Роль липопротеинов и их комплексов со стероидными гормонами в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках

Белоногова, Жанна Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль липопротеинов и их комплексов со стероидными гормонами в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль липопротеинов и их комплексов со стероидными гормонами в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках"

На правах рукописи

Белоногова Жанна Ивановна

РОЛЬ ЛИПОПРОТЕИНОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ В РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005532717

О 5 СЕН 2013

Новосибирск — 2013

005532717

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

доктор медицинских наук, академик РАМН

Панин Лев Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Усынин Иван Федорович, доктор биологических наук,

ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, заведующий лабораторией молекулярной биологии клетки

Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологический наук, профессор, ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится 24 сентября 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии» СО

РАМН

Автореферат разослан «_»

2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Русских Г. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Известно, что липопротеины плазмы крови представляют собой одну из самых больших групп сложных плазменных белков крови, состоящие из белка и липидов. Липопротеины осуществляют транспорт липидов из мест их всасывания и синтеза в жировые депо или другие органы, обеспечивают нормальный обмен липидов между кровью и клетками организма. В последнее время имеются данные о липопротеинах как транспортной системе для биологически активных веществ, таких как стероидные соединения [Панин Л.Е. и др., 1988; Meng Q.H. et al., 1999; Khalil А. et al., 2000], тиреоидные гормоны [Benvenga S. et al., 1989, 1991; Поляков Л.М., 1998], жирорастворимые витамины [Glevidence B.A., Bieri J.G., 1993; Панин Л.Е. и др., 1997; Balazs Z. et al., 2004], ксенобиотики [Поляков Л.М. и др., 1992; Woofter R.T., Ramsdell J.S., 2007], различные лекарственные препараты [Rensen P.C. et al., 2001; Lou В. et al., 2005; Lacko A.G. et al., 2007; Feng M. et al., 2008] и эндотоксины [Massamiri Т. et al., 1997].

Клеточный захват липо(апо)протеинов осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, что представляет возможность рассматривать их как ■ потенциальные переносчики ряда лекарственных препаратов. Так ЛПВП с достаточно высоким сродством связывают стероидные гормоны и ксенобиотики, играя роль их активной транспортной формы в организме [Панин Л.Е. и др., 1992; Поляков Л.М. и др., 1992]. Показана способность ЛПВП осуществлять транспорт некоторых противоопухолевых лекарственных препаратов [Kader A., Pater А., 2002], а также способность апоА-I транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты через SR-Bl-рецепторный путь [Kim S.I. et al., 2009; Lee H. et al., 2009]. Отмечено участие апоА-I в переносе олигонуклеотидов через гемато-энцефалический барьер [Kratzer I. et al., 2007].

Помимо транспортной функции липо(апо)протеины принимают участие в регуляции многих метаболических процессов. ЛПВП и апоА-I осуществляют регуляцию обмена холестерина в клетках посредством мембранных белков АВСА1 и SR-BI [Zannis V.l. et al., 2006]. Липопротеины разных классов оказывают влияние на функцию эндокринной системы: на стероидогенез [Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1979; Temel R.E. et al., 1997; Travert С. et al., 2000], на синтез тироксина [Бернштейн Л.М. и др., 1982] и инсулина [Панин Л.Е. и др., 1994]. Описано влияние липо(апо)протеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий [Панин Л.Е. и др., 1982, 1991]. Показана роль липопротеинов и их белковых компонентов в регуляции углеводного обмена [Панин Л.Е. и др., 1990].

Отмечены антимикробные свойства аполипопротеина A-I [Beck W.H. et al., 2013], его противовирусное действие [Srinivas R.V. et al., 1990; Owens B.J. et al., 1990; Панин Л.Е. и др., 2002], а также лизосомотропный эффект [Панин

JI.Е., 1987]. ЛПВП, апоА-I и его синтетические аналоги обладают кардиопротекторным, антиоксидантным и противовоспалительным действием [Ma J. et al., 2004; Gupta Н. et al., 2005; Navab M. et al., 2007; Gomaraschi M. et al., 2008].

Имеются данные о способности ЛПВП усиливать пролиферацию опухолевых клеток [Favre G. et al., 1989, 1993; Rotheneder M. et al., 1989]. Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и их основной белковый компонент аполипопротеин Е (апоЕ) ингибируют деление многих клеток, включая опухолевые [Vogel Т. et al., 1994; Рака L. et al., 1999; Moore Z.W., Hui D.Y., 2005].

Не меньшее внимание исследователей направлено на изучение взаимодействия липопротеинов и гормонов. Отмечено, что стимулирующий эффект эстрадиола на клеточный рост карциномы грудной железы проявляется только в присутствии ЛПВП [Jozan S. et al., 1985]. Показан кооперативный эффект в действии гидрокортизона, адреналина и ЛПВП, в основе которого лежит лизосомозависимая активация хроматина, приводящая к индукции синтеза РНК и белка в печени крыс [Панин Л.Е., 1987; 1990].

В настоящее время в литературе накопилось достаточное количество работ по изучению регуляторной роли липопротеинов плазмы крови и их белковых компонентов, однако многие вопросы в этой области остаются открытыми. В частности, окончательно не выяснены механизмы регуляции метаболических процессов с участием липо(апо)протеинов. Недостаточно работ по изучению возможности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов для повышения эффективности лечения ряда заболеваний.

Цель исследования: изучить роль липо(апо)протеинов, а также их комплексов со стероидными гомонами и противоопухолевыми препаратами в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках. Задачи исследования:

1. Изучить влияние липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на скорость биосинтеза ДНК в опухолевых клетках в опытах in vitro.

2. Изучить влияние липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на скорость биосинтеза белка в опухолевых клетках в опытах in vivo.

3. Изучить возможность комплексообразования липо(апо)протеинов с противоопухолевыми лекарственными препаратами.

4. Изучить влияние липо(апо)протеинов и их комплексов с противоопухолевыми препаратами на скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках НА-1 гепатомы и карциномы Эр лиха в опытах in vitro.

Научная новизна. На культурах опухолевых клеток НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха в опытах in vitro изучено влияние липопротеинов плазмы крови и их комплексов с кортизолом на скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот (ДНК). Показано, что наибольшим ингибирующим эффектом обладал комплекс липопротеинов очень низкой плотности с кортизолом (ЛПОНП-кортизол). На различных клеточных системах в экспериментальных условиях ингибирование составляло от 20 до 70% по отношению к контролю.

Показана возможность использования липо(апо)протеинов для направленного транспорта в опухолевые клетки некоторых цитостатиков. Отмечено, что аполипопротеин A-I в комплексе с актиномицином Д значительно подавляет синтез ДНК. Ингибирующий эффект в условиях направленного транспорта сохраняется даже при низких дозах актиномицина Д. Аналогичный эффект показан и в случае использования винбластина, который ингибирует синтез РНК и подавляет внутриклеточное перемещение.

Теоретическая и практическая значимость. В работе описан неизвестный ранее механизм запуска апоптоза опухолевых клеток: асцитной карциномы Эрлиха и НА-1 гепатомы. Он связан с действием биологически активного комплекса липопротеинов очень низкой плотности и кортизола. Высокая эффективность действия данного механизма подтверждена в опытах с ингибированием скорости биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, а также с помощью электронной микроскопии. Последний метод позволяет утверждать, что гибель опухолевых клеток осуществляется в результате запуска апоптоза.

Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортных форм для противоопухолевых лекарственных препаратов. Применение их в клинической практике открывает новые возможности для подавления опухолевого роста у больных с различными формами онкопатологии. Положения, выносимые на защиту:

1. ЛПОНП в комплексе со стероидными гормонами подавляют биосинтез ДНК и белка в опухолевых клетках как in vitro в сокультуре, содержащей опухоль-ассоциированные макрофаги, так и в опытах in vivo.

2. ЛПВП и их белковый компонент аполипопротеин A-I образуют стабильные комплексы с противоопухолевыми препаратами (актиномицин Д, винбластин и др.). Степень насыщения апоА-I для актиномицина Д составляет 70-80 моль на 1 моль белка.

3. Комплексы ЛПОНП и апоА-I с цитостатиками обладают высокой противоопухолевой активностью, значительно подавляя скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках.

4. Комплексы ЛПОНП-кортизол перспективны в клинике для запуска апоптоза опухолевых клеток, тогда как комплексы апоА-1-цитостатики

могут быть рекомендованы как средства с различным повреждающим

действием.

Апробация работы. Материалы докладывались на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2008), IX германо-российской конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2009), Международной научно-практическая конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2010), VI региональной конференция молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011), Пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011), Второй Международной научно-практическая конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011), Третьей Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XI века» (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 1 - в центральном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов исследований), выводов и списка литературы, включающего 220 источников, из них - 172 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 19 таблицами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на лабораторных животных с моделью опухолевого роста: мыши-самцы линии A/Sn с асцитной НА-1 гепатомой и мыши-самцы линии ICR с асцитной карциномой Эрлиха массой 15-20 г, любезно предоставленные Калединым В.И. (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение

их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984) и специальными рекомендациями [Западнюк И.П. и др., 1974]. Основные методы, используемые в работе:

1. Выделение липопротеинов сыворотки крови методом ультрацентрифугирования в растворах KBr [Hatch F.T., Lees R.S., 1968].

2. Делипидирование липопротеинов [Herbert P.N. et.al.,1973]. Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром.

3. Хроматографические методы. Смесь аполипопротеинов наносили на колонку (1,6 X 100 см) с Сефарозой CL-4B "Pharmacia" (Швеция) и элюировали 0,01 M трис-HCl буфером, pH 8,6, содержащим 6 M мочевину, 0,01% азида натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторида [Herbert P.N. et. al., 1973].

4. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [Laemmli U.K., 1970].

5. В качестве модели опухолевого роста использовалась асцитная карцинома Эрлиха и НА-1 гепатома (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).

6. Скорость биосинтеза белка в культуре клеток оценивали по включению 14С-лейцина и выражали в имп/мин на 1 мг белка [Weigand К. et.al., 1974].

7. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток оценивали по включению 3Н-тимидина и выражали в имп/мин на 1 мг белка [Шаткин А., 1972].

8. Выполнялся твердофазный имуноферментный анализ содержания аполипопротеинов A-I и Е в сыворотке крови мышей с НА-1 гепатомой.

9. Анализ взаимодействия триптофансодержащих белков ЛП-фракций с цитостатиками проводили на спектрофлуориметре «RF-5301 PC» («Shimadzu», Япония) при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 600 нм.

10. Константы ассоциации (Касс) для цитостатиков были рассчитаны на основании кривых тушения флуоресценции [Attala N. A., Lata G.F., 1968].

Статистическую обработку результатов проводили с вычислением простой средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения и ошибки средней (m) [Лакин Г.Ф., 1980]. Совокупность исследуемых признаков распределялась по нормальному закону. Уровень значимости различий экспериментальных данных (р) рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Обработку результатов проводили с использованием прикладной компьютерной программы Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние лииопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на скорость биосинтеза ДНК в опухолевых клетках в опытах in vitro

Исследования проводили на культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха и клеток НА-1 гепатомы с опухоль-ассоциированными макрофагами. Обнаружен ингибирующий эффект ЛПОНП в комплексе с кортизолом на скорость биосинтеза ДНК в клетках НА-1 гепатомы. Снижение скорости биосинтеза ДНК в клетках НА-1 гепатомы составило 52% (табл.1).

Таблица 1

Скорость биосинтеза ДНК в общей культуре клеток НА-1 гепатомы под влиянием комплекса ЛПОНП-кортизол _

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± m, п=6

Контроль 14233±1802

ЛПОНП 9647±1613

Кортизол 9903±2644

ЛПОНП-кортизол 6909±565*

* - достоверноеразличие по сравнению с контролем (р < 0,01)

Полученные ранее в институте биохимии данные говорят, что это может быть связано с действием апоЕ, обладающего антипролиферативной активностью [Князев P.A., 2007]. Однако, присутствие в культуральной среде кортизола, как проапоптотического гормона, позволяет предположить, что это может быть связано с запуском сигнального механизма апоптоза.

Данный механизм действия мы проверили и на другой культуре клеток -асцитной карциноме Эрлиха (табл.2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха наблюдается такой же эффект, как и в клетках НА-1 гепатомы, т.е. наиболее выраженное ингибирование синтеза ДНК отмечено в случае использования комплекса ЛПОНП-кортизол, в которой снижение скорости синтеза составило 46%.

Таблица 2

Скорость биосинтеза ДНК в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха под влиянием комплекса ЛПОНП-кортизол

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± ш, п=6

Контроль 7805±447

ЛПОНП 5002±298

Кортизол 5939±236

ЛПОНП-кортизол 4176±376*

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05)

Вклад в этот механизм опухоль-ассоциированных макрофагов оценивался нами в эксперименте с отсутствием прилипающих клеток, т.е. макрофагов (табл.3).

Таблица 3

Скорость биосинтеза ДНК в культуре асцитной карциномы Эрлиха после удаления прилипающих клеток под влиянием комплекса ЛПОНП-кортизол

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± ш, п=6

Контроль 12681±420

ЛПОНП 8113±1698

Кортизол 10286±1671

ЛПОНП-кортизол 7927±511 *

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05)

Оказалось, что ингибирующий эффект выявлялся и в отсутствии опухоль-ассоциированных макрофагов: подавление синтеза ДНК под действием комплекса ЛПОНП-кортизол в этом случае составило 37%.

По-видимому, в опухолевых клетках также может происходить запуск сигнального механизма апоптоза клеток. Это, конечно, не означает, что опухоль-ассоциированные макрофаги не вносят в него никакой специфики.

В дальнейшем мы исследовали влияние комплекса ЛПОНП-кортизол на биосинтез белка в общей культуре опухолевых клеток (табл.4).

Таблица 4 Скорость биосинтеза белка в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± ш, п=6

Контроль 18800±601

ЛПОНП 19503±1468

Кортизол 18243±1225

ЛПОНП-кортизол 14583±762*м

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,002) *- достоверное различие по сравнению с кортизолом (р < 0,05) $ - достоверное различие по сравнению с ЛПОНП (р < 0,05)

Оказалось, что скорость биосинтеза белка изменялась аналогично скорости синтеза ДНК. Снижение скорости биосинтеза белка в общей культуре опухолевых клетках в присутствии комплекса ЛПОНП-кортизол по сравнению с контролем составило 22%. Это говорит о том, что под влиянием данного комплекса происходит подавление экспрессии генов опухолевых клеток.

Таким образом, в опытах in vitro на культурах опухолевых клеток НА-1 гепатомы и асцитной карциномы Эрлиха показано влияние липопротеинов плазмы крови и их комплексов с кортизолом на скорость биосинтеза белка и ДНК. Оказалось, что наибольшим ингибирующим эффектом обладал комплекс липопротеинов очень низкой плотности с кортизолом (ЛПОНП-кортизол). На различных клеточных системах в экспериментальных условиях ингибирование составляло от 20 до 70% по отношению к контролю. Наиболее выраженный ингибирующий эффект биосинтеза был отмечен в общей культуре клеток в присутствии опухоль-ассоциированных макрофагов.

Влияние липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на биосинтез белка в опухолевых клетках в

опытах in vivo

Для того чтобы ответить на вопрос можно ли результаты, полученные in vitro, переносить на целостный организм, следующую часть работы по выяснению механизма действия комплексов ЛПОНП-глюкокортикоиды мы проводили в опытах in vivo. Комплексы вводили опытным животным, как внутрибрюшинным, так и внутривенным способами. После декапитации животных вскрывали брюшную полость и забирали асцитическую жидкость. Клетки осаждали центрифугированием и инкубировали с |4С-лейцином.

Оказалось, что комплекс ЛПОНП-кортизол in vivo при внутрибрюшинном введении значительно (на 54%) подавлял скорость синтеза белка в общей культуре (табл.5). ЛПОНП без гормона повышали скорость синтеза белка.

Вероятно, этот факт, может быть обусловлен повышенным захватом и использованием ЛПОНП опухолевыми клетками в качестве строительного материала. Известно, что активно пролиферирующие опухолевые клетки имеют повышенную потребность в липидах в качестве структурных компонентов [Lenz М. et al., 1997]

Таблица 5

Скорость биосинтеза белка в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха при внутрибрюшинном введении комплекса ЛПОНП-кортизол_

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± ш, п=6

Контроль 99254±1577

ЛПОНП 131277±3772*

ЛПОНП-кортизол 45424±1578*

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,01)

Внутривенное введение комплекса ЛПОНП-кортизол несколько менее эффективно, чем внутрибрюшинное введение, если судить по скорости включения 14С-лейцина в белок. Оказалось, что действие комплекса на развитие опухоли в данном случае приводило к снижению пролиферативной активности на 24% (табл.6).

Таблица 6

Скорость биосинтеза белка в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха при внутривенном введении комплекса ЛПОНП-кортизол_

Условия инкубации Имп/мин/мг белка М ± ш, п=6

Контроль 103726±4163

ЛПОНП-кортизол 80750±3614*

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05)

Методом электрофореза в геле агарозы нами была дана оценка изменения содержания ДНК и РЖ в клетках асцитной карциномы Эрлиха после удаления прилипающих клеток, т.е. макрофагов. Оказалось, что содержание ДНК в клетках значительно снижается (рисЛА, дорожка 3). Содержание транспортной и рибосомальной РНК также снижается (рис.1 Б, дорожка 3). Полученные результаты хорошо согласуются с фактом ингибирования биосинтеза белка и снижения клеточной пролиферации.

иРНК-рРНК-

тРНК-

1« <и т

1 2 3

Рис. 2. Электронная микроскопия клеток асцитной карциномы Эрлиха после внутрибрюшинного введения комплекса ЛПОНП-кортизол (ув. х8000). 1- Контроль; 2,3- ЛПОНП-кортизол

Электронно-морфологически была обнаружена картина апоптоза опухолевых клеток, включающая секвестрацию цитоплазмы и фрагментацию ядер (рис.2).

12 3 1

А Б

Рис. 1. Электрофорез ДНК (А) и РНК (Б) в геле агарозы 1 - Контроль; 2- ЛПОНП; 3- ЛПОНП-кортизол

В опытах in vivo на мышах с асцитной НА-1 гепатомой, а также с карциномой Эрлиха в результате введения комплекса глюкокортикоиды-ЛПОНП нами наблюдались и внешние различия между контрольными и опытными животными (рис.3).

А Б

Рис.3. Мыши линии ICR на 12-е сутки после перевивания асцитной карциномы Эрлиха.

А - Контроль; Б - Опыт (ЛПОНП-кортизол)

Также отмечено снижение численности популяции опухолевых клеток и уменьшение объема асцитической жидкости. Эти показатели в контроле в два раза превышали соответствующие показатели в опытной группе при внутрибрюшинном введении комплекса ЛПОНП-кортизол, и в полтора раза -при внутривенном введении комплекса.

В проведённых экспериментах на мышах с асцитной карциномой Эрлиха при внутривенном введении ЛПОНП в комплексе с глюкокортикоидами методом диск-электрофореза в ПААГ выявлены различия в спектре белков плазмы крови и асцитической жидкости по сравнению с контролем (введение физиологического раствора). Показано увеличение Р- и у-фракций глобулинов, альбумина (67 кДа), а также содержания белка с молекулярной массой порядка 50-60 кДа, предположительно относящегося к белку р53 (53 кДа). Отмечено появление банда, соответствующего по электрофоретической подвижности апоА-I (28кДа). В наибольшей степени эти различия были заметны в группе мышей, получавших ЛПОНП в комплексе с кортизолом (рис.4).

у- Глобулин Р-Глобулин

Альбумин (67 кДа) Белок (50-60 кДа)

АпоА-1 (28 кДа)

Рис.4. Диск-электрофорез белков сыворотки крови и асцитической жидкости мышей с асцитной карциномой Эрлиха в 12,5% ПААГ с

1,5- контроль; 2,6- ЛПОНП; 3,7- ЛПОНП-кортизол; 4,8- ЛПОНП-дегидроэпиандростерон-сульфат

Кроме того, методом диск-электрофореза изучен спектр белков плазмы крови и экссудата мышей с асцитной НА-1 гепатомой (рис.5). Отличительные особенности белков плазмы крови заключались в увеличении фракций белков, соответствующих по подвижности апоА-1 (28кДа) и низкомолекулярных белков с молекулярной массой 6-8 кДа. Полученные результаты характерны для опытных мышей, получавших ЛПОНП-кортизол и ЛПОНП-дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС). В асцитной жидкости содержание низкомолекулярных белков было снижено по сравнению с контролем, что, по всей видимости, объясняется меньшим выходом белков из плазмы крови или меньшей наработкой белка клетками гепатомы. Это согласовывалось и со снижением объёма асцитной жидкости опытных мышей по сравнению с контрольными.

АпоС (6-8 кДа)

1 2 3 4 I I 5 6 7 8 Сыворотка | | Экссудат

AnoA-l (28 кДА)

АпоС — (6-8 кДа)

«И* " щттт У й шш МН \

« ш. . ШШ iшШ Ш тт

13 4 5 6 Сыворотка

8 9 10 Экссудат

Рис.5. Диск-электрофорез белков сыворотки крови и асцитической жидкости мышей с НА-1 гепатомой в 12,5% ПААГ с Од-Ка.

1-АпоА-1; 2- белки-маркеры; 3,7- контроль (физ. раствор); 4,8- ЛПОНП; 5,9-ЛПОНП -кортизол; 6,10- ЛПОНП- дегидроэпиандростерон-сульфат

# Ti #

«t ф Ф ■

с?

12 3 12 3

АпоА-I АпоЕ

Рис.6. Твердофазный иммуноферментный анализ содержания апоА-I и Е в сыворотке крови мышей с НА-1 гепатомой при введении комплексов ЛПОНП с кортизолом и с дегидроэпиандростерон-сульфатом. Дорожки: 1 - контроль; 2 - ЛПОНП-кортизол; 3 - ЛПОНП-дегидроэпиандростерон-сульфат.

Твердофазный иммуноферментный анализ показал, что введение комплексов ЛПОНП с кортизолом и с дегидроэпиандростерон-сульфатом практически не влияло на содержание аполипопротеина A-I в сыворотке крови

мышей с НА-1 гепатомой (рис.6). Однако, содержание аполипопротеина Е в сыворотке крови значительно увеличивалось в группе ЛПОНП-кортизол по сравнению с контролем, а также по сравнению с введением комплексов ЛПОНП-ДЭАС. Конкретный механизм данного факта неясен. Однако можно предположить непосредственное участие в данном процессе макрофагов, в том числе и опухоль-ассоциированных, в наработке данного белка, вклад которого в подавление опухолевого роста был описан нами ранее [Князев P.A., 2007].

Таким образом, на мышах с асцитной НА-1 гепатомой, а также с карциномой Эрлиха в результате введения комплексов ЛПОНП-кортизол получено снижение численности популяции опухолевых клеток, а также уменьшение объема асцитической жидкости, подавление синтеза нуклеиновых кислот и белка. Морфологически обнаружена картина апоптоза опухолевых клеток.

Анализ взаимодействия липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина A-I с противоопухолевыми лекарственными

препаратами

Следующим этапом нашей работы был анализ взаимодействия липо(апо)протеинов, в частности, липопротеинов высокой плотности и их главного белкового компонента - апоА-I с противоопухолевыми лекарственными препаратами - актиномицином Д и винбластином. Известно, что одним из наиболее информативных методов изучения комплексообразования является флуоресцентная спектроскопия, позволяющая выявить конформационные изменения белковой молекулы в результате образования связи с лигандом. Об образовании комплексов судили по изменению интенсивности свечения, сдвигу спектров в синюю область разной степени выраженности, что связано с увеличением гидрофобности триптофанового микроокружения и локальными конформационными перестройками белкового компонента липопротеиновых частиц после их взаимодействия с лигандом. Рассчитанные константы ассоциации указывают на то, что связывание белок-лиганд не является высокоспецифичным, что может являться положительным моментом при освобождении противоопухолевого препарата после доставки его в опухолевую клетку (табл.7).

Таблица 7

Константы ассоциации для комплексов липо(апо)протеин-цитостатик, рассчитанные на основании результатов тушения флуоресценции триптофана (х10б М"')___

Лиганды ЛПВП апоА-1

Актиномицин Д 0,37 х10ьМ~' 0,15 х106М"1

Винбластин 0,23 х10ьМ"' 0,39 х106М"'

Интенсивность изменений флуоресцении при взаимодействии цитостатиков с ЛПВП и апоА-I практически не отличались друг от друга: тушение флуоресценции составило порядка 70-80 молей на 1 моль белка. Взаимодействие ЛПВП и апоА-I с противоопухолевыми лекарственными препаратами позволяет сделать вывод о возможности их транспорта в клетку в составе комплексов, а количество мест связывания представляет широкий диапазон выбора оптимальной дозировки препарата.

Влияние липо(апо)иротеинов и их комплексов с противоопухолевыми препаратами на скорость биосинтеза белка и ДНК в опухолевых клетках НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха

Эффективность использования липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы противоопухолевых препаратов мы изучали на культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха, с использованием противоопухолевых препаратов - актиномицина Д и винбластина. Полученные результаты позволили предложить апоА-I для направленного транспорта в опухолевые клетки некоторых цитостатиков. Оказалось, что апоА-1 (60 мг/мл) в комплексе с актиномицином Д (0,1 мкг/мл) значительно подавляет синтез ДНК (рис. 8).

\ б £ 1=

35000 30000 25000

I ® 20000 : £

! 5 15000

: |

: | юооо

5000

Контроль

АкшномицннД АпоА-1-актнномнцинД

Рис. 8. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация актиномицина Д ОД мкг/мл.

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,01) " - достоверное различие по сравнению с актиномицином Д (р < 0,05)

Ингибирующий эффект сохранялся даже при снижении дозы актиномицина Д в 2 раза (рис.9).

30000 25000

а | 20000 т- 3 X

5 5

г - 15000

? 5 « 1

§ I 10000

0 Я

1 5000 Я

Контроль АктиношщинД АпоА-1-актиномныинД

* # Й

Рис. 9. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация актиномицина Д 0,05 мкг/мл

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05)

* - достоверное различие по сравнению с апоА-1-актиномицин Д (р < 0,01)

Аналогичное снижение скорости синтеза ДНК показано и в случае использования винбластина (1мкг/мл). В данном случае оно составляло около 30% по отношению к контролю (рис. 10).

Рис. 10. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация винбластина 1 мкг/мл * - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05) " - достоверное различие по сравнению с апоА-1-винбластин (р < 0,05)

Эффект снижения биосинтеза ДНК при добавлении комплекса ЛПОНП-актиномицин Д при высоком содержании цитостатика в препарате также приводил к ингибирующему эффекту, который составил 55% по отношению к контролю (рис.11). Однако в этой же дозе цитостатический эффект проявлял и

сам актиномицин Д, хотя и в меньшей степени, чем комплекс ЛПОНП-актиномицин Д.

55000

50000

45000

Ї 40000 & в

- 1 35000 Е «=

1 J 30000 ¡S я 25000 ® 1 20000 § В

2 3 15000

0 =

1 10000 я

5000

Контроль Актиномицин Д ЛПОНП ЛПОНП-акіиномицин Д

Рис. 11. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация актиномицина Д 3 мкг/мл * - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05) - достоверное различие по сравнению с апоА-1-актиномицин Д (р < 0,05)

Таким образом, при использовании липопротеинов различных фракций и их белковых компонентов в качестве транспортной формы цитостатиков в опухолевые клетки в опытах in vitro наиболее эффективным способом доставки препаратов является использование ЛПОНП и белкового компонента ЛПВП -апоА-I. При этом эффект актиномицина Д и винбластина в комплексе с липо(апо)протеинами проявлял себя при более низких концентрациях препарата. Исходя из данных результатов исследований, можно рекомендовать белковый компонент ЛПВП - апоА-I в качестве перспективной транспортной формы для противоопухолевых лекарственных препаратов, как в эксперименте, так и в клинике. Использование липо(апо)протеинов в качестве переносчиков позволит повысить терапевтическую эффективность препаратов, уменьшить лечебную дозу и снизить их токсическое действие.

ВЫВОДЫ

1. ЛПОНП в комплексе с кортизолом снижают скорость биосинтеза белка и ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха и гепатомы НА-1 в опытах in vitro, как в присутствии опухоль-ассоциированных макрофагов, так и при их отсутствии.

2. На клеточной культуре НА-1 гепатомы, а также карциномы Эрлиха в опытах in vivo с введением комплекса ЛПОНП-глюкокортикоиды получено снижение численности популяции опухолевых клеток, а также уменьшение объема асцитической жидкости. Морфологически обнаружена картина апоптоза опухолевых клеток, включающая секвестрацию цитоплазмы, фрагментацию ядер, подавление синтеза нуклеиновых кислот и белка.

3. Методами тушения триптофановой флуоресценции показана высокая способность ЛПВП и их основного белкового компонента - аполипопротеина A-I связывать противоопухолевые препараты: актиномицин Д и винбластин. Полученные константы ассоциации указывают на то, что связывание не является высокоспецифичным. Это позволяет быстро освобождать противоопухолевый препарат после доставки его в опухолевые клетки для получения необходимого фармакологического действия.

4. Высокая связывающая способность апоА-I цитостатиков (70-80 молей на 1 моль белка) позволяет широко варьировать их лечебные дозы в зависимости от чувствительности опухолевых клеток к действию того или иного препарата, а также использовать комбинированные схемы лечения.

5. Снижение биосинтеза белка и ДНК актиномицином Д и винбластином в комплексе с аполипротеином A-I проявлялось при более низких концентрациях цитостатиков. Использование апоА-I в качестве переносчика позволяет повысить терапевтическую эффективность противоопухолевых препаратов и снизить их токсическое действие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Князев P.A., Гринюк Ж.И., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние

внутрибрюшинного введения липопротеинов очень низкой плотности на рост и развитие асцитной карциномы Эрлиха у мышей // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 7-9 ноября 2007. - Новосибирск: Сибирский консилиум. - 2007. - Т.62, №7. - С.78.

2. Гринюк Ж.И., Князев P.A., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние

внутрибрюшинного введения липопротеинов очень низкой плотности и кортизола на биосинтез белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // IX германо-российская конференция Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении», 8-9 декабря 2010г., Новосибирск. - Материалы конференции. - С. 116-117.

3. Князев P.A., Гринюк Ж.И., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние внутрибрюшинного введения липопротеинов очень низкой плотности на рост и развитие асцитной карциномы Эрлиха у мышей // Международная

научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине", 23-26 ноября 2010г., Санкт-Петербург. - Материалы конференции. - Т.З. - С.67.

4. Князев P.A., Гринюк Ж.И., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние внутривенного введения липопротеинов очень низкой плотности и кортизола на биосинтез белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Пятая Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты омпенсаторно-приспособительных процессов», 12-14 апреля 2011г., Новосибирск. - Материалы конференции. -С. 92.

5. Князев P.A., Гринюк Ж.И. Цитостатический эффект комплекса липопротеинов очень низкой плотности с кортизолом на рост и развитие опухолевых клеток в культуре // VI региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», 28 апреля 2011г., Томск. - Сибирский онкологический журнал. - Приложение №1,-С. 61-62.

6. Князев P.A., Гринюк Ж.И., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов очень низкой плотности и кортизола на биосинтез ДІЖ и белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Вторая Международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине", 2628 октября 2011г., Санкт-Петербург. - Сборник статей. - Т.З. - С. 160-162.

7. Белоногова Ж.И., Князев P.A., Твердохлеб Н.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е.. Аполипопротеин А-І — транспортная форма противоопухолевого препарата актиномицина Д // Третья Международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине", 26-28 апреля 2012г., Санкт-Петербург. - Сборник статей. - Т.2. - С. 65-67.

8. Князев P.A., Белоногова Ж.И., Твердохлеб Н.В. Регуляторная роль аполипопротеина А-І и аполипопротеина Е в норме и при опухолевом росте // Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XI века» 5-6 декабря 2012г. Москва, Материалы конференции. - С. 250-252.

9. Панин Л.Е., Белоногова Ж.И., Князев P.A., Чешенко И.О. Влияние кортизола в комплексе с липопротеинами очень низкой плотности на развитие гепатомы НА-1 и карциномы Эрлиха // Сибирский онкологический журнал. -2013.- №3. - С. 43-46.

Подписано к печати 2¡августа 2013г. Тираж 100 экз. Заказ № 040. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоногова, Жанна Ивановна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФГБУ НИИ БИОХИМИИ

На правах рукописи

04201362062

БЕЛОНОГОВА ЖАННА ИВАНОВНА

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАМН Л.Е.Панин

Новосибирск - 20X3

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Общие представления о липо(апо)протеинах плазмы крови 11

1.2. Механизмы поглощения липо(апо)протеинов соматическими клетками 15

1.2.1. Общие сведения 15

1.2.2. В/Е-рецепторы 16

1.2.3. Скевенджер-рецепторы 21

1.2.4. Рецепторы, связывающие липопротеины высокой плотности 25

1.3. Роль липопротеинов в транспорте биологически активных веществ и лекарственных препаратов в клетку 35

1.3.1. Транспорт стероидных гормонов 38

1.3.2. Транспорт лекарственных препаратов 39

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45

2.1. Экспериментальные животные 45

2.2. Используемые реактивы и оборудование 45

2.3. Экспериментальные модели 47

2.4. Препаративные процедуры 49

2.4.1. Выделение липопротеинов плазмы крови 49

2.4.2. Выделение аполипопротеинов 50

2.5. Биохимические методы 52

2.5.1. Определение концентрации белка 52

2.5.2. Оценка скорости биосинтеза белка и нуклеиновых кислот 53

2.5.3. Выделение асцитных опухолевых клеток и опухоль-

ассоциированных макрофагов 53

2.5.4. Оценка чистоты клеточных фракций, подсчет клеток и определение их жизнеспособности 54

2.5.5. Количественное определение содержания суммарного белка в тканях 55

2.5.6. Изучение белкового спектра: электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноэлектроблоттинг 55

2.5.7. Изучение связывания липопротеинов и их белковых компонентов с различными лигандами 57

2.5.7.1. Тушение триптофановой флуоресценции 57

2.5.7.2. Электрофорез в геле агарозы 59

2.6. Морфологические методы 59

2.7. Статистические методы обработки результатов 59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 60

3.1. Влияние липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на скорость биосинтеза ДНК в опухолевых клетках в опытах in vitro 60

3.2. Влияние липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами на скорость биосинтеза белка в опухолевых клетках в опытах in vivo 66

3.3. Анализ взаимодействия липо(апо)протеинов с некоторыми лекарственными препаратами 76

3.4. Влияние липо(апо)протеинов и их комплексов с противоопухолевыми препаратами на скорость биосинтеза белка и ДНК в опухолевых клетках НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха 81

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 86

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

95 96 3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ano - аполипопротеины

БАВ - биологически активные вещества

БСА - бычий сывороточный альбумин

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ЛПС - липополисахариды

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

ПААГ - полиакриламидный гель

ДГЭА-С - дегидроэпиандростерон-сульфат

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФСБ - фосфатный солевой буфер

ФСБА - фосфатный солевой буфер в модификации Дюльбекко ЭДТА-Ыа2 - этилендиаминтетраацетат натрия Ds-Na - додецилсульфат натрия

HEPES - N-2-гидроксиэтилпиперазин- Ы'-2-этансульфоновая кислота P¡ - неорганический фосфат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что липопротеины плазмы крови представляют собой одну из самых больших групп сложных плазменных белков крови, состоящие из белка и липидов. Липопротеины осуществляют транспорт липидов из мест их всасывания и синтеза в жировые депо или другие органы, обеспечивают нормальный обмен липидов между кровью и клетками организма. В последнее время имеются данные о липопротеинах как транспортной системе для биологически активных веществ, таких как стероидные соединения [Панин J1.E. и др., 1988; Meng Q.H. et al., 1999; Khalil A. et al., 2000], тиреоидные гормоны [Benvenga S. et al., 1989, 1991; Поляков JI.M., 1998],жирорастворимые витамины [Glevidence B.A., Bieri J.G., 1993; Панин Л.Е. и др., 1997; Balazs Z. et al., 2004], ксенобиотики [Поляков Л.М. и др., 1992; Woofter R.T., Ramsdell J.S., 2007], различные лекарственные препараты [Rensen P.C. et al., 2001; Lou В. et al., 2005; Lacko A.G. et al., 2007; Feng M. et al., 2008] и эндотоксины [Massamiri Т. et al., 1997].

Клеточный захват липо(апо)протеинов осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, что представляет возможность рассматривать их как потенциальные переносчики ряда лекарственных препаратов. Так ЛПВП с достаточно высоким сродством связывают стероидные гормоны и ксенобиотики, играя роль их активной транспортной формы в организме [Панин Л.Е. и др., 1992; Поляков Л.М. и др., 1992]. Показана способность ЛПВП осуществлять транспорт некоторых противоопухолевых лекарственных препаратов [Kader A., Pater А., 2002], а также способность апоА-I транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты через SR-Bl-рецепторный путь [Kim S.I. et al., 2009; Lee H. et al., 2009]. Отмечено участие апоА-I в переносе олигонуклеотидов через гемато-энцефалический барьер [Kratzer I. et al., 2007].

Помимо транспортной функции липо(апо)протеины принимают участие в регуляции многих метаболических процессов. ЛПВП и апоА-1 осуществляют регуляцию обмена холестерина в клетках при участии мембранных белков АВСА1 и SR-BI [Zannis V.l. et al., 2006]. Липопротеины разных классов оказывают влияние на функцию эндокринной системы: на стероидогенез [Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1979; Temel R.E. et al., 1997; Travert С. et al., 2000], синтеза тироксина [Бернштейн Л.М. и др., 1982] и инсулина [Панин Л.Е. и др., 1994]. Описано влияние липо(апо)протеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий [Панин Л.Е. и др., 1982, 1991]. Показана роль липопротеинов и их белковых компонентов в регуляции углеводного обмена [Панин Л.Е. и др., 1990].

Отмечены антимикробные свойства аполипопротеина A-I [Beck W.H. et al., 2013], его противовирусное действие [Srinivas R.V. et al., 1990; Owens ВJ. et al., 1990; Панин Л.Е. и др., 2002], а также лизосомотропный эффект [Панин Л.Е., 1987]. ЛПВП, апоА-I и их синтетические агонисты обладают кардиопротекторным, антиоксидантным и противовоспалительным действием [Ma J. et al., 2004; Gupta Н. et al., 2005; Navab M. et al., 2007; Gomaraschi M. et al., 2008].

Не меньшее внимание исследователей направлено на изучение

взаимодействия липопротеинов и гормонов. Отмечено, что стимулирующий

эффект эстрадиола на клеточный рост карциномы грудной железы

проявляется только в присутствии ЛПВП [Jozan S. et al., 1985]. Показан

кооперативный эффект в действии гидрокортизона, адреналина и ЛПВП, в

основе которого лежит лизосомозависимая активация хроматина,

приводящая к индукции синтеза РНК и белка в печени крыс [Панин J1.E., 1987; 1990].

Задачи исследования:

Научная новизна работы.

На культурах опухолевых клеток НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха в опытах in vitro изучено влияние липопротеинов плазмы крови и их комплексов с кортизолом на скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот (ДНК). Показано, что наибольшим ингибирующим эффектом обладал комплекс липопротеинов очень низкой плотности с кортизолом (ЛПОНП-кортизол). На различных клеточных системах в экспериментальных условиях ингибирование составляло от 20 до 70% по отношению к контролю.

Показана возможность использования липо(апо)протеинов для направленного транспорта в опухолевые клетки некоторых цитостатиков. Отмечено, что аполипопротеинА-I в комплексе с актиномицином Д подавляет синтез ДНК. Ингибирующий эффект в условиях направленного транспорта сохраняется даже при низких дозах актиномицина Д. Аналогичный эффект показан и в случае использования винбластина, который ингибирует синтез РНК и подавляет внутриклеточное перемещение.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В работе описан неизвестный ранее механизм запуска апоптоза опухолевых клеток: асцитной карциномы Эрлиха и НА-1 гепатомы. Он связан с действием биологически активного комплекса липопротеинов очень низкой плотности и кортизола. Высокая эффективность действия данного механизма подтверждена в опытах с ингибированием скорости биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, а также с помощью электронной микроскопии. Последний метод позволяет утверждать, что гибель опухолевых клеток осуществляется в результате запуска апоптоза.

Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортных форм для противоопухолевых лекарственных препаратов. Применение их в клинической практике открывают новые возможности для подавления опухолевого роста у больных с различными формами онкопатологии.

Положения, выносимые на защиту:

2. ЛПВП и их белковый компонент аполипопротеин A-I образуют стабильные комплексы с противоопухолевыми препаратами (актиномицин Д, винбластин и др.). Степень насыщения апоА-1 для актиномицина Д составляет 70-80 моль на 1 моль белка.

3. Комплексы ЛПОНП и апоА-1 с цитостатиками обладают высокой противоопухолевой активностью, значительно подавляя скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в опухолевых клетках.

4. Комплексы ЛПОНП-кортизол перспективны в клинике для запуска апоптоза опухолевых клеток, тогда как комплексы апоА-1-цитостатики могут быть рекомендованы как средства с различным повреждающим действием.

Апробация результатов исследования.

Материалы докладывались на Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты

компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2008), IX

германо-российской конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова

«Новые горизонты: Инновации и сотрудничество в медицине и

здравоохранении» (Новосибирск, 2009), Международной научно-

практическая конференции "Высокие технологии, фундаментальные и

прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург,

2010), VI региональной конференция молодых ученых-онкологов,

посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы

экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011), Пятой

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011), Второй Международной научно-практическая конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011), Третьей Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XI века» (Москва, 2012).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов исследований), выводов и списка литературы, включающего 220 источников, из них - 172 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 19 таблицами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие представления о липопротеинах плазмы крови

Липопротеины плазмы крови представляют собой сложные белково-липидные комплексы. Транспорт липидов эндогенного и экзогенного происхождения осуществляется липопротеинами через систему циркуляции к местам их утилизации и депонирования. Впервые липопротеины были описаны Машбефом в 1929 г. и представлены как сложные молекулярные ассоциации, относительно устойчивые к действию органических растворителей и разрушающиеся при обработке крови денатурирующими или поверхностно-активными веществами [МасИеЬое^ М.А., 1929].

Все липопротеины имеют типичное строение, включающее ядро и поверхностный фосфолипидный монослой. Ядро липопротеиновой частицы гидрофобно и состоит из неполярных липидов: триглицеридов и эфиров холестерина. Поверхностный слой образован полярными соединениями и включает фосфолипиды, холестерин и аполипопротеины, придающие липопротеиновой частице стабильность и обеспечивающие хорошую растворимость её в водных средах (рис. 1).

Фосфолипиды Холестерин

Ядро частицы с триглицеридами и эфирами холестерина

листер!

Рис. 1. Структура липопротеиновой частицы [КоБШег К., 2002].

Во всех основных компонентах комплекса химические связи нековал ентные. Это водородные связи, гидрофобные и ионные взаимодействия, что облегчает обмен структурными компонентами между липопротеинами. Размер липопротеиновых частиц определяется величиной гидрофобного ядра. Она варьирует в широких пределах, тогда как поверхностный слой стабилен и составляет примерно 2 нм в сечении. Плотность липопротеиновых частиц зависит от соотношения липидного и белкового компонента (табл. 1). Именно этот показатель используется в качестве дифференциального критерия в наиболее часто используемой классификации липопротеинов. Согласно ей различают 4 основных класса липопротеинов: липопротеины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП), липопротеины очень низкой плотности ЛПОНП и хил омикроны (ХМ) [Климов А.Н., 1999]. Различные классы липопротеинов in vivo находятся в динамическом равновесии, обмениваясь друг с другом структурными компонентами, поэтому их деление по липидному и белковому составу является весьма условным.

Табл. 1. Химический состав и размер частиц липопротеинов разных классов

Класс Химические соединения, % Диаметр нм Плотность М.м.

ТГ X, ЭХ ФЛ Ano г/мл кДа

ЛПВП 3 20 27 50 8-20 1,063-1,21 200-400

ЛПНП 7 50 21 22 20-25 1,006-1,063 l-3xl0J

ЛПОНП 55 17 18 10 30-90 0,95-1,006 З-ЮхЮ3

ХМ 85 5 3 2 100-1000 <0,95 до 40хЮь

Примечание: ТГ - триглицериды, X, ЭХ - холестерин и его эфиры, ФЛ -фосфолипиды.

Гетерогенность липопротеинов как структурная, физико-химическая и функциональная во многом определяется их белковые компонентами, имеющих различные молекулярные массы, химическое строение, свойства, положением в частице (интегральные и периферические), биологической

активностью. Для обозначения аполипопротеинов используют так называемую номенклатуру ABC [Alaupovic Р., 1978]. Основные характеристики аполипопротеинов представлены в табл. 2.

Табл. 2. Характеристика основных аполипопротеинов [Климов А.Н., 1999]

Ano Молекулярная масса (Да) Места синтеза Распределение между частицами Функция

активатор ЛХАТ,

рецепторное

A-I 28331 кишечник, печень лпвп, хм связывание, активатор печеночной липазы

A-II 17400 кишечник, кишечник, печень печень лпвп, хм не известна

A-IV 46000 лпвп, лповп активатор ЛХАТ рецепторное

В-100 549000 печень кишечник хм, лпонп, лпнп связывание, образование частиц

В-48 264000 ХМ и их ремнанты образование частиц

C-I 6550 печень ХМ, ЛПОНП, лпвп ингибитор ЛПЛ

С-И 8837 печень ХМ, лпонп, лпвп активатор ЛПЛ

C-III 8240 печень хм, лпонп, лпвп неизвестна