовательного цитокинеза. В мейозе у видов двудольных растений описано формирование неподвижного фрагмопласта в телофазе I из радиальных пучков интерфазного цитоскелета.
3.6. Переход от телофазной конфигурации цитоскелета в виде фрагмопласта к радиальной интерфазной происходит автоматически у видов двудольных растений и путем синтеза новых пучков микротрубочек от дочерних ядер у однодольных.
4. Полученные данные по исследованию цикла цитоскелета в материнских клетках пыльцы высших растений в основном согласуются с представлениями Э. Байера о самосборке структур цитоскелета в делении растительной клетки и противоречат гипотезе Д Мэзия о гибкой центросоме.
5 Изучены и подробно описаны цитоскелетные механизмы реституционного процесса в мейозе у видов однодольных и двудольных растений - всего 13 новых механизмов.
6. Составлен каталог аномалий веретена деления растительной клетки в составе 26 аномалий, 23 из которых описаны впервые. Морфогенез каждой аномалии детально описан В основу каталога положен принцип последовательных нарушений событий цитоскелетного цикла.
Список статей, опубликованных по теме диссертации
1. Н.В. Шамина, И.Н. Голубовская. 1981. Контроль формирования и функции митотического аппарата. Цитология и Генетика, т. 15, стр. 7787.
2. Н.В. Шамина, И.Н. Голубовская, А.Д. Груздев. 1981. Морфологические нарушения веретена у некоторых мейотических мутантов кукурузы. Цитология, т.23. стр.275-281.
3. Н.В. Шамина, А Д.Груздев. 1987. Исследование двойного лучепреломления веретена у меймутантов кукурузы. Цитология, т.29, стр. 104-106.
4. Н.В. Шамина. 1988. Изучение генетического контроля построения и функции веретена деления с использованием мутаций, нарушающих расхождение хромосом в мейозе у кукурузы. Цитология, т. 30, стр. 1301-1305.
5. Н.В. Дорогова, Н.В. Шамина. 1994. Особенности цитокинеза в клетках высших растений. Цитология, т.Зб, стр. 899-915.
6. Н.В. Шамина, Я.С. Рузанкина, СП. Соснихина. 1994. Нарушение структуры веретена деления мутацией теНО в мужском мейозе у ржи. Цитология, т.36, стр. 189-194.
7. Н.В. Шамина, С.Е. Козырева. 1995. Аномалии веретена, ведущие к мейотической реституции в мейозе отдаленных гибридов. Цитология, т.37, стр.775-782.
8. Н.В. Дорогова, Н.В. Шамина. 1995. Ультраструктура аномального мейоза у мутанта ms43 у кукурузы. Цитология, т.37, стр.561-566.
9. N.V. Dorogova, N.V. Shamina, S.I. Maletski. 1999. The mutational variation of a cytoskeleton and formation of unreduced male gametes in sugar beet. Sugar Tech vol.1, p.83-85.
10. N.V. Shamina, N.V. Dorogova, A.G. Oiiova, S.A. Trunova, N.P. Gontcharov. 1999. Abnormalities of spindle and cytokinesis behavior leading to meiotic restitution in cereals. Cell Biol Internatl vol.23, pp. 863-870.
11. Н.В. Шамина, Н.В. Дорогова. 2000. Аномалии микротрубочкового цитоскелета в мутантной линии сахарной свеклы. Цитология, т.42, стр.372-379.
12. Н.В. Шамина. Н.В. Дорогова, П.Л. Перельман. 2000. Нарушения мужского мейоза у гороха Pisum sativum L, вызываемые мутацией ms3. Цитология, т.42, стр 404-411.
13. N.V. Shamina, N.V. Dorogova, ТА Trunova. 2000. Radial spindle and the
phenotype of maize meiotic mutant, dv. Cell Biol Internatl vol.24, pp.729-736.
14.H.B. Шамина, Н.В. Дорогова, A.A. Загорская, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный. 2000. Аномалии мужского мейоза в стерильной трансгенной линии табака RES91. Цитология, т.42, стр. 1159-1164.
15.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, lu.V. Sidorchuk, A.A. Zagorskaya, E.V. Deineko, and V.K. Shumny. 2000. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco (Nicotiana tabacum L). Cell Biol Internatl vol 25, pp. 367-369.
16.Ю.В. Сидорчук, А.А. Загорская, Е.В. Дейнеко, Н.В. Шамина, В.К. Шумный. 2000. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ. Цитология и Генетика, т. 34, стр. 3-8.
17.Н.В. Шамина, Н.Я. Вайсман, Н.В. Дорогова, ОА Шаворская, СИ. Малецкий. 2001. Интерзональные микротрубочки и мейотическая реституция у двудольных. Цитология, т.43, №1, стр.33-38.
18.Дорогова Н.В., Шамина Н.В. 2001. Феномен чрезмерного цитокинеза в фенотипе мейотической мутации рату кукурузы. Цитология. Т.43. С. 471-476
19.Серкжова Е.Г., Дорогова Н.В., Жарков НА, Шамина Н.В. 2003. Нарушения прометафазы, приводящие к реституции ядер. Цитология т. 45, №3. стр. 244248.
20.Shamina N.V., Silkova O.G., Seriukova E.G. 2003. Monopolar spindles in meiosis of
intergeneric cereal hybrids. Cell Biol Intematl 27: 657-664. 21 .Шамина Н.В. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. I. Околоядерное кольцо микротрубочек и построение мейотического веретена. Цитология, т.45, №7, стр. 650-654.
22.Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серюкова Е.Г. 2003а. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. II. Формирование перинуклеарного кольца микротрубочек. Цитология, т. 45, №7, стр. 655-660.
23.Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серюкова Е.Г, Силкова О.Г. 20036. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. III. Стадии ранней прометафазы. Цитология, т. 45, №7, стр. 661-667.
24.Conicella С, Capo A, Cammareri M, Errico A, Shamina N, Monti L 2003. Elucidation of meiotic nuclear restitution mechanisms in potato through analysis of microtubular cytoskeleton. Euphytica 133:107-115.
Подписано к печати 16 февраля 2004 г. Формат бумаги 60 X 90 Печ. л. 2. Уч. изд. л 1,4 Тираж 110 экз. Заказ 26
Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10
-
Шамина, Наталия Владимировна
-
доктора биологических наук
-
Новосибирск, 2004
-
ВАК 03.00.25
- ДИНАМИКА МИКРОТРУБОЧКОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ХОДЕ ДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
- Динамика микротрубочкового цитоскелета в аномальном мейозе у трансгенных растений табака (N. tabacum L.)
- Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки
- Структурная и функциональная организация цитокинеза у высших растений на примере мейотического деления в материнских клетках пыльцы
- Морфофизиологические изменения корней озимой пшеницы в связи с деструкцией цитоскелета при действии индукторов морозоустойчивости
