Изучение комбинированного действия стероидных гормонов и теплового шока на клетки высших организмов

Зацепина, Ольга Георгиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение комбинированного действия стероидных гормонов и теплового шока на клетки высших организмов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение комбинированного действия стероидных гормонов и теплового шока на клетки высших организмов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРТА

На правах рукописи УДК 577.2:595.773.4

3 ¿и^г^гх/св^

ЗАЦЕПИНА Ольга Георгиевна

«ИЗУЧЕНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И ТЕПЛОВОГО ШОКА НА КЛЕТКИ ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ»

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии им. В. А. Энгсльгарта АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ —

доктор биологических наук Евгеньев М. Б.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ —

доктор биологических наук Адлер В. В.

доктор биологических наук, чл. кор. ВАСХНИЛ Скрябин К. Г. ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ — Институт медицинской генетики АМН

седании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгсльгарта АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологин им. В. А. Энгсльгарта АН СССР.

Автореферат разослан « ТА » 1991 г.

СССР.

Защита состоится «

1991 г. в 14

часов на за-

Учсный секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

- 3 -Введение

Способность поддерживать' постоянство внутренней среды, независимо от изменений внешних условий жизни, является одной из основных проблемы изучаемых в биологии. Регуляция гомеостаза клеток и организмов обеспечивается регуляторной активностью ряда защитных систем. Наиболее универсальной и эеолюционно ранней можно считать систему, включавшуюся у всех .организмов от бактерий до человека при резком изменении температуры, а также в ответ на действие ряда других повреждающих факторов ( дыхательные яды,тяжелые металлы, Б-Н реагенты, аналоги аминокислот и др.). Изучение регуляции активности этой системы в основном связано с ее реакцией на тепловой шок (ТШ) и на другие стреСсирующие воздействия. Обычно, при этом, подавляется деление клеток, снижается уровень синтеза многих конститутивных клеточных белков, а также индуцируется синтез ноеых белков теплового шока (БТШ). Как выяснилось, эти белки способствуют выживанию ;:лстск в экстремальных условиях.

У многоклеточных организмов в дополнение к системе БТШ имеется ряд других адаптационных систем, в том числе гормонального реагирования на возникновение экстемалъных условий. По-видимому это связано с тем, что в многоклеточных организмах, клетки различных органов и тканей не одинаково близки к экстремальным условиям, и поэтому один из способов их своевременного оповещения о возникновении экстремальных условий существования - это изменение концентрации гормонов в крови. Одна из таких систем связана с реакцией клеток на изменение уровня стероидных гормонов. У млекопитающих, это глюкокортикоидные гормоны (ГК). У насекомых их аналогом можно рассматривать - стероидный гормон экдизон.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ

Изучение защитных систем, обеспечивающих выживание организма в экстремальных условиях, ведется активным образом во всех лабораториях мира. Особенно хорошо изученной можно считать систему защиты организма от теплового шока. Активно изучается также

роль стероидных гормонов в экстремальных условиях. При этом малоизученным остается вопрос о взаимодействии этих систем во время стресса. Поэтому актуальным является изучение способности стероидных гормонов оказывать- свое влияние на клетки во время ТШ и после его. Важен вопрос о судьбе рецепторов к ГК во время TUL

. Известно,что ГК способствуют вшиванию некоторых клеток млекопитающих после TIIL В связи с этим интересно узнать универсально или специфично предохраняющее действие ГК на разные типы клеток млекопитающих. Для решения этой проблемы мы выбрали систему контрастно реагирующих на ГК клеток плазьоцитомы мыши РЗХ 63 Ag8 Ad и фибробластов человека.

Важную роль в защите клеток играет семейство генов, кодирующих белки с мол.весом 70 КДа(БТШ 70). Сейчас показано, что ЕТШ 70,также необходимы и для нормальной жизнедеятельности клеток, в частности уровень экспрессии одного из них кБТПГ70 зависит от пролиферативной активности клеток. Так, как глюкокортикоиды влияют на размножение клеток, то интересно знать,как при этом изменяется уровень транскрипции генов кБТШ 70 и с-мус гена ( игравшего важную роль регуляции клеточной пролиферации), а также меняется ли при этом терморезистентность клеток.

ЦЕЛЬ'ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования явилось изучение взаимодействия двух защитных систем организма (ТШ и стероидные гормоны) на примере клеток Drosophila melanogaster и плаэмоцитомы мыши РЗХ 63 Ag8 Ad.

. Для решения этой проблемы было поставлено ряд задач.

1. Исследовать,возможна ли индукция пуфов экдизоном в клетках слюнных желез Drosophila mslanotasteг во время и непосредственно после ТШ.

2. Выяснить,что происходит с рецепторами к ГК во время ТШ(на клетках фибробластов и плазмоцитомы).

3. Исследовать изменение синтеза белка в клетках плазмоцитомы мыши после ТШ, а также комбинированного действия ТШ и ГК.

4. Изучить влияние ТШ и ГК на пролиферацию клеток плазмоцитомы мыши.

• ~ 5 -

5. Определить изменения транскрипционной активности генов, играющих важную роль в пролиферации клеток (с-мус и кБТШ 70) и в выживании клеток после ТШ (кБТШ 70), в результате воздействия на клетки ТШ и ГК.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В нашей работе мы впервые показали, что такие стероидные гормоны, как зкдизон и ГН, в отличии от зстрадиола, способны оказывать сЕое влияние на клетки непосредственно после ТШ; то есть рецепторный аппарат к данным гормонам, если и повреждается ТШ, то незначительно.

Кроме того, в работе было обнаружено, что в клетках плазмо-цитомы мыши нарушен ответ на ТШ, т. е не индуцируется главный белок ТШ млекопитающих БТШ 68, а лишь усиливается синтез кБТШ 70. Выявлен ряд особенностей-усиления синтеза кБТШ 70 после ТШ. При длительной инкубации ¡'.лете;: ллаамицитомы с ГК снижается уровень транскрипции гена кБТШ 70. Снижение уровня транскрипции гена кБТШ 70 коррелирует с подавлением пролиферации клеток ГК Обнаружено, что, несмотря на отсутствие индукции БТШ 68, клетки плазмоцитомы мши становятся терморезистентными в результате предварительного мягкого шока. Длительная инкубация клеток плазмоцитомы мыши с ГК приводит к снижению их терморевистентности. Таким образом, при отсутствии индукции гена БТШ 68, повышение активности гена кБТШ 70 способно (хотя и с меньшей эффективностью) заменить БТШ 68. Мы пришли также к еыводу, что предохраняющее действие ГК специфично и зависит от типа клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выяснения вопросов о способности стероидных гормонов^-осуществлять СЕое воздействие на клетки во время или непосредственно после ТШ, а также каким образом ТШ изменяет транскрипцию генов, индуцированных перед ТШ, мы выбрали удобную и хорошо изученную систему индукции пуфов в слюнных железах БгозорЫ1а те1апо£а£1ег под действием ТШ и стероидного гормона экдизона.

Т'ис 1. Фотографии флуоресценции, наблюдаемой е политенных хромосомах Drosophila melanogaster. А - контроль, личинки при 25° С (Экдизоновые пуфы отмечены стрелками). Е - личинки с развитыми экдизоноеыми пуфами подвергали £0 мин. TUL Резко сокращается число ярко - флуоресцирующих сайтоЕ. Яркое СЕечение наблюдается, как е пуфах ТШ 87 С и 87 А, так и б экдизоновых пуфах 74 EF и 75 В.

Рис 2. Типичная картина, включения [3НЗ уридина, если экдизон вводить б среду после прекращения Till Стрелкой указан экдизоновый пуф 75 В, включающий 13Ю-уридин, по сравнению с пуфами ТЕ

■ -. 7 -

1 Комбинированное действие ТШ и зкдизона на транскрипцию политенных хромосом.

В первой серии опытов, где ТШ давали после индукции пуфов экдизоном. установили, что индуцированные экдизоном ранние пуфы не регрессируют при повышении температуры.' В опытах по непрямой иммуно-флуоресценции с использованием антител к ДНК/ТНК гибрида),! по методу Алковера наблюдали яркое свечение как в активно-транскрибируемых пуФах ТШ, так и в зкдизоновых пуфах, хотя и сохранивших свои размеры, но не участвующих в транс-крипции(рис1). Таким образом РНК, синтезируемая в экдизоноеых пуфах, остается там и после TUL •

Во второй серии опытое, когда ТШ и экдизон применяли одновременно. нам не удалось индуцировать ни одного зкдизоноеого пуфа. При последовательном действии ТШ - экдизон установили, что через час после снятия шока первыми, при подавленной в значительной степени активности остального геном?., начинают появляться ";;д;:эоновые пуфы, в первую очередь 75 В. Более того в них начинается активная транскрипция (рис2). Таким образом мы выяснили, что хотя е пуфах, индуцируемых экдизоном во время ТШ прекращается транскрипция, в них остаются незавершенные транскрипты РНК и, еозможно. FHK-полимераза II, что позволяет им быстро возобновить транскрипцию после снятия TBL Нам не удалось индуцировать экди-зоноЕые пуфы во Бремя TUL Зато, если экдизон давать сразу после ТШ. то первыми активируются именно экдизоноЕые пуфы. Это свидетельствует о том, что рецепторньй аппарат к экдизону сохраняется неповрежденным во время Till

2. Влияние ТШ на аппарат рецепции глккокортикоидных гормонов.

Известно, что ГК гормоны играют важную роль в адаптации животных во время стресса, изменяя метаболизм клеток. Поэтому особенно интересно знать, что происходит с рецепторами к ГК во вре-^-' мя ТШ, иными словами могут ли они функционировать в клетках жи-еотных во Еремя ТШ и Е процессе их восстановления после tul Мы изучали действие ТШ на глюкокортикоидные рецепторы (ГКР) на примере клеток плазмоцитомы мыши и фибробластов человека.

- 8-

ТАБЛИЦА 1

ЛепстЕие ТШ на параметры связывания глкжокортикоидных горноноЕ с рецепторами.

Ай ИМГ 795

Б 10-15 К Б 10 15

гпах шах

М/10 нМ N8 М/10 нМ

клеток клеток

контроль, (37 ) 100 5 72,8 95 8,6 73,6

41 С, 40' 69 5,7 60 95 - -

42 С, 50' 30 5,3 53 - - -

45 С, 5' 56 4,8 41 85 9 73

45 С, 15' 20 5 29 - - -

45 с, 30' - - - 51 .3,7 29,7

ТАБЛИЦА 2

Параметры аккумуляции гормон-рецепторных комплексов в ядро I по Скэтчарду).

линия клеток Контроль 45 С, 5 мин 45 С, 40 мин

Б ядра тах м К* нМ В ядра тах г м нМ В ядра тах м нМ

Ай ИМГ 795 74-Ю"15 72-Ю*^15 10.9 9 51-10~15 ' 8.7 24-Ю-15 12.3

Мы провели исследование основных параметров связывания ГК с клетками радиолигандным методом и получили, что ТШ вызывает пропорциональное длительности воздействия снижение, как максимального числа мест связывания (В мах) гормона с рецептором, так и снижение процента аккумуляции гормон-рецепторных •комплексов (ГРК) в ядре (таС1). Из таблицы также видно, что рецепторы клеток плазмоцитомы повреждаются ТШ значительно сильнее, чем рецепторы фибробластов. Выявленное снижение количества рецепторов и их аккумуляции в ядре связаны, видимо, с повреждением их ТШ. Существенно, однако, что при режимах ТШ, эффективных для индукции БТШ, в клетках остается не мене 50% мест связывания по сравнению с контролем, а X аккумуляции ГРК в ядро снижается не • более, чем на 30%. Учитывая огромный избыток количества ГКР в клетке, сохраняющегося при ТШ числа, активных рецепторов, способных взаимодействовать с ядром, вполне достаточно для реализации эффектов ГК Важным моментом в оценке состояния аппарата рецепции ГК клтахй при ТШ является анализ зависимости количества связанных с хроматином в ядре ГРК от концентрации гормона по графикам Скетчарда. Полученные результаты (таб2) свидетельствуют о том, что несмотря на снижение количества ГРК в ядре при ТШ, кажущаяся константа диссоциащи дексаметазона (химический аналог ГК) с рецепторами, аккумулированными в ядре, остается неизменной при ТШ. Это позволяет сделать вывод об интактности ядерных гормон-рецепторных комплексов при ТШ и высказать предположение о том, что возможна реализация эффектов ГК при ТШ, опосредованная рецепторами. Скорее Есего, эффекты воздействия ГК в сочетании .с ТШ осуществляются не во Еремя ТШ, когда подавляется транскрипционная активность генов, а после, во время восстановительного периода.

3. Характеристика белкового синтеза в клетках плазмоцитомы— мыши в ответ на ТШ и ГК.

Как уже было сказано Еыше, воздействие ряда физических и

химических факторов на клетки индуцируют в них синтез БТШ, способствующий их выживанию в экстремальных условиях. У млекопитающих для клеток внутренних органов сигналом о возникновении экстремальных условий яЕляется повышение уроеня ГК в кроЕИ, характерного признака любого стрессорного явления. Было обнаружено что ГК могут е некоторых клетках модулировать уровень синтеза БТШ и повышать их терморезистентность. Так как реакция разных типов клеток на ГК специфична, то интересно было выяснить насколько универсально повышение терморезистентности разных типое клеток при обработке их ГК, и как изменяется в них синтез БТШ после инкубации с ГК.

Первоначально для решения этих вопросов мы исследовали влияние одного ТШ на синтез белка е клетках плазмоцитомы мыши РЗХ 63 А^8-Ас1 и для сравнения в клетках спленоцитов мыши и фиброб-ластов человека. Так, если в клетках фибробластов человека при ТШ 45°С 5-30 мин. происходит индукция БТШ 110, 90, 68, 59 , 35,5, 28 кДа, а в клетках спленоцитов мыши БТШ 90, 68 кДа.то в клетках плазмоцитомы при ТШ в 45°С 5мин., через 2 часа восстановительно- . го периода происходит лишь усиление синтеза БТШ 70 и БТШ 90, и индукция БТШ 110. (рисЗ) Из результатов двумерного электрофореза белков (рис4) видно,что в клетках плазмоцитомы в отличии от клеток спленоцитов мыши отсутствует индукция БТШ 68, а происходит усиление синтеза конститутивного БТШ 70. Это подтверждает также иммуноблотинг белков плазмоцитомы с моноклональными антителами к БТШ 70. Интересно то, что при увеличении длительности ТШ до 15 мин. в клетках плазмоцитомы происходит не усиление,а некоторое снижение уровня синтеза БТШ 70. (по данным "сканирования). Ери ТШ 45°С 30 мин. наблюдается значительное прдавление синтеза белков, за исключением актина и БТШ 70. фи Шоке 44°С 5 мин. наблюдается аналогичная картина усиления синтеза КБТШ 70 и БТШ 90, и индукция БТШ 110. Зато "при ТШ 44°С 30 мин. наблюдается усиление синтеза БТШ 90 и индукция БТШ 110, в то время как уровень синтеза БТШ 70 остается сравнимым с контролем. При увеличении длительности восстановительного периода до 6 часов при ТШ 45 ° С 15мин.

Пп

И V

Г"| г

I. -и и

зо~—

70-—

- -

и4. | . *

* Г 4

г М

* ^

д -Г

Рис 3.

/ 0.

3 V

Рис .5"

(5'); 3-45°С (15'); 4~45°С (30'), 2 часа

Рис 3. Радиоавтограмма белкового синтеза в клетках плазмоцитомы

о о

мыши: 1-37 0; 2-45° С восстановительного периода. Стрелками отмечены БТШ 110, ВТШ 90, ■ БТШ 70. Электрофорез в 15 % геле по Лэммли Рис 5. Радиоавтограмма белкового.синтеза в клетках плазмоцитомы мыши: 1-37°С; 2-45°С (5'); 3-45°С (15'), 2 часа восстановительнокг периода; 4-45°С (15'), 6 часов восстановительного периода. Стрелками отмечены БТШ 110, БТШ 90, БТШ 70. Электрофорез в 12 % геле по Лэммли.

Рис 4. Радиоавтограмма белкового синтеза. А - в клетках сплено-цитов мыши: 1-37°С; 2-45°С (5*), 2 часа восстановительного периода: Стрелками отмечены БТШ 70 и индукция при 45"С (5*) БТШ 68. Двумерный электрофорез по 0'Саррелу. Б - в клетках плазмоцитомы мыши: 1-37®С; 2-45еС (5') , 2 часа восстановительного периода. В - иммуноблотинг белков, перенесенных методом электроблотинга на нитроцеллюлозу, с моноклональными антителами* взаимодействующими с БТШ 70: 1-37*0; 2-45вС (5').

- - 13 -

вновь восстанавливается характерная картина усиления синтеза кБТШ 70 и ЕТШ 90(рис 5). Важно отметить, что при ТШ 45°С 5 мин. через 6 часов восстановительного периода не происходит снижения синтеза кБТШ 70, в то время как известно," что активный синтез ЕТШ 70 в клетках млекопитающих продолжается в течение 1-2 часов. Необычную картину усиления синтеза кБТШ 70 в клетках плазмоцитомы мыши, вероятно, можно объяснить следующим образом. Известно, что синтезу каждого БТШ соответствует свой температурный оптимум. Естественно предположить, что для синтеза кБТШ 70 оптимальна нормальная температура При кратковременном ТШ усиление синтеза КБТШ 70 может происходить за счет стабилизации РНК При увеличении длительности ТШ-подавляется синтез кБТШ 70, как и многих других клеточных белков, и для активации его синтеза требуется длительный восстановительный период при нормальной температуре. Сейчас ео многих работах раскрыта важная роль семейства БТШ 70 в правильном сворачивании и разворачивании белков, сборке олигомерных белков, дезагрегировании обрявовавщихся белковых комплексов и в предотвращении их образования в нормальных условиях и после ТШ. При ТШ обычно ряд этих функций выполняет инду-цибельный БТШ 68. В клетках плазмоцитомы отсутствует индукция БТШ 68 и, вероятно, кБТШ 70 в какой-то степени заменяет БТШ 68. Возможно, поэтому в клетках плазмоцитомы, как и в ряде других клеток, в которых отсутствует индукция БТШ 68,' наблюдается высокий конститутивный синтез кБТШ 70, а после ТШ его активный синтез длится в течении необычайно длительного времени. В пользу взаимозаменяемости белков БТШ 68 и БТШ 70 говорит и то, что клетки плазмоцитомы, несмотря на отсутствие в них индукции основного БТШ 68 становятся термотолерантными в результате предварительного нагревания. Мы подвергали клетки плазмоцитомы ТШ 45°С : 15 мин., а затем через 24 часа давали повторный ток в 45°С. 15 30 мин.. Мы получили,что клетки подвергнутые предварительному нагреванию, значительно лучше контрольных клеток переносят повторный шок. Так, даже при ТШ 45 °С 30 мин. продолжает синтезироваться полный спектр белков(рисб)..;

Введение дексаметазона (0,5. мМ) в культуру за 12-24 часа до

ТШ у клеток фибробластов и плазмоцитомы изменений в индукции ос-' ноеных БТШ не вызывает. При этом в клетках плазмоцитомы после ТШ наблюдается более сильное подавление в 1.5-2 раза синтеза бел-ка(по-сравнению необработанными ГК клетками), что видно из просчета включения меченных аминокислот в белок. В обработанных ГК клетках плазмоцитомы индуцируется белок с мол. в. 30 кДа и усиливается синтез белка с мол. е. 29.5 кДа(рис7). Интересно то, что в клетках фибробластов человека обработанных гормоном , так же наблюдается усиление синтеза белков с мол. в. 30 и 29.5 кДа. Известно, что в клетках млекопитающих тяжелые металлы и сульфгид-рид-реактивные агенты, такие как арсенит натрия индуцируют синтез белков стресса с мол. в. в 32/34 кДа, в клетках крысы с мол. в. 25,35 кДа. Возможно, индуцируемые в клетках плазмоцитомы и фибробластов белки с мол. в. в 29.5-30 кДа это изоформы одного и того же белка, относящегося к этой семье стресса.

Не обнаружив изменения в индукции основных БТШ при кратковременном культивировании клеток плазмоцитомы с дексаметазоном, мы решили изучить изменения в ответе на ТШ вызываемые длительным, до 3-х дней культивированием клеток плазмоцитомы с дексаметазоном. Оказалось, что при такой постановке опыта усиление синтеза кБТШ 70 и БТШ 90 при ТШ 45 С 5 мин. слабее, а общее подавление синтеза белков сильнее, чем в клетках, растущих без гормона.

4. Комбинированное действие глюкокортикоидных гормоное и ТШ на пролиферацию клеток плазмоцитомы.

Исследовав изменение характера синтеза БТШ после комбинированного действия гормона и ТШ, мы обнаружили, что длительное инкубирование клеток плазмоцитомы с гормоном вызывает более сильное подавление общего синтеза белка и снижение уровня индукции кБТШ 70 и БТШ 90 по-сраЕнению с контролем. Чтобы выяснить, ели-яет ли такое изменение в синтезе к БТШ 70 на выживаемость клеток после ТШ, мы решили изучить Елияние на пролиферативную активность клеток комбинированного действия дексаметазона и Tili В первой серии опытов мы исследовали влияние этих факторов на ско-

Рис 6. Радиоавтограмма белкового синтеза в клетках плазмоцитомы мыши.. Клетки подвергали предварительному ТШ 45°С 10 мин., а через 24 часа проводили следующие воздействия: -

1-37° С; 2-45°С (5'); 3-45°С (15'); 4-45°С (30'), 5-БТШ из клеток ОговорЫ 1а те1агю§аз1ег, 2 часа восстановительного периода. Электрофорез в 15% геле по Лэммли. : ■ Рис 7. Радиоавтограмма белкового синтеза в клетках плазмоцитомы мыши. В культуру клеток за 12 часов до ТШ был добавлен дексамета-зон в концентрации 5-10~? КЬ 1-37°С; 2-45°С (5*); 3-45°С (15'),.^-2 часа восстановительного периода. Стрелками отмечены БТШ 90, БТШ 70, белки с мол. массой в 30 кДа и 29,5 кДа. Электрофорез в 15% геле по Лэммли.

скорость пролиферации клеток в отдельности. Мы обнаружили, что подавляющее на пролиферацию действие дексаметазона значительно сильнее сказывается на клетках плазмоцитомы чем на фиб-робластах. Так при инкубации клеток плазмоцитомы с дексаметазо-ном в концентрациях 0.01-0.5 мЫ. в течении 7 дней скорость их пролиферации снижается в 1.2 -6 раза соответственно по-сраЕнению с контролем. ТШ в режиме 45°С (25-35 мин.) подавлял пролиферацию клеток плазмоцитомы в 3.7-7 раз. ТШ 45°С -40 мин. губителен для клеток плазмоцитомы. (Для фибробластов смертельным оказывается ТШ 45 0 С. - 80 мин.) Мы 'также исследовали способность клеток к приобретению термотолерантности в результате предварительного за 24 часа до стандартного шока 45 С. 25-40 минут мягкого шока 45° С. 10 минут. Шказано, что в результате такого воздействия клетки становятся термотолерантными, что проявляется в повышении скорости их пролиферации в 2-3 раза по-сравнению с контролем.

Предварительное введение дексаметазона за 12-24 часа до ТШ, а также одновременное введение гормона с ТШ с последующим культивированием клеток после ТШ без гормона практически не влияло на выживаемость клеток плазмоцитомы после шока, то есть мы наблюдали незначительное подавление скорости пролиферации обработанных дексаметазоном клеток. Однако, если клетки культивировать с гормоном в течении длительного времени (72 ч.), а затем подвергнуть ТШ картина меняется. Такие клетки переносят ТШ значительно хуже контрольных (в 2 раза), что коррелирует со снижением уровня индукции кБТШ 70. Если дексаметазон ввести е культуру сразу после ТШ и дальше клетки инкубировать с гормоном, то наблюдается сложение эффектов глюкокортикоидов и ТШ на скорость деления клеток, что проявляется в более сильном угнетении пролиферации в зависимости от дозы дексаметазона и длительности ТШ. Известно, что ГК оказывают выраженный противоспалительный эффект, подавляя активность иммунокомпитентных клеток. Не удивительно, что дексаметазон подавляет скорость пролиферации клеток плазмоцитомы. При этом дексаметазон и ТШ подавляют пролиферацию клеток, вероятно, действуя на различные клеточные системы. Поэтому при

■ - 17 -

добавлении гормона в среду сразу после ТШ наблюдается суммарное С по силе) подавление пролиферации клеток-. Ухудшение выживаемости клеток после ТШ при длительной предварительной их инкубации с ГК может быть связана также и с тем, что дексаметазон резко изменяет клеточный метаболизм, запускает синтез множества новых белков, для сборки и транспортировки которых необходим ЕТШ 70. В таких условиях, синтезируемого ЕТШ 70 может не хватать на выполнение всех функций и тогда отсутствие индукции БТШ 68 при ТШ сказывается значительнее, чем в клетках растущих без гормона.

5. Характеристика изменения уровня транскрипции генов с-мус и кБТШ 70 в результате действия дексаметазона и ТШ.

Известно, что выживанию клеток при ТШ способствует синтез БТШ. В клетках млекопитающих синтез основных белков ТШ, кодируемых семейством генов БТШ 70, находится под сложным контролем. БТШ 70 индуцируются не только под действием стресса-ТШ, тяжелыми металлами и др., а также при стимуляции сывороткой, иммортализу-ющими продуктами аденовирусов и полиомы. Его синтез ¡лггивируется при входе клеток в Б фазу. Возможно,синтез БТШ 70 взаимосвязан с синтезом ДНК и пролиферацией клеток." Ряд авторов считает, что продукт протоонкогена с-мус, играющий важную роль в пролиферации и дифференцировке клеток, может влиять на экспрессию гена БТШ 70. В данной работе мы попытались проанализировать, каким образом изменяется уровень транскрипции генов с-мус и БТШ 70 в клетках плазмоцитомы мыши при подавлении их. пролиферативной' активности дексаметазоном и ТШ.

При инкубации клеток плазмоцитомы с"дексаметазоном О. БмМ значительно снижается скорость их размножения. Динамику подавления скорости пролиферации клеток плазмоцитомы гормоном мы оцени. з

вали по включению Н-тимидина в ДНК клеток, растущих на среде с дексаметазоном и без него. Уровень включения'3Н-тимидина начинает^ падать через 8-12 часов после введения гормона в среду и достигает минимального значения через 30-35 часов. Этому предшествует снижение уровня транскрипции с-мус гена. (Уровень транскрипции с-мус гена и БТШ 70 мы анализировали методом гибридизации тотальной и поли (А+) РНК из клеток с фрагментами ДНК с-мус гена и

гена БТШ 70, соответственно. Для количественного сравнения, предварительно, поли (А") РНК и тотальную РНК прокрашивали мети-лен0Е0й синькой.) Так через 6 часов после введения гормона уровень транскрипции с-мус гена значительно снижается и становится минимальным через 10-12 часов(рис8). В контрольных клетках интенсивность транскрипции с-мус гена постоянна. Таким образом снижение уровня репликации ДНК совпадает по Бремени с минимальным значением уроеня транскрипции с-мус гена. При ТШ 45°С 5 минут уровень с-мус РНК не изменяется. Значительное падение интенсивности транскрипции с-мус гена наблюдается также при воздействии ТШ 45° С. 15 минут. При этом наблюдается резкое снижение уровня пролиферации клеток. При более длительных сроках инкубации клеток с дексаметазоном (24-48ч.) происходит постепенное ЕосстаноЕление уровня транскрипции с-мус гена. Несмотря на восстановление активности с-мус гена, уровень репликации ДНК продолжает оставаться минимальным. В клетках плазмоцитомы, дифференцированных В клетках, экспрессия с-мус имеет некоторые особенности, связанные с транслокацией с-мус гена в иммуноглобулиновый локус. Нормальный с-мус ген в клетках плазмоцитомы, как и в других дифференцированных клетках находится в репрессированном состоянии. ТранслоцироЕанный, потерявший при перестройке 5' регуля-торные последовательности и часть экзона 1, с-мус ген активно экспрессируется. Учитывая эти особенности, вряд ли снижение экспрессии с-мус гена в клетках плазмоцитомы СЕязано с тем, что дексаметазон индуцирует отдельные элементы клеточной дифференцирован. Возможно, что при ингибировании клеточного роста дексаметазоном происходит дестабилизация с-мус РНК. Так, известно, что при подавлении пролиферации клеток Дауди интерфероном, первоначальное снижение в уровне РНК происходит за счет ее быстрой деградации, с последующим выключением РНК на уровне транскрипции. В клетках плазмоцитомы , ТранслоцироЕанный с-мус ген лишен регуля-торных последовательностей, следовательно уровень его транскрипции Еряд ли регулируется. Это объясняет повышение уровня с-туе РНК в клетках плазмоцитомы через 48 часов инкубации с гормоном.

i г з * s i ? Li.sk

Рис 8. Элекрофореграмма поли (A ) РНК из клеток плазмоцитомы е 1. 2 % геле с формальдегидом. Гибридизация с фрагментом 3-го экзо-на гена с-мус. Радиоавтографы: А. 1-РНК из клеток, растущих без дексаметазона; 2-после ТШ в 45°С (15"); 3,5,7-через 12. 24, 48 ч. инкубации с гормоном; 4,6- через 12 и 24 ч. инкубации с гормоном с последующим Till Б. 1-К; 2,3 через 6 и 12 ч. инкубации с гормоном;

4- после ТШ в 45°С (15').

в_

I и ч 1 гэ н 113

Рис 9. Электрофореграмма поли (А ) РНК из клеток плазмоцитомыл-фибробластов е 1.2% геле с формальдегидом. Гибридизация с фрагментом кДНК гена человека БТПГ70. А-РНК из клеток плазмоцитомы. Б-РНК из клеток фибробластов. 1-К; 2-ТШ 45 °С (15'); 3-12 ч. инкубации с гормоном; 4-12ч. инкубации с гормоном с последующим ТЕ -В-РНК из клеток плазмоцитомы: 1-К; 2,3-после 12 и 24 ч. инкубации с гормоном.

Выключение транслоцированного с-тус гена может быть связано' также с тем, что дексаметазон угнетает антителообразоЕание. Подавление экспрессии иммуноглобулинового локуса приводит к снижению транскрипции с-туе гена, находящегося под его контролем. Выяснение причин подавления транслоцированного с-тус гена дексаме-тазоном важно для понимания механизмов регуляции его экспрессии.

В клетках плазмоцитомы (по сравнению с клетками фиброблас-тов) в норме наблюдается поышенный синтез мРНК 70, который усиливается при ТШ(рис9). Ранее методом двумерного электрофореза белков мы показали, что е клетках плазмоцитомы при ТШ усиливается лишь синтез конститутивного ЕТШ 70. Известно, что именно активность конститутивного ЕТШ 70 тесно взаимосвязана с уровнем пролиферации клеток. .Эти факты дают возможность нам предположить, что мы анализировали изменения уровня транскрипции кБТШ 70, хотя используемые нами методы не позволяют дифференцировать мРНК индуцибельного от кБТШ 70. При инкубировании клеток плазмоцитомы с дексаметазоном в течении 24-70 часов происходит постепенное снижение уровня м РНК кБТШ 70, что совпадает со снижением Еключения^Н-тимидина е ДНК клеток, а также с ухудшением выживаемости этих клеток после ТЕ При этом мы не обнаружили корреляции е изменении уровня мРНК БТШ 70 и с-мус мРНК. Так, несмотря на ЕосстаноЕление уровня мРНК с-мус гена через 70 часов инкубации с гормоном, уровень мРНК БТШ 70 гена продолжает снижаться. Таким образом, хотя экспрессия этих ДЕух генов зависит от пролифера-тиеной актиЕности клеток, регуляция транскрипции гена кБТШ, вероятно, не зависит от экспрессии с-мус гена.

В нашей работе мы не обнаружили предохранения клеток плазмоцитомы глюкокортикоидами от ТШ . Но.мы полагаем, что подавление пролиферации клеток плазмоцитомы дексаметазоном, как и других иммунокомпитентных клеток играет защитную роль в организме при стрессе. Так, известно,что основными целями иммунного ответа при стрессе яеляются БТШ 70. Уровень БТШ при стрессе резко повышается. Для уменьшения возможностей развития аутоиммунного процесса при стрессе е организме выработалась защитная реакция- подавление глюкокортикоидими пролиферации иммунных клеток.

7 21 -

ВЫВОДЫ.

1.При ТШ пуфы, индуцируемые экдизоном не регрессируют,в них остаются незавершенные транскрипты РНК, что позволяет им быстро возобновить транскрипцию после ТЕ ■

2. Рецепторный аппарат к ГК, хотя и повреждается ТШ, но сохраняющегося числа рецепторов достаточно для реализации эффектов ГК после ТЕ

3.При ТШ в клетках плазмоцитомы мыши.РЗХ 63 АЗ 8 А<3 отсутствует индукция БТШ 68, но происходит усиление синтеза конститутивного БТШ 70 и БТШ 90. Несмотря на отсутствие индукции БТШ 68 ТШ клетки плазмоцитомы становятся терморезистентными после мягкого шока. - . . . .

4. При инкубации клеток плазмоцитомы с ГК снижается уровень их пролиферации в зависимости от дозы гормона. Длительная инкубация клеток плазмоцитомы с гормоном перед ТШ приводит к снижению их устойчивости к ТШ. • ■

5. При длительной инкубации клеток с ГК снижается уровень транскрипции гена БТШ' 70. При этом наблюдается также снижение транскрипции гена с-мус с последующим восстановлением.уровня его транскрипции. ' . - .' ' '..

6. Предохраняющее действие ГК на клетки - после ТШ . не универсально и зависит от типа клеток. Подавление ГК пролиферации клеток плазмоцитомы мыши, как и других иммунокомпетентных клеток играет защитную роль в организме при стрессе, предотвращая развитие аутоиммунного процесса

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. М. Б. Евгеньев, О.Г. Зацепина, Е Т. Какпаков, Е. И. Власова.

"Комбинированное действие ТШ и экдизона на транскрипцию по-

литенных хромосом ОгоБорЬЛа melano^asteг."

Мол. биол. 1985 г. Т. 19. С. 483-488

2. О.Г. Зацепина, М. Б. Евгеньев, Е ЕЛяшко.

"Комбинированное действие ТШ и . глюкокортикоидных гормонов

на культивируемые клетки млекопитающих.

Мол. биол. 1988 г. Т. 22. С. 813-821.

- 22 -

3. М. В. Evgen'ev, 0. В. Zatsepina, Н. Titarenko. Autoregulftion of heat-shock system in Drosophila

Meiaricgaster."