Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепторы низкомолекулярных нейромодуляторов на иммунокомпетентных клетках крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецепторы низкомолекулярных нейромодуляторов на иммунокомпетентных клетках крови человека"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ диагностики И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи УДК 577.17:519.240, 577.156

КОЗЮКОВ Андрей Владимирович

РЕЦЕПТОРЫ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ НЕЙРОМОДУЛЯТОРОВ НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в отделе молекулярной фармакологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ).

Научный руководитель: доктор химических наук Поро-денко Н. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Шахов Ю. А.

кандидат химических наук, заведующий департаментом физико-химической биологии ВНЦМДЛ Курочкин И. Н.

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ АН РФ г. Черноголовка.

Защита состоится « » 1993 г. в ча-

сов на заседании Специализированного Совета Д 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения.

Автореферат разослан « » мая 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук В. В. Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. Серотонин, ацетилхолин и другие низкомолекулярные нейромодуляторы .играющие ключевую роль в функционировании ЦНС и всего организма, реализуют свои функции посредством взаимодействия со специфическими центрами связывания-мембранными рецепторами. Сведения о рецепторах важны для медицины в плане диагностики, создания новых лекарственных препаратов .изучения механизмов биохимической регуляции и природа патологий всех систем организма. Метода прижизненного изучения рецепторов низкомолекулярных веществ в организме человека практически не разработаны. Иммунокомпетентные клетки крови являются одним из наиболее подходящих объектов для изучения периферических рецепторов нейро-модуляторов ввиду их доступности, стабильности и сходства параметров связывания в ЦНС и на периферии. Большинство функциональных клеточных ответов (хемотаксис эозинофилов и базофилов, фагоцитоз гранулоцитов и др.) являются рецепторопосредованными. Серотонин и другие эндогенные нейромодуляторы могут влиять на иммунные функции in vivo или in vitro. Универсальным медиатором межклеточных взаимодействий при развитии иммунного ответа и воспалительных реакциях является фактор активации тромбоцитов. Повышенный интерес к имипраминовым рецепторам объясняется тем, что параметры рецепции этого лиганда коррелируют для Щ1С и периферических объектов (тромбоцитов) .коррелируют с характеристиками обратного захвата серотонина и изменяются при различных психических заболеваниях(плотность имипраминовых рецепторов уменьшается у больных маниакально-депрессивным психозом).

Цель в задачи исследования. Целью работы явилось изучение рецепции ряда нейромодуляторов на иммунокомпетентных клетках крови человека, а также биологического ответа этих клеток, вызванного рецепторно-опосредованным характером взаимодействия.

Задачи исследования включали,-I. Определение физико-химических характеристик связывания и определение механизма взаимодействия имипрамина и серотонина с моно-нуклеарными лейкоцитами крови человека. Сравнительное изучение рецепторов различных нейромодуляторов на различных клетках крови человека.

2. Определение физико-химических параметров рецепции фактора активации тромбоцитов на нейтрофилах и макрофагах в юс взаимосвязи с параметрами дыхательного взрыва на этих клетках.

Научная новизна исследования. Впервые выявлены центры специфического связывания имипрамкна на мононуклеарных лейкоцитах человека, не сопряженные с каналами обратного захвата серотонина. Установлена связь низко аффинного центра связывания ишпрачина с центром связывания антагониста мускариновых ; рецепторов-аыв Показана роль фактора. активации тромбоцитов . в •активации дыхательного взрыва в нейтрофилах и макрофагах, осуществляемой .. посредством рецепции его на специфических высокоаффинных центрах связывания и выявлены отличия в процессах активации указанных двух типов клеток. Показано влияние агониста бензодиазепкновкх рецепторов ко-5-4864 на дыхательный взрыв в нейтрофилах под воздействием фактора активации тромбоцитов.

Практическая ценность работы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что лейкоциты крови человека могут слукить хорошей моделью для изучения механизмов взаимодействия низкомолекулярных нейромодуляторов с периферическими рецепторами, а также, открывают возможность разработки новых лекарственных средств (в . частности производных периферических Сензодиазепиновых лигандов . при лечении воспалительных процессов и астмы и производных три-циклических антидепрессантов при лечении, ряда психических забо- . леваний). Физико-химические характеристики связывания нейромоду- : ляторов с клетками крови,полученной от здоровых доноров, могут: быть использованы в дальнейшем в медицине при исследовании. -. различных патологических состояний.организма человека. -

Апробация работы. Результаты представленные в диссертации были представлены на VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзи-мологии (Вильнюс, 1988), на 14-м Международном конгрессе по'; ' Биохимии (Прага, 1988), на 1-м Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс,1989), на 1-м Международном конгрессе по нейроишунологии (Флоренция,Италия,1990), на Международной конференции по клеточной , биологии (Новосибирск,I990), на Международной конференции по фактору активации тромбоцитов (Париж, Сранция,1990), а такие на: конкурсе молодых ученых института в 1991 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ в

отечественной и зарубежной печати.'

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, пяти глав, в которых излагаются результаты исслэдований и их обсуждение, выводов и списка литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста и включает_таблиц и_ рисунков.

СОДЕРИНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРШЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мононуклэарныэ лейкоциты и нейтрофилы выделяли из крови здоровых доноров, с цитратннм антихоагулянтом по стандартной методике (воуит,1968) путем центрифугирования в течении 4D мин при 400g Через Ficoll-Paque ("Pharmacia".швэция). ЙНТаКТНЫе ЛИМфОЦИТЫ ПОЛу-чапи методом градиентного центрифугирования через percoii ("Pharmacia", Швеция) Макрофаги получали путем прикрепления к поверхности пластиковых культуралъных чашек с последующей промывкой фосфатным буфером и снятием с поверхности суспендированном в 0.2% растворе ЭДТА. Бронхоальвеолярные макрофаги получали с помощью бронхоскопа olympys bf-B2 (Япония) путем заливки физиологического раствора при 37°С с последующим отсасыванием жидкости из бронхов, центрифугированием 10 мин при 150й и прикреплением к пластиковым чашкам.

Подсчет числа клеток осуществляли в камере Горяева, концентрацию белка определяли с помощью метода Lowry,1951.

Процессы комплексообразования меченых лигандов-. н3-имипрамина (ИМИ), н3-серотонина (5-ОТ),н3-дагидроальпренолола (она), н3-хинукпндинилбензилата (вкв), н3-спиперона (spx>, H3-Ro-5-4864, Н3-РК-1П95 с лейкоцитами изучали методом вакуумного фильтрования через фильтры gf/b ("WhatnaiT,Англия), обработанные О.Бж раствором голиэтиленимина ("Serva", ФРГ). Разделение свободного и связавшегося меченого фактора активации тромбоцитов осуществляли путем центрифугирования. Нвспецифическое связывание оценивали в присутствии избытка соответствующих немеченых • лигандов. Уровень радиоактивности измеряли на сцинтилляционном р-счеттане Rack-Betta.riKB" .Швеция).

Измерение активных форм кислорода проводили, используя хемилюминисценцию люминода (5-амино-2,3-дагидро- I ^-фталазине-дионаЬЭмиссия регистрировалась на лимяномвтре ькв-125о (ькв,Швеция) при 37°С и чувствительности 1г»/см.

результаты и обсуждение

В результате серии экспериментов с использованием меченого н3-И№ нами были выявлены центры специфического связывания этого лигавда на мояовукле арных лейкоцитах (ШШ) и гранулоцитах человека.не сопряженные с каналом транспорта серотонина,определены кинетические и физико-химические параметры рецепции имипрамина. ;

Кинетические закономерности связывания н3-Ш*Г с МШГ.

Кинетические кривые взаимодействия н3-ИМИ с МНЛ, , представленные на рис.I., указывают на обратимый и насыщаемый характер связывания меченого лиганда, а также на отсутствие в системе кооперативных эффектов и диффузионных затруднений..

В-ЯТнМ

Рис л. Кинетика связывания н3-имипрамина на МНЯ

Кривая I- кинетика общего связывания Кривая 2- кинетика неспецифического связывания в присутствии 10мкМ немеченого имипрамина. Кривая 3-кинетика диссоциации после добавления 10 мкМ немеченого имипрамина. Кривая 4.- то же после 20-ти кратного разбавления буфером инкубации..

"Ь,Н1Ш

Условия: Концентрация н3-ишпршина= 2 нМ, t0=40CIбyфep рвэ.

•Время установления равновесия общего связывания при 4°С составляет 60 мин, а неспецифического- 5мин. В течении времени инкубации (3 часа) не происходит заметного снижения связывания.

Исследование кинетики взаимодействия имипрамина с МНЛ при различной температуре показало, что время установления равновесия сильно зависит от температуры (15 мин при 37°0, 30 мин при 20°с и 2 часа при 0°С), причем уровень специфического связывания лиганда максимален при 4°С, а неспецифическое связывание линейно возрастает с увеличением температуры. Максимальное число центров связывания лиганда (впах) имеет наибольшее значение при 4°С, в то время как сродство лиганда (1/Кд) практически одинаково в диапазоне температур от 4°С до 37°С.

Физико-химические харатеристики взаимодействия -- - имипрамина с МНЛ человека.

Кривая вытеснения меченого имипрамина немеченым лигандом с мест связывания на МШГ человека, представленная на рис.2, имеет двухступенчатый вид.

Условия:Конц.н3-ИМИ=1.5нМ.инкубация 90 мин при 4°С,буфер рвэ..

Первый участок кривой соответствует высокоаффинному центру связывания ишпрамина с 1С50=з.5^1.о нМ. Доля меченого лиганда,, связанного с этим центром, составляет Ю-15Х. Остаточное вытеснение обусловлено взаимодействием лиганда с низкоаффинным центром с 1с50 около 120 нМ. Преобразование изотермы специфического связывания меченого имипрамина в координатах Скэтчарда (рис.3) выявило ее нелинейный, гиперболический вид. Анализ результатов эксперимента, выполненный на ЗВМ, с использованием специальных программ, в том числе разно- стного метода /МеИсЬоуа еь а1,1988/, позволил предположить, что полученные данные хорошо описываются моделью с участием как минимум двух независимых типов" центров связывания: высокоаффшшого с константой диссоциации 1^=1.8-0.5 НМ И низкоаффинного С ^2=75-30 НМ.

Пара-гетры взаимодействия н -ИМИ с центрами связывания на МНЛ, полученные в серии из 5 независимых опытов, приведены таблице I.

Таблица I

Параметры рецепторного связывания н3-1Ш1 с интактными МНЛ у различных доноров. Условия: буфер рвэ, инкубация 90 мин при 4°С.

Л экспэ- Параметры высокоаСЕфинного Параметры низкоаффшшого римента центра связывания центра связывания

к.,нМ в в к.,нМ в в

<1 пах шах, а шах шах

флоль/мг флоль/млн , фмоль/мг фмоль/млн белка клеток белка клеток

1 2.05-0, .40 200-50 60^15 79.5-17 3375-750 1013-225

2 1.49-0, .30 240-60 72^18 ВЗ.9-11 2380^500 714-150

3 2.20±0 .20 280-75 84-24 100.8-20 3700-400 1110-120

4 1.61-0 .30 240-40 70-12 46.4-13 3400-1120 1020-336

5 1.85-0 .25 160-35 48±12 ■ 91.3-14 4200-1000 1260-300

средаее.-й.в^о.з 224-40 67-12 73-20 3400-600 1023-180

Высокоаффшпшй центр связывания имипрамина по своим характеристикам близок к центру связывания лигавда с тромбоцитами /0ау1а et а1 1983 /• Близкие значения физико-химических параметров связывания для высокоаффинного центра, полученные при работе с разными донорами, говорят о малых индивидуальных отличиях параметров этих центров у здоровых людей. В то же время, физико-химические характеристики низкоаффинного центра у. разных доноров значительно отличаются. Это может быть связано с большей лабильностью низкоаффинного центра по сравнению с высокоаффинным.

Инактивация рецепторов имипрамина на МНЛ.

Наш было проведено исследование стабильности имипраминовых рецепторов на МЕЛ при инкубации клеток при 4°С и при разрушении клеток в ходе замораживания- оттаивания и гипотонического лизиса.

Изотермы специфического связывания сн3]-КМИ с интактными клетками (кривая I), целыми клетками после хранения 24 часа при 4°С (кривая 2), клетками после гипотонического лизиса ( кривая 3) и с клетками после замораживания-оттаивания (кривая 4), в координатах Скэтчарда, представлены на рис 4.

&/Р

ю-

б"

2-

а5" £

Рис.4. Преобразование изотерм специфического связывания , меченого имипрамина с МЮГ человека в координатах Скэтчарда ..' I (•)-интактные МЕЯ, 2(о)-мембраны МЮГ,полученные лизисом, зи)-МНЛ,после .хранения 24 часапри 4°С, 4 (Д)-мембраны МНЛ после замораживания в жидком азоте. Условия: инкубация 90 мин при 4°С. ;

Общий вид кривых 2-4 указывает на то,что в этих условиях в основном меняются параметры связывания ИМИ с низкоаффинным центром, а характеристики высокоаффинного центра практически не изменяются. Параметры связывания н3-ИМИ приведены в таблице г.

в . разных условиях

4

Таблица 2

Стабильность центров связывания имипрамина на МНЛ Условия,- на,х-фосфагный буфер.инкубация 90 мин при 4°С.

МНЛ

к^нМ

Параметры высокоаф&инного связывания в

пах'

фмоль/мг белка

Параметры низкоаффшшого связывания в

К„.нм

вах'

фмоль/мг белка

интактные

клетки г.ОБ^.ЗБ 200-50 79.5±17.2 3375±750

клетки инкубированные

24ч.при 4°С 2.20±0.80 200^53 81.0-20.5 934±266

мембраны МНЛ

после лизиса 1.52*0.30 173±40 45.0±12.5 1400*270

мембраны МНЛ после замо-рахиния-

оттаивания 3.50*0.85 120*26 отсутствует

■ Фармакологический профиль центров связывания имипрамина с МНЛ.

Анализ кривых вытеснения меченого имипрамина лигандами различных классов рецепторов выявил высокое сродство антагониста мускаринрвнх рецепторов етв, а также серотонина к центрам связывания имипрамина на мшг человека (Таблица 3).

а

Таблица 3

Фармакологический профиль связывания н3-ИМИ на МШГ человека

лиганд класс рецепторов 1с50.нМ

имипрамин имипрашшовые. 3.5 и 120

серотонин 5-ОТ. 900

вив мускариновые 250

оксотреморин мускариновыв 3000 -

празозин а-адрено- 1500

циметидан гистаминовые 10000

Наличие имипраминовых рецепторов на МНЛ, близких по физико-химическим характеристикам к рецепторам н3-ИМЯ на тромбоцитах, а также высокая стабильность высокоаффинных мест связывания на МНЯ,делает возможным использование МНЛ в качестве модели для фармакологического изучения действия различных соединений. ;

Рецепторы имипрамина на полиморфоядзрных лейкоцит ах (кейтрофилах)

Нами было изучено взаимодействие меченого имипрамина (при различных концентрациях) с мембанными препаратами нейтрофилов и интактными клетками. Уровень специфического связывания имипрамина с интактными нейтрофилами составил около ЗОх, а на мембранах не было зафиксировано специфического связывания вообще. Данные, полученные в серии из 3 независимых экспериментов, указывают на наличие одного высокоаффинного центра связывания ( кй=2.о нМ) ,так как изотерма специфического связывания в координатах Скэтчарда имеет линейный вид. Низкая плотность имипраминовых рецепторов на этих клетках (20 фмоль/млн клеток), а также высокий уровень не специфического связывания делает этот объект., мало пригодным для изучения.

Рецепторы имипрамина на лимфоцитах'периферической крови -Как было показано выше, рецепторы имипрамина сосредоточены преимущественно на фракции мононуклеарных лейкоцитов, включающей кроме лимфоцитов также моноциты (до 8х), гранулоциты. и незначительное количество других клеток.' Определение параметров связыва-, ния н3-ИМИ с интактными лимфоцитами разных типов (т ив. клетками)

ю

представляло интерес с точки зрения установления точной локализации имипраминовых рецепторов, а также сравнения физико-химических характеристик связывания на разных клетках.

Как показало дальнейшее исследование, фракции т и в клеток в равной мере обладают местами специфического связывания н3-ИШ. Анализ изотерм специфического связывания лиганда в широком диапазоне концентраций в координатах Скэтчарда выявил ее нелинейный вид. Использование разностного метода в оценке полученных данных выявило наличие двух независимых типов центров связывания для обоих типов клетоквысокоаффинного (к.=з.о нМ.в____=120 фмоль/млн

и шаХ

ЗСЛ6ТОК ДЛЯ т лимфоцитов И Kd = 3.5 НМ, Вшах=97 фюль/млн клеток для

В лимфоцитов) И низкоаффинного (Kd=43 НМ, Вшах=1800 фмоль/млн

клеток ДЛЯ т лимфоцитов И К. = 52 НМ, в =1500 фмоль/млн клеток

a max

для в лимфоцитов). Полученные значения физико-химических характеристик связывания имипрамина на лимфоцитах близки к полученным ранее параметрам связывания этого лиганда на МЕТ, а некоторое увеличение плотности имипраминовых рецепторов на интактных лимфоцитах по сравнению с плотностью этих рецепторов на МНЯ свидетельствует о - том что именно первые обогащены местами специфического связывания имипрамина.

Исследование стабильности имипраминовых рецепторов на лимфоцитах выявило большую лабильность рецепторов на т клетках по сравнению с таковыми на в лимфоцитах. Так плотность рецепторов имипрамина уменьшается вдвое на в клетках и в 4 раза на т клетках при хранении клеток при 4°С в течении 24 часов.

Рецепторы qnb на мнл и их связь с низкоаффинным центром связывания ИМИ.

Анализ изотерм специфического связывания н3-анв в диапазоне концентраций or I до 100 нМ, в координатах Скэтчарда выявил наличие одного типа центров связывания на МНЛ со следующими физико-химическими характеристиками: Kd=40.0-5 нМ ввах=2юо±зоо фмоль/мг белка. Полученные параметры рецепторного связывания h3-qnb на мнл практически совпадают с физико-химическими характеристиками связывания лиганда на интактных в-лимфоцитах а также литературными данными /Zaleman et al 1Э81/-ПЛ0ТН0СТЬ M-ХОЛИНОрвЦеПТОрОВ На мнл близка к значению в для низкоаффинного центра связывания

н3-ИМИ на МНЛ, указанного в таблице 1 .Проведенное нами исследование стабильности м-холино-рецепторов на МШГ,в-и т-лимфоцитах показало, что хранение клеток при 4°С в течение 24 часов приводит к уменьшению числа центров связывания на МНЛ в 2 раза;,на в-лимфоцитах в 1.4 раза и на т-лимфоцитах в 5 раз. Сродство лиганда к рецептору при этом не изменяется. В то не время замораживание клеток в жидком азоте приводит к снижению числа центров связывания на ШГ почти в 10 раз ,а на лимфоцитах в 15-20 раз. Сравнение характера инактивации центров связывания ИМИ и центра связывания вив на лейкоцитах человека, позволило предположить, что низкоаффинный центр связывания имипрамина может являться центром связывания антагониста мускариновых рецепторов айв.

При использовании в качестве вытесняющего . лиганда имипрамина, а радиоактивно меченого- н3-в1№, получена кривая вытеснения, ха- рактеризунцаяся значением 1С50=2ОО нМ. Уровень вытеснения состав- ляет не менее 70х от уровня общей радиоактивности, указывая на то,что н3-сш взаимодействует ' с центром связывания ИМИ на МНЛ. в этой связи представлял интерес анализ кривых специфического связывания н3-ИМИ при оценке уровня неспецифнческого связывания с помощью добавления немеченого акв и имипрамина (рис.5)

В/Г-¿О'2

Рис.5. Преобразование изотермы специфического связывания меченого имипрамина в присутствии 10 мкМ немеченого имипрамина (1) и 100 мкМ немеченого внв (2),в координатах Скэтчарда. Условия: конц.белкв-0.2 мг/мл, инкубация 90 мин при 4°С. ..

. В отлитие от гиперболы (кривая I),соответствующей связыванию н3-ИМИ с двумя типами рецепторов,зависимость,полученная в присутствии 100 мкМ вдв (кривая 2) линейна и соответствует модели связывания шипрамина с одним типом рецепторов. Группа точек на кривой I, характеризующая взаимодействие [н3]-ИШ с низкоаффинным центром связывания, удовлетворительно описывается прямой 2.

Таким образом, близкие значения физико- химических характеристик связывания, а также высокая лабильность обоих центров связывания на МВД подтвэрздает гипотезу о том, что низкоаффинный центр связывания имипрамина является центром связывания антагониста мускариновых рецепторов qnb.

Захват 5-ОГ и его связь с центрами связывания имцпрамина на МНЛ.

Чтобы выявить молекулярные механизмы функционирования имипраминовых рецепторов на МНЛ, было необходимо выяснить:сопряжены ли рецепторы имипрамина на МНЛ с каналами обратного захвата 5-ОТ ? ( 5-ОТ в микромолярных концентрациях необратимо захватывается в синапгосомы крыс и тромбоциты человека, а имипрамин и его ТрИЦИКЛИЧеСКИе анаЛОГИ ИНГНбируюТ ЭТОТ Процесс /Meyerson et al,1887 /. В то же время 5-ОТ специфически связывается с высоким . сродством с клетками коры головного мозга и крови крыс и человека /Eliseeva et al,1982/).

Нами было изучено влияние температуры и ионного состава среды инкубации на процесс взаимодействия н3-5-0Т с МНЛ человека.На взаимодействие серогонина с МНЛ по механизму необратимого захвата может указывать высокий уровень специфического взаимодействия при малых временах инкубации (2 мин),уменьшение этого уровня при инкубации при 4°0,а также снижение, на 85х уровня связывания на мембранах МШГ.полученных путем лизиса по сравнению с- интактными МНЛ. Взаимодействие я3-5-ОТ с МНЛ ингибируется ионами са2+ и Mg2+ и не является на+-чувствительным процессом. Все ьто.а также пониженный уровень специфического взаимодействия н3-5-0Т с МНЛ в сравнении с тромбоцитами,указывает на то,что взаимодействие 5-ОТ с МНЛ отличается по способам регуляции от описанного в литературе процесса обратного захвата н3-5-0Т на тромбоцитах.

' Анализ кинетических кривых взаимодействия серотонина с МНЯ выявил обратимый, насыщаемый и температурозависимый характер взаимодействия, причем имипрамин является конкурентным ингибитором этого связывания (рис.6.) > у £

В,нМ

Рис.6.Кинетические кривые взаимодействия н3-5-от с МНЛ человека. I (•)-кинетика взаимодействия при 37°С, 2(о)-то ке в присутствии ЮмкМ немеченого нмипрамина.З (о)-вытеснение немеченым имипрамином в конц.ЮмкМ, 4(А)-вытеснение немеченым серотонином в конц.ЮмкМ. 5(Д)-диссоциация при разбавлении буфером, 6(в)-кинетика взаимо-деействия при 4°С. Условия:конц н3-5-от= 200нМ.

С целью определения параметров связывания 5-ОТ с МНЯ, была получена изотерма специфического связывания н3-5-ОГ с МНЛ человека. Линейный характер зависимости в координатах Скэтчарда (рис.7) свидетельствует о наличии одного типа центров связывания лиганда и об отсутствии кооперативных эффектов в изучаемой системе. Получены следующие параметры рецепторного связывания

Н3-5-ОТ С МЮ1: К .=150-20 НМ, В =2300^300 фМОЯЬ/МГ бЭЯКа.

_ . а ПаХ

В/Р-Ю2

Рис.7.Преобразование изотермы . специфического связывания н3-5-ог с МНЛ человека в координатах Скэтчарда. Условия-, конц.белка-0.5 мг/мл, инкубация 10 мин при 37°С.

А В,нМ

Рецептора ФАГ на иммунокомпетенгных клетках крови Серия экспериментов с использованием меченого ФАТ выявила наличие высокоаффинных центров специфического связывания лиганда на мембранах клеток,и на интакгных клетках, участвующих в воспалительных реакциях: нейтрофилов, макрофагов.

Физико-химические характеристики связывания н3-ФАГ с макрофагами и нвйтрофилами человека. Связывание н3-ФАТ с макрофагами и нейтрофилами носит обратимый, насыщаемый характер (время установления равновесия 20 мин при 37°С). Данные по вытеснению меченного фактора активации тромбоцитов немеченым ФАТ на макрофагах и нейтрофилах человека свидетельствуют, что активность нейтрофилов (гс50=о.2 нМ) выше чем макрофагов (гс50=1.5 нМ). Анализ изотерм специфического связывания лиганда с макрофагами и нейтрофилами в координатах Скэтчар-да (рис.8), выявил линейный вид зависимостей на обоих видах клеток, что свидетельствует о наличие, одного типа центров связывания на макрофагах и нейтрофилах.причем сродство ФАТ на макрофагах (ка=о.8*0,1 нМ) ниже чем на нейтрофилах (ка=0.12*о.огнМ). Максимальное число центров связывания н3-ФАТ на нейтрофилах- 250 фмоль

нейтрофилами и макрофагами в координатах Скэтчарда.1(»)-нейтрофилы 2(о)~макрофаги. Условия: инкубация 15 мин при 37°С.

Индукция дыхательного взрыва, опосредованная рецепторкым

связыванием ФАГ с фагоцитами человека Выброс 02~и HgOg, происходит при активации нейтрофилов и мак- . рофагов под воздействием различных агонистов,таких как н-Формило-вые олигопептида,зимозан.форболовне эфиры.ФАТ./Holgate et ai,i99i/. Молекулярным базисом индукции дыхательного взрыва в макрофагах является активация HADPH-оксидазы - фермента, локализованного на плазматической мембране и катализирующего одноэлектронное восстановление 02 до 02~ и. его выброс /Tauber,1887/. У нейтрофилов биологическая активность обусловлена наличием фермента миелопероксидазы.

ФАТ стимулирует заметное и быстрое образование активных форм кислорода в.нёйтрофилах (кривая I на рис 9) и макрофагах (1фивая 2 на рис 9), причем максимальный ответ наблюдается через 20-25 сек в системе с нейтрофилами и через 60 сек. с макрофагами, что указывает на большую реактивность нейтрофилов, чем макрофагов. mb ^

Рис.9. Кинетика образования активных форм кислорода под воздействием ФАТ на нёйтрофилах (кривая I) и макрофагах (кривая 2) Условия: конц ФАТ-2 мкМ, концентрация нейтрофилов-1млн/мл, макрофагов-О.5 млн/мл, t=3?°c.

t.C&K

Кривые' дозовой зависимости от концентрации фат на нёйтрофилах и макрофагах в координатах Иди-Хофсти, представление, на рис.10, имеют нелинейный характер, свидетельствующий о наличиидвух значений к . соответстуицих высокоаффинной и

низкоаффинной ветвям. Для макрофагов:* .si.3-o.i4BN я

^ м_ вх,

к

п2

*сакрофагов:кв1=1.з^о .14HN

=94-30НМ; ДЛЯ Н6ЙТр0фИЛ0В:К ,=10±2НМ И К _=110^25НМ.

В1 BZ

тВ

з-

А

з г

г

20 «О 60

Рис.10. Преобразование кривых дозовых зависимостей от концентрации ФАТ на макрофагах (кривая I) и нейтрофилах (кривая 2) в координатах Иди-Хофсти. Условия: инкубация 2 мин при 37°С, буфер рве,

Низкоаффинный участок кривых мокет отражать неспешфгюскж процессы, происходящие с клетками и не связанные со специфической рецепцией ФАТ на соответствующих центрах связывания. Значение кю1 для макрофагов удовлетворительно совпадает со значением к^ на этих клетках; а кп1 для нейтрофилов значительно ниже, чем величина к^. Значение константы Михаэлиса (кп1),характеризующей процесс индукции супероксидных радикалов для нейтрофилов, снижается, а амплитуда - ответа увеличивается при преинкубаций клеток с форболовым эфиром и азидом натрия. Полученные данные указывают на отличие в лимитирующей стадии процесса активации на изученных клетках крови: у- макрофагов это- связывание ФАТ с рецептором, " а у нейтрофилов- передача сигнала Енутри клетки.

Значительные различия изученных типов иммунокомпетентных клеток наблюдаются в' составе фиксируемых радикальных продуктов дыхательного взрыва: у макрофагов ФАГ стимулирует выброс только супероксидного аниона ■ (добавление, супероксиддисмутазы в количестве ЗБОэд." снимает ответ ФАТ), а у нейтрофилов- продуктов

миелопероксидазной реакции (синглетного кислорода, ось" радикала)

Ингибировевде образования активных форм кислорода под воздействием ФАТ бензодиазетшами на фагоцитах человека. Бензодиазепины ^известны в качестве антагонистов ФАТ в реакции активации тромбоцитов. Нами было изучено влияние перифе- , рических бензодиазепиновых лигандов Но-5-4864 и рк •11195 на спе-пифическое связывание н3-ФАТ с макрофагами и нейтрофилами, неме- ченого ФАТ на связывание меченых бензодиазепиновых лигандов и влияние этих лигандов на образование 02~ под воздействием ФАТ.

Показано,- ■ что йо-5-4864 ингибирует ФАТ стимулированную активацию дыхательного взрыва на нейтрофилах в диапазоне концентраций от I до ЮОнМ (ес50=75 нМ). Параллельно проводили изучение влияния йо-5-4864 и немеченого ФАТ на связывание н3-ФАТ и н3-!1о-5-48б4 на нейтрофилах. Кривая вытеснения н3-ФАТ немеченым. Яо-5-48б4 характеризуется значением 1с50=140 нМ, в то время как немеченый ФАТ также конкурирует за места . связывания агониста бензодиазепиновых рецепторов Ео-5-4384 (1с50=200 нМ). Полученные данные (близкие значения хс50 и ес50) указывают на то, что эти лиганды могут взаимодействовать через одни и те же рецепторы на • нейтрофилах. Отличие величин ю50 ' вытеснения меченого н3-ФАТ немеченым к0-5-48б4 и наоборот с мест связывания на макрофагах указывают на отличие рецепторов этих лигандов на этих клетках.

Антагонист периферических бензодиазепиновых рецепторов' рк 11195 оказывал существенное влияние на дыхательный . взрыв в нейтрофилах, но не влиял на связывание н3-ФАТ.

Рецепторы нейромодуляторов на клеточных линиях Интерес к изучению рецепторов низкомолекулярных соединений на различных клеточных линиях' обусловлен, во-первых, возможностью поддерживания и постоянного производства соответствующих культур, и во-вторых, близкими характеристика® рецепторного связывания и. биохимического функционирования на этих линиях и на клетках крови, из которых они получены. На основании анализа изотерм специфического связывания ряда меченых низкомолекулярных нейромодуляторов получены - физико-химические характеристики связывания нейромодуляторов с иммунизированными 1п у^со вирусом

Эпштейн-Барр в-лимфоцитами .линией моноцитов 096) и макрофагов (идз7) Полученные данные в сравнении с аналогичными характеристиками на исходных клетках крови приведе1ш в таблице 4.

Таблица 4.

культуры клеток

параметры связывания различных рецепторов ИМИ 5~от2 м-холино- ФАТ

* гт(| и *

к.,нМ в

(3' пах

К,,НМ В с!' шах

К..НМ 8 * К.,НМ В * с! шах й шах

лимфэбласты 4.1 56 23.0 850

32.5 800 *

в-лимфоциты 3.5 42 30.5 900 ,

35.7 765

93

^937 макрофаги

6.0 4.5 2.7

где в

120 70 57

4.5

85

3.0 100

1.5 200 5.0 530 0.8 ' 150

- плотность рецепторов в фмоль/млн клеток

Следует отметить близость параметров связывания имипрамина и днз на культуре лимфобластов и в-лимфоцитах. Наличие имипраминовых и м-холияорецепторов на этой в-клеточной линии делает ее удобной моделью для изучения механизма действия различных веществ.

Клеточные линии здв- и идз? обладают активностью а-нафилэсте-разы и другими элементами фенотипа моноцитов-макрофагов. Несмотря на наличие высокоаффинных мест .связывания ФАТ с этики клетками,ни с одной из линий не наблюдалось стимуляции выброса супероксидногб радикала (02~) под воздействием низких доз (Ю_8М) фактора активации тромбоцитов, что отличает эти культуры клеток от макрофагов. Параметры связывания Jgs и иэз? с имипрамшошми и Б-ОТ2-рецепторами отличаются от аналогичных характеристик на моноцитах крови. -..'.■

Рецепторы нейромодуляторов на бронхо-альвеолярных макрофагах. ,

Клетки ЛАВАЖа представляют собой смесь лейкоцитарных клеток (в основном альвеолярных макрофагов,а также нейтрофилов у доноров с выраженным воспалительным процессом в легких) и могут служить удобным объектом в клинической медицине, поскольку изменения в фенотипе клеток могут служить индикатором развития воспаления при аллергических процессах.

Использование радиолигандного метода выявило наличие имипра-миновых, серотониновых 5-0Т2, м-холино-,р-адрено- и гистаминовых рецепторов на легочных лейкоцитах. Бронхоальвеолярные макрофаги отличаюся от клеток крови человека морфологически и по своим характеристикам связывания с различными рецепторами. Плотность 5-0Т2-и р-адрено-рецепторов на этих клетках в несколько раз превышает число мест связывания лигандов на клетках крови(таблица 6).

Таблица 6

Рецепторы нейромодулягоров на клетках ЛАВАЖа

Донор состав ЛАВАЖа (¡о Уровень специфического связывания(ори)

м Н" Л ИМИ (2нМ) С ДГА (4нМ) выв (10нМ) спиперон (Знм) цимвтидин (5нМ)

I 66 28 6 4219 2425 Д560 2300 140

2 66 33 . I 3226 3106 1350 4017 351

3 80. 19 I 3212 751 1270 , - ■ .425

4 91 9 • - 1304 283 - ■ 3200 .190

5 81 19 - 1500" 1795 2170 4650 235

6 38 57 5 2742 2392 1494 2980 136

7 39 I - 3453 ; 2902 1610 70

где м-макрофаги, н-нейтрофилы, л-лимфоциты.

выводы

1. Впервые выявлены центры специфичечкого связывания ишпрамина с мононуклеарными лейкоцитами крови человека, не сопряженные с каналами обратного захвата серотонина.

2. Показано наличие двух независимых типов центров связывания имипрамина: высокоаффинного и низкоаффинного. Выявлена высокая лабильность низкоаффинного центра- и его связь с. центром связывания антагониста мускариновых рецепторов ад в.

3. Установлено, что серогонин взаимодействует с мононуклеарными лейкоцитами крови человека по типу обратимого, насыщаемого, зависимого от температуры рецепторного связывания и определены физико-химические характеристики взаимодействия.. Показано, что имипрамин является конкурентным ингибитором связывания серотонина.

4. Показана роль фактора активации тромбоцитов в активации дыхательного взрыва в макрофагах и нейтрофилах посредством рецепции на специфических высокоаффинных центрах связывания.Выявлены различия в реактивности этих двух типов клеток и в составе фиксируемых радикальных продуктов взрыва.

5. Показано, что агонист периферических бензодиазепиновых рецепторов Ro-5-4864 взаимодействует с рецептором фактора активации тромбоцитов на нейтрофилах человека.

6. Получены . физико-химические характеристики связывания низкомолекулярных: нейромодуляторов с клеточными линиями и альвеолярными макрофагами.

СПИСОК РАБОТ,' ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

■ I. Зайцев C.B., Породенко'Н.В.. Козюков A.B., Варфоломеев С.Д. Рецепторный портрет человека: имипраминовые рецепторы лимфоцитов. Материалы vi Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Вильнюс,1988, ч.н, с.36.

2.Porodenko H,V., Formakidcva O.K..Kozyukov A.V.,Zaitsev S.V., Hunan "Receptor Image": Benzodiazepine and inipramine receptors

on human lymphocytes. Proc.of 14-th Int. Congress of Biochemistry Prague, 1988, p.68.

3. Породенко H;B., Шумилов В.Г., Козюков A.B. Рецепторы нейромодуляторов на лимфоцитах человека. Материалы первого , Всесоюзного съезда иммунологов, Дагомыс,1989, с.91.

4. Porodenko N.V., Kozyukov A.V. , Karaulov A.V. Molecular mechanisms of the interaction between tricyclic antidepressants and human immunocompetent cells. Proc. 1-st Int. Congress-INSIM, Florence, Italy, 1S90, p.243.

5. Koskaleva E.Yu.,Kolyada T.I.,Duvakin M.G..Pustynnikov M.G.. Kozyukov A.V., Porodenko S.V. Characterization of an established line J-96 human oonocytoid cells as 'compared to peripheral monocytes. Proo.of Int.Conference "Mononuclear phagocytes in norn-and pathology", Novosibirsk, 1990, p.129.

6. Pustynnikov M.G., Porodenko H.V., Sokolovsky A.A., Kozyukov A.V. Benzodiazepine induced intibition of the production of reactive oxygen internediates in neutrophiles stinulated by platelet activating factor. Proc.of Int Conference "Advances in platelet activating factor research* Paris,France, 19S0,p.49.

7. Породенко H.B., Козюков A.B., Караулов A.B. Природа . взаимодействия имипрамина и серотонина с лимфоцитами' человека. Иммунология, 1991, т.4, с.12-15. ■■„ .

8. Pustynnikov H.G., Porodenko К.7., Hakarova O.V., Rozyukov A.V., Hoskaleva E.Yu., Sokolovsky A.A., Severin E.S. Platelet-Activating Factor Stinulates Receptor-Mediated Fornation of Reactive Oxygen Internrdiates in Нилал Monocytes: LIPIDS,1992, v. 26, * 12,p.1214-1217.