Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепторы бензодиазепинов на клетках крови человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рецепторы бензодиазепинов на клетках крови человека"

министерство здравоохранения ссср

всесоюзный научный центр молекулярной диагностики и лечения

На правах рукописи

шах0вкша ольга кирилловна

удк 577.17:519.240

рецепторы бензодиазепинов на клетках крови человека

03.00.03 - молекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в отделе биокинетики Межфакультетской проблемной НМЛ им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и во Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук

профессор С.Д.Варфоломеев

доктор химических наук

Н.В.Породенко

доктор химических наук

В.П.Демушкин

доктор медицинских наук

В.А.Виноградов

Институт физиологичекси

активных веществ АН СССР

г.Черноголовка

Защита состоится

Иъ

1991г. в/С_ часов

на заседании специализированного совета при Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР' по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научного центра молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР.

Автореферат разослан " " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

_В.В.Отраднова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .,. Актуальность проблемы. Различные виды рецепторов выполняют важнейшие регуляторные функции в организме человека и животных. Представление о бензодиазепиновых рецепторах возникло после открытия в головном мозге млекопитающих специфических участков, связывающих с высоким сродством препараты бензодиазепинового ряда. Бензодиазепины широко используются в клинической практике как транквилизаторы. Исходя из сродства ряда селективных лигандов к рецепторам бензодиазепинов, их подразделяют на рецепторы центрального и периферического типа. Рецепторы центрального типа, обнаруженные только в ЦНС, изучены подробно. Бензодиазепиновые рецепторы, локализованные на периферических тканях, а также в ЦНС, мало изучены. В то же время их роль в возникновении побочных эффектов бензодиазепинов является, по-видимому, очень важной. Таким образом, изучение периферических бензодиазепиновых рецепторов важно для дальнейшего развития фармакотерапии психических заболеваний. Особый интерес представляют рецепторы форменных элементов крови и, в частности, лимфоцитов, как ключевого звена иммунной системы, и тромбоцитов, играющих важную роль в процессе свертывания крови. Кроме этого, характеристики рецепторов на клетках крови могут отражать состояние рецепторов в ЦНС.

Цель работы. Целью настоящей работу явилось исследование специфической рецепции бензодиазепинов на клетках крови человека. В связи с поставленной целью в работе решались задачи определения типа бензодиазепиновых рецепторов на клетках крови человека (лимфоцитах и тромбоцитах), получение физико-химических параметров связывания различных бензодиазепиновых лигандов с рецепторами тромбоцитов и лимфоцитов.

Научная новизна работы. В работе установлено, что на клетках крови человека локализованы бензодиазепиновые рецепторы периферического типа. Впервые показано, что различные бензодиазепиновые лиганды- агонист Ко 5-4864 и антагонист РК 11195 - связываются с различными подтипами периферических рецепторов бензодаазепинов на тромбоцитах и лимфоцитах., Получены параметры связывания бензодиазепиновых лигандов с рецепторами клеток крови, изучены температурная и рН-зависимости связывания. Проведено сравнение параметров связывания бензодиазеринов с различными типами специфических рецепторов на клетках крови и в мозжечке человека.

Практическая ценность работы. Полученные результаты

свидетельствуют о том, что клетки крови - тромбоциты и лимфоциты -могут служить моделью для изучения периферических типов бензодиазепиновых рецепторов человека. Физико-химические характеристики связывания бензодиазепиновых лигандов изучались на различных препаратах, выделенных из донорской крови здоровых людей. В дальнейшем они могут быть использованы в практической медицине при исследовании различных патологических состояний организма человека. Полученные результаты позволяют судить о механизмах побочных эффектов транквилизаторов бензодиазепинового ряда, что имеет большое значение для фармакотерапии заболеваний ДНС, а также открывают возможность разработки новых препаратов периферического действия.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всесоюзной конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987г.), на конференции молодых ученых химического факультета МГУ (Москва,1988), на VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Вильнюс, 1988).

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методики эксперимента, 3-х глав, в которых излагаются результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах,

включает таблиц и рисунков.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Методическая часть. Исследования проводились на препаратах лимфоцитов и тромбоцитов, выделенных из донорской крови по стандартной методике. Процессы комплексообразования меченных тритием бензодиазепиновых лигандов: 3Н-флунитразепама, 3H-Ro 5-4864,

3Н-РК II195, с препаратами клеток крови изучали с использованием вакуумного фильтрования через фильтры GF/B ("Whatman", Англия). Неспецифическое связывание оценивали в присутствии избытка соответствующих немеченых лигандов. Уровень радиоактивности связанного с препаратами клеток крови меченого соединения измеряли на сцинтилляционном J} -счетчике "Mark-Ill" (США).

результаты работы

Первоочередной задачей настоящей работы явилось изучение связывания бензодиазепиновых лигандов с рецепторами клеток крови человека с целью определения параметров комплексообразования и идентификации типа бензодиазепиновых рецепторов. Была проведена серия экспериментов по вытеснению 3Н-дйазепама и 3Н-флунитразепама на различных препаратах клеток крови человека немечеными селективными лигандами. Результаты этих исследований выявили наличие высокоаффшшого обратимого насыщаемого связывания на препаратах тромбоцитов и лимфоцитов.

Идентификация ша бензодиазепиновых рецепторов на клетках крови человека Для решения этой задачи был использован метод конкурентногс вытеснения. В качестве меченого лиганда был взят 3Н-флунитразепам, который связывается как с центральными, так и с периферическими рецепторами бензодиазепинов. В качестве немеченых вытесняющие агентов были взяты: специфический антагонист центральных рецептороЕ йо 15-1788, селективный лиганд- периферических рецепторов ио 5-4864 и диазепам - лиганд обоих типов рецепторов. На рисунке I представлены результаты этих исследований.

Рис.1. Вытеснение 3Н-флунитразепама с мембранных препаратов а)лимфоцитов и б)тромбоцитов немечеными лигандами: I -диазепамом, 2 - Ло 5-4864, 3 - Ио 15- 1788. Условия: температура 4°С,[3н-флунитразепам]=9нМ.

Нами установлено, что лиганд ио 15-1788, избирательно связывающийся с центральными бензодиазепиновыми рецепторами, практически не вытесняет 3Н-флунитразепам, периферический агонист Но 5-4864 наиболее активно конкурирует с 3Н-флунитразепамом

(1с50=90 нМ). Диазепам, связыващийся с обоими типами рецепторов, вытесняет флунитразепам подобно ио 5-4864 (1С50=120 нМ). Способность лигандов вытеснять связанный 3Н-флунитразепам с рецепторов мембранных препаратов лимфоцитов снижается в следующем порядкегйо 5-4864 > диазепам >> Ио 15-1788. Вытеснение 3Н-флунитразепама с мембран тромбоцитов менее выражено. По-видимому, это связано с более низким уровнем специфического связывания бензодиазепиновых лигандов с мембранными рецепторами тромбоцитов ( 30-40% - от уровня общего связывания) по сравнению с уровнем специфического связывания бензодиазепиновых лигандов с мембранными рецепторами лимфоцитов (50-60%- от уровня общего связывания). Несмотря на это, характер вытеснения 3Н-флунитразепама различными селективными лигандами с мембран тромбоцитов и лимфоцитов сходен.

С целью выявления сопряжения бензодиазепиновых рецепторов клеток крови с ГАМК-рецепторами нами были проведены эксперементы по изучению влияния ГАМК на связывание 3Н-флунитразепама с мембранами клеток крови. Показано, что присутствие в инкубационной среде ГАМК в концентрации 5^ М не изменяет уровень специфического связывания.

Полученные нами данные по вытеснению 3Н-флунитразепама различными селективными лигандами и по изучению сопряжения бензодиазепиновых рецепторов с ГАЖ-ергической системой позволяют отнести бензодиазепиновые рецепторы лимфоцитов и тромбоцитов к периферическому типу.

Физико-химические характеристики комплексообразования бензодиазепинов с мембранами клеток крови человека в условиях равновесия С целью получения физико-химических характеристик рецепции

Сензодиазепинов на клетках крови были изучены изотермы связывания 3Н-флунитразепама на мембранах лимфоцитов и•тромбоцитов. Неспецифическое связывание учитывалось при добавлении 10 М немеченого диазепама.При этом кривая неспецифического связывания имела строго линейный вид, т.е. неспецифическая абсорбция лиганда при данных концентрациях практически является ненасыщаемым процессом. Изотермы специфического связывания были получены путем вычитания уровня неспецифического связывания из уровня общего связывания. Кривые специфического связывания имели гиперболический вид и выходили на плато в диапазоне концентраций 3Н-флунитразепама 20-40 нМ.

В, им

Рис.

2. Преобразование изотерм специфического связывания 3Н-флунитразепама в координатах .Скэтчарда с мембранами а) лимфоцитов и б) тромбоцитов, в - концентрация специфически связанного лиганда, г концентрацго свободного лиганда. Условия: температура 4°С, концентрация белка 3,2 мг/мл.

Преобразования изотерм специфического связывания в координата!

Скэтчарда для мембран лимфоцитов и тромбоцитов представлены на рисунке 2. Вид графиков Скэтчарда свидетельствует о наличии одного типа центров связывания и об отсутствии кооперативных эффектов. Таким образом, модель связывания бензодиазепинов с рецепторами клеток крови можно описать схемой:

+ 1_ *=£* 1?1_

где - рецептор, 1_ - лиганд,

- лиганд-рецепторный комплекс, Кд - константа диссоциации лиганд-рецепторного комплекса. Сравнивая параметры связывания 3Н-флунитразепама с рецепторами мембран лимфоцитов и тромбоцитов, можно сделать вывод о том, что Кд в обоих случаях близки (для лимфоцитов 30 ± 2 нМ, для тромбоцитов 33 ± 2 нМ), в то время как концентрация центров связывания значительно выше для лимфоцитов (220 ± 15 фмоль/мг белка), чем для тромбоцитов (21 ± 2 фмоль/мг белка).

Сходство значений Кд при связывании бензодиазепинового лиганда с мембранными препаратами лимфоцитов и тромбоцитов, свидетельствует об идентичности бензодиазепиновых рецепторов этих клеток по структуре и свойствам. Отличаются эти клетки концентрацией центров связывания - на мембранах лимфоцитов она в 10 раз выше. Более низкий уровень специфического связывания бензодиазепинов на тромбоцитах (40 ± 5 % от уровня общего связывания), обусловленный низкой концентрацией центров связывания, а также методические трудности в выделении мембранных препаратов тромбоцитов, делают лимфоциты более удобным объектом для исследования закономерностей рецепции бензодиазепинов на клетках крови человека.

Кинетические параметры связывания флунитразепама с мембранами лимфоцитов человека С целью получения кинетических параметров модели с одним типом центров связывания были проведены эксперименты по изучению кинетики ассоциации 3Н-флунитразепама с мембранами лимфоцитов человека. Равновесие в процессе связывания достигалось к 1-2 минутам инкубации при 37°С. При этом уровень специфического связывания составлял 50 ± 5 % от уровня общего связывания.

Диссоциацию лиганд-рецепторного комплекса изучали двумя способами: при добавлении избытка немеченого лиганда и при разбавлении избытком среды инкубации после установления равновесия. В обоих случаях связывание - обратимо и кинетические кривые совпадают, что также указывает на отсутствие кооперативных эффектов. Оценка значения кинетической константы диссоциации комплекса в полулогарифмических координатах дает величину =

0,15 мин-1. Линейность зависимости связывания в этих координатах подтверждает правильность применения модели с одним типом центров связывания. Инактивация рецептора за время инкубации (1,5 часа) не происходит, т.е. процесс связывания 3Н-флунитразепама с мембранами лимфоцитов остается в равновесии.

Температурная зависимость параметров связывания флунитразепама с бензодиазепиновыми рецепторами лимфоцитов Из литературных источников известно, что связывание бензодиазепинов с рецепторами центрального типа сильно зависит от температуры и максимально при 4°С. Данные по температурной зависимости параметров связывания бензодиазепинов с рецепторами периферического типа в литературе отсутствуют. Анализ изотерм специфического связывания выявил следующий факт: концентрация

>нтров связывания и сродство 3Н-флунитразепама к периферическим щепторам клеток крови при 4°С и 37°С близки. Была изучена змпературная зависимость комплексообразования 3Н-флунигразепама с змбранами лимфоцитов' человека в интервале температур 4-50°С. элучены изотермы специфического связывания при разных температурах ледует отметить, что при температуре выше 40°С специфическое вязывание на препарате мембран отсутствовало, что, по-видимому, бусловлено инактивацией рецепторов. Параметры, полученные на-снове анализа изотерм связывания в координатах Скэтчарда при азличных температурах приведены в таблице I. Видно, что .онцентрация центров связывания 3Н-флунитразепама на мембранах шмфоцитов с изменением температуры меняется незначительно.

Таблица I. Температурная зависимость параметров рецепции

флунитразепама.

температура, °С Константа диссоциации, нМ Концентрация центров связывания,фмоль/мг белка

4 28 ± 2 244 ± 22

8 13 ± I 152 ± 15

15 10 ± I 140 ± 10

20 15 ± I 195 ± 20

25 28 ± 2 260 ±-22

30 30 ± 2 220 ± 20 '

37 30 ± 2 220 ± 20

Зависимость константы диссоциации от температуры представляет собой кривую с выраженным минимумом при температуре около 15°С (рис.3). По-видалому, при этом значении температуры происходит скачкообразное изменение состояния мембраны, или конформационные изменения структуры рецептора, что отражается на

характеристиках сродства рецепторов к бензодиазепиновому лиганду. ^А'иМ _ Рис. 3. Температурная зависимость

константы диссоциации комплекса 3Н-флунитразпам-рецептор на мембранах лимфоцитов .

/О 20 30 40 ^ °с

рН-зависимость связывания флунитразепама с мембранами лимфоцитов человека При работе с биологическими объектами традиционно исследования проводятся в условиях, приближенных к физиологическим, т.е. при температуре 37°С, рН 7,2-7,4. Полученные наш результаты экспериментов относятся к физиологическим условиям. Представляет интерес выяснить как меняются характеристики связывания 3Н-флунитразепама с периферическими рецепторами при изменении рН среды инкубации, тем более, что такие исследования не проводились ни с центральными ни с периферическими рецепторами.

Были получены и преобразованы в координатах Скэтчарда изотермы специфического связывания 3Н-флунитразепама с мембранами лимфоцитов при различных значениях рН. Зависимость параметров связывания от величины рН приведена в таблице 2.

Из этих данных видно, что при кислых значениях рН ( < 7) концентрация центров связывания уменьшается почти в 2 раза по сравнению с концентрацией при физиологическом значении рН. Константа диссоциации при этом меняется мало. При слабощелочных

значениях рН (>7) концентрация центров связывания практически не меняется, в то время как константа диссоциации сильно увеличивается ю сравнению со значением при физиологическом рН. Таблица 2. рН-зависимость параметров рецепции

3Н-флунитразепама.

рН Константа диссоциации, нМ Концентрация центров связывания, фмоль/мг бежа

5,7 30 ± 2 305 ± 30

6,4 39 ± 2 270 ± 25

7,4 31 ± 2 529 ± 50

8,3 78 ± 4 490 ± 50

С целью более подробного изучения явления изменения параметров связывания при различных значениях рН был проведен эксперимент по выявлению рН-зависимости уровня специфического связывания при фиксированной концентрации 3Н-флунитразепама. Эта зависимость приведена на рисунке 4. Видно, что зависимость имеет вид кривой с максимумом в области физиолигических значений рН. Кривая 2 получена в условиях, когда исследуемый препарат инкубировали при различных значениях рН, осаждали центрифугированием и ресуспендировали все пробы при рН 7,4. Затем оценивался уровень специфического связывания 3Н-флунитразепама в каждой пробе.

рН-зависимость уровня специфического связывания 3Н-флу-нитразепама с мембранами лимфоцитов; I- рН-зависимость, 2- проверка обратимости действия рН; температура 37°С, концентрация меченого флуни-тразепама 6 нМ.

Видно, что инкубация мембран лимфоцитов при рН < 7 приводит к необратимой инактивации, снижению уровня связывания в полном соответствии с ходом кривой I. При инкубации препарата в щелочных средах снижение уровня специфического связывания обратимо и при ресуспендировании мембран в среде инкубации с рН 7,4 связывание достигает исходного уровня.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что при рН < 7 происходит необратимая инактивация периферических бензодиазепиновых рецепторов на мембранах лимфоцитов, сопровождающаяся уменьшением концентрации^ центров связывания. В щелочных средах происходит изменение свойств рецепторов, выражающееся в уменьшении сродства ( увеличении константы диссоциации) рецепторов к бензодиазепиновым лигандам. Концентрация центров связывания при этом практически не меняется. По-видимому, уменьшение уровня связывания в щелочной среде обусловлено депротонированием ионогенной группы рецептора.

Физико-химические закономерности комплексообразования селективных бензодиазепиновых лигандов с рецепторами клеток крови человека

Поскольку на клетках крови человека нами установлено наличие периферического типа бензодиазепиновых рецепторов, представляется интересным охарактеризовать эти центры, используя селективные лиганда: агонист Яо 5-4864 и антагонист РК 11195.

Были изучены изотермы специфического связывания 3Н-РК 11195 с интактными лимфоцитами и их мембранными препаратами. Установлено, что преобразование изотерм специфического связывания в координатах Скэтчарда для антагониста 3Н-РК 11195 имеет линейный характер. Следовательно, процесс рецепции описывается моделью, учитыванхце!

наличие одного типа центров связывания. Равновесные константы диссоциации имеют сходные значения для интактных лимфоцитов и их мембранных препаратов. Для мембран лимфоцитов константа диссоциации равна 10 нМ.

При изучении связывания агониста 3H-Ro 5-4864 преобразование изотермы в координатах Скэтчарда выявило, что существует один тип центров связывания, максимальная концентрация рецепторов Ro 5-4864 на интактных клетках имеет значение 1400 фмоль/мг белка, Кд=55 нМ.

Таблица 3. Характеристики связывания лигандов периферических бензодиазепиновых рецепторов с препаратами лимфоцитов человека.

Л И Г А Н Д 3H-Ro 5-4864 3Н-РК II195

Характеристики связывания Кд,нМ В..,фмоль/мг м белка Кд,нМ Вм,фмоль/мг белка

КЛЕТКА 55 1400 16 2400

МЕМБРАНЫ нет связывания 10 3940

Из данных, представленных в таблице 3, следует, что мембранные препараты лимфоцитов- не содержат центров связывания этого селективного лиганда. Вероятно, при разрушении клеток происходит их инактивация. Сравнивая характеристики связывания периферических лигандов с рецепторами бензодиазепинов на лимфоцитах, можно сделать предположение о том, что 3Н-Ио 5-4864 и 3Н-РК 11195 взаимодействуют с двумя различными подтипами периферических бензодиазепиновых рецепторов.

Сделав такое предположение, важно было изучить влияние ГАМК на связывание 3Н-Ио 5-4864 и 3Н-РК 11195 с рецепторами интактных

лимфоцитов. Нами показано, что ГАМК и ее аналоги дают различные эффекты при связывании этих периферических лигандов с лимфоцитами. Это проиллюстрировано на рисунке 5.

гамн мШЮфй/' "Ьтосрен гши мБтофеи нбахлифеи

Рис. 5. Влияние ГАМК и ее аналогов на уровень специфического связывания селективных лигандов с интактными лимфоцитами: а) связывание 3Н-Ио 5-4864, концентрация 10 нМ, б) связывание 3Н-РК III95концентрация 10 нМ; I - в присутствии эффектора, 2 - в отсутствии эффектора; концентрация эффекторов Ь/л М, I мл препарата лимфо-

с

цитов содержит 9'10 клеток.

Введение в среду инкубации 5/4М ГАМК увеличивает связывание агониста 3Н-йо 5-4864 в 2 раза и снижает связывание 3Н-РК 11195 на 30%. Стереоизомеры баклофена практически не влияют на связывание 3Н-РК 11195 с интактными лимфоцитами, в то время как (+) баклофен в 2 раза активирует связывание 3Н-йо 5-4864, в отличие от своего стереоизомера (-) баклофена. Следует отметить, что эксперименты по изучению влияния ГАМК и ее аналогов как с центральными, так и с периферическими рецепторами, описанные в литературе, проводились на

мембранных препаратах мозга и почек. Согласно результатам этих опытов, периферические места связывания бензодиазепинов, в отличие от центральных, не сопряжены с ГАМК - рецепторами. В последнее время в литературе обсуждается предположение о возможности регуляции периферических рецепторов бензодиазепинов ГАМК и ее аналогами. Это подтверждается приведенными данными. Результаты по изучению влияния ГАМК и ее аналогов на связывание периферических лигандов 3Н-йо 5-4864-и 3Н-РК 11195 с интактными лимфоцитами также подтверждают наше предположение о существовании двух различных подтипов периферических бензодиазепиновых рецепторов. Для лимфоцитов человека это показано впервые.

Изучены изотермы специфического связывания периферических лигандов 3Н-РК 11195 и 3Н-Ко 5-4864 с интактными тромбоцитами. Связывание является насыщаемым, вид графиков в координатах Скэтчарда указывает на существование одного типа центров связывания для каждого из этих лигандов. Различная концентрация центров связывания для 3Н-Ло 5-4864 и 3Н-РК 11195 также свидетельствует о •том, что эти лиганды связываются с различными подтипами периферических рецепторов на тромбоцитах.

Изучение комплексообразования различных бензодиазепиновых

лигандов с мембранными препаратами мозжечка человека

С целью выяснения соотношения характеристи связывания центральных и периферических типов рецепторов человека с бензодиазепинами наш был взят мозжечок человека в качестве модели, обогащенной центральными бензодиазепиновыми рецепторами.

■ Были проанализированы кривые вытеснения связанного 3Н-флунитразепама с мембран мозжечка селективными лигандами центральных и периферических рецепторов бензодиазепинов. Рисунок 6

Рис.6.Вытеснение 3Н-флунитра-зепама с мембран мозжечка человека немечеными лигандами: I ■ ИО 5-4864, 2 - РК 11195, 3 ■ Ио 15-1788, 4 - флунитразепам Концентрация 3Н-флунитразепам; 3 нМ, температура 4°С, концентрация белка 1,55мг/мл. 1С50 дл: Ио 15-1788 и флунитразепам; 20нМ.

3Н-флунитразепам связывается с высоким сродством с бензодиазепиновыми рецепторами мозжечка человека. Конкурировать с ним за места связывания может только селективный лиганд центральных рецепторов Ио 15-1788 (Ю50=20 нМ). Лиганды периферических бензодиазепиновых рецепторов практически не способны вытеснить меченый флунитразепам с мембран мозжечка человека. Это указывает на их крайне низкое сродство к рецепторам 3Н-флунитразепама.

Были получены также изотермы связывания

3Н-флунитразепама,3Н-Но 5-4864 и 3Н-РК 11195 с мембранами мозжечка человека. Связывание 3Н-флунитразепама характеризуется насыщаемостью и описывается моделью, учитывающей существование одного типа центров связывания с высокой аффинностью ( Кд=2,5нМ). Оценка концентрации участков связывания дает значение 1300 фмоль/мг белка. Связывание 3Н-РК 11195 с бензодиазепиновыми рецепторами препарата мембран мозжечка человека также описывается моделью с одним типом рецепторов. Константы диссоциации лиганд-рецепторного

отражает данные этих исследований.

комплекса для 3Н-флунитразепама и 3Н-РК 11195 существенно различны. 3Н-ш 5-4864 практически не связывается с мембранами мозжечка человека.

Соотношение физико-химических характеристик процессов связывания бензодиазепиновых лигандов с центральными и периферическими бензодиазепиновыми рецепторами человека Таблица 4 отражает характеристики связывания бензодиазепинов с бензодиазепиновыми рецепторами человека. Описывая эту таблицу, важно отметить, что в организме человека имеются бензодиазепиновые рецепторы центрального и периферического типа. Селективный лиганд флунитразепам связывается с высоким сродством с мембранами мозжечка. Мозжечок содержит также и периферические рецепторы бензодиазепинов, которые связываются с РК 11195 и но взаимодействуют с ио 5-4864. На клетках крови человека обнаружены только периферические рецепторы бензодиазепинов, которые различаются своими характеристика™ при связывании с агонистом Ио5-4864 и антагонистом РК 11195. Можно сделать вывод, что различные периферические бензодиазепиновые лиганды связываются на клетках крови с различными подтипами периферических рецепторов бензодиазепинов.

Более наглядно это изображено на рисунке 7. Итак, в организме человека локализованы бензодиазепиновые рецепторы обоих типов - центральные и периферические. Моделью изучения периферических типов бензодиазепиновых рецепторов могут служить клетки крови: тромбоциты и лимфоциты. Эти клетки содержат участки связывания Ио 5-4864 и РК 11195, которые можно отнести к различным подтипам периферических рецепторов, и которые теряют рецепторную активность при разрушении клетки. Участки связывания

Таблица 4. Характеристики связывания бензодиазепинов в организме человека.

л и г а н д улуштразеш; Ко 5-4864 рк 11195

мембраны клеток целые к л е т к и

характеристики ^^^^язывания Объект кд,нм р гомоль М' мг . ■ белка кд.нм 2 ймоль м' мг белка кд.нм р ймоль м' мг белка

лимфоцит 30 220 55 1400 16 2400

тромбоцит 33 21 46 1000 18 1900

шзяечск 2,5 1300 нет связывания 21 2100

ы

03

флунитразепама на них выявляются лишь при нарушении целостности этих клеток.

0

ТРОМБСЩ

© -2 А - 3 А-Л

ЛИМФОЦИТ

МОЗГ

Рис.7. Локализация бензодиазепиновых рецепторов на клетках крови и мозжечке человека. I- рецепторы ио 5-4864, 2 -рецепторы РК 11195, 3 - рецепторы флунитразепама центрального типа, 4 - рецепторы флунитразепама периферического типа.

- 20 -ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение бензодиазепиновых рецепторов на клетках крови человека и мозжечке человека в сранительном аспекте.

2. Показано, что бензодиазепиновые рецепторы клеток крови человека по своим характеристикам относятся к периферическому ' типу. Определены физико-химические параметры рецепции агониста и антагониста периферических рецепторов. Процесс - связывания описывается моделью, учитывающей наличие одного типа центров связывания.

3. Впервые обнаружено, что температурная зависимость связывания фдунитразепама с мембранами лимфоцитов имеет вид кривой с выраженным минимумом.

4. Изучены закономерности связывания лигандов периферических бензодиазепиновых рецепторов при различных значениях рН. Показано, что при рН < 7 происходит необратимая инактивация рецепторов.

5. Впервые показано, что на интактных лимфоцитах человека ГАМК и ее аналог (+) Саклофен активируют связывание периферического лиганда йо 5-4864.

6. Установлено, что связывание с периферическими рецепторами на клетках крови описывается моделью, учитывающей наличие независимых подтипов центров связывания для агонисте Ио 5-4864 и антагониста РК 11195.

7. Показано, что связывание бензодиазепиновых лигандов с рецепторами головного мозга человека (мозжечка) описывается моделью, учитывающей наличие центров связывания для центрального и периферического лигандов."

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Формакидова O.K. Бензодиазепиновые рецепторы на клетках крови человека. Материалы Всесоюзной конференции "Биология клетки" Тбилисского государственного университета, 23-26 ноября 1387г.

2. Физико-химические закономерности комплексообразования бен-зодиазепинов с рецепторами лимфоцитов человека. Материалы конференции молодых ученых химического факультета Московского государственного университета им.Ломоносова, Москва, 26-28 января, 1988г. В34/МГУ, M.1988,часть 2,деп,ВИНИТИ 25.07.88, N 588I-B-88,С.142-145.

3. Породенко Н.В., Формакидова O.K., Зайцев C.B. Рецепторный портрет человека: бензодиазепиновые рецепторы лимфоцитов. Материалы VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимо-логии, ч.И, стр.34-35, Вильнюс, 1988.