Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки"

На правах рукописи УДК.581.17в:581Л:57в.35

Шамина Наталия Владимировна

ЦИКЛ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА В ДЕЛЕНИИ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории ультраструктуры клетки, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Васильев Андрей Евгеньевич, Биологический ин-т РАН, г. Санкт-Петербург

Доктор биологических наук, лрофессор

Стегний Владимир Николаевич, Томский государственный университет

Доктор биологических наук с-н.с. Чадов Борис Федорович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « ноября_ 2005 г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г Новосибирск, просп.акад. Лаврентьева, 10. Тел. (383) 333-31-17, e-mail: dissov@bionet.nsc.nj. FAX (383) 333 12 78.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « /К Ра-'^Ь^лР 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Груздев АД.

2 UM

ЦОШд

Актуальность проблемы. Цитоскелетом называется совокупность внутриклеточных фибриллярных структур, осуществляющих широкий спектр разнообразных функций в процессе жизнедеятельности клетки. Цитоскелет растительной клетки представлен, в основном, двумя составляющими: тубулиновыми микротрубочками (МТ) и акгиновыми микрофиламентами (МФ). Фундаментальным биологическим процессом, в котором цитоскелету принадлежит ключевая роль, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно своим изменяющимся функциям на каждой стадии деления. В делении растительной, да и любой эукариотной, клетки основная роль принадлежит микротрубочковому цитоскелету (Baluska et al., 2004). Актиновые микрофиламенты колокализуются с микротрубочковыми пучками в составе основных цитоскелетных структур, но их функция в них не ясна, поскольку ингибиторы актина не нарушают деления растительной клетки. Растительная клетка отличается от животной многообразием структур цитоскелета, сменяющих друг друга в ходе клеточного цикла Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (Goddard et al., 1994). В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. В клетках высших цветковых растений центросома не идентифицирована в качестве морфологической структуры. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов деления эукариотной клетки была предложена еще Т Бовери (Boveri, 1901) и активно поддержана Д. Мэзия. Мэзия предложил для растительной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, линейно соединенных меязду собой гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомной структуры в растительной клетке - дело будущего и зависит от развития методов цитологического анализа (Mazia, 1987). Существует противоположная точка зрения на регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых пучков в различные конфигурации посредством активности ассоциированных с ними белков (Smimova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.

Согласно современным представлениям, для регуляции динамики МТ цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: центры организации микротрубочек (ЦОМТ), - служащие в качестве затравки для полимеризации МТ. В животных клетках ЦОМТ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений ЦОМТ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1993). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют Собой важнейшую нерешенную проблему в клеточной биологии (Marc, 1997; Baluska et al. 1998, 2004).

Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и актуальной

является задача детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. До сих пор это не было сделано по причине деполимеризации цитоскелета на некоторых переходных стадиях цикла.

Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.

Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма информативный способ решения разнообразных задач клеточной биологии. К сожалению, до сих пор использование морфологических аномалий в цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993; Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект - изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или к апомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999) Третий аспект использования клеточных аномалий для решения цитологических задач - анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних,- предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et al., 1997; Binarova et al., 1998).

Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрьггые в норме. Полностью нарушая или изменяя взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают роль этих структур в таком взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалий используется в анализе. Мы назвали этот подход морфологической диссвкцивй.

Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны, легко доступны, многочисленны, синхронизованы по стадиям деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений могут быть получены в большом количестве. Легкая асинхронность между мейоцитами по длине пыльника позволяет проследить кратковременные переходные этапы каждой стадии мейотического деления В настоящее время для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки в качестве модели используются клетки различных типов: протопласты, эндосперм, меристематические вакуолизированные и лишенные вакуолей, дифференцирующиеся и так далее. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью.

Главные переходные стадии перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки не были описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологическом

уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукаристной клетки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических механизмов регуляции цикла морфологических структур цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне на основании полученных данных. Для выполнения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1 Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований

2. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки.

3. Создать обширную коллекцию аномалий мейолгического деления различной этиологии у различных видов однодольных и двудольных растений.

4 Разработать варианты методов визуализации микротрубочкового цитоскелета - как классических так и иммуноокрашивания,- оптимальных для работы с материнскими клетками пыльцы и адекватных поставленным задачам

5. Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.

6. Сравнить цикл цитоскелета в мейозе у видов с последовательным и одновременным цитокинезом.

7 Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет - для выяснения цитоскелетных механизмов мейотической реституции. Научная новизна работы. В результате проведенных в настоящей работе исследований внесен существенный вклад в решение важной проблемы клеточной биологии: мор<}юлогической регуляции перестроек цитоскелета в ходе деления бесцентриолярной клетки. Представленные к защите результаты и выводы оригинальны и получены впервые.

Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований - морфологическая диссекция - представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. Впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных центральных и кинетохорных фибрилл веретена; выявлены не описанные ранее механизмы формирования биполярного веретена в поздней прометафазе. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Выявлены три новые процесса цикла цитоскелета в растительной клетке: перемещение стабильных элементов цитоскелета (пучков МТ) в пространстве клеточной цитоплазмы, изменение их профиля и консолидация элементов цитоскелета. Предложена модель временной регуляции цитокинеза. Внесен существенный вклад в

понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.

Положения, выносимые на защиту. 1). Описано 9 новых этапов цикла цитоскелета в растительном мейозе в дополнение к 4 уже известным. 2). Выявлено 3 новых морфологических процесса, лежащих в основе реорганизации цитоскелета в растительной клетке, в дополнение к 3 известным. 3) Полученные в настоящей работе данные о неизвестных ранее этапах цикла цитоскелета и об обеспечивающих этот цикл процессах, а также об их аномалиях не поддерживают гипотезу о присутствии центросомы в делящейся растительной клетке. Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения, промышленное получение дигаплоидов и апомиксис С этой точки зрения особенно актуален представленный в работе каталог механизмов мейопгической реституции, в котором впервые описаны 18 цитоскелетных механизмов мейотической реституции у видов однодольных и двудольных растений. Описаны 26 новых аномалий анастрального веретена в дополнение к 4, известным ранее в литературе, а также 23 новые аномалии цитокинеза. Разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам Каталоги аномалий растительного веретена деления и структур цитокинеза, подавляющую часть которых составляют аномалии, описанные впервые, представляют ценность как справочное пособие, в частности, при анализе морфологического фенотипа мейотических мутаций, особенно у сложных для цитологического анализа объектов Разработанный по результатам настоящей работы диагностикум аномалий мейотического деления по его продуктам представляет собой руководство по цитологическому анализу аномального мейоза у высших растений. Полученные сведения о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки используются для чтения лекций по цитологии и цитогенетике в Новосибирском и Санкт-Петербургском государственных университетах., а также в Университете Джапура (Индия). Апробация работы Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Конгрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гт, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на Гордоновской конференции "Meiosis" (США, 1996), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на (Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 2003), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации. По теме работы сделано 52 публикации, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, 6 глав результатов исследований с обсуждением, заключение и перспективы, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 360 страницах машинописного текста, содержит 45 схем, 10 таблиц и 36 сводных рисунков, включающих 453 микрофотографии. Список литературы включает 423 источника.

Материал и методы

Таблица 1. Формы с аномальным мейозом, использованные для выявления нарушений цикла цитоскелета в делении материнских клеток пыльцы

Отдаленные гибоиды злаков F1 Фоомы с аномальным мейозом v видов

Triticum aestivum х Elytrigia elongatum: Иртышанка 10 х Nsl5 Кормовая 128 x N«15; СП718 х №15 E.elongetum х Т. aestivum: №15 x Лютесценс 132 Triticum durum х Elytrigia elongatum: Алмаз x №15 ; Алтайка х №15 Алтайская нива х №15 Triticum dicoccum х Е. elongatum (Г.М. Серюков, ОмГАУ) Triticum aestivum х A. glaucum: АНК26-А x №260-8; АНК260-А х №2577; АНХ9 ж №257-7; АНК9 х №52-3 ; АНЮ 5 x №257-7 Новосибирская 67 х №13-1 Новосибирская 67 х №20 Новосибирская 67 х №52-3 Новосибирская 67 х №260-8 Новосибирская 67 х №257-7) Альбидум 114 x №3 (A.M. Орлова, ИЦиГ СО РАН) СП718х№7 ( Г.М. Серюков, ОмГАУ) Т. aestivum с.Саратовская 29 х S. cereale с Онохойская (АИ.Щапова, ИЦиГ СО РАН) T.palmovae xT.aestivumc.Triple Dirk; T. femiginea x S. cereale, с. Онохойская (Н.П. Гончаров, ИциГ) Мейотические мутации у видов двудольных оастений Линия СОАН-112 Beta vulgaris (С.Г. Вепрев, ИЦиГ СО РАН). Линия В-24 Beta vulgaris (С.И. Малецкий, ИЦиГ СО РАН). Гаплоиды Brassica juncea Rajat. (Я. Кестере, PRI, Нидерланды). Medteago sativa от 4л до 8п (Е.ВДейнеко.ИЦиГ СО РАН). Клоны картофеля Solanum tuberosum L. CD1015, CD1045, СЕ 10, ВЕ62, ВЕ1050,(М. Раманна, WUR); RH95-237-03, RH95-237-06, RH95-237-14; RH95-273-20; RH96-2013-03, HZ94DTA, НЕ096-959, 98-2013 (P.XerreH„WUR. Нидерланды). Трансгенные стерильные клоны катофеля S. tuberosum CD29.14, CD29.21 ;CD29.22,CD29.23, CD29.26, CR29.09,CR29.10,CR29.18, CR29.19, B92.7015,HB29-12, HB29.17, R29.02, R29.03, R29.10^(12.02^(12.04,6486.04 (К. Хейтинг, WUR, Нидерланды). Трансгенные стерильные линии N'Kotiana tabacum Res47, Res73, Res79, Res91, 10.8, 121.57, 121.83, 121.86,121.92,- (E.B. Дейнеко, ИЦиГ) Аллотриплоиды S. tuberosum x L esculentum x L. penneffii (X. ван Эюс, WUR, Нидерланды) Естественный апомикг Arabis МЬоеШ (К Бутелье ,PRI, Нид-ды) Межвидовые гибриды картофеля F1: Solanum tuberosum с. Kathadin х Solanum fureja; Solanum tuberosum с. Chippewa x Solanum fureja, (K. КЬничелла, Неапол. ун-т, Италия). Томатно-картофельные гибриды L. Esculentum х S. tuberosum , Lesculentum х S. commersonii (Д. Хайхен, WUR, Нидерланды) Мейотические мутанты у видов

однодольных метений ms28, divergent spindle (dv), теЮ25, pam1, ms43 Zea mays - (ВИР им. Н.И. Вавилова); mei10 Seeale cereale -(С.П. Соснихина, С-Петербургекий Университет). Псючие сЬоомы Моносомная линия пшеницы Triticum aestivum L. с. Мильтурум 553 по хромосоме 1А (А.Н. Жарков, (СибНИИСХоз, Омск). Аллоплазмат. линия СуАНК-1А (Т. astivum с. Новосибирская 67 х S. cereale, (С.Ф. Коваль, ИЦиО Триплоиды вороньего глаза Paris quadrifolia (A.A. Козлова, ТГУ) Гаплоиды Zea mays в различных линиях (Э.Р. Забирова, КНИИСХ)

двудольных растений ms3, ms2, as1, as2, as3, as4, asS, as7, dsyl, dsy3 Pisum sativum, c. Dippes Gelbe Victoria (Nordic Gene Bank, Atnarp, Швеция), as6 L. esculentum (X. де Йонг, WUR)

В скобках поименованы авторы коллекций, любезно предоставившие материал для исследования.

Всего нами изучено 302 различных генотипа с аномальным мейозом, а также их дикий тип или родительские формы Материал охватывает 20 видов однодольных и двудольных растений, относящихся к 7 семействам.

Методы исследования. Для цитологического анализа материнских клеток пыльцы (МКП) применяли все известные в настоящее время методы визуализации цитоскелета: традиционные (по Навашину, оптика Номарского), иммуноокрашивание и электронную микроскопию. Во всех трех группах методов нами были разработаны варианты, оптимальные для работы с МКП.

Результаты

Вариабельность и консервативность цикла цитоскелета в мейозе у высших растений

В исследованном материале нами было обнаружено 39 типов аномалий цикла цитоскелета и сопряженных с ним процессов карио- и цитокинеза

Два основных препятствия в изучении цикла цитоскелета в ходе деления растительной клетки - это отсутствие морфологически идентифицируемых центросомальных структур и деполимеризация цитоскелета на некоторых переходных стадиях цикла, в результате чего он становится недоступен для наблюдения Деполимеризация происходит главным образом в профазе - ранней прометафаэе, когда осуществляются важнейшие процессы перехода от интерфазной конфигурации цитоскелета к веретену деления. С этой точки зрения большой удачей оказалось обнаружение в исследованном материале форм, в которых деполимеризации цитоскелета на этих стадиях не происходит. Мы назвали эти формы девиантными Под девиацией мы подразумеваем такое отклонение от дикого типа, при котором изменяются некоторые характеристики изучаемого процесса, но сам процесс происходит нормально, то есть формируются, сменяют друг друга и нормально функционируют все системные структуры цитоскелета, и деление клетки происходит само по себе нормально По нашим данным, этот девиантный путь может осуществляться спонтанно в небольшой части МКП в мейозе тех видов, у которых преобладает деполимеризация цитоскелета в профазе Девиация цикла цитоскелета, заключающаяся в отсутствии его деполимеризации в профазе/прометафазе, весьма характерна для мейотического деления в МКП отдаленных гибридов первого поколения- она наблюдалась в 100% МКП в 40 изученных нами различных генотипах ППГ Р1. Кроме того, мы обнаружили, что цикл цитоскелета без деполимеризации в профазе/прометафазе осуществляется в 100% МКП в мейозе дикого типа у пырея удлиненного (Е^пд/'а е/опдай/т) Девиации являются ценным инструментом цитологического исследования, поскольку прямо, а не косвенно выявляют неизвестные характеристики изучаемого процесса Ранее такой материал для анализа цикла цитоскелета не использовался

Детальный цитологический анализ нормального, девиантного и множества аномальных вариантов цикла цитоскелета в изученном материале показал высокую консервативность этого процесса в мейозе у высших растений. Во всех проанализированных нами фенотипах цитоскелет проходит (или проходит частично в блокирующих аномалиях) единообразную последовательность перестроек из одной системы в другую. Подавляющее большинство аномалий цикла цитоскелета встречаются в мейозе у различных видов и форм, что показано в таблице 2.

Таблица 2. Количество генотипов с определенными аномалиями цитоскелетного цикла, выявленное в различных группах исследованных растений. В столбце «прочие» объединены трансгенные, полиплоидные, анеуплоидные, аллоплазматические, гибридные растения, а также линии и клоны.

Фенотип Пшенично- пырейные гибриды Р1 Пшенично- ржаные гибриды Р1 Меймутанты Гаплоиды Прочие формы фенотип I Пшенично-пырейные гибриды Р1. Пшенично- ржаные гибриды Р1 Меймутанты Гаплоиды Прочив формы

Девиация <50%МКП 43 4 7 1 17 Разомкнутое веретено 2 2

Блок 2 Нарушение 1 5

перемещения радиальных пространствен ной

пучков цитоскелета организации фрагмопласта

Автономное 2 1 Дивергентное

перинуклеарное веретено 11 3 2 1 8

кольцо

Прямой 1 Митотическое 3 1

тангенциальный пучок в профазе веретено в мейозе

Деформированное перинуклеарное 2 Гилертрофиров анное веретено 3 2

кольцо

Общее кольцо 5 3 3 Автономное веретено 5 1

Слившиеся 1 Отсутствие 7 1 1

кольца клеточной пластинки

Нарушение входа МТ в зону бывшего ядра 2 Чрезмерный цитокинез 1 1 1

Сохранение 4 «Комета», 3 1 1 1

перинуклеарного кольца на более монополярое расхождение

поздних стадиях деления хромосом в биполярном веретене

С-образное 52 6 7 4 5 Нарушение 1 1

веретено движения фрагмопласта

Э-образное веретено 12 3 2 5 Диады с деформацией дочерних мембран 1

Комбинированное 3 1 1 Туннельный 9 4 2

веретено цитокинез

Отсутствие кинетохорных МТ 4 1 2 2 Отсутствие фрагмопласта 4 2 1

Нарушение формирования центральных фибрилл веретена 2 2 1 1 Полиаркальное или многополюсное веретено 7 2 3 в

Автономный конус 2 Разомкнутый фрагмопласг 2 2 1

Монополярное веретено 2 1 2 1 Мини-веретена 3 1

Хаотическое веретено 4 2 1 Кольцевое веретено 3 1

Радиальное веретено 1 Дезориентация веретен(а) 1 3 36

Дезинтегрированн ое веретено 1 1 Неполный цитокинез 37 в 7 4 14

Динамика цитоскелета в мейотической профазе.

В ходе цитоскелетного цикла профаза является промежуточной стадией при преходе от интерфазной конфигурации микротрубочковых (МТ) пучков к прометафазной. Изучение поведения цитоскелета в профазе осложняется тем, что как в растительных, так и в животных клетках цитоскелет на этой стадии деполимеризуется. Однако если в животных клетках ход цикла цитоскелета в этот момент можно проследить, наблюдая поведение центросомных структур (центриолей), организующих цитоскелет, то растительная клетка их лишена. Поэтому механизм перехода МТ цитоскелета от интерфазной конфигурации к прометафазной неизвестен. Мы обнаружили, что иногда в МКП наблюдается иной путь прохождения цитоскелетом профазы, при котором деполимеризации микротрубочек цитоскелета не происходит, и он остается доступным для цитологического анализа.

Согласно нашим наблюдениям, в ходе девиантной профазы микротрубочки ретикулярного цитоскелета, ранее отходившие в цитоплазму от всей площади поверхности ядерной оболочки, в поздней профазе распространяются от довольно узкой кольцевой меридиональной (относительно оси будущего деления) области на поверхности ядерной оболочки. Форма пучков также изменяется: они становятся выпрямленными. В результате этих изменений цитоскелет принимает вид плоской радиальной системы прямых микротрубочковых пучков, в виде спиц колеса, лежащей в плоскости будущего деления. Затем радиальный цитоскелет постепенно замещается изогнутыми пучками микротрубочек, окружающими ядро в меридиональной плоскости относительно оси будущего деления. Промежуточным этапом этого процесса является одновременное присутствие в клетке радиальных и тангенциальных пучков, а также МТ пучков промежуточной ориентации. В ходе этого процесса можно наблюдать смещение пучков микротрубочек из радиального в тангенциальное положение. Сформированная система теринуклеарных микротрубочек в мейотическом делении представляет собой плоское кольцо, ориентированное меридионально относительно оси будущего целения. Пучки МТ, образующие кольцо, изогнуты. Ни одно из многих сотен проанализированных нами колец в девиантном мейозе у различных видов и форм высших растений не имело точек конвергенции микротрубочек. У всего множества

проанализированных нами форм с девиантным мейоэом (табл.2) перестройки цитоскелета в профазе происходили по описанной схеме (ретикулярный цитоскелет - радиальный цитоскелет - перинуклеарное кольцо), единообразно и без вариаций. См. рис.1.

Рисунок 1. Перинуклеарные цитоскелегные кольца в мейозе у различных видов Sol añacea. Микротрубочки визуализированы методом иммуноокрашивания а)- на а-тубулин; б, в)- на ß-тубулин.

а)-заключительные стадии формирования кольца в профазе I в МКП картофеля Solanum tuberosum, сорт Катаден; б) - сформированное перинуклеарное кольцо в МКП дикого типа томата Lycopersocon esculentum, с. Черри; в)- перинуклеарные кольца в профазе II в МКП томата Lesculentum, с. Черри.

Исследуя линии с аномальным мейозом, мы обнаружили ряд нарушений процесса динамики цитоскелета в профазе: 1) блок перестройки радиального цитоскелета в перинуклеарное кольцо (ППГ № 9-00 Triticum aestivum L. SP-718 x Agmpyron glaucum; ППГ № 83-4 T.aestívum ANK9 x A.giaucum). 2) формирование автономного кольца микротрубочек, отделенного от ядра (ППГ№№14-2 и 14-4 Т. aestivum ,с. Новосибирская 67 х A. glaucum Ne 13-1), 3) прямой тангенциальный пучок МТ вместо околоядерного кольца (ППГ № 13-1 Т. aestivum L с. Альбидум х A. glaucum); 4) общее перинуклеарное кольцо в многоядерных МКП однодольных видов (мутация рат1 Zea mays, ППГ Ne 16-5 (Г. aestivum L.copr Иртышанка 10 х Elytrigia elongatum; ППГ № 1-99 Е. etongatum х Т. aestivum, с. Лютесценс; формы с цитомиксисом); 5) слияние перинукпеарных колец в фенотипе «слившиеся веретёна> (клон СЕЮ картофеля S. tuberosum), 6) деформированные перинуклеарные кольца (ППГ F1Ne 22-2 Triticum aestivum с Кормовая 128 х Elytrigia elongatum; ПП1Т1 №16-3, Т. aestivum с. Иртышанка х £. elongatum) что позволило расчленить его на отдельные этапы и события, а также выявить некоторые его характеристики. Аномалии 2 и 4 указывают на независимость перестроек цитоскелета в профазе от дифференциальной активности МТОЦ ядерной оболочки и подтверждают наблюдаемый в норме механизм формирования перинуклеарного кольца как процесс перемещения в цитоплазме стабильных МТ пучков. Аномалии 1 и 3 являются результатом блока обнаруженных нами в норме процессов: перемещения МТ пучков из радиального положения в тангенциальное и изгиба МТ в составе перинуклеарного кольца. Аномалия 5 наглядно демонстрирует, что перинуклеарное кольцо обладает собственной динамикой и способностью к активным морфологическим преобразованиям, ведущим к консолидации цитоскелета и генетического материала. Аномалия 6 демонстрирует нарушение изменения профиля МТ пучков при формировании кольца.

Необходимо отметить, что наши исследования цикла цитоскелета в фенотипах с деполимеризацией МТ в профазе показали наличие очень тонкого кольцевого меридионального перинуклеарного антитубулинового окрашивания в поздней профазе, сохранявшегося вплоть до распада ядерной оболочки. Это не

удивительно, поскольку деполимеризация МТ представляет собой их укорочение по направлению к (-)-концам, то есть от периферии к ядру. В некоторых МКП, где деполимеризация МТ была замедлена, можно было наблюдать формирование плоской радиальной системы МТ, которая предшествует формированию кольца в девиантных клетках. Это указывает на общий принцип перестроек цитоскелета в профазе нормальных и девиантных клеток. На это же указывает спонтанное появление девиантных МКП в пыльниках с МКП обычного фенотипа. Сохранение очень тонкого перинуклеарного кольцевого окрашивания в поздней профазе было описано ранее в МКП баклажана (Traas et al., 1989). Однако деполимеризация цитоскелета, происходящая в профазе мейоза у этого объекта, не дает возможности связать эту фигуру с предыдущей и последующей цитоскелетными структурами. Поэтому авторы никак не обсуждали это наблюдение, и впоследствии оно было забыто.

Динамика цитоскелета в прометафазе. Построение анастрального веретена деления.

Прометафаза отделяется от профазы таким значимым морфологическим событием, как распад ядерной оболочки. В результате этого цитоскелет получает возможность контакта с хромосомами в процессе построения веретена деления. В девиантных клетках переход от профазной конфигурации к веретену возможно проследить, поскольку МТ достаточно длинны для визуального наблюдения. Цикл цитоскелета в этом случае предстает непрерывным процессом пространственных перемещений МТ пучков.

Ранняя прометафаза После (или в процессе) распада ядерной оболочки перинуклеарное кольцо разделяется на отдельные пучки микротрубочек, которые выпрямляются и занимают тангенциальное положение по отношению к зоне бывшего ядра. Наблюдая сотни синхронизованных клеток на одном препарате, можно видеть, как МТ бывшего перинуклеарного кольца постепенно перемещаются в цитоплазме и входят в зону бывшего ядра. На этой стадии прометафазная фигура цитоскелета представляет собой хаотичную сеть из перекрещивающихся пучков МТ. Период цитоскелегаого цикла от распада перинуклеарного кольца до формирования хаотичной фигуры мы назвали ранней прометафазой. Ее основные процессы, наблюдаемые в девиантной норме' 1) разделение кольца на отдельные пучки МТ, 2) выпрямление МТ пучков, 3) их поворот и вход в зону бывшего ядра с формированием хаотичной фигуры. Этот процесс консервативен и наблюдался во всех изученных нами девиантных формах различных видов и форм высших растений (см. табл. 2).

Нам удалось выделить ряд аномалий по процессам ранней прометафазы, подтверждающих приведенные выше наблюдения:

1) В 20% МКП ППГ F1 № 9-3 (Triticum. aestivum L, с. Новосибирская 67 х Agropyron glaucum; № 2-2 и 2-5 Т. durum с. Алтайская Нива х Е. elongatum) происходит нарушение разборки перинуклеарного кольца и сохранение его на стадии метафазы вплоть до телофазы. Сегрегация хромосом и цитокинез полностью блокированы.

2) При нормальной «разборке» кольца и нарушении выпрямления его МТ формируются изогнутые С-, S-образные, а также комбинированные, сформированные из изогнутых и прямых пучков МТ, веретёна. Искривление веретена является массовой аномалией асинаптического мейоза и наблюдается в 80% изученных нами отдаленных гибридов 1 поколения, а

также у всех синаптических мутантов и гаплоидов. В МКП меймутанта ms28 (Zea mays) изогнутые веретена формируются на фоне полного синапсиса хромосом.

3) В мейозе у ППГ F1 № 5-5 (Г. aestívum , с. ANK9 х A. glaucum 52-3; Ne 9-4 Т. aestivum с. Новосибирская 67 х A. glaucum) блокирована последняя стадия ранней прометафазы: вход цитоскелета в ядро Кольцо теряет целостность, разделяется на отдельные пучки МТ, которые распрямляются, но не перемещаются в цитоплазме. Тангенциально ориентированные прямые пучки МТ окружают зону бывшего ядра и сохраняют это расположение вплоть до телофазы. Веретено не строится, карио- и цитокинез полностью блокированы Перечисленные аномалии являются результатом блока основных процессов ранней прометафазы.

Средняя прометафазе. Переориентация МТ перинуклеарного кольца и перемещение их в область расположения хромосом автоматически создает хаотическую цитоскелетную фигуру, состоящую из множества ориентированных случайным образом МТ пучков. Мы выделили хаотическую стадию в особую под стадию прометафазы и назвали ее средней прометафазой по причине ее значительной продленности по сравнению с прочими. Происходящие в этот период процессы не были ранее описаны. A priori можно предположить, что в это время происходит взаимодействие МТ с кинетохорами хромосом. Действительно, в ряде фенотипов с продленной хаотической стадией мы наблюдали, что хромосомы в этот период несут полностью сформированные, противоположно направленные кинетохорные пучки МТ. Это представляет собой важнейший этап формирования элементов биполярного веретена - формирование биполярных кинетохорных фибрилл, у которых (+)-концы МТ находятся в центре фибриллы, на кинетохорах, а (-)-концы МТ - на концах фибриллы.

Наши данные свидетельствуют также о том, что в средней про мета фазе формируются и биполярные центральные фибриллы веретена, представляющие собой результат соединения (+)-концами двух свободных МТ пучков. На это указывает ход прометафазы в мейозе у ППГ F1 № 27-1 (Т. aestivum с. Саратовская 29 х A. glaucum; ППГ № 5-1 T.aestivum ANK9 х A.glaucum 257-7; ППГ № 5-98 Т. durum с. Алтайка х Е. elongatum; у пшенично.-ржаной аллоплазматической линии СуАМКЭА), где блокировано формирование кинетохорных фибрилл. В этих фенотипах хаотическая фигура в средней прометафазе состоит из длинных МТ пучков, сравнимых по длине с длиной метафазного веретена. На десятках синхронизованных клеток на каждом препарате на этой стадии можно наблюдать постепенную ориентацию этих целостных МТ пучков вдоль оси деления и формирования из них биполярной системы веретена деления. Хромосомы из веретена исключены. Конвергенция фибрилл на полюсах указывает на то, (-)-концы МТ находят») на их концах, то есть что они являются биполярными. В телофазе на экваторе такого веретена строится клеточная пластинка, что доказывает присутствие в этой области (+•)-концов МТ, то есть также биполярность этих фибрилл.

При одновременном нарушении формирования биполярных кинетохорных и биполярных центральных фибрилл веретена формируются монополярные веретена, морфологически представляющие собой полуверетено. В материнских клетках пыльцы (МКП) пшенично-пырейного гибрида F1 № 30-2 (Tríticum aestivum с. Кормовая 128 х Elytrigia elongatum ) цикл цитоскелета происходит в виде девиантной нормы в профазе (формирование перинуклеарного кольца МТ) и ранней прометафазе (формирование хаотической фигуры). На стадии метафазы

1 вместо биполярного веретена формируется монополярное в виде конуса Биполярные кинетохорные фибриллы в этом случае не формируются по причине унивалентного состояния хромосом (каяодая хромосома несет только один кинетохор), а биполярные центральные фибриллы не формируются из-за нарушения соединения (+)-концов свободных МТ пучков. На то, что эта аномалия (блок соединения +-концов ) характерна для этого фенотипа, указывает присутствие в части МКП этого гибрида так называемых разомкнутых веретен" биполярных, но с торчащими в стороны свободными пучками МТ Такие веретена формируются либо в результате появления в клетке одного-двух бивалентов и формирования на них биполярных кинетохорных фибрилл, либо за счет соединения (+)-концами части свободных МТ пучков.

Объединение монополярных кинетохорных фибрилл (унивалент с одним пучком МТ) и свободных МТ пучков в единую систему и конвергенция их (-)-концов приводит к формированию цитоскелетной фигуры в виде конуса. (-)-КЬнцы МТ находятся на вершине конуса, а (+)-концы свободных МТ и хромосомы - в его основании. Движения хромосом и цитокинеза в таком веретене не происходит.

В делящейся растительной клетке монополярное веретено было описано нами впервые. Монополярные веретена описаны нами также в гаплоидах сарептской горчицы, где цикл цитоскелета происходит с деполимеризацией МТ в профазе/ранней прометафазе, а также в гаплоидах кукурузы. В ППГ № 45-11 Т. durum с Алтайская Нива х A glaucum и в ПРГ T.aestivum с. Саратовская 29 х S сегеа/е с Онохойская монополярные веретена имеют вид звезды (моноастера).

Поздняя прометафаза В дальнейшем ходе прометафазы хаотичный набор сформировавшихся в средней прометафазе биполярных фибрилл постепенно ориентируется вдоль оси будущего деления. Это можно наблюдать непосредственно В результате этих перемещений хромосомы оказываются на экваторе и образуют метафазную пластинку. Последний этап прометафазы -конвергенция концов фибрилл в одну точку и формирование полюсов биполярного веретена. Период от хаотичной фигуры до биполярного веретена деления называется поздней промета фазой. В норме ее процессы происходят быстро и слитно, так что трудно выяснить их механизмы. Предполагают, что формирование биполярной системы цитоскелета из хаотичной происходит в результате процесса латеральной ассоциации МТ пучков (Franklin, Cande, 1999); завершающим процессом поздней прометафазы является конвергенция МТ на полюсах (Staiger, Cande, 1990; 1991).

Нами впервые показано, что в формировании биполярного веретена в поздней прометафазе принимают участие полностью сформированные в средней прометафазе биполярные элементы веретена - центральные и кинетохорные фибриллы. Анализ составленной нами коллекции аномалий поздней прометафазы выявил дополнительный процесс формирования биполярного веретена: ориентацию фибрилл вдоль оси деления На это указывает аномалия «дезинтегрированное веретено» в фенотипе мейотического мутанта твИО ржи и серии клонов картофеля RH95. В этих фенотипах в 100% МКП формирование биполярного веретена из хаотической фигуры происходит без латеральной ассоциации фибрилл. Возможно, этот процесс осуществляется параллельно с латеральной ассоциацией и также приводит к формированию биполярной системы цитоскелета из хаотической На осуществление в поздней профазе еще одного, не описанного ранее, процесса, который можно назвать консолидацией веретена, указывает аномалия «радиальное веретено» в фенотипе мейотического мутанта dv (Zea mays). При этом из хаотической фигуры сформированных биполярных фибрилл при одновременном нарушении их латеральной

ассоциации, конвергенции и ориентации вдоль оси деления формируется оригинальное аномальное веретено в виде розетки При нарушении процесса консолидации в одноядерных клетках формируется несколько веретен деления (ПРГ Т. fenuginea х S. cereale). При блоке всех процессов поздней прометафазы метафазное веретено имеет вид хаотической фигуры. Эта аномалия была описана нами в фенотипе мбиотического мутанта ms3 (Pisum sativum), в мутантной линии СО АН-112 сахарной свеклы (Beta vulgaris) и у ряда отдаленных гибридов злаков.

Динамика цитоскелета в телофазе. Формирование фрагмопласта и цитокинез.

Детальный цитологический анализ процессов перестроек МТ цитоскелета на стадии телофазы в обоих мейотических делениях МКП у различных видов однодольных растений (последовательный цитокинез) в норме и при аномалиях показал, что для построения клеточной пластинки и осуществления цитокинеза у них в качестве фибриллярной системы фрагмопласта утилизуются центральные фибриллы веретена деления, которые окружают растущий край клеточной пластинки и осуществляют вместе с ней центробежное движение. Подтверждением этому служат также аномалии цитокинеза: «S-фрагмопласт» и «автономное веретено». В первом из этих фенотипов фрагмопласт в МКП с S-образным веретеном также имеет S-образную форму Во втором цитокинез происходит на экваторе веретена, лишенного хромосом, без каких-либо изменений его формы и структуры. Аномалия «пустой фрагмопласт», обнаруженная нами в 8 различных генотипах отдаленных гибридов злаков и в гаплоидах кукурузы, демонстрирует центробежное движение центральных фибрилл веретена в цитокинезе в отсутствие клеточной пластинки. Это указывает на активную роль цитоскелета в данном процессе и опровергает существующее представление о том, что причиной центробежного движения фрагмопласта служит центробежный рост клеточной пластинки. Нами показано также, что в ходе цитокинеза фибриллы центрального веретена меняют профиль от прямого к изогнутому.

На основании этих данных, а также данных литературы нами предложена модель центробежного движения фрагмопласта. Этот механизм представлен нами как модификация механизма удлинения центрального веретена в В-анафазе в клетках животных и низших эукариот Как известно, это удлинение происходит за счет присоединения димеров тубулина к (+)-концам МТ в области их перекрывания на экваторе, а также за счет взаимного скольжения противоположно направленных МТ в составе центрального веретена. Предложенная модель центробежного движения фрагмопласта основывается на наших данных о том, что

1) фибриллярная система фрагмопласта представляет собой систему фибрилл центрального веретена;

2) она активно движется центробежно за счет собственных механизмов;

3) фибриллы центрального веретена в ходе центробежного движения изгибаются.

Модель основывается также на данных литературы, согласно которым

1) в зону перекрывания (+)-концов МТ пучков на экваторе фрагмопласта происходит активное встраивание димеров тубулина (Vantard et al., 1990; Zang et al., 1990) и

2) во фрагмопласте обнаруживается присутствие моторных белков, вызывающих взаимное скольжение антипараллельных МТ (Asada et al, 1997).

Мы полагаем, что центробежное движение фибрилл фрагмопласта происходит в результате сочетания двух процессов: их удлинения и изгиба. Удлинение происходит за счет присоединения димеров тубулина к (+)-концам МТ в зоне их перекрывания и взаимного скольжения противоположно направленных МТ. Изгиб может регулироваться активностью МТ-ассоциированных белков. В результате этого точка перекрывания (+)-концов МТ каждой фибриллы может перемещаться центробежно Поскольку в эту точку происходит транспорт мембранных пузырьков клеточной пластинки, перемещение этих точек у всей совокупности фибрилл фрагмопласта обеспечивает центробежный рост клеточной пластинки

На основании анализа таких обнаруженных нами аномалий цитокинеза у однодольных, как «чрезмерный цитокинез», «блок слияния пласгосом», «добавочный цитокинез», «преждевременный цитокинез», «неполный цитокинез», «туннельный цитокинез» предложена модель временной регуляции процесса последовательного цитокинеза в мейозе у высших растений Согласно этой модели, сигналом к прекращению основных процессов цитокинеза (центробежного движения фибрилл фрагмопласта и синтеза мембранных пузырьков клеточной пластинки) является формирование дочерних клеточных мембран или их фрагментов при соприкосновении клеточной пластинки с мембраной материнской клетки (см. рис.2).

Рисунок 2. Схема временной регуляции процессов цитокинеза Пластосомы = мембранные пузырьки клеточной пластинки

Анализ динамики цитоскелета на стадии телофазы в мейозе у видов двудольных растений показал, что принципиальных отличий цикла цитоскелета на этой стадии от такового в МКП однодольных нет. Роль фрагмопласта в мейозе у

двудольных выполняют фибриллы центрального веретена и радиального интерфазного цитоскелета. Фибриллы фрагмопласта в результате заполняют всю цитоплазму и не совершают центробежного движения в ходе построения клеточной пластинки (неподвижный фрагмопласт). Отсутствие цитокинеза после первого мейотического деления в МКП у двудольных обусловлено блоком формирования клеточной пластинки в этот период; формирование же фрагмопласта происходит без нарушений.

Из вышеизложенного следует, что в мейозе у высших растений в цикле цитоскелета не формируется такой специальной системной структуры цитоскелета, как фрагмопласт, а его функцию выполняют другие системные структуры цитоскелета (веретено деления и радиальный цитоскелег).

Переход от фрагмопласта к интерфазному радиальному цитоскелету.

Согласно нашим наблюдениям, в МКП у видов однодольных и двудольных растений формирование радиального интерфазного цитоскелета происходит в поздней телофазе от полюсных районов веретена и позднее - от оболочки дочерних ядер. Фибриллы фрагмопласта (бывшего центрального веретена) у однодольных могут включаться в состав радиального цитоскелета, а могут деполимеризоваться после формирования мембран дочерних клеток, Консервация или деполимеризация МТ фрагмопласта может наблюдаться в различных МКП одного и того же пыльника и представляет собой девиацию цитоскелетного цикла на этой стадии. В МКП видов двудольных растений роль фрагмопласта играют пучки радиального цитоскелета, которые и остаются в статусе интерфазного цитоскелета после формирования дочерних клеточных мембран.

В исследованном материале мы выделили ряд аномалий процесса перехода к интерфазному цитоскелету: 1) блок разделения (+)-концов МТ фрагмопласта в результате неполного цитокинеза ; 2) блок разделения (+)-концов фрагмопласта при полном цитокинезе; 3) нарушение формирования радиальной системы цитоскелета; 4) радиальный цитоскелет в клетках с микроядрами. Эти аномалии указывают на то, что переход от фрагмопласта к радиальному цитоскелету включает специальный процесс разделения (+)-концов МТ фрагмопласта, который не происходит автоматически при формировании дочерних мембран и может быть нарушен. Важнейшей характеристикой этой стадии является то, что она - единственная в цикле, когда происходит полимеризация новых микротрубочек на новых МТОЦ оболочек дочерних ядер или даже микроядер. Фактически, эта стадия аналогична стадии удвоения центросом в клетках животных и низших эукариот. Именно на этой стадии происходит, так сказать, «умножение цитоскелета». Осуществляется оно, безусловно, за счет увеличения числа МТОЦ, но когда и как происходит умножение этих последних - остается неизвестным.

Каталог аномалий цитокинеза представлен 26 аномалиями, 20 из которых описаны впервые. Типы аномалий: 1) нарушения пространственного расположения фрагмопласта, 2) нарушения структуры фрагмопласта, 3) нарушения функции фрагмопласта, 4) аномалии клеточной пластинки, 5) нарушения временной регуляции цитокинеза и 6) нарушения процессов завершения цитокинеза.

Аномалии цикла цитоскелета, приводящие к мейотической реституции.

Мейотическая реституция - это процесс формирования нередуцированных и просто 2п гамет, происходящий чаще всего благодаря аномалиям карио - и

цитокинеза Поскольку и сегрегация дочерних геномов, и их автономизация осуществляются цитоскелетом, нам удалось описать ряд его аномалий, приводящих к мейотической реституции По своим механизмам они подразделяются на три группы 1) формирование реституционных ядер; 2) объединение дочерних геномов; 3) консолидация структур цитоскелета.

Формирование реституционных ядер, согласно нашим данным, является результатом полного блока пространственного разделения дочерних геномов. Мы обнаружили 5 аномалий цикла цитоскелета, приводящих к формированию реституционных ядер Это описанные выше блок реориентации радиального цитоскелета, консервация перинуклеарного кольца, блок входа МТ в зону бывшего ядра, блок формирования кинетохорных МТ и монополярное веретено. Формирование реституционных ядер происходит, таким образом, в результате резких нарушений аппарата сегрегации - веретена деления.

Объединение дочерних геномов как реституционный процесс происходит после сегрегации дочерних геномов, то есть после их разделения в пространстве и формирования вокруг них ядерной оболочки После этого в результате нарушения структур цитоскелета может происходить возвратное сближение дочерних ядер в общей цитоплазме Причиной этого являются нарушения структур, осуществляющих автономизацию дочерних геномов, то есть структур цитокинеза. Вследствие этого дочерние ядра сближаются в общей цитоплазме, и в следующем делении, после распада ядерных оболочек, оба дочерних генома включаются в одно общее веретено деления В результате сегрегации формируются ядра с удвоенным числом хромосом. «Слияния» оболочек сближенных дочерних ядер и формирования за счет этого реституционного ядра мы никогда не неблюдали Согласно нашим данным, сближение ядер в общей цитоплазме может происходить вследствие аномалий поддерживающих структур цитоскелета' центральных фибрилл веретена и интерзональной системы МТ Сближение дочерних ядер на полюсах С-образного веретена описано нами в мейозе ПРГ F1 (Т. aestivum с Саратовская 29 х S cereale Аномалия формирования интерзональной цитоскелетной структуры в интеркинезе у двудольных, приводящая к сближению дочерних ядер - в мейозе мутанта ps (Beta vulgaris). Сближение дочерних ядер наблюдается в телофазе у однодольных видов при отсутствии клеточной пластинки в результате смещения к периферии центральных фибрилл веретена в ходе центробежного движения фрагмопласта. Спонтанное сближение дочерних ядер в общей цитоплазме в профазе II (стадия перинуклеарных колец) мы наблюдали в мейозе у клонов картофеля RH95 -продуцентов 2п гамет. Аномалий цикла МТ цитоскелета на этой стадии в этом фенотипе нами обнаружено не было. Механизм этого процесса остается неизвестным.

Консолидация структур цитоскелета, как свидетельствуют наши данные, также приводит к объединению сегрегировавших дочерних геномов и, соответственно, к мейотической реституции, если процесс консолидации происходит на не свойственной ему стадии В 50% МКП клона картофеля СЕЮ в профазе II происходит спонтанное сближение дочерних ядер со сформированными перинуклеарными цитоскелетными кольцами После сближения ядер вплотную кольца размыкаются и сливаются, образуя одно общее перинуклеарное кольцо вокруг обоих ядер После распада ядерной оболочки из общей леринуклеарной цитоскелетной системы формируется общее веретено деления. В 100% МКП меймутанта as6 томата в средней прометафазе II происходит сближение и слияние в центре клетки цитоскелетных хаотических фигур. Никаких иных аномалий МТ цитоскелета в этом фенотипе не наблюдается.

Наши исследования цикла цитоскелета в мейозе форм - продуцентов 2п гамет - позволили выявить 17 не описанных ранее аномалий, приводящих к мейотической реституции в МКП видов однодольных и двудольных растений. До этого анализа в литературе была описана лишь одна аномалия цитоскелета, приводящая к мейотической реституции (вепиаМо ег а1, 1998). Ниже представлен краткий перечень обнаруженных нами цитоскелетных механизмов мейотической реституции, то есть тех аномалий цикла цитоскелета, которые к ней приводят

1 Нарушение формирования перинуклеарной системы цитоскелета (блок цитоскелета в радиальной конфигурации) (Шамина и др, 2003а).

2 Формирование автономного перинуклеарного кольца при ацентрическом положении ядра (Шамина и др, 20036);

3. Нарушение распада перинуклеарного цитоскелетного кольца (Шамина и др., 20036).

4 Кольцевое и спиральное веретено;

5 Нарушение входа цитоскелета в зону бывшего ядра (Шамина и др, 20036).

6 Одновременное нарушение формирования биполярных центральных и кинетохорных фибрилл веретена деления (монополярное веретено) (вИагтипа е! а1, 2003).

7. Блок формирования кинетохорных МТ (БИатта е! а!, 1999).

8 Сближение дочерних ядер на полюсах изогнутого веретена (Шамина, Козырева, 1995).

9 Отсутствие клеточной пластинки (ЭИагтапа е! а!., 1999)

10 Блок формирования дочерних клеточных мембран (блок слияния пласгосом) (Дорогова, Шамина, 2001);

11 Нарушение формирования биполярного веретена в поздней прометафазе - хаотическое веретено (Серюкова и др., 2003);

12. Нарушение формирования биполярного веретена в поздней прометафазе - нонполярное веретено (вЬатта е1 а1, 2000)

13 Нарушение полимеризации микротрубочек интерзональной системы цитоскелета (у видов двудольных растений) (Оогодоуа е1 а1,1999).

14. Нарушение структуры интерзональной системы цитоскелета (блок соединения + концов МТ)

15 Спонтанное сближение дочерних ядер в профазе II у видов двудольных растений (Шамина и др.,2004).

16 Слияние перинуклеарных колец (СогисеНа е1 а1., 2003).

17 Сближение и консолидация хаотических прометафазных фигур цитоскелета (Шамина и др.,2004).

18 Полный блок всех процессов телофазы (Шамина и др , 2005)

Каталог аномалий мейотического веретена высших растений. В

исследованном материале мы обнаружили 24 не известные ранее аномалии веретена деления растительной клетки, описали их морфогенез и представили в виде каталога, расположив по порядку проявления аномальных событий в ходе цитоскелетного цикла. В каталог включены также 3 аномалии веретена, описанные ранее в литературе (С-веретено, полиаркальное, дивергентное)

Рисунок 3. Каталог аномалий мейотического веретена деления растительной клетки На рисунке представлена 21 обнаруженная нами новая аномалия и 3 описанные ранее в литературе. На схемах пучки микротрубочек обозначены линиями, хромосомы - маленькими прямоугольниками; обозначены также (+) и (-)-концы микротрубочек.

1 Кольцевое веретено Результат соединения хромосом с МТ, блокированными в конфигурации профазной перинуклеарной системы (кольца) Такое «веретено» не имеет полюсов, биполярных фибрилл и не способно к перемещению хромосом. Если перинуклеарное кольцо размыкается, возникает разновидность кольцевого веретена - спиральное, в виде завитка Причина аномалии - полный или частичный блок дезинтеграции околоядерного кольца При полном блоке хромосомы в кольцо не встраиваются, но иногда могут скользить по нему за счет взаимодействия плеч с пучками МТ.

2. Собразное веретено. Фибриллы этого веретена состоят из дугообразно

изогнутых МТ пучков, соединенных (+)-концами, а (-)- концы которых находятся в аз-положении Движение хромосом не нарушено, цитокинез асимметричен, телофазные группы хромосом смещены. Причина аномалии - изгиб МТ пучков из-за нарушения выпрямления МТ околоядерного кольца.

3 Б-образное веретено. Фибриллы веретена состоят из дугообразных МТ пучков, (-)-концы которых находятся в ¿тале-положении Сопоставление двух аномалий -С- и в-образных веретен - указывает на то, что изгиб МТ пучков возник на стадии ранней прометафазы.

4. й-образное веретено. Возникает в том случае, когда выпрямляется лишь часть МТ пучков, составлявших околоядерное кольцо. Комбинация прямых и изогнутых биполярных пучков С-формы при их коориентации в теле веретена и двух общих точках конвергенции (-)-концов. Р-веретено является причиной неожиданного результата сегрегации хромосом: в две телофазные группы из двух различных метафазных пластинок.

5. У-образное веретено. Также представляет собой результат комбинации прямых и С-образных биполярных фибрилл, но с одной общей точкой конвергенции (-)-концов. В результате сегрегации формируются три телофазные группы хромосом из одной метафазной пластинки.

в Ы-образное веретено. Комбинация двух прямых и одного Э-пучка. Сегрегация хромосом биполярная.

7. Т-образное веретено. Сложная комбинация из одного прямого пучка и двух С-образных. Служит причиной трехполюсной сегрегации хромосом; цитокинез идет только в экваториальной зоне прямого пучка.

8. Монополярное коническое веретено. Фактически является полуверетеном, поскольку состоит из «половинок» биполярных фибрилл. Половины центральных фибрилл конвергированы (-)-концами на единственном полюсе и обращены свободными расходящимися (+)-концами наружу. Хромосомы по разным причинам несут только одну кинетохорную фибриллу; последние конвергируют (-)-концами на полюсе и имеют одинаковую длину с половинками центральных фибрилл, так что хромосомы находятся в области расположения (+)-концов свободных МТ, в зоне веретена, противоположной полюсу (условный экватор). Движения хромосом в анафазе не происходит, цитокинез блокирован Продукт деления - монада с реституционнным ядром Причина аномалии -

одновременное нарушение формирования биполярных фибрилл веретена, как центральных, так и кинетохорных.

9. Монополярное радиальное веретено (моноастер). Принцип строения и причины формирования те же, что и у монополярного конуса, за исключением того, что единственный полюс веретена более «развернут», и веретено имеет вид звезды, то есть пучки МТ распространяются от центра конвергенции по радиусам. Два других важных отличия - аномальная ориентация (перпендикулярно оси деления) и формирование микроядер вместо одного реституционного ядра.

10. Автономный конус. Монополярное веретено без хромосом. Формируется при одновременном нарушении соединения (+)-концов МТ и присоединения их к кинетохорам на фоне нормальных коориентации пучков и конвергенции (-)-концов

11. Разомкнутое веретено Биполярное веретено с центральными фибриллами смешанного состава- как биполярными, так и «половинками», т.е свободными МТ пучками, не соединенными (+)-концами друг с другом Свободные пучки конвергируют (-)-концами на полюсах, а их (+)-концы торчат наружу и перекрещиваются в области экватора. Кинетохорные фибриллы также могут быть биполярными или одиночными Анафазное движение хромосом в таком веретене блокировано. Причина аномалии - в блоке формирования части биполярных центральных фибрилл веретена

12. Веретено с дополнительным полуверетеном. Возникает в случае объединения свободных МТ пучков, не способных соединиться (+)-концами, в автономное полуверетено. Оно может отходить от основного биполярного веретена в произвольном месте, иногда включает в себя хромосомы. Причина -частичный блок соединения (+)-концов.

13. Хаотичное веретено. Представляет собой набор хаотично ориентированных биполярных фибрилл веретена: центральных и кинетохорных Последние могут не бьггь биполярными. Конфигурация нормальной средней прометафазы. Причина аномалии - блок ориентации фибрилл веретена вдоль оси будущего деления, коориентации фибрилл в теле веретена и конвергенции (-)-концов. Анафазное движение хромосом и цитокинез блокированы.

14 Диаметральное нонполярное веретено. Структура, возникающая при равномерном расположении биполярных фибрилл веретена по линиям диаметра клетки, так что хромосомы с противоположно направленными кинетохорными пучками, а также области перекрывания (+)-концов в центральных фибриллах оказываются в центральной точке клетки, а (-)-концы - как бы на поверхности сферы в кортикальной зоне цитоплазмы. Резко аномальная фигура веретена, в которой район полюса в виде сферы окружает район экватора, превратившийся в точку. Причина аномалии - одновременное нарушение ориентации биполярных фибрилл вдоль оси деления и конвергенции (-)-концов. Регулярная структура в виде помпона, свойственная этому веретену, возникает благодаря тому, что процесс коориентации фибрилл в теле веретена не нарушен.

15. Дезинтегрированное веретено. Состоит из биполярных фибрилл, не строго ориентированных вдоль оси деления, не конвергированных на полюсах и расположенных под углом друг к другу, то есть не коориентированных взаимно параллельно. Фенотип мутанта теНО у ржи, также в МКП клона ЯН95 картофеля. Анафазное движение хромосом и цитокинез происходят нормально, нарушена структура телофазных групп хромосом. Причина аномалии - нарушение коориентации фибрилл в теле веретена и блок конвергенции (-)-концов МТ..

16 Полиаркальное, или иультиполярное, веретено Описано в литературе в мейозе у отдаленных гибридов (Wilson, 1928) Имеет вид объемной звезды с несколькими «лучами» - полуверетенами Состоит из биполярных фибрилл, конвергированных на этих нескольких полюсах. Анафазное движение хромосом и цитокинез осуществляются нормально между всеми полюсами. Является также распространенной промежуточной конфигурацией нормальной прометафазы. Причина аномалии - нарушение ориентации сформированных биполярных фибрилл веретена (как кинетохорных, так и центральных) вдоль оси деления

17. Биполярное веретено без хромосом (автономное веретено). Биполярное веретено, состоящее из одних центральных фибрилл. Формируется либо при полном блоке построения кинетохорных МТ, либо при недоступности хромосом для цитоскелета (блок распада ядерной оболочки). Способно осуществлять перемещение хромосом, по-видимому, за счет взаимодействия с их плечами.

18 Сферическое веретено. Аномально расширенное биполярное веретено с нормальными полюсами; пропорции настолько изменены, что выглядит шарообразным. Количество микротрубочек в веретене по сравнению с нормой не увеличено, но наблюдается нарушние «чистой зоны» и присутствие в теле веретена органелл периферической цитоплазмы, что указывает на нарушение внутренней структуры тела веретена. Причина - нарушение коориентации фибрилл на фоне нормальной конвергенции (-)-концов МТ.

19. "Комета"- биполярный конус. Характерная фигура, напоминающая комету, проявляется в телофазе в результате монополярного расхождения лишенных кинетохорных фибрилл хромосом в биполярном дивергентном рыхлом веретене В телофазе веретено представляет собой конус с хромосомами на вершине, т е. асимметричное биполярное веретено, у которого один полюс (с хромосомами) конвергирован, а второй - дивергентный. При формировании мини-веретена на полюсе располагаются две сближенные группы хромосом («двухголовая комета») Цитокинез идет нормально на экваторе «конуса», преобразующегося затем во фрагмопласт Причина аномалии - отсутствие кинетохорных фибрилл и конвергенции (-)-концов, а также атипичная сегрегация хромосом (скольжение плеч вдоль фибрилл веретена). Аномалия довольно распространенная.

20. Бочонкообразное веретено. Формируются изредка в МКП отдаленных гибридов первого поколения, а также в 100% МКП у полиплоидов с высоким уровнем плоидности (наши наблюдения мейоза в октаплоидах люцерны Medicago sativa). Типичное митотическое цилиндрическое (barrel-shaped) веретено с широкими полюсами. Интересно сравнить, что в МКП мутанта ameiotic (Zea mays), где мейоз заменен митозом, формируются типичные мейотические (pointed) веретена (Palmer, 1971).

21 «Фонтан». Дивергентное веретено с нарушением коориентации фибрилл и конвергенции (-)-концов Вариант фенотипа мутации divergent spindle (Zea mays). Состоит из С-образных фибрилл

22. Дивергентное веретено. Впервые описано в 1940 г. Кларком (Clark, 1940) в фенотипе мутанта кукурузы divergent spindle Представляет собой биполярное веретено с параллельно коориентированными фибриллами и неконвергированными полюсными районами Анафазное движение и цитокинез в норме, структура телофазных групп хромосом нарушена (микроядра). Причина аномалии - блок конвергенции (-)-концов пучков МТ. Вариантом фенотипа этой мутации, проявляющимся при изменении фототемпературного режима, является нонполярное диаметральное веретено.

23. Дивергентное С-ееретвно Причина аномалии - одновременное нарушение выпрямления пучков МТ и их конвергенции на полюсах. Наблюдается довольно часто в фенотипе ППГ F1 и в гаплоидах кукурузы.

24. Мини-веретена. Формируются изредка в случае пространственной разобщенности цитоскелета и хромосом Нам не удалось установить их происхождение: формируются ли их микротрубочки хромосомами, околохромосомным пространством или эти МТ транспортируются из других областей цитоплазмы. Образуются в случае нарушения разборки околоядерного кольца или при формировании автономного веретена без кинетохорных фибрилл. Представляют собой крошечные биполярные веретена с присоединенными хромосомами, конвергированными полюсами, ориентированы произвольно. Разделяют хромосомы на две хорошо различимые телофазные группы, лежащие вплотную бок о бок. Фрагмопласт и клеточная пластинка также строятся в этом мини-веретене. Мини-веретена бывают моно- и триполярными. Хромосомы на схеме не обозначены.

Обсуждение

Наши наблюдения цикла цитоскелета в мейотическом делении клеток высших растений показали, что этот процесс является консервативным. Обычный и девиантный циклы цитоскелета происходят в МКП всех изученных нами видов и форм высших растений в неизменном виде; аномальные фенотипы универсальны.

Результаты, полученные при изучении цитоскелетного цикла как в ходе нормального мейоза, так и посредством морфологической диссекции с использованием широкого спектра аномалий, позволили впервые представить динамику МТ в делении растительной клетки в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса. На схеме на рис. 4 представлены сводные результаты наших исследований. Этапы, описанные ранее в литературе, на схеме подчеркнуты.

Согласно нашим данным, интерфазный ретикулярный цитоскелет в средней/поздней профазе преобразуется в систему радиальных пучков, ориентированных в плоскости будущего деления (1). Одновременно с этим пучки МТ, ранее волнистые, выпрямляются. Затем происходит их поворот на 90° и ориентация по касательной к поверхности ядерной оболочки (2 и 3). После этого пучки МТ изгибаются, опоясывая ядро, коориентируются и формируют перинуклеарную про фазную систему в виде меридионально ориентированного кольца (4). После распада ядерной оболочки или одновременно с ним кольцо распадается на отдельные пучки МТ (5), которые вновь выпрямляются (6) и входят в зону бывшего ядра (7). Начинается хаотическая стадия прометафазы, сравнительно длительная, во время которой происходит соединение (+)-концов микротрубочковых пучков с кинетохорами хромосом и друг с другом, то есть происходит формирование кинетохорных и центральных биполярных фибрилл веретена (8 и 9). Сформированные биполярные фибриллы в поздней прометафазе поворачиваются и ориентируются вдоль оси будущего деления (10). Затем (или одновременно с этим) они коориентируются параллельно (11), конвергируют (-)-концами (12) и формируют метафазное веретено. В анафазе кинетохорные пучки МТ деполимеризуются (13, 13а), и веретено в ранней телофазе состоит из полюсных районов с телофазными группами хромосом и центральных фибрилл, идущих от полюса к полюсу. В ранней телофазе в мейозе у видов однодольных растений на экваторе телофазного веретена закладывается клеточная пластинка и формируется фрагмопласт путем перераспределения в

пространстве центральных фибрилл веретена, которые перемещаются и окружают растущий край клеточной пластинки (14) После этого начинается центробежное движение фрагмопласга (15) В мейозе у двудольных в телофазе I клеточная пластинка не формируется, а происходит массовая полимеризация МТ пучков от полюсных районов веретена по направлению к экватору (14а) и формирование интерзональной цитоскелетной системы (15а), которая играет роль интерфазного цитоскелета в интеркинезе. В профазе II вокруг ядер формируются перинуклеарные кольца; у двудольных это сопровождается частичной деполимеризацией интерзональной системы и укорочением пучков МТ в ее составе После формирования веретена и его функции в анафазе-телофазе II реформация радиального интерфазного цитоскелета у однодольных происходит, как и в первом мейотическом делении, за счет включения в его состав фибрилл центрального веретена и новосинтезированных МТ, а у двудольных она представляет собой фибриллы неподвижного фрагмопласга. Таким образом, завершение цитоскелетного цикла в мейотическом делении происходит как за счет перемещения МТ пучков (центробежное движение фрагмопласга), так и за счет полимеризации МТ заново от полюсных районов веретена в виде компенсации деполимеризации цитоскелета в анафазе

Согласно нашим данным, в МКП фрагмопласг как самостоятельная структура не строится, а для осуществления цитокинеза используется центральное веретено (у однодольных видов) или радиальный цитоскелет (у двудольных) Профазную перинуклеарную систему в виде околоядерного кольца микротрубочек также можно отнести к системным структурам цитоскелета лишь условно, так как ее функция в мейотическом делении пока не установлена. Тем не менее, высокая степень структурной организации кольца, его специальная ориентация относительно оси деления, собственная динамика, о чем свидетельствует феномен активного слияния колец, а также измененный относительно предыдущей и последующей структур профиль составляющих кольцо МТ пучков (изгиб) заставляют предполагать, что перинукпеарное кольцо играет в мейозе более значимую роль, чем быть просто промежуточной конфигурацией цитоскелета при построении вереггена деления.

Таким образом, цитоскелет в мейозе как у однодольных, так и у двудольных видов проходит единообразный цикл, состоящий из следующих основных этапов: 1) формирование перинуклеарного кольца из радиального цитоскелета, 2) формирование веретена деления из перинуклеарного кольца, 3) полимеризация cfe novo МТ радиального цитоскелета Резкие морфологические различия меиоду последовательным и одновременным цитокинезом в мейозе у однодольных и двудольных видов объясняется, согласно нашим данным, лишь различием во времени синтеза мембранных пузырьков клеточной пластинки в том и в другом случае.

Анализ цикла цитоскелета посредством морфологической диссекции позволил выявить не только его основные и промежуточные стадии, но также те морфологические механизмы, которые лежат в основе этих перестроек. Наши результаты показывают, что процесс перехода МТ цитоскелета из одной системы в другую в растительном мейозе осуществляется посредством двух основных механизмов: перемещением стабильных микротрубочковых пучков в пространстве клеточной цитоплазмы и деполимеризацией/реполимеризацией МТ. Эти процессы мы определяем как основные, поскольку они- 1) осуществляются при переходе цитоскелета от одной системной структуры к другой, 2) необходимы при формировании всех системных цитоскелетных структур в ходе клеточного деления; 3) не зависят друг от друга и от второстепенных процессов перестройки систем МТ.

Рисунок 32. Сводная схема динамики микротрубочкового цигоскелета в мейотическом делении МКП видов однодольных (1-15) и двудольных (1-12,13а-15а) растений.

1)- плоскостная реориентация цигоскелета; Ту- перемещение пучков МТ; 3)-тангенциальная ориентация пучков МТ; 4)- изгиб МТ и формирование перинуклеариого цитоскелетного кольца; 5)- распад ядерной оболочки и дезинтеграция перинуклеариого кольца; 6)- выпрямление МТ; 7)-вход МТ в зону ядра; 8,9)- хаотичная стадия, формирование биполярных фибрилл веретена; 10)-биполярная ориентация фибрилл; 11)- коориентация фибрилл; 12)-конвергенция Ф на полюсах; 13,1 За) - деполимеризация кМТ; 14)- цитокинез в подвижном фрагмопласте; 14а)-формирование неподвижного фр-ста; 15,15 а)-интеркииез с формированием дочерних мембран и без них соответственно.

К второстепенным мы относим процессы, необходимые для окончательного формирования отдельных системных структур после того, как произошел переход (реориентация) цитоскелета от предыдущей структуры к последующей: латеральную коориентацию пучков МТ, взаимодействие концов МТ (перекрывание, конвергенция), взаимное скольжение антипараллельных МТ, консолидация цитоскелета, изменение профиля пучков МТ (изгиб - выпрямление).

Основные морфологические механизмы цикла цитоскелета.

1. Перемещение в цитоплазме стабильных пучков МТ. На то, что переходы от одной цитоскелетной структуры к другой в мейоцитах растений осуществляются посредством перемещения в цитоплазме стабильных МТ пучков, указывают наши данные о формировании автономной перинуклеарной системы лри ацентрическом положении ядра, о формировании общего перинуклеарного кольца в многоядерных клетках, о построении веретена деления (вход МТ в зону ядра, выход из хаотической стадии). Результатом таких перемещений является переориентация пучков МТ с поворотом на 180° при переходе от радиального интерфазного цитоскелета к веретену деления. Он происходит в два этапа: на 90° до распада ядерной оболочки (в профазе) и на 90° после (в прометафазе). Результатом первого этапа переориентации является формирование перинуклеарной системы, результатом второго - хаотичная стадия прометафазы с формированием биполярных фибрилл. А общим итогом - перемещение (+)-концов микротрубочковых пучков из кортикальной зоны цитоплазмы в центр клетки для прикрепления к кинетохорам хромосом. Кроме этого кардинального процесса передвижение стабильных пучков МТ в пространстве клетки происходит в поздней прометафазе при построении биполярного веретена (выход из хаотической стадии).

Молекулярные механизмы, осуществляющие такие перемещения, неизвестны. На этот счет имеются противоречивые данные о роли актина в осуществлении перемещения пучков МТ и целых веретен в ходе дифференцировки соматических клеток (Hepler, Jackson, 1974, Wymer et al., 1998). Наши данные ставят под сомнение предположение о том, что переход от хаотичной стадии прометафазы к биполярному веретену деления осуществляется за счет латеральных взаимодействий фибрилл строящегося веретена (Smirnova, Bajer, 1998; Franklin, Cande, 1999). Мы наблюдали, что в процессе перемещений каждый пучок МТ ведет себя независимо от остальных. На это же указывает фенотип «дезинтегрированное веретено» у мутанта mei10 у ржи и клона картофеля RH95. Эту данные можно интерпретировать также как свидетельство того, что формирование биполярного веретена осуществляется за счет двух независимых механизмов: латеральной ассоциации фибрилл и ориентации фибрилл вдоль оси деления.

2. Полимеоизация/деполимеоизация МТ. В клетках эукариот, содержащих центросому, переориентация микротрубочек и переход их из одной конфигурации в другую осуществляется путем полной деполимеризации МТ предыдущей цитоскелетной системы и реполимеризации их на новых ЦОМТ. В бесцентросомных клетках высших растений на определенных стадиях деления деполимеризация /реполимеризация МТ также происходит, причем, по нашим данным, на различных стадиях она может носить обязательный или необязательный характер. Обязательной для правильного осуществления деления клетки является деполимеризация кинетохорных МТ в ходе их укорочения в анафазе. Вслед за этим в телофазе происходит реполимеризация

ос

МТ от полюсных районов веретена, а в интеркннезе - от поверхности ядерной оболочки Массовая деполимеризация МТ цитоскелета в делящейся растительной клетке происходит в профазе. Однако на этой стадии, в отличие от анафазы, деполимеризация не является обязательной и может не происходить без ущерба для процесса деления клетки и хода цитоскелетного цикла. Согласно нашим данным, в мейотической профазе деполимеризация МТ происходит не полностью, так что тонкое кольцевое перинукпеарное окрашивание на тубулин сохраняется вплоть до распада ядерной оболочки. Очевидно, что переориентируя МТ пучки в профазе, клетка может оперировать как длинными, так и короткими пучками, поворачивая их либо целиком, либо в виде коротких проксимальных относительно ядра отрезков. В зависимости от этого и перинуклеарная система может иметь вид или широкого развитого кольца, или весьма узкого. Во втором случае реполимеризация МТ (их удлинение) наступает после распада ядерной оболочки, в период формирования хаотической фигуры.

Мы относим процесс деполимеризации/реполимеризации МТ к основным процессам динамики цитоскелета в растительной клетке, поскольку он является главным при формировании такой системной структуры цитоскелета, как радиальные интерфазные пучки. Это естественно, так как в череде делений клетки количество ЦОМТ должно умножаться, и число МТ в каждом цикле деления должно пополняться. Такое «пополнение» происходит в телофазе -интеркинезе за счет дополнительных синтезов МТ радиального цитоскелета. В следующем цикле деления, согласно нашим данным, перестройки цитоскелета осуществляются за счет перемещения стабильных пучков МТ, так что для построения последующей структуры цитоскелета используются МТ, входившие в состав предыдущей. Затем происходит полимеризация новых МТ на новых ЦОМТ в телофазе/интеркинезе, и цикл завершается.

Второстепенные процессы динамики МТ цитоскелета в ходе деления растительной клетки.

После реориентации и пространственного перемещения пучков МТ при переходе от одной системной структуры цитоскелета к другой происходит собственно формирование этих структур за счет дополнительных процессов, которые мы называем второстепенными, или вспомогательными. Это латеральная коориентация пучков МТ, дезинтеграция предыдущей структуры, взаимодействие концов МТ (перекрывание (+)-концов, конвергенция (-)-концов), взаимное скольжение антипараллельных МТ, консолидация элементов цитоскелета в единую структуру и изменение профиля пучков МТ т. е. их изгиб или выпрямление. Согласно нашим наблюдениям аномальных фенотипов, эти процессы осуществляются независимо друг от друга.

Динамика цитоскелета и проблема центросомы растительной клетки.

Кардинальным свойством микротрубочек как морфологических структур является то, что для их формирования необходимы специальные «затравки»: микротрубочкоорганизующие центры, ЦОМТ. Клетка не может создавать микротрубочки в любой точке цитоплазмы, но лишь там, где находятся ЦОМТ. Таким образом, динамика цитоскелета определяется ими. ЦОМТ соединены с (-)-концами микротрубочек. В клетках животных и низших эукариот ЦОМТ консолидированы в специальных структурах : центросомах, - претерпевающих собственный цикл в ходе деления клетки. Смысл этого цикла в том, что центросомы выполняют роль полюсных организаторов веретена, и для выполнения этой функции должны удвоиться и разойтись. В клетках высших растений таких структур нет, а местом локализации ЦОМТ является ядерная

оболочка, исчезающая на мобильных стадиях клеточного цикла. Поэтому проблема регуляции динамики цитоскелета на уровне морфологических структур остается в этом случае до сих пор не решенной. В животной клетке, содержащей морфологически оформленную центросому, в ходе деления существуют лишь две системные цитоскелетные структуры: радиальные пучки и веретено. Делящаяся растительная клетка в силу своих морфологических особенностей (жесткая клеточная стенка) проходит более сложный цитоскелетный цикл с формированием большего числа весьма разнообразных цитоскелетных структур (кортикальные спирали, препрофазный пучок, радиальные пучки, веретено деления и фрагмопласт). Очевидно, что консолидация ЦОМТ в оформленной центросоме ограничивало бы число вариантов структур цитоскелета, формирование и развитие которых такая центросома могла бы регулировать. Она эффективна только при формировании биполярного веретена Поэтому становится понятной точка зрения, согласно которой цикл оформленной центросомы (например, центриолярной в животных клетках) считается редуцированным вариантом более сложного цикла (Оохвеу, 2001). Гипотезу такого цикла диффузной, или «гибкой», центросомы выдвинул Мэзия (Маг!а, 1987) Он постулировал, что в эукариотной клетке центросома представляет собой совокупность дискретных ЦОМТ, соединенных между собой линейно некоей гипотетической структурой, которая может изменять свою конформацию. В зависимости от этого изменяется расположение соединенных с ней ЦОМТ и, соответственно, пространственное расположение и ориентация микротрубочковых систем, полимеризующихся от этих ЦОМТ

В каком соотношении с этой гипотезой находятся результаты нашей работы и каким образом выявленные нами детали динамики микротрубочкового цитоскелета вскрывают механизмы регуляции этой динамики? Функцией гибкой центросомы в гипотезе Мэзия является полимеризация и переориентация микротрубочек Обнаруженный нами поворот радиальных МТ в тангенциальное положение в МКП в профазе и формирование перинуклеарной системы может быть результатом переориентации ЦОМТ, расположенных на ядерной оболочке и соединенных с МТ, и отсутствие деполимеризации МТ визуализирует этот процесс Тем не менее, наши данные указывают на то, что переориентироваться способны и свободные пучки МТ, отделенные от ЦОМТ, например, при формировании циркулярных МТ структур в периферической цитоплазме Возможно, что в процессе поворота одновременно участвуют два механизма, либо они представляют собой два возможных пути. Итак, первый поворот радиальных пучков может происходить в результате поворота их ЦОМТ на ядерной оболочке. После ее распада дальнейший поворот ЦОМТ, соединенных с длинными или предельно укороченными МТ, происходит за счет неизвестного механизма. Вряд ли это может быть взаимодействие МТ, поскольку в результате формируется хаотическая фигура Процессы как первого (в профазе), так и второго (после распада ядерной оболочки) поворотов не противоречат гипотезе Мэзия об ориентирующей активности «гибкой» центросомы Гипотетическая линейная структура, соединяющая ЦОМТ, может изменять их ориентацию при изменении своей конформации.

Однако в серьезное противоречие с гипотезой Мэзия приходят наши данные относительно механизмов формирования веретена деления. Согласно логике происходящего, удвоенные материнская и дочерняя центросомы, играющие роль полюсных организаторов веретена, должны разойтись в пространстве до того, как цитоскелет вступит в коктакт с кинетохорами хромосом. В противном случае существует опасность монополюсного присоединения

хромосом и биполюсного - одного кинетохора. В поздней профазе вплоть до распада ядерной оболочки цитоскелет организован в перинуклеарную кольцевую структуру Никаких признаков его биполяризации не наблюдается ни в норме, ни в аномалиях Описанный нами непрерывный ход процесса перестроек цитоскелета на стадии построения веретена из перинуклеарного кольца предполагает присутствие в этих (и промежуточных) структурах и гибкой центросомы, если она существует. Можно предположить, что биполяризация существует в виде двух полуколец, составляющих одно целое. Гибкая центросома казедого полукольца, изменяя конформацию, может служить в этом случае одним полюсным организатором веретена. Этому противоречат наши данные о формировании биполярных веретен при сближении ядер и слиянии перинуклеарных колец. Мы никогда не наблюдали в этом случае формирования многополюсных веретен, и это исключает присутствие четырех центросом, как это предполагалось бы по гипотезе Мэзия. На это же указывает описанное нами формирование биполярных веретен при слиянии хаотических прометафазных фигур в фенотипе fused spindles. Кроме того, мы никогда не наблюдали аномальных структур цитоскелета в поздней профазе и ранней/средней прометафазе в фенотипах с монополярными веретенами В животных клетках монополярные веретена формируются в результате отсутствия пространственного разделения центросомальных структур. Если в МКП гибкая центросома существует, и, согласно нашим данным, имеет в профазе форму кольца, то в фенотипах с монополярными веретенами вместо перинуклеарного кольца должно формироваться полукольцо, но этого никогда не наблюдалось.

Таким образом, наши результаты не укладываются в гипотезу Мэзия о гибкой центросоме растительной клетки. Гораздо проще предположить в этом случае автономность пучков МТ и их перемещение за счет внешнего ориентирующего механизма (ток цитоплазмы, моторные белки в кортекее, латеральная ассоциация пучков и т.п.).

Согласно нашим данным, элементарной и независимой единицей процесса перестроек МТ цитоскелета в делении растительной клетки является индивидуальный микротрубочковый пучок (или индивидуальная микротрубочка) как длинная, так и укороченная. Визуализировать укороченные МТ в виде «затравок» современными методами исследования не удается; они становятся доступными для наблюдения лишь при условии удлинения, или когда они создают ассоциации. Так, в профазе митоза в эндосперме африканской лилии гемантус предельно укороченные пучки МТ конвергируют своими (-)-концами и визуализируются в результате как миниатюрные конусы на поверхности ядерной оболочки. Смирнова и Байер обозначили их как центры конвергенции микротрубочек (ЦКМТ) и приписывают им ключевую роль в динамике цитоскелета в ходе растительного митоза (Smirnova, Bajer, 1994). Например, в профазе происходит переориентация ЦКМТ на 180°, так что вершина конуса, т. е. (-)-концы МТ, ориентируются по направлению к периферии клетки, а (+)-концы, соответственно, внутрь ядра. Механизм этой реориентации неизвестен. При сопоставлении этих данных с нашими можно сказать, что процесс переориентации в профазе митоза гемантуса происходит по такой же схеме, как в мейозе, но с некоторыми отличиями. Во-первых, полный поворот осуществляется до распада ядерной оболочки, тогда как в мейозе он происходит на 90° в профазе и еще на 90е в прометафазе В митозе «затравки» организованы в конусы за счет конвергенции (-)-концов, в мейозе они формируют организованную кольцевую структуру. Можно сказать, что в мейозе МТ перемещаются по отдельности, независимо друг от друга, а в митозе - группами, объединенными в ЦКМТ. Однако, согласно нашим данным, отсутствие конвергенции (-)- концов МТ не

препятствует их перемещениям в цитоплазме' в ходе формирования биполярного веретена отдельные пучки МТ поворачиваются и ориентируются вдоль оси веретена так же, как и организованные в «конусы» дополнительные полюса прометафазных полиаркальных веретен.

Проведенный нами широкий скрининг аномалий цитоскелетного цикла не выявил фенотипов, которые можно было бы отнести к результату нарушения центросомального цикла В животных клетках это монополярные (блок удвоения или расхождения центросом) и мультиполярные (дополнительные циклы удвоения центросом) веретена. В растительной клетке нам впервые удалось обнаружить монополярные веретена в мейозе ряда форм, но детальный анализ процесса их формирования и сопутствующих аномалий (разомкнутые веретена) указывает на иной механизм их морфогенеза, нежели блок удвоения (или расхождения) центросом. Мультиполярные (полиаркальные) веретена в растительной клетке известны, но их неизменная встречаемость, согласно нашим данным, в нормальной прометафазе мейоза дикого типа указывает на девиацию нормального процесса, но не на аномалию Иными словами, полиаркальные веретена у растений не могут считаться доказательством нарушения цикла гипотетической центросомы в растительной клетке

Таким образом, наши данные указывают на то, что динамика цитоскелета в ходе деления растительной клетки определяется активностью множества дискретных ЦОМТ, осуществляющих полимеризацию/деполимеризацию МТ, а построение микротрубочковых систем различной конфигурации может происходить за счет внешних сил, приложенных к этим ЦОМТ на поверхности ядерной оболочки, а в ее отсутствие - к ассоциированным с ЦОМТ микротрубочкам Наши данные противоречат гипотезе о присутствии центросомальной структуры в МКП высших растений

Перспективы. Разработанный подход к изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований - морфологическая диссекция - оказался весьма информативным при анализе цикла микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки. Мы также получили предварительные обнадеживающие результаты, демонстрирующие эффективность этого подхода для анализа циклов других внутриклеточных структур, например, хромосомного цикла и цикла ядерной оболочки Многообещающим, по нашим предварительным данным, является этот подход также для изучения процессов перемещения хромосом в мейотическом ядре на стадии профазы I, в период синапсиса гомологичных хромосом. Этот процесс практически не изучен и представляет собой важнейшую проблему клеточной биологии ^¡сМег, К1екпег, 1997) Такой комплексный процесс в делении клетки, как цитокинез, включающий в себя, кроме активности цитоскелета, динамику мембранных структур и весьма слабо изученный в растительной клетке, также может быть с успехом подвергнут «морфологической диссекции» и расчленен на элементарные морфологические события Выявленные на морфологическом уровне механизмы перестроек цитоскелета позволяют сделать обоснованные предположения о молекулярных механизмах этих перестроек и целенаправленно вести их поиск Это в первую очередь касается описанного нами процесса перемещения стабильных пучков МТ в пространстве клеточной цитоплазмы, происходящего за счет внешних приложенных к микротрубочкам сил. Первый кандидат на роль такого агента -актиновый кортикальный слой мейоцита.

Выводы

1 Анализ соответствующих аномалий является эффективным подходом к изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований

2 На стадиях от профазы до телофазы ход цикла цитоскелета обеспечивается утилизацией элементов предшествующей цитоскелетиой системы при построении последующей, а именно:

21. В профазе цитоскелет проходит плоскостную реориентацию, тангенциальную ориентацию и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца

2.2 В ранней прометафазе происходит дезинтеграция перинуклеарного кольца, выпрямление его микротрубочковых пучков и вход их в зону бывшего ядра с формированием хаотичной фигуры цитоскелета.

2.3 В средней прометафазе, или хаотической стадии, происходит формирование биполярных фибрилл веретена - центральных и кинетохорных.

2.4 В поздней прометафазе происходит ориентация сформированных биполярных фибрилл веретена вдоль оси будущего деления и окончательное формирование веретена за счет процессов самосборки элементов цитоскелета.

2 5. В телофазе построение фрагмопласта происходит как посредством утилизации фибрилл центрального веретена, так и синтеза полюсных МТ. 3. Формирование интерфазной радиальной системы МТ является автономным процессом в цикле реорганизации цитоскелета.

4 Выявлены новые процессы, обеспечивающие реорганизацию цитоскелета в ходе клеточного деления- перемещение стабильных пучков МТ, изменение их профиля и консолидация в единую структуру. 5. Полученные данные по динамике цитоскелета указывают на отсутствие

цикла центросомы в делении материнских клеток пыльцы в. Составлены каталоги аномалий веретена деления (24 аномалии, 21 описана впервые), аномалий структур цитокинеза (26 аномалий, 20 описано впервые) и механизмов мейотической реституции (19 механизмов, 18 описаны впервые) растительной клетки 7. Впервые разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1 Н В. Шамина, И.Н. Голубовская. 1981. Контроль формирования и функции митотического аппарата Цитология и Генетика, т 15- 77-87.

2 НВ Шамина, И Н. Голубовская, А Д Груздев 1981. Морфологические нарушения веретена у некоторых мейотических мутантов кукурузы. Цитология, т.23. стр.275-281

3 Н В. Шамина, А.Д Груздев 1987 Исследование двойного лучепреломления веретена у меймутантов кукурузы Цитология, т.29, стр. 104-106.

4 Н В. Шамина 1988. Изучение генетического контроля построения и функции веретена деления с использованием мутаций, нарушающих расхождение хромосом в мейозе у кукурузы. Цитология, т. 30, стр.

1301-1305.

5 Н В. Дорогова, Н.В. Шамина 1994. Особенности цитокинеза в клетках высших растений. Цитология, т.36, стр. 899-915.

6. Н.В. Шамина, Я.С. Рузанкина, С.П. Соснихина. 1994. Нарушение структуры веретена деления мутацией теИО в мужском мейозе у ржи. Цитология, т 36, стр. 189-194.

7. Н.В. Шамина, С Е. Козырева. 1995. Аномалии веретена, ведущие к мейотической реституции в мейозе отдаленных гибридов. Цитология, т. 37, стр.775-782.

8.Н.В Дорогова, Н.В. Шамина 1995. Ультраструктура аномального мейоза у мутанта ms43 у кукурузы Цитология, т 37, стр.561-566.

9. N V. Dorogova, N.V. Shamina, S.I. Maletski. 1999. The mutational variation of a cytoskeleton and formation of unreduced male gametes in sugar beet Sugar Tech vol.1, p.83-85.

10 N.V. Shamina, N.V Dorogova, A.G. Orlova, S.A. Trunova, N.P. Gontcharov. 1999. Abnormalities of spindle and cytokinesis behavior leading to meiotic restitution in cereals Cell Biol Internatl vol.23, pp. 863-870.

11 Н.В. Шамина, H В. Дорогова. 2000. Аномалии микротрубочкового цитоскелета в мутантной линии сахарной свеклы. Цитология, т.42, стр.372-379.

12.Н.В Шамина. Н.В. Дорогова, П.Л. Перельман. 2000. Нарушения мужского мейоза у гороха Pisum sativum L., вызываемые мутацией ms3. Цитология, т 42, стр.404-411.

13.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, ТА Trunova. 2000. Radial spindle and the phenotype of maize meiotic mutant, dv Cell Biol Internatl vol.24, pp.729-736. 14 Н.В. Шамина, Н.В. Дорогова, A.A Загорская, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный. 2000. Аномалии мужского мейоза в стерильной трансгенной линии табака RES91. Цитология, т.42, стр. 1159-1164.

15.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, lu.V. Sidorchuk, A.A. Zagorskaya, E.V. Deineko, and V.K. Shumny. 2000. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco (Nicotiana tabacum L.). Cell Biol Internatl vol 25, pp. 367-369.

16 Ю.В. Сидорчук, А.А. Загорская, E.B. Дейнеко, Н.В. Шамина, В.К. Шумный. 2000. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ. Цитология и Генетика, т. 34, стр. 3-8. 17.Н.В. Шамина, Н.Я. Вайсман, Н.В. Дорогова, О.А. Шаворская, С.И. Малецкий. 2001. Интерзональные микротрубочки и мейотическая реституция у двудольных. Цитология, т.43, №1, стр.33-38. 18 Дорогова Н.В , Шамина Н.В. 2001 Феномен чрезмерного цитокинеза в фенотипе мейотической мутации рат у кукурузы. Цитология. Т.43. С. 471-476

19.Серюкова ЕГ, Дорогова Н.В., Жарков НА, Шамина Н.В. 2003. Нарушения прометафазы, приводящие к реституции ядер. Цитология т. 45, №3. стр. 244-248.

20.Shamina N.V., Silkova O.G., Seriukova E.G 2003 Monopolar spindles in meiosis of intergeneric cereal hybrids. Cell Biol Internatl 27: 657-664.

21.Шамина Н.В. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. I. Околоядерное кольцо микротрубочек и построение мейотического веретена. Цитология, т.45, №7, стр. 650-654.

22.Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серюкова Е.Г. 2003. Динамика

микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. II. Формирование перинуклеарного кольца микротрубочек Цитология, т. 45, №7, стр. 655-660.

23 Шамина H В., Дорогова НВ, Серюкова ЕГ, Силкова О. Г 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. III. Стадии ранней прометафазы. Цитология, т 45, №7, стр. 661-667. 24..Conicella С, Capo A, Cammaneri M, Errico A, Shamina N, Monti L 2003. Elucidation of meiotic nuclear restitution mechanisms in potato through analysis of microtubular cytoskeleton. Euphytica 133: 107-115. 25.. H.B. Шамина, H. В. Дорогова, А. Е. Чередниченко 2004. Консолидация цитоскелета при формировании веретена деления в растительной клетке. II. «Слившиеся веретена». Цитология, т. 46, №8, стр. 685-689.

26 Н.В Шамина, H M Ковалева, OA. Шацкая, Е.Д. Гаврилова. 2004.

Консолидация цитоскелета при формировании веретена деления в

растительной клетке. I. Аномалии, затрагивающие целостность веретена

в мейозе. Цитология, т. 46, №7, стр. 587-591.

27. Н.В. Шамина, Н.В. Дорогова. 2004. Цикл микротрубочкового

цитоскелета в делении растительной клетки. Цитология, т.46, №11, стр.

960-965.

28 H В. Шамина 2004 Молекулярные механизмы цикла цитоскелета в ходе деления растительной клетки Биологические мембраны, т 21, № 6, с. 435-441.

29.Н.В Шамина, Н.В. Дорогова. 2004 Цикл микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки. Цитология, т. 46: 960-965.

30.H В Дорогова, Шамина Н.В. 2005 Организация цитокинеза в делении растительной клетки. Цитология, т. 47. №7, стр. 563-577.

31. Н.В. Шамина 2005. Аномалии веретена деления растительной клетки. Цитология, т. 47, №7, стр. 584-594.

32. N V. Shamina . 2005. Formation of division spindle in higher plant meiosis. Cell Biology International 29: 309-318.

33. N.V Shamina. 2005. Catalogue of division spindle abnormalities in higher plants. Cell Biology International 29: 384-391.

34. H В Шамина. 2005. Аномалии цитоскелета и мейотическая реституция в мейозе у высших растений. Цитология т 47, №8: 692-697.

35.Н.В Шамина, Н.М. Ковалева, Н.В. Соловьева. 2005 Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. IV. Средняя прометафаза. Цитология т.47, №9, 760-765.

36 H В. Шамина, Н.М Ковалева, Н.В. Соловьева, Е И. Гордеева 2005. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. V Поздняя прометафаза Общая схема формирования веретена деления. Цитология т. 47, №10, 889-897.

Подписано к печати 12/Х 2005 г.

Формат бумаги 60ч90 1/16. Печ. л. 2. Уч. изд. л. 1,4

Тираж 120 экз. Заказ 129

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

»19X53

РНБ Русский фонд

2006-4 21284

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шамина, Наталия Владимировна

Введение

Глава 1. Цитоскелет в делении растительной клетки. Обзор литературы

1.1. Микротрубочки и ассоциированные с ними белки ж 1.2. Цикл микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки

1.2.1. Интерфазные кортикальные спирали

1.2.2. Препрофазный пучок микротрубочек

1.2.3. Перинуклеарная система микротрубочек. Профазное веретено.

1.2.4. Веретено деления.

1.2.5. Система фибрилл фрагмопласта

1.3. Актиновый цитоскелет растительной клетки

1.4. Центры организации микротрубочек (ЦОМТ) и регуляция перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки

1.5. Цитоскелет и пространственная организация клетки

1.6. Цикл цитоскелета в мейотическом делении у высших растений

1.7. Мутации, затрагивающие цитоскелетный цикл у высших растений

1.7.1. Мутации, нарушающие структуру интерфазного цитоскелета

1.7.2. Мутации, нарушающие формирование препрофазного пучка

1.7.3. Мутации, нарушающие формирование веретена деления

1.7.4. Мутации, нарушающие цитоскелетные структуры цитокинеза

1.8. Аномалии цитоскелета в мейозе у отдаленных гибридов

1.9. Аномалии цитоскелета, вызываемые специфическими ингибиторами

1.10. Регуляция цикла деления у высших растений

1.11. Механизмы мейотической реституции

1.11.1. Мейотическая реституция у видов однодольных растений

1.11.2. Мейотическая реституция у видов двудольных растений

Глава 2. Материал и методы

2.1. Использованный материал

2.1.1. Виды однодольных растений

2.1.2. Виды двудольных растений

2.2. Методы исследования

2.2.1. Иммуноокрашивание микротрубочкового цитоскелета и визуализация хромосом

2.2.2. Метод электронной микроскопии

2.2.3. Визуализация МТ цитоскелета классическими методами

Глава 3. Динамика цитоскелета в мейотической профазе

3.1. Динамика цитоскелета на стадии профазы в норме

3.1.1. Деполимеризация цитоскелета в профазе

3.1.2. Консервация цитоскелета в профазе.

3.1.3. Деполимеризация цитоскелета с последующим формированием перинуклеарного кольца

3.1.4. Смешанные фенотипы, промежуточные между вышеописанными

3.1.5. Динамика цитоскелета в профазе II у видов двудольных растений

3.2.Аномалии построения перинуклеарного кольца МТ

3.2.1. Блок перестройки радиального цитоскелета в перинуклеарное кольцо МТ

3.2.2. Автономное кольцо МТ при ацентрическом положении ядра

3.2.3. Прямой пучок МТ вместо перинуклеарного кольца в профазе

3.2.4. Общее цитоскелетное кольцо в многоядерных МКП у видов однодольных

3.2.5. Слияние перинуклеарных колец

3.2.6. Формирование перинуклеарной системы цитоскелета в профазе в отсутствие ядерной оболочки

3.3. Цитоскелет в мейотической профазе. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки"

Цитоскелет - внутриклеточная филаментная цитоплазматическая структура, гораздо более подвижная и динамичная, чем можно заключить из ее названия. Среди функций цитоскелета - определение формы клетки и расположения в ней ядра и органелл, внутриклеточный транспорт, сегрегация хромосом (кариокинез), разделение цитоплазмы с автономизацией дочерних геномов (цитокинез), обеспечение дифференцировки клеток и тканей, формирование клеточной стенки у растений, удлинение растительной клетки. Все многообразие этих функций осуществляется цитоскелетными системами, весьма различными по морфологии и внутриклеточной локализации. Цитоскелет растительной клетки представлен, в основном, двумя составляющими: тубулиновыми микротрубочками (МТ) и актиновыми микрофиламентами (МФ).

Фундаментальным биологическим процессом, осуществляемым цитоскелетом, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно различным своим функциям на каждой стадии деления. Эти конфигурации называются системными структурами цитоскелета. Растительная клетка отличается от животной особенным многообразием цитоскелетных структур, сменяющих друг друга в ходе клеточного деления. Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (СосШагс! е1 а1., 1994). В делении растительной, да и любой эукариотной, клетки основная роль принадлежит микротрубочковому цитоскелету (Ва1иБка е1 а1., 2004). Актиновые микрофиламенты колокализуются с микротрубочковыми пучками в составе основных цитоскелетных структур, но их функция в них не ясна, поскольку ингибиторы актина не нарушают деления растительной клетки (51а1дег, БсЫм/а, 1987).

В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов клеточного деления была предложена еще Бовери (Воуеп, 1901) и активно поддержана Мэзия (Маг1а, 1984). Мэзия предложил для эукариотной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, соединенных между собой линейно гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомы в растительной клетке - дело будущего и целиком зависит от развития цитологических методов анализа (Mazia, 1987).

Существует противоположная точка зрения на морфологическую регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых пучков в различные конфигурации посредством активности белков, ассоциированных с микротрубочками (Smirnova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.

Согласно современным представлениям, для регуляции динамики цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: центры организации микротрубочек (ЦОМТ), - служащие в качестве «затравки» для полимеризации микротрубочек. В животных клетках и клетках низших эукариот ЦОМТ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений ЦОМТ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1995). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют собой важнейшую нерешенную проблему клеточной биологии (Mazia, 1987; Маге, 1997; Baluska et al., 1998).

Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и гипотезой самосборки, актуальной является вполне выполнимая задача: детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.

Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма информативный подход к решению разнообразных задач клеточной биологии. К сожалению, до сих пор использование морфологических аномалий в цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993; Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект -изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или к апомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999). Третий аспект применения клеточных аномалий для решения цитологических задач -анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et a!., 1997; Binarova et al., 1998a;).

Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе, безотносительно их генетической подоплеки, биологической или физиологической значимости является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Особенно эффективен этот подход для изучения клеточного деления и дифференцировки. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрытые в норме. Полностью нарушая или искажая взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают их роль в этом взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалий используется в анализе. Заранее предсказать, какую именно новую информацию удастся получить в результате такого анализа, невозможно. Может быть, поэтому этот подход до сих пор не используется в изучении структурного аспекта внутриклеточных процессов. Тем не менее, он имеет ряд существенных достоинств, главные из которых - высокая эффективность, методическая простота, а также возможность получить информацию, недоступную для других цитологических методов исследования. Мы назвали этот подход морфологической диссекцией.

Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны (десятки микрон в диаметре), многочисленны, синхронизованы по стадиям деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений легко доступны, то есть могут быть получены в достаточно большом количестве. Нарушениями мейотического деления характеризуются отдаленные гибриды, аллоплазматические линии, гаплоиды, полиплоиды, анеуплоиды и, конечно же, обширная коллекция мейотических мутантов, известная у высших растений (Каи1, 1988).

Правомерен ли выбор мейотического деления, которое является специализированным, в качестве модели для изучения деления растительной клетки вообще, и перенос полученных результатов на митотическое деление? Механизм динамики цитоскелета в отсутствие морфологически идентифицируемых центросомальных структур является важнейшей нерешенной проблемой клеточной биологии. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью. Кроме того, цикл цитоскелета в ходе мейотического деления в МКП практически не отличается от такового в митотическом делении бесстеночных клеток, например, эндосперма - классической модели для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки (Бгтгпоуа, Ва]ег, 1998). Морфологическими элементами цитоскелета, организующимися в цитоскелетные структуры и выявляемыми на световом уровне классическими методами визуализации цитоскелета, являются пучки МТ в комплексе с МФ или без них.

Многие промежуточные стадии цитоскелетного цикла для растительной клетки до сих пор не описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологическом уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукариотной клетки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических механизмов регуляции цикла морфологических структур цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне на основании полученных данных.

Для выполнения этой цели были поставлены конкретные задачи:

1. Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований со всеми переходными стадиями.

2. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки.

3. Создать обширную коллекцию аномалий различной этиологии по мобильным стадиям мейотического деления у различных видов однодольных и двудольных растений.

4. Разработать варианты методов визуализации микротрубочкового цитоскелета -как классических так и иммуноокрашивания,- оптимальных для работы с материнскими клетками пыльцы и адекватных поставленным задачам.

5. Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.

6. Сравнить цикл цитоскелета в мейозе у видов с последовательным и одновременным цитокинезом.

7. Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет т для выяснения цитоскелетных механизмов мейотической реституции.

8. Составить каталог аномалий веретена деления растительной клетки.

9.Составить аналог аномалий цитокинеза растительной клетки.

10. Составить каталог механизмов мейотической реституции.

11. Составить диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных в настоящей работе исследований внесен существенный вклад в решение важной проблемы клеточной биологии: морфологической регуляции перестроек цитоскелета в ходе деления бесцентриолярной клетки. Представленные к защите результаты и выводы оригинальны и получены впервые.

Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований: морфологическая диссекция, представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке впервые представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. В том числе впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных фибрилл веретена.выявлены новые механизмы реорганизации цитоскелета, участвующие в формировании биполярного веретена в поздней прометафазе. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Предложена модель временной регуляции цитокинеза. Впервые проведено сравнение циклов цитоскелета в мейозе с последовательным и одновременным цитокинезом и показано отсутствие принципиальных различий между ними. Выявлены новые механизмы цитоскелетного цикла: перемещение стабильных элементов цитоскелета, изменение их профиля и консолидация в единую структуру. Внесен существенный вклад в понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.

Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как естественная полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения и апомиксис. Описаны 26 новых аномалий анастрального веретена в дополнение к 4, известным ранее в литературе, а также 23 аномалии цитокинеза. Впервые описаны 18 цитоскелетных механизма мейотической реституции у однодольных и двудольных видов. Разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам. Составленные каталоги представляют ценность при анализе морфологического фенотипа мейотических мутаций, особенно у таких сложных для цитологического анализа объектов, как арабидопсис. Полученные знания о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки могут быть использованы при чтении университетского курса лекций по цитологии и клеточной биологии. Результаты настоящей работы используются для чтения лекций по курсу цитогенетики в Санкт-Петербургском и Новосибирском Государственных университетах и в Университете Джапура (Индия).'

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Когрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гг, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на Гордоновской конференции «Meiosis» (1996, США), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском Межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г.), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на I Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 2003), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. Публикации по теме работы. По теме работы опубликовано 36 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Шамина, Наталия Владимировна

Основные выводы

1. Анализ аномалий клеточного деления как таковых является эффективным подходом к изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований.

2. На стадиях от профазы до телофазы ход цикла цитоскелета обеспечивается утилизацией элементов предыдущей цитоскелетной системы при построении последующей, а именно:

2.1. В профазе цитоскелет проходит плоскостную реориентацию, тангенциальную ориентацию и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца.

2.2. В ранней прометафазе происходит дезинтеграция перинуклеарного кольца, выпрямление его микротрубочковых пучков и вход их в зону бывшего ядра с формированием хаотичной фигуры цитоскелета.

2.3. В средней прометафазе, или хаотической стадии, происходит формирование биполярных фибрилл веретена - центральных и кинетохорных.

2.4. В поздней прометафазе происходит ориентация биполярных фибрилл вдоль оси будущего деления за счет внешнего по отношению к цитоскелету механизма и окончательное формирование веретена деления за счет процессов самосборки элементов цитоскелета.

2.5. В телофазе построение фрагмопласта происходит как посредством утилизации фибрилл центрального веретена, так и синтеза полюсных МТ.

3. Формирование интерфазной радиальной системы МТ является автономным процессом в цикле реорганизации цитоскелета.

4. Впервые установлены процессы, обеспечивающие реорганизацию цитоскелета в ходе клеточного деления: перемещение стабильных пучков МТ, изменение их профиля и консолидация их в единую структуру.

5. Полученная картина динамики цитоскелета указывает на отсутствие цикла центросомы в делении материнских клеток пыльцы.

6. Впервые составлены полные каталоги: аномалий веретена деления растительной клетки (24 аномалии, 21 описана впервые); аномалий морфологических структур и процессов цитокинеза растительной клетки (26 аномалий, 20 описаны впервые); цитоскелетных механизмов реституционного процесса (19 механизмов, 18 описаны впервые).

7. Впервые разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. И.Н. Голубовская, Н.В. Шамина. 1980. Цитогенетическое изучение некоторых мейотических мутаций кукурузы, затрагивающих расхождение хромосом. «Актуальные вопросы генетики и селекции растений» Тезисы, докладов Сибирской региональной конференции, Новосибирск, стр. 182

2. И.Н. Голубовская, Н.Б. Христолюбова, В.Т. Сафонова, Н.В. Шамина. 1980. Мейоз как генетически регулируемый онтогенетический процесс. Всесоюзное совещание по генетике развития растений. Ташкент, с. 154.

3. Н.В. Шамина, И.Н. Голубовская. 1981. Контроль формирования и функции митотического аппарата. Цитология и Генетика, т. 15, стр. 77-87.

4. Н.В. Шамина, И.Н. Голубовская, А.Д. Груздев. 1981. Морфологические нарушения веретена у некоторых мейотических мутантов кукурузы. Цитология, т.23. стр.275-281.

5. Н.В. Шамина, А.Д.Груздев. 1987. Исследование двойного лучепреломления веретена у меймутантов кукурузы. Цитология, т.29, стр.104-106.

6. Н.В. Шамина. 1988. Изучение генетического контроля построения и функции веретена деления с использованием мутаций, нарушающих расхождение хромосом в мейозе у кукурузы. Цитология, т. 30, стр. 1301-1305.

7. Н.В. Шамина. 1989. Цитогенетическое изучение мейотических мутантов кукурузы с нарушенной сегрегацией хромосом. «Цитогенетика с-х растений», Новосибирск. Стр. 23-27.

8. Н.В. Шамина. 1988. Некоторые неизвестные механизмы построения мейотического веретена высших растений. 3 Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки. Петрозаводск, стр.21.

9. Н.В. Шамина. 1989. Первичный морфологический эффект трех мейотических мутаций, затрагивающих функцию веретена деления в мейозе у кукурузы. Тез. докладов Всес. конф. «Частная генетика растений», Киев, т.2, стр.121.

10. Н.В. Шамина. 1989. Некоторые неизвестные механизмы построения и функции мейотического веретена растительной клетки. В сб. «Цитогенетика сельскохозяйственных растений», Новосибирск, стр. 38-48.

11. Н.В. Шамина. 1990. Генетический контроль формирования мейотического веретена на примере ряда меймутантов кукурузы. IV Всесоюзн. Конф. Молодых ученых по физиологии растительной клетки. Минск, стр.15.

12. Н.В. Шамина. 1990. Мейотические мутации как модельный объект для изучения клеточных механизмов мейоза. 111 Всесоюз. Конференция по генетике и цитологии мейоза. Новосибирск, стр.28.

13. Н.В. Шамина. 1990. Контролирующее действие мутаций на морфологические структуры мейоза. 111 Всесоюзн. Конференция по генетике и цитологии мейоза. Новосибирск. Стр. 28.

14. N.V. Shamina. 1992. Three meiotic mutations altering the fidelity of chromosome transmission in maize. Abstr. 5 Intern. Congress on Cell Biology. Madrid, p.260.

15. N.V. Shamina. 1992. Two meiotic mutations altering the fidelity of chromosome transmission in maize. Chromosome Transmission and Mitosis Meeting, may, Leningrad, USSR, p.13-18.

16. Н.В.Шамина, Н.В.Дорогова. 1992. Ультраструктура материнских клеток пыльцы с нарушенной сегрегацией хромосом у кукурузы. Тез. ВОГИС, Минск.

17. Н.В. Дорогова, Н.В. Шамина. 1994. Особенности цитокинеза в клетках высших растений. Цитология, т.36, № 9-10, стр. 899-915.

18. Н.В. Шамина, Я.С. Рузанкина, С.П. Соснихина. 1994. Нарушение структуры веретена деления мутацией теНО в мужском мейозе у ржи. Цитология, т.36, №2. Стр.189-194.

19. Н.В. Шамина, С.Е. Козырева. 1995. Аномалии веретена, ведущие к мейотической реституции в мейозе отдаленных гибридов. Цитология, т.37. N28, стр.775-782.

20. Н.В. Шамина. 1994. Околоядерное кольцо микротрубочек - новая морфологическая структура в мейотической клетке. Тезисы съезда ВОГИС

21., Н.В. Шамина. Н.В. Дорогова. 1995. Изучение ультра структуры аномального мейоза у мутанта ms43 у кукурузы. Цитология, т.37, №7, стр.561-566.

22. N.V. Shamina. 1994. Planar perinuclear band and anastral meiotic metakinesis -normal and anomalous. 4th European Congress on Cell Biology. Prague, abstr. 33.

23.N.V. Shamina, N.V. Dorogova. 1997. Excessive cytokinesis distortion of cell division caused by meimutation pam in maize. Cell Biol Intern., v.21, p.292-294.

24.N.V. Dorogova, N.V. Shamina, S.I. Maletski. 1999. The mutational variation of a cytoskeleton and formation of unreduced male gametes in sugar beet. Sugar Tech vol.1,

No2, p.83-85.

25.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, A.G. Orlova, S.A. Trunova, N.P. Gontcharov. 1999. Abnormalities of spindle and cytokinesis behavior leading to meiotic restitution in cereals. Cell Biol Internatl vol.23, No12, pp. 863-870.

26.H.B. Шамина, H,B. Дорогова. 2000. Аномалии микротрубочкового цитоскелета в мутантной линии сахарной свеклы. Цитология, т.42, №4, стр.372-379.

27.Н.В. Шамина. Н.В. Дорогова, П.Л. Перельман. 2000. Нарушения мужского мейоза у гороха Pisum sativum L., вызываемые мутацией ms3. Цитология, т.42, N24, стр.404411.

28.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, Т.А. Trunova. 2000. Radial spindle and the phenotype of maize meiotic mutant, dv. Cell Biol Internatl vol.24, No.10, pp.729-736.

29.H.B. Шамина, Н.В. Дорогова, A.A. Загорская, E.B. Дейнеко, B.K. Шумный. 2000. Аномалии мужского мейоза в стерильной трансгенной линии табака RES91. Цитология, т.42, № 12, стр. 1159-1164.

30.N.V. Shamina, N.V. Dorogova, lu.V. Sidorchuk, A.A. Zagorskaya, E.V. Deineko, and V.K. Shumny. 2000. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco (Nicotiana tabacum L.). Cell Biol Internatl vol 25, pp. 367-369.

31.Ю.В. Сидорчук, A.A. Загорская, E.B. Дейнеко, Н.В. Шамина, B.K. Шумный. 2000. T-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ. Цитология и Генетика, т. 34, №6, стр. 3-8.

32.Н.В. Шамина, Н.Я. Вайсман, Н.В. Дорогова, О.А. Шаворская, С.И. Малецкий. 2001. Интерзональные микротрубочки и мейотическая реституция у двудольных. Цитология, т.43, №1, стр.33-38.

33.Дорогова Н.В., Шамина Н.В. 2001. Феномен чрезмерного цитокинеза в фенотипе мейотической мутации рат у кукурузы. Цитология. Т.43. С. 471-476

34.Серюкова Е.Г., Дорогова Н.В., Жарков Н.А., Шамина Н.В. 2003. Нарушения прометафазы, приводящие к реституции ядер. Цитология т. 45, N23. стр. 244-248. 35.Shamina N.V., Silkova O.G., Seriukova E.G. 2003. Monopolar spindles in meiosis of intergeneric cereal hybrids. Cell Biol Internatl 27: 657-664.

Зб.Шамина Н.В. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. I. Околоядерное кольцо микротрубочек и построение мейотического веретена. Цитология, т.45, №7, стр. 650-654.

37.Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серюкова Е.Г. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. II. Формирование перинуклеарного кольца микротрубочек. Цитология, т. 45, №7, стр. 655-660.

38.Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серюкова Е.Г., Силкова О.Г. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. III. Стадии ранней прометафазы. Цитология, т. 45, №7, стр. 661-667.

ЗЭ.Сидорчук Ю.В., Шамина Н.В., Дейнеко Е.В. 2003. Цитомиксис в материнских клетках пыльцы трансгенных растений табака. Тезисы Международного симпозиума по проблемам мейоза, Санкт-Петербург, октябрь 2003. Цитология, т. 45, №9, стр. 962.

40.Шамина Н.В. 2003. Каталог аномалий веретена деления растительной клетки. Тезисы Международного симпозиума по проблемам мейоза, Санкт-Петербург, октябрь 2003, Цитология, т. 45, №9, стр. 966.

41. Conicella С, Capo А, Cammaren М, Errico A, Shamina N, Monti L. 2003. Elucidation of meiotic nuclear restitution mechanisms in potato through analysis of microtubular cytoskeleton. Euphytica vol.133:107-115.

42. Н.В. Шамина, H.M. Ковалева, O.A. Шацкая, Е.Д. Гаврилова. 2004. Консолидация цитоскелета при формировании веретена деления в растительной клетке. I. Аномалии, затрагивающие целостность веретена в мейозе. Цитология, т. 46, №7, стр. 587-591.

43. Н.В. Шамина, Н.В. Дорогова, А. Е. Чередниченко. 2004. Консолидация цитоскелета при формировании веретена деления в растительной клетке. II. «Слившиеся веретена». Цитология, т. 46, №8, стр. 685-689.

44. Шамина Н. В., Дорогова Н.В. 2004. Молекулярные механизмы динамики цитоскелета в делении растительной клетки. Биологические мембраны, т 21, № 6, с. 435-441.

45. Н.В. Шамина, Н.В. Дорогова. 2004. Цикл микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки. Цитология, т. 46, №11, стр. 960-965.

46.Н.В Дорогова, Шамина Н.В. 2005. Организация цитокинеза в делении растительной клетки. Цитология, т. 47. №7, стр. 563-577.

47. Н.В. Шамина. 2005. Аномалии веретена деления растительной клетки. Цитология, т. 47, №7, стр. 584-594.

48. N.V. Shamina . 2005. Formation of division spindle in higher plant meiosis. Cell Biology International 29: 309-318.

49. N.V. Shamina. 2005. Catalogue of division spindle abnormalities in higher plants. Cell Biology International 29: 384-391.

50. H.B. Шамина. 2005. Аномалии цитоскелета и мейотическая реституция в мейозе у высших растений. Цитология, т. 47, №8,стр. 692-697.

51.Н.В. Шамина, Н.М. Ковалева, Н.В. Соловьева. 2005. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. IV. Средняя прометафаза. Цитология т.47, №9, 760-765.

52. Н.В. Шамина, Н.М. Ковалева, Н.В. Соловьева, Е. И. Гордеева. 2005. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. V. Поздняя прометафаза. Общая схема формирования веретена деления. Цитология 47 (10): 889-897.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шамина, Наталия Владимировна, Новосибирск

1. Васильев А.Е. 1996а. Сравнительная структурно-функциональная характеристика цитоскелета животных и высших растений. Журнал Общей Биологии 57: 293-324. Васильев А.Е. 19966. Цитоскелет генеративной сферы высших растений. Журнал Общей Биологии 57: 567-591.

2. Данжар П. 1950. Цитология растений и общая цитология. М., «Иностранная литература», 647 стр.

3. Дорогова Н.В., Шамина Н.В. 2001. Феномен чрезмерного цитокинеза в фенотипе мейотической мутации рат у кукурузы. Цитология 43: 471-476

4. Жарков H.A. 1990. Аномалии мейоза у пшеницы Мильтурум 553, моносомной по хромосоме 3D. Цитология и Генетика 24: 7-10

5. Звержанская Л. С. 1975. Некоторые особенности мейоза у гаплоидов кукурузы В сб.

6. Апомиксиси цитоэмбриология растений», Саратов, вып. 3:145—153.

7. Малецкий С. И., Денисова Э. В., Лутков А. Н. 1970. Получение самоопыленных линийу самонесовместимых растений сахарной свеклы. Генетика. 6:180-184.

8. Малецкий С.И., Колодяжная Я.С. 1999. Генетическая изменчивость в популяцияхсоматических клеток и ее влияние на репродуктивные признаки у покрытосеменныхрастений. Успехи Совр Биологии 119: 128-143.

9. Малюта Э. Н. 1984. Получение мейотических тетраплоидов сахарной свеклы с помощью мутации, приводящей к образованию нередуцированных гамет. В кн.: Генетика сахарной свеклы. Новосибирск, Наука, 161-182.

10. Машкина О. С. 1979. О путях образования нередуцированных микроспор у черешни. Цитология и генетика 13: 343—346.

11. Подлисских В.Е., Анкудо Т.М., Аношенко Б.Ю. 2002. особенности формирования веретена деления и поведение хромосом в мейозе у образцов картофеля с мутациейслившиеся веретена». Цитология 44: 996-1004.

12. Потапова Т. А., Щапова А. И. 1989. Мейоз у фертильных пшенично-пырейных полигаплоидов. Цитология 31: 108—110.

13. Потапова Т. А., Щапова А. И., Кравцова Л. А. 1990. Преодоление стерильностимежродовых гибридов. В сб. «Характеристика генома некоторых видовсельскохозяйственных растений». Новосибирск, С. 170—177.

14. Серюкова Е.Г., Дорогова Н.В., Жарков H.A., Шамина Н.В. 2003. Нарушенияпрометафазы, приводящие к реституции ядер. Цитология 45: 244- 248.

15. Склярова Н. П., Петухов С. Н. Особенности микроспорогенеза у диплоидных формкартофеля в связи с формированием нередуцированной пыльцы. Генетика 23:1622—1629.

16. Смирнова Е.А., Светлицкая О.М., Ченцов Ю.С. 2002. Нарушение организации митотических микротрубочек в клетках меристемы корешков Allium сера при действии хлоралгидрата. Цитология 47: 120-130.

17. Смирнова Е.А, Ченцов Ю.С. 1991. Восстановление микротрубочек в митотических клетках корневой меристемы Allium сера после действия колцемида. Цитология 33: 47-54.

18. Шамина Н.В.1988. Изучение генетического контроля построения и функции веретена деления с использованием мутаций, нарушающих расхождение хромосом в мейозе у кукурузы. Цитология 30: 1301-1305.

19. Шамина H.В., Дорогова H.B. 1995. Изучение ультраструктуры аномального мейоза у мутанта ms43 кукурузы. Цитология 37: 561-566.

20. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Загорская A.A., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. 200Ö. Нарушения мужского мейоза в трансгенной линии res91 табака. Цитология 42: 11731178.

21. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Серкжова Е.Г. 2003. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе высших растений. II. Формирование перинуклеарного кольца микротрубочек. Цитология 45: 655-660.

22. Шамина Н.В., Козырева С.Е. 1995. Аномалии веретена, ведущие к мейотическойреституции в мейозе у отдаленных гибридов. Цитология 37:775-782.

23. Шамина Н. В., РузанкинаЯ. С., Соснихина С. П. 1994. Нарушение структуры веретенаделения мутацией mei 10 в мужском мейозе у ржи. Цитология 36: 189—194.

24. Н.В. Шамина. 2005. Аномалии цитоскелета и мейотическая реституция в мейозе увысших растений. Цитология, т. 47, №8,стр. 692-697.

25. Н.В. Шамина, Н.М. Ковалева, Н.В. Соловьева. 2005. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. IV. Средняя прометафаза. Цитология т.47, №9, 760-765.

26. Н.В. Шамина, Н.М. Ковалева, Н.В. Соловьева, Е. И. Гордеева. 2005. Динамика микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших растений. V. Поздняя прометафаза. Общая схема формирования веретена деления. Цитология 47 (10): 889-897.

27. Шкутина Ф. М., Калинина Н. П., Усова Т. К., Богдевич И. Н. 1986. Цитологическоеизучение пшенично-ржаных гибридов F1. Генетика 22: 2126—2134.

28. Щапова А. И., Потапова Т. А. 1989. Генетическая обусловленность образованияреституционных ядер в мейозе полигаплоидов. В сб.: «Цитогенетикасельскохозяйственных растений». Новосибирск, 1989. С. 4—17.

29. Щапова А. И., Потапова Т. А., Кравцова Л. А. 1987а. Генетическая обусловленностьнерасхождения хромосом в мейозе пшенично-ржаных полигаплоидов. Генетика 23:473—481.

30. Albani D, Mariconti L, Ricagno S, Pitto L, Moroni C, Helin K, Cella R. 2000. DcE2F, a functional plant E2F-like transcripional activator from Daucus carota. J Biol Chem 275: 19258-19267.

31. Albrecht-Buehler G. 1990. In defense of non-molecular cell biology. Ann Rev Cytol 120: 191-241.

32. Alfano F, Errico A, Conicella C. 1997. Potato meiotic mutants and importance of changes in the cytoskeleton. Cell Biol. Intemat. 21: 3-5.

33. The Arabidopsis Genome Initiative. 2000. Analysis of the genome sequence of theflowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408:796-815.

34. Amon A. 1999. The spindle checkpoint. Curr Opin Genet Dev 9: 69-75.

35. Asada T, Kuriyama R, Shibaoka H. 1997. TKRP125, a kinesin-related protein involved inthe centrosome-independent organization of the cytokinetic apparatus in tobacco. J Cell1. Sci 110: 179-189.

36. Assaad FF, Mayer U, Wanner G, Jurgens G. 1996. The KEULE gene is involved in cytokinesis in Arabidopsis. Mol Gen Genet 253: 267-277.

37. Avers CJ. 1954. Chromosome behaviour in fertile triploid aster hybrids. Genetics 39 : 117—126.

38. Avila J. 1990. Microtubule dynamics. FASEB J 4: 3284-3290.

39. Azimzadeh J, Traas J, Pastuglia M. 2001. Molecular aspects of microtubule dynamics in plants. Curr Opin Plant Biol 4: 513-519.

40. Baas PW, Joshi HC. 1992. y-Tubulin distribution in the neuron: Implications for the origin of neuritic microtubules. J Cell Biol 119:171-178.

41. Bajer A. 1968. Fine studies on phragmoplast and cell plate formation. Chromosoma 24: 383-417.

42. Bajer A. 1968. Behavior and fine structure of spindle fibers during mitosis in endosperm. Chromosoma 25: 249-281.

43. Bajer A, Allen RD. 1966. Role of phragmoplast filaments in cell plate formation. J Cell Sci 1:455-462.

44. Bajer A, Cypher C, Mole-Bajer J, Howard HM. 1982. Taxol-induced anaphase reversal: Evidence for elongating microtubules can exert a pushing force in living cells. Proc Natl Acad Sci USA 79: 6569-6573.

45. Bajer A, Mole-Bajer J. 1972. Spindle dynamics and chromosome movements. Int Rev Cytol, Suppl 3: 1-217.

46. Bajer AS, Mole-Bajer J. 1982. Asters, poles and transport properties within spindle-like micrptubule arrays. Cold Spring Harbor Symp 46: 263-283.

47. Bajer AS, Smirnova EA, Mole-Bajer J. 1993. Microtubule-converging centers implications for microtubule dynamics in higher plants. In: Chromosome Segregation and Aneuploidy, Vig B ed., Berlin- Heidelberg; Springer, v. 72: 225-239.

48. Baluska F, Volkmann D, Barlow PW. 2001. Motile plant cell body: a "bug" within a "cage". Trends Plant Sci 6:104-111.

49. Barlow PW, Parker JS. 1996. Microtubular cytoskeleton and root morphogenesis. Plant Soil 187: 23-36.

50. Barroso C, Chan J, Allan V, Doonan J, Hussey P, Lloyd CW. 2000. Two kinesin-related proteins associated with the cold-stable cytoskeleton of carrot cells: characterization of a novel kinesin, DcKRP120-2. Plant J 24: 859-868.

51. Beadle GW. 1932. A gene in Zea mays for failure of cytokinesis during meiosis. Cytologia 3: 142-150.

52. Bichet A, Desnos T, Turner S, Grandjean 0, Hoffe H. B0TER01 is required for normal orientation of cortical microtubules and anisotropic cell expansion in Arabidopsls. Plant J 25:137-148.

53. Binarova P, Dolezel J, Draber P, Heberle-Bors E, Strnad M, and L Bogre. 1998. Treatment of Vicia faba root tip cells with specific inhibitors to cyclin-dependent kinases leads to abnormal spindle formation. Plant J 16: 697-707.

54. Binarova P, Hause B, Dolezel J, Draber P. 1998. Association of y-tubulin with kinetochores in Vicia faba meristem cells. Plant J 14: 751-757.

55. Bisgrove S.R., Hable W.E., Kropf D.L. 2004. +TIPs and microtubule regulation: thebeginning of the plus end in plants. Plant Physiol 136: 3855-3863.den Boer BG, Murray JA. 2000. Triggering the cell cycle in plants. Trends Cell Biol 10:245.250.

56. Blangy A, Lane HA, d'Hefin P, Harper M, Kress M, Nigg EA. 1995. Phosphorilation by p34cdc2 regulates spindle association of human Eg5, a kinesin-related motor essential for bipolar spindle formation in vivo. Cell 83: 1159-69.

57. Bonsignore CL, Hepler PK. 1985. Caffeine inhibition of cytokinesis: dynamics of cell plate formation. Protoplasma 129: 28-35/

58. Booher RN, Alfa CE, Hyams JS, Beach DH. 1989. Cell 58: 485-497.

59. Borisy GG, Rodionov VI. 1999. Lessons from the melanophore. FASEB J 13(Suppl):1. S221-S224.

60. Burgess J, Northcote DH. 1968. The relationship between the endoplasmic reticulum and microtubule aggregation and disaggregation. Planta 80: 1-14.

61. Burk DH, Liu B, Zhong R, Morrison WH, Ye ZH. 2001. A katanin-like protein regulates normal cell wall biosynthesis and cell elongation. Plant Cell 13: 807-827.

62. Busby CH, Gunning BES. 1983. Orientation of microtubules against transverse cells walls in root of Azolla pinnata R. Br. Protoplasma 116: 78-85.

63. Canaday J, Stoppin-Mellet V, Mutterer J, Lambert AM, Schmit AC. 2000. Higher plant ceells: gamma-tubulin and microtubule nucleation in the absence of centrosomes. Microsc Res Tech 49: 487-495.

64. Chan A, Cande WZ.1998. Maize meiotic spindles assemble around chromatin and do not require paired chromosomes. J Cell Sci 111: 3507-3515.

65. Chen C., Marcus A., Li W., Hu y., Grossniklaus U., Cyr R., Ma H. 2002. The Arabidopsis ATK-1 gene is required for spindle morphogenesis in male meiosis. Development 129: 2401-2409.

66. Cho S-O, Wick SM. 1990. Distribution and function of actin in developing stomatalcomplex of winter rye (Secale cereale cv. Puma). Protoplasma 157: 154-164.

67. Criqui et al., 2000. Cell-cycle-dependent proeolysis and ectopic overexpression of cyclin B1 in tobacco BY-2 cells. Plant J 24: 763-773.

68. Conicella C, Barone A, Del Guidice A, Frusciante L, Monti LM. 1991. Cytological evidences of SDR-FDR mixture in the formation of 2n eggs in a potato diploid clone. Theor Appl Genet 81: 59-63.

69. Conicella C, Capo A, Cammareri M, Errico A, Shamina N, Monti L. 2003. Elucidation of meiotic nuclear restitution mechanisms in potato through analysis of microtubular cytoskeleton. Euphytica 133:107-115.

70. Cullen CF, Deak P, Glover DM, Ohkura H. 1999. Mini-spindles: A gene encoding a conserved microtubule-associated protein required for the integrity of the mitotic spindle in Drosophila. J Cell Biol 146:1005-1018.

71. Cyr RJ. 1994. Microtubules in plant morphogenesis: Role of the cortical array. Ann Rev• Cell Biol 10:153-180.

72. Cyr RJ, Palevitz BA. 1989. Microtubule-binding proteins from carrot. I. Initial characterization and microtubule bundling. Planta 177: 245-260.

73. Cyr RJ, Palevitz BA. 1995. Organization of cortical microtubules in plant cells. Curr Opin Cell Biol 7: 65-71.

74. Dangeard P. 1947. Cytologie vegetale et cytologie generale. Paris, 650 p. Darlington CD. 1965. Cytology. London, J & A Churchill LTD.

75. Desai A, Mitchison TJ. 1997. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol 13: 83-117.

76. Deysson G. 1975. Microtubules and antimitotic substances. In: Microtubules and microtubule inhibitors. Amsterdam: North Holland Publ. Comp/ American Elsevier. 427451.

77. Dietrich J. 1979. Reconstructions tridimensionelles de l'appareil mitotique a partir de ^ coupes seriees longitudinales de meiocytes polliniques. Biol Cellulaire 34: 77-82.

78. Doonan J, Fobert P. 1997. Concerved and novel regulators of the plat cell cycle. Curr Opin Cell Biol 9: 824-830.

79. Dorogova N.V,. Shamina N.V,. Maletski S.I. 1999. The mutational variation of a cytoskeleton and formation of unreduced male gametes in sugar beet. Sugar Tech 1:.83-85.

80. Durso N.A., Leslie J.D., Cyr R.J. 1996. In sito immunochemical evidence that a homolog of protein translation elongation factor EF-1a is associated with microtubules in carrot cells. Protoplasma 190:141-150.

81. Euteneuer U, Mcintosh JR. 1980. Polarity of midbody and phragmoplast microtubules. J Cell Biol 87: 509-515.

82. Euteneuer U, Jackson WT, Mcintosh JR. 1982. Polarity of spindle microtubules in Haemanthus endosperm. J Cell Biol 91: 644-653.

83. Falconer MM, Donaldson G, Seagull RW. 1988. MTOCs in higher plant cells: an immunofluorescent study of microtubule assembly sites following depolymerization by APM. Protoplasma 144:46-55.

84. Fankhauster C, Simanis V. 1994. Cold fission: splitting the pombe cell at room temperature. Trend Cell Biol 4: 96-101.

85. Franklin AE, Cande WZ.1999. Nuclear organization and chromosome segregation. Plant Cell 11: 523-534.

86. Fuge H. 1994. Unorthodox male meiosis in Trichosia pubescence (Sciaridae). J Cell Sci 107: 299-312.

87. Gonzalez C, Saunders RD, Casal J, Molina I, Carmena M, Ripoll P. 1990. Mutation in theasp locus of Drosophila lead to multiple free centrosomes in syncitial embrios, but restrictcenttrosome duplication in larval neuroblasts. J Cell Sci 96: 605-616.

88. Gottschalk W, Klein HD. 1976. The influence of mutated genes on sporogenesis. A surveyof the genetic control of meiosis in Pisum sativum. Theor Appl Genet 48: 23-34.

89. Granger C, Cyr R. 2000. Microtubule reorganization in tobacco BY-2 cells stablyexpressing GFP-MBD. Planta 210: 502-509.

90. Gu X., Verma DPS. 1997. Dynamics of phragmoplastin in living cells during cell plate formation and uncoupling of cell division. Plant Cell 9: 157-169.

91. Gunning BES, Wick S. 1985. Preprophase bands, phragmoplasts, and spatial control of cytokinesis. J Cell Sci Suppl 2: 157-179.

92. Gustafsson A. 1935. Studies on mechanisms of parthenogenesis. Hereditas 21:1-111. Gutierres C. 1998. The retinoblastoma pathway in plant cell cycle and development. Curr Opin Plant Biol 1:492-497.

93. Hasezawa S, Kumagai K. 2002. Dynamic changes and the role of the cytoskeleton during the cell cycle in higher plant cells. Int Rev Cytol 214: 161-191.

94. Hatsumi M, Endow SA. 1992a. The Drosophila ncd microtubule motor protein is spindle-associated in meiotic and mitotic cells. J Cell Sci 103:1013-1020.

95. Hatsumi M, Endow SA. 1992b. Mutants of the microtubule motor protein, non-claret disjunctional, affect spindle structure and chromosome movement in meiosis and mitosis. J Cell Sci 101: 547-559.

96. Hawes CR, Juniper BE, Home JC. 1981. Low and high voltage electron microscopy of mitosis and cytokinesis in maize roots. Planta 152: 397-407.

97. Hepler PK, Bonsignore CL. 1990. Caffeine inhibition of cytokinesis: ultrastructure of cell plate formation/degeneration. Protoplasma 157: 182-192.

98. Hepler PK, Jackson W. 1969. Isopropil N-phenylcarbamate affects spindle microtubule orientation in dividing endosperm cells of Haemanthus katherinae Baker. J Cell Sci 5: 727• 743.

99. Hermsen JG. 1984. Mechanisms and genetic implications of 2n-gamete formation. Iowa State J Research 58:421-434.

100. Hogan C. 1987. Microtubule patterns during meiosis in two higher plant species. Protoplasma 138: 126-136.

101. Hogetsu T, Oshima Y. 1986. Immunofluorescence microscopy of microtubule arrangementin root cells of Pisum sativa L., var. Alaska. Plant Cell Physiol 27: 939-945.

102. Hoyt MA, Geiser JR. 1996. Genetic analysis of the mitotic spindle. Ann Rev Genet 30: 733.

103. Hunter AW, Wordeman L. 2000. How motor proteins influence microtubule polymerization dynamics. J Cell Sci 113: 4379-4389.

104. Hush JM, Overall RL. 1996. Cortical microtubule reorientation in higher plants: Dynamics and regulation. J Microsc 181: 129-139.

105. Hush JM, Wadsworth P, Callaham DA, Hepler PK. 1994. Quantification of microtubule dynamics in living plant cells using fluorescence redistribution after photobleaching. J Cell Sci 107: 775-784.

106. Huskins C. 1948. Segregation and reduction in somatic tissues. 1. Initial observations on Allium cepa. J Hered 39: 311-325.

107. Jackson WT. 1982. Actomyosin. In: Lloyd CW (ed) The cytoskeleton in plant growth and development. Academic Press, London, pp.3-29.

108. Jeng R, Sterns T. 1999. V-tubulin complexes: Size does matter. Trends Cell Biol 9: 339342.

109. Joubes J, Chevalier C, Dudits D, Heberle-Bors E, Inze D, Umeda M, Renaudi JP. 2000. CDK-related protein kinases in plants. Plant Mol Biol 43: 607-620.

110. Kakimoto T, Shibaoka H. 1987. Actin filaments and microtubules in the preprophase band and phragmoplast of tobacco cells. Protoplasma 140:151-156

111. Kamiya N. 1981. Physical and chemical basis of cytoplasmic streaming. Ann Rev Plant Physiol 32: 205-236.

112. Karyophyllis D, Galatis B. and C Katsaros. 1997. Centrosome and microtubule dynamics in apical cells of Sphacelaria rigidula (Phaeophyceae) treated with nocodazole. Protoplasmal 19:161-172.

113. Katsuta J, Shibaoka H. 1988. The roles of the cytoskeleton and the cell wall in nnuclear positioning in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol 29: 403-413.

114. Kaul M.L.H. 1988. Male Sterility in Higher Plants. Springer Verlag, Berlin - London -Tokyo.

115. Kuriyama R, Savereide P, Lefebvre P, Dasgupta S. 1990. The predicted amino acid sequence of a centrosphere protein in dividing sea urchin eggs is similar to elongation factor (EF-1a). J Cell Sci 95: 231-236.

116. Maan SS, Sasakuma T. 1977. Fertility of amphihaploids in Triticinae. J Hered 68: 87— 94.

117. Mandelkow E, Mandelkow E-M. 1995. Microtubules and microtubule-associated proteins. Curr Biol 144: 72-81.

118. Marcus A.I., Li W., Ma H., Cyr R.J. 2003. A kinesis mutant with an atypical bipolar spindle undergoes normal mitosis. Mol Biol Cell 14: 1717-1726.

119. Mathur J, Chua NH. 2000. Microtubule stabilization leads to growth reorientation in Arabidopsis trichomes. Plant Cell 12: 465-477.

120. Matthies HJG, McDonald HB, Goldstein LSB, Theurkauf WE. 1996. Anastral meiotic spindle morphogenesis: role of the non-claret disjunctional kinesin-like protein. J Cell Biol 134: 455-464.

121. Mazia D. 1984. Centrosomes and mitotic poles. Exp Cell Res 153: 1-15.

122. Mazia D. 1987. The chromosome cycle and the centrosome cycle in the mitotic cycle. Int Rev Cytol 100:49-92.

123. McCurdy DW, Gunning BES. 1990. Reorganization of cortical actin microfilaments and microtubulees at preprophase and mitosis in wheat root-tip cells: a double label immunofluorescence study. Cell Motil Cytoskeleton 15: 76-87.

124. McCurdy DW, Palevitz BA, Gunning BES. 1991. Effect of cytohalasins on actin in dividing root tip cells of Allium and Triticum: a comparative immunocytochemical study. Cell Motil Cytoskel 18: 107-112.

125. McCurdy DW, Williamson RE. 1991. Actin and actin-associated proteins. In: The

126. Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form. Academic Press Ltd, pp. 3-14.

127. McDonald HB, Stewart RJ, Goldstein LSB. 1990. The kinesin-like NCD protein of

128. Drosophila is a minus end-directed microtubule motor. Cell 63:1159-1165.

129. McLean BG, Eubanks S, Meagher RB. 1990. Tissue-specific expression of divergentactins in soybean root. Plant Cell 2: 335-344.

130. Meagher RB, McLean BG. 1990. Diversity of plant actins. Cell Motil Cytoskeleton 16: 164166.

131. Mendiburu AO, Peloquin SJ. 1976. Sexual polyploidization and depolyploidization: some terminology and definitions. Theor Appl Genet 48: 137-143.

132. Mews M., Sek F.J., Moore R., Volkmann D., Gunning B.E.S., John P.C.L. 1997. Mitotic cyclin distribution during maize division: implication for sequence diversity and function of cyclins in plants. Protoplasma 200: 128-145.

133. Mikhailov AV, Gundersenn GG. 1995. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton 32:173-186.

134. Mineyuki Y. 1999. The preprophase band of microtubules: its function as a cytokinetic apparatus in higher plants. Int Rev Cytol 187: 1-49.

135. Mineyuki Y, Gunning BES. 1990. A role for preprophase bands of microtubules in maturation of new cell walls, and a general proposal on the function of preprophase band * sites in cell division in higher plants. J Cell Sci 97: 527-537.

136. Mineyuki Y, Palevitz BA. 1990. Relationship between preprophase band organization, F-actin and the division site in Allium. Fluorescence and morphometric studies on cytochalasin-treated cells. J Cell Sci 97: 283-295.

137. Mironov V, De Veylder L, Van Montagu M, Inze D. 1999. Cyclin-dependent kinases and cell division in higher plants The nexus. Plant Cell 11: 509-521.

138. Mitchison TJ. 1992a. Self-organization of polymer-motor systems in the cytoskeleton. Phil Trans R Soc Lond B 336: 99-106.

139. Mitchison TJ. 1992b. Compare and contrast actin filaments and microtubules. Molec Biol Cell 3: 1309-1315.

140. Mitsuoka S. 1953. Morphology and fertility of the Fl hybrids between certain varietes of Triticum dicoccum and Aegilops squarrosa. Seiken Ziho 6: 91—96. Mizuno K. 1993. Microtubule-nucleation sites on nuclei of higher plant cells. Protoplasma 173:77-85.

141. Mok DWS, Peloquin SJ. 1975. Three mechansms of 2n pollen formaton n diploid potatoes. Can J Genet Cytol 17: 217-225.

142. Mole-Bajer J. 1967. Chromosome movements in chloralhydrate treated endosperm cells in vitro. Chromosoma 26:427-448. ^ Mole-Bajer J. 1969. Fine structural studies of apolar mitosis. Chromosoma 26: 427-448.

143. Mole-Bajer J , Bajer AS. 1983. Action of taxol on mitosis: Modification of microtubule arrangements and function of the mitotic spindle in Haemanthus endosperm. J Cell Biol 94:455-465.

144. Mole-Bajer J, Bajer AS. 1988. Relation of F-actin organization to microtubules in drug treated Haemanthus mitosis. Protoplasma, Suppl 1: 91-112.

145. Morejoihn LC, Bureau TE, Mole-Bajer J, Bajer AS, Fosket DE. 1987. Oryzalin, a dinitroaniline herbicide, binds to plant tubulin and inhibits microtubule polymerization in vitro. Planta 172: 252-264.

146. Moritz M, Braunfeld MB, Sedat JW, Alberts B, Agard DA. 1995. Microtubule nucleation byv-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature 378: 638-640.

147. Murray AW. 1992. Creative blocks: cell cycle checkpoints and feedback controls. Nature 359: 599-604.

148. Murray AW, Hunt T. 1993. The Cell Cycle: an Introduction. New York, Oxford. Oxford University Press. 251 p.

149. Nakaseko Yu, Yanagida M. 2001. Cytoskeleton in the cell cycle. Nature 412:291-292.

150. Nedelec FJ, Surrey T, Maggs AC, Leibler S. 1997. Self-organization of microtubules and motors. Nature 389: 305-308.

151. Nickle TC, Meinke DW. 1998. A cytokinesis-defective mutant of Arabidopsis (cytl)characterizedby embryonic lethality, incomplete cell walls, and excessive caltose accumulation. Plant J 15: 321-332.

152. Nogami A, Suzaki T, Shigenaka Y, Nagahama Y, Mineyuki Y. 1996. Effects of cycloheximide on preprophase bands and prophase spindles in onion (Allium cepa L.) root tip cells. Protoplasma 192: 109-121.

153. Nothnagel EA, Barak LS, Sanger JW, Webb WW. 1981. Fluorescence studies on modes of cytochalasin B and phallotoxin action on cytoplasmic streaming in Chara. J Cell Biol 88: 364-372.

154. Oakley BR. 1995. y-Tubulin and the fungal microtubule cytoskeleton. Can J Bot 73 (Suppl 1): S352-S358.

155. Ookata K, Hisinaga S, Bulinski JC, Murofushi H, Aizawa H, Itoh TJ, Hotani H, Okumura E, Tachibana K, Kishimoto T. 1995. J Cell Biol 128: 849-862.

156. Oryol LI. 1969. Polarity of microspores and movement of nuclei and of generative cells in Zea mays. Rev Cytol Biol Veg 32: 37-42.

157. Palevitz BA. 1980. Comparative effects of phalloidin and cytochalasin B on motility and morphogenesis in Allium. Can J Bot 58: 773-785.

158. Palevitz BA. 1982. The stomatal complex as a model of cytoskeleetal participation in cell differentiation. In: "Cytoskeleton in Plant Growth and Development", CW Lloyd ed., London: Academic Press, pp. 345-376.

159. Palevitz BA. 1987. Actin in the preprophase band of Allium cepa. J Cell Biol 104: 15151519.

160. Palevitz BA. 1988. Cytochalasin-induced reorganization of actin in Allium root cells. Cell Motil Cytoskeleton 9: 283-298.

161. Palevitz BA. 1990. Kinetochore behavior during generative cell division in Tradescantia virginiana. Protoplasma 157: 120-127.

162. Palevitz BA. 1991. Potential significance of microtubule rearrangement, translocation and reutilization in plant cell. In: The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form. Academic Press Ltd, pp 46- 55.

163. Palevitz BA, Ash JF, Hepler PK. 1974. Actin in the green alga, Nitella. Proc Natl Acad Sci USA 71: 363-366.

164. Palevitz BA, Hepler PK. 1974a. The control of the plane of division during stomataldifferentiation in Allium. I. Spindle reorientation. Chromosoma 46: 297-326.

165. Palevitz BA, Hepler PK. 1974b. The control of the plane of division during stomataldifferentiation in Allium. II. Drug studies. Chromosoma 46: 327-341.

166. Palmer RG. 1971. Cytological studies of ameiotic and normal maize with reference topremeiotic pairing. Chromosoma 35: 233-246.

167. Panteris E, Apostolakos P, Galatis B. 1992. The organization of F-actin in root tip cells of Adiantum capillus-veneris throughout the cell cycle. A double label fluorescence microscopy study. Protoplasma 170: 128-137.

168. Parthasarathy MV. 1985. F-actin architecture in coleoptile epidermal cells. Eur J Cell Biol 39: 1-12.

169. Peirson IH, Bowling SE, Makaroff CA. 1997. A defect in synapsis causes male sterility in a T-DNA-tagged Arabidopsis thaliana mutant. Plant J 11: 659-669.

170. Peloqun SJ, Boteux LS, Carputo D. 1999. Meotic mutants n potato: valuable variants. Genetics 153:1493-1499.

171. Pickett-Heaps JD. 1969. The evolution of the mitotic apparatus: an attempt at comparative ultrastructural cytology of dividing plant cell. Cytobios 3: 257-280.

172. Qu L, Vorsa N. 1999. Desynapsis and spindle abnormalities leading to 2n pollen formation in Vaccinium darrowi. Genome 42: 35-40.

173. Quarmby L. 2000. Cellilar samurai: katanin and the severing of microtubules. J Cell Sci113:2821-2827.

174. Ramanna MS. 1983. First division restitution gametes through fertile desynaptic mutants of potato. Euphytica 32: 337-350. ^ Rhoades MM, Dempsey E. 1966. Induction of chromosome doubling at meiosis by the elongate gene in maize. Genetics 54: 505-522.

175. Rieder CL, Alexander SP. 1990. Kinetochores are transported poleward along a single astral microtubule during chromosome attachment to the spindle in newt lung cells. J Cell Biol 110: 81-96.

176. Rieder CL, Novogrodski R. 1983. Intranuclear membranes and the formation of the firest meiotic spindle in Xenos peckic (Acroschismus roheeleri) oocytes. J Cell Biol 94: 11441155.

177. Riley R, Chapman V. 1957. Haploids and polyhaploids in Aegilops and Triticum. Heredity 11: 195—207.

178. Sadasivaiah RS, Kasha KJ. 1971. Meiosis in haploid barley an interpretation of nonhomologous chromosome association. Chromosoma 35: 247-263.

179. Sasakuma T, Kihara H. 1981. A synthesized common wheat obtained from a triploid hybrid, Aegilops squarrosa var. Strangulata x Triticum durum . Wheat Inf. Serv 52: 14— 18.

180. Sawin KE, LeGuellec K, Philippe M, Mitchison TJ. 1992. Mitotic spindle organization by a plus end-directed microtubule motor. Nature 359: 540-543.

181. Schellenbaum P, Vantard M, Lambert A-M. 1992. Higher plant microtubule-associated proteins (MAPs): a survey. Biol Cell 6: 359-364.

182. Schellenbaum P, Vantard M, Peter C, Fellous A, Lambert AM. 1993. Co-assembly properties of higher plant microtubule-associated proteins with purified brain and plant tubulin. Plant J 3:253-260

183. Schliwa M. 1986. The cytoskeleton, an introductory survey. Springer, Wien, New York, 328p.

184. Schmit AC, Vantard M, DeMey J, Lambert AM. 1983. Aster-like microtubule centers establish spindle polarity during interphase-mitosis transition in higher plant cells. Plant Cell Rep 2: 285-288.

185. Schmit AC, Lambert AM. 1987. Characterization and dynamics of cytoplasmic F-actin in higher plant endosperm cells during interphase, mitosis and cytokinesis. J Cell Biol 105: 2157-2166.

186. Sears ER. 1953. Addition of the genome of Haynaldia villosa to Triticum aestivum. Amer J Bot 40: 168—174.

187. Shamina NV,. Dorogova NV, Orlova AG,. Trunova SA. Gontcharov NP. 1999. Abnormalities of spindle and cytokinesis behavior leading to meiotic restitution in cereals.• Cell Biol Internatl 23: 863-870.

188. Shamina NV,. Dorogova NV, Sidorchuk luV, Zagorskaya AA, Deineko EV, Shumny VK. 2000. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco (iNicotiana tabacum L.). Cell Biol Internatl 25: 367-369.

189. Shamina NV, Silkova OG, Seriukova EG. 2003. Monopolar spindles in meiosis of intergeneric cereal hybrids. Cell Biol Internatl 27: 657-664.

190. Shamina NV, Dorogova NV,. Trunova TA. 2000. Radial spindle and the phenotype of maize meiotic mutant, dv. Cell Biol Internatl 24: 729-736.

191. Shamina N.V. 2005. Formation of division spindle in higher plant meiosis. Cell Biology International 29: 309-318. 0 Shamina N.V. 2005. Catalogue of division spindle abnormalities in higher plants. Cell Biology International 29: 384-391.

192. Sheldon JM, Hawes C. 1988. The actin cytoskeleton during male meiosis in Lilium. Cell Biol Int Rep 12: 471-476.

193. Shibaoka H. 1994. Plant hormone-induced changes in the orientation of cortical microtubules: alterations in the cross-linking between microtubules and plasma membrane. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 45: 527-544.

194. Shiina N, Gotoh Y, Kubomura N, Iwamatsu A, Nishida E. 1994. Microtubule severing byelongating factor 1a. Science 266: 282-285.

195. Smirnova EA, Bajer AS. 1992. Spindle poles in higher plant mitosis. Cell Motil Cytoskel 23: 1-7.

196. Smirnova EA, Bajer AS. 1994. Microtubule converging centers and the reorganization of interphase cytoskeleton and the mitotic spindle in higher plant Haemanthus. Cell Motil1. Cytoskel 27: 219-233.

197. Smirnova ES, Bajer AS. 1998. Early stages of spindle formation and independence of chromosome and microtubule cycles in Haemanthus endosperm. Cell Motil Cytoskeleton 40: 22-37.

198. Smith L.G. 1999. Divide and conquer: cytokinesis in plant cells. Curr. Opin. Plant Biol 2:• 447-453.

199. Staiger CH, Cande WZ. 1993. Cytoskeletal analysis of maize meiotic mutants. In:

200. Molecular and Cell Biology of the Plant Cell Cycle. JC Omrod and D. Francis (eds), Kluver Academic Press, pp. 157-171.

201. Staiger CH, Schliwa M. 1987. Actin localization and function in higher plants. Protoplasma 141: 1-12.

202. Stefani A. 1986. Unreduced gametes in the Fl hybrid of Triticum durum Desf. x Haynaldia villosa Schur. Z. Pflanzenzuchtg 96: 8—14.

203. Stoppin V, Lambert A-M, Vantard M. 1995. Plant microtubule-associated proteins (MAPs) affect microtubule nucleation and growth at plant nuclei and mammalian centrosomes. Eur J Cell Biol 69:11-23.

204. Stoppin V, Vantard M, Schmit AM, Lambert AM. 1994. Isolated plant nuclei nucleate microtubule assembly: the nuclear surface in higher plants has centrosome-like activity. Plant Cell 6:1099-1106.

205. Stoppin-Mellet V., Peter C., Lambert A-M. 2000. Distribution of y-tubulin in higher plant cells: cytosolic y-tubulin is part of high molecular weight complexes. Plant Biol 2: 290-296.

206. Sun et al., 1999. Characterization of maize (Zea mays L.) Wee1 and its activity in developing endosperm. Proc Nal Acad Sci USA 96: 4180-4185.

207. Sunkel CE, Glover DM. 1988. polo, a mitotic mutant of Drosophila displaying abnormal spindle poles. J Cell Sci 89: 25-38.

208. Tanaka M. 1959. Newly synthesized amphidiploid from the hybrids, Emmer wheat x Aegilops squarrosa varieties. Wheat Inf Serv 8: 8.

209. Tiwari SC, Wick SM, Williamson RE, Gunning BES. 1984. Cytoskeleton and integration of cellular function in cells of higher plants. J Cell Biol 99: 63S-69S.

210. Toczyski DP, Galgoczy DJ, Hartwell LH. 1997. CDC5 and CKII control adaptation to the yeast DNA damage checkpoint. Cell 90: 1097-1106.

211. Traas JA, Burgain S, Dumas de Vaulx R. 1989. The organization of the cytoskeleton during meiosis in eggplant Solatium melongena L. : Microtubules and F-actin are both necessary for coordinated meiotic division. J Cell Sci 92: 541-550.

212. Traas JA, Doonan JH, Rawlins DJ, Shaw PJ, Watts J, Lloyd CW. 1987. An actin network is present in cytoplasm throughout the cell cycle of carrot cells and associates with the dividing nucleus. J Cell Biol 105: 387-395.

213. Ueda K, Matsuyama T. 2000. Rearrangement of cortical microtubules from transversee to oblique or lonngitudinal in living cells of transgenic Arabidopsis thaliana. Protoplasma 213: 28-38.

214. Vaarama A. 1949. Spindle abnormalities and variation in chromosome number in Ribes nigrum. Hereditas 35:136-162.

215. Vale R. 1991. Severing of stable microtubules by a mitotically activated protein in Xenopus egg extracts. Cell 64: 827-839.

216. Van Lammeren AAM, Bednara J, Willemse MTM. 1988. Organization of the actin cytoskeleton during pollen development in Gasteria verrucosa (Mill.) H. Duval visualized with rhodamine-phalloidin. Planta 178: 531-539.

217. Van Lammeren AAM, Keijzer CJ, Willemse MTM, Kieft H. 1985. Structure and function of the microtubular cytoskeleton during pollen development in Gasteria verrucosa (Mill.) H. Duval. Planta 165: 1-11.

218. Vantard M, Schellenbaum P, Fellous A, Lambert AM. 1991. Characterization of maize microtubule-associated proteins, one of which is immunologically related to tau. Biochemistry 30: 9334-9340.

219. Vantard M, Stoppin V, Lambert AM. 1996. Cell cycle dependent nucleation and assembly of plant microtubular proteins. Int Rev Cytol 179: 302-318.

220. Veilleux RE, McHale NA, Lauer Fl. 1982. 2n gametes in diploid Solarium: frequency and types of spindle abnormalities. Can J Genet Cytol 24: 301-314.

221. Venverloo CJ, Libbenga KR. 1987. Regulation of the plane of cell division in vacuolated cells. I. The function of nuclear positioning and phragmosome formation. J Plant Physiol 131:267-284.

222. Vernos I, Karsenti E. 1995. Chromosomes take the lead in spindle assambly. Trends Cell Biol 5: 297-301.

223. Vorsa N, Ortiz R. 1992. Cytology of 2n pollen formation in a blueberry aneuploid (2n= 4x+9=57). J Hered 83: 346-349.

224. Vorobjev IA, Nadezhdina ES. 1987. The centrosome and its role in the organization of microtubules. Int Rev Cytol 106: 227-293.

225. Vos JW, Safadi F, Reddy AS, Hepler PK. 2000. The kinesin-like calmodulin binding protein is differentially involved in cell division. Plant Cell 12: 979-990. Wada B. 1965. Analysis of mitosis. Cytologia 30 (Suppl): 1-158.

226. Wada B, Kusunoki F. 1964. Spindle membrane in meiosis of pollen mother cells of Tradescantia and in mitosis of endosperm cells of Zephyranthes. Cytologia (Tokyo) 29: 109-111.

227. Wagenaar EB. 1968. Meiotic restitution and the origin of polyploidy. I. Influence of genotype on polyploid seedset in a Triticum crassum x T. turgidum hybrid. Can J Genet Cytol 10: 836—843.

228. Walker RA, Salmon ED, Endow SA. 1990. The Drosophila claret segregation protein is a minus-end directed molecule. Nature (Lond.) 347: 780-782.

229. Wang H, Cutler AJ, Fowke LC. 1991. Microtubule organization in cultured soybean and black spruce cells: interphase mitosis transition and spindle morphology. Protoplasma 162:46-54.

230. Wang H, Qi Q, Schorr P, Cufter AJ, Crosby Wl, Fowke LC.1998. ICK1, a cyclin-dependentprotein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interacts with both Cdc2a and CycD3 and its expression is induced by abscisic acid. Plant J 15: 501-510.

231. Wang RJ, Wissinger W, King EJ, Wang G. 1983. Studies on cell division in mammalian cells. VII. A temperature sensitive cell line abnormal in centriole separation and chromosome movement. J Cell Biol 96: 301-306.

232. Wang H, Zhou Y, Gilmer S, Whitwill S, Fowke LC. 2000. Expression of the plant cyclin-depedent kinase inhibitor ICK1 affects cell division, plant drowth and morphology. Plant J 24: 613-623.

233. Wasteneys GO. 2001. MOR1 is essential for organizing cortical microtubules in plants. Nature 411:610-613.

234. Wasteneys G.O. 2002. Microtubule organization in the green kingdom: chaos or self-order? J Cell Sci 115:1345-1354.

235. Wasteneys GO, Gunning BES, Hepler, PK. 1993. Microinjection of fluorescent brain tubulin reveals dynamic properties of cortical microtubules in living plant cells. Cell Motil Cytoskeleton 24:205-213.

236. Wheatley SP, Hinchcliffe EH, Glotzer M, Hyman A, Sluder G, Wang Y. 1997. CDK1 inactivation regulates anaphase spindle dynamics and cytokinesis in vivo. J Cell Biol 138:385.393.

237. Whittington AT, Vugrek O, Wei KJ, Hassenbein NG, Sugimoto K, Rashbrooke MC,. J Cell Biol 139: 417-434.

238. Wick S. 1985. Immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. III. Transition between mitotic/cytokinetic and interphase microtubule arrays. Cell Biol Intern Rep 9: 357-371.

239. Wick S. 1991. The perprophase band. In: CW Lloyd ed, The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form. Academic Press, London, pp. 231-244.

240. Wick SM, Duniec J. 1983. Immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. I. Preprophase band development and concomitant appearance of nuclear-associated tubulin. J Cell Biol 97: 235-243.

241. Wick SM, Duniec J. 1984. Immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. II. Transition between the pre-prophase band and the mitotic spindle. Protoplasma 122: 45-55.

242. Williamson RE. 1980. Actin in motile and other processes in plant cells. Can J Bot 58: 766772.

243. Williamson RE. 1990. Alignment of cortical microtubules by anisotropic wall stresses. Aust J Plant Physiol 17:601-613.

244. Williamson RE. 1991. Orientation of cortical microtubules in interphase plant cell. Int Rev Cytol 129: 135-206.

245. Xu SJ, Joppa LR. 1995. Mechanisms and inheritance of first division restitution in hybrids of wheat, rye, and Aegi/ops squarrosa. Genome 38: 607-615.

246. Yasuhara H, Sonobe S, Shibaoka H. 1993. Effects of taxol on the development of the cell plate and of the phragmoplast in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol 34: 21-29.

247. Yu HS, Russell SD. 1995. Three-dimentional ultrastructure of generative cell mitosis in the pollen tube of Nicotiana tabacum. Eur J Cell Biol 61: 338-348.

248. Yuan M, Shaw PJ, Warn RM, Lloyd CW. 1994. Dynamic reorientation of cortical microtubules, from transverse to longitudinal, in living plant cells. Proc Natl Acad Sei USA 91:6050-6053.

249. Zandomeni K, Schopfer P. 1993. Reorientation of microtubules at the outer epidermal wall of maize coleoptiles by phytochrome, blue-light photoreceptor, and auxin. Protoplasma 173:103-112.

250. Zee SY, Ye XL. 2000. Microtubule reorganization during pollen development of rice (Oryza sativa L.). Protoplasma 210: 188-201.

251. Zhang D, Wadsworth P, Hepler PK. 1990. Microtubule dynamics in living dividing plant cells: Confocal imaging of microinjected fluorescent brain tubulin. Proc Natl Acad Sei USA 87: 8820-8824.

252. Zickler D, Kleckner N. 1999. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Ann Rev Genet 33: 603-754.