Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая мутация рецептора прогестерона

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агульник, Ирина Юрьевна, Новосибирск

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт биоорганической химии

На правах рукописи

Агульник Ирина Юрьевна НОВАЯ МУТАЦИЯ РЕЦЕПТОРА ПРОГЕСТЕРОНА: ЕЁ ВЛИЯНИЕ НА ОНКОГЕНЕЗ, ФЕРТИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИИ

РЕЦЕПТОРА

Генетика 03.00.15

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.х.н. В.В.Власов -

Новосибирск - 1999

1. ВВЕДЕНИЕ 3

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9

1 .Физиология стероидных рецепторов. 9

2. Гомология между стероидными рецепторами 12

3.Функциональная характеристика различных районов стероидных рецепторов. 13

4. Механизм гормональной активации 35

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ 72

1. Анализ экзонов 2-8 рецептора прогестерона. 72

2. Сравнение частоты встречаемости РШЗОЩБ у здоровых женщин и пациенток с раком яичников и груди в китайской и немецкой популяциях. 78

3. Сравнение встречаемости ргс^тз у здоровых женщин, в популяциях с различной частотой заболевания раком яичников. 80

4. Сравнение частоты встречаемости рк^тэ аллеля среди популяции

фертильных женщин и женщин с идеопатическим бесплоднием. 81

5. Сравнительный функциональный анализ нормального и мутантного рецепторов прогестерона. 84

5.1. Сродство нормального и мутантного рецепторов

прогестерона к лиганду. 84

5.2. Определение количества рецептора в клетке. 87

5.3. Сравнение транскрипционной активности. 89

5.4. Динамика диссоциации лиганда и рецептора. 92

5.5. Сравнение стабильности мутантного и нормального

рецепторов прогестерона. 94

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 100

VI. ВЫВОДЫ ________112

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114

ВВЕДЕНИЕ

Рецептор прогестерона (ПР) играет решающую роль в развитии, дифференцировке и функционировании женской половой системы. У мышей с делецией гена рецептора прогестерона нарушены процессы дифференцировки молочной железы, овуляции, имплантации, отсутствует сексуальное поведение и затронута иммунная система (Lydon et al, 1996). Мутации в генах семейства рецепторов стероидных/тиреоидных гормонов приводят к ряду клинических проявлений, таких как микседема (рецептор гормона щитовидной железы) (Oppenhimer et al, 1979), ERKO синдром (рецептор эстрогена) (Korach et al, 1996), рак простаты и бесплодие у мужчин (рецептор андрогена) (Wilson et al, 1983, Patterson et al, 1994). По-видимому, вследствие того, что ПР исключительно важен для репродуктивных функций млекопитающих, отклонения от дикого типа в гене ПР встречаются чрезвычайно редко. До сих пор не было обнаружено мутаций в гене ПР человека. В представленной работе впервые описаны две новых мутации входящих в мутационный комплекс аллеля гена ПР, называемого PROGINS.

В настоящее время клонировано большинство рецепторов стероидных гормонов, определены их структура и функциональные районы. Установлено, что рецепторы стероидных гормонов содержат лиганд- и ДНК-связывающих домены, соединённые подвижным хиндж районом. Для некоторых рецепторов картированы также районы, ответственные за транскрипционную активацию и

репрессию (Meyer et al, 1992, Sartorius et al, 1994); сигналы ядерной транслокации (Guiochon-Mantel et al, 1989), гомо - и гетеро-димеризации (Tetel et al, 1997), участки связывающие ко-репрессоры, ко-активаторы и молекулярные чапероны (Jakson et al, 1997). Изучение мутантного варианта ПР позволит точнее установить значимость районов, в которых произошла мутация, для различных ступений взаимодействия и функционирования рецептора и лиганда. Такой подход использовался и для анализа других стероидных рецепторов. В данной работе сочетается изучение физиологических последствий наличия мутации на уровне целостного организма и функциональных отличий на уровне рецептора.

Ранее было показано, что в популяции здоровых женщин существует вариант гена ПР с инсерцией Alu повтора в интрон G гена рецептора прогестерона, называемый PROGINS (PROGesteron gene INSertion) (Fuqua et al, 1991). Мы предположили, что дополнительные изменения в кодирующей части гена ПР могут изменить функции рецептора и, таким образом, повлиять на риск заболевания раком груди или яичников. Естественно ожидать, что изменения в рецепторе могут также повлиять на репродуктивную функцию, иммунную систему, процессы развития и дифференциации тканей экспрессирующих ПР. Цель работы.

Целью настоящей работы было охарактеризовать структуру аллеля PROGINS гена ПР, охарактеризовать влияние структурных изменений на функцию рецептора и изучить их физиологические последствия.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Установить является ли PROGINS аллель ПР фактором риска в возникновении рака груди и рака яичников в различных этнических группах.

2. Проанализировать частоту встречаемости мутантного аллеля ПР у женщин с идиопатическим бесплодием.

3. Определить, существуют ли дополнительные изменения в кодирующей части гена мутантного рецептора прогестерона PROGINS, приводящие к аминокислотным заменам.

4. Изучить функциональную значимость обнаруженных изменений в структуре белка.

Научная новизна.

В работе впервые установлены новые характеристики аллеля PROGINS рецептора прогестерона. Было показано, что наряду с вставкой Alu повтора в интрон G гена рецептора прогестерона, в мутационный комплекс входят синонимическая замена в пятом экзоне и мутация в четвёртом экзоне, приводящая к замене валина 660 на лейцин. При анализе ДНК всех 1603 женщин в данном

исследовании установлено, что все три изменения всегда присутствовали вместе. В ходе эпидемиологического исследования пяти этнических групп было впервые показано, что существует достоверная корреляция между частотой алллеля PROGINS и частотой рака яичников в данной популяции. Установлено также, что PROGINS аллель встречается чаще среди пациенток с раком яичников и груди и, таким образом, является фактором риска для этих заболеваний. В случае спорадического рака яичников риск заболевания у носителя PROGINS аллеля является одним из наивысших (3.0) из всех известных факторов риска. Было впервые обнаружено, что PROGINS является фактором риска и в случае идиопатического бесплодия. В ходе функционального анализа было определено, что стабильность рецептора прогестерона изменена в результате мутации. Мутантный рецептор более стабилен в . отсутствии гормона и менее стабилен в присутствии гормона. При этом, сродство рецептора к лиганду, динамика диссоциации рецептора и лиганда, а также взаимодействие с молекулярными чаперонами не меняются в результате мутации. Практическая ценность.

Рак груди является самым распространённым раковым заболеванием у женщин (Muir 1987, N.C.f.H. Statistics 1990). У пациенток с раком яичников наблюдается наивысшая смертность по сравнению со всеми гинекологическими опухалевыми заболеваниями (Boring

1993). При этом, только около 10% заболеваний раком яичников и груди являются наследственными и могут быть предсказаны с помощью анализа мутаций генов В11СА1 и ВКСА2 (Мл1а 1994, рЩгеа1 1994). Для оставшихся 90% спорадических раковых новообразований существует очень ограниченный набор факторов, позволяющих адекватно оценить риск заболевания этими видами рака. Мы установили, что описанный в этой работе аллель является фактором риска для спорадического рака молочной железы и яичников. Мы также обнаружили, что РЯООШБ влияет на фертильность носителей. Таким образом, тестирование на присутствие аллеля РЮОШБ в комбинации с другими факторами риска может выявить женщин, имеющих повышенный риск заболевания раком, для профилактической терапии злокачественных новообразований яичников и молочной железы, а также бесплодия.

Результаты работы докладывались на ежегодных 87 и 88 конференциях Американской Ассоциации Изучения Рака (Вашингтон, США, 1996, Сан Диего, США, 1997), 49 Симпозиуме по Фундаментальному Изучению Рака (Хьюстон, США, 1996), 44 Научном собрании Общества Гинекологических Исследований США (Сан Диего, США, 1997), Годовом Собрании Эндокринологического Общества США (Новый Орлеане, США, 1998), а также на межлабораторных семинарах департамента клеточной биологии и департамента акушерства и гинекологии

медицинского колледжа Бэйлор, г.Хьюстон, США, Новосибирского института биоорганической химии, СО РАН, г.Новосибирск и Института цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск. По материалам диссертации опубликовано и принато в печать 12 работ.

Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю диссертации член-корреспонденту РАН д.х.н. Валентину Викторовичу Власову, а также доктору Дирку Кибаку и доктору Нэнси Вайгел.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ФИЗИОЛОГИЯ СТЕРОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Стероидные гормоны регулируют многие сложные физиологические процессы, включая развитие, рост, размножение и метаболизм (Chappell et al 1997, Humphreys et al 1997, Lydon et al 1996, Mani et al 1997). Являясь производными холестерола, они действуют через свои внутреклеточные рецепторы. Активированные рецепторы координируют экспрессию генов посредством либо образования активного транскрипционного комплекса (Yamaraoto et al 1985), либо предотвращая образование такового (Charron et al 1989, Sakai et al

1988).

На рисунке 1 показаны физиологические лиганды стероидных рецепторов. Основываясь на функции стеродов, их можно подразделить на адренальные стероиды и репродуктивные.

Адренальные стероиды регулируют метаболизм гликогена и солей, реакции стресса, нейроэндокринный контроль, рост и ^дифференциацию клеток in vivo и in vitro (Funder 1987). Репродуктивные стероиды ответственны за нормальное развитие первичных и вторичных половых характеристик, сексуальное поведение и играют существенную роль в размножении (Rories et al

1989).

Рисунок 1

Репродуктивные стероиды

Адренальные стероиды

СН„

С= о

Прогестерон

с = о

Альдостерон

Дегидротестостерон

о

Кортизол

он

но

Эстрадиол

Прогестероновый рецептор (ГТР) играет важную роль во всех аспектах женской репродуктивной системы. ПР неоходим для процессов овуляции, зачатия и поддержания беременности (Baulieu, Clarke et al 1990). Экспрессия сбалансированных количеств двух изоформ ПР в эпителии и строме молочной железы необходима для нормального развития железы (Humphreys et al 1997, Shyamala et al 1998, Lydon et al 1996). Мыши с делетированным рецептором прогестерона имеют существенные репродуктивные нарушения. Так, у гомозиготных самок рг"/рг" проявляется неспособность к овуляции, недоразвитие молочной железы, а также полное отсутствие сексуального поведения децидуализации матки в ответ на механическое раздражение (Lydon et al 1986).

Мутаций,,.стероидных гормонов приводят к нарушению регуляции генов. С этой точки зрения, стероидные рецепторы можно рассматривать как протоонкогены (Bishop 1986, Green et al 1986). Ряд наследственных заболеваний, таких как рахит (Hughes et al 1988, Ritchie et al 1989), нечувствительность к андрогенам (Lubahn et al 1989, Gottlieb -et al 1997), а также повышенный риск рака яичников и груди (Agoulnik et al 1999) ассоциируется с мутациями стероидных рецепторов.

В этом обзоре литературы будут рассмотрены основные характеристики структуры рецепторов стероидных гормонов и возможные механизмы гормональной регуляции транскрипции.

2. ГОМОЛОГИЯ МЕЖДУ СТЕРОИДНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

Стероидные рецепторы представляют собой класс транскрипционных факторов, активируемых с помощью гормонов. К настоящему времени гены, кодирующие многие рецепторы стероидных/тиреоидных, гормонов клонированы и хорошо изучены [рецептор прогестерона (ПР)-Соппее1у et al 1986, Gronemeyer et al 1987, Misrahi et al 1987; рецептор эстрогена (3P)-Koike et al 1987, Walter et al 1985; рецептор андрогена (АР) - Chang et al 1988, Lubahn et al 1989; глюкокортикоидный рецептор (ГР) - Hollenberg et al 1985, Miesfeld et al

1986, Murray et al 1987, минералокортикоидный рецептор (MP) - Arriza et al 1987, Patel et al 1989; тиреоидный рецептор (TP)- Thompson et al

1987, Benbrook et al 1987; ретиноидный рецептор (PP) - Giguere et al 1986, Petkovich et al 1987, Zelent et al 1989, Krust et al 1989; рецептор витамина Д (ВДР) - McDonnell et al 1987, Baker et al 1988, Evans et al 1989]. Стероидные рецепторы представляют собой класс транскрипционных факторов, активируемых с помощью лигандов.

Сравнение аминокислотных последовательностей клонированных рецепторов выявило три области гомологии: CI, С2 и СЗ. Наиболее консервативная область (С1) представляет собой богатый цистеином участок, взаимодействующий с ДНК. С2 и СЗ менее консервативны. N-конец белков является рецептор-специфическим. Карбоксильный участок рецептора отвечает за взаимодействие с лигандом, активацию

транскрипции и взаимодействие с ко-репрессорами и ко-активаторами.

Эти структурные характеристики указывают на то, что группа стероидных рецепторов представляет собою древнее семейство регулируемых транскрипционных факторов. Предполагается, что ранние эволюционные формы этих рецепторов регулировались внутреклеточными метаболическими лигандами (O'Malley 1989). Некоторые рецепторы возможно потеряли структуры, связывающие лиганд, и, таким образом, переродились в независимые транскрипционные факторы, как, например, v-erb-A (de Boer et al 1987). Другие рецепторы могли приобрести специфичность к стероидам, гормону поджелудочной железы, ретиноидной кислоте и возможно к другим, ещё неизвестным лигандам. Существует большое разнообразие рецепторов со сходным ДНК -связывающим участком (Giguere et al 1986). Некоторые из этих рецепторов уже клонированы, хотя их лиганды ещё не известны (Giguere et al ,1987, Wang et al 1989, Watson et al 1989, Agoulnik et al 1998). Эти, так называемые "orphan receptors", вероятно представляют собою ранние эволюционные формы в семействе стероидных рецепторов.

Э. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ ДОМЕНОВ СТЕРОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Структура стероидных рецепторов подразделена на функциональные домены, отвечающие за разные функции. Обработка

протеазами позволила разделить ДНК -связывающую активность от стероид-связывающей (Wrange et al 1978, de Boer et al 1987). Исследование различных делений позволило точнее очертить границы этих участков (Maxwell et al 1987, White et al 1987, Haussier et al 1988). Следующие функции стероидных рецепторов рассмотрены ниже, взаимодействие со специфическими последовательностями ДНК, связывание стероидных лигандов, димеризация и взаимодействие с белками-модуляторами.

3.1. СВЯЗЫВАНИЕ ДНК

3.1.а Структурные характеристики регуляторных элементов.

Многие гены, регулируемые стероидами, имеют участок ДНК, специфически связываемый со стероидными рецепторами, называемый steroid responce element (SRE). Эти участки являются типичными транскрипционными энхансерами (Manniatis et al 1987). Их наличие имеет существенное влияние на уровень транскрипции в присутствии стероидных рецепторов и соответствующего гормона (Chandler et al 1983, Ponta et al 1985). Регуляция транскрипции отдельных генов достигается посредством комбинации различных SRE, ко-репрессоров и ко-активаторов (Bradshaw et al 1988, Dynan et al 1989, Tremea et al 1989). Транскрипционный ответ на присутствие стероидов контролируется различным уровнем экспрессии стероидных рецепторов в разных тканях (Vanderbilt et al 1987).

БЕШ описаны практически для всех известных ядерных рецепторов, активируемых лигандами. Таблица 1 показывает основные БЛЕ. Они являются несовершенными палиндромами, разделёнными несколькими нуклеотидами, что указывает на то, что рецепторы связываются с этими последовательностями в виде функциональных димеров (СЬа1ера1<л8 е! а1 1988). У классических адренальных и репродуктивных стероидов промежуток в палиндроме состоит из трёх нуклеотидов. У рецептора гормона поджелудочной железы и витамина ДЗ количество промежуточных нуклеотидов может быть от 0 до 6.

Таблица 1

Класс РЕЦЕПТОР РЬох БЬох БКЕ

I ГР, ПР, МР вБСКУ AGR.NO (ХтТАСА-КЗ-

АР ОБСКУ АБЯШ ТСТТСТ

ПА ЭР ЕвСКА РАТОС} А(ЮТСА№

ТСАССТ

11В ТР-а ЕОСКв КУБ8С АШТСА - ТСАССТ

ТР-Ь ЕОСШ КУЕОК вАТСА -N6- ТСАСС

ПС РР (а,(3,у) ЕвСКО ОАТСА-Ш-ТСАСС

СТТСАС^5-

ОТТСАС

1ГО вдр ЕОСКО РРЫСО ОАСТСА - ТСААСО

Описаны и негативные SRE (hSRE). В большинстве своём они являются теми же палиндромами, но с другим числом промежуточных нуклеотидов. Рецепторы связываются с hSRE, предотвращают образование активного транскрипционного комплекса, и таким образом ингибируют транскрипцию (Drouin et al 1987, Akerblom et al

1988, Sakai et al 1988).

Одним из первых был описан SRE ГР (GRE) у вируса молочной железы мыши (MMTV) (Payvar et al 1981, Scheidereit et al 1983, Bronnegard et al 1987), затем GRE в гене лизоцима курицы (Renkawitz et al 1984). По мере открытия новых GRE, обнаружилось, что последовательность, связывающаяся с ГР, связывается также и с ПР (von der Ahe et al 1985), MP (Arriza et al), АР (Наш et al 1988), но не связывается с ЭР (Otten et al 1988). SRE для рецептора эстрогена (ERE) структурно отличается от типичного GRE (Klock et al 1987). Последовательность ERE более похожа на последовательность SRE TP (TRE) (Brent et al 1989), отличаясь только количеством промежуточных нуклеотидов в палиндроме. Установлено, что РР способен активировать транскрипцию используя TRE (Umesono et al

1989, Graupner et al 1989). Описана также последовательность, которая _ связывается с РР in vivo (de The et al 1990). Не связанный со своим

гормоном TP может действовать как ингибитор генов, регулируемых ретиноидной кислотой и гормоном щитовидной железы. При связывании с гормоном щитовидной железы TP действует как

активатор. Таким образом, через регуляцию уровней различных гормонов достигается более тонк