Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химическая организация цитоскелета и водный обмен озимой пшеницы при действии низкой температуры и абсцизовой кислоты

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Олиневич, Ольга Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Цитоскелет растений: интегрирующая и структурно -функциональная роль в клетках

1.1.1. Микротрубочки.

1.1.2. Микрофиламенты.

1.1.3. Промежуточные филаменты.

1.1.4. Цитоскелет как целостная внутриклеточная система.

1.2. Мембранно-ассоциированный цитоскелет.

1.3. Влияние низких температур на структурное состояние и стабильность цитоскелета

1.3.1. МТ и МФ растительных клеток при действии низких температур.

1.3.2. Механизмы увеличения стабильности основных компонентов цитдскелета к холоду.-.

1.4. Зависимость состояния и транспорта воды в клетках от цитоскелета.

1.5. АБК как индуктор морозоустойчивости растений.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. Объекты, схема и методика исследований

2.1.1. Условия выращивания растений и схема опытов.

2.1.2. Исследование цитоскелетных и фосфорилированных белков в клетках методом одномерного электрофореза и иммуноблотинга.

2.1.3. Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для визуализации тубулинового и актинового цитоскелета в клетках разных органов проростков с использованием воска Стидманса

2.1.3.1. Методика I для визуализации МТ в клетках корней.

2.1.3.2. Методика II для визуализации МТ и МФ в клетках корней, колеоптилей и листьев.

2.1.4. Методический подход для выявление зависимости водного обмена от структурного состояния цитоскелета.

2.1.5. Приготовление растворов ингибиторов и стабилизаторов цитоскелета.

2.1.6. Методика определения водоудерживающей способности.

2.1.7. Измерение биофизических показателей водного обмена.

2.1.8. Изучение проницаемости мембран по выходу электролитов из тканей.

2.1.9. Оценка морозоустойчивости растений по ЛТ50.

2.1.10. Статобработка.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Иммунохимическое изучение цитоскелетных и фосфорилированных белков в экстрактах листьев и корней проростков разных сортов озимой пшеницы при действии низких температур и АБК

3.1.1. Иммунохимическое исследование цитоскелетных белков.

3.1.1.1. Иммуноблоты а-тубулиновых белков.

3.1.1.2. Иммуноблоты {3-тубулиновых белков.

3.1.1.3.Иммуноблоты актиновых белков.

3.1.1.4. Иммуноблоты (3-тубулиновых и актиновых белков молодых проростков.

3.1.1.5. Иммуноблоты а- и (3-тубулиновых белков проростков, подвергшихся криострессу.

3.1.2. Иммунохимическое исследование фосфорилированных белков.

3.2. Иммунофлуоресцентная визуализация тубулинового и актинового цитоскелета в клетках корней, колеоптилей и листьев с использованием воска с низкой точкой плавления

3.2.1. Конфокальные изображения тубулинового цитоскелета в интерфазных меристематических клетках корней разных сортов пшеницы.

3.2.2. Визуализация тубулиновых компонентов в делящихся клетках, разных зонах корней, колеоптилях и листьях проростков различного возраста.

3.2.3. Визуализация актиновых МФ в клетках разных зон корней.

3.3. Иммуноцитохимическое исследование влияния АБК и закаливания растений к холоду на содержание, структуру и стабильность тубулиновых и актиновых компонентов цитоскелета в разных зонах корней

3.3.1. Содержание тубулиновых белков.

3.3.2. Содержание тубулиновых белков в обработанных оризалином корнях.;.

3.3.3. Структура тубулинового цитоскелета: ориентация, пространственная локализация, уровень агрегации и иммунофлуоресценции МТ.

3.3.4. Структура и стабильность МТ в обработанных оризалином корнях.

3.3.5. Структура актинового цитоскелета: ориентация, пространственная локализация, уровень агрегации и иммунофлуоресценции МФ.

3.4. Изучение эффектов последействия АБК на структурное состояние и стабильность тубулиновых компонентов цитоскелета в клетках разных зон корней с использованием метода непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии

3.4.1. Структурная организация МТ-скелета.

3.4.2. Стабильность МТ-скелета.

3.5. Индуцированные модификаторами цитоскелета изменения физиологических и биофизических показателей водного обмена растений разных сортов озимой пшеницы при действии низких температур и АБК

3.5.1. Влияние цитохалазина Б и колхицина на ВС листьев проростков, выращенных в нормальных условиях (без закаливания).

3.5.2. Эффект пипольфена и осмотического стресса на ВС листьев, обработанных колхицином и цитохалазином Б.

3.5.3. Действие разных концентраций СаСЬ на ВС листьев, обработанных колхицином и цитохалазином Б.

3.5.4. Влияние колхицина и ДМСО на ВС листьев незакалённых и холодозакалённых проростков.

3.5.5. Эффект оризалина на водный обмен незакалённых, закалённых к холоду и обработанных АБК проростков

3.5.5.1. Водоудерживающая способность и времена спин-спиновой релаксации (Т2) проростков, закалённых к холоду в течение 3 суток.

3.5.5.1.1. ВС листьев.

3.5.5.1.2. ВС корней.

3.5.5.1.3. Т2 листьев и корней.

3.5.5.2. ВС листьев и биофизические показатели водного обмена проростков, закалённых к холоду в течение 7 суток

3.5.5.2.1. ВС листьев.

3.5.5.2.2. Времена спин-спиновой релаксации (Т2) и эффективный коэффициент саммодиффузии воды (ДЭфф) листьев.

3.5.6. Действие ингибиторов цитоскелета на ВС листьев проростков в условиях криостресса разной силы.

3.6. Вызываемые оризалином изменения проницаемости плазматических мембран клеток незакалённых, закалённых к холоду и обработанных АБК растений

3.6.1. Проницаемость мембран клеток листьев и корней при закаливании растений к холоду в течение 3 суток.

3.6.2. Проницаемость мембран клеток листьев при закаливании растений к холоду в течение 7 суток.

3.7. Оценка морозоустойчивости листьев и корней закалённых к холоду и обработанных АБК проростков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химическая организация цитоскелета и водный обмен озимой пшеницы при действии низкой температуры и абсцизовой кислоты"

Актуальность темы. Исследования свойств и функций цитоскелета, являющегося важнейшей полифункциональной надмолекулярной системой, относятся к перспективным направлениям клеточной биологии и способствуют глубокому пониманию закономерностей пространственно- временной организации клеточного метаболизма и сохранения структурной целостности клеток. Чрезвычайно разветвлённая сеть цитоскелета в виде тубулиновых (МТ) и актиновых микрофиламентов (МФ) играет ключевую роль в процессах роста и развития растений, регулируя субклеточную организацию, деление, полярность, различные формы подвижности клеток и участвуя тем самым в морфогенезе органов и тканей (Туркина, 1985; Дорогова, Шамина, 1994; Васильев, 1996; Медведев, Маркова, 1998; Соколов и др., 1998; Lloyd, 1987; Baluska et al.,,1998; Nick, 1998; Quader, 1998).

В настоящее время благодаря широкому применению иммунохимиче-ских и микроскопических методов вплоть до конфокальной лазерной микроскопии, а также методов молекулярной генетики многое известно о локализации белков цитоскелета в растительных клетках, их химическом и структурном состоянии, о механизмах сборки и разборки элементов цитоскелета, их контактах с мембранами и органеллами (Lloyd, 1996; Baluska et al., 1997; Nick, 1998; Collings et al., 1998). Особенно интенсивно развиваемыми направлениями являются исследования структурного и функционального значения взаимодействий кортикального цитоскелета с плазматической мембраной (Lloyd, 1996), состава и функций ассоциированных с МТ и МФ белков (Клячко, 1998; Goddard et al., 1994), молекулярная фармакология и генетика тубулинов и актинов (Блюм, Страшнюк, 1993; Morejohn, 1991; Quader, 1998). Показана высокая динамичность и чувствительность цитоскелетных структур растений к различным абиогенным и биогенным факторам внешней среды (Shibaoka, 1994; Lloyd et al., 1996; Nick, 1998), в том числе и к низким температурам, изменяющим полимерное состояние МТ и МФ, состав изотипов и взаимодействия с 9 мембранами (Astrom et al., 1991; Chu et al., 1993; Bokros et al., 1996). Большое число генов тубулиновых и актиновых белков в клетках растений рассматривается как необходимое условие для адаптации растений к внешним условиям (Goddard et al., 1994; Mcdowell et al., 1996). При этом особое внимание уделяется участию цитоскелета в сигнальных системах (Nick, 1999; Volkmann, Baluska, 1999).

Наряду с впечатляющими достижениями в области молекулярной биологии цитоскелета, однако, о его физиологической роли и, в частности, о механизмах вовлечения компонентов цитоскелета в адекватные ответы клеток растений на низкие температуры имеется крайне ограниченная информация. Так, охлаждение и замораживание многих видов растений вызывает деполимеризацию МТ (Bartolo, Carter, 1991) и нередко их полную деструкцию вплоть до деградации тубулиновых белков с одновременным повреждением растений от хо-лодового стресса (Rikin et al., 1983; Okamura et al., 1993). Предполагается, что стабильность МТ, проявляющаяся в их способности сохранять свое полимерное состояние, связана с холодостойкостью многих видов растений (Jian et al., 1989; Astrom et al., 1991), но существует и иное мнение (Chu et al., 1992). Сведения же о влиянии низкотемпературного закаливания растений на филаменты цитоскелета являются немногочисленными и противоречивыми (Kerr, Carter, 1990 а, б; Pihakaski-Maunsbach, Puhakainen, 1995). Из-за отсутствия системных знаний оставался нерешенным вопрос об участии цитоскелета в адаптивных изменениях физиологических процессов при развитии морозоустойчивости растений. Проведение такого рода цитофизиологических исследований необходимо для расшифровки первичных индуцибельных механизмов термоустойчивости и разработки новых генно-инженерных подходов к повышению адаптивного потенциала и экологической пластичности растений.

Закаливание озимых растений к низким температурам и формирование их морозоустойчивости тесно связаны с водным обменом (Туманов, 1979) и, в частности, с водоудерживающей способностью тканей (Хохлова и др., 1991).

10

Однако в этом отношении ничего не было известно о роли основных компонентов цитоскелета. Clegg (1984) и Снигиревская (1990) обобщили немногочисленные данные о влиянии МТ и МФ на состояние и транспорт воды в клетках животных тканей. В немногих работах сообщается об участии белков цитоскелета в процессах транспорта воды в растениях (Можаева, Пилыцикова, 1972, 1976; Жолкевич, Чугунова, 1987, 1995; Wayne, Tazawa, 1988) и низкотемпературном обезвоживании протопластов (Исабеков, Красавцев, 1989). В связи с этим представляло интерес исследовать зависимость водного обмена от структурной организации цитоскелетных компонентов при закаливании растений низкими положительными температурами и действии абсцизовой кислоты. Известно, что оба фактора повышают морозоустойчивость озимых злаков (Gusta et al., 1996; Veisz et al., 1996) и изменяют стабильность цитоскелета (Sakiyama, Shibaoka, 1990; Eun, Lee, 1997). В то же время высказана точка зрения о существовании АБК-зависимых и независимых путей повышения устойчивости растений к низким температурам (Dallaire et al., 1994; Hughes, Dunn, 1996; Gusta et al, 1996).

При выполнении работы мы исходили из теоретической предпосылки о том, что общей системой, воспринимающей сигналы от низких температур и АБК, является цитоскелет, динамическая реорганизация которого оказывает влияние на морозоустойчивость растений через изменение водного статуса клеток и прежде всего - состояния и транспорта воды. При этом большое внимание было уделено выяснению сходства и различий между действием холодового закаливания и АБК.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение физико - химической организации тубулинового и актинового цитоскелета и его роли в водном обмене в связи с формированием морозоустойчивости у разных сортов озимой пшеницы при закаливании к холоду и действии АБК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

11

- провести электрофоретический анализ и иммуноблотинг цитоскелет-ных белков и выявить их сортоспецифические и органоспецифические особенности;

- осуществить иммунофлуоресцентную визуализацию тубулинового и актинового цитоскелета в клетках листьев, колеоптилей и разных зон корней;

- изучить влияние низких температур, АБК и оризалина на основные параметры физико - химического состояния МТ и МФ (содержание, локализация, ориентация, структура, стабильность) в клетках разных зон корней;

- выявить эффект последействия АБК на тубулиновые компоненты цитоскелета корней;

- изучить влияние направленной модификации цитоскелета in vivo с помощью ингибиторов и стабилизаторов полимеризации тубулиновых и актино-вых белков на водоудерживающую способность (ВС) и биофизические показатели транспорта воды (Т2, Дэфф), а также на проницаемость клеточных мембран листьев и корней;

- установить органо-, сортоспецифические и АБК- опосредуемые особенности действия структурных модификаторов цитоскелета на параметры водного обмена.

Научная новизна работы. Впервые проведена иммуноцитохимическая визуализация тубулинового и актинового цитоскелета в клетках листьев, колеоптилей и разных зон корней и проанализирован состав цитоскелетных белков в экстрактах растительных тканей отличающихся по морозоустойчивости трёх сортов озимой пшеницы при адаптации растений к низким температурам и обработке их АБК. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что закаливание растений к холоду и АБК сортоспецифично уменьшают деполимеризующее действие оризалина на МТ корней, то есть повышают их стабильность, что коррелирует с увеличением морозоустойчивости растений. Реализация стабилизирующего действия этих факторов на МТ осуществляется разными путями: усиление пространственной агрегации МТ между собой (за

12 каливание) и уменьшение содержания тубулиновых компонентов (белков и МТ) и деполимеризация МФ (АБК). Впервые показано, что наиболее выраженные изменения цитоскелета происходят в клетках зоны дифференциации, которая является ответственной за морозоустойчивость корней. В условиях последействия АБК обнаружено ингибирующее влияние гормона на содержание и стабильность МТ в меристематических клетках корней, в то время как в зоне дифференциации уровень тубулиновых компонентов, снижение которого было отмечено при действии АБК, восстанавливался.

Для выявления зависимости водного обмена тканей/клеток от состояния цитоскелета разработан новый методический подход, основанный на модификации цитоскелетных структур с помощью вводимых в интактные ткани ингибиторов и стабилизаторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков и последующей регистрации физиологических и биофизических показателей водообмена. Установлено, что дезорганизация цитоскелетной сети снижает ВС и усиливает трансмембранный перенос воды, в то время как её стабилизация вызывает противоположные изменения. Обнаружено, что зависимость водного обмена от структурной целостности цитоскелета является генотипически детерминированной, органоспецифической, гормонопосредуемой и определяется физиологическим состоянием растений.

Впервые идентифицированы критерии стабильности цитоскелета: степень сохранности МТ в полимерной форме в оризалин - обработанных клетках, высокое соотношение актиновые/тубулиновые белки, продольная ориентация МТ, интенсивно флуоресцирующие пучки МТ и МФ, низкая чувствительность параметров водного обмена (ВС, Т2, ДЭфф) к антицитоскелетным препаратам. Высокое соотношение актиновые/тубулиновые белки и низкая чувствительность ВС к оризалину соответствуют более высокому уровню ВС и морозоустойчивости листьев по сравнению с корнями.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые создана определённая система представлений о фенотипических и гормональных аспектах

13 физико-химической организации цитоскелета и его физиологической роли при развитии термоадаптивного потенциала растений. Выдвинута и обоснована новая концепция о том, что при обработке проростков АБК, так же, как и на начальных этапах холодового закаливания (3°С, 3 сут), в клетках появляются более стабильные, но функционально менее активные сообщества тубулиновых структур и происходит деполимеризация МФ, что способствует замедлению процессов роста и водного обмена растений. На заключительных этапах холо-довой адаптации (3°С, 7 сут) стабильность МТ несколько уменьшается, а полимеризация МФ возрастает, и это, вероятно, создаёт условия для частичного восстановления ростовых и адаптивных процессов.

Снижение чувствительности ВС листьев к оризалину в ряду мало—» средне-» высокоморозоустойчивый сорт, указывающее на неодинаковую способность сортов к стабилизации системы «цитоскелет-вода», а также АБК- индуцированное увеличение статуса полимеризации МТ корней могут быть использованы в качестве чувствительных физиологических тестов на холодостойкость МТ и. морозоустойчивость растений. Использование экзогенной АБК для активизации защитных процессов и повышения устойчивости растений является наиболее эффективным лишь для маломорозоустойчивых сортов озимой пшеницы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на международном XXVII конгрессе Ампера "Magnetic resonance and related phenomena" (Kazan, August 21-28, 1994), на международном семинаре «New biological approaches to understand and improve winter survival of plants» (Archus, Denmark, April 11-13, 1996), на X международном конгрессе «From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach» (Florence, Italy, September 9-13, 1996), на международной конференции «The cereal adaptation to low temperature stress in controlled environments" (Martonvasar, Hungary, June 2-4, 1997), на III европейской конференции «Modern aspects of the structure and dynamic investigation of paramagnetic systems by EPR" (Leipzig, August 21-29,

14

1997), на международной конференции "Plant cytoskeleton: molecular keys for biotechnology" (Yalta, Crimea, Ukraine, September 14-19, 1998), на ежегодных симпозиумах ОФР «Физико-химические основы физиологии растений (Пущи-но, 4-6 января, 1995; Пенза, 5-8 февраля, 1996; Москва, 24-28 июня, 1997), на Первой всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению (С.Петербург, 25-30 ноября, 1996), на II (X) съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков» (С.- Петербург, 26-29 мая,

1998), на международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 4-9 октября, 1999), на V международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 29 июня - 1 июля, 1999), на международном научном семинаре "Development of cold and water stress résistance in différent genotypes of wheat» (Казань, 1 -9 июля, 1999), на международной конференции "Molecular biology and physiology of water and soluté transport» (Goteborg, Sweden, July 1-5, 2000), на IV республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 14-15 декабря, 2000), на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета 1992, 1993, 1996- 2000 годов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста, включает 36 рисунков и 7 таблиц, состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов и списка литературы (295 наименований, из них 56 на русском языке).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Олиневич, Ольга Викторовна

выводы

1. Электрофоретическое разделение полипептидов с последующим иммуноблотингом позволило установить, что листья озимой пшеницы содержали больше актиновых белков, чем тубулиновых, а корни, наоборот, -меньше актиновых и больше тубулиновых. Предполагается, что высокое отношение актина к тубулинам в листьях соответствует высокой стабильности МТ, низкое соотношение этих белков в корнях - низкой стабильности МТ.

2. Иммуноцитохимически показано, что закаливание растений к холоду и обработка растений экзогенной АБК сортоспецифично снижали деполимеризующее действие оризалина на МТ корней, что свидетельствует об увеличении стабильности тубулинового цитоскелета и коррелирует с повышением морозоустойчивости растений.

3. Реализация стабилизирующих эффектов закаливания и АБК на цитоскелет осуществляется разными путями: адаптация растений к низким температурам, усиливая пространственную агрегацию МТ между собой, приводила к образованию плотной сети тубулинового цитоскелета из толстых пучков МТ, а АБК вызывала уменьшение содержания тубулиновых компонентов (белков и МТ), появление менее разветвлённой сети слабо флуоресцирующих МТ и деполимеризацию МФ.

4. В отличие от зон меристемы и растяжения наиболее выраженные температуро- и АБК-индуцированные изменения цитоскелета выявлены в клетках зоны дифференциации корней, что указывает на высокую адаптационную способность и ответственную роль этой зоны за морозоустойчивость растений.

5. В условиях последействия показано ингибирующее влияние гормона на содержание и стабильность МТ в меристематических клетках корней, в то время как в зоне дифференциации уровень тубулиновых компонентов, снижение которого было отмечено при действии АБК, восстанавливался.

212

Возможно, эти изменения обусловлены межзональным перераспределением гормона из дифференцирующихся клеток в меристематические.

6. Установлено, что в условиях, индуцирующих деполимеризацию МТ и МФ (оризалин, колхицин, цитохалазин Б, высокие концентрации кальция, осмотический стресс, замораживание), происходило снижение ВС, коррелирующее с повышением скорости межклеточного транспорта воды и увеличением проницаемости клеточных мембран. В условиях, благоприятствующих полимеризации филаментов цитоскелета (ДМСО, низкие концентрации кальция, закаливание к холоду), отмечены противоположные изменения. Эти результаты можно рассматривать как указание на то, что термодинамическое состояние воды и её трансмембранный перенос контролируются целостностью цитоскелетной сети и её взаимодействиями с плазмалеммой.

7. Показано, что закаливание растений к холоду и экзогенная АБК уменьшали чувствительность ВС, Т2, Дэфф листьев к колхицину и оризалину. В корнях АБК усиливала действие этих препаратов на ВС и Т2, а закаливание -снижало. Степень ингибирующих эффектов оризалина и колхицина обратно коррелировала с уровнем морозоустойчивости сорта и сильнее проявлялась в корнях, чем листьях. Изменение восприимчивости ВС к антицитоскелетным препаратам может быть следствием реорганизации цитоскелетной сети и, тем самым, изменения матричной функции (контакты с водой) цитоскелета и взаимодействующих с ним клеточных структур, в том числе и аквапоринов водных каналов.

8. АБК приводила к снижению ЛТ5о (повышению морозоустойчивости) листьев и корней как незакалённых, так и закалённых растений, но у разных сортов с неодинаковой степенью, причём эффект закаливания был выше такового АБК, особенно у морозоустойчивых сортов. Наибольшее действие АБК как индуктора морозоустойчивости, наблюдаемое у листьев незакалённых

213 растений, выращенных при оптимальных условиях (23 °С), может быть связано с повышением ВС за счёт стабилизации системы «цитоскелет- вода».

9. Гипотермия и АБК аддитивно снижали чувствительность ВС к оризалину в листьях, но не в корнях, лишь на начальных этапах низкотемпературного закаливания (3°С, 3 сут) и сильнее всего у маломорозоустойчивого сорта, у которого отмечен также наибольший дополнительный АБК- индуцированный прирост ВС и морозоустойчивости. В корнях, по-видимому, действует иной механизм индукции морозоустойчивости под влиянием АБК, не связанный с возрастанием ВС.

10. Обнаружено устранение эффектов АБК низкими температурами к концу холодового закаливания. В связи с этим предполагается, что замедление роста растений под действием АБК и на начальных этапах адаптации (3°С, 3 сут) связано с появлением в клетках более стабильных, но функционально менее активных сообществ МТ. На заключительных этапах закаливания (3°С, 7 сут), по-видимому, происходит смена состава тубулиновых структур на менее стабильные и возрастает полимеризация МФ, что создаёт условия для частичного восстановления ростовых и продолжения термоадаптивных процессов в новых условиях.

214

заключение

Цитоскелетным структурам, проявляющим высокую лабильность и динамическую нестабильность, отводится значительное место в ответах клеток растений на внешние воздействия (Shibaoka, 1994; Lloyd et al., 1996; Nick, 1999). Показано, что охлаждение и замораживание многих видов растений вызывает деполимеризацию МТ (Bartolo, Carter 1991) и нередко их полную деструкцию вплоть до деградации тубулиновых белков (Okamura et al., 1993; Pichakaski-Maunsbach, Puchakainen 1995). Обнаружена обратная корреляция между способностью МТ деполимеризоваться и уровнем холодостойкости растений (Jian et al., 1989). Предполагается, что стабильность МТ, проявляющаяся в их способности сохранять свое полимерное состояние, имеет отношение к развитию холодостойкости пыльцевых трубок табака (Astrom et al., 1991), а холодовое повреждение моркови и хлопчатника связано с деструкцией МТ (Okamura et al, 1993; Rikin et al., 1983). Однако деполимеризация кортикальных МТ суспензионной культуры клеток кукурузы не является главной причиной летального повреждения растений от охлаждения (Chu et al., 1992).

Медиатором при ответах растений на низкие температуры является АБК (Hughes, Dunn 1996). Установлено, что обработка растений хлопчатника и гороха АБК повышает стабильность тубулинового цитоскелета к холоду, предотвращая вызванную охлаждением деструкцию МТ (Rikin et al., 1993) и способствуя их продольной ориентации (Shibaoka, Nagai, 1994). В противоположность этим данным в опытах с суспензионной культурой клеток кукурузы экзогенная АБК не снижала индуцированную охлаждением степень деполимеризации кортикальных МТ (Chu et al., 1992).

Известно, что адекватная реакция растительных клеток на действие низких температур связана с регуляцией водного обмена (Туманов, 1979). В литературе имеются данные о матричной функции цитоскелетной сети, создающей вследствие своей сильной разветвленности огромную

192 гидрофильную поверхность, влияющую на состояние и свойства клеточной воды (Clegg, 1984), а также об участии тубулиновых и актиновых структур во внутри- и межклеточном транспорте воды (Можаева, Пилыцикова, 1972, 1976; Жолкевич, Чугунова, 1987, 1995; Wayne, Tazawa, 1988; Снигиревская 1990). Принимая во внимание эти сведения, в своей работе мы исходили из концепции, согласно которой общей системой, воспринимающей сигналы как от АБК, так и низких температур, может быть цитоскелет, динамическая реорганизация которого оказывает влияние на морозоустойчивость растений через изменение водного статуса клеток и, прежде всего, состояния и транспорта воды. Для подтверждения этого предположения была проведена оценка физико-химического состояния цитоскелета и водного обмена у растений разных по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы при закаливании к холоду и действии АБК.

В экспериментах с использованием одномерного ДДС-электрофореза, вестерн-блот-анализа, моноклональных первичных и вторичных антител к тубулиновым и актиновым белкам было обнаружено, что в корнях 9-суточных проростков пшеницы содержание тубулинов выше, а актина меньше по сравнению с листьями. Сортовые различия проявились в большем содержании а-тубулинов в листьях маломорозоустойчивого сорта по сравнению с более морозоустойчивыми. Из этих данных следует, что разные органы и сорта растений пшеницы характеризуются неодинаковым соотношением тубулиновые/актиновые белки, которое, по нашему мнению, является одним из существенных факторов, определяющих низкотемпературную стабильность МТ. Высокое отношение актина к тубулинам (больше актина и меньше тубулинов) в листьях соответствует высокой стабильности тубулинового цитоскелета и, наоборот, более низкое соотношение этих белков (меньше актина и больше тубулинов) в корнях коррелирует с низкой стабильностью МТ. Правомерность выдвинутого предположения подтверждается результатами опытов по иммуноцитохимической визуализации МТ в клетках листьев и

193 корней озимой ржи (РШакаБкьМаишЬасЬ, РиЬакатеп, 1995). Мы полагаем, что хорошо развитая сеть актинового цитоскелета в клетках листьев необходима для поддержания более высокого уровня устойчивости малочисленных тубулиновых структур этих органов. Об участии МФ в стабилизации МТ в клетках табака ранее сообщил М1гипо (1992);

Как известно, полифункциональный гормон ингибиторного комплекса -АБК, обладающий широким спектром действия, играет существенную роль в формировании морозоустойчивости растений (Уе1зг е1 а1., 1996; Четверикова, 1999). Впервые нами было обнаружено АБК-индуцируемое уменьшение содержания основных цитоскелетных белков только в клетках зоны дифференциации корней трёх исследуемых сортов пшеницы, а также в листьях маломорозоустойчивого сорта Безостая 1. При этом актиновые белки были более устойчивыми к ингибирующему действию гормона по сравнению с тубулиновыми. По данным Ноиёе с сотр. (1995), именно зона формирования ксилемных элементов у пшеницы более всего ответственна за развитие морозоустойчивости растений. Следовательно, снижение содержания цитоскелетных белков под действием АБК может быть одним из факторов формирования устойчивого к холоду состояния растений вида ТгШсит аевйчит Ь. Тем не менее 7-суточное закаливание растений к холоду снимало этот эффект гормона на цитоскелетные белки и более всего в корнях высокоморозоустойчивого сорта Альбидум 114. Возможно, это указывает на преимущественную роль АБК на начальных этапах адаптации растений к низким температурам, тогда как к концу закаливания адаптогенная роль гормона, по-видимому, ослабевает. Индуцируемый холодом синтез цитоскелетных белков в АБК-обработанных корнях свидетельствует о значении хорошо развитой сети цитоскелета в восстановлении метаболической активности клеток на последующих этапах холодового закаливания, особенно высокоморозоустойчивых растений.

194

По данным МсЫаПу (1998), полимерное состояние цитоскелетных структур зависит от статуса фосфорилирования МТ-ассоциированных белков. В связи с этим мы провели исследование содержания фосфорилированных полипептидов в клетках разных органов проростков трёх сортов пшеницы на фоне закаливания их к холоду и при действии АБК. С использованием специфических поликлональных антител к белкам, фосфорилированным по треонину, в корнях и листьях 9-суточных проростков обнаружили от 3 до 7 различных фосфорилированных белков. В корнях преобладал полипептид с М.м. 60 кД, который, по-видимому, принадлежал к группе белков, ассоциированных с МТ, поскольку изменение содержания этого фосфобелка и тубулинов под действием АБК и низких температур было сходным. Некоторые различия отмечены только для корней пшеницы Безостая 1, у которой гипотермия значительно увеличивала уровень фосфорилированного белка с М.м. 60 кД. Значительное фосфорилирование (гиперфосфорилирование) МТ-ассоциированных белков, как известно, предотвращает взаимодействие их с МТ (МсКаПу, 1996) и может вызвать прекращение регулирования сборки-разборки МТ-скелета. Это, по всей вероятности, приводит к значительному нарушению субклеточной организации у маломорозоустойчивых растений. В листьях наиболее значительную долю фосфорилированных белков составляли полипептиды с М.м. от 30 кД до 43 кД, имеющие, очевидно, хлоропластное происхождение (ШгйатаИ е1 а1., 1997). Показано, что в корнях, в отличие от листьев, АБК индуцировала образование новых фосфорилированных белков с М.м. 85 и 90 кД, которые отсутствовали в закалённых к холоду клетках. Последнее заставляет предположить существование разных путей действия гормона и холода на клетки корней пшеницы, что подтверждается литературными данными ^ЫпогаЫ, Уагг^исЫ- БЫпогакь 1996).

Сравнительный анализ содержания тубулиновых и актиновых белков в корнях и листьях 5- и 9-суточных проростков позволил выяснить, что в клетках этих органов молодых растений уровень тубулиновых белков был примерно

195 одинаковым, в то время как у взрослых растений содержание тубулинов в листьях было ниже, чем в корнях. Эти результаты указывают на то, что в клетках листьев 5-суточных растений количество тубулиновых белков было более высоким, чем у 9-суточных. Полученные данные соответствуют результатам опытов Joyce с сотр. (1992), которые показали снижение уровня транскриптов всех а-тубулиновых изотипов в стареющих листьях кукурузы. Замораживание (-7°С, 5ч) и медленное оттаивание (3°С, 12ч) молодых проростков приводило к исчезновению a-, ß- тубулинов в клетках листьев, однако в корнях их уровень не изменялся. Из этого можно заключить, что 5-суточные листья имеют более низкую криостабильность МТ-структур, чем корни. По мере роста растений, по-видимому, содержание тубулиновых структур в листьях уменьшается, но их стабильность возрастает, тогда как в корнях количество и качество МТ- компонентов цитоскелета изменяются незначительно.

В иммуноцитохимических опытах по наблюдению МТ и МФ для сохранения интактности клеток и нативной структуры цитоскелета нами были усовершенствованы методики получения тонких срезов растительных объектов (Baluska et al., 1992, 1993, 1997), основанные на внедрении в ткань «мягкого» легко удаляемого фиксатора - воска Стидманса с низкой точкой плавления. В результате была осуществлена иммунофлуоресцентная визуализация тубулинового и актинового цитоскелета в клетках листьев, колеоптилей и разных зон корней, а также с высоким разрешением на лазерной конфокальной сканирующей системе получены иммунофлуоресцентные изображения МТ-структур в клетках, находящихся на разных фазах клеточного цикла. Обнаружено, что в клетках зон меристемы и растяжения ориентация МТ являлась преимущественно поперечной или случайной, тогда как в зоне дифференциации - наклонной и продольной. В связи с тем, что поперечная и продольная ориентации тубулиновых компонентов определяют соответственно низкую и высокую стабильность этих структур (Marc et al., 1998), можно

196 сделать вывод о более высокой устойчивости МТ в клетках зоны дифференциации по сравнению с таковой в клетках зон меристемы и растяжения. В клетках последних актиновый цитоскелет был представлен толстыми, состоящими из нескольких МФ пучками, по-видимому, выполняющими роль остова, организующего многочисленные тубулиновые компоненты цитоскелета корней. Это предположение подтверждается данными других авторов (Seaqull, 1990; Такеэие, 8ЫЬаока, 1998), которые с использованием ингибиторного анализа показали участие актиновых филаментов в поддержании структуры поперечных построений кортикальных МТ, ответственных за полярность роста клеток растяжением. Несмотря на то, что в литературе имеются сведения о контролировании МФ-ми МТ-организации в клетках зоны дифференциации (Рикиёа, 1997), по-видимому, подобное заключение не может быть сделано на основании представленных в работе фотографий. На них чётко показано уменьшение толщины продольных актиновых структур и их частичная деполимеризация (связанная, возможно, с процедурой фиксации образцов), свидетельствующая о снижении стабильности МФ при переходе клеток к дифференциации. В связи с этим мы предполагаем, что в клетках зоны дифференциации тонкие актиновые нити поддерживаются высокоорганизованной структурой более стабильных по сравнению с другими участками корня наклонно-ориентированных МТ. Можно полагать, что в направлении от меристемы к зоне дифференциации стабильность МТ увеличивается, а МФ, наоборот, уменьшается, что, вероятно, способствует сохранению стабильности и целостности цитоскелета в разных областях корней. Функциональное значение этого компенсаторного механизма может быть связано с необходимостью перераспределения функций между актиновыми и тубулиновыми структурами в разных зонах корня.

Обнаружено, что в клетках колеоптилей и молодых листьев тубулиновый цитоскелет состоит из плотно упакованных поперечно ориентированных МТ-х тяжей, тогда как в клетках более старых листьев- из

197 тонких, редких, наклонно ориентированных нитей. Следовательно, результаты непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии подтвердили предположение, сделанное нами на основании данных иммунохимических экспериментов, о снижении массы тубулиновых компонентов в листьях при увеличении возраста проростков.

Были выявлены чёткие сортовые особенности в распределении тубулиновых элементов в интерфазных меристематических клетках корней: плотная сеть эндоплазматических МТ в клетках Безостой 1 и более развитый слой кортикальных МТ с малым содержанием эндоплазматических тубулиновых структур в клетках Мироновской 808 и Альбидум 114. В связи с этим можно считать, что высокая морозоустойчивость растений определяется хорошо развитой сетью кортикального цитоскелета, а низкая-эндоплазматического, и что в клетках высокоморозоустойчивого сорта формируется холодостабильный цитоскелет-мембранный комплекс за счёт усиления взаимодействий кортикальных МТ с плазматической мембраной. Возможность создания единого мембранно - цитоскелетного комплекса подтверждается результатами экспериментов Stephens, (1986) и Laporte с сотр. (1993), которые обнаружили тубулиновые белки непосредственно в препаратах мембран.

Показано, что закаливание растений к холоду (3°С, 7 суток) вызывало агрегацию МТ между собой, повышение интенсивности флуоресценции тубулиновых структур и лучшей сохранности полимерного состояния актиновых филаментов преимущественно в зоне дифференциации корней! Как известно, увеличение агрегации тубулиновых компонентов приводит к усилению их иммунофлуоресценции и повышению устойчивости МТ к действию деполимеризующих факторов (Marc et al., 1998). Следовательно, можно заключить, что низкие температуры увеличивали стабильность основных компонентов цитоскелета в клетках корней. АБК (30 мкМ, добавление в среду выращивания, 3 сут) по аналогии с закалкой индуцировала

198 образование пучков МТ в клетках лишь зон меристемы и растяжения, тогда как в зоне дифференциации - уменьшала содержание, степень агрегации и иммунофлуоресценцию МТ. Одновременно в клетках всех исследуемых зон корней и более всего в области дифференциации отмечено деполимеризующее влияние гормона на структуру актинового цитоскелета, что, вероятно, определяется специфическим действием АБК как ингибитора роста растений. Установлено, что разрушение МФ приводит к торможению роста клеток растяжением у разных тканей, органов и видов растений (Thimann et al., 1992; Baskin, Bivens, 1995), в том числе у проростков пшеницы (Pope et al., 1979). Более сильная деполимеризация МФ в клетках зоны дифференциации АБК-обработанных проростков может свидетельствовать о низкой стабильности актиновых структур в этой области корня и быть следствием гормон-индуцированной деградации тубулиновых компонентов.

При исследовании совместного влияния АБК и низких температур на проростки обнаружено усиление иммунофлуоресценции плотных рядов поперечно-ориентированных МТ в клетках зон меристемы и растяжения по сравнению с действием этих факторов по отдельности. В области дифференциации клеток холодообработанных растений выше описанный эффект АБК на тубулиновый цитоскелет незакалённых проростков проявлялся в меньшей степени. Следовательно, низкие температуры и гормон оказывали аддитивное действие на тубулиновый цитоскелет в зонах меристемы и растяжения и антагонистическое - в области дифференциации корней. При этом закаливание устраняло влияние АБК на МТ дифференцирующихся клеток. Такой же вывод может быть сделан на основании анализа структуры актинового цитоскелета в клетках этой зоны корней у растений, обработанных раздельно и совместно низкими температурами и АБК. Обнаружено, что в условиях гипотермии происходила более слабая гормон-индуцированная деполимеризация МФ по сравнению с таковой у незакалённых проростков. В клетках корней двух других зон отмечена лишь тенденция этих изменений.

199

Отсюда следует, что низкие температуры и гормон оказывали на актиновый цитоскелет, в отличие от тубулинового, антагонистическое влияние в клетках всех исследуемых областей, но более всего в зоне дифференциации. Видимое сходство эффектов холода и АБК на МТ, заключающееся в усилении их иммунофлуоресценции в клетках зон меристемы и растяжения, определяется, по-видимому, разными механизмами действия этих факторов на актин-микротрубочковый цитоскелет. При закаливании возрастание флуоресценции, возможно, определяется упрочнением контактов МТ с МФ, а при действии АБК- является следствием слипания МТ в результате гормон- индуцированной деполимеризации актиновых связок между тубулиновыми структурами. При совместном действии этих факторов холод, устраняя деполимеризующее влияние АБК на актин, способствует упрочению МТ пучков, что приводит к дополнительному усилению их иммунофлуоресценции и созданию более организованной структуры тубулинового цитоскелета. Не исключено, что наблюдаемые эффекты также могут быть следствием перестройки качественного состава тубулиновых и актиновых белков, так как оба фактора вызывают модификацию экспрессии генов (Hughes, Dunn, 1996). Более того, Kerr и Carter (19906) обнаружили изменение тубулиновых изотипов в ответ на закаливание корней озимой ржи к холоду.

Как известно, оценка стабильности компонентов цитоскелета является показателем качественного состояния тубулиновых и актиновых белков. Однако использование 10 мкМ концентрации оризалина для этой цели не позволило выявить изменений в стабильности МТ (способности сохранять полимерное состояние в ингибирующих условиях) в обработанных совместно АБК и низкими температурами клетках зон меристемы и растяжения вследствие полной деполимеризации МТ-структур. Одновременно было установлено, что оризалин не оказывал влияния на общее содержание тубулиновых белков в клетках этих зон после действия на них гипотермии и АБК. Можно заключить, что у пшеницы этот препарат не вызывает деградации

200 тубулиновых белков, как было отмечено для проростков риса в работе Giani с сотр. (1998). Следовательно, можно говорить о существовании межвидовой специфичности тубулиновых популяций у холодочувствительных и холодоустойчивых растений.

В клетках зоны дифференциации незакалённых проростков разных сортов пшеницы зарегистрированы вариабельные ответы МТ на оризалин. Стабильность тубулиновых структур обратно коррелировала с уровнем морозоустойчивости сорта: была наибольшей в клетках корней Безостой 1 и наименьшей в клетках корней Альбидум 114. При этом нами была отмечена разная скорость роста проростков различных сортов: более низкая у растений маломорозоустойчивого сорта по сравнению с таковой у более морозоустойчивых сортов. В специально поставленной серии опытов были обнаружены морфологические различия в структуре корней разных сортов: корни Безостой 1 были толстыми и короткими, а корни Альбидум 114 -тонкими и длинными. В связи с этими данными мы предположили, что высокая стабильность МТ в клетках Безостой 1 определяет низкую скорость роста проростков, (корней и листьев) этого сорта пшеницы и, наоборот, высокая лабильность и динамическая нестабильность тубулиновых структур в клетках Мироновской 808 и Альбидум 114 являются ответственными за интенсивное протекание метаболических процессов и высокую скорость роста растений этих сортов. Данное предположение полностью согласуется с данными работы Marc с сотр. (1998), в которой авторы также выявили существование обратной корреляции между функциональной активностью растительных клеток и стабильностью тубулиновых компонентов цитоскелета.

Показано, что закаливание растений к холоду (3°С, 7 суток), как и обработка проростков АБК повышали стабильность МТ в клетках зоны дифференциации. Степень стабилизирующего влияния АБК на МТ прямо коррелировала с уровнем морозоустойчивости сорта, то есть была сортоспецифичной, что позволяет использовать эту реакцию в качестве

201 физиологического теста низкотемпературной устойчивости растений. В связи с тем, что повышение стабильности тубулиновых структур под действием холода в зоне дифференциации коррелировало с усилением агрегации МТ друг с другом и, по-видимому, с актиновыми филаментами, а под влиянием АБК- с уменьшением содержания тубулиновых и актиновых компонентов, мы полагаем, что механизмы повышения структурной стабильности МТ и, возможно, морозоустойчивости проростков, индуцируемые гормоном и низкими температурами, в клетках зоны дифференциации корней являются различными. В частности, эти различия проявляются в том, что стабилизация тубулиновых филаментов под действием АБК осуществляется за счёт компенсаторных изменений.

При совместной обработке растений гормоном и холодом дополнительный прирост стабильности МТ зарегистрирован только в дифференцирующихся клетках корней маломорозоустойчивого сорта, в то время как в клетках корней более морозоустойчивых сортов уровень стабильности МТ оказывался ниже, чем в тканях, обработанных одной АБК и особенно у высокоморозоустойчивого сорта. Выше мы отметили эффект устранения холодом влияния гормона на стабильность МФ. Поэтому можно заключить, что низкие температуры нивелировали действие экзогенного гормона на структурную организацию актин-микротрубочкового цитоскелета в зоне дифференциации клеток Мироновской 808 и Альбидум 114, однако усиливали влияние АБК на стабильность МТ корней Безостой 1. С учётом сказанного, можно утверждать, что уменьшение массы неустойчивых МТ и увеличение - стабильных, а также разрушение МФ является необходимым условием замедления ростовых процессов в клетках АБК-обработанных растений. Поскольку больше всего эндогенной АБК у озимой пшеницы накапливается в первые дни закаливания (Veisz et al., 1996), то, возможно, аналогичные изменения цитоскелета, индуцируемые АБК, происходили и у проростков на начальных этапах их адаптации к действию холода. На

202 завершающих же стадиях закаливания увеличение содержания нестабильных, высоколабильных МТ и усиление статуса полимеризации МФ, возможно, являются определяющими факторами некоторой активации роста холодозакалённых растений и адекватного продолжения адаптивных процессов. Снятие и усиление низкими температурами эффектов гормона в клетках высоко- и маломорозоустойчивого сортов, соответственно, могут быть следствием высокой (Альбидум 114) и низкой (Безостая 1) скорости протекания процессов закаливания в клетках.

При последействии АБК на структурное состояние цитоскелета растений наблюдали исчезновение МТ в меристематических клетках и увеличение содержания интенсивно флуоресцирующих тубулиновых структур в клетках зон растяжения и особенно дифференциации. При этом ранее выявленный стабилизирующий эффект при действии гормона на МТ дифференцирующихся клеток в этих условиях сохранялся. Мы полагаем, что при инкубации растений на среде с АБК аккумуляция эндогенного гормона происходит преимущественно в зоне дифференциации корней. Это приводит к снижению уровня актиновых и тубулиновых компонентов, повышению числа стабильных МТ именно в данной области корня. После удаления гормона из среды выращивания в условиях последействия активируются механизмы регуляции баланса АБК, вызывающие перемещение гормона из области дифференциации корней в зону меристемы, где создание его высоких доз может привести к деградации МТ и/или тубулиновых белков и транспорту образующих эти структуры мономерных единиц в зону растяжения и более всего в зону дифференциации для активации процессов транспорта воды и роста клеток растяжением. В литературе есть сведения, подтверждающие возможность быстрого перемещения АБК по растению как в базипетальном, так и акропетальном направлениях (Муромцев с сотр., 1987).

Для выявления зависимости водного обмена клеток от состояния цитоскелета нами был разработан методический подход (Хохлова с сотр.,

203

1997а, б), основанный на структурной модификации компонентов цитоскелета in situ с помощью специфических ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков и последующей регистрации физиологических и биофизических показателей водного обмена и проницаемости плазматических мембран. Показано, что ингибиторы полимеризации тубулиновых (колхицин, оризалин) и актиновых (цитохалазин Б) белков снижали, а стабилизаторы (ДМСО), наоборот, повышали ВС листьев. Одной из возможных причин изменения ВС под действием ингибиторов может быть нарушение целостности цитоскелета. Дезорганизация цитоскелетных структур, обусловленная блокированием процессов образования МТ и МФ, и, возможно, их разборкой приводит к дегидратационным процессам как самой цитоскелетной сети, так и связанных с ней белков, ферментов и мембран и, вместе с тем, - к усилению выхода воды из взаимодействующих с цитоскелетом компартментов клетки (цитозоль, вакуоль, органеллы). В конечном итоге это может сказаться на изменении соотношения разных фракций воды - снижении содержания связанной и увеличении - свободной, что повлечёт за собой уменьшение общей ВС клеток и тканей. К такому же эффекту может привести уменьшение диффузионных потоков воды, обусловленное замедлением циклоза и клеточного метаболизма вследствие деструкции цитоскелета и подавления его сократительных и транспортных функций. По-видимому, ДМСО вызывает обратные процессы в клетках, способствуя увеличению содержания связанной воды и снижению свободной.

Сильный водный стресс (30% ПЭГ), мембранотропный препарат

9+ Ч пипольфен, высокие дозы Са (10" М) и замораживание средней силы с последующим медленным оттаиванием проростков повышали эффективность действия колхицина и цитохалазина Б на ВС листьев, что, вероятно, указывает на усиление деструкции основных компонентов цитоскелета под влиянием этих факторов. Низкие дозы

Са (5*10 М), наоборот, уменьшали эффект ингибиторов полимеризации цитоскелетных белков на водный статус тканей. В

204 связи с этим вполне допустимо соображение о том, что Са2+ в микромолярной концентрации повышал структурную стабильность МТ и МФ, и это положительно повлияло на ВС тканей. Высокоспецифическое и разнообразное действие Са2+ на цитоскелетные компоненты может опосредоваться через актин-связывающие и ассоциированные с МТ белки, активность и конформация которых регулируется концентрацией свободного Са в комплексе с кальмодулином (Schliva et al., 1981; Williamson, 1987; Fisher et al., 1996). Возможно, низкие и высокие дозы Са , обусловливая разный уровень фосфорилирования и активности взаимодействующих с МТ и МФ белков, способствуют образованию или разрушению этих компонентов и вместе с тем -увеличению или сокращению поверхностей филаментов, контактирующих с водой.

Непродолжительное (3-суточное) и более длительное (7-суточное) закаливание растений к холоду, а так же, как и их обработка АБК снижали чувствительность ВС листьев к структурным модификаторам МТ и повышали морозоустойчивость проростков (уменьшение JIT50). Степень ингибирующего влияния колхицина и оризалина на ВС обратно коррелировала с уровнем морозоустойчивости сорта. Эти результаты можно интерпретировать как указание на возможность появления в закалённых к холоду и обработанных АБК клетках новых более холодостойких популяций МТ, менее чувствительных к действию ингибиторов. Закономерное и последовательное снижение чувствительности ВС листьев в ряду мало—»средне—»высокоморозоустойчивый сорт позволяет рассматривать эту реакцию как генотипически обусловленную способность сорта к стабилизации системы «цитоскелет-вода» и как физиологический тест на холодовую стабильность МТ и морозоустойчивость растений.

При совместной обработке растений АБК и холодом в течение 3 суток была четко выявлена аддитивность их действия на ВС листьев, так как суммарный ингибирующий эффект оризалина у закаленных и одновременно

205 обработанных АБК растений был меньше, чем при действии каждого из этих факторов по отдельности. Причем степень синергизма соответствовала генотипическим особенностям сортов: была наибольшей у листьев морозоустойчивых сортов Мироновской 808 и Альбидум 114 и несколько меньшей - у Безостой 1. Из этих данных следует, что АБК и 3-суточное закаливание к холоду сходным путем влияют на динамическую реорганизацию тубулинового цитоскелета листьев, повышая его стабильность, но у разных сортов с неодинаковой степенью. Синергетический эффект гормона и гипотермии выявлен и относительно повышения ВС листьев (контрольные варианты без оризалина) и уровня их морозоустойчивости, но только у Безостой 1. Следовательно, установленная для этого сорта корреляция между степенью синергизма 3-суточного закаливания и АБК на величину ВС и снижением ее чувствительности к оризалину, с одной стороны, и приростом морозоустойчивости листьев в этих условиях, с другой, является основанием для утверждения о том, что сохранение у маломорозоустойчивого сорта эффекта АБК как индуктора морозоустойчивости листьев после непродолжительного закаливания связано со стабилизацией водного обмена (повышением ВС), одной из причин которой может быть соответствующая перестройка цитоскелетной сети. У устойчивых сортов, судя по наличию аддитивного действия гормона и холода (ослабление ингибирующего эффекта оризалина), дополнительная стабилизация тубулиновых структур под влиянием АБК в клетках листьев на фоне закаливания, хотя и является вполне вероятной, однако не сопровождается индуцированным АБК достоверным увеличением ВС и снижением JlT5o.

После более длительного (7-суточного) закаливания в отличие от 3-суточного не было обнаружено аддитивного действия АБК и низких температур на ВС листьев. Холодовое закаливание устраняло наблюдаемые для листьев незакаленных растений эффекты АБК, связанные с уменьшением воздействия ингибитора на извлекаемость воды, то есть длительная закалка на

206 фоне АБК обращала действие оризалина на противоположное, повышая к нему восприимчивость ВС листьев. АБК-индуцированное снижение ВС листьев и повышение её чувствительности к оризалину после длительного закаливания растений указывает на значение экзогенного гормона в стабилизации системы «цитоскелет-вода» только на начальных этапах развития холодоадаптационных процессов, тогда как к их завершению роль АБК в клетках снижается и особенно у высокоморозоустойчивых сортов. Логичность этой мысли подтверждается отсутствием прироста морозоустойчивости листьев под действием гормона у закалённых к холоду растений Мироновской 808 и Альбидум 114. Увеличение морозоустойчивости листьев Безостой 1 как под влиянием непродолжительной, так и более продолжительной обработки растений АБК и низкими температурами, по нашему мнению, может быть следствием низкой скорости протекания холодоадаптационных процессов в клетках этого сорта. Во многом сходные результаты получены в иммуноцитохимических экспериментах. В связи с этим можно заключить, что действие АБК как индуктора морозоустойчивости растений проявляется в оптимальных условиях роста растений у всех сортов, а при закаливании к холоду- только у маломорозоустойчивого.

При анализе изменений биофизических показателей водного обмена (Т2 и Дэфф) и проницаемости мембран выяснено, что оризалин, как правило, снижал Т2 и увеличивал Дэфф и экзоосмос электролитов из клеток листьев. Это свидетельствует об усилении скорости трансмембранного переноса воды через плазмалемму и увеличении её проницаемости, возможно, вследствие индуцируемого препаратом разрушения связей между мембраной и тубулиновыми элементами цитоскелета из-за деполимеризации последних. Такого рода изменения, вызываемые оризалином, по данным Thion с сотр. (1998), могут привести к деполяризации плазмалеммы и активации находящихся в ней кальциевых каналов. В свою очередь, усиление статуса фосфорилирования белков водных каналов- аквапоринов при повышении

207 концентрации кальция в цитоплазме увеличивает их активность и водопроницаемость (Johansson et al., 1998). Кроме того, не исключается, что причиной повышения проницаемости мембран и транспорта воды под действием оризалина может быть непосредственное разрушение связей между МТ и аквапориновыми белками, тем более что наличие взаимодействий между этими структурными элементами было обнаружено в клетках животных (Elkjar et al., 1995). АБК, 3- и 7-суточное закаливание в основном нивелировали влияние оризалина на Т2, ДЭфф и экзоосмос электролитов, по-видимому, восстанавливая нарушенные связи и затрудняя сродство ингибитора к МТ. Реакция Т2, Дэфф и проницаемости мембран на оризалин, АБК и холод являлась генотипически зависимой, то есть сортоспецифической. Обнаружено синергетическое действие АБК и низких температур на чувствительность Т2 листьев к оризалину в начале периода закаливания растений к холоду (3°С, 3 суток), которое сменялось на антоганистическое к концу закаливания (3°С, 7 суток). Наличие корреляции между изменением ВС, Т2, ДЭфф и проницаемости клеточных мембран листьев, обработанных оризалином, АБК и холодом, позволяет заключить, что термодинамическое состояние воды и её межклеточный транспорт контролируются целостностью цитоскелетной сети, а также её взаимодействиями с плазмалеммой.

Обнаружено, что в корнях ВС клеток была ниже, а проницаемость плазматических мембран выше таковых листьев. Кроме того, корни проявляли более высокую чувствительность ВС и Т2 к оризалину и обладали более низкой морозоустойчивостью по сравнению с листьями. Этот результат является подтверждением нашего предположения о более низкой стабильности многочисленных тубулиновых структур корней, чем листьев. В корнях, так же, как и в листьях, оризалин снижал ВС клеток больше всего у Безостой 1 и меньше - у Альбидум 114. Полученные данные, однако, невозможно объяснить, основываясь на представлении о наличии в клетках корней, как и в клетках листьев высокоморозоустойчивого сорта более стабильных МТ, а в

208 клетках корней маломорозоустойчивого, соответственно, менее устойчивых тубулиновых структур. Это следует из данных иммуноцитохимических экспериментов, в которых выявлено существование обратной корреляции между уровнем стабильности МТ и морозоустойчивостью сорта. Основываясь на этом, мы полагаем, что видимое сходство сортоспецифических реакций ВС корней и листьев на оризалин определяется разными причинами. Возможно, что в направлении от кончика к основанию корня и далее от основания к кончику листьев стабильность МТ в клетках незакалённых растений последовательно увеличивается и это происходит в большей степени у высокоморозоустойчивого сорта и в меньшей- у маломорозоустойчивого. Отсюда следует, что у проростков Альбидум 114 стабильность МТ в корнях может быть более низкой, а в листьях более высокой, чем у Безостой 1 и Мироновской 808. Поэтому низкая . чувствительность ВС корней высокоморозоустойчивого сорта к оризалину может определяеться существованием в клетках Альбидум 114 более совершенных, чем у других менее морозоустойчивых сортов, механизмов регуляции водного обмена, препятствующих выходу воды из клеток с почти полностью деполимеризованными МТ.

Корни, в отличие от листьев, по-другому реагировали на обработку тканей АБК и низкими температурами. Как правило, гормон усиливал действие оризалина на ВС и Т2 клеток, а низкие температуры, наоборот, устраняли этот эффект ингибитора. В обоих случаях, как мы показали выше, стабильность МТ возрастала или вследствие значительного уменьшения содержания тубулиновых и актиновых компонентов в клетках (АБК) или через усиление агрегации МТ-структур и упрочение актин-микротрубочковых контактов (закаливание). Это коррелировало с увеличением морозоустойчивости корней как АБК-обработанных, так и холодозакалённых растений. Следовательно, можно предположить, что механизмы действия гормона и холода в клетках корней, происходящие с участием системы «цитоскелет-вода», являются

209 различными. Уменьшение содержания МТ в клетках корней гормон-обработанных растений, по-видимому, является определяющим фактором усиления эффектов оризалина на ВС этих органов. В листьях незначительное снижение уровня тубулиновых белков под влиянием АБК отмечено только у проростков Безостой 1 и совсем не обнаружено у Мироновской 808 и Альбидум 114, вероятно, из-за более высокой устойчивости малочисленных МТ- структур этих органов по сравнению с корнями. Уменьшение чувствительности водного статуса листьев к оризалину в обработанных гормоном растениях свидетельствует о том, что увеличение стабильности МТ в клетках этих органов под действием АБК происходило не за счёт уменьшения содержания тубулиновых компонентов цитоскелета (как это свойственно клеткам корней), а за счёт изменения качественного состава МТ. Более того, сравнительный анализ действия АБК на водный статус тканей корней и листьев позволяет заключить о более высокой чувствительности корней к изменению гормонального баланса. На это указывают данные об АБК-индуцированном повышении фосфорилирования белков in situ в клетках корней трёх сортов и его отсутствии в клетках листьев.

При совместной обработке растений АБК и холодом низкие температуры нивелировали эффект гормона на ВС и Т2 в оризалин-обработанных корнях в основном средне- и высокоморозоустойчивого сортов. В этих условиях стабильность МТ в клетках корней Мироновской 808 и Альбидум 114 снижалась, однако возрастала в клетках корней Безостой 1. Совместное действие гормона и холода на корни, как правило, приводило к укорочению Т2 (увеличение транспорта воды) по сравнению с влиянием одного закаливания либо только АБК и особенно у проростков Альбидум 114. При этом не отмечено дополнительного прироста морозоустойчивости в клетках закалённых (3°С, 7 сут) растений этого сорта под действием АБК.

На основании результатов проведённых исследований выдвинуто и обосновано новое положение, согласно которому появление в клетках более

210 стабильных, но функционально менее активных сообществ цитоскелетных структур способствует замедлению процессов роста и водного обмена как при обработке растений экзогенной АБК, так и на начальных этапах холодового закаливания проростков. На заключительных стадиях адаптации некоторое уменьшение стабильности цитоскелетных компонентов является необходимым условием для активизации транспорта воды и продолжения роста клеток закалённых к холоду растений. Скорость протекания этих процессов прямо коррелирует с уровнем морозоустойчивости сорта.

Таким образом, главным итогом работы является создание определённой системы представлений о фенотипических и гормональных аспектах физико-химической организации цитоскелета и его физиологической роли при развитии термоадаптивного потенциала растений. Полученные результаты позволяют заключить, что зависимость водного обмена тканей/клеток от состояния цитоскелета является генотипически детерминированной, органоспецифической, гормонопосредуемой и определяется физиологическим состоянием растений. При этом необходимо отметить вероятность неодинакового вклада цитоскелет-обусловленных изменений водного статуса в физиологические ответы растений на воздействующие факторы с учётом органной и сортовой специфики.

211

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Олиневич, Ольга Викторовна, Казань

1. Аксёнов С.И. Метод ЯМР-релаксации // Новые физические методы в биологических исследованиях.- М.: Наука, 1987. С.147-163.

2. Аксёнова Л.А., Зак Е.А., Куликова А.Л., Клячко H.JI. 40 кД белок из листьев Vicia faba: актин или родственный актину белок // Физиология растений. 1998. Т. 45, №2. С. 218-226.

3. Албертс Б., Брей Д. Молекулярная биология клетки.- М.: Мир, 1987. Т.З. 296с.

4. Алексеев A.M. Водный режим клеток растения в связи с обменом веществ и структурированностью цитоплазмы. 28-е Тимирязевское чтение.- М.: Наука, 1969. 35 с.

5. Аллен Р.Д. Микротрубочки- внутриклеточный мотор // В мире науки. 1985, №12. С. 56-62.

6. Анисимов A.B., Самуилов И.Ф., Гусев H.A. Межклеточный диффузионный перенос воды после действия пониженных температур. Исследования импульсным методом ЯМР // Биофизика. 1982. Т.92, № 1. С. 51-58.

7. Аршавский И. А., Калевич А.Б., Кефели В.И. К анализу роли цитоскелета зародышей растительных организмов в эволюции процессов роста и развития // Биофизика. 1992. Т. 37, №5. С. 983-992.

8. Блюм Я.Б., Страшнюк Н.М. Получение мутантов по генам белков микротрубочек // Цитология и генетика. 1993. Т. 27, №6. С. 79-95.

9. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы.- Ленинград : Наука, 1987. 230 с.

10. Васильев А.Е. Сравнительная структурно-функциональная характеристика цитоскелета животных и высших растений // Ж. общей биологии. 1996. Т. 57. С. 293-325.

11. П.Вебер К., Осборн М. Молекулы клеточного матрикса // В мире науки. 1985, №12. С. 62-64.215

12. Великанов Г.А., Гордон JI.X., Волков В.Я., Барышева Т.С. Изучение проницаемости клеточных мембран для воды методом ЯМР // Физиология и биохимия культурных растений. 1977. Т.9, №2. С. 197-201.

13. Войников В.К., Корытов М.В. Синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы при закаливании к холоду // Физиология растений. 1991. Т.38, вып.5. С. 960-969.

14. Волков В.Я., Баширов Ф. И., Даутов Р.К. и др. Изучение пространственно- ограниченной самодиффузии молекул импульсным методом ЯМР // Некоторые вопросы физики жидкостей. 1976. Вып. 6. С. 65-88.

15. Гордон JI.X., Муравьёва A.C., Бичурина А. А., Алексеева В.Я. К вопросу о влиянии кальция на проницаемость клеток корня для воды // Докл. АН СССР. 1973. Т.21, №6. С. 1466- 1468.

16. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений.- М.: Мир, 1986. Т. 1.275 с.

17. Гусев H.A. Некоторые методы исследования водного режима растений.-М.: Изд. АН СССР, 1960. 60 с.

18. Гусев Н.Г., Киваева JI.C. О физиологическом значении и современных методах исследования водообмена и состояния воды растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1978. Т.10, №1. С. 3-17.

19. Гусев H.A., Самуилов Ф.Д., Пахомова Г.И., Жолкевич В.Н. Состояние воды в растении // Водный обмен растений.- М.: Наука, 1989. С.21-44.

20. Дорогова Н.В., Шамина Н.В. Особенности цитокинеза в клетках высших растений//Цитология. 1994. Т.36, №9/10. С. 899-914.

21. Жолкевич В.Н., Чугунова Т.В. Об участии паренхимных клеток в насасывающей деятельности корня // Докл. АН СССР. 1987. Т.297, №3. С. 758761.

22. Жолкевич В.Н., Чугунова Т. В. О взаимодействии белков цитоскелета, биомедиаторов и фитогормонов при регуляции транспорта воды в растении//Докл. АН СССР. 1995. Т.341, №1. С. 122-125.216

23. Ильящук Е.М., Лихолат Д.А. Влияние низкой температуры на содержание абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях озимой и яровой пшеницы на ранних фазах развития // Физиология и биохимия культурных растений. 1989. Т.21, №3. С. 286.

24. Исабеков Б.Н., Красавцев O.A. Осмотические свойства морозостойких протопластов // Физиология растений. 1989. Т. 36, вып. 2. С. 372-381.

25. Каппуччинелли П. Подвижность живых клеток.- М.: Мир, 1982. 125с.

26. Каримова Ф.Г., Жуков С.Н. Влияние цАМФ на фосфорилирование белков листьев гороха при низкой положительной температуре // Докл. АН СССР. 1991. Т. 316, №5. С. 1277-1279.

27. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин E.H. Природный ингибитор роста- абсцизовая кислота.- М.: Наука, 1989. 184с.

28. Красавцев O.A. Физиология закаливания растений отрицательными температурами: Автореф. диссерт. док. биол. наук. Москва: ИФР РАН, 1974. 44с.

29. Красавцев O.A. Свойства плазмалеммы морозостойких растительных клеток // Успехи современной биологии. 1988. Т. 106, вып. 1, №4. С. 143158.

30. Клячко Н.Л. Белоксинтезирующий аппарат и цитоскелет // Физиология растений. 1998. Т. 45, №2. С. 208-217.

31. Колесниченко A.B., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиология растений. 2000. Т. 47, №4. С. 624-630.

32. Ларская И.А. Ответные реакции клетки на действие закаливающей температуры: Автореф. диссерт. канд. биол. наук. Казань: КИБ КНЦ РАН, 1996. 24с.

33. Медведев С.С., Маркова И.В. Цитоскелет и полярность растений // Физиология растений. 1998. Т. 45, №2. С. 185-197.217

34. Можаева Л.В., Пилыцикова Н.В. О природе нагнетания воды корнями растений // Известия ТСХА. 1972. Вып. 3. С. 3-15.

35. Можаева JI.B., Пилыцикова Н.В. О неосмотическом поступлении воды в сосуды корня // Известия ТСХА. 1976. Вып. 6. С. 3-11.

36. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987.384 с.

37. Парфёнова Е.А. Интегральные переходные ионные токи через мембраны изолированных вакуолей и протопластов из клеток высших растений: Ав-тореф. дис. канд. биол. наук.- Казань: КИБ КНЦ РАН, 1994. 25 с.

38. Першина В.П., Пинаев Г.П., Гончарова Е.И. Взаимодействие актина с фракцией плазматических мембран клеток суспензионной сублинии мышиных фибробластов // Цитология. 1990. Т. 32, №12. С. 1198-1204.

39. Полевой В.В. Физиология растений.- М.: Высшая школа, 1989. 463с.

40. Пустовойтова Т.Н. Абсцизовая кислота и засухоустойчивость растений // Водный режим сельскохозяйственных растений (Материалы 1 Респ. симп. физиологов и биохимиков).- Кишинёв, 1989. С. 37-41.

41. Пустовойтова Т.Н., Жолкевич В.И. Основные направления в изучении влияния засухи на физиологические процессы у растения // Физиология и биохимия культурных растений. 1992. Т. 24, №1. С. 14-18.

42. Рощина В.В. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины.-Пущино, 1991. 192с.

43. Снигиревская Е.С. Изменения ультраструктуры клеток вазопрессин-чувствительных эпителиев при стимуляции транспорта воды // Цитология. 1990. Т.32, №8. С. 766-794.

44. Соколов О.И., Грингауз O.K., Рихтер Т.Я. Идентификация F- актина растений фаллоидин-коллоидным золотом // Биохимические препараты. 1998. Т. 45, №2. С. 227-234.218

45. Сопина Н.Ф., Карасёв Т.С., Трунова Т.И. АБК как фактор закаливания суспензионной культуры пшеницы к морозу // Физиология растений. 1994. Т.41, №4. С.546-551.

46. Таланова В.В., Титов А.Ф., Боева Н.П. Изменение уровня эндогенной абсцизовой кислоты в листьях растений под влиянием холодовой и тепловой закалки // Физиология растений. 1991. Т.38, №5. С. 991-997.

47. Туманов М.М. Физиология закаливания и морозостойкость растений.-М.: Наука, 1979.350с.

48. Туркина М.В., Куликова JI.A. и др. Актин и термостабильные актин-связывающие белки в культуре клеток пшеницы // Физиология растений. 1985. Т. 42, №3. С. 348-355.

49. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки.- М.: Мир, 1987. 115с.

50. Хохлова Л.П., Олиневич О.В., Панкратова О.В. Изменение водоудерживающей способности тканей озимой пшеницы под влиянием структурных модификаторов цитоскелета // Физиология растений. 1997а. Т.44, №3. С.379-384.

51. Хохлова Л.П., Палих Э., Олиневич О.В., Тараканова Н.Ю. Влияние ингибиторов цитоскелета на водный обмен растений в связи с закаливанием к холоду и разными условиями замораживания- оттаивания // Цитология. 19976. Т.39, №4/5. С.294-304.

52. Четверикова Е.П. Роль абсцизовой кислоты в морозоустойчивости растений и криоконсервация культур in vitro II Физиология растений. 1999. Т. 46, №5. С. 823-829.

53. Шарманкин С.В., Мережинский Ю.Г. Выделение белков микротрубочек из растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1991. Т. 23, №5. С. 513-515.

54. Ягушева М.Р. Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальной систем.- Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань: КИББ КНЦ РАН, 2000. 24с.

55. Abe S., Ito., Davies Е. Association of cytoskeletal protein in the membrane-bound polysome fraction from peas using conventional polysome isolation buffers // Plant Physiol. Biochem. 1994. V. 32. P. 547-554.

56. Abromeit M., Dorffling K. ABA and frost tolerance in winter wheat // Crop Adaptation to Cool Climates / Ed. Dorffling K., Brettschneider В., Tantau H., Pithan K. Germany: Acad. Press, 1994. P. 223-229.

57. Aderem A. Signal transduction and the actin cytoskeleton: the roles of MARCKS and profilin // TIBS. 1992. V.17. P. 438-443.

58. Akashi Т., Kawasaki S., Shibaoka H. Stabilization of cortical microtubules by the cell wall in cultured tobacco cells : effects of extensin on the cold- stability of cortical microtubules // Planta. 1990. V. 182. P. 363-369.

59. Akashi Т., Shibaoka H. Involvement of transmembrane proteins in the association of cortical microtubules with the plasma membrane in tobacco BY-2 cells // J. Cell Science. 1991. V. 98. P. 169-174.

60. Amos L.A. Structure of microtubules // Microtubules / Ed. Roberts K., Hyams J.S. London: Academic Press, 1979. 64 p.220

61. Anthony R. G., Hussey P.J. Dinitroaniline herbicide resistance and the microtubule cytoskeleton // Trends in Plant Science. 1999. V. 4. P. 112-116.

62. Asada T., Sonobe S., Shibaoka H. Microtubule translocation in the cytokinetic apparatus of cultured tobacco cells // Nature. 1991. V. 350. P. 238-241.

63. Assmann S. Signal transduction in guard cells // Annu. Rev. Cell Biol. 1993. V.9. P. 345-375.

64. Astrom H., Virtanen I., Raudaskoski M. Cold-stability in the pollen tube cytoskeleton // Protoplasma. 1991. V.160. P.99-107.

65. Astrom H. Acetylated a-tubulin in the pollen tube microtubules // Cell Biology Inter. Reports. 1992.V.16. P. 871-881.

66. Astrom H. The structure and function of tobacco pollen tube cytoskeleton. -Academic dissertation: Helsinki, 1997. 263 p.

67. Aszalos A., Yang G., Gottesman M. Depolymerization of microtubules increases the motional freedom of molecular probes in cellular plasma membranes //J. of Cell Biol. 1985. V. 100. P. 1357-1362.

68. Baluska F., Parker J.S., Barlow P.W. Specific patterns of cortical and endoplasmic microtubules associated with cell growth and tissue differentiation in roots of maize {Zea mays L.) // J. Cell Sci. 1992. V. 103. P. 191-200.

69. Baluska F., Parker J.S., Barlow P.W. The microtubular cytoskeleton in cells of cold-treated roots of maize {Zea mays L.) shows tissue-specific responses // Protoplasma. 1993. V.172. P. 84-96.

70. Baluska F., Barlow P.W., Lichtscheidl I.K., Volkmann D. The plant body: a cytoskeletal tool for cellular development and morphogenesis // Protoplasma.1998. V. 202. P. 1-10.221

71. Bartolo M.E., Carter J.V. Microtubules in mesophyll cells of nonacclimated and cold-acclimated spinach // Plant Physiol. 1991. V.97. P. 175-181.

72. Baskin T.I., Bivens N.J. Stimulation of radial expansion in arabidopsis roots by inhibitors of actomyosin and vesicle secretion but not by various inhibitors of metabolism // Planta. 1995. V. 197. P. 514-521.

73. Baskin T.I., Wilson J.E. Inhibitors of protein kinases and phosphatases alter root morphology and disorganize cortical microtubules // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 493-502.

74. Beall P.T. Water- macromolecular interactions during the cell cycle // Nuclear cytoplasmic interactions in the cell cycle.- New York: Academic Press, 1980. P. 223-270.

75. Bergeron D., Beauseigle D., Bellemare G. Sequence and expression of a gene encoding a protein with RNA-binding and glycine-rich domains in Brassica Yicipus II Biochimica et Biophysica Acta. 1993. V. 1216. P. 123-125.

76. Beven A., Guan Y., Peart J., Cooper C., Shaw P. Monoclonal antibodies to plant nuclear matrix reveal intermediate filament-related components within the nucleus // J. Cell Sci. 1991. V. 98. P. 293-302.

77. Bhattacharyya B., Sackett D.L., Wolff J. Tubulin, hybrid dimers, and tubulin S. Stepwise charge reduction and polymerization // J. of Biol. Chemistry. 1985. V. 260. P. 10280-10216.

78. Bissell M.J., Hall H.G., Parry G. How does the extracellular matrix direct gene expression? // J. Theor. Biol. 1982. V. 99. P. 31-68.

79. Blumenfeld A., Bukovak M.J. Cuticular penetration of ABA // Planta. 1972. V. 107. P. 261-268.

80. Bohn M., Dorffling K. Changes of phospholipid contents in wheat seedling induced by cold hardening and abscisic acid // New Biological Approach to Understand and Improve Winter Survival of Plants. Arhus, Denmark: Acad. Press, 1996. P. 11-13.222

81. Bradford M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

82. Bulinski J.C., Gundersen G.G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis // BioEssays. 1991. V.13. P.285-293.

83. Capell B., Dorffling K. Low temperature- induced changes of abscisic acid contents in barley and cucumber leaves in relation to their water status // J. Plant Physiol. 1989. V. 135. P. 571-575.

84. Carr H.Y., Parcell E.M. Effect of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments // Phys. Rev. 1954. V. 94. P. 630-638.

85. Carter J.V., Wick S. Irreversible microtubule depolymerization associated with freezing injury in Allium sera root tip cells // Cryo. Lett. 1984. V. 5. P. 373-382.

86. Chan J., Rutten T., Lloyd C. Isolation of microtubule- associated proteins from carrot cytoskeletons: a 120 kDa map decorates all four microtubule arrays and the nucleus // The Plant Journal. 1996. V. 10. P. 251-259.

87. Chen T.H., Li P.H., Brenner M.L. Involvement of abscisic acid in potato cold acclimation // Plant Physiol. 1983. V. 71. P. 362-365.

88. Chanson A., Pilet P.E. Transport and metabolism of ( 2-14C) abscisic acid in maize root // Planta. 1982. V. 154. P. 556-561.

89. Cho S.O., Wick S.M. Distribution and function of actin in the developing sto-matal complex of winter rye {Secale cereale cv. Puma) II Protoplasma. 1990. V. 157. P. 254-264.

90. Chu B., Xin Z., Li P.H., Carter J.V. Depolymerization of cortical microtubules is not a primary cause of chilling injury in corn {Zea mays L. cv. black mexicansweet) suspension culture cells // Plant, Cell and Environment. 1992. V.15. P. 307-312.

91. Chu B., Snustad D. P., Carter J.V. Alteration of p-tubulin gene expression during low-temperature exposure in leaves of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1993. V.103. P. 371-377.

92. Cleary A.L., Gunning B.E., Wasteneys G.O., Hepler P.K. Microtubule and F-actin dynamics at the division site in living Tradescantia stamen hair cells // J. Cell Sci. 1992. V. 103. P. 977-988.

93. Clegg J.S. Intracellular water and the cytomatrix: some methods of study and current views // J. Cell Biol. 1984. V. 99. P. 167-171.

94. Cleveland D.W. Autoregulated instability of tubulin mRNAs: a novel eukary-otic regulatory mechanism // TIBS. 1988. V. 13. P. 339-343.

95. Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxy terminal peptid // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 279-286.

96. Collings D.A., Asada T., Allen N.S., Shibaoka H. Plasma membrane-associated actin in Bright Yellow 2 tobacco cells. Evidence for interactions with microtubules // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 917-928.

97. Cooper R.L., Chang D.B., Joung A.C. et al. Restricted diffusion in biological systems //Biophys. 1974. V. 4. P. 161-177.

98. Cramer G.R., Jones R.L. Osmotic stress and abscisic acid reduce cytosolic calcium activities in roots of Arabidopsis thaliana // Plant Cell and Envir. 1996. V. 19. P. 1291-1298.224

99. Crossin K.L., Carney D.H. Evidence that microtubule depolymerization erly in the cell cycle is sufficient to initiate DNA synthesis // Cell. 1981. V. 21. P. 61-71.

100. Cyr RJ. Calcium/calmodulin affects microtubule stability in lysed protoplasts //J. of Cell Sci. 1991.V. 100. P. 311-317.

101. Cyr R. J. Microtubules in plant morphogenesis : role of the cortical array // Annu. Rev. Cell Biol. 1994. V. 10. P. 153-180.

102. Cyr R.J., Palevitz B.A. Organization of cortical microtubules in plant cells // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V.7. P. 65-71.

103. Dallaire S., Houde M., Gagne Y., Saini H.S., Boileau S., Chevrier N., Sarhan F. ABA and low temperature induce freezing tolerance via distinct regulatory pathways in wheat // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. P. 1-9.

104. Danyluk J., Carpentier E., Sahan F. Identification and characterization of a low temperature regulated gene encoding an actin- binding protein from wheat // FEBS Letters. 1996. V. 389. P. 324-327.

105. Dawson P.J., Hulme J.S., Lloyd C.W. Monoclonal antibody to intermediate filament antigen cross- reacts with higher plant cells // J. Cell Biol. 1985. V. 100. P. 1793- 1798.

106. Dawson P. J., Lloyd C.W. Comparative biochemistry of plant and animal tubulin // The Biochemistry of Plants / Ed. Davies D.D. New York: Academic Press, 1987. P. 3-47.

107. Derksen J., Emons A.M. Microtubules in tip growth systems // Tip Growth in Plant and Fungal Cells / Ed. Heath I.B. San Diego, California: Academic Press, 1990. P. 147-181.

108. Dexter S.T. Effect of several environmental factors on the hardening of plants //PlantPhysiol. 1933. V. 8. P. 123-139.

109. Ding B., Kwon M., Warnberg L. Evidence that actin filaments are involved in controlling the permeability of plasmodesmata in tobacco mesophyll // The Plant J. 1996. V. 10. P. 157-164.

110. Ding A., Turgeon R., Parthasarathy M.V. Microfilament organization and distribution in freeze-substituted tobacco plant tissues // Protoplasma. 1991. V.165.P. 96-105.

111. Ducket C.M., Lloyd C. Gibberellic acid-induced microtubule reorientation in dwarf peas is accompanied by rapid modification of an a-tubulin isotype // Plant J. 1994. V. 5. P. 363-372.

112. Dugas C.M., Li Q., Khan I.A., Nothnagel E. A. Lateral diffusion in the plasma membrane of maize protoplast with implications for cell culture // Planta. 1989. V. 179. P. 387-396.

113. Dure L. Structural motifs in LEA proteins of higher plants // Response of Plants to Cellular Dehydration During Environmental Stress / Ed. Close T.J., Bray E.A. Rockvill: MD. ISBN 0-943088-26-7, 1993. P. 91-103.

114. Durica D. S., Schlass J.A., Grain W.R. Organization of actin gene seguences in the sea urchin molecular cloning of a intron-containing DNA sequence coding for a cytoplasmic actin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 56835687.

115. Egly J.M., Miyamoto N., Moncollin V., Chambon P. Is actin a transcription factor for RNA polymerase B? // EMBO J. 1984. V. 3. P. 2363-2371.

116. Erickson H.P., O'Brien E.T. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis // Ann. Rev. Biophys. 1992. V. 21. P. 145-166.226

117. Eim S., Lee Y. Actin filaments of guard cell are reorganized in response to light and abscisic acid // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1491- 1498.

118. Farkas T., Singh B., Nemecz G. Abscisic acid-related changes in composition and physical state of membranes in bean leaves // Plant Phisiol. 1985. V. 118. P. 373-379.

119. Ferrua B., Manie S., Doglio A., Shaw A., Sonthonnax S., Limouse M., Schaf-far L. Stimulation of human interleukin 1 production and specific mRNA expression by microtubule disrupting drugs // Cell Immunol. 1990. V. 131. P. 391-397.

120. Finkelstein A. Water movement through lipid bilayer, pores, and plasma membranes, theory and reality.- New York: Wiley, 1987. 214p.

121. Firtel R. A. Multigene families encoding actin and tubulin // Cell. 1981. V. 24. P. 6-7.

122. Fisher D., Gilroy S., Cyr R. Evidence for opposing effects of calmodulin on cortical microtubules//Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 1079- 1087.

123. Flores-Nimedez A., Vergara B.S., Dorffling K. Effect of synthetic phytohor-mone analog on leaf water potential during chilling // IRRN. 1990. V. 15. P. 218.

124. Foissner I., Wasteneys G.O. Taxol stabilizes microtubules in characean internodal cells but does not prevent their disassembly at wound sites // Cell Biol. Inter. 1997. V. 21. P. 866-867.

125. Fosket D. Cytoskeletal proteins and their genes in higher plants // Biochemistry of Plants. Molecular Biology / Ed. Stumpf P., Conn E.E. New York: Academic Press, 1989. V.15. P. 393-454.

126. Fosket D.E., Morejohn L.C. Structural and functional organization of tubulin // Annu. Rev. Plant Physiol. 1992. V. 43. P. 201-240.

127. Fukuda H. Tracheary element differentiation // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1147-1156.227

128. Galiba G., Tuberosa R., Kocsy G., Sutka J. Involvement of chromosomes 5A and 5D in cold-induced abscisic acid accumulation and frost tolerance of wheat calli // Plant Breeding. 1993. V. 110. P. 237-242.

129. Gao Y. P., Young L., Bonham-Smith P., Gusta L.V. Characterization and expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in primed seed of Bras-sica napus during germination under stress conditions // Plant Molec. Biol. 1999. V. 40. P. 635-644.

130. Giani S., Qin X., Faoro F., Breviario D. In rice, oryzalin and abscisic acid differentially affect tubulin mPNA and protein levels // Planta. 1998. V. 205 .P. 334- 341.

131. Glinka Z. Abscisic acid promotes both volume flow and ion release to the xylem in sunflower roots // Plant Physiol. 1980. V. 65. P. 537-540.

132. Goddard R.H., Wick S.M., Silflow C.D., Snustad D.P. Microtubule components of plant cell cytoskeleton // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 1-6.

133. Godoy J.A., Lunar R., Torres-Schumann S., Moreno J., Rodrigo R.M., Pintor-Toro J.A. Expression tissue distribution and subcellular localization of dehydrin TAS14 in salt-stressed tomato plants // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 19211934.

134. Gusta L.V., Fowler D.B., Chen P. A nuclear magnetic resonance study of water in cold-acclimating cereals // Plant Physiol. 1979. V. 63. P. 627-634.

135. Gusta L.V., Wilen R.W., Fu P. Low-temperature stress tolerance: The role of abscisic acid, sugars, and heat-stable proteins //HortScience. 1996. V.31. P. 3946.228

136. Guy C.L. Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 187-223.

137. Guy C.L., Haskell D. Induction of freezing tolerance in spinach is associated with the synthesis of cold acclimation induced proteins // Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 872.

138. Hahne G., Hoffman G. Dimethyl sulfoxide can initiate cell divisions of arrested callus protoplast by promoting cortical microtubule assembly // Proc. Natl.

139. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 5449-5453.

140. Hardham A.R., Gunning B.E.S. Structure of cortical microtubule arrays in plant cells // J. Cell Biol. 1978. V. 77. P. 14-34.

141. Hasezawa S., Sano T., Nagata T. The role of microfilaments in the organization and orientation of microtubules during the cell cycle transition from M phase to G1 phase in tobacco BY- 2 cells // Protoplasma. 1998. V. 202. P. 105114.

142. Himes R.H., Burton P.R., Gaito J.M. Dimethyl sulfoxide induced self-assembly of tubulin lacking associated proteins // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 6222-6228.

143. Hogetsu T. Re-formation of microtubules in Closterium ehrenbergii Me-neghini after cold- induced depolymerization // Planta. 1986. V. 167. P. 437443.

144. Holappa I., Walker-Simmons M.K. The wheat abscisic acid responsive protein kinase mRNA, PKABA1, is up-regulated by dehydration, cold temperature, and osmotic stress // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1203-1210.

145. Hong S.W., Jon J.H., Kwak J.M., Nam H.G. Identification of a receptor-like protein kinase gene rapidly induced by abscisic acid, dehydration, high salt, and229cold treatments in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1997.V.113. P. 12031212.

146. Houde M., Claude D., Lachapelle M., Allard F., Laliberte S., Sarhan F. Im-munolocalization of freezing-tolerance-associated proteins in the cytoplasm and nucleoplasm of wheat crown tissues // The Plant J. 1995. V. 8. P. 583- 593.

147. Hughahl J.D., Bokros C.L., Hanesworth V.R., Aalund G.R., Morejohn L.C. Unique functional characteristics of the polymerization and MAP binding regulatory domains of plant tubulin // The Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1063-1080.

148. Hughes M., Dunn M. The molecular biology of plant acclimation to low temperature // J. Exper. Bot. 1996. V.47. P.291-305.

149. Hunter T., Karin M. The regulation of transcription by phosphorylation // Cell. 1992. V. 70. P. 375-387.

150. Hush J. M., Overall R.L. Cortical microtubule reorientation in higher plants : dynamics and regulation//J. of Microscopy. 1996. V. 181. P. 129-139.

151. Hwang I.W., Goodman H.M. An Arabidopsis thaliana root specific kinase homolog is induced by dehydration, ABA and NaCl // Plant J. 1995. V. 8. P. 3743.

152. Ilker R., Breidenbach R.W., Lyons J.M. Sequence of ultrastructural changes in tomato cotyledons during short periods of chilling // Low Temperature Stress in Crop Plants / Ed. Lyons J.M., Graham D., Raison J.K. London: Academic Press, 1979. P. 97-113.

153. Ingber D.E. The riddle of morphogenesis : a question of solution chemistry or molecular cell engineering? // Cell. 1993. V. 75. P. 1249-1252.

154. Janowiak F., Dorffling K. Chilling of maize seedlings: changes in water status and abscisic acid content in ten genotypes differing in chilling tolerance // J. Plant Physiol. 1996. V. 147. P. 582-588.

155. Jian L.C., Sun L.H., Lin Z.P. Studies on microtubule cold stability in relation to plant cold hardiness//Acta Bot. Sin. 1989. V. 31. P. 737-741.230

156. Jiang C.J., Nakajima N., Kondo N. Disruption of microtubules by abscisic acid in guard cells of Vicia faba L. II Plant and Cell Physiol. 1996. V. 37. P. 697-701.t>

157. Jiang C.J., Sonobe S. Identification and preliminary characterization of 65 kDa higher- plant microtubule- associated protein // J. Cell Sci. 1993. V. 105. P. 891-901.

158. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M.J., Larsson C., Kjell-bom P. Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation // The Plant Cell. 1998. V. 10. P. 451-459.

159. Joshi H.C., Cleveland D.W. Diversity among tubulin subunits: toward what functional end? // Cell Motil Cytoskeleton. 1990. V. 16. P. 159-163.

160. Joshi H.C., Palevitz B.A. y-Tubulin and microtubule organization in plants // Trends Cell Biol. 1996. V. 6. P. 41 -44.

161. Joyce C.M., Villemur R., Snustad D.P., Silflow C.D. Tubulin gene expression in maize {Zea mays L.)\ change in isotype expression along the developmental axis of seedling root // J. Mol. Biol. 1992. V. 227. P.97-107.

162. Kaldenhoff R., Kolling A. Richter G. Regulation of the Arabidopsis thaliana aquaporin gene ATHH2 (PIPIB) // J. of Photochem. and Photobiol. B-Biology. 1996. V. 36. P. 351-354.

163. Kerr G.P, Carter J.V. Relationship between freezing tolerance of root-tip cells and cold stability of microtubules in rye {Secale cereale L. cv Prima) // Plant Physiol. 1990a.V.93. P. 77-82.

164. Kerr G.P., Carter J.V. Tubulin isotypes in rye roots are altered during cold acclimation // Plant Physiol. 19906. V. 93. P. 83-88.231

165. Kim S.R., Kim Y., An G., Molecular cloning and characterization of anther-preferential cDNA encoding a putative actin-depolymerizing factor // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 39-45.

166. Kjellbom P., Larsson C., Johansson I., Kalsson M., Johanson U. Aquaporins and water homeostasis in plants // Trends in Plant Science. 1999. V. 4. P. 308314.

167. Knight M.R., Campbell A.K., Smith S.M., Trewavas A.J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium //Nature. 1991. V. 352. P. 524-526.

168. Kobayashi H., Fukuda H., Shibaoka H. Interrelation between the spatial disposition of actin filaments and microtubules during the differentiation of tra-cheary elements in cultured Zinnia cells // Protoplasma. 1988. V. 143. P. 29-37.

169. Koike M., Takezawa D., Arakawa K., Yoshida S. Accumulation of 19-kDa plasma membrane polypeptide during induction of freezing tolerance in wheat suspension-cultured cells by abscisic acid // Plant and Cell Physiol. 1997. V. 38. P. 707-716.

170. Komatsu S., Kato A. Varietal differences in protein phosphorylation during cold treatment of rice leaves // Phytochemistry. 1997. V. 45. P. 1329-1335.232

171. Kopczak S.D., Haas N.A., Hussey P.J., Silflow C.D., Snustad D.P. The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed a-tubulin genes // Plant Cell. 1992. V.4. P. 539-547.

172. Kuiper P.J.C. Water transport across membranes // Ann. Rev. Plant Physiol. 1972. V. 23. P. 157-172.

173. Lalk I., Dorffling K. Hardening, abscisic acid, proline and freezing resistance in two winter wheat varieties // Physiol. Plant. 1985. V. 63. P. 287-292.

174. Lamport D.T.A., Catt J.W. Glycoproteins and enzymes of the cell wall // Encyclopedia of Plant Physiology / Ed. Tanner W., Loewus F.A. Berlin: Acad. Press, 1981. P. 133-165.

175. Lang V., Palva E.T. The expression of rab-related gene, rab 18, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh//Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 951-962.

176. Langford G.M. Actin- and microtubule- dependent organelle motors: interrelationships between the two motility systems // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V. 7. P. 82-88.

177. Lambert A.M. Microtubule- organizing centers in higher plants: Evolving concepts // Bot. Acta. 1995. V. 108. P. 535-537.

178. Laporte K., Rossignol M., Traas J.A. Interaction of tubulin with the plasma membrane- tubulin is present in purified plasmalemma and behaves as an integral membrane protein // Planta. 1993. V. 191. P. 413-416.

179. Lee S.P., Chen T.H., Fuchigami L.H. Changes in the translatable RNA population during abscisic acid induced freezing tolerance in bromegraass suspension culture // Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 45-49.

180. Lee J.C., Timasheff Z. In vitro reconstruction of cell brain microtubules: effects of solution variables // Biochem. 1971. V. 16. P. 1754-1764.

181. Levitt J. Chilling, freezing, and high temperature stresses.- New York : Academic Press, 1980. V. 1. 497 p.

182. Litauer U.Z., Giveon D., Thierauf M„ Ginzburg I., Ponstingl H. Common and distinct binding sites for microtubule- associated proteins // Proceedings of the National Academy of Sci. USA. 1986. V. 83. P. 7162-7166.

183. Lloyd C.W. Toward a dynamic helical model for the influence of microtubules on wail patterns in plants // Int. Rev. Cytol. 1984. V. 86. P. 1-51.

184. Lloyd C.W. The plant cytoskeleton: the impact of fluorescence microscopy // Ann. Rev. Plant Physiol. 1987. V. 38. P. 119-139.

185. Lubit B., Schwartz H. An antiactin antibody that distinguishes between cytoplasmic and skeletal muscle actins // J. Cell Biol. 1980. Y, 86. P. 891-997.

186. Ludevid M.D., Freire M.A., Gomez J., Burd C.G., Albemcio F., Giralt E., Dreyfuss G., Pages M. RNA binding characteristics of a 16 kDa glycine-rich protein from maize // The Plant Journal. 1992. V. 2. P. 999-1003.

187. Luduena R.F. Are tubulin isotypes functionally significant // Molecular Biol, of the Cell. 1993. V. 4. P. 445-457.

188. Mantula E. Freezing tolerance and accumulation of low-temperature-induced proteins in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 140-148.

189. Marc J., Sharkley D.E., Durso N.A., Zhang M., Cyr R.J. Isolation of a 90-kD microtubule-associated protein from tobacco membranes // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 2127-2138.234

190. Marc J., Grander C., Brincat. J., Fisher D., Kao T., McCubbin A. Cyr R. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cell // The Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1927- 1939

191. Masters C.J. Interaction between glycolytic enzymes and components of the cytomatrix // Cell Biol. 1984. V. 99. P. 222-225.

192. McDowell J. M., Huang S., McKinney A.C., An Y.Q., Meagher R.B. Structure and evolution of the actin gene family in Arabidopsis thaliana II Genetics. 1996. V.142. P.587-602.

193. McNally F. Modulation of microtubule dynamics during the cell cycle // Curr. Op. Cell Biol. 1996. V. 8. P. 23-29.

194. McNulty A.K., Saunders M.J. Purification and immunological detection of pea nuclear intermediate filaments : evidence for plant nuclear lamins // J. Cell Sci. 1992. V. 103. P. 407-414.

195. Meiboom S., Gill D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times//Rev. Sci. 1958. V. 61. P. 688-691.

196. Mizuno K. Induction of cold stability of microtubules in cultured tobacco cells // Plant Physiol. 1992. V.100. P.740-748.

197. Mizuno K. A cytoskeletal 50 kDa protein in higher plants that forms intermediate-sized filaments and stabilizes microtubules // Protoplasma. 1995. V. 186. P. 99-112.

198. Mizuta S., Kaneko M., Tsurumi S. Assembly of cortical microtubules during cold treatment of the coenocytic green alga, Chaetomorpha moniligera II Planta. 1995. V. 196. P.190-192.235

199. Monroy A.F., Castonguay Y., Laberge S., Sarhan F., Vezina L.P., Dhindsa R.R. A new cold- induced alfalfa gene is associated with enhanced hardening at subzero temperature //Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 873-879.

200. Monroy A.F., Dhindsa R.S. Low temperature perception in plants // Plant Cell. 1995. V.7.P. 321-331.

201. Monroy A.F., Labbe E., Dhindsa R.S. Low temperature perception in plants : effects of cold on protein phosphorylation in cell free extracts // FEBS Letters. 1997. V. 410. P. 206-209.

202. Morejohn L.C., Bureau T.E., Tocchi L.P., Fosket D.E. Tubulins from different higher plant species are immunologically nonidentical and bind colchicine differentially//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 1440-1444.

203. Morejohn L.C. The molecular pharmacology of plant tubulin and microtubules // The cytoskeletal basis of plant growth and form / Ed. Lloyd C.W. L.: Acad. Press, 1991. P. 29-43.

204. Muller S., Kazchadorian W., DiScala V.A. Evidence that ADM-stimulated intramembrane particle aggregates are transferred from cytoplasmic to luminal membranes in toad bladder epithelial cells // Cell Biol. 1980. V. 85. P. 83-95.

205. Nagai R. Regulation of intracellular movements in plant cells by environment stimuli // Internat. Rev. Cytol. 1993. V. 145. P. 251-310.

206. Nick P. Signaling to the microtubular cytoskeleton in plants // Inter. Review of Cytology. 1998. V. 184. P. 33-79.

207. Nick P. Signals, motors, morphogenesis the cytoskeleton in plant development//Plant Biol. 1999. V. l.P. 169-179.

208. Nordin K., Vahala T., Palva E.T. Differential expression of two related low temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 641-653.

209. Okamura S., Kakiuchi M., Sano A., Kawajiri M. Loss of tubulin during cold treatment of cultured carrot cells // Physiol. Plantarum. 1993. V. 88. P. 93-98.236

210. Olinevich O. V., Khokhlova L.P., Raudaskoski M. Effects of abscisic acid and cold acclimation on the cytoskeletal and phosphorylated proteins in different cultivars of Triticum aestivum L. II Cell Biology International. 2000. V. 24. P. 365-373.

211. Pantieris E., Galatis B., Apostolakos P. Patterns of cortical and perinuclear microtubule organization in meristematic root cells of Adiantum capillus-venerisll Protoplasma. 1991. V. 165. P. 173-188.

212. Parke J.M., Miller C.J., Cowell I., Dodson A., Dowding A., Downess M., Duckett J.G., Anderton B.J. Monoclonal antibodies against plant proteins recognize animal intermediate filaments // Cell Mobil Cytoskeleton. 1987. V.8. P. 312-323.

213. Pearce R.S., Willison J.H.M. A freezeatch study of cellular membranes of wheat//Planta. 1985. V. 163. P. 304-316.

214. Picquot P., Vantard M., Amiri I., Fausser L., Lambert A.M. Amino acid composition and proteolytic generated domains of higher plant tubulin // Biochem. Biophys. 1988. V. 156. P. 304-311.

215. Pihakaski-Maunsbach K., Puhakainen T. Effect of cold exposure on cortical microtubules of rye (Secale cereale) as observed by immunocytochemistry // Physiol. Plantarum. 1995. V. 93. P.563-571.

216. Plana M., Martinez M.C. Phosphorylation of maize RAB-17 protein by casein kinase 2 // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 22510-22514.

217. Pollard T.D., Selden S.C., Moupin P. Interaction of actin filaments with microtubules // Cell Biol. 1984. V. 99. P. 335-375.237

218. Pope D.G., Thorpe J.R., Al-Azzawi M.J., Hall J.L. The effect of cytochalasin B on the rate of growth and ultrastructure of wheat coleoptiles and maize roots // Planta. 1979. V. 144. P. 373-383.

219. Porter K.R., Beskerle M., McNiven M. The cytoplasmic matrix // Cell Biol. 1993. V. 2. P. 259-302.

220. Quader H., Hofmann A., Schnebf E. Reorganization of the endoplasmic reticulum in epidermal cells of onion bulb scales after cold stress: Involvement of cytoskeletal elements // Planta. 1989. V. 177. P. 273-280.

221. Quader H. Cytoskeleton: microtubules // Progress in Botany. 1998. V. 59. P. 374-395.

222. Quintero J.M., Fournier J.M., Ramos, J., Berlloch M. K+ status and ABA affect both exudation rate and hydraulic conductivity in sunflower roots // Physiol. Plantarum. 1998. V. 102. P. 279- 284.

223. Reynolds T.L. Effects of calcium on embryogenic induction and the accumulation of abscisic acid, and an early cysteine-labeled metallothionein gene in androgenic microspores of Triticum aestivum II Plant Science. 2000. V. 150. P. 201-207.

224. Rikin A., Atsmon D., Gitler C. Quantitation of chill-induced release of a-tubulin-like factor and its prevention by abscisic acid in Cossypium hirsutum L. II Plant Physiol. 1983. V.71. P.747-748.

225. Rintamaki E. Salonen M., Carlberg I., Andersson B., Aro E. Phosphorylation of light-harvesting complex 2 and photosystem 2 core proteins shows different irradiance- dependent regulation in vivo // The J. of Biol. Chemistry. 1997. V. 272. P. 35-40.

226. Robinson D.G., Quader H. The microtubule-microfibril syndrome // The cytoskeleton in plant growth and development. London: Academic Press, 1982. P.109-126.238

227. Rosette C., Karin M. Cytoskeletal control of gene expression: depolymeriza-tion of microtubules activates NF-AB II The J. of Cell Biol. 1995. V. 128. P. 1111-1119.

228. Ryu J.H., Takagi S., Nagai R. Stationary organization of the actin cytoskele-ton in Vallisneria: the role of stable microfilaments at the end walls // J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 1531-1539.

229. Sabala I., Egertsdotter U., Vonfircks H., Vonarnold S. Abscisic acid- induced secretion of an antifreeze-like protein in embryogenic cell lines of picea abies // J. of Plant Physiol. 1996. V. 149. P. 163-170.

230. Sackett D., Wolf J. Proteolysis of tubulin and the substructure of the tubulin dimer// J. of Bio. Chemistry. 1986. V. 261. P. 9070-9076.

231. Sakiyama M., Shibaoka H. Effects of abscisic acid on the orientation and cold stability of cortical microtubules in epicotyl cells of the dwarf pea // Protoplasma. 1990. V.157. P. 165-171.

232. Sasaki S., Tilles S., Condeolis S. Electronmicroscopic study of the apical region of the toab bladder epithelial cell // Physiol. 1984. V. 247. P. 268-281.

233. Satio T., Sugawara Y. Freezing tolerance and freezing injury in wheat cells cultured with ABA // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. P. 164-167.

234. Schaffner A.R. Aquaporin function, structure and expression: are there more surprises to surface in water relations? // Planta. 1998. V. 204. P. 131- 139 .252.

235. Schliva M. The cytoskeleton.- Wien, New York: Springer. Varlag, 1986. 326p.

236. Schliva M., Euteneuer V., Bulinski J.C., Izant J.G. Calcium lability of cytoplasmic microtubules and its modulation by microtubule-associated proteins // Cell Biol. 1981. V. 78. P. 1037-1041.

237. Schonbohm E.S., Sens M.W. Actin polymerization as an essential process in light- and dark- controled chloroplast anchorage // Biochem. and Physiol. Plants. 1989. V. 185. P. 337-342.239

238. Seagull R.W. The effects of microtubules and microfilament disrupting agents on cytoskeletal arrays and wall deposition in developing cotton fibers // Protoplasma. 1990. V. 159. P. 44-59.

239. Sheen J. Mutational analysis of a protein phosphatase 2C involved in abscisic acid signal transduction in higher plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 975- 980.

240. Sheer V., Hinssen H., Franke W.W., Jockusch B.M. Microinjection of actin-binding proteins and actin antibodies demonstrates involvement of nuclear actin in transcription of lamp brush chromosomes // Cell. 1984. V. 39. P. 111-122.

241. Shibaoka N., Nagai R. The plant cytoskeleton // Cur. Opinion in Cell Biol. 1994. V. 6. P. 10-15.

242. Shindy W.W., Asmundson C.M., Smith O.E. Kumamoto J. Absorption and distribution of high specific radioactivity 2-C14-abscisic acid in cotton seedlings // Plant Physiol. 1973. V. 52. P. 443-447.

243. Shinozaki K., Yamaguchi- Shinozaki K. Molecular responses to drought and cold stress // Current Opinion in Biotechnology. 1996. V. 7. P. 161-167.

244. Silflow C.D., Oppenheimer D.G., Kopczak S.D., Ploense S.E., Ludwig S.R. Plant tubulin genes: structure and differential expression during development // Dev. Genet. 1987. V. 8. P. 435-460.

245. Singh S., Gupta P.D. Intermediate filaments- heterogenous expression pattern and modulation: can their role in structure and function of the cell be ascertained? // Biol. Cell. 1994. V. 82. P. 1-10.

246. Smertenko A., Blume Y., Viklicky V., Opatrny Z., Draber P. Post-translational modifications and multiple tubulin isoforms in Nicotiana tabacum /. cells // Planta. 1997. V. 201. P. 349-358.

247. Snustad D.P., Hass N.A., Kopczak S.D., Silflow C.D. The small genome of Arabidopsis contains at least nine expressed (3-tubulin genes // The Plant Cell. 1992. V. 4. P. 549-556.240

248. Sonobe S., Shibaoka H. Cortical fine actin filaments in higher plant cell visualized by rhodamine-phalloidin after pretreatment with m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide ester//Protoplasma. 1989. V. 148. P. 80-86.

249. Sonobe S., Takahashi S. Association of microtubules with the plasma membrane of tobacco BY-2 cells in vitro // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. P. 451460.

250. Staiger C.J., Lloyd C.W. The plant cytoskeleton // Curr. Opinions Cell Biol. 1991. V.3.P. 33-42.

251. Steinert P., Zackroff R., Aynardi-Whitman M., Doldman R.D. Isolation and characterization of intermediate filaments // Methods Cell Biol. 1982. V. 24. P. 399-419.

252. Stephens R.E. Membrane tubulin II Biol. Cell. 1986. V. 57. P. 95-110.

253. Stephens R.E., Edds K.T. Microtubules: structure, chemistry and function // Physiol. Rev. 1976. V. 56. P. 709-777.

254. Takesue K., Shibaoka H. The cyclic reorientation of cortical microtubules in epidermal cells of azuki bean epicotyls: the role of actin filaments in the progression of the cycle // Planta. 1998. V. 205. P. 539-546.

255. Tewenkeland M., Kruse S., Quader U., Volkmann D., Sievers A. Visualization of actin filament pattern in plant cells without pre-fixation. A comparison of differently modified phallotoxins// Protoplasma. 1989. V. 149. P. 178-182.

256. Thimann K.V., Reese K., Nachmias V.T. Actin and the elongation of plant cell. Protoplasma. 1992. V. 171. P. 153-166.

257. Thomas D.S., Lager N.M., Manavathu E.K. Cytochalasin B: effects on root morphogenesis in Allium sera II Can. J. Bot. 1973. V. 51. P. 2269-2273;241

258. Tominaga M., Morita K., Yokota E., Shimmen T. Microtubules regulate the organization of actin filaments at the cortical region in root hair cells of Hydro-charis II Protoplasma. 1997. V. 199. P. 83- 92.

259. Torres A., Delgado P. Effect of cold and nocodazole treatments on the mi-crotubular systems of Paramecium in interphase // J. Protozool. 1989. V. 36. P. 113-119.

260. Traas J.A., Burgain R., Dumas de Vaulx R. The organization of the cyto-skeleton during meiosis in eggplant (Solarium melongena L.): microtubules and F-actin are both necessary for coordinated meiotic division // J. Cell Sci. 1989. V. 92. P. 541-550.

261. Traas J.A. The plasma membrane-associated cytoskeleton // The Plasma Membrane / Eds Larsson C., Moller I.M. Berlin: Springer-Verlag, 1990. P. 270-292.

262. Valenta R., Duchene M., Ebner C., Valent P., Sillaber C., Deviller P., Ferreira F., Tejkl M., Edelman H., Kraft D., Scheiner O. Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens // J. Exp. Med. 1992. V. 175. P. 377385.

263. Vandekerckhove J., Weber K. At least six different actins are expressed in a higher mammal: an analysis based on the amino acid sequence of the amino terminal tryptic peptide // J. Mol. Biol. 1978. V. 126. P. 783-802.

264. Veisz O., Galiba G., Sutka J. Effect of abscisic acid on the cold hardiness of wheat seedlings // J. Plant Physiol. 1996. V.149. P.439-443.

265. Villemur R., Joyce C.M., Haas N.A., Goddard R.H., Kopczak S.D., Hussey P.J., Snustad D.P., Silflow C.D. a-Tubulin gene family of maize (Zea mays L.): Evidence for two ancient a-tubulin genes in plants // J. of Mol. Biol. 1992. V. 227. P. 81-96.

266. Volkmann D., Baluska F. Actin cytoskeleton in plants: from transport networks to signaling networks // Microscopy Research and Technique. 1999. V. 47. P. 135-154.242

267. Wang H., Cutler A.J., Saleem M., Fowke L.C. Microtubules in maize protoplasts derived from cell suspension cultures : effect of calcium and magnesium iones // Eur. J. Cell Biol. 1989. V. 49. P. 80-86.

268. Wang C. Xing L., Zhai Z. Intermediate filaments in higher plant cells and their assembly in a cell-free system // Protoplasma. 1992. V. 171. P. 44-54.

269. Wayne R., Tazawa M. The actin cytoskeleton and polar water permeability in Characean cell//Protoplasma. 1988. Supp 1.2. P. 116-130.

270. Webster D.R., Borisy G.G. Microtubules are acetylated in domains that turn over slowly // J. Cell Sci. 1989. V. 92. P. 57-65.

271. Welbaum G.E., Bian D., Hill D.R., Grayson R.L., Gunatilaka M.K. Freezing tolerance, protein composition, and content of pea epicotyl, shoot, and root tissue in response to temperature and water stress // J. Exper. Bot. 1997. V.48. P. 643-654.

272. Williamson R.E. Calcium and the plant cytoskeleton // Plant Cell Environ. 1987. V. 7. P. 431-440.

273. Williamson R.E. Organelle movements // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 181-202.

274. Wymer C., Loyd C. Dynamic microtubules: implications for cell wall patterns // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 222-228.

275. Zhang C.L., Li P.H., Brenner M.L. Relationship between mefluidide treatment and abscisic acid metabolism in chilled corn leaves // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 699-701.

276. Zhang W.H., Jones G.P. Water permeability in wheat root protoplasts determined from nuclear magnetic resonance relaxation times // Plant Science. 1996. V. 118. P. 97-106.