Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета

Чубинский-Надеждин, Владислав Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета"

На правах рукописи

005055753

ЧУБИНСКИИ-НАДЕЖДИН Владислав Игоревич

РОЛЬ МЕМБРАННОГО ХОЛЕСТЕРИНА В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ И АКТИНОВОГО

ЦИТОСКЕЛЕТА

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012

005055753

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Елена Алексеевна Морачевская

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Сергей Михайлович Антонов

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Ирина Акивовна Гамалей Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение пауки Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «14» декабря 2012 года в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д .4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812)297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

играют ионные каналы плазматической мембраны, реагирующие на изменение ее механического статуса [1]. Такие каналы называют механоуправляемыми (mechanogated) или механочувствительными, они чрезвычайно широко распространены в живой природе и, в то же время, остаются наименее изученными. Один из центральных вопросов регуляции механочувствительных каналов в клетках эукариот — исследование вклада липидного бислоя и актинового цитоскелета. Анализ функциональных взаимосвязей ионных каналов с липидным окружением и структурами цитоскелета необходим для выяснения физиологических путей их активации в нативных клетках.

Холестерин (холестерол) — это один из основных липидных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих. Известно, что динамические параметры липидного бислоя зависят от состава и концентрации стеролов [2, 3]. Традиционно присутствие . стеролов в клеточных мембранах связывали, прежде всего, с их механическими свойствами. Однако за последние десятилетия возникло новое понимание роли липидов в жизнедеятельности клеток, сформировались новые концепции и гипотезы относительно организации клеточных мембран. Согласно современным представлениям, принципиальной особенностью их структурно-функциональной организации является латеральная гетерогенность бислоя, зависящая, в первую очередь, от липидного состава. Уровень мембранного холестерина имеет определяющее значение для структуры и целостности липидных микродоменов (рафтов), участков, характеризующихся более плотной упаковкой, повышенным содержанием холестерина, сфинголипидов и насыщенных жирнокислотных остатков [4-6].

Первоначально рафты рассматривались как некие «фокальные точки», обеспечивающие связь мембраны с кортикальными микрофиламентами [4, 7, 8]. При этом предполагалось, что деструкция рафтов при частичной экстракции холестерина (cholesterol depletion) приводит к разобщению плазматической мембраны и цитоскелета и сопровождается повышением ее деформируемости. Однако, как показали дальнейшие исследования, в том числе анализ изменений механических свойств комплекса «мембрана-цитоскелет» при варьировании уровня стеролов [9-11], такая точка зрения является весьма упрощенной. Пока остаются открытыми вопросы о связи динамики липидных рафтов и примембранного актина. Нарушения структуры рафтов, по-видимому, могут инициировать различные процессы реорганизации цитоскелета, включая сборку микрофиламентов [12].

Таким образом, до недавнего времени регуляторная роль холестерина в составе клеточных мембран оставалась недооцененной и неясной. В настоящее время проблемы участия холестерина и рафтов в процессах механотрансдукции в живых клетках приобретают особую актуальность и значимость. В мировой науке эта новая область молекулярной физиологии начинает интенсивно разрабатываться, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной сигнализации, так и новых направлений клеточной медицины. Ряд данных указывает на связь клеточной механотрансдукции и опухолевой трансформации [13], а также на вероятную роль Са2+-проницаемых механочувствительных каналов и липидных рафтов в сигнальных процессах, связанных с адгезией и миграцией клеток [14-15]. Все сказанное определило основные задачи данной работы, направленной на выявление функционального вклада мембранного холестерина в механозависимые реакции живой клетки.

Цели и задачи исследования Цель работы - выяснение роли мембранного холестерина и липидных микродоменов (рафтов) в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Сопоставить эффекты акцептора стеролов метил-бета-циклодекстрина и его структурного аналога альфа-циклодекстрина на характеристики механочувствительных каналов плазматической мембраны.

2. С помощью атомно-силовой микроскопии выявить- влияние экстракции холестерина на механические свойства клеток.

3. Оценить изменения липидного бислоя и рафтов в плазматической мембране клеток с пониженным содержанием холестерина.

4. Выяснить, чем обусловлено подавление механозависимой активации каналов после экстракции мембранного холестерина.

5. Определить, как влияет снижение холестерина и разрушение липидных рафтов на организацию акгинового цитоскелета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разрушение липидных микродоменов после экстракции мембранного холестерина приводит к повышению жесткости плазматической мембраны клеток лейкемии человека и ингибирует активацию механочувствительных каналов.

2. Разборка Р-актина восстанавливает высокий уровень активности механочувствительных каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина.

3. Участие мембранного холестерина и рафтов в процессах клеточной механотрансдукции и регуляции ионных каналов опосредовано реорганизацией актинового цитоскелета.

4. Экстракция мембранного холестерина и разрушение липидных микродоменов может приводить как к сборке, так и к разборке актинового цитоскелета. Направление перестроек системы микрофиламентов определяется степенью развития актиновых структур, а именно, соотношением глобулярной и фибриллярной форм актина в клетке.

Научная новизна работы

разрушением липидных микродоменов. Выявлено нарушение структуры рафтов при снижении уровня холестерина в различных типах клеток. Обнаружено, что влияние холестерина и рафтов на актиновый цитоскелет зависит от исходного состояния сети микрофиламентов. Впервые показано, что холестерин-зависимые перестройки цитоскелета определяются балансом глобулярного и фибриллярного актина в клетке. Результаты демонстрируют новую роль мембранного холестерина в регуляции ионных каналов и клеточной механспрансдукции.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Измерения жесткости клеток были проведены на атомно-силовом микроскопе NTegra Aura в Физико-техническом институте им. А.Ф. Иоффе РАН. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные существенны для понимания роли холестерина и липидных рафтов в модуляции мембранных функций клеток. Выявление физиологических механизмов регуляции механочувствительных каналов важно для понимания феномена механотрансдукции на уровне клеток и тканей. Фундаментальное значение имеет анализ взаимосвязей мембраны и цитоскелета как ключевого звена в передаче сигнала. Исследование действия модификаторов липидного состава, в том числе циклодекстринов, представляет интерес как для разработки новых препаратов противоопухолевой терапии, так и для анализа плейотропных эффектов статинов — веществ, широко используемых для коррекции липидного профиля. Результаты демонстрируют принципиальные различия клеточных и модельных мембран и ограничения в применимости последних при исследовании регуляции каналов и роли мембранных липидов. Данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии, биофизике и клеточной биологии.

молекулярной биологии (Сан-Фелю, 2010), конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), I Всероссийской конференции "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (Санкт-Петербург, 2011), международном симпозиуме «Нобелевские каналы» (Наймеген, 2011), III Конференции молодых ученых ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2012), III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), на семинарах ИНЦ РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего %{^ссылок. Диссертация изложена на//2страницах и иллюстрирована 1 таблицей и ^рисунками.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04-00574, 12-0400622), Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Правительства Санкт-Петербурга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры. Клеточные линии получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки миелоидной лейкемии человека К562 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Перед началом экспериментов клетки высевали на покровные стекла, покрытые иоли-Ь-лизином. Эмбриональные фибробласты мыши линий BALB/3T3, ЗТЗВ-SV40, клетки НЕК293 культивировали на среде DMEM с добавлением 10 % сыворотки. Для снижения уровня мембранного холестерина использовали метил-бета-циклодекстрин (МбЦД) — циклический олигосахарид, являющийся селективным акцептором стеролов. Для снижения содержания холестерина клетки инкубировали с МбЦД в среде без добавления сыворотки в течение 1 ч (37 °С, 5 %

со2).

Регистрация ионных токов. С помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) регистрировали ионные токи через одиночные каналы в участке плазматической мембраны нативной клетки (вариант cell-attached) или в изолированном мембранном фрагменте (inside-out). Для исследования механозависимых токов использовали известный способ механической стимуляции участка клеточной мембраны, который состоял в натяжении мембраны посредством уменьшения гидростатического давления (ДР<0, suction) в регистрирующей

микропипетке. Пипетки изготавливали из боросиликатных стеклянных капилляров (BF-150-110-10, Sutter Instruments) на автоматической кузнице Flaming/Brown Р-97. С выхода патч-кламп усилителя НЕКА ЕРС-8 сигналы записывали в реальном масштабе времени через 12-разрядный аналого-цифровой преобразователь (L-card, Москва) на диск компьютера для последующей обработки. На основании анализа записей токов при различных уровнях мембранного потенциала получали характеристики одиночных каналов, идентифицировали их по проводимости и селективности. Амплитуды токов, протекающих через одиночные каналы, определяли из амплитудных гистограмм или непосредственно из записей токов. Уровень активности каналов оценивали по значению вероятности открытого состояния: P0=I/Ni, где N - число элементарных уровней проводимости, I - средний ток для заданного временного интервала, i — амплитуда тока, протекающего через одиночный канал. Результаты представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего (mean ± SEM). Для обработки результатов использовали программные пакеты Clampfit 9.2 и Microcal Origin.

Растворы. Перед началом экспериментов пипетки заполняли стандартным наружным раствором, содержащим (мМ): 145 NaCl, 2 СаСЬ, 1 MgCb, 10 HEPES/TrisOH. В опытах cell-attached раствор в камере содержал (мМ): 145 КС1, 2 СаСЬ, 1 MgCl2, 10 HEPES/TrisOH. В конфигурации inside-out раствор в камере, контактирующий с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента, содержал (мМ): 140 K-Aspartate, 5 NaCl, 2 EGTA, 1 MgCl2, 20 HEPES/TrisOH и соответствующее количество СаСЬ (0.176 мМ) для установления свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (рСа=8). рН всех растворов поддерживали на уровне 7.2-7.3.

Флуоресцентная микроскопия. Для визуализации актиновых структур цитоскелета применяли стандартные методики фиксации клеток и окрашивания F-актина с помощью флуоресцентного красителя родамин-фаплоидина (Sigma-Aldrich, США). Клетки фиксировали 3.7 %-ным раствором параформапьдегида (PFA, 10 мин.) при комнатной температуре, обрабатывали 0.1 %-ным раствором Тритона X-100 (8 мин) и окрашивали родамин-фаллоидином (2 мкМ, 15 мин., 37 °С). Для оценки состояния липидных микродоменов использовали коньюгат нетоксичной бета-субъединицы холерного токсина с FITC (FITC-CTB, Sigma-Aldrich, США). Клетки фиксировали 3.7%-ным раствором PFA и инкубировали в присутствии FITC-CTB (5 мкг/мл, 10 мин., 4 °С). Для получения изображений использовали

флуоресцентный микроскоп «Carl Zeiss IM 35» (Carl Zeiss AG) и конфокальный микроскоп «Leica TCS SP5» (Leica Microsystems, GmBH). Возбуждение флуоресценции производили светом с длинами волн 546 и 488 нм для родамин-фаллоидина и FITC-CTB, соответственно. Для обработки изображений использовали программные пакеты Leica LAS AF, MaxIM DL и Image J.

Атомно-силовая микроскопия. Для оценки изменений жесткости клеточной мембраны в различных условиях использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). Метод АСМ позволяет с высокой точностью производить прямые измерения механической жесткости (модуля Юнга) живых клеток и тканей. Использовали коммерчески доступные кантилеверы (NT-MDT, Зеленоград), на кончик которых крепили гранулу аморфного диоксида кремния (Si02) известного диаметра (650 нм, Рис. 1А). Данная модификация позволяет существенно снизить повреждающее воздействие на клетку и проводить расчет механических параметров клеток (модуль Юнга) на основе модели Герца [17].

F{z) на подложке

Рис. 1. (А) - Изображение кончика зонда с гранулой SiO2 Сканирующая электронная микроскопия. (Б) - Примеры силовых кривых F(z), полученных на подложке (калибровка) и на клетке, h,- величина индентации образца.

В контактном режиме производили касание зондом поверхности одиночной клетки и осуществляли индентацию (indentation, продавливание) клетки на заданную величину. При этом регистрировали силовые кривые, отражающие зависимость силы, действующей на зонд со стороны клетки, от глубины индентации (Рис. 1Б). Зная радиус и форму индентора (сфера), рассчитывали модуль Юнга (Es) живых клеток согласно теории Герца: Es = 3-ks/(8-V(R-hj)), где ks - локальная жесткость клетки, рассчитываемая из силовых кривых: ks=kc-S/(S0 -S), kc - жесткость кантилевера (кс= 0.787 Н/м), S и S0 — наклоны силовых кривых на клетке и на твердой подложке, соответственно. Для управления экспериментом и параметрами

регистрации использовали программное обеспечение Nova. Анализ данных проводили в программном пакете Microcal Origin.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Участие мембранного холестерина в функционировании механочувствительных каналов

Механозависимая активация ионных токов: анализ действия цикподекстринов. Для исследования роли холестерина в регуляции механочувствительных каналов была использована удобная экспериментальная модель — клетки миелоидной лейкемии человека линии К562. В этих клетках были идентифицированы механочувствительные (МЧ) стретч-активируемые (stretch-activated) катионные каналы, типичные для клеток млекопитающих; детально изучены их ионная селективность и проводящие свойства [18]. С помощью метода локальной фиксации потенциала регистрировали активность МЧ каналов в ответ на приложение «отрицательного давления» к участку клеточной мембраны (вариант cell-attached). В контроле уровень стимула, необходимый для активации МЧ каналов, составлял около 30-40 мм рт. ст. Среднее значение вероятности открытого состояния (Р0) составило 0.29 ± 0.04 (Рис. 2). Ранее было показано, что обработка клеток К562 акцептором стеролов метил-бета-циклодекстрином (МбЦД) приводила к ингибированию стретч-активируемых МЧ каналов в клетках К562 [11]. Обнаруженный эффект может быть обусловлен экстракцией мембранного холестерина и разрушением липидных микродоменов в клеточной мембране. Дня проверки данной гипотезы в электрофизиологических экспериментах проведено сопоставление характеристик МЧ каналов в контроле, после действия МбЦД и после обработки клеток альфа-циклодекстрином - структурным аналогом МбЦД, не связывающим стеролы.

Для частичной экстракции мембранного холестерина клетки инкубировали в течение 1 ч в бессывороточной среде, содержащей 5 мМ МбЦД. Величина давления, необходимого для активации МЧ каналов в клетках, обработанных МбЦД, увеличилась в 1.5-2 раза по сравнению со значениями, наблюдаемыми в контрольных условиях (60-70 мм. рт. ст.). Вероятность открытого состояния каналов

составляла 0.08 ± 0.03, что существенно ниже контрольных значений. После обработки клеток альфа-циклодекстрином (5 мМ, I ч), не приводящим к экстракции холестерина из мембраны, наблюдали активность МЧ ионных каналов, характеристики которых, включая порог активации и уровень Р0, близки к значениям, полученным в контрольных условиях (Рис. 2). Проводимость каналов после обработки циклодекстринами была близка к контролю и составляла около 17 пСм. Таким образом, результаты опытов с МбЦД и альфа-циклодекстрином свидетельствуют о том, что подавление активации каналов опосредовано именно экстракцией мембранного холестерина. Данные электрофизиологических экспериментов и анализ характеристик МЧ каналов свидетельствуют о вероятном изменении механических свойств клеток после снижения уровня холестерина.

Контроль

' -ъи ми ---

Альфа-циклодекстрин, (5 мМ, 60 мин)

I -30 мВ

Метил-бета-циклодекстрин (5мМ, 60 мин)

■vu »lb'

- Контроль 1.0 1, ПА

.....МбЦД

---Альфа ЦД о.в 0.4 0,2 Е, мВ

70 -60 -50 -40 -30 -20 -ХЯ* .Jr.0.2- -0.8 -1,0- 10 20 30 4С

^ЩШШШШШ ¡швшШШттшЩШшшшвкяшя

Альф а -цикпод« г.стрин Контроль

О 10 20 30 40 SO 60 70 Минимальный уровень стимула: мм.рт.ст.

Альфа-циклодекстрин

0,0 0,1 0.2 0.3 0-4 0.5 Вероятность открытого состояния (Ро)

Рис. 2. Влияние циклодекстрииов на характеристики механочувствительных каналов. (А) - Записи механозависимых токов в варианте cell-attached при различных потенциалах на мембране. С - закрытое состояние каналов. (Б) - Вольт-амперные характеристики каналов. Проводимость составляла около 17 пСм. (В) -Минимальный уровень стимула и вероятность открытого состояния каналов.

..Изменения жёсткости клеток после экстракции холестерина. Для оценки механических параметров клеток К562 были проведены эксперименты с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ). Регистрировали силовые кривые в контроле и после обработки МбЦЦ, производили их усреднение (Рис. ЗА) и рассчитывали среднее значение модуля Юнга клеток в контроле и после снижения уровня мембранного холестерина. Расчет осуществляли для глубины индентации 200 нм.

3.1 2,6 2,1 1.6 1,1 0.6 0,1

Контроль

50 100 150 200

индентация, нм

50-, 45 £ 40

Q 25 -О 20 |l5 О ю 5 0

+46%

ННІІІ

Контроль МбЦД

Рис. 3. Повышение жесткости клеток К562 после экстракции холестерина. (А) — усредненные силовые кривые, построенные на основании нескольких экспериментов. (Б) — среднее значение модуля Юнга, рассчитанное по 10 клеткам в контроле и после обработки МбЦЦ.

Результаты АСМ свидетельствовали о том, что частичная экстракция холестерина приводила к повышению жесткости клеточной мембраны примерно в 1.5 раза (Рис. ЗБ). Однако, согласно модельным исследованиям, холестерин повышает жесткость мембран и снижает их деформируемость [2]. Таким образом, обнаруженные изменения механических параметров клеток не соответствуют зависимости физических свойств липидного бислоя от содержания стеролов. В то же время, механические свойства плазматической мембраны и клетки могут определяться также внутриклеточными структурами, в первую очередь актиновым цитоскелетом. Процессы реорганизации микрофиламентов могут опосредовать изменение клеточной механики и ингибирование механозависимых ионных токов. Данный эффект может быть связан с разрушением липидных микродоменов в плазматической мембране.

Нарушение целостности липидных рифтов после частичной экстракции мембранного холестерина. Для визуализации состояния липидного бислоя мембраны и липидных рафтов в клетках К562 были проведены эксперименты с использованием конъюгата бета-субъединицы холерного токсина с флуоресцентным красителем (БІТС-СТВ). Известно, что бета-субъединица холерного токсина (СТВ) селективно связывается с одним из маркерных компонентов рафтов ганглиозидом ОМ 1. Обработка клеток МбЦД приводила к резкому уменьшению флуоресценции по сравнению с контролем (Рис. 4), в то время как альфа-циклодекстрин не влиял на интенсивность окрашивания ОМ 1. Обнаруженный эффект снижения флуоресценции после действия МбЦД отражает нарушение структуры и разрушение липидных микродоменов в плазматической мембране. Бета-субъединица холерного токсина является пентамером, и для её присоединения необходимо присутствие пяти ко-локализованных молекул ОМ 1 [19]. Деструкция или модификация липидных микродоменов приводит к увеличению латеральной диффузии ганглиозида йМ1 [20], что нарушает его ко-локализацию в мембране и препятствует связыванию СТВ. Это подтверждается сопоставлением изображений, полученных в фазовом контрасте, с флуоресценцией РІТС-СТВ.

Фазовый контраст Флуоресценция РІТС-СТВ

Рис. 4. Визуализация липидных рафтов в мембране клеток К562.

Слева — изображения, полученные в проходящем свете (фазовый

контраст). Справа -флуоресценция РІТС-СТВ. (а, б) - контроль, (в, г) — альфа-

циклодекстрин, 5 мМ, (д, е) - МбЦД, 5 мМ. Масштабная линейка 10 мкм.

■

Выявление Р-актина в клетках К562. В контроле в клетках К562 выявляются примембранные актиновые структуры, типичные для клеток миелоидного и лимфоидного ряда. Данные конфокальной микроскопии позволяют обнаружить, что снижение уровня холестерина и деструкция рафтов вызывают формирование актиновой сети в цитоплазме (Рис. 5). Можно полагать, что сборка актиновых филаментов после частичной экстракции холестерина и разрушения рафтов опосредует повышение жесткости плазматической мембраны и подавление активности МЧ каналов в клетках К562.

Контроль

в В ...... V У { % • 1 V 1

\ } , 4, 1 ч ✓ <- "V

5 мМ МбЦД

^-- " С;.' * V Л ' V* ) 1" У* N ЖГ) 1 V У г" Г \ / **л,

Ъ То. ъ Ь— Ар -Ъ Ч» ■ Т ) -'{ ) X,. \ ) .

Рис. 5. Выявление Р-актина в клетках К562 в контроле и после экстракции холестерина. Приведены оптические срезы (г-з1аск). Окраска родамин-фаллоидином. Масштабная линейка 30 мкм.

Подавление активации механочувствительных каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина опосредовано реорганизацией Р-

актина. Для выяснения механизма ингибирования МЧ каналов в клетках после снижения уровня холестерина и проверки гипотезы о возможном участии актиновой сети были проведены электрофизиологические эксперименты с использованием деструкторов микрофиламентов цитохалазина Д и латрункулина Б.

Сопоставление результатов экспериментов показывает, что обработка клеток с пониженным уровнем холестерина цитохалазином или латрункулином привела к восстановлению высокого уровня активности МЧ каналов (Рис. 6). Параметры активации каналов (минимальный уровень стимула и Р0) стали близки к значениям, полученным для клеток в контрольных экспериментах (Рис. 7).

МбЦД (5 мМ, 1 час) ; Цит Д (40 мкМ, 10 мин)

I*.»,«»»!

|1 ПА 900 мс

ОмВ 0.9- 1, пА

-30 мВ 0,5, 0.1- Е, мВ

-40 мВ '.70 -50 -30 .10 , -0.3- 10 3«

-50 мВ Ж'' "07 Л' •1,1

МбЦД (5 мМ, 1 час) + Лат Б (10 мкМ, 30 мин)

...... .........................................0 м8

0,5

-30 мВ

0,1

ТА КП 1А

-40 мВ

-70 -50 -30 .10 -0,3

1 пА 500 мо

-50 м8

-0,7 -1,1

I, гЛ

Е.мВ

10 30

Рис. 6. Активность механочувствительных каналов после снижения уровня холестерина (МбЦД) и действия цитохалазина Д (Цит Д) или латрункулина Б (Лат Б). Записи токов при различных значениях мембранного потенциала. С -закрытое состояние каналов.

Таким образом,, разрушение актинового цитоскелета "отменяет" действие экстракции мембранного холестерина на ионные каналы. Можно заключить, что перестройки Б-актина, вызванные деструкцией липидных микродоменов после снижения уровня холестерина, приводят к повышению механической жесткости клеточной мембраны и ингибированию МЧ ионных каналов. Состояние актиновой сети влияет на воротные свойства МЧ каналов опосредованно, изменяя деформируемость клеточной мембраны. Выявленный механизм регуляции МЧ

каналов принципиально отличает их от натриевых каналов, активность которых непосредственно управляется динамикой примембранного актина [21].

30 мм. рт. ст.

МбЦД.ЦитД

О 10 20 30 40 50 60 70 Минимальный уровень стимула, мм.рт.ст.

|30мм. рт. ст.

МбЦД+Лат Б

МбЦД + латрункулин Б МбЦД + цитохэлазмн Д

жид

Альфа-циклодокстрин Контроль

0,0 0.1 0,2 0.3 0.4 0,5 Вероятность открытого состояния (Ро)

Рис. 7. Разрушение актинового цитоскелета восстанавливает высокий уровень активности МЧ каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Слева — типичные записи механозависимых токов. Справа — сопоставление параметров активации каналов.

Результаты исследований механочувствительных каналов в клетках лейкемии человека К562 и комплементарные данные флуоресцентной и атомно-силовой микроскопии позволяют полагать, что экстракция холестерина МбЦД приводит к сборке филаментов на базе имеющегося пула глобулярного актина. В экспериментах с использованием цитохалазина и латрункулина показано, что повышение жесткости клеток и изменения параметров активации каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина обусловлены именно реорганизацией актиновой сети [22].

2. Анализ роли мембранного холестерина в организации актинового

цитоскелета

Известно, что липидные рафты играют ключевую роль во многих важнейших сигнальных процессах, включающих перестройки микрофиламентов. Однако в

литературе существуют противоречивые данные об участии холестерина и липидных микродоменов в организации актинового цитоскелета. Сообщается, что экстракция холестерина может запускать как сборку филаментов, так и процессы деполимеризации актина [9, 12, 23]. В связи с этим возник вопрос о том, чем определяется вектор (сборка или разборка филаментов) холестерин-зависимых перестроек цитоскелета. Анализ данных литературы и результатов, полученных на клетках К562, позволяет сделать предположение о том, что направление перестроек актинового цитоскелета после снижения уровня мембранного холестерина может определяться исходным соотношением глобулярной и фибриллярной форм актина в клетках. Для выявления роли холестерина и липидных рафтов в процессах реорганизации актинового цитоскелета в качестве экспериментальной модели использовали линии клеток, характеризующиеся различной степенью развития актиновых структур. Это культивируемые фибробласты мыши линий ВАЬВ/ЗТЗ и ЗТЗВ-8У40, эмбриональные клетки почки человека линии НЕК 293 и первичная культура фибробластов мыши (МЭФ).

Для визуализации состояния липидных микродоменов фибробласты окрашивали Р1ТС-СТВ и анализировали па конфокальном микроскопе. В контроле в мембране фибробластов выявлялись участки с интенсивной флуоресценцией, отражающие присутствие ко-локализованных молекул ганглиозида СМ 1 в составе липидных рафтов (Рис. 8А,В). Обработка клеток МбЦД приводила к резкому уменьшению интенсивности свечения, что отражает разрушение рафтов в нормальных и трансформированных клетках после экстракции холестерина (Рис. 8Б, Г). Наблюдаемые эффекты близки к обнаруженным ранее в клетках К562.

Контроль 5 мМ МбЦД

Рис. 8. Разрушение липидных микродоменов после экстракции холестерина в фибробластах ВАЬВ/ЗТЗ (А, В) и ЗТЗВ-8У40 (Б,

Г). Окраска FiTC-C.TR (А, В) -контроль, (Б, Г) — Обработка 5 мМ МбЦД. Конфокальная микроскотт. Параметры

регистрации были установлены на постоянном уровне. Масштабная линейка 30 мкм.

А Ч Б

в - Г

В контроле нормальные фибробласты характеризуются хорошо развитыми актиновыми структурами в виде стресс-фибрилл (Рис. 9А). Частичная экстракция холестерина приводила к разборке Р-актина и редукции стресс-фибрилл в фибробластах ВАЬВ/ЗТЗ (Рис.9Б, В). Кроме того, после обработки МбЦД наблюдали существенные изменения формы и снижение распластанности клеток.

Контроль 5 мМ МбЦД

Рис. 9. Разборка актииового цитоскелета в клетках ВАЬВ/ЗТЗ после частичной экстракции холестерина. (А) - Контроль. (Б, В) - после обработки 5мММбЦД (60 мин). Окраска Р-актина родамин-фаллоидином. Масштабная линейка 30 мкм.

В трансформированных клетках снижение содержания холестерина вызывало противоположные эффекты. В контроле трансформированные фибробласты ЗТЗВ-йУ40 имели типичную округлую форму, низкое содержание фибриллярного актина, в них отсутствовали выраженные стресс-фибриллы (рис. 10 А). После инкубации клеток З ГЗВ-8У40 с МбЦЦ наблюдали интенсивное формирование стресс-фибрилл, ориентированных вдоль длинной оси клетки (рис. 10 А-В), клетки утрачивали характерные признаки трансформированного фенотипа. Аналогичные результаты были получены в экспериментах на клетках карциномы Нер-2 [24] и остеобластах МСЗТЗ [12].

Контроль 5 мМ МбЦД

Рис. 10. Формирование стресс-фибрилл в клетках ЗТЗВ-8У40 после снижения уровня холестерина. (А) - Контроль. (Б, В) - после обработки 5мМ МбЦД (60 мин). Окраска Р-актина родамин-фаллоидином. Масштабная линейка 30 мкм.

Таким образом, снижение уровня мембранного холестерина и разрушение липидных микродоменов может приводить как к сборке, так и к разборке актинового цитоскелета. Влияние экстракции холестерина на систему микрофиламентов действительно зависит от исходного состояния цитоскелета и, вероятно, определяется соотношением глобулярной и фибриллярной форм актина. В клетках, обладающих выраженными стресс-фибриллами и развитой сетью микрофиламентов (фибробласты ВАЬВ/ЗТЗ и МЭФ), экстракция холестерина вызывает разборку цитоскелета. Во всех клетках, характеризующихся слабым развитием актиновых структур и наличием значительного пула глобулярного актина (клетки НЕК 293 и К562, фибробласты ЗТЗВ-ЙУДО, карцинома Нер-2), разрушение липидных рафтов, напротив, инициирует сборку актиновой сети и формирование стресс-фибрилл. Можно полагать, что перестройки цитоскелета, вызванные экстракцией мембранного холестерина, включают стадию декэпирования микрофиламентов и поэтому зависят от баланса в- и Р-актина в клетке. Это соотношение и определяет направление обратимой реакции полимеризации-деполимеризации на свободных концах актиновых нитей.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что пусковым механизмом, инициирующим перестройки микрофиламентов, является именно нарушение структуры и целостности липидных микродоменов (рафтов) клеточной мембраны. Возникает вопрос о том, каким образом реализуется обнаруженная функциональная связь организации мембраны и цитоскелета на молекулярном уровне, и каковы основные участники цепи передачи сигнала. Ранее показано, что экстракция холестерина может приводить к активации киназ семейства 8гс, типичных рафт-ассоциированных белков [25]. В литературе обсуждается возможная роль 8гс-киназ, как ключевого сигнального звена в запуске перестроек цитоскелета, инициируемых деструкцией рафтов [12]. Имеются также данные о возможном участии фосфоинозитидов и в-белков [9, 26]. Мы проверили возможное участие Згс-киназ в процессах реорганизации Р-актина в экспериментах на трансформированных фибробластах ЗТЗВ-8У40 с использованием селективного ингибитора киназ семейства Эгс (8гс-11, Sigma-Aldrich, США).

Контроль МбЦД Src-11 +М6ЦД

Г 3 і "Ч , «¿V ч V -

$' ''if . ... , fV ffr - * \ ■•■„J

\ - ' ". У 'mgjy^-d-'

к ■ \ .л- ■ "*>"/ • '

«Ъ „ J ••V ■' . .

Рис. 11. Ингибирование киназ семейства 8гс не препятствует холестерин-зависимой сборке стресс-фибрилл в фибробластах ЗТЗВ-8\'40. Окраска родамин-фаллоидином. Масштабная линейка 30 мкм.

Как показали проведенные эксперименты, ингибирование Src киназ при действии Src-Il(10 мкМ) не препятствовало формированию стресс-фибрилл после экстракции мембранного холестерина (Рис. 11). Другими возможными участниками сигнального механизма, опосредующего реорганизацию цитоскелета после модификации липидного бислоя и рафтов, являются фосфоинозитиды. Известно, что фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (Р1Рг) и фосфатидилинозитол-4-монофосфат (PIP) вызывают быструю диссоциацию кэпирующего белка от актиновых филаментов [27]. Показано, что экстракция холестерина может модулировать распределение Р1Р2 в мембране и компартментализацию в рафтах [28]. Таким образом, процессы сборки или разборки актинового цитоскелета после частичной экстракции холестерина могут управляться фосфоинозитид-зависимыми механизмами, что согласуется с предположениями об определяющей роли баланса полимерного и мономерного актина в клетке. Весьма вероятно, что в основе обнаруженных эффектов могут лежать процессы декэпирования (uncapping) филаментов, что и определяет направление холестерин-зависимых перестроек актинового цитоскелета.

ВЫВОДЫ

1. Частичная экстракция мембранного холестерина метил-бета-циклодекстрином приводит к подавлению активности механочувствительных каналов в клетках миелоидной лейкемии человека К562. Альфа-циклодекстрин, структурный аналог, не связывающий стеролы, не влияет на параметры активации каналов.

2. Подавление механозависимой активации каналов обусловлено повышением жесткости плазматической мембраны после действия метил-бета-циклодекстрина.

3. Снижение содержания холестерина в клетках различных типов приводит к нарушению структуры липидных микродоменов (рафтов) в плазматической мембране.

4. Повышение жесткости мембраны и ингибирование механочувствительных каналов в клетках с пониженным уровнем холестерина опосредовано реорганизацией актинового цитоскелета, вызванной нарушением целостности липидных рафтов.

5. Снижение уровня мембранного холестерина и разрушение рафтов инициирует процессы реорганизации микрофиламентов. Перестройки цитоскелета, вызванные экстракцией холестерина, зависят от исходного баланса фибриллярного и глобулярного актина в клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Т.Н. Ефремова, В.И. Чубинскин-Надеждин, С.Ю. Хайтлина, Е.А. Морачевская. Сборка актиновых филаментов в трансформированных клетках при действии мембранных модификаторов, связывающих холестерин. 2012. Цитология 54(6): 508-514.

2) V.I. Chubinskiy-Nadezhdin, Y.A. Negulyaev, Е.А. Morachevskaya. Cholesterol depletion-induced inhibition of stretch-activated channels is mediated via actin rearrangement. 2011. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 80-85.

3) А. В. Сударикова, В.И. Чубивский-Надеждин, Ю.А. Негуляев, Е.А. Морачевская. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. 2009. Цитология. 51 (8): 676-683.

4) В.И. Чубинский-Надеждин, Е.А. Морачевская. Активация мехаиочувствительных ионных каналов клеток К562 в условиях экстракции мембранного холестерина. 2008. Сб. «XXXVI Неделя науки СПбГПУ», с. 207-209.

5) В.И. Чубинский-Надеждин, Е.А. Морачевская. Подавление активности мехаиочувствительных каналов при экстракции холестерина опосредовано реорганизацией F-актина. 2008. Сб. «XXXVII Неделя науки СПбГПУ», с. 46-48.

6) Ефремова Т.Н., Чубинский-Надеждин В.И., Негуляев Ю.А., Хайтлина, С.Ю. Морачевская Е.А. Влияние экстракции мембранного холестерина на характеристики мехаиочувствительных каналов и актиновый цитоскелет. Сб. "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 2009, с. 42-45.

7) Чубинский-Надеждин В.И., Морачевская Е.А. Роль липидных рафтов и актинового цитоскелета в регуляции мехаиочувствительных ионных каналов. Сборник тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции "Биология-наука 21 века", 2011, с.136.

8). В.И. Чубинский-Надеждин, Т.Н. Ефремова, Е.А. Морачевская.

Механозависимая активация катионных каналов в фибробластах Balb/ЗТЗ и ЗТЗВ-SV40. Цитология. 2011, 53 (9): 719-720.

9) Vladislav I. Chubinskiy-Nadezhdin, Yuri A. Negulyaev, Elena A. Morachevskaya. Suppression of stretch-activated channels in human myeloid leukaemia cells after cholesterol depletion is mediated by actin rearrangement. 2011': New Frontiers in Nobel Channels Symp. p.8.

10) В.И. Чубинский-Надеждин. Участие мембранного холестерина и рафтов в регуляции мехаиочувствительных каналов и актинового цитоскелета. 2012. Цитология 54 (4): 362-363.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Arnadottir J., Chalfie М. 2010. Annu. Rev. Biophys. 39: 111-137. 2. Ивков В. Г., Берестовский Т. Н. 1982. М. Наука: 224с. 3. Needham D., Nunn R.S. 1990. Biophys. J. 58: 997-1009. 4. Brown D. A. and London E. 2000. J. Biol. Chem. 275: 17221-17224. 5. Pike L.J. 2009. J. Lipid Res. 50: 323-328. 6. Lingwood £>., Simons K. 2010. Science 327: 46-50. 7. Nebl T. et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 43399-43409 8. Harder Т., Simons K. 1999. Eur. J. Immunol. 29: 556-562. 9. Kwik J. et al. 2003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 13964-13969. 10. Byfield F.J. et. al. 2004. Biophys. J. 87: 3336-3343. 11. Morachevskaya E.A. et. al. 2007. Cell Biol. Int. 31: 374-381. 12. Qi M. et al. 2009. J. Cell Biochem. 106: 1031-1040. 13. Suresh S. 2007, Acta Biomater. 1-53. 14. Maroto et al. 2012. Channels 6: 1-18. 15. Murai T. 2012, Int. J. Cell Biol. 2012: 763283-9 16. Филатова H. А. и др. 2010. Цитология. 52 (12): 983-989. 17. Няпшаев И.А. и др. 2012. ЖТФ 82(10): 109-117. 18. Staruschenko A. V., Vedernikova Е.А. 2002. J. Physiol 541: 81-90. 19. Lencer W.I. and Tsai B. 2003. Trends Biochem. Sci. 28: 639-645. 20. Lai C.H. et al. 2008. Infect. Immun. 76: 3293-3303. 21. Сударикова и др. 2009. Цитология. 51 (8): 676-683 22. Chubinskiy-Nadezhdin V.I. et al. 2011. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 80-85. 23. Klausen Т.К. et al. 2006. Am. J. Physiol. 291: 757-771. 24. Ефремова Т.Н. и др. 2012. Цитология 54(6): 508-514. 25. Pike L. 2003. J. Lipid. Res. 44: 655-667. 26. Grimmer S. et al. 2002. J. Cell Sci. 115: 2953-2962. 27. Schafer D.A. et al. 1996. J. Cell Biol. 135(1): 169-79.28. Chichili G.R., Rodgers W.2009. Celi Mol. Life Sci. 66(14): 2319-28.

Подписано в печать 30.10.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 575

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чубинский-Надеждин, Владислав Игоревич

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ

2.1.1. Механочувствительные ионные каналы прокариот

2.1.2. Механочувствительные ионные каналы в клетках эукариот 13 2.1.2.1 Общая характеристика и функциональные свойства

2.1.2.2. Предположения о молекулярной природе каналов

2.1.2.3. Модели активации

2.1.2.4. Роль цитоскелета в функционировании каналов

2.1.2.5. Клетки лейкемии человека К562 как модель для исследования 34 регуляции каналов.

2.2. ЛИПИДНЫЕ МИКРОДОМЕНЫ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

2.2.1. Понятие о латеральной гетерогенности липидного бислоя

2.2.2. Холестерин и его роль в структуре липидных микродоменов

2.2.3. Визуализация липидных микродоменов в клеточных мембранах

2.2.4. Участие липидных рафтов в процессах передачи сигнала

2.2.5. Липидные рафты и актиновый цитоскелет: структурно- 52 функциональная взаимосвязь

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Регистрация ионных токов

3.2. Растворы

3.3. Клеточные культуры

3.4. Флуоресцентная микроскопия 59 3.5 Атомно-силовая микроскопия

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Участие мембранного холестерина и рафтов в регуляции 61 механочувствительных каналов

4.1.1 Механозависимая активация ионных токов: анализ действия 61 циклодекстринов

4.1.2. Изменения жёсткости клеток после частичной экстракции 64 мембранного холестерина

4.1.3. Нарушение целостности липидных рафтов при снижении уровня 65 холестерина

4.1.4. Выявление Р-актина в клетках К562.

4.1.5. Подавление активации механочувствительных каналов в клетках с 68 пониженным содержанием холестерина опосредовано реорганизацией Р-актина

4.2. Анализ роли мембранного холестерина в организации 72 актинового цитоскелета

4.2.1. Визуализация липидных микродоменов в нормальных и 72 трансформированных фибробластах.

4.2.2. Перестройки цитоскелета в клетках различных типов после 73 снижения уровня холестерина

5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Функциональный вклад мембранного холестерина в процессы 79 клеточной механотрансдукции

5.2. Стретч-активируемые каналы: возможная молекулярная природа и 84 роль в клетке

5.3. Реорганизация актинового цитоскелета, сопряженная с нарушением 87 целостности рафтов

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета"

Актуальность исследования

Механозависимые процессы являются неотъемлемой составляющей жизнедеятельности клетки, как в норме, так и при различных патологиях. Изучение молекулярной природы механочувствительности занимает важное место в решении проблем современной клеточной биологии. В механотрансдукции ключевую роль играют ионные каналы плазматической мембраны, реагирующие на изменение ее механического статуса [Arnadottir, Chalfie, 2010]. Такие каналы называют механоуправляемыми (mechanogated) или механочувствительными, они чрезвычайно широко распространены в живой природе и, в то же время, остаются наименее изученными. Один из центральных вопросов регуляции механочувствительных каналов в клетках эукариот - исследование вклада липидного бислоя и актинового цитоскелета. Анализ функциональных взаимосвязей ионных каналов с липидным окружением и структурами цитоскелета необходим для выяснения физиологических путей их активации в нативных клетках.

Холестерин (холестерол) — это один из основных липидных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих. Известно, что динамические параметры липидного бислоя зависят от состава и концентрации стеролов [Ивков, Берестовский, 1982; Needham, Nunn, 1990]. Традиционно присутствие стеролов в клеточных мембранах связывали, прежде всего, с их механическими свойствами. Однако за последние десятилетия возникло новое понимание роли липидов в жизнедеятельности клеток, сформировались новые концепции и гипотезы относительно организации клеточных мембран. Согласно современным представлениям, принципиальной особенностью их структурно-функциональной организации является латеральная гетерогенность бислоя, зависящая, в первую очередь, от липидного состава. Уровень мембранного холестерина имеет определяющее значение для структуры и целостности липидных микродоменов (рафтов), участков, характеризующихся более плотной упаковкой, повышенным содержанием холестерина, сфинголипидов и насыщенных жирнокислотных остатков [Brown and London, 2000; Pike, 2009; Lingwood, Simons, 2010].

Высказываются многочисленные гипотезы о роли холестерина и рафтов в передаче сигнала с поверхности мембраны к внутриклеточным структурам и, в частности, в процессах реорганизации и динамики актинового цитоскелета. Первоначально рафты рассматривались как некие «фокальные точки», обеспечивающие связь мембраны с кортикальными микрофиламентами [Harder, Simons, 1999; Brown, London, 2000; Nebl et al, 2002]. При этом предполагалось, что деструкция рафтов при частичной экстракции холестерина (cholesterol depletion) приводит к разобщению плазматической мембраны и цитоскелета и сопровождается повышением ее деформируемости. Однако, как показали дальнейшие исследования, в том числе анализ изменений механических свойств комплекса «мембрана-цитоскелет» при варьировании уровня стеролов [Kwik et al., 2003; Byfíeld et al., 2004; Morachevskaya et al., 2007], такая точка зрения является весьма упрощенной. Пока остаются открытыми вопросы о связи динамики липидных рафтов и примембранного актина. Нарушения структуры рафтов, по-видимому, могут инициировать различные процессы реорганизации цитоскелета, включая сборку микрофиламентов [Qi et al., 2009].

Таким образом, до недавнего времени регуляторная роль холестерина в составе клеточных мембран оставалась недооцененной и неясной. В настоящее время проблемы участия холестерина и рафтов в процессах механотрансдукции в живых клетках приобретают особую актуальность и значимость. В мировой науке эта новая область молекулярной физиологии начинает интенсивно разрабатываться, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной сигнализации, так и новых направлений клеточной медицины. Ряд данных указывает на связь клеточной механотрансдукции и опухолевой трансформации [Suresh, 2007], а также на вероятную роль Са2+-проницаемых механочувствительных каналов и липидных рафтов в сигнальных процессах, связанных с адгезией и миграцией клеток [Maroto et al., 2012; Murai, 2012]. Все сказанное определило основные задачи данной работы, направленной на выявление функционального вклада мембранного холестерина в механозависимые реакции живой клетки.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Сопоставить эффекты акцептора стеролов метил-бета-циклодекстрина и его структурного аналога альфа-циклодекстрина на характеристики механочувствительных каналов плазматической мембраны.

2. С помощью атомно-силовой микроскопии выявить влияние экстракции холестерина на механические свойства клеток.

5. Определить, как влияет снижение холестерина и разрушение липидных рафтов на организацию актинового цитоскелета.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Разборка Б-актина восстанавливает высокий уровень активности механочувствительных каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Научная новизна работы

Впервые получены данные о роли холестерина и липидных микродоменов в регуляции механочувствительных каналов и организации цитоскелета. Установлено, что частичная экстракция мембранного холестерина и разрушение рафтов приводит к подавлению механозависимой активации ионных токов. С помощью метода атомно-силовой микроскопии исследована зависимость механических свойств живых клеток от содержания холестерина. Впервые показано, что ингибирование механочувствительных каналов и повышение жесткости клеток после снижения уровня холестерина обусловлено реорганизацией актиновой сети, инициированной разрушением липидных микродоменов. Выявлено нарушение структуры рафтов при снижении уровня холестерина в различных типах клеток. Обнаружено, что влияние холестерина и рафтов на актиновый цитоскелет зависит от исходного состояния сети микрофиламентов. Впервые показано, что холестерин-зависимые перестройки цитоскелета определяются балансом глобулярного и фибриллярного актина в клетке. Результаты демонстрируют новую роль мембранного холестерина в регуляции ионных каналов и клеточной механотрансдукции.

Личный вклад автора

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные существенны для понимания роли холестерина и липидных рафтов в модуляции мембранных функций клеток. Выявление физиологических механизмов регуляции механочувствительных каналов важно для понимания феномена механотрансдукции на уровне клеток и тканей. Фундаментальное значение имеет анализ взаимосвязей мембраны и цитоскелета как ключевого звена в передаче сигнала. Исследование действия модификаторов липидного состава, в том числе циклодекстринов, представляет интерес как для разработки новых препаратов противоопухолевой терапии, так и для анализа плейотропных эффектов статинов - веществ, широко используемых для коррекции липидного профиля. Результаты демонстрируют принципиальные различия клеточных и модельных мембран и ограничения в применимости последних при исследовании регуляции каналов и роли мембранных липидов. Данные могут быть использованы в курсах лекций по физиологии, биофизике и клеточной биологии.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ (3 статьи и 7 тезисов) в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях. Материалы работы доложены и обсуждены на конференциях «Неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2008, 2009), конференции Европейского общества молекулярной биологии (Сан-Фелю, 2010), конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), I Всероссийской конференции "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (Санкт-Петербург, 2011), международном симпозиуме «Нобелевские каналы» (Наймеген, 2011), III Конференции молодых ученых ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2012), III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), на семинарах ИНЦ РАН.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Чубинский-Надеждин, Владислав Игоревич

ВЫВОДЫ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чубинский-Надеждин, Владислав Игоревич, Санкт-Петербург

1. Ефремова Т. Н., Чубинский-Надеждин В. И., Хайтлина С. Ю., Морачевская Е. А. 2012. Сборка актиновых филаментов в трансформированных клетках при действии мембранных модификаторов, связывающих холестерин. Цитология. 54 (6): 508-514.

2. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. 1981. Динамическая структура липидного бислоя. М. Наука: 286с.

3. Няпшаев И. А., Анкудинов А. В., Стовпяга А. В., Трофимова Е. Ю., Еропкин М. Ю. 2012. Диагностика живых клеток в атомно-силовом микроскопе, используя субмикронный сферический зонд калиброванного радиуса кривизны. ЖТФ 10- 109-117.

4. Сударикова А. В., Чубинский-Надеждин В. И., Негуляев Ю. А., Морачевская Е. А. 2009. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. Цитология. 51 (8): 676-683.

5. Сударикова А.В., Васильева И.О., Морачевская Е. А., Негуляев Ю. А. 2012. Молекулярная и функциональная идентификация натриевых каналов в клетках К562. Цитология 54(7):573-579.

6. Филатова Н. А., Чубинский-Надеждин В. И., Иванов В. А., Морачевская Е. А. 2010.Чувствительность к действию естественных киллеров зависит от целостности липидных рафтов в мембране трансформированных клеток. Цитология. 52 (12): 983-989.

7. Alessandri-Haber N., Joseph E., Dina O. A., Liedtke W., LevineJ. D. 2005. TRPV4 mediates pain-related behavior induced by mild hypertonic stimuli in the presence of inflammatory mediator. Pain 118:70-79.

8. Alessandri-Haber N., YehJ. J., Boyd A. E., Parada C. A., ChenX., Reichling D. В., Levine J. D. 2003. Hypotonicity induces TRPV4-mediated nociception in rat.1. Neuron 39:497-511.

9. Bautista D. M., Jordt S. E., Nikai T., Tsuruda P. R., Read A. J., Poblete J., Yamoah E. N., Basbaum A. I., Julius D. 2006. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 124:1269-82.

10. Bickel, P. E., Scherer P. E., Schnitzer J. E., Oh P., Lisanti M. P., Lodish H. F. 1997. Flotillin and epidermal surface antigen define a new family of caveolae-associated integral membrane proteins. J. Biol. Chem. 272: 13793-13802.

11. Blin G., Margeat E., Carvalho K., Royer C. A., Roy C., Picart C. 2008.

12. Booth I. R., Edwards M. D., Black S„ Schumann U., Miller S. 2007. Mechanosensitive channels in bacteria:signs of closure? Nat. Rev. Microbiol. 5:431-40.

13. Bourque C.W., Oliet S.H.R. 1997. Osmoreceptors in the central nervous system. Annu. Rev. Physiol. 59: 601-619.

14. Brown D. A. 2006. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Am. J. Physiol. 21: 430-439.

15. Brown D. A., London E. 1998. Structure and origin of ordered lipid domains in biological membranes. J. Membr. Biol. 164: 103-114.

16. Brown D. A., London E. 2000. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275: 17221-17224.

17. Burnstock G. 1999. Release of vasoactive substances from endothelial cells by shear stress and purinergic mechanosensory transduction. J. Anat. 194: 335-342.

18. Carattino M.D., SHeng S., Kleyman T.R. 2005. Mutations in the pore region modify epithelial sodium channel gating by shear stress. J. Biol. Chem. 280:4393-401.

19. Chalfie M. 2009. Neurosensory mechanotransduction. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.10(l):44-52.

20. Chalfie M., Au M. 1989. Genetic control of differentiation of the Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. Science 243:1027-33.

21. Chalfie M., Thomson J. N. 1982. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 93: 15-23.

22. Chang G., Spencer R. H., Lee A. T., Barclay M. T. and Rees D. C 1998. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science 282, 2220—2226.

23. Zl.Chapleau M. W. 1992. Cardiovascular mechanoreceptors. Adv. Comp. Environ. Physiol. 10: 138-164.

24. Lai C., Chang Y-C., Du S-Y, Wang H-J, Kuo C-H., Fang S-H, Fu H-W., Lin H-H, Chiang A-S. and Wang W-C. 2008. Cholesterol Depletion Reduces Helicobacter pylori CagA Translocation and CagA-Induced Responses in AGS Cells. Infect. Immun. 76(7): 3293-3303.

25. Chichili G. R., Rodgers W. 2009. Cytoskeleton-membrane interactions in membrane raft structure. Cell. Mol. Life Sci. 66: 2319-2328.

26. Cho H., Shin J., Shin C. Y., Lee S. Y., Oh U. 2002. Mechanosensitive ion channels in cultured sensory neurons of neonatal rats. J. Neurosci. 22: 1238-1247.

27. Christensen A. P. and Corey D. P. 2007.TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nat. Rev. Neurosci.8: 510-521.

28. Chubinskiy-Nadezhdin V. I., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2011. Cholesterol depletion-induced inhibition of stretch-activated channels is mediated via actin rearrangement. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 80-85.

29. Chun M., Liyanage K., Lisanti M. P., Lodish H. F. 1994. Signal transduction of a G protein-coupled receptor in caveolae: colocalization of endothelin and its receptor with caveolin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 11728-11732.

30. Corey D.P., Hudspeth A.J. 1979. Response latency of vertebrate hair cells.1. Biophys. J. 26:499-506

31. Coste B., Mathur J., Schmidt M., Earley T.J., Ranade S., Petrus M.J., Dubin A.E., Patapoutian A. 2010. Piezol and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science. 330(6000):55-60.

32. Coste B., Xiao B., Santos J.S., Syeda R., Grandl J., Spencer K.S., Kim S.E., Schmidt M., Mathur J., Dubin A.E., Montal M., Patapoutian A.2012. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483(7388): 17681.

33. Delcour A. H., Martinac B., Adler J. and Kung, C. 1989. Modified reconstitution method used in patch-clamp studies of Escherichia coli ion channels. Biophys. J. 56, 631-636.

34. Du H., Gu G., William C. M. and Chalfie M. 1996. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron 16, 183-194.

35. Duncan R. L., Turner C. H. 1995. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcif. Tissue. Int. 57: 344-358.

36. Edidin M. 2003. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32: 257-283.

37. Elliott R., Szleifer I., Schick M. 2006. Phase diagram of a ternary mixture of cholesterol and saturated and unsaturated lipids calculated from a microscopic model. Phys. Rev. Lett. 96: 98-101.

38. Epand R. M. 2008. Proteins and cholesterol-rich domains. Biochim. Biophys Acta. 1778:1576-1582.

39. Ermakov YA, Kamaraju K, Sengupta K, Sukharev S.2010. Gadolinium Ions Block Mechanosensitive channels by altering the packing and laterial pressure of anionicphospholipids. Biophys. J. 98(6): 1018-1027.

40. Foger N., Marhaba R., Zdller M. 2001. Involvement of CD44 in cytoskeleton rearrangement and raft reorganization in T cells. J Cell Sci. 114: 1169-1178.

41. Fronius M., Clauss W. G. 2008. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Eur. J. Physiol. 455: 775-785.

42. Fujimoto T., Miyawaki A., Mikoshiba K. 1995. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-like protein in plasmalemmal caveolae is linked to actin filaments. J. Cell Sci. 108: 7-15.

43. Gamaley I., Efremova T., Kirpichnikova K, Kever L., Komissarchik Y., Polozov Y., Khaitlina S. 2006. N-Acetylcysteine-induced changes in susceptibility of transformed eukaryotic cells to bacterial invasion. Cell Biol. Int. 30: 319-325.

44. Garcia-Anoveros J., Samad T.A., Zuvela-Jelaska L., Woolf C.J., Corey D.P. 2001. Transport and localization of the DEG/ENaC ion channel BNaCl alpha to peripheral mechanosensory terminals of dorsal root ganglia neurons. J. Neurosci. 21:2678-86.

45. Gottlieb P., Folgering J., Maroto R., Raso A., Wood T.G., Kurosky A., Bowman C., Bichet D., Patel A., Sachs F., Martinac B., Hamill O.P., Honoré E. 2008. Revisiting TRPC1 and TRPC6 mechanosensitivity. Pflugers Arch. 455:1097-103.

46. Grimmer S., van Deurs B., Sandvig K. 2002. Membrane ruffling and macropinocytosis in A431 cells require cholesterol. J. Cell Sci. 115: 2953-2962.

47. Guharay F., Sachs F. 1984. Stretch-activated single ion channel currents in tissue cultured embryonic chick skeletal muscle. J. Physiol. 352: 685-701.

48. Hackney C.M., Furness D.M. 1995. Mechanotransduction in vertebrate hair cells: structure and function of the stereociliary bundle. Am. J. Physiol. 268: 1-13.

49. Hamill O. P, Martinac B. 2001. Molecular basis of mechanotransduction in livingcells. Physiol. Rev. 81: 685-740. 73.Hamill O. P., McBride Jr. D. W. 1996. The pharmacology of mechanogated membrane ion channels. Pharmacol. Rev. 48: 231-252.

50. A. Hamill O.P., McBride D.W. Jr. 1992. Rapid adaptation of single mechanosensitivechannels in Xenopus oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7462-66.

51. Hanaoka K., Qian F., BolettaA., Bhunia A.K., Piontek K., Tsiokas L., Sukhatme V. P., Guggino W B., Germino G.G. 2000. Co-assembly of polycystin-1 and -2 produces unique cation-permeable currents. Nature 408:990—94.

52. Hell S. W. 2007. Far-field optical nanoscopy. Science 316, 1153-1158.

53. Rev. Neurosci. 8:251-61. S3.Hope H. R., Pike L. J. 1996. Phosphoinositides and phosphoinositide-utilizing enzymes in detergent-insoluble lipid domains. Mol. Biol. Cell. 7: 843-851.

54. Howard J., Bechstedt S. 2004. Hypothesis: a helix of ankyrin repeats of the NOMPC-TRP ion channel is the gating spring of mechanoreceptors. Curr. Biol. 14:224-26.

55. Howard J., Roberts W. M., Hudspeth A. J. 1988. Mechanoelectrical transduction by hair cells. Annu. Rev. Biophys. Chem. 17: 99-124.

56. Hudspeth A.J., Jacobs R. 1979. Stereocilia mediate transduction in vertebrate hair cells (auditory system/cilium/vestibular system). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1506-9.

57. Ishitsuka R., Sato S. B., Kobayashi T. 2005. Imaging lipid rafts. J. Biochem. 137: 249-254.

58. Janmey P. A. 1998. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78: 763-781.

59. Kamkin A., I. Kiseleva I., Isenberg G. 2003. Ion selectivity of stretch-activated cation currents in mouse ventricular myocytes. Pflugers Arch. 446: 220-231.

60. Kaufmann S., Kas J., Goldmann W. H., Sackmann E., Isenberg G. 1992. Talin anchors and nucleates actin filaments at lipid membranes. A direct demonstration. FEBSLett. 314:203-205.

61. Kim S. E., Coste B., Chadha A., Cook B., Patapoutian A. 2012. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483(7388):209-12.

62. Klausen T. K., Hougaard C., Hoffmann E. K., Pedersen S. F. 2006. Cholesterol modulates the volume-regulated anion current in Ehrlich-Lettre ascites cells via effects on Rho and F-actin. Am. J. Physiol. 291: 757-771.

63. Kobayashi T, Takahashi M, Nagatsuka Y, Hirabayashi Y. 2006. Lipid rafts: new tools and a new component. Biol Pharm Bull. 29(8): 1526-31.

64. Kolanjiappan K., Ramachandran C.R., Manoharan S. 2003. Biochemical changes in tumor tissues of oral cancer patients. Clin Biochem. 36:61-65.

65. Kung C. 2005. A possible unifying principle for mechanosensation. Nature 436(7051):647-54.

66. Kwan K.Y., Allchorne A.J., Vollrath M.A., Christensen A.P., Zhang D.S., Woolf C. J., Corey D. P. 2006. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron 50:277-89.

67. Laux T., Fukami K., Thelen M., Golub T., Frey D., Caroni P. 2000. GAP43, MARCKS, and CAP23 modulate PI(4, 5)P2 at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J. Cell Biol. 149: 14551472.

68. Leitinger B., Hoggl N., 2002. The involvement of lipid rafts in the regulation of integrin function. J. Cell Sci. 115: 963-972.

69. Lekka M., Pogoda K., GostekJ., Klymenko O., Prauzner-Bechcicki S., Wiltowska

70. Zuber J., Jaczewska J., Lekki J., Stachura Z. 2012. Cancer cell recognition-mechanical phenotype. Micron 43(12): 1259-66.

71. Lencer W.I. and Tsai B. 2003. The intracellular voyage of cholera toxin: going retro.Trends Biochem. Sci. 28: 639-645.

72. Lenne, P F. Wawrezinieck L., Conchonaud F, Wurtz O., Boned A., Guo X. J., Rigneault H., He H. T., Marguet D. 2006. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25, 3245-3256.

73. Lingwood D., Simons K 2010. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science 327: 46-50.

74. Liu, P., Ying Y, Ko Y-G., Anderson R. G. W. 1996. Localization of platelet-derived growth factor-stimulated phosphorylation cascade to caveolae. J. Biol. Chem. 271: 10299-10303.

75. Maingret F., Fosset M., Lesage F., Lazdunski M, Honore E. 1999. TRAAK is a mammalian neuronal mechano-gated K+ channel. J. Biol. Chem. 274: 1381-1387.

76. Maroto R., Kurosky A., Hamill O.P. 2012. Mechanosensitive Ca (2+) permeant cation channels in human prostate tumor cells. Channels 6(4): 290-307.

77. Wl.Maroto R., Raso A., Wood T.G., Kurosky A., Martinac B., Hamill O.P. 2005. TRPC1 forms the stretch-activatedcation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7:179-85.

78. Martel V., Racaud-Sultan C., Dupe S., Marie C., Paulhe F., Galmiche A., Block M. R., Albiges-Rizo C. 2001. Conformation, localization, and integrin binding of talin depend on its interaction with phosphoinositides. J. Biol. Chem. 276: 2121721227.

79. Martinac B., Adler J., Kung C. 1990. Mechanosensitive ion channels of E. coli activated by amphipaths. Nature. 348: 261-263.

80. Martinac B., Buechner M., Delcour A. H., Adler J. and Kung C. 1987. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 2297-2301.

81. Martinac B., Delcour A. H., Buechner M., Adler J. and Kung, C. Advances in Comparative and Environmental Physiology 3—18 (Springer, Heidelberg, 1992).

82. Middlebrook J. L., Dorland R. B. 1984. Bacterial Toxins: Cellular Mechanisms of Action Microbiol. Rev, 48: 199-221.

83. XTh.Mineo, C., James G. L., Smart E. J., Anderson R. G. W. 1996. Localization of epidermal growth factor-stimulated Ras/Raf-1 interaction to caveolae membrane. J. Biol. Chem. 271: 11930-11935.

84. Mizuno A., Matsumoto N., Imai M., Suzuki M. 2003. Impaired osmotic sensation in mice lacking TRPV4. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 285:96-101.

85. Morachevskaya E. A., Sudarikova A. V., Negulyaev Y. A. 2007. Mechanosensitive channel activity and F-actin organization in cholesterol-depleted human leukaemia cells. Cell Biol. Int. 31: 374-381.

86. Mukherjee S., Zha X., Tabas /., Maxfield F.R. J998. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophys J. 75(4):1915-25.

87. Murai T. 2012. The role of lipid rafts in cancer cell adhesion and migration. Int J Cell Biol.; 2012:763283.

88. Murata, M., Peranen J., Schreiner R., Wieland F., Kurzchalia T. V., Simons K. 1995. VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:10339-10343.

89. Nakamura T. Y, Iwata Y., Sampaolesi M., Hanada H., Saito N., Artman M., Coetzee W. A., Shigekawa M. 2001. Stretch-activated cation channels in skeletal muscle myotubes from sarcoglycan-deficient hamsters. Am. J. Physiol. 281: 690699.

90. Nauli S.M., Alenghat F.J., Luo Y., Williams E., Vassilev P., Li X., Elia A. E., Lu W., Brown E. M., Quinn S. J., Ingber D. E., Zhou J. 2003. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nat. Genet. 33:129-37.

91. Nauli S.M., Rossetti S., Kolb R.J., Alenghat F.J., Consugar M.B., Harris P.C, Ingber D. E, Loghman-Adham M., Zhou J. 2006. Loss of polycystin-1 in human cyst-lining epithelia leads to ciliary dysfunction. J. Am. Soc. Nephrol. 17:1015-25.

92. Nebl T., Pestonjamasp K. N., Leszyk J. D., Crowley J. L., Oh S. W., Luna E. J. 2002. Proteomic analysis of a detergent-resistant membrane skeleton from neutrophil plasma membranes. J. Biol. Chem. 277: 43399^13409.

93. Needham D., Nunn R.S. 1990. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58: 997-1009.

94. Negulyaev Y.A., Khaitlina S.Y., Hinssen H., Shumilina E.V., Vedernikova E.A. 2000. Sodium channel activity in leukemia cells is directly controlled by actin polymerization. J Biol Chem. 275(52):40933-7.

95. Niisato N., Marunaka Y. 2001. Blocking action of cytochalasin D on protein kinase A stimulation of a stretch-activated cation channel in renal epithelial A6 cells. Biochem. Pharmacol. 61: 761-765.

96. Nilius B., Eggermont J., Voets T., Buyse G., Manolopoulos V., Droogmans G. 1997. Properties of volume-regulated anion channels in mammalian cells. Progr.

97. Biophys. Mol. Biol. 68: 69-119.3S.Nilius B.2009. Polycystins under pressure. Cell. 139(3):466-7.

98. Numata T, Shimizu T, Okada Y. 2007. TRPM7 is a stretch- and swelling-activated cation channel involved in volume regulation in human epithelial cells. Am. J Physiol Cell Physiol. 292(l):C460-467.

99. AO. Numata T., Shimizu T., Okada Y. 2007. Direct mechano-stress sensitivity of TRPM7 channel. Cell. Physiol. Biochem. 19(l-4):l-8.

100. O'Hagan R., Chalfie M., Goodman M.B. 2005. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8:43-50.

101. Ohtani E., Irie T., Uekama K., Fukunaga K. Pitha J. 1989. Differential effects of alpha-, beta- and gamma -cyclodextrins on human erythrocytes. Eur. J. Biochem. 186: 17-22.

102. O ike M., Schwarz G., Sehrer J., Jost M., Gerke V., Weber K., Droogmans G., Nilius B. 1994. Cytoskeletal modulation of the response to mechanical stimulation in human vascular endothelial cells. Pflügers Arch. 428: 569-576.

103. Okada Y. 1997. Volume expansion-sensing outward-rectifier C12 channel: fresh start to the molecular identity and volume sensor. Am. J. Physiol. 273: 755-789.

104. Oliferenko S., Paiha K., Harder T., Gerke V., Schworzler C., Schwarz H. 1999. Analysis of CD44-containing lipid rafts: Recruitment of annexin II and stabilization by the actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 146: 843-854.

105. Orlandi P. A., Fishman P. H. 1998. Filipin-dependent inhibition of cholera toxin: evidence for toxin internalization and activation through caveolae-like domains. J Cell Biol. 141(4):905-15.

106. XAS.Parmryd I., Adler J., Patel R., Magee A.I. 2003. Imaging metabolism of phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate in T-cell GM1 -enriched domains containing ras proteins. Exp. Cell Res. 285: 27-38.

107. Pierce S. K. 2002. Lipid rafts and B-cell activation. Nat. Rev. Immunol. .2: 96105.

108. Pike L. J. 2009. The challenge of lipid rafts. J. Lipid Res. 50: 323-3286.

109. Pike L. J., 2003. Lipid rafts bringing order to chaos. J. Lipid Res. 44:655-667.

110. Pike L. J., Han X., Gross R. W. 2005. EGFR are localized to lipid rafts that contain a balance of inner and outer leaflet lipids: A shotgun lipidomics study. J. Biol. Chem. 280: 26796-26804.

111. Pinaud F.,Michalet X.,Iyer G.,Margeat E., Moore H. P., Weiss S.2009. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic 10, 691-712.

112. Praetorius H. A., Spring K. R. 2001. Bending theMDCKcell primary cilium increases intracellular calcium. J. Membr. Biol. 184:71-79.

113. Price M. P., Mcllwrath S. L., Xie J., Cheng C., Qiao J., Tarr D. E., Sluka K. A., Brennan T. J., Lewin G. R., Welsh M. J. 2001. The DRASIC cation channel contributesto the detection of cutaneous touch and acid stimuli in mice. Neuron 32:1071-83.

114. Qi M., Liu Y., Freeman M.R., Solomon K.R. 2009. Cholesterol-regulated stress fiber formation. J Cell Biochem. 106(6): 1031-40.

115. Roza C., Puel J.L., Kress M., Baron A., Diochot S., Lazdunski M., Waldmann R. 2004. Knockout of the ASIC2 channel in mice does not impair cutaneous mechanosensation, visceral mechanonociception and hearing. J. Physiol. 558:65969.

116. Rust M. J., Bates M. and Zhuang, X. 2006. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Meth. 3, 793-795.

117. Sachs F., Morris C. E. 1998. Mechanosensitive ion channels in nonspecialized cells. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 132: 1-77.

118. Saeki K, Miura Y., Aki D., Kurosaki T., Yoshimura A. 2003. The B cell specific major raft protein, Raftlin, is necessary for the integrity of lipid raft and BCR signal transduction. EMBO J. 2: 3015-3026.

119. Salzer U., Prohaska R. 2001. Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts. Blood. 97: 1141-1143.

120. Sargiacomo, M., Sudol M., Tang Z., Lisanti M. P. 1993. Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositollinked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol. 122: 789-807.

121. Scheiffele P., Roth M. G., and Simons K. 1997. Interaction of influenza virus haemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain. EMBO J. 16: 5501-5508.

122. Schermelleh L., Heintzmann R. and Leonhardt H. 2010. A guide to superresolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190, 165-175.

123. Shroff H., Galbraith C. G., Galbraith J. A. and Betzig E. 2008. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Meth. 5,417-423.

124. Shumilina E.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A., Hinssen H., Khaitlina S.Y. 2003. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol. Biol. Cell. 14(4):1709-16.

125. Simons K., Gerl M. 2010. | Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nature Reviews Molecular Cell Biology 11,688-699.

126. Simons K., Toomre D. 2000. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 31-39.

127. Simpson-Holley M., Ellis D., Fisher D., Elton D., McCauley J., Digard P. 2002. A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions. Virology. 301: 212-225.

128. Singer S. J., Nicolson G. L. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175: 720-731.

129. Small D. L., Morris C. E. 1994. Delayed activation of single mechanosensitive channels in Lymnaea neurons. Am. J. Physiol. 267: 598-606.

130. Co-purification and direct interaction of Ras with caveolin, an integral membrane protein of caveolae microdomains. J. Biol. Chem. 271: 9690-9697.

131. Sonnino S., Mauri L., Chigorno V., Prinetti A. 2006. Gangliosides as components of lipid membrane domains. Glycobiology. 17: 1-13.

132. Staruschenko A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. 2005. Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of stretch-activated cation channels in leukaemia cells. Biochim Biophys Acta. 1669:53-60.

133. Staruschenko A. V., Sudarikova A. V., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A., 2006. Magnesium permeation through mechanosensitive channels: single-current measurements. Cell Res. 16:723-30.

134. Sukharev S. I., Blount P., Martinac B., Blattner F. R. and Kung C. 1994. A large conductance mechanosensitive channel in E. coli encoded by mscL alone. Nature 368, 265-268. '

135. Sukharev S. I., Blount P., Martinac B., Kung C.1997. Mechanosensitive channels of Escherichia coli: the MscL gene, protein, and activities. Annu. Rev. Physiol. 59: 633-657.

136. Sukharev S. I., Martinac B., Arshavsky V. Y. and Kung C. 1993. Two types of mechanosensitive channels in the Escherichia coli cell envelope: solubilization andfunctional reconstitution. Biophys. J. 65, 177-183

137. Sukharev S., Betanzos M., Chiang C. S. and Guy, H. R. 2001. The gating mechanism of the large mechanosensitive channel MscL. Nature 409, 720-724.

138. Sun M., Northup N. Marga F., Huber T., Byjield F.J., Levitan I., Forgacs G. 2007. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J Cell Sci. 120(Pt 13):2223-31.

139. Suresh S. 2007. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3(4):413-38.

140. Suzuki M., Mizuno A., Kodaira K., Imai M. 2003. Impaired pressure sensation in mice lacking TRPV4. J. Biol. Chem. 278:22664-68.

141. Suzuki M., Watanabe Y., Oyama Y., Mizuno A., Kusano E., Hirao A., Ookawara S. 2003. Localization of mechanosensitive channel TRPV4 in mouse skin. Neurosci. Lett. 353:189-92.

142. Tabuchi K., Suzuki M., Mizuno A., Hara A. 2005. Hearing impairment in TRPV4 knockout mice. Neurosci. Lett. 382:304-8.

143. Tskvitaria-Fuller I., Rozelle A. L., Yin H. L., and Wulfing C. 2003. Regulation of sustained actin dynamics by the TCR and costimulation as a mechanism of receptor localization. J. Immunol. 171: 2287-2295.

144. Uittenbogaard A., Everson W. V., Matveev S. V., Smart E. J. 2002. Cholesteryl ester is transported from caveolae to internal membranes as part of a caveolin-annexin II lipid-protein complex. J. Biol. Chem. 277: 4925-4931.

145. Valensin S., Paccani S. R., Ulivieri C., Mercati D., Pacini S., Patrussi L. 2002. F-actin dynamics control segregation of the TCR signaling cascade to clustered lipid rafts. Eur. J. Immunol. 32: 435-446.

146. Van Deurs B., Nilausen K., Faergeman O., Meinertz H. 1982. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27:270.278.

147. Van Haller P. D., Donohoe S., Goodlett D. R., Aebersold R., Watts J. D. 2001. Mass spectrometric characterization of proteins extracted from Jurkat T cell detergent-resistant membrane domains. Proteomics. 1: 1010-1021.

148. Van Rheenen J., Achame E. M., Janssen H., Calafat J., Jalink K. 2005. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. EMBO J. 24: 1664-1673.

149. Venkatachalam K., Montell C. 2007. TRP channels. Annu. Rev. Biochem. 76:387-417.

150. Vieira F. S., Correa G., Einicker-Lamas M., Coutinho-Silva R. 2010. Host-cell lipid rafts: a safe door for micro-organisms? Biol Cell. 102(7):391-407.

151. Walker R. G., Willingham A. T., Zuker C. S. 2000. Drosophila mechanosensory transduction channel. Science 287:2229-34.

152. Wissenbach U., Bodding M., Freichel M., Flockerzi V. 2000. Trpl2, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485:127-34.

153. Wu L.J., Sweet T.B., Clapham D.E. 2010. Current progress in the mammalian TRP ion channel family. Pharmacol Rev.;62(3):381-404.

154. HA.Xiao R. and Xu X.Z. 2010. Mechanosensitive Channels: In Touch with Piezo. Curr. Biol. 20: 2191.

155. Xu X., London E. 2000. The effect of sterol structure on membrane lipid domains reveals how cholesterol can induce lipid domain formation. Biochemistry. 39: 843849.

156. Zarychanski R., Schulz VP., Houston B.L., Maksimova Y., Houston D.S., Smith B., Rinehart J., Gallagher P.G. 2012. Mutations in the mechanotransduction protein PIEZOl are associated with hereditary xerocytosis. Blood 120:1908-1915.

Информация о работе

Чубинский-Надеждин, Владислав Игоревич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы