Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов в формировании риска развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов в формировании риска развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края"

005538720

ПЕЧКОВСКИИ Евгений Васильевич

Роль полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов в формировании риска развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края

03.01.04 - биохимия 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Новосибирск - 2013

005538720

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Научные руководители:

д.м.н., чл.-корр. РАМН, профессор Кушлинский Николай Евгеньевич к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Официальные оппоненты:

Макарова Светлана Ивановна, д.б.н., старший научный

сотрудник лаборатории метаболизма лекарств и

фармакокинетики Федерального государственного бюджетного

учреждения «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Гимаутдинова Ольга Ивановна, д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Защита состоится « » декабря 2013 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 630099, Новосибирск, ул. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « /¿?» /-¿дС^г 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) является самым распространённым онкологическим заболеванием среди женщин. Вероятность развития этого заболевания на протяжении жизни составляет в среднем 9-10 %, а в случае наличия рака молочной железы в семейном анамнезе - как минимум 20% (Willems, 2007). Как заболеваемость, так и смертность от данного вида неоплазии в настоящее время имеют тенденцию к неуклонному росту. Считают, что РМЖ имеет мультифакториальную этиологию - на риск его возникновения оказывают влияние как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Роль генетических факторов более высока при семейной форме рака молочной железы, которая составляет около 10% от общей заболеваемости этим видом неоплазии. В этом случае к развитию опухоли приводят высокопенетрантные мутации в таких генах, как BRCA1 и BRCA2, СНЕК2, PTEN, ATM (Dunning et al, 1999). Спорадическая форма развивается, как правило, у женщин старше 40-45 лет, не имеющих семейной отягощенности по этому заболеванию. К развитию такой формы рака могут приводить аллельные варианты генов в сочетании с воздействием внешних факторов (канцерогенные вещества, курение и потребление алкоголя, ионизирующее излучение, стресс, травма молочных желез и др.) Идентификация генетических вариантов, ассоциированных с увеличением риска развития опухоли, открывает новые возможность для прогнозирования риска возникновения РМЖ и ранней его диагностики, а значит и успешного лечения этого заболевания.

Известно, что половые стероидные гормоны (эстрогены, ацдрогены, прогестерон) необходимы для правильного развития и функционирования молочных желез. Действие этих гормонов осуществляется через геномные и негеномные механизмы. В первом случае димеризованные комплексы рецептор-гормон связываются с респонсивными элементами ДНК и регулируют экспрессию генов. Во втором случае гормоны через свои рецепторы взаимодействуют с участниками МАРК-киназного пути внутриклеточной передачи сигнала, и таким образом участвуют в регуляции эффектов других сигнальных молекул. Метаболизм стероидных гормонов является важным регулятором гормонального гомеостаза в молочной железе, поддерживая оптимальную концентрацию гормонов в этом органе. Нарушение метаболизма половых стероидных гормонов может приводить к аккумуляции соединений, обладающих способностью индуцировать пролиферацию клеток и ингибировать апоптоз, а также повреждать генетический материал. Это может лежать в основе злокачественной трансформации.

К настоящему времени в мировой литературе опубликован ряд исследований, в которых изучали влияние аллельных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов на риск развития РМЖ. Тем не менее, результаты работ, выполненных на популяциях различного этнического происхождения, противоречивы и не позволяют однозначно ответить на вопрос о роли полиморфизма этой группы генов в развитии данной патологии. Таким

образом, исследование ассоциации полиморфных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском развития РМЖ в русской этнической группе является важной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования - изучение ассоциации полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rs 1048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 в выборке женщин, больных спорадическим раком молочной железы, и в группе контроля.

2. Выполнить анализ ассоциации аллелей и генотипов вышеуказанных полиморфных локусов с риском развития рака молочной железы.

3. Исследовать влияние аллельных вариантов данных полиморфных локусов на риск рака молочной железы в подгруппах женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов прогестерона (PGR), эстрогенов (ER) и HER2/neu в опухолевых клетках, в подгруппах женщин с разной продолжительностью лактации, а также в пре- и постменопаузе.

Научная новизна работы

Впервые была изучена ассоциация полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rs 1048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 с риском возникновения РМЖ в популяции этнических русских на представительной выборке, состоящей из 670 женщин, больных спорадическим раком молочной железы, и 480 женщин без онкологических заболеваний. При этом ассоциация локуса rs2470152 в гене CYP19A1 с риском данного заболевания исследована впервые. При сравнении случай-контроль ни для одного из локусов не было продемонстрировано ассоциации с риском данного заболевания после введения поправки на множественное сравнение. Кроме этого, впервые был проведен анализ влияния вышеописанных полиморфных вариантов на риск РМЖ в подгруппах женщин, имеющих разную продолжительность лактации, разный уровень экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевой ткани и у женщин в пост- и пременопаузе. Впервые выявлена ассоциация локуса rs 1042838 в гене PGR с увеличением риска РМЖ в группе женщин имевших опухоли с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и рецептора HER2/neu, а также локуса rsl048943 в гене CYP1A1 с риском развития РМЖ в подгруппе женщин, не кормивших грудью.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты данной работы вносят вклад в понимание молекулярно-генетических и патофизиологических механизмов развития рака молочной железы, подтверждая гипотезу о роли нарушения баланса метаболизма половых стероидных гормонов в этиологии данного заболевания. Выявленные биологические маркеры PGR rsl042838 и CYP1A1 rsl048943, ассоциированные с риском возникновения РМЖ, могут быть использованы в дальнейшем для прогнозирования риска развития данного заболевания при условии подтверждения обнаруженных ассоциаций на независимых выборках русского этнического происхождения. В перспективе, возможно, это будет способствовать внедрению персонализированного подхода к профилактике РМЖ у пациенток.

Помимо этого, в настоящей работе было проанализировано распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах метаболизма половых стероидных гормонов в выборке русских жительниц Алтайского края, что вносит вклад в изучение особенностей генетической структуры жителей данного региона. Основные положения, выносимые на защиту

1. Полиморфный локус rs1042838 в гене PGR ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов (для аллеля Т: OR = 1.59, р = 0.02 в подгруппе с низким уровнем рецептора эстрогена; OR = 1.52, р = 0.04 в подгруппе с низким уровнем рецептора прогестерона) и в группе с низким уровнем экспрессии рецептора HER2/neu (для аллеля Т: OR = 1.82,р = 0.002).

2. Полиморфный локус rs¡048943 в гене CYP1A1 увеличивает риск развития рака молочной железы в подгруппе женщин, не кормивших грудью (р = 0.002).

3. Аллельные варианты генов метаболизма половых стероидных гормонов rsl056836 в гене CYP1B1, rs762551 в гене CYPJA2, rs2470152 в гене CYP19A1 и rs743572 в гене CYP17A1 не ассоциированы с риском развития рака молочной железы в исследуемой выборке женщин, либо ассоциация мала для выявления при данном размере анализируемых групп.

Личный вклад автора

Автор организовал и лично участвовал в сборе и обработке первичного биоматериала, создании системы холодовой цепи доставки образцов, формировании экспериментальной выборки и контрольной группы на базе филиала ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в г. Барнауле, составлении таблиц клинических признаков и формировании критериев разделения пациентов на группы и подгруппы. Автор проводил технические работы по выделению и амплификации ДНК на базе лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины РАН в г. Новосибирске. На основании полученных результатов автором проведен статистический анализ ассоциации полиморфных локусов с риском возникновения РМЖ, в том числе в выделенных подгруппах. К обсуждению вопросов по ходу написания работы автором привлекал ведущих

специалистов по теме проводимых исследований, по результатам исследования написаны и опубликованы статьи, а по материалам обзора литературы опубликована монография «Половые стероидные гормоны и рак молочной железы».

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых ВАК. Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Высокие технологии в онкологии» (Барнаул, 2012) и Научно-практической конференции с международным участием «Инновации в лабораторной медицине» (Новосибирск, 2012).

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками. Список литературы содержит 257 библиографических источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выборки. Выборка женщин со спорадической формой рака молочной железы и контрольная группа были сформированы в рамках эпидемиологического исследования, проводимого Алтайским филиалом ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Все женщины принадлежали к европеоидной расе русской этнической группы и проживали на территории Алтайского края РФ. Все члены выборок подписывали информированное согласие в соответствии с требованиями этического комитета. В контрольную группу было включено 480 женщин (средний возраст - 53.9 ± 12.6), не имеющих онкологических заболеваний. Экспериментальная выборка состояла из 670 женщин (средний возраст — 56.3 ± 7.8 лет) с гистологически верифицированным диагнозом РМЖ. Из них 529 (79%) пациенток имело РМЖ в постменопаузе, 141 (21%) - в пременопаузе. Уровни экспрессии ER, PGR и HER2/neu исследовали в опухоли у 60% пациенток иммуногистохимическим (ИГХ) методом, который основан на специфическом связывании антител, меченных специальными красителями, с выявляемыми молекулами в биологическом материале (табл. 1). Выраженность экспрессии оценивали в баллах от 0 до 300 по шкале Н-счёта, используя следующую формулу: Н = 3*А + 2*В + 1*С, где А - процент сильноокрашенных ядер опухолевых клеток, В - процент умеренно окрашенных

ядер, С - процент слабоокрашенных ядер. Основываясь на результатах ИГХ исследования, для дальнейшего анализа были выделены подгруппы женщин с низким (от 0 до 50 баллов) и высоким (100 и выше баллов) уровнем экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевых клетках.

Таблица 1. Уровень экспрессии ER, PGR и HER2/neu в опухолевой ткани пациенток, больных РМЖ._

Показатели Количество пациенток (%)

< 50 баллов от 50 до 100 баллов >100 баллов

ER 177 (44.4 %) 60(15.0%) 162 (40.6 %)

PGR 202 (50.6 %) 43 (10.8 %) 154 (38.6%)

HER2/neu 133 (33.3 %) 76 (19.0 %) 191 (47.8 %)

Для 81% женщин из контрольной и 75% женщин из экспериментальной выборки имелась информация о продолжительности лактации (табл. 2).

Таблица 2. Продолжительность лактации у женщин из контрольной и экспериментальной групп.

Лактация Количество пациенток (%), экспериментальная группа Количество пациенток (%), контрольная группа

не было 38 (7.6 %) 56 (14.4 %)

менее 1 года 299 (59.4 %) 276 (71.1 %)

более 1 года 166 (33.0%) 56 (14.4 %)

Определение генотипов. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом. Данный метод является трудоёмким и затратным по времени, тем не менее позволяет получить большой выход материала (около 2,5 мкг ДНК из 3-4 мл крови). Кроме того, ДНК, выделенная данным методом, содержит минимальное количество примесей, что является важным преимуществом данного метода, поскольку примеси могут снижать эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение генотипов полиморфных локусов rs 1056836 в гене CYP1B1, rs 1048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1 и rsl042838 в гене PGR проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплиментарных

полиморфной последовательности ДНК. Данный метод является быстрым и простым в исполнении и позволяет наблюдать картину накопления продукта непосредственно во время реакции. Вследствие этого, не требуется этап электрофоретического анализа продуктов амплификации, который всегда сопряжен с риском контаминации реагентов наработанными фрагментами ДНК. На рис. 1 в качестве примера представлены кривые накопления флюоресценции

и кластеризация образцов на основе интенсивности флюоресценции для полиморфного локуса CYP1B1 rsl056836.

Для локуса rs743572 в гене CYP17A1 нуклеотидное окружение полиморфного участка ДНК не позволяло подобрать TaqMan зонды, имеющие оптимальную температуру отжига, поэтому для определения генотипов использовали более трудоёмкий метод, также основанный на ПЦР в режиме реального времени -метод аллель-специфичной ПЦР с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I (индикатора начилия двуцепочечной ДНК в образце). На рисунке 2 представлены кинетические кривые накопления флюоресценции, а также график производных кривых плавления для трех генотипов локуса CYP17A1 rs743572.

ПЦР проводили на ДНК-амплификаторах iCycler iQ5 и CFX96 («Bio-Rad», США).

Статистическая обработка данных. Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов исследуемых локусов в опытной и контрольной группах проводили с использованием критерия х2, тест на соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга - с использованием точного критерия Фишера. Различия в частотах считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0.05. Для оценки степени выраженности влияния полиморфных локусов на риск РМЖ использовали отношение шансов (OR) с его 95% доверительным интервалом (СЛ.). Вычисления производили с помощью он-лайн программы DeFinetti (http://ihg2.he1niholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwal.pt). В настоящем исследовании также была проведена оценка значений OR, которые со статистической мощностью, равной 80%, могут быть выявлены при данном размере анализируемых групп. Вычисления были проведены с помощью онлайн программы Genetic Power Calculator (http://pngii.mgh.harvard.edii/~purcel1/gpc/).

і z ...«-" 1 . ■' ........ і FAM J 1 a) j Ci FAM < R6G /і.................. б)

.... .................. \

СїЛ.

і Z ..... .....Щ в) 5- Ii I ] 1 г)

» :......................:....... і .. _сс|

і

i » « і ■ .^..Г*-'''" - І

Рисунок 1. Кривые накопления флюоресценции для трех генотипов локуса СУР1В1 гэ 105683 6 и результаты кластеризации образцов в группы на основании интенсивности флюоресценции, а) генотип СС, б) генотип СО, в) генотип вв, г)

кластеризация образцов.

Т а) |:L=Jzzdzzztzrtzdcz; ¡-,.5.............;.............;.............j.....j......j................... с - б> С т ! ' It

с т в) ............|.........................1..../....I...........I.........j i : • * - г) ~ Специфический пик * I < 1

Рисунок 2. Кинетические кривые накопления продуктов амплификации лля трех генотипов полиморфного локуса СУР17А1 ге743572. а) генотип ТТ, б) генотип СС, в) генотип СТ, г) график производной кривой плавления.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе были определены частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах метаболизма половых стероидных гормонов -rsl056836 в гене CYP1B1, rsl048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 - в выборке женщин, больных спорадическим РМЖ, и в группе контроля. Распределение генотипов в контрольной выборке для всех проанализированных локусов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.

Влияние генетических вариантов на риск развития заболевания может быть разным на фоне действия различных факторов - в том числе, образа жизни пациенток, их гормонального статуса, особенностей метаболизма и др. Например, полиморфные локусы, эффект которых связан с увеличением концентрации эстрогенов в ткани молочной железы, могут оказывать большее влияние на риск РМЖ у женщин, имеющих большее количество рецепторов к этим гормонам. Также, можно предположить, что влияние этих локусов на риск будет более выражено в период, когда уровень эстрогенов в организме пациентки выше — в период до наступления менопаузы. Поскольку некоторые ферменты метаболизма стероидных гормонов также участвуют в метаболической активации ряда канцерогенных веществ, то на их эффект может оказывать влияние продолжительность лактации (при лактации из молочных желез выводятся в том числе и вещества, обладающие канцерогенным действием).

В связи с этим, мы разделили выборку пациенток с РМЖ на подгруппы, в зависимости от (1) уровня экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона и белка HER2/neu, (2) менопаузального статуса, (3) продолжительности лактации и оценили влияние исследуемых локусов на риск РМЖ в каждой из подгрупп по отдельности.

Мы проанализировали следующие подгруппы больных:

1. подгруппы пациенток с низким (от 0 до 50 баллов) и высоким (100 и выше баллов) уровнем экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевых клетках,

2. подгруппы женщин с РМЖ в пост- и пременопаузе

3. подгруппы женщин

— не кормивших грудью

— кормивших грудью (лактация любой продолжительности)

- кормивших грудью больше года

- кормивших грудью меньше года

Частоты аллелей и генотипов в контрольной группе сравнили с таковыми в экспериментальной выборке и в её подгруппах с целью выявления ассоциации с риском РМЖ и его подтипами. Выявленные ассоциации представлены в таблицеЗ.

Таблица 3. Выявленные ассоциации аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах метаболизма половых стероидных гормонов с раком молочной железы (РМЖ) и его подтипами.

Локус Подгруппа РМЖ СЖ (отношение шансов); 95% С.1.(95% доверительный интервал); р Р*

rsl042838 PGR РМЖ (Ж (ТТ ув вв) = 2.27; 1.09-4.70; 0.02 (Ж (Т ув в) = 1.31; 1.05-1.65; 0.02 0.12 0.12

РМЖ (экспрессия Ж в диапазоне от ) до 50 баллов) СЖ (ТТ ув вй) = 2.83; 1.12-7.13; 0.02 (Ж (ОТ уэ вв) = 1.53; 1.04-2.24; 0.03 <Ж (ТУЭ в) = 1.59; 1.17-2.18; 0.003 0.12 0.18 0.02

РМЖ (экспрессия ^ОЯ в диапазоне от 0 до 50 баллов) <Ж (ТТ УБ вв) = 2.67; 1.09-6.57; 0.03 (Ж(ТУБ й)= 1.52; 1.12-2.06; 0.006 0.18 0.04

ЭМЖ (экспрессия ЖИ2/пеи в диапазоне от 0 до 50 баллов) (Ж (ТТ УЭ Ов) = 4.66; 1.91-11.36; 0.0002 (Ж (Т УЭ в) = 1.82; 1.30-2.55; 0.0004 0.001 0.002

РМЖ (лактация пюбой 1родолжительност ■I) <Ж(ТТУ5 0С) = 2.32; 1.08-5.00; 0.03 (Ж (ТУЯ в) = 1.34; 1.05-1.72; 0.02 0.18 0.12

3МЖ (лактация иенее года) (Ж (ТТ УБ вв) = 2.61; 1.15-5.92; 0.02 (Ж(ТУБв) = 1.40; 1.06-1.83; 0.02 0.12 0.12

rs2470152 CYP19A1 РМЖ (лактация ченее года) СЖ(ТТУ5СС) = 1.60; 1.07-2.41; 0.02 (Ж(ТуеС)= 1.27; 1.03-1.57; 0.02 0.12 0.12

rsl048943 CYP1A1 РМЖ (нет пактации) генотип вв ассоциирован с увеличением риска РМЖ**; р = 0.0004 0.002

rs743572 CYP17A1 РМЖ ^пременопауза) <Ж(ССубТТ) = 2.04; 1.01-4.15; 0.04 (Ж (С УБ Т) = 1.45; 1.02-2.06; 0.04 0.24 0.24

* значение р после введения поправки Бонферрони на множественное сравнение. ** (Ж (вв уэ АА) невозможно вычислить, поскольку частота генотипа Єй в контрольной группе равно нулю.

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs!056836 гена CYP1B1 с риском РМЖ

Фермент CYP1B1 экспрессируется в ткани молочной железы и других органах и катализирует реакцию гидроксилирования эстрогенов по 4 положению. Продукты этой реакции, 4-гидроксиэстрогены, обладают потенциальным генотоксическим и мутагенным эффектом. Кроме того, они медленнее, чем эстрогены, диссоциируют от эстрогеновых рецепторов и могут оказывать более сильное пролиферативное воздействие на клетки молочных желез. Минорной активностью этого фермента является образование 2-гидроксиэстрогенов, не обладающих канцерогенными свойствами, и 16-гидроксиэстрогенов, способных ковалентно связываться с рецепторами и вызывать стойкий пролиферативный эффект в клетках-мишенях. Фермент CYP1B1 также задействован в метаболической активации проканцерогенов, таких как полициклические ароматические углеводороды и гетероциклические ароматические амины. В исследовании Wen et al, (2007) было показано достоверное увеличение экспрессии данного фермента в опухолевой ткани молочной железы по сравнению с нормальной.

Нуклеотидная замена C4326G (rsl056836) в гене CYP1B1 приводит к аминокислотной замене Leu432Val в последовательности фермента CYP1B1. Функциональный эффект данной замены в настоящее время ещё до конца не установлен (Hanna et al, 2000; Shimada et al, 1999). В настоящей работе были определены частоты аллелей и генотипов данного локуса в группе больных спорадическим РМЖ и в контрольной группе женщин без онкологических заболеваний и изучена ассоциация rsl056836 с риском РМЖ и его подтипов.

Частота аллеля G (Val) в контрольной выборке русских жительниц Алтайского края составила 41%, что несколько ниже, чем частота этого аллеля в некоторых странах Европы, таких как Германия (45%), Швеция (45%), Польша (по разным данным - 44% и 42%), но выше, чем в Финляндии (34%). Сравнение вышеуказанных частот методом х2 показало, что различия значимы лишь при сравнении настоящей выборки с немецкой (р = 0.03) и финской (р = 0.001) популяциями. В российской популяции частота аллеля G была определена ранее в выборке, проанализированной авторами Зимарина с соавт. (2004), и составила 44%. Различия в частотах аллелей между данной выборкой и группой русских жительниц Алтайского края также не были статистически значимыми.

Анализ ассоциации rsl056836 с риском РМЖ и его подтипов не выявил значимой ассоциации ни в совокупной выборке, ни в проанализированных подгруппах. В большинстве исследований, выполненных другими авторами, локус rs 1056836 также не был ассоциирован с РМЖ. Исключение составили работы Listgarten et al. (2004), Jiao et al. (2010); Wang et al. (2011) и Le Marchand et al. (2005). Однако, в трех последних работах наблюдалось значимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга в группах контроля, поэтому к результатам этих работ следует относиться с осторожностью.

По всей видимости, rsl056836 CYP1B1 не ассоциирован с риском РМЖ, либо его ассоциация настолько мала, что может быть детектирована только на

выборках большего размера, чем анализировались до нынешнего времени. В настоящей работе, при размере выборки 642/463 (случай/контроль), со статистической мощностью 80% можно было выявить ассоциацию rsl056836 с риском РМЖ с OR не менее 1.28. Ассоциация с меньшим значением OR могла быть пропущена. Для проанализированных подгрупп РМЖ с вероятностью 80% можно было детектировать ассоциацию с ещё большим значением OR (от 1.29 до 1.80). Для выявления более слабой ассоциации rs 1056836 с РМЖ различных подтипов целесообразно исследовать более крупные выборки.

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs!048943 гена CYP1A1 с

риском РМЖ

Фермент CYP1A1 катализирует реакции гидроксилирования эстрогенов (преимущественно по 2 положению), а также реакции первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, таких как полициклические ароматические углеводороды, гетероциклические ароматические амины, хлорорганические соединения. Данные реакции приводят к их активации и образованию аддуктов с ДНК. Таким образом, увеличение активности CYP1A1 может приводить к повышению внутритканевой концентрации активных метаболитов и способствовать злокачественной трансформации. В экзоне 7 гена CYP1A1 располагается полиморфная замена A/G, обозначаемая как A4889G или A2455G. В литературе аллель G также обозначается как CYP1A1*2C или т2. Получаемая аминокислотная замена Ile462Val в гем-связывающем домене фермента ассоциируется с увеличенной индуцибельностью и активностью фермента (Crofts et al, 1994; Kiyohara et al; 1996, Land, et al, 1994). В настоящей работе изучалось влияние данного полиморфного локуса на риск РМЖ у русских жительниц Алтайского края.

Частота аллеля G в контрольной группе (4%) не отличалась значимо от частоты этого аллеля в Германии, Австрии, Англии, в популяции канадцев французского происхождения и Польше и была статистически значимо ниже, чем в Финляндии (7%).

В результате сравнения частот аллелей и генотипов в выборке больных РМЖ и контрольной группе не было выявлено ассоциации rsl048943 с изменением риска данного заболевания, за исключением подгруппы женщин, не кормивших грудью. Частота генотипа GG в этой подгруппе больных РМЖ составила 3%, в то время как в контрольной выборке этот генотип не встречался. Значимость различий была достаточно высока (р = 0.0004) и не нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение (после введения поправки р = 0.002). Тем не менее, нулевая частота встречаемости генотипа GG в группе контроля обусловила невозможность вычисления значения OR (GG vs АА) в настоящем исследовании (нуль в знаменателе формулы). Для того, чтобы в контрольной группе встретился хотя бы один генотип GG при частоте аллеля G, равной 4%, размер контрольной выборки должен составлять не менее 625 женщин.

Кормление грудью является фактором, снижающим риск РМЖ (Helewa et al, 2002). Анализ результатов 47 эпидемиологических исследований, выполненных в 30 странах, показал, что риск РМЖ снижается на 4.3% на каждые 12 месяцев грудного вскармливания (в дополнение к 7% снижению риска, приходящемуся на каждые роды). В исследовании Ing et al. (1977), в котором анализировали выборку женщин, проживавших в Гонконге, которые в силу культурных традиций кормили только правой грудью, было выявлено четырехкратное увеличение риска рака левой груди по сравнению с правой. Предполагаемые причины протективного эффекта лактации - это, во-первых, снижение числа овуляций и уровня эстрогенов в молочной железе. Во-вторых, кормление грудью понижает уровень рН в ткани молочной железы, что препятствует гиперплазии (Kennedy, 1994). В третьих, при кормлении из долек и протоков молочных желез выводятся соединения, обладающие канцерогенной активностью (например, органохлорины). У некормящих женщин ксенобиотики экскретируются в протоки и аккумулируются в них, что может способствовать злокачественному перерождению протокового эпителия (Petrakis et al, 1975). Вероятно, увеличение риска РМЖ у носительниц гомозиготного генотипа GG, не кормивших грудью, связано с более интенсивной (чем у носителей других генотипов) активацией проканцерогенов, накопившихся в молочных железах и не секретируемых наружу с молоком.

Необходимо отметить, что в настоящей работе подгруппа больных РМЖ, не кормивших грудью, имела небольшой размер (35 человек). Поэтому в дальнейшем целесообразно подтвердить выявленную ассоциации на выборке большего размера.

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs762551 гена CYP1A2 с

риском РМЖ

CYP1A2 является одним из основных ферментов, катализирующих гидроксилирование эстрогенов по 2 положению. Также этот фермент участвует в метаболизме кофеина, афлатоксина В1, ацетаминофена и различных полициклических ароматических углеводородов. CYP1A2 экспрессируется в преимущественно в печени, составляя до 13% от всех печеночных CYP. В молочной железе экспрессия этого фермента не обнаружена. В 1 интроне гена CYP1A2 располагается полиморфный локус rs762551 (замена А-164С, обозначаемая также в литературе как CYP1A2*1F), который, в соответствии с данными, полученными рядом авторов (Castorena-Torres et al, 2005; Dobrinas et al, 2011; Han et al, 2001; Sachse et al, 1999), снижает активность фермента.

Частота аллеля С в контрольной выборке женщин, проанализированной в настоящем исследовании, составила 37%. Эта частота незначимо отличалась от частоты аллеля С во французской (36%) и североамериканской (35%) популяциях, но была значимо выше, чем в Швеции и Германии (29%), Англии (33%) и Италии (33%).

В настоящем исследовании не было выявлено ассоциации rs762551 с риском РМЖ у русских жительниц Алтайского края. В большинстве предыдущих работ, посвященных анализу влияния этого локуса на риск РМЖ, включая мета-анализ авторов Qiu et al. (2010), ассоциации также показано не было.

Настоящая работа имела 80% статистическую мощность для детекции ассоциации с OR не менее 1.45 в совокупной выборке РМЖ и не менее 1.48-2.44 в подгруппах. Поэтому нельзя исключить, что rs762551 всё же ассоциирован с РМЖ в российской популяции, но для выявления этой ассоциации потребуются выборки большего размера.

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs2470152 гена CYP19A1 с

риском РМЖ

В гене CYP19A1 закодирован фермент ароматаза, конвертирующий андрогены в эстрогены в различных тканях организма, в том числе в молочной железе. Увеличение активности фермента может приводить к повышению концентрации эстрогенов, что может лежать в основе развития рака молочной железы. В работах Eriksson et al. (2009) и Jiang et al. (2010) было выявлено, что полиморфный локус rs2470152 (С/Т), расположенный в первом интроне гена CYP19A1, ассоциируется со снижением уровня эстрогенов в плазме мужчин. У европеоидных носителей генотипа СС уровень эстрадиола был выше на 11-13% по сравнению с носителями генотипа TT, а уровень эстрона — на 10-16%. Анализ влияния данного SNP на уровень эстрогенов у женщин до настоящему времени ещё не проводился.

В нашей работе впервые в мире было исследовано влияние rs2470152 на риск развития РМЖ. Частота аллеля Т в контрольной выборке русских жительниц Алтайского края составила 41%, что статистически значимо ниже, чем в европеоидных группах в работе Eriksson et al. (2009) (46-48%). Частоты, приведенные в базе данных NCBI для трех выборок европеоидного происхождения, тоже выше и составляют 45-50% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/snp ref.cgi?rs=2470152).

Нами не было выявлено ассоциации rs2470152 с риском РМЖ и его подтипов за исключением подгруппы женщин, кормивших грудью менее года (табл. 3). Тем не менее, уровень значимости был невысок (р = 0.02), и значимость ассоциации нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение (после поправки р = 0.12). Объяснить полученную ассоциацию затруднительно: поскольку лактация является протективным фактором в отношении риска РМЖ, а локус rs2470152 теоретически должен снижать уровень эстрогенов у женщин, то ожидаемая ассоциация - обратная (снижение риска). В нашей же работе носители аллеля Т, напротив, имели повышенный риск РМЖ. Чтобы подтвердить или опровергнуть выявленную ассоциацию, целесообразно провести дополнительные исследования на подгруппах большего размера.

Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl042838 гена PGR с риском

РМЖ

Прогестерон является стероидным гормоном, контролирующим процессы пролиферации и дифференцировки в молочной железе. Рецепторы прогестерона, PRA и PRB, принадлежат к классу ядерных рецепторов и закодированы в одном и том же гене, транскрибируясь при этом с разных промоторов. Вследствие этого, PRB имеет N-концевую последовательность длиной в 164 аминокислоты, отсутствующую у PRA (Scarpin et al, 2009). В ряде исследований было показано, что PRB требуется для нормального развития молочных желез, a PRA — для развития матки и поддержания репродуктивной функции.

Полиморфный локус rsl042838 (замена G/T, Val66QLeu) в гене рецептора прогестерона PGR находится в полном неравновесии по сцеплению с двумя другими локусами в том же гене - rsl042839 (замена С/Т, HisllQHis) и интронной инсерцией Alu-повтора (320 п.н.). Аллель, несущий замены rsl042838 Т, rsl042839 Т и /1/н-повтор, обозначается в литературе как аллель PROGINS. Анализ влияния этих генетических изменений на функциональные особенности PGR показал противоречивые результаты (Agoulnik et al, 2004; Romano et al, 2007), зависящие от типа клеток, на которых изучался эффект аллеля PROGINS. На линии раковых клеток молочной железы T47-D было выявлено, что аллель PROGINS ассоциируется со снижением уровня транскрипции и меньшей стабильностью пре-мРНК PRA и PRB. А на другой клеточной линии рака молочной железы, MCF-7, была показана одинаковая способность активировать транскрипцию репортерного гена для мутантной и нормально формы PGR.

В настоящем исследовании был выполнен анализ ассоциации локуса rsl042838 с риском РМЖ у русских жительниц Алтайского края. Ранее эффект этого локуса изучался на выборках разного этнического происхождения, и в большинстве работ ассоциации с риском РМЖ показано не было. В России до нынешнего времени таких исследований не проводилось.

Частота аллеля Т (PROGINS) в группе контроля в настоящей работе составила 15%, что соответствует данным по другим популяциям европеоидного происхождения. Локус rsl042838 показал статистически значимую ассоциацию с увеличением риском РМЖ в совокупной выборке, а также в подгруппах больных РМЖ с низким уровнем экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PGR) и HER2/neu, а также в подгруппе женщин, кормивших грудью (табл. 3). При анализе ассоциации в подгруппах женщин, кормивших более или менее года, значимая ассоциация была обнаружена только для последней.

После введения поправки Бонферрони на множественное сравнение значимость ассоциации сохранилась только для подгрупп с низким уровнем HER2/neu, ER и PGR. В подгруппе с низким уровнем HER2/neu ассоциация имела самый высокий уровень значимости (после введения поправки р = 0.002 для аллеля Т и р = 0.001 для генотипа TT). В подгруппах с низким уровнем экспрессии ER и PGR уровень значимости был ниже, и ассоциация была

значимой только для аллеля Т (после введения поправки р = 0.03 и р = 0.04, соответственно).

Поскольку и роль прогестерона в развитии злокачественных опухолей молочных желез, и функциональное значение аллеля PROGINS при экспрессии гена PGR в ткани молочной железы ещё до конца не установлены, интерпретировать выявленную ассоциацию в настоящий момент достаточно сложно. Если принять гипотезы, постулирующие, что: 1) аллель PROGINS снижает количество рецептора прогестерона в клетке молочной железы, 2) воздействие прогестерона является антипролиферативным, то носители аллеля PROGINS имеют сниженное количество PGR и, вследствие этого, сниженный ответ клеток молочной железы на действие прогестерона, что приводит к увеличению риска РМЖ. Это согласуется с полученными нами данными об ассоциации аллеля PROGINS с РМЖ в подгруппе с низким уровнем экспрессии PGR.

Связь аллеля PROGINS с увеличением риска РМЖ с низким уровнем ER и HER2/neu ещё более сложна для объяснения. В литературе не опубликовано данных о том, влияет ли прогестерон на экспрессию ER и HER2/neu в ткани молочной железы человека посредством его связывания с PGR. В исследовании Richer et al. (2002) изучали какие именно гены находятся под контролем PGR в клеточной линии рака молочной железы T47-D. В опубликованный ими список генов, регулируемых прогестероном в этой клеточной линии, не вошли ни ER, ни HER2/neu. Тем не менее, если предположить, что аллель PROGINS ассоциируется со снижением экспрессии PGR в молочной железе, а прогестерон при связывании с PGR увеличивает экспрессию ER и HER2/neu, то снижение количества PGR на мембранах клеток у носителей аллеля PROGINS привело бы к соответствующему снижению количества ER и HER2/neu. И тогда, если эффект прогестерона антипролиферативный, носители аллеля PROGINS могли бы обладать повышенным риском развития РМЖ в связи с низким уровнем этих рецепторов.

Очевидно, что в этой области исследования больше вопросов, чем ответов, и все вышеизложенные интерпретации требуют принятия слишком большого количества гипотез. Тем не менее, данные об ассоциации rsl042838 с риском РМЖ, полученные в настоящей работе, могут быть полезны для дальнейшей функциональной валидации роли PGR в развитии РМЖ. Выявленную нами ассоциацию необходимо подтвердить на независимых выборках в России или других странах.

Анализ ассоциации полиморфного локуса гз743572гена СУР17А1с риском РМЖ

Фермент СУР17А1 катализирует реакции, продукты которых являются предшественниками стероидных гормонов - андрогенов, эстрогенов, прогестинов, глюкокортикоидов. Полиморфный локус гб743572 (замена Т/С),

располагающийся в 5'-нетранслируемой области гена CYP17A1, создает дополнительный промоторный Spl-сайт. Теоретически, это может оказывать влияние на эффективность транскрипции и концентрацию фермента в клетках и приводить к изменению уровня гормонов в плазме крови и ткани молочных желез. В настоящее время функциональная значимость rs743572 до конца не изучена. В двух работах была выявлена ассоциация этого локуса с увеличением концентрации эстрогенов (Feigelson et al, 1998; Haiman et al, 1999) и прогестерона (Feigelson et al, 1998) в плазме женщин, но эта ассоциация не подтвердилась в двух других исследованиях (Lurie et al, 2005; Travis et al, 2004).

Частота аллеля С, рассчитанная нами для контрольной группы русских жительниц Алтайского края, составила 46%. Эта частота не отличалась значимо от частот в российской популяции, полученных в работах Артамонова с соавт. (2003) (48%) и Kuligina et al. (2000) (45%). В большинстве европейских стран частота аллеля С ниже и составляет 34-42%.

В настоящей работе локус rs743572 не показал статистически значимой ассоциации с риском РМЖ в совокупной выборке и в подгруппах, кроме подгруппы женщин в пременопаузе (табл. 3). Ассоциация имела низкий уровень значимости (р = 0.04) и нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение. Объяснить наличие ассоциации в подгруппе женщин с РМЖ в пременопаузе и отсутствие её в подгруппе женщин с РМЖ в постменопаузе можно тем, что для менопаузы характерен крайне низкий уровень эстрадиола. При этом у женщин с генотипом СС — уровень должен быть несколько выше, чем у носительниц других генотипов, но вследствие общего критического снижения уровня эстрогенов в постменопаузе, носительство генотипа СС теряет свое значение и, по всей видимости, не влияет на риск развития заболевания.

В большинстве аналогичных работ, в том числе в работе Kuligina et al. (2000), выполненной на выборке жительниц Санкт-Петербурга, ассоциации выявлено не было. Тем не менее, в исследовании Артамонова с соавт. (2003) была обнаружена ассоциация rs743572 с увеличением риска РМЖ в российской популяции. Можно предположить, что причиной разницы в результатах служат какие-то различия в особенностях формирования выборок, в том числе различная представленность в выборке пациенток с РМЖ в пре- и постменопаузе. Но выявить эти особенности не представляется возможным, поскольку в публикациях Артамонова с соавт. (2003) и Kuligina et al. (2000) не приведены характеристики исследуемых групп, за исключением среднего возраста и медицинского учреждения, где была сформирована выборка.

Заключение

В настоящей работе были определены частоты генотипов 6-ти полиморфных локусов генов метаболизма половых стероидных гормонов CYP1B1, CYP1A1, CYP1A2, CYP19A1, PGR и CYP17A1 в выборке русских жительниц Алтайского края, а также выполнен анализ ассоциации аллельных вариантов данных генов с риском развития одного из самых распространенных онкологических заболеваний -рака молочной железы. Были выявлены ассоциации локусов rs!042838 в гене PGR и rs1048943 в гене CYP1A1 с увеличением риска развития данного вида опухоли в подгруппах с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов, рецептора HER2/neu и в подгруппе женщин, не кормивших грудью. Результаты данной работы вносят вклад в понимание молекулярно-генетических и, возможно, патофизиологических механизмов развития рака молочной железы. Генетические локусы, показавшие ассоциацию с риском данного заболевания, могут быть использованы в дальнейшем для прогнозирования риска развития рака молочной железы при условии подтверждения обнаруженных ассоциаций на независимых выборках русского этнического происхождения.

ВЫВОДЫ:

1. Полиморфный локус гу1042838 в гене РОЯ ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов (для аллеля Т: ОЛ = 1.59, р = 0.02 в подгруппе с низким уровнем рецептора эстрогена; ОЯ = 1.52, р = 0.04 в подгруппе с низким уровнем рецептора прогестерона) и в группе с низким уровнем экспрессии рецептора НЕЯ2/пеи (для аллеля Т: ОЯ= 1.82, р = 0.002).

2. Полиморфный локус Г51048943 в гене СУР1А1 увеличивает риск развития рака молочной железы в подгруппе женщин, не кормивших грудью (р = 0.002).

3. Аллельные варианты генов метаболизма половых стероидных гормонов гз1056836 в гене CYP1B1, ге762551 в гене СУР1А2, ^2470152 в гене СУР19А1 и ге743572 в гене СУР 17/11 не ассоциированы с риском развития рака молочной железы в исследуемой выборке женщин, либо ассоциация мала для выявления при данном размере анализируемых групп.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Gulyaeva L.F., Mikhailova O.N., Pustylnyak V.O., Kim I.V., Gerasimov A.V., Krasilnikov S.E., Filipenko M.L., Pechkovsky E.V. Comparative analysis of SNP in estrogen-metabolizing enzymes for ovarian, endometrial, and breast cancers in Novosibirsk, Russia. // Adv Exp Med Biol. - 2008.- Vol.617. - P. 359-66.

2. Печковский E.B., Вайнер A.C., Боярских У.А., Билтуева Ю.А., Селезнёва И.А., Синкина Т.В., Лазарев А.Ф., Петрова В.Д., Филипенко М.Л. Аллель PROGINS гена рецептора прогестерона PGR ассоциировано риском рака молочной железы в Западно-Сибирском регионе России. // Medline.ru. -2012. - Т. 13. - № 1. - С. 207-217.

3. Монография: Вайнер А.С., Боярских У.А., Печковский Е.В. Половые стероидные гормоны и рак молочной железы// LAP LAMBERT Academic Publishing (2013-06-26)-ISBN-13: 978-3-659-13005-2, 76c.

Сокращения и обозначения

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГХ - иммуногистохимия мРНК - матричная рибонкулеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция РМЖ - рак молочной железы

CYP1A1 (cytochrome Р450 1А1) -цитохром Р450 1А1 CYP1A2 (cytochrome Р450 1А2) - цитохром Р450 1А2 CYP1B1 (cytochrome Р450 1В1) - цитохром Р450 1В1 CYP17A1 (cytochrome Р450 17А1) - цитохром Р450 17А1 CYP19A1 (cytochrome Р450 19А1) - цитохром Р450 19А1 C.I. (confidence interval) - доверительный интервал ER (estrogen receptor) - рецептор эстрогена FAM (fluorescein) - флуоресцеин

HER2/neu - рецепторная тирозинкиназа семейства erbB

МАРК (mitogen-activated protein kinase) - митоген-активируемая протеинкиназа OR (odds ratio) - отношение шансов

NCBI (National center for Biotechnological Information) - Национальный центр

биотехнологической информации США (Бетесда, Мэриленд)

PGR (progestone receptor) - ген рецептора прогестерона

PRA (progestone receptor А) - рецептор прогестерона А

PRB (progestone receptor В) - рецептор прогестерона В

R6G (rhodamine 6G)- родамин 6G

SNP (single nucleotide polimorfism) - однонуклеотидный полиморфизм Spl - фактор транскрипции семейства Sp/KLF

Благодарности

Автор благодарит:

Заведующего лабораторией клинической биохимии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», д.м.н., чл.корр. РАМН профессора Кушлинского Николая Евгеньевича за научное руководство и консультации по теме диссертации и обсуждение роли молекулярных биомаркеров в канцерогенезе.

Директора Алтайского филиала ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», д.м.н., чл.корр. РАМН, профессора Лазарева Александра Федоровича и заведующую лабораторией, д.м.н. Петрову Валентину Дмитриевну за помощь в сборе биоматериала и формировании выборки пациентов, консультации по клиническим аспектам данной работы и возможность доложить и обсудить результаты исследований на научно-практической конференции.

Заведующего лабораторией фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, к.б.и. Филипенко Максима Леонидовича за общее научное и идеологическое руководство работой и ценные научные и организационно-методические рекомендации.

Сотрудницу лаборатории фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, м.н.с. Шадрину Александру Сергеевну за огромную помощь в работе над совместными публикациями.

Сотрудницу лаборатории фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, с.н.с. к.б.н. Боярских Ульяну Александровну за помощь в статистической обработке результатов исследований и конструктивную критику.

Заведующую лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБУ НИИ МБиБ СО РАМН, д.б.н. профессора Гуляеву Людмилу Федоровну как своего первого научного руководителя, за организационную помощь в подготовке этой диссертации.

Главного специалиста по ЬСЛД МЗ РФ по СФО, д.м.н. профессора Пикалова Илью Викторовича за поддержку, общие консультации и возможность доложить результаты работы на конференции.

Главного специалиста по КЛД ВС РФ, д.м.н. профессора Иванова Андрея Михайловича за поддержку при подготовке к сдаче кандидатских экзаменов в BMA им. Кирова г. Санкт-Петербург.

Заместителя генерального директора по науке компании Инвитро, к.м.н. Юрасова Василия Викторовича и заведующую КДЛ ФГБУ КБ УДП, к.б.н.

Стериополо Нику Александровну за моральную поддержку и ценные замечания по сути и стилю изложенного материала.

д.б.н. Гимаутдиновой Ольге Ивановне и д.б.н. Макаровой Светлане Ивановне за самоотверженный труд и помощь в работе над ошибками.

Подписано в печать 08.11.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 187

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Печковский, Евгений Васильевич, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреяедение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Россиийской академии наук

Печковский Евгений Васильевич

Роль полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов в формировании риска развития рака молочной железы у русских жительниц

Алтайского края

03.01.04 - биохимия 03.01.07 - молекулярная генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАМН, профессор Кушлинский Николай Евгеньевич к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Новосибирск 2013

Оглавление

Введение..................................................................................................................................................3

Основные положения, выносимые на защиту.....................................................................................6

Обзор литературы...................................................................................................................................8

1. Гормоны как регуляторы физиологических функций....................................................................В

2. Молекулярные механизмы действия половых стероидных гормонов.........................................9

2.1. Эстрогены................................................................................................................................9

2.2. Прогестерон...........................................................................................................................19

2.3. Андрогены..............................................................................................................................22

3. Метаболизм стероидных гормонов................................................................................................27

4. Роль метаболизма стероидных гормонов в раке молочной железы............................................33

5. Полиморфизм генов метаболизма половых стероидных гормонов и рак молочной железы... 38

5.1. Полиморфный локус rsl056836 гена CYP1B1...................................................................38

5.2. Полиморфный локус rsl048943 гена CYP1A1...................................................................41

5.3. Полиморфный локус rs762551 гена CYP1А2.....................................................................43

5.4. Полиморфный локус rs2470152 гена CYP19A1................................................................45

5.5. Полиморфный локус rs743572 гена CYP17A1...................................................................47

5.6. Полиморфный локус rsl042838 гена PGR..........................................................................49

Материалы и методы............................................................................................................................52

1. Исследуемые группы.......................................................................................................................52

2. Определение генотипов...................................................................................................................54

3. Статистическая обработка данных.................................................................................................59

Результаты.............................................................................................................................................62

Обсуждение...........................................................................................................................................74

1. Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl056836 гена CYP1B1 с риском РМЖ................74

2. Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl048943 гена CYP1 AI с риском РМЖ...............75

3. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs762551 гена CYP1А2 с риском РМЖ.................77

4. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs2470152 гена CYP19A1 с риском РМЖ.............78

5. Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl042838 гена PGR с риском РМЖ......................79

6. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs743572 гена CYP17A1 с риском РМЖ...............81

Выводы..................................................................................................................................................83

Заключение...........................................................................................................................................84

Сокращения и обозначения.................................................................................................................85

Список литературы..............................................................................................................................86

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) является самым распространённым онкологическим заболеванием среди женщин. Вероятность развития РМЖ на протяжении жизни составляет в среднем 9-10 %, а в случае наличия этого заболевания в семейном анамнезе - как минимум 20% [1,2]. Как заболеваемость, так и смертность от РМЖ в настоящее время имеют тенденцию к неуклонному росту. РМЖ имеет мультифакториальную этиологию, то есть на риск его возникновения оказывают влияние как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Роль генетических факторов более высока при семейной форме РМЖ, которая составляет около 10% от общей заболеваемости этим видом неоплазии. В этом случае к развитию опухоли приводят высокопенетрантные мутации в таких генах, как BRCA1 и BRCA2, СНЕК2, PTEN, ATM [3]. Спорадическая форма РМЖ развивается, как правило, у женщин старше 40-45 лет, не имеющих семейной отягощенности по этому заболеванию. К развитию такой формы РМЖ могут приводить аллельные варианты различных генов в сочетании с воздействием внешних факторов (канцерогенные вещества, курение и употребление алкоголя, ионизирующее излучение, стресс, травма молочных желез и др.) Идентификация генетических вариантов, ассоциированных с увеличением риска развития опухоли, открывает новые возможности для прогнозирования риска РМЖ и ранней диагностики, а следовательно и успешного лечения этого заболевания.

Известно, что половые стероидные гормоны (эстрогены, андрогены, прогестерон) необходимы для правильного развития и функционирования молочных желез [4]. Действие этих гормонов осуществляется через геномные и негеномные механизмы. В первом случае димеризованные комплексы рецептор-гормон связываются с респонсивными элементами ДНК и регулируют экспрессию генов [5]. Во втором случае гормоны через свои рецепторы взаимодействуют с участниками МАРК-киназного пути внутриклеточной передачи сигнала, и таким образом участвуют в регуляции эффектов других сигнальных молекул [6]. Метаболизм стероидных гормонов является важным

регулятором гормонального гомеостаза в молочной железе, поддерживая оптимальную концентрацию гормонов в этом органе. Нарушение метаболизма половых стероидных гормонов может приводить к аккумуляции соединений, обладающих способностью индуцировать пролиферацию клеток и ингибировать апоптоз, а также повреждать генетический материал. Это может лежать в основе злокачественной трансформации.

К настоящему времени в мировой литературе опубликован ряд исследований, в которых изучали влияние аллельных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов на риск развития РМЖ. Тем не менее, результаты работ, выполненных на популяциях различного этнического происхождения, противоречивы и не позволяют однозначно ответить на вопрос о роли полиморфизма этой группы генов в развитии данной патологии. Таким образом, исследование ассоциации полиморфных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском РМЖ в русской этнической группе является важной и актуальной задачей.

Цель настоящего исследования - изучение ассоциации полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rsl048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 в выборке женщин, больных спорадическим раком молочной железы, и в группе контроля.

2. Выполнить анализ ассоциации аллелей и генотипов вышеуказанных полиморфных локусов с риском развития рака молочной железы.

3. Исследовать влияние аллельных вариантов данных полиморфных локусов на риск рака молочной железы в подгруппах женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов прогестерона (PGR), эстрогенов (ER) и HER2/neu в

опухолевых клетках, в подгруппах женщин с разной продолжительностью лактации, а также в пре- и постменопаузе.

Научная новизна работы - впервые изучена ассоциация полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rsl048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 с риском РМЖ в популяции этнических русских на представительной выборке, состоящей из 670 женщин, больных спорадическим РМЖ, и 480 женщин без онкологических заболеваний. При этом ассоциация локуса rs2470152 в гене CYP19A1 с риском данного заболевания исследована впервые. Ни для одного из локусов не было продемонстрировано ассоциации с риском данного заболевания после введения поправки на множественное сравнение. Кроме этого, впервые проведен анализ влияния вышеописанных полиморфных вариантов на риск РМЖ в подгруппах женщин, имеющих разную продолжительность лактации, разный уровень экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевой ткани и у женщин в пост- и пременопаузе. Впервые выявлена ассоциация локуса rs1042838 в гене PGR с увеличением риска РМЖ в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и рецептора HER2/neu, а также локуса rs 1048943 в гене CYP1A1 с риском развития РМЖ в подгруппе женщин, не кормивших грудью.

Теоретическое и практическое значение - результаты данной работы вносят вклад в понимание молекулярно-генетических и патофизиологических механизмов развития РМЖ, подтверждая гипотезу о роли нарушения баланса метаболизма половых стероидных гормонов в этиологии данного заболевания. Выявленные биологические маркеры PGR rsl042838 и CYP1A1 rsl048943, ассоциированные с риском РМЖ, могут быть использованы в дальнейшем для прогнозирования риска развития данного заболевания при условии подтверждения обнаруженных ассоциаций на независимых выборках русского этнического происхождения. В перспективе, это будет способствовать внедрению персонализированного подхода к профилактике РМЖ.

Помимо этого, в настоящей работе проанализировано распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах метаболизма половых стероидных гормонов в выборке русских жительниц Алтайского края, что вносит вклад в изучение особенностей генетической структуры жителей данного региона.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Полиморфный локус rs1042838 в гене PGR ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов (для аллеля Т: OR=1.59, р=0.02 в подгруппе с низким уровнем ER; OR =1.52,/?=0.04 в подгруппе с низким уровнем PGR) и в группе с низким уровнем экспрессии рецептора HER2/neu (для аллеля Т: OR=l .82, /?=0.002).

2. Полиморфный локус rsl048943 в гене CYP1A1 увеличивает риск развития рака молочной железы в подгруппе женщин, не кормивших грудью (р=0.002).

3. Аллельные варианты генов метаболизма половых стероидных гормонов rsl056836 в гене CYP1B1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1 и rs743572 в гене CYP17A1 не ассоциированы с риском развития рака молочной железы в исследуемой выборке женщин, либо ассоциация мала для выявления при данном размере анализируемых групп.

Личный вклад автора - автор организовал и лично участвовал в сборе и обработке первичного биоматериала, создании системы холодовой цепи доставки образцов, формировании экспериментальной выборки и контрольной группы на базе филиала ФГБУ «РОНЦ им Н.Н.Блохина» РАМН в г. Барнауле, составлении таблиц клинических признаков и формировании критериев разделения пациентов на группы и подгруппы. Автор проводил технические работы по выделению и амплификации ДНК на базе лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины в г. Новосибирске. На основании полученных результатов автором проведен статистический анализ ассоциации полиморфных локусов с риском РМЖ, в том числе в выделенных подгруппах. К обсуждению вопросов по ходу написания работы автор привлекал

ведущих специалистов по теме проводимых исследований, по результатам исследования написаны и опубликованы статьи, а по материалам обзора литературы опубликована монография «Половые стероидные гормоны и рак молочной железы».

Апробация результатов - по теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых ВАК. Основные положения и результаты работы представлены и обсуждены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Высокие технологии в онкологии» (Барнаул, 2012) и Научно-практической конференции с международным участием «Инновации в лабораторной медицине» (Новосибирск, 2012).

Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 13 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 257 библиографических источников.

Обзор литературы 1. Гормоны как регуляторы физиологических функций

Гормоны являются биологически активными веществами, осуществляющими регуляцию многих процессов в организме, включая рост, развитие, обмен веществ, реакцию на изменение условий среды, репродуктивные функции и многое другое. Гормоны могут реализовать свое действие, переносясь с кровью или другими биологическими жидкостями и воздействуя на клетки-мишени, удаленные от места синтеза гормона, то есть осуществлять эндокринную регуляцию функций. Также гормоны способны регулировать деятельность клеток, расположенных рядом с гормон-синтезирующими клетками и даже функционирование самих клеток, вырабатывающих гормон (паракринная и аутокринная регуляция). При интракринной регуляции гормон оказывает воздействие непосредственно на месте синтеза, без необходимости выделять его в межклеточное пространство. Эффекты гормонов реализуются благодаря взаимодействию с рецепторами, которые обладают высоким сродством к гормону и высокой избирательностью связывания. Рецепторы могут быть расположены на мембране клеток, в цитоплазме клеток и в их ядре.

В зависимости от химической структуры, гормоны подразделяются на следующие классы:

1. Класс стероидных гормонов, являющихся производными холестерола;

2. Класс белково-пептидных гормонов;

3. Класс гормонов-производных аминокислот.

В последнее время к гормонам стали относить и такие регуляторные молекулы, как эйкозаноиды - простагландины, лейкотриены, а также липоксины, гидроксипероксины, тромбоксаны, являющиеся производными арахидоновой кислоты, и другие биологически активные вещества, например, окись азота или витамин Д и его производные.

Класс стероидных гормонов включает в себя:

- Прегнановые производные, такие как минералокортикоиды, глюкокортикоиды и прогестины;

- Андростановые производные, к которым относятся андрогены;

- Эстрановые производные, к которым относяится эстрогены;

- Холестановые производные, к которым принадлежит холекальциферол (витамин Эз).

По механизму действия все стероидные гормоны являются гормонами проникающего типа, то есть могут свободно диффундировать через мембрану клетки и взаимодействовать со своими рецепторами, которые являются факторами транскрипции.

Знание молекулярных основ реализации эффектов половых стероидных гормонов позволяет оценить их вклад в основные патофизиологические и молекулярно-генетические механизмы развития рака молочной железы (РМЖ).

2. Молекулярные механизмы действия половых стероидных гормонов

2.1. Эстрогены

Эстрогены относятся к классу стероидных гормонов и играют важную роль в регуляции развития и функционирования женской репродуктивной системы, оказывая пролиферативное действие на клетки эпителия и стромы молочных желез, эндометрия, влагалища и гранулезные клетки фолликулов яичника. Совместно с прогестероном эстрогены регулируют нормальное течение беременности и родов. Помимо влияния на репродуктивную функцию, эстрогены необходимы для поддержания баланса между активностью остеобластов и остеокластов в костной ткани, а также регуляции физиологических процессов в сердечно-сосудистой, иммунной и центральной нервной системе [4]. Эстрогены существуют в трёх основных формах: эстрон (Е1), эстрадиол (Е2) и эстриол (Е3) (рис. 1). Эстрадиол является активной формой эстрогенов и основным видом эстрогенов у женщин репродуктивного возраста. После менопаузы основной формой эстрогенов в плазме женщины становится эстрон. В период беременности ведущую роль играет эстриол [7].

сн3 А СНз1и

„jOCJ У ^J^ НО'''^^

эстрон эстрадиол сн он

J0C CQ I он

эстриол

Рисунок 1. Три основные формы эстрогенов: эстрон, эстрадиол и

эстриол.

Эстрогены осуществляют своё действие благодаря связыванию с рецепторами эстрогена - ERa и ER0. Конечным эффектом взаимодействия эстрогена с рецептором является изменение уровня экспрессии гена-мишени. Известно три механизма реализации этого эффекта:

1. Связывание гормон-рецепторного комплекса с эстроген-респонсивными элементами (EREs; estrogen-responsive elements) в составе промоторов или энхансеров генов-мишеней и регуляция экспрессии этих генов (классический ERE-зависимый механизм действия эстрогенов);

2. Взаимодействие комплекса рецептор-гормон с факторами транскрипции АР-1, Spl, NF-kB, STAT5 и др., приводящее к активации или супрессии транскрипции генов-мишене