Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль Fcγ-рецепторов в реализации биологического действия C-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль Fcγ-рецепторов в реализации биологического действия C-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки"

На правах рукописи

005535467

ТРУЛЁВ Андрей Сергеевич

Роль Гсу-рецеиторов в реализации биологического действия С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ОКТ 2013

Санкт-Петербург 2013

005535467

Работа выполнена в Отделе иммунологии и Отделе биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Назаров Пётр Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, профессор кафедры гистологии и общей биологии

Чумасов Евгений Иванович

доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией общей патологии отдела общей патологии и патологической физиологии

Кокряков Владимир Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

Защита диссертации состоится " 12 " ноября 2013 г. в \3> часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан " " _2013 года

Учёный секретарь Специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук /

Дыбан П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С-реактивный белок принадлежит к семейству пент-раксинов, является белком острой фазы. Отличительная черта С-реактивного белка — возможность быстрого, многократного увеличения его концентрации в крови при развитии воспаления любой природы и локализации. С-реактивный белок играет важную роль в защите организма. В системе врожденного иммунитета пентраксины играют роль растворимых распознающих белков, сходную с ролью иммуноглобулинов: С-реактивный белок способен опсонизировать бактерии, а связываясь с компонентами некротизированных или апоптотических клеток, способствуют их фагоцитозу и тем самым препятствуют их накоплению в тканях и развитию аутоиммунных реакций (Du Clos T.W., 1991). При системной красной волчанке имеется недостаточность продукции С-реактивного белка, а у мышей с нокаутом гена пентраксина (SAP) развивается спонтанный аутоиммунный процесс против компонентов ядер клеток, что указывает на возможную сдерживающую роль пентраксинов в предотвращении аутоиммунитета (Du Clos T.W., Mold С., 2011). До сих пор не описан дефицит С-реактивного белка, связанный с естественной делецией гена или его части. Отсутствие дефицита С-реактивного белка и то, что белок филогенетически консервативен по первичной и третичной структуре и лиганд-связывающей специфичности, указывает на то, что С-реактивный белок был необходим для выживания (Назаров П.Г., 2010).

С-реактивный белок обладает не только защитными функциями во врожденном иммунитете, но и участвует в патогенезе таких распространенных заболеваний человека, как сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и различные фиб-ротические нарушения. На ранних этапах (острой фазе) воспаления С-реактивный белок провляет провоспалительную, на поздних - противовоспалительную активность.

Тучные клетки (ТК) являются мультифункциональными клетками иммунной системы и играют важную роль в защите организма, в частности, в таких процессах как фиброз, ангиогенез, перестройка тканей и заживление ран, взаимодействия хозяин-паразит (Быков B.JI., 1999). По ряду признаков тучные клетки близки к базофилам крови, например, они экспрессируют высокоаффинный рецептор к IgE и содержат в гранулах вазоактивные вещества. Но, в отличие от базофилов и других клеток кровяного происхождения, они являются резидентами соединительной ткани и обычно не обнаруживаются в кровяном русле, а располагаются, как правило, в соединительной

/ !

з

ткани. В ответ на различные стимулы запускается процесс дегрануляции ТК, что способствует запуску процессов воспаления.

Фибробласты (Фб), являются резидентными клетками соединительной ткани. Они создают микроокружение для ТК, для их созревания и функционирования. ТК находятся в постоянном контакте с Фб и компонентами межклеточного матрикса. Активация ТК необходима для запуска воспалительных реакций в соединительной ткани. Под действием медиаторов ТК повышается проницаемость локальных сосудов, что приводит к увеличению температуры локуса воспаления, покраснению и отёку, что вместе с болью (которая инициируется, в том числе в результате активности тучных клеток) и является четырьмя основными признаками воспаления (Krishnaswamy, 2010). При воспалении ТК повышают количество контактов с Фб. ТК продуцируют большое количество биологически активных веществ, которые играют как про-, так и противовоспалительную роль. Большинство цитокинов, синтезируемых ТК, оказывает комплексное воздействие на Фб: влияют на их пролиферативную активность, на экспрессию рецепторов гистамина, серотонина, TNF, а также на выброс фибробластами хемокинов CCL8, CCL13, CXCL4 и CXCL6 (Müller et al., 2011).

В настоящее время достаточно хорошо изучена провоспалительная активность ТК на стадии инициации воспаления, и репаративная активность фибробластов на продуктивной стадии воспаления. В то же время данных о кооперации этих клеток в острой фазе воспаления, в том числе о роли в этом взаимодействии белков острой фазы крайне мало. Остается спорным и вопрос о клеточном рецепторе, через который реализуется действие С-реактивного белка на клетки соединительной ткани. Изучению данной проблемы и посвящена наша работа.

Цель работы. Изучить влияние С-реактивного белка на взаимодействие иммунокомпетентых клеток (тучных клеток, моноцитов) с фибробластами и эндотелиальными клетками, а также оценить роль Fcy-рецепторов в реализации действия С-реактивного белка на клетки.

Решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию Fcy-рецепторов на тучных клетках линии НМС-1, моно-цитоподобных клетках линий ТНР-1 и U-937, фибробластах, эндотелиальных клетках EA.hy926, клетках карционмы толстой кишки линии COL0320HSR.

2. Определить рецепторы для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1 и эндо-телиальных клетках EA.hy926.

3. Изучить способность С-реактивного белка вызывать выход гистамина из тучных клеток линии НМС-1.

4. Определить влияние С-реактнвного белка на адгезию тучных клеток и моноцитов к клеткам эндотелия и фибробластам.

5. Изучить роль Fcy-рецепторов в активации NF-кВ-сигнального пути при действии С-реактивного белка на клетки.

Научная новизна работы. Показано, что рецепторами для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1, а также на эндотелиальных клетках EA.hy926, служат рецепторы иммуноглобулина класса IgG. Основной рецептор для CRP — низкоаффинный FcyRII. Кроме того, впервые показано, что, действуя на Fcy-рецепторы тучных клеток, С-реактивный белок вызывает изменение их адгезивных свойств. Впервые показано, что пентраксины С-реактивный белок и сывороточный Р-компонент амилоида способствуют прикреплению тучных клеток и моноцитов к матриксу соединительной ткани. Установлено, что высокоаффинный рецептор FcyRI также является рецептором для CRP на тучных клетках. Но в отличие от FcyRII, конститутивно экспрессирован-ного на их поверхности, экспрессия FcyRI требует индукции и может быть индуцирована IFNy. Воздействие С-реактивного белка на тучные клетки через FcyRI приводит к активации тучных клеток и выбросу гистамина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Исследование направлено на изучение неаллергических механизмов активации тучных клеток человека, в частности, на оценку роли Fcy-рецепторов во влиянии белка острой фазы воспаления — CRP. Получены новые данные о значении Fcy-рецепторов в активации тучных клеток. Расшифрованы механизмы вовлечения CRP в патофизиологические процессы. В частности, показано, что влияние С-реактивного белка на тучные клетки вызывает их активацию, проявляющуюся выбросом медиаторов и усилением контактов с окружающей тканью - с фибробластами и белками межклеточного матрикса. Это углубляет теоретические знания о тучных клетках, их роли в процессах иммунорегу-ляции. Результаты работы способствуют углублению представлений о механизмах участия тучных клеток в патофизиологических процессах, важны для развития представлений об аллергии и воспалительных процессах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Экспрессия Рсу-рецепторов необходима для взаимодействия С-реактивного белка с клетами организма.

2. При действии С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки усиливается их адгезия к другим клеткам и компонентам межклеточного матрикса.

3. Для индукции выброса гистамина из тучных клеток человека линии НМС-1 под действием С-реактивного белка необходима экспрессия РсуШ.

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 23 печатных работ, в том числе 5 статей, из которых 3 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007, 2009, 2011), 7-й английской школе иммунологов им. Дж. Хэмфри (Москва, 2007), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (Москва, 2008), 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Китай, Харбин, 2008), Всероссийской научной конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (С.-Петербург, 2010), заседании Российского научного общества иммунологов (РНОИ) (С.-Петербург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология — практическому здравоохранению» (Москва, 2012), XI и XII Международных конгрессах «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2012, 2013), I, II и IV Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (С.-Петербург, 2007, 2009, 2013).

Объем и структура диссертации. Объем - 140 стр. текста, включая 5 таблиц и 47 рисунков. Список литературы состоит из 189 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена с использованием клеток перевиваемых линий и первичных фибробластов, выделенных из кожи человека.

Тучные клетки (ТК) линии НМС-1, выделенные от больного тучноклеточной лейкемией, получены от проф. J.H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA). По многим свойствам клетки этой суспензионной линии соответствует соединительнотканным ТК: экспрессируют kit-рецептор, продуцируют гистамин, гепарин, хондрои-тинсульфат, триптазу, обладают поверхностными антигенами обычных ТК человека, за исключением отсутствия на клетках НМС-1 рецепторов к IgE (Butterfield et al., 1988; Li et al., 1995). Их культивировали в среде Iscove с необходимыми добавками.

Фибробласты (Фб) кожи человека культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ЭТС, L-глутамина и гентамицина. Линия клеток ТНР-1, выделенная от пациента с промоноцитарной лейкемией, получена от проф. M. De Ley (Университет г. Левена, Бельгия). Клетки экспрессируют Рг-интегрины (Hmama et al., 1999; Ronald et al., 2001), рецептор фракталкина (Umehara et al., 2001; Ronald et al., 2001), рецептор ламинина, Fc-рецепторы, молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (Montuori et al., 1999).

Клеточная линия U-937, выделенная от больного гистиоцитарной лимфомой в период бластного криза, получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Экспрессирует маркеры, характерные для моноцитов. Способна дифференцироваться в макрофаги (Старикова Э.А., 2006).

EA.hy926 — линия клеток эндотелия человека, полученная гибридизацией клеток эндотелия пупочной вены (HUVEC) с клетками карциномы легкого человека А-549 (Edjell et al., 1983), предоставлена Dr. Cora-Jean С. Edgell (Университет Северной Калифорнии, США). По морфологии, фенотипу и функциям сходна с нормальными эндотелиальными клетками человека: спонтанно экспрессирует фактор фон Вилле-бранда, ингибитор активатора плазминогена (PAI-1), тканевой фактор и тромбомоду-лин. После активации клетки экспрессируют адгезионные молекулы (Е-селектин, ICAM-1 и VCAM-1) и хемокины IL-8 и МСР-1 (Mutin et al., 1998).

Линия клеток карциномы толстого кишечника человека COL0320HSR получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург): не экспрессирует CD64 и CD32 (Орлов и др., 2002). Использована для сравнения.

Все клеточные культуры инкубировали при 37 °С в атмосфере с 5 % СО2 и 100 % влажностью. Отсутствие инфицированности контролировалось. Во всех экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 98 %.

Проточную цитометрию использовали для оценки экпрессии клетками поверхностных молекул (цитофлюориметры Navios или Epics Altra Cell Sorter, Beckman-Coulter) с использованием меченых флюорохромами антител. Для каждого из мо-ноклональных антител использовали изотопические контроли. Окраску поверхностных антигенов антителами производили в соответствии с инструкциями производителя.

Степень активации тучных клеток оценивали по выбросу гистамина методом Шора (Shore P.A., 1959) после инкубации ТК с тем или иным препартом в течение 30 мин при 37 °С. Концентрацию гистамина в надосадочной жидкости определяли по флюоресценции продукта конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом при 350/460 нм с помощью Fluoroscan Accent FL (ThermoFisher Scientific).

Оценка адгезии клеток друг к другу. Для оценки интенсивности адгезии суспензионных клеток (НМС-1, ТНР-1 и U-937) их предварительно метили флуоресцентным витальным красителем сукциниловым эфиром карбоксифлюоресцеина и добавляли к конфлюэнтному монослою адгезионной культуры (Фб или EA.hy926). После отмывки монослоя число прикрепившихся клеток оценивали по яркости флюоресценции при помощи спектрофлюориметра Fluoroscan Accent (480/535 нм). Флюоресценция линейно зависела от числа прикрепившихся клеток. При изучении влияния индукторов на адгезию, стимуляцию клеток индукторами производили в течение суток.

Связывание меченого биотином CRP с ТК линии НМС-1 оценивали проточной цитометрией по флюоресценции, с помощью стрептавидина, меченого аллофико-цианином (АРС). В экспериментах по конкуренции одновременно с меченым биотином CRP к клеткам добавляли немеченный CRP или агрегированный IgG человека (algG, полученный нагреванием раствора IgG при 63 °С в течение 10 мин.), или антитела к Fcy-рецепторам в различных концентрациях.

Трансфекцию клеток НМС-1 и COL0320HSR проводили двумя плазмидами: 1) плазмидой pNF-KBluc, содержащей ген люциферазы (lue) с промотором, содержащим пять цис-сайтов для белков NF-kB; 2) плазмидой pCMVL с геном ß-галактозидазы под промотором цитомегаловируса (CMV) человека. Клетки активи-

ровали исследуемыми веществами через сутки после трансфекции, ответ оценивали по активности люциферазы или (3-галактозидазы.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Результаты цитометрического учета анализировали при помощи пакетов программ Kaluza («Beckman Coulter Inc.», США). Различия между независимыми

группами нормально распределённых данных оценивали с помощью парного критерия Стьюдента и считали статистически достоверными при р<0,05.

Исследование экспрессии F су-рецепторов клетками исследуемых линий. Результаты показали, что ТК линии НМС-1 экспрессируют Fcy-рецепторы II типа — CD32. В меньшей степени на поверхности ТК представлены высокоаффинные Fcy-рецепторы I типа — CD64. Низкоаффинные Fcy-рецепторы 111 типа (CD 16) на ТК линии НМС-1 отсутствуют (рис. I).

Под действием IFNy на ТК клетках линии НМС-1 усиливалась экспрессия CD64 с максимумом через 24 ч. На экспрессию низкоаффинных рецепторов клетками НМС-1 стимуляция IFNy не влияла (рис. 2). а. б. в.

Рис. 1. Экспрессия клетками линии НМС-1 Рсу-рецепторов II типа(С032). а. экспрессия СЭ16 клетками НМС-1; б. экспрессия С032 клетками и-937; в. экспрессия СЭ64 клетками ЕА.11у92б. Серым цветом обозначен уровень связывания клеток с антителами изотопического контроля, черным — связывания антител против Рсу-рецепторов II типа. По оси абсцисс уровень флюоресценции, в Яри (относительных единицах флуоресценции), по оси ординат — процент от общего числа проанализированных клеток.

В результате наших экспериментов по изучению экспрессии Рсу-рецепторов клетками исследуемых линий мы получили следующие данные (табл. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

CD 16 НМС-1

CD32 НМС-

CD64 НМС-1

Ч

Как известно из литературы, интактные ТК человека, полученные культивированием С034"-клеток, выделенных из крови, несут на себе главным образом СЭ32, а в цитоплазме содержат следовые количества мРНК СЭ64 (РсуИЛ) и С016 (FcyR.HI). При стимуляции 1РТч1у они начинали экспрессировать высокоаффинный Рсу-рецептор 1 типа (РсуМ, С064), хотя экспрессия низкоаффинных рецепторов при этом не усиливалась (Окауата й а1., 2000).

б.

С »16

сп32

сом

I \

Рис. 2. Влияние 1РКу на экспрессию Рсу-рецепторов клетками НМС-1. а. Экспрессия FcyR.HI (С016); б. Экспрессия РсуЯП (СЭ32); в. Экспрессия РсуЯ! (С064). Серым цветом обозначено связывание антител против соответствующих Рсу-рецепторов с интактными клетками, черным — с клетками, активированными По оси абсцисс - уровень флюоресценции (ЯР11), по оси ординат — процент от общего числа проанализированных клеток.

Таблица 1

Экспрессия исследуемыми клеточными линиями Рсу-рецепторов

Линия клеток РсуШН(СВ16) РсуШ! (СБ32) РсуЮ (С 064)

НМС-1 - +++ +

ТНР-1 - ++ ±

11-937 - ++ ±

ЕА.11у926 - + -

Фибробласты - - -

соьозгошя -

Примечание. * — Орлов и др., 2002; Ьэакоу е1 а1., 2002.

Нами показано, что интактные ТК линии НМС-1 несут на себе не только СЭ32, но и небольшое количество С064, причем при стимуляции 1РЫу экспрессия С064 также усиливается (табл. 1).

Из литературы известно, что ТК кожи и легких человека экспрессируют только CD32a (активационный) (Zhao et al., 2006), тогда как ингибирующий рецептор CD32b, возможно, отсутствует на ТК человека, в отличие от базофилов крови. На ТК мышей, напротив, CD32b экспрессируется, причем воздействие на него лиганда генерирует ингибиторный сигнал, в результате чего ингибируется ответ ТК и на агрегацию FcsRI (высокоаффинного рецептора для IgE) (Daeron et al., 1995). В некоторых работах показано, что FcyR II типа (CD32) — единственный Fcy-рецептор, который экспрессируют ТК линии НМС-1 (Wedi et al., 1996).

Связывание С-реактнвного белка с тучными клетками линии НМС-1. Наши данные показали, что CRP взаимодействует с ТК. Разрешающая способность проточной цитометрии при использовании аллофикоцианина в качестве флюоресцирующего агента позволяла регистрировать связывания CRP с клетками, начиная с концентрации 10 мкг/мл (рис. 3). Результаты опытов по конкуренции за связывание с ТК НМС-1 биотинилированного и немеченого CRP свидетельствуют о специфичности связывания CRP (рис. За). Одновременная инкубация ТК линии НМС-1 с биотинили-рованным CRP и algG также приводила к зависимому от концентрации algG снижению флюоресценции клеток (рис. 36). Антитела к FcyR также снижали связывание CRP с клетками НМС-1 (рис. Зв).

а. б. в.

Рис. 3. Оценка специфичности связывания CRP с тучными клетками НМС-1. Ингибиция связывания меченого биотином CRP возрастающими концентрациями не-меченного CRP (а) и агрегированного IgG человека (б), а также моноклонапьными антителами к Fc-рецепторам I (CD64) и II типа (CD32).

По оси абсцисс — концентрация немеченого CRP (а) или algG (б), мкг/мл; наименование антител (в): К - изотопический контроль, CD64 и CD32 - антитела к соответствующим рецепторам. По оси ординат — уровень флюоресценции клеток, RFU (условные единицы интенсивности флуоресценции).

Как показали наши данные, CRP в концентрациях от 0,03 до 30 мкг/мл не влиял на выход гистамина из клеток НМС-1.

Иная картина наблюдалась при изучении влияния CRP на выброс гистамина из ТК НМС-1, стимулированных IFNy. В исследованных концентрациях CRP наблюдалось увеличение выхода гистамина по сравнению с контролем (рис. 4).

Из литературы известно, что стимуляция ТК человека через FcyRII IgG не приводит к дегрануляции и не влияет на ответ ТК на анти-IgE (Wedi et а!., 1996; Guo et al., 1992; Okayama et al., 2001). В то же время, есть данные и о стимулирующем действии агрегированного IgG и CRP на ТК человека линии НМС-1. Так, в исследовании А.П. Прониной оба лиганда индуцировали дегрануляцию клеток НМС-1 и выход гистамина, при этом эффект CRP был, хотя и умеренным по интенсивности, но достоверным, тогда как эффект algG — достаточно выраженным (Пронина, 2011). На ТК клетках мышей также показана дегрануляция при стимуляции FcyRII IgG.

D НМС-1: К 13 НМС-1: IFNy

НЕ"

- ■ ■ ¡1111 _-xJ --Л —

I

К 48/8 0 0,03 0,3 3 30

Рис. 4. Влияниие CRP на выход гистамина из тучных клеток НМС-1. Зависимость от IFNy

Клетки НМС-1 инкубировали 24 ч с 15 нг/мл IFNy (столбцы серого цвета) или без IFNy (белые столбцы), после чего стимулировали CRP в указанных концентрациях. По оси абсцисс: К - ЗФР (негативный контроль), 48/80 - соединение 48/80 (20 мкг/мл; позитивный контроль), цифры — концентрация CRP (мкг/мл). По оси ординат — индекс стимуляции (отношение выхода гистамина к негативному контролю). Уровень спонтанного выхода гистамина—без обработки IFNy составлял 0,220+0,01, после обработки IFNy - 0,195±0,02 (р<0,05). Достоверность различий с контролем (К): * — р<0,05, ** — р<0,01, *** — р<0,001.

Т.о., в норме FcyRlI является единственным рецептором к иммуноглобулину IgG на ТК человека, причем стимуляция ТК IgG либо совсем не вызывает дегрануляции, либо вызывает её в малой степени. В то же время показано, что после стимуляции IFNy ТК начинают экспрессировать на своей поверхности FcyRI и приобретают способность отвечать на IgG (Woolhiser et al., 2001).

Наши данные не противоречат этому. Так, интактные клетки НМС-1 не отвечали на добавление в среду CRP достоверным выходом гистамина. Но если ТК были предварительно активированы IFNy, это приводило не только к повышению экспрессии высокоаффинных рецепторов FcyRI на их поверхности), но и к выходу гистамина в ответ на стимуляцию CRP. По данным литературы, концентрация algG, при которой степень дегрануляции ТК максимальна, — 1 мкг/мл (Woolhiser et al., 2004). В наших экспериментах, наибольший выход гистамина наблюдался при стимуляции CRP в концентрации 3 мкг/мл, то есть при концентрации CRP того же порядка.

Влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам. Результаты наших исследований показали, что при увеличении продолжительности совместной инкубации тучных клеток и фибробластов (в пределах от 20 до 50 мин) адгезия ТК к Фб возрастала. При совместной инкубации ТК и Фб добавление в среду 50 мкг/мл CRP приводило к дополнительному увеличению интенсивности адгезии. При 30-минутной совместной инкубации клеток в присутствии CRP различие с адгезией контрольных клеток было максимальным (рис. 5).

Рис. 5. Адгезия тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам при культивировании смеси клеток в присутствии С-реактивного белка. Зависимость от времени

Белые столбики — спонтанная адгезия тучных клеток к Фб. Серые — адгезия в присутствии CRP, 50 мкг/мл. Достоверность различий с контролем: * — р<0,05, *** — р<0,001.

□ к в crp

"X —

20 минут 30 минут 40 минут 50 минут

Влияние лигандов Fcy-рецепторов (С-реактивного белка, агрегированного IgG) на адгезивность тучных клеток НМС-1. Наши опыты показали (рис. 6), что 24-часовая стимуляция тучных клеток CRP приводит к достоверному и дозозависимому увеличению адгезии тучных клеток к монослою интактных фибробластов. Стимуляция algG также приводила к более интенсивной адгезии тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам.

Рис. б. Адгезия активированных тучных клеток НМС-1 к интактным фибробластам.

По оси абсцисс — активаторы тучных клеток и их концентрация, по оси ординат— индекс стимуляции. Различия с контролем достоверны: **— р<0,01; *** — р<0,001.

Из литературных данных известно, что для С-реактивного белка характерно проявление провоспалительной активности [Назаров, 2001], в частности известно, что он усиливает моноцитарно-эндотелиальную адгезию, увеличивает уровень экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелиальных клетках [Devaraj et al., 2008]. Кроме того, показано, что агрегация Fcy-рецепторов на поверхности мышиных тучных клеток приводит к усилению их адгезии к фибронектину [Dastych et al., 1997].

Влияние С-реактивного белка на адгезивность фнбробластов для тучных клеток линии НМС-1. Несмотря на отсутствие на фибробластах Fc-рецепторов (табл. 1, раздел «Экспрессия Fcy-рецепторов на фибробластах»), прединкубация монослоя Фб с различными концентрациями CRP приводила к дозозависимому увеличению степени адгезии к ним интактных ТК линии НМС-1 (рис. 7а).

В отличие от эффекта CRP, после инкубации монослоя Фб с algG в концентрациях 10 и 50 мкг/мл достоверного увеличения степени адгезии к ним ТК не происходило (р>0,05) (рис. 76). Другой пентраксин, сывороточный Р-компонент амилоида (SAP), который, как известно из литературы, также связывается с FcyR, в концентра-

ции 30 мкг/мл, также оказывал стимулирующее действие на Фб и вызывал увеличение адгезии на 40 % по сравнению с контролем (рис. 76).

Как показали наши опыты, при стимуляции фибробластов С-реактивным белком все же происходит некоторое усиление адгезии к ним тучных клеток (рис. 7а) несмотря на отсутствие на фибробластах рецепторов к CRP (то есть Fcy-рецепторов). Как известно, растущие в культуре фибробласты продуцируют белки матрикса, в том числе фибронектин и ламинин, с которыми на молекуле CRP имеются сайты связывания (Saionen et al., 1984). Pia обратной же стороне молекулы CRP находятся сайты связывания с Fcy-рецепторами (Marnell et al., 2005). а. б.

1.35 1.25 1,15 1,05 0,95 0,85 0,75

в

СИ', 5 мкг/мл

CRP, 10 мкг/мл

CRP, 50 мкг/мл

1,55 -

1,45--—р-

1.35--Г-ТГ

1,15 " - Г 1

1,05--" 1

0,95 11 " I *

К algG.10 algG, 50 SAP, 30

мкг/мл мкг/мл мкг/мл

1 III

- ± - т -

Рис. 7. Адгезия тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам, обработанным CRP, algG или сывороточным Р-компонентом амилоида.

По оси ординат— индекс стимуляции. Различия с контролем достоверны: * — р<0,05, ***— р<0,001.

В связи с этим мы предположили, что в случае прединкубации фибробластов с CRP этот пентраксин может способствовать их адгезии с ТК не прямо, т.е. не путем непосредственного связывания с Фб и их активации, а косвенно — связываясь с компонентами межклеточного матрикса (фибронектином и другими белками). Когда же происходит добавление ТК, то они в свою очередь связываются своими FcyR с CRP, ассоциированным с матриксом, и таким образом происходит усиление адгезии.

Для проверки данного предположения был произведен следующий эксперимент. Мы произвели обработку монослоя Фб CRP в концентрации 50 мкг/мл. На следующий день произвели отмывку Фб для удаления несвязавшегося белка. ТК перед добавлением к фибробластам обработали Fc-фрагментами IgG человека, чтобы «блокировать» на

них FcyR. Контролем служили необработанные ТК. После отмывки от несвязавшегося Fc-фрагментов ТК добавили к Фб.

Адгезия ТК с заблокированными FcyR не отличалась от контроля, то есть от адгезии ТК с интактным Фб, не обработанным CRP, и была достоверно ниже адгезии ТК, не обработанных Fc-фрагментами (рис. 9). Т.о., было подтверждено предположение, что С-реактивный белок не активизирует фибробласты, а является якорем для тучных клеток в матриксе соединительной ткани.

Рис. 9. Адгезия тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам, активированным CRP. Роль Fcy-рецепторов клеток НМС-1

Из наших данных видно, что CRP и algG, действуя через одни и те же рецепторы— FcyR I и II типов (Crowell et al., 1991; Bharadwaj et al., 1999), вызывают у клеток однонаправленный ответ (табл. 2). Также стоит отметить, что для CD32 (FcyR 11) в большей степени характерно взаимодействие с IgG в виде иммунных комплексов (Gessner et al., 1998), нежели с отдельными молекулами IgG. Результаты наших экспериментов также показали стимулирующее влияние algG на адгезию клеток. Т.о., можно сделать заключение, что активация FcyRIl приводит к запуску сигнального каскада, результатом которого является активация генов, отвечающих за адгезию клеток друг к другу или к белкам матрикса соединительной ткани. Подобное действие CRP, в частности, было показано на эндотелиальных клетках, выделенных из аорты (D. Bharadwaj et al, 1999). Кроме того, авторы показали, что при выключении гена CD32 при помощи siRNA происходит снижение адгезивных свойств клеток эндотелия относительно ин-тактных клеток, обработанных CRP. Такого же эффекта авторы достигали при добавлении в среду к эндотелиальным клеткам блокирующих антител против CD32.

Для проверки активации NF-кВ-сигнального пути при действии на ТК CRP, мы трасфецировапи ТК плазмидой, содержащей ген люциферазы под промотором, содержащим сайты связывания с белками NF-кВ. Т.о., при активации белков NF-кВ в клет ках начинала накапливаться люцифераза. активность которой можно измерить при помощи люминометра. Наши данные показали, что ТК НМС-1, трансфецированные

Таблица 2

Влияние С-реактивного белка и агрегированного ^С на адгезию клеток исследуемых линий (степень усиления по сравнению с контролем, %)

Взаимодействующие клетки Препарат А ±ni t Р

Обработаны лигандом FcyR Не обработаны CRP algG

% п % п

НМС-1 Фб 54±7 18 58±4 14 4±8 0,5 >0,05

EA.hy926 НМС-1 83±И 87 43±12 66 40±16 2,5 <0,05

EA.hy926 ТНР-1 78±14 66 200±32 50 122±35 3,5 <0,01

U-937 Фб 26±4 30 56±7 30 30±8 3,75 <0,01

Примечание. CRP и algG использованы в концентрации 50 мкг/мл. Контроль —

уровень адгезии при использовании соответствующей пары необработанных клеток.

плазмидой pNF-KBluc, реагировали на стимуляцию CRP синтезом люциферазы: люминесценция в клетках, стимулированных CRP, увеличивалась на 40 % по сравнению с контрольными.

В контрольных опытах клетки COL0320HSR, не экспрессирующие на своей поверхности Fcy-рецепторы, не реагировали на добавление в среду CRP или algG ни при одной из исследованных концентраций.

ВЫВОДЫ

1. На тучных клетках HMC-I, моноцитоподобных клетках ТНР-1 и U-937, на эндоте-лиальных клетках EA.hy926 экспрессируются Fc-рецепторы второго типа к IgG (FcyRII, CD32). Экспрессия высокоаффинных Fc-рецепторов первого типа (FcyRI, CD64) на тучных клетках усиливается под влиянием IFNy. На фибробластах и клетках карциномы толстой кишки COL0320HSR Fcy-рецепторы не экспрессируются.

2. Низкоаффинные Fc-рецепторы к иммуноглобулину класса IgG (FcyRII) служат рецепторами для С-реактивного белка на эндотелиальных клетках EA.hy926 и на тучных клетках НМС-1.

3. Интактные тучные клетки линии НМС-1 не отвечают на стимуляцию С-реактивным белком выходом гистамина. Способность к дегрануляции и выбросу гистамина в ответ

на С-реактивный белок требует экспрессии высокоаффинных рецепторов FcyRI и наблюдается после активации IFNy.

4. С-реактивный белок и другие лиганды Fcy-рецепторов - агрегированный IgG и сывороточный Р-компонент амилоида усиливают адгезию клеток дуг к другу: стимулируют адгезию тучных клеток и моноцитов к фибробластам, усиливают адгезивные свойства эндотелиальных клеток для тучных клеток и моноцитов, повышают адгезив-ность фибробластов.

5. При действии С-реактивного белка на клетки, несущие FcyRII, происходит активация NF-кВ-сигнального пути.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи (в т.ч. опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ):

1. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fc-gamma receptormediated effects on human peripheral blood basophils in vitro / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // C-Reactive Protein: New Research / Ed. S. Nagasawa. - New York: Nova Science Publishers, 2009. - P. 147-169.

2. Трулёв, A.C. Факторы острой фазы воспаления как модуляторы взаимодействия тучных клеток и фибробластов / A.C. Трулёв, И.В. Кудрявцев, П.Г. Назаров // Бюлл. Восточно-Сибирск. Научн. Центра СО РАМН. - 2012. - № 3 (85). - Ч. 2. - С. 319-322.

3. Трулев, A.C. Влияние факторов острой фазы воспаления на взаимодействие тучных

клеток с соединительной тканью. Взаимодействие тучных клеток человека линии НМС-1 с фибробластами / A.C. Трулев, H.A. Иванова, П.Г. Назаров // Росс, аллер-гол. журн.-2012.-№ 1. — Вып. 1.-С. 313-315.

4. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fe receptor-mediated effects on human peripheral blood basophils / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Basophil Granulocytes / Ed. P.K. Vellis. -New York: Nova Science Publishers, 2009. -P. 95-121.

5. Трулев A.C. Базофилы человека: регрануляция и повторная активация в культуре in vitro / А. С. Трулев, П.Г. Назаров // Астраханск. мед. журн. - 2008. - № 3. - С. 135137.

Тезисы:

6. Трулев, A.C. Индукция программируемой клеточной гибели мономерной формой С-

реактивного белка / A.A. Бутюгов, A.C. Трулев, П.Г. Назаров // Rus. J. Immunol. -2004. - Vol. 9. - N 1. - P. 290.

7. Трулев, A.C. Пентраксины, пептиды, противовоспалительные средства / П.Г. Назаров, A.A. Бутюгов, А.П. Пронина, A.C. Трулев // Russ. J. Immunol. — 2006. - Vol. 9. -Suppl. 3.-C. 129.

8. Трулев, A.C. Пентраксины и нейромедиаторы / П.Г. Назаров, Г.И. Нежинская, A.A.

Бутюгов, A.C. Трулев//Мед. иммунол. - 2006.-Т. 8. —№ 2-3. - С. 161.

9. Trulioff, A.S. Cholinergic regulation of anaphylaxis. The parasympathetic and autono-

mous mechanisms / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Abstr. Int. Symp. «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». - 2007. — P. 54-55.

10. Трулев, А.С. Активация пентраксинами фактора NF-kB в клетках COL0320HSR, лишенных Fcy-рецепторов / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров//Мед. иммунол. - 2007. -Т. 9, № 2-3. - С. 166-167.

11. Трулев, А.С. Fc gammaR-независимая активация фактора NF-kB пентраксином / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс, аллергол. журн.

- 2007. - № 3, прилож. 1. - С. 36.

12. Trulioff, A.S. Fc gammaR-independent NF-kB activation by a pentraxin / A.S. Trulioff, S.V. Orlov, A.P. Perevozchikov, P.G. Nazarov // Abstr. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Immunology and viral infection. Moscow, Sept. 1014, 2007.-P. 58.

13. Трулев, А.С. Активация базофилов крови лигандами Fcy-рецепторов и ее холинер-гическая модуляция / А.П. Пронина, П.Г. Назаров, А.С. Трулев // Сибирск. мед. журн.-2008.-Т. 23.-№3,-Вып. 1.-С. 108.

14. Trulioff, A.S. Activation of human blood basophils by Fc gamma receptor-specific lig-ands and its cholinergic modulation / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Asian J. Pharmacodyn. Pharmacokin. -2008. - Vol. 8. -№ 3. - P. 184.

15. Трулев, А.С. Роль Fc gamma-рецепторов в реализации биологического действия пентраксинов на клетки нелимфоидного происхождения / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс, аллергол. журн. - 2008. - №1, прил.1. -С.295-296.

16. Трулев, А.С. Способность базофилов крови человека к повторной дегрануляции и выбросу гистамина / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Цитокины и воспаление. — 2008. — Т. 7. -№ 3. - С. 67-68.

17. Трулев, А.С. Новые данные о роли Fcy-рецепторов в физиологии базофилов человека / П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С.Трулев // Аллергол. иммунол. - 2008. - Т. 9.

- № 4. - С. 486-487.

18. Trulioff, A.S. A role of cholinergic system of blood basophilic leukocytes in regulation of spontaneous and Fc-gamma-receptor-induced histamine release / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff [et al.] // Abstr. 2nd Int. symp. "Interaction of the nervous and immune systems in health and disease", June 16- 19 2009. St. Petersburg, 2009. - P. 42-43.

19. Трулев, А.С. Пентраксины в защитных реакциях и процессах иммунорегуляции / П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С. Трулев, [и др.] // Мед. иммунол. - 2009. - Т. 11, № 4. - С. 326-327.

20. Трулев, А.С. Сравнительный анализ влияния С-реактивного белка и агрегированного IgG на адгезивность клеток эндотелия для моноцитов / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Вестн. Уральск, акад. мед. науки. — 2010. - 2/1 (29). - С. 212.

21. Трулев, А.С. Связывание С-реактивного белка с эндотелиальными клетками EA.hy 926 / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Мед. иммунол. - 2011. - Т. 13. - № 4-5. - С. 337338.

22. Трулев, А.С. Автономная холинергическая система: пермиссивная роль в регуляции рецепторных функций тучных клеток / П.Г. Назаров, Н.А. Иванова, А.С. Трулев [и др.] // Росс, аллергол. жур. -2013. -№ 2.-ч. 2. - С. 207-208.

23. Trulioff, A.S. Autonomous cholinergic system of mast cells: a role in the modulation of cell-cell contacts / P.G. Nazarov, N.A. Ivanova, A.S. Trulioff// «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии»: Тезисы IV Международного симпозиума. Санкт-Петербург, 18июня —21 июня 2013 г.-С. 125-126.

Подписано в печать 09.10.2013г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1 Уч.-изд.л 1 . Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13484 от 09.10.2013г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трулёв, Андрей Сергеевич, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201364779

ТРУЛЁВ Андрей Сергеевич

Роль Жсу-рецепторов в реализации биологического действия С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 - патологическая физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор П.Г. Назаров доктор биологических наук профессор А.П. Перевозчиков

Санкт-Петербург 2013

Содержание

Список использованных сокращений..................................................... 6

Введение............................................................................................ 9

1. Литературный обзор.......................................................................... 14

1.1. Тучные клетки................................................................................. 14

1.1.1. Общая информация....................................................................... 14

1.1.2. Роль тучных клеток в защите организма............................................ 18

1.1.3.Взаимодействие тучных клеток с матриксом соединительной ткани... 23 1.1 АВзаимодействие тучных клеток с фибробластами.................................. 26

1.2. Пентраксины: структура — свойства, лиганды, роль в защите организма................................................................................................................ 29

1.2.1. С-реактивный белок.......................................................................... 30

1.2.2. Рецепторы для С-реактивного белка................................................. 32

1.3. Бсу-рецепторы................................................................................. 34

1.3.1. Структура, классы, распространение на клетках, функции.................. 34

1.3.2. Бсу-рецепторы на тучных клетках................................................... 37

2. Материалы и методы............................................................................ 38

2.1 Культуры клеток.................................................................................. 38

2.1.1. Тучные клетки линии НМС-1 ........................................................ 38

2.1.2. Фибробласты человека................................................................... 39

2.1.3. Клетки линии ТНР-1 ..................................................................... 39

2.1.4. Клеточная линия 11-937 ................................................................ 41

2.1.5. Клеточная линия ЕА.11у926 ............................................................... 41

2.1.6. Клеточная линия СОШ320Н8Я.......................................................... 43

2.2. Приготовление и окраска мазков клеток...................................... 43

2.3. Оценка токсического эффекта исследуемых препаратов на клетки ТНР-1, И-937 и НМС-1............................................................................. 44

2.4. Проточная цитометрия.................................................................... 45

2.5. Оценка активации тучных клеток линии НМС-1............................. 47

2.5.1. Стимуляция тучных клеток................................................................. 47

2.5.2. Оценка активации по экспрессии на клетках молекул СБ63 и СБ203с.................................................................................................... 47

2.5.3. Оценка активации по выходу гистамина из тучных клеток, методом Шора........................................................................................................... 48

2.6. Оценка адгезии клеток друг к другу....................................................... 48

2.6.1. Оценка адгезии при помощи спектрофлюориметра............................ 49

2.6.2. Оценка адгезии клеток при помощи методов проточной цитометрии 50

2.6.3. Оценка адгезии клеток и-937 по активности миелопероксидазы..... 52

2.7. Связывание С-реактивного белка с клетками........................................ 52

2.7.1. Мечение С-реактивного белка биотином.............................................. 52

2.7.2. Связывание С-реактивного белка с клетками эндотелия линии ЕА.Ьу926....................................................................................................... 53

2.7.3. Связывание С-реактивного белка с тучными клетками линии НМС-1 54

2.8. Трансфекция................................................................................... 55

2.8.1. Выделение плазмидной ДНК........................................................... 55

2.8.2. Трансфекция клеток.............................................................................. 56

2.9. Статистическая обработка..................................................................... 57

3. Результаты.............................................................................................. 58

3.1. Исследование токсического эффекта различных доз препаратов С-реактивного белка и агрегированного человека на клетки перевиваемых линий ТНР-1, И-937 и НМС-1................................................... 58

3.2. Экспрессия Бсу-рецепторов на клетках исследуемых линий................ 59

3.2.1. Экспрессия Бсу-рецепторов на фибробластах........................................ 59

3.2.2. Экспрессия Бсу-рецепторов на клетках линии СОЬ0320Н8К............. 59

3.2.3. Экспрессия Рсу-рецепторов на эндотелиальных клетках линии ЕА.Ьу926 ................................................................................................ 60

3.2.4. Экспрессия Рсу-рецепторов на моноцитоподобных клетках линий ТНР-1 и и-937 .......................................................................................... 61

3.2.5. Экспрессия Рсу-рецепторов на тучных клетках линии НМС-1............................................................................................. 62

3.2.5.1. Влияние 1БЫу на экспрессию Б су-рецепторов тучными клетками

линии НМС-1 ...................................................................................... 63

3.3.Связывание С-реактивного белка с клетками........................................... 65

3.3.1. Связывание С-реактивного белка с эндотелиальными клетками линии ЕА.Ьу926........................................................................................ 65

3.3.2. вязывание С-реактивного белка с тучными клетками линии НМС-1 68

3.4. Влияние С-реактивного белка на дегрануляцию тучных клеток линии НМС-1 ................................................................................................ 72

3.5. Влияние лигандов Бсу-рецепторов (С-реактивного белка, агрегированного 1§0) на адгезивность клеток.............................................. 73

3.5.1. Влияние С-реактивного белка и агрегированного на адгезивные свойства тучных клеток линии НМС-1.......................................................... 73

3.5.2. Влияние С-реактивного белка на адгезивность фибробластов для тучных клеток линии НМС-1 и моноцитов линии ТНР-1...................... 78

3.5.3. Влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам в его присутствии..................................................... 87

3.5.4. Влияние С-реактивного белка на адгезивность эндотелиальных клеток линии ЕА.Ьу926 для тучных клеток линии НМС-1.......................... 89

3.5.5. Влияние С-реактивного белка на адгезивность эндотелиальных клеток линии ЕА.Ьу926 для моноцитов линии ТНР-1.............................. 90

3.5.6. Влияние С-реактивного белка на адгезивность моноцитов линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам линии ЕА.Ьу926 в присутствии С-реактивного белка..................................................................................... 92

3.5.7. Влияние С-реактивного белка на адгезию моноцитов линии Ц-937 к фибробластам......................................................................................... 94

3.6. Влияние С-реактивного белка на активацию транскрипционного фактора ОТ-кВ......................................................................................... 96

3.6.1. Влияние С-реактивного белка на активацию ОТ-кВ в тучных клетках линии НМС-1............................................................................ 97

3.6.2. Влияние С-реактивного белка на активацию ОТкВ в клетках

нелимфоидного происхождения................................................................ 98

4. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................. 102

5. ВЫВОДЫ.................................................................................... 119

Список использованной литературы........................................................ 120

Список использованных сокращений

48/80 — соединение 48/80, либератор гистамина

АПК — антиген-презентирующая клетка

БСА — бычий сывороточный альбумин

ЗФР — забуференный фосфатами физиологический раствор

кД — килодальтон

МАК — мембраноатакующий комплекс

ОФА — орто-фталевый альдегид

ТК — тучные клетки

Фб — фибробласты

ФХ — фосфорилхолин

ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка

А23187 — кальциевый ионофор

algG — агрегированный иммуноглобулин

АРС — аллофикоцианин

С1 q — белок системы комплемента С1 q

СЗа — белок системы комплемента СЗа

С5а — белок системы комплемента С5а

CADM1 — молекула адгезии иммуноглобулинового суперсемейства

(также SgIGSF)

CXCL — лиганд хемокинового рецептора CXCR

CD — кластер дифференцировки

CFSE — сукциниловый эфир карбоксифлюоресцеина

CMV — цитомегаловирус

CRP — С-реактивный белок

СТМС — соединительнотранные тучные клетки

FcyR — рецепторы к Fc-фрагментам иммуноглобулинов (класса G)

FceR — рецепторы к Fc-фрагментам иммуноглобулинов (класса Е)

FITC — флюоресцеина изотиоцианат

G-CSF — гранулоцитарный колониеобразующий фактор

вМ-СБЕ

НАТ

НМС-1 1САМ-1

№

1кВ

1кКБ

1Ь

1ТАМ

1Т1М

К1Т ЬРБ

МАс1САМ-1

МАРК

МСР-1

МСс

МСтс

МСТ

МНС

МПМа

ММС

ОТ-кВ

ЫРХ-1, 2

РА1-1

— гранулоцитарно-макрофагальный колониеобразующий фактор

— гипоксантин, аминоптерин, тимидин (добавка для культуральных сред)

— лейкозная/опухолевая линия тучных клеток человека

— молекула межклеточной адгезии 1 типа

— интерферон

— иммуноглобулин Е

— иммуноглобулин в

— ингибиторы ОТ-кВ

— киназы ингибиторов ОТ-кВ

— интерлейкин

— иммунорецепторный тирозин-содержащий активационный мотив

— иммунорецепторный тирозин-содержащий ингибиторный мотив

— рецептор ростового фактора стволовых клеток

— липополисахарид

— молекула адгезии эндотелия (мукозный адрессин)

— митогенактивируемая протеинкиназа

— хемотактический белок макрофагов

— химаза-положительные тучные клетки

— триптазо-химаза-положительные тучные клетки

— триптаза-положительные тучные клетки

— главный комплекс гистосовместимости

— воспалительный белок макрофагов

— тучные клетки слизистых

— ядерный фактор кВ

— нейрональный пентраксин 1, 2

— ингибитор-1 активатора плазминогена

PE — фикоэритрин

PMA — форболмиристиловый эфир уксусной кислоты

RFU — относительные единицы флюоресценции (relative fluorescence units)

RLU — относительные единицы свечения (relative luminescence units)

SAP — сывороточный Р-компонент амилоида (serum amyloid P-

component)

SCF — фактор стволовых клеток

SD S — додецил сульфат натрия

TGFß — трансформирующий ростовой фактор ß

Thl, 2 — Т хелперы первого/второго типа

TLR — Toll -подобные рецепторы

TNF — фактор некроза опухоли

TSG-14 —TNF-индуцируемый ген 14

VCAM-1 — молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа

VEGF — эндотелиальный фактор роста сосудов

VLA — очень поздние антигены (молекулы межклеточной адгезии)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. С-реактивный белок принадлежит к семейству пентраксинов, является белком острой фазы. Отличительная черта С-реактивного белка — возможность быстрого, многократного увеличения его концентрации в сыворотке крови при развитии воспаления любой природы и локализации. С-реактивный белок играет важную роль в защите организма. В системе врожденного иммунитета пентраксины играют роль растворимых распознающих белков, сходную с ролью иммуноглобулинов: С-реактивный белок способен опсонизировать бактерии, связываясь с компонентами некротизированных или апоптотических клеток, способствуют их фагоцитозу, тем самым препятствует их накоплению в тканях и развитию аутоиммунных реакций (Du Clos T.W., 1991). При системной красной волчанке имеется некоторая недостаточность продукции С-реактивного белка, а у мышей с нокаутом гена пентраксина (SAP) развивается спонтанный аутоиммунный процесс против компонентов ядер клеток, что указывает на возможную сдерживающую роль пентраксинов в предотвращении аутоиммунитета (Du Clos T.W., Mold С., 2011). До сих пор не описан дефицит С-реактивного белка, связанный с естественной делецией гена или его части. Отсутствие дефицита С-реактивного белка и то, что белок филогенетически консервативен по аминокислотной последовательности, третичной структуре и лиганд-связывающей специфичности, указывает на то, что С-реактивный белок был необходим для выживания (Назаров П.Г., 2010). Кроме того, известно, что С-реактивный белок способен активировать синтез цитокинов в клетках.

С-реактивный белок обладает не только защитными функциями во врожденном иммунитете, но и участвует в патогенезе таких распространенных заболеваний человека, как сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и различные фибротические нарушения. На ранних этапах (в острой фазе) воспаления С-реактивный белок провляет провоспалительную активность, в более поздние сроки - противовоспалительную.

Тучные клетки (ТК) являются мультифункциональными клетками иммунной системы и играют важную роль в защите организма, в частности, в

таких процессах как фиброз, ангиогенез, перестройка тканей и заживление ран, взаимодействия хозяин-паразит (Быков B.JL, 1999). По ряду признаков ТК близки к базофилам крови, например, они экспрессируют на своей поверхности высокоаффинный рецептор к IgE и содержат в гранулах вазоактивные вещества. Но, в отличие от базофилов и других клеток кровяного происхождения, ТК являются резидентами соединительной ткани и обычно не обнаруживаются в кровяном русле, а располагаются, как правило, в соединительной ткани субэпителиального пространства в коже, легких, по ходу желудочно-кишечного тракта. В ответ на различные стимулы запускается процесс дегрануляции ТК, что способствует запуску процессов воспаления.

Фибробласты (Фб) являются резидентными клетками соединительной ткани. Они создают микроокружение для тучных клеток, для их созревания и функционирования, таким образом, тучные клетки находятся в постоянном контакте с фибробластами и компонентами межклеточного матрикса. Активация тучных клеток необходима для запуска воспалительных реакций в соединительной ткани. Под действием медиаторов тучных клеток повышается проницаемость локальных сосудов, что приводит к увеличению температуры локуса воспаления, покраснению и отёку, что вместе с болью (которая инициируется, в том числе в результате активности тучных клеток) формирует четыре основных признака воспаления (Krishnaswamy, 2010; Rivas, 2010). Кроме того, при воспалении ТК повышают количество контактов с фибробластами, а секретируемые клетками медиаторы влияют на их активность. ТК продуцируют большое количество биологически активных веществ, которые играют как про-, так и противовоспалительную роль. Большинство цитокинов, синтезируемых ТК, оказывает комплексное воздействие на фибробласты: влияют на их пролиферативную активность, на экспрессию на фибробластах рецепторов гистамина, серотонина, TNF, а также на выброс фибробластами хемокинов CCL8, CCL13, CXCL4 и CXCL6 (Müller et al., 2011).

В настоящее время достаточно хорошо изучена провоспалительная активность тучных клеток на стадии инициации воспаления, и репаративная

активность фибробластов на продуктивной стадии воспаление. В то же время данных о кооперации этих клеток в острой фазе воспаления, в том числе данных о роли в этом взаимодействии белков острой фазы крайне мало. Остается спорным вопрос о клеточном рецепторе, через который реализуется действие С-реактивного белка на клетки соединительной ткани. Изучению данной проблемы и посвящена наша работа.

Цель работы. Изучить влияние С-реактивного белка на взаимодействие иммунокомпетентых клеток (тучных клеток, моноцитов) с фибробластами и эндотелиальными клетками, а также оценить роль Fcy-рецепторов в реализации действия С-реактивного белка на клетки. Решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию Fcy-рецепторов на тучных клетках линии НМС-1, моноцитоподобных клетках линий ТНР-1 hU-937, фибробластах, эндотелиальных клетках EA.hy926.

2. Определить рецепторы для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1 и эндотелиальных клетках EA.hy926.

3. Изучить способность С-реактивного белка вызывать выход гистамина из тучных клеток линии НМС-1.

4. Определить влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток и моноцитов к клеткам эндотелия и фибробластам.

5. Изучить роль Fcy-рецепторов в активации NF-кВ-сигнального пути при действии С-реактивного белка на клетки.

Научная новизна работы. Показано, что рецепторами для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1, а также на эндотелиальных клетках EA.hy926, служат рецепторы иммуноглобулина класса IgG. Основной рецептор для CRP — низкоаффинный FcyRII. Кроме того, впервые показано, что, действуя на Fcy-рецепторы тучных клеток, С-реактивный белок вызывает изменение их адгезивных свойств. Впервые показано, что пентраксины С-реактивный белок и сывороточный Р-компонент амилоида способствуют прикреплению тучных клеток и моноцитов к матриксу соединительной ткани. Установлено, что

высокоаффинный рецептор FcyRI также является рецептором для CRP на тучных клетках. Но в отличие от FcyRII, конститутивно экспрессированного на их поверхности, экспрессия FcyRI требует индукции и может быть индуцирована IFNy. Воздействие С-реактивного белка на тучные клетки через FcyRI приводит к активации тучных клеток и выбросу гистамина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Исследование направлено на изучение неаллергических механизмов активации тучных клеток человека, в частности, на оценку роли Fcy-рецепторов во влиянии белка острой фазы воспаления — CRP. Получены новые данные о значении Fcy-рецепторов в активации тучных клеток. Расшифрованы механизмы вовлечения CRP в патофизиологические процессы. В частности, показано, что влияние С-реактивного белка на тучные клетки вызывает их активацию, проявляющуюся выбросом медиаторов и усилением контактов с окружающей тканью - с фибробластами и белками межклеточного матрикса. Это углубляет теоретические знания о тучных �