Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей столовой свеклы в трансдукции внутриклеточных сигналов при биотическом стрессе

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей столовой свеклы в трансдукции внутриклеточных сигналов при биотическом стрессе"

На правах рукописи

Рыкун

Ольга Васильевна

Участие аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей столовой свеклы в траисдукции внутриклеточных сигналов при биотическом стрессе

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г В ФЕ8 2013

Иркутск, 2013

005050198

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Романенко Анатолий Сидорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Осипова Светлана Владимировна

доктор биологических наук,

профессор Каримова Фатима Габдулладзяновна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете

Защита диссертации состоится «19» марта 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@,sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «18» февраля 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 003.047.01, кандидат биологических наук

QJ/wJju?/^

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем, как в физиологии человека и животных, так и в физиологии растений, остается устойчивость организмов к стрессу. В настоящее время лучше всего изучены процессы, происходящие на начальном и конечном этапах восприятия и ответной реакции растительного организма на стрессовое воздействие (Swindell, 2006; Akram, 2008). Однако внутриклеточные процессы, связующие эти два этапа, остаются мало исследованными. В последние годы методами биоинформатики создаются схемы организованных в сеть сигнальных путей, дешифрующих и дифференцирующих входящие сигналы для индукции экспрессии определенных генов (Klamt, Kamp, 2011; Ballerstein et al., 2012), но отсутствие биохимических данных по исследуемым системам пока не позволяет создать полноценную модель. При этом, весьма актуальным является изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих восприятие и трансдукцию внутриклеточных сигналов, в том числе при инфицировании фитопатогенами, на различных этапах покоя соответствующих органов растений.

В рамках этой проблемы возникает вопрос о возможном участии внутриклеточных структур в трансдукции сигналов. В последние годы появились данные о прямом и ретроградном сигналингах, функционирующих в несущих геном компартментах клеток растений, таких как ядра, хлоропласты и митохондрии (Юрина, Одинцова, 2007). Что касается роли других органелл во внутриклеточной трансдукции сигналов, то эта тема является совершенно не разработанной. В полной мере это относится к вакуолям растительных клеток. Традиционно считается, что одной из важных функций вакуоли является запасание каких-либо метаболитов. Однако уже есть сведения, указывающие на то, что в вакуолях функционируют компоненты аденилатциклаз-ной (Ломоватская и др., 2010), а также НАДФН-оксидазной сигнальных систем (Прадедова и др., 2011; Андреев, 2012). В связи с этим, весьма актуальным является изучение участия вакуоли растительной клетки в трансдукции внутриклеточных сигналов, поскольку она может занимать до 90% пространства клетки, контактируя при этом со всеми внутриклеточными мембранами, что позволяет ей достаточно быстро обмениваться сигнальными молекулами с другими компартментами.

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключалась в изучении влияния ионов кальция и пероксида водорода на активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей столовой свеклы при биотическом стрессе (инфицирование корнеплодов Botritis cinerea L.) на различных этапах покоя корнеплода.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику изменения концентрации цАМФ в «солевых» и «сахарных» вакуолях, изолированных из корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.), а также во вневакуолярном пространстве под воздействием био-

тического стрессора на различных стадиях покоя корнеплода: начала и глубокого покоя.

2. Исследовать влияние различных концентраций перекиси водорода и ионов кальция на динамику уровня цАМФ в «солевых» и «сахарных» вакуолях и за их пределами в норме и под воздействием биотического стрессора в те же периоды покоя.

3. Идентифицировать и изучить изменение активности связанной с то-нопластом и растворимой аденилатциклаз вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы {Beta vulgaris L.) под влиянием различных концентраций перекиси водорода и кальция при биотическом стрессе на различных стадиях покоя корнеплода.

Научная новизна. Установлено, что в вакуолях клеток паренхимы столовой свеклы присутствуют ключевые компоненты аденилатциклазной сигнальной системы: две формы аденилатциклаз - тонопластная (тАЦ), растворимая (рАЦ), а также продукт их реакции - цАМФ, выполняющий роль вторичного мессенджера. Соотношение уровней цАМФ в вакуолях двух типов -«солевых» и «сахарных» и во вневакуолярном пространстве значительно отличалось в различные периоды покоя: в начале покоя уровень этой молекулы во вневакуолярном пространстве преобладал над внутривакуолярным, тогда как в глубоком покое основной пул цАМФ был сосредоточен в вакуолях. На всех этапах покоя более высокая концентрация цАМФ, активности рАЦ и тАЦ наблюдались в «солевых» вакуолях. По сравнению с периодом начала покоя, в глубоком покое активность тАЦ обоих типов вакуолей возрастала. Ионы кальция оказывали более сильный эффект на активность обеих форм ферментов, чем пероксид водорода. Инфицирование грибом Botritis cinerea модулировало активность аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей: в начальный период покоя ингибировало тАЦ и почти не влияло на рАЦ в обоих типах вакуолей, а при глубоком покое подавляло тАЦ в «солевых» и стимулировало активность рАЦ в «сахарных» вакуолях. При инфицировании степень активации тАЦ и рАЦ экзогенными ионами кальция и пероксидом водорода существенно снижалась на обеих фазах покоя, за исключением повышения активности обоих форм АЦ в «сахарных» вакуолях при глубоком покое.

Теоретическая и практическая значимость работы: В данной работе впервые показано, что вакуоль клеток корнеплодов может выполнять сигнальные функции, индуцируя внутриклеточные сигналы с помощью компонентов аденилатциклазного сигнального пути. Активность этой сигнальной системы вакуолей тесно взаимосвязана с физиологическим состоянием корнеплода. Выявление различных эффектов от ионов кальция и пероксида водорода на активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы добавляет доказательства перекрестного влияния сигнальных путей на уровне органелл. Это вносит вклад в развитие теории внутриклеточной трансакции сигналов у растений и участии вакуолей в этом процессе.

Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций по сигна-лингу клеток растений и физиологии растений, а также использоваться в профильных научно-исследовательских институтах РАН, РАМН и РАСХН.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены в устных докладах на 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); на IV Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз России» (Воронеж, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (398 источников, из них 132 отечественных). Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 12 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Растительным материалом служили корнеплоды столовой свбклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо. В работе использовали покоящиеся корнеплоды, находящиеся в фазах начала и глубокого покоя (хранение при температуре +4°С). Биотический стресс создавали заражением здоровых корнеплодов мицелием фитопатогенного гриба Botritys cinerea, чистая культура которого была получена из НИИ СХ (г. Москва). После чего корнеплоды хранились при температуре +4°С, на протяжении 14 дней. При выделении вакуолей из инфицированных корнеплодов столовой свеклы некротизи-рованную паренхиму удаляли и использовали соседние живые ткани, не содержащие гифов гриба.

Методы. Выделение вакуолей из ткани корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.J проводили модифицированным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Саляев и др., 1981). В градиенте плотности сахарозы получали две фракции вакуолей: фракция "сахарных " вакуолей располагалась между слоями с плотностями 1.080 и 1.145 г/см3; а фракция "солевых" вакуолей - между слоями с плотностями 1.050 и 1.080 г/см3. Фракции отбирали, суспендировали в среде (6.5 мМ трис/HCl (pH 7.4), 1 М KCl, 1 мМ MgCl2) и центрифугировали 10 мин при 100g. Чистоту фракций (осадок) контролировали, используя световой микроскоп. Кроме того, о чистоте фракций вакуолей судили по отсутствию в них ДНК (Гааль и др., 1982). Все этапы выделения проходили при комнатной температуре, за исключением центрифугирования, которое осуществляли при 4°С.

Для получения фракции тонопласта 1 мл суспензии вакуолей ресуспен-дировали в 10 мл гипотонического раствора, состоящего из 1мМ Трис-НС1, pH 7.4, 1 мМ MgCl2 и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, затем суспензию несколько раз пропускали через иглу шприца, что приводило к осмотическому шоку

вакуолей и образованию везикул вакуолярных мембран, после чего центрифугировали 15 мин при 15000g. Надосадочную жидкость, содержащую везикулы тонопласта в гипотонической среде, центрифугировали 90 мин при 105000g. Супернатант использовали для определения активности растворимой аденилатциклазы (рАЦ), осадок (тонопласт) ресуспендировали в 50мМ Трис-HCI, рН 7.4 и хранили при -80°С.

Количество пероксида водорода в вакуолях корнеплода столовой свеклы определяли при помощи FOX-метода, основанного на изменении окраски ксиленолового оранжевого (Galletti, 2008). Общий кальций в пробах определяли атомно-абсорбционным анализом в в институте геохимии Сибирского отделения Российской академии наук (г. Иркутск).

Для изучения влияния ионов кальция или пероксида водорода на уровень цАМФ к суспензии вакуолей в среде ресуспендирования добавляли приготовленные на этой же среде растворы различных концентраций СаС12 или Н202 (100 нМ - 7 мкМ) с присутствием 0.1 мМ теофиллина - ингибитора фосфодиэстеразы цАМФ. Образцы инкубировали в течение 20 с и суспензию центрифугировали при 14000g 40 с. В супернатанте (среда инкубации вакуолей) в дальнейшем определяли уровень цАМФ, а осадок вакуолей промывали в среде следующего состава: 6.5 мМ трис/HCl (рН 7.4), 1 М КС1, 1 мМ MgCl2, плотностью 1.043 - 1.045 г/см3 . Затем осадок вакуолей помещали в гипотоническую среду (1мМ Трис-HCI, рН 7.4, 1 мМ MgCl2 и 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола) для высвобождения вакуолярного сока. После чего все образцы кипятили на водяной бане (3 мин) для инактивации ферментов и разрушения тонопласта и определяли в них уровень цАМФ.

Период полураспада вакуолей составлял в наших опытах около 10 час. Время проведения экспериментов не превышало 15 мин, в течение которых при обработке вакуолей любыми опытными растворами разрушения тонопласта не наблюдалось, что проверяли наблюдением в световом микроскопе, а также судили по отсутствию изменения оптической плотности р-цианинов.

Для повышения специфичности иммуноферментного анализа ГИФА) к цАМФ. растительные образцы очищали от присутствия других циклических нуклеотидов на колонке с нейтральной окисью алюминия с параллельным анализом спектра веществ с помощью хроматографического оборудования ("Uvicord", Швеция) при длине волны 276 нм. Стандартами служили адено-зин, 5'-АМФ, цАМФ, цГМФ, цТМФ и цЦМФ. Элюат концентрировали на роторном испарителе и при помощи ИФА определяли количество цАМФ (Lomovatskaya et al., 2012). Расчет количества цАМФ в пробе вели на мг белка (Lomovatskaya et al., 2012). Белок в растительном образце определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Для определения активностей растворимой и связанной с тонопластом аденилатциклаз (рАЦ и тАЦ, соответственно) фракции вакуолей гомогенизировали в растворе следующего состава: 1мМ трис-HCl, рН 7.4, 1 мМ MgCl2 и 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола и центрифугировали при 105000 g 3 ч. Получен-

ный осадок (тонопласт) использовали для определения активности тАЦ. а супернатант - для определения активности рАЦ. Реакцию начинали с внесения растительного белка (100-150) мкг в 500 мкл инкубационной среды: 50 мМ трис-HCl. pH 7.2, 0.1 мМ теофиллин. 1мМ дитиотреитол. 0.5 мМ АТФ. В качестве кофактора для тАЦ использовали MgS04 (3 мМ), а для рАЦ - МпС12 (3 мМ). Реакцию проводили при 27°С в течение 30 мин и останавливали кипячением в течение 3 мин на водяной бане. Об активности аденилатциклазы судили по возрастанию количества цАМФ в пробе, рассчитанному на мг белка в мин.

Полученные результаты обрабатывали статистически, с вычислением ошибки среднего. Значимость различий между вариантами опыта анализировали по критерию Стьюдента (Брехман, 1970; Кошникович. 2006). Каждый эксперимент проводился в трех биологических (на протяжении 3 лет) и 8 аналитических повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние Са2+, Н202 и биотического стресса на активность аденилат-циклазной сигнальной системы вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы

1. Синтез цАМФ. Показателем активности аденилатциклазной сигнальной системы (АСС) является уровень цАМФ (Николаев, 2011). В настоящей работе уровни цАМФ определяли во фракциях «сахарных» и «солевых» вакуолей (рис. 1) и в среде их инкубации на разных стадиях покоя, а также на фоне биотического стресса (инфицирование грибом Botritis cinerea).

А Б В

Рис. I. А - «сахарные» и «солевые» вакуоли в градиенте плотности сахарозы (1 - фракция «сахарных» вакуолей, 2 - фракция «солевых» вакуолей). В — те же фракции под световым микроскопом. С - поперечный срез корнеплода столовой свеклы. Кольцевая паренхима содержит «сахарные» вакуоли, межкольцевая паренхима - «солевые». Фото Прадедовой Е.В.

Из приведенных в табл. 1 данных видно, что в фазе начального покоя «солевые» и «сахарные» вакуоли, выделенные из неинфицированных тканей корнеплода, существенно отличались по содержанию цАМФ. Так, в «солевых» вакуолях уровень данного вторичного мессенджера был выше, чем в «сахарных». Однако во вневакуолярном пространстве этот показатель преобладал в «сахарных» вакуолях. Характерно, что в этой фазе покоя почти весь пул цАМФ находился не в вакуолях обоих типов, а за их пределами.

Таблица 1. Влияние Са2+ и Н202 на содержание цАМФ в вакуолях и в среде их инкубации на начальной стадии покоя (октябрь-ноябрь), а также на фоне биотического стресса.

Варианты опыта Содержание цАМФ, нмоль/мг белка

«Солевые» вакуоли «Сахарные» вакуоли

вакуоли среда инкубации среда нкуба-ци и/вакуоли вакуоли среда инкубации среда инкубации/вакуоли

Начало покоя, неинфицированные ткани

контроль I 20±1 1 120±7 | 6 | 5±0,3 | 300±17 | 60

Са/+

ЮОнМ 50±2,8* 120±7 2,4 4±0,2 330±16 67,5

500нМ 50±2,8* 228±12** 4,6 4±0,2 300±17 67,5

1мкМ 50±2,8* 228±12** 4,6 4±0,3 300±17 67,5

ЮмкМ 50±2,7* 180±9** 3,6 4±0,3 300±18 67,5

н2о2

ЮОнМ 19±1 Ю0±6* 5,3 4±0,2 210±11* 52,5

350нМ 20±1 Ю0±6* 5 4±0,2 2Ю±11* 52,5

700нМ 26±1,2* 1Ю±6* 4,3 5±0,3 200±Ю* 40

7мкМ 26±1,2* 1Ю±6* 4,3 5±0,3 200±Ю* 40

Начало покоя, инфицированные ткани

контроль | 18±0,9 | 54±3 | 3 | 16±0,8 | 100±6 | 6,3

Са2+

ЮОнМ 18±0,9 60±3 3,3 8±0,4* 80±4* 10

500нМ 18±0,9 50±2,5 2,8 9±0,4* 79±4* 9,8

1мкМ 18±0,9 50±2,5 2,8 9±0,4* 78±4* 9,7

ЮмкМ 17±0,6 50±2,6 2,9 9±0,4* 79±4* 9,8

н2о2

ЮОнМ 16±0,8 54±2,5 3,4 Р,4±0,02*' 2±0,1 * * 5

500нМ 13±0,6* 54±2,5 4,2 0,4^=0,02** 2±0,1** 5

1мкМ 13±0,6* 54±2,5 4,2 а,4±0,02** 2±0,1** 5

ЮмкМ 13±0,6* 54±2,5 4,2 0,4±0,02*1 2±0,1** 5

Приведены средние значения из 8 аналитических повторностей ± ошибка средней. *Р < 0,01, **Р < 0,001, сравнение с контролем.

Ионы кальция значительно повышали уровень цАМФ только в «солевых» вакуолях. При этом количество цАМФ в среде инкубации в сравнении с таковым внутри «солевых» вакуолей было меньше аналогичного показателя в контроле (табл. 1). У «сахарных» вакуолей различные концентрации кальция не оказывали влияния на уровни цАМФ в вакуолях и за их пределами. Пероксид водорода в пределах испытанных концентраций на количественные показатели цАМФ в обоих типах вакуолей и среде их инкубации также почти не влиял (табл. 1).

Инфицирование в различной степени сказывалось на активности адени-латциклазной сигнальной системы в обоих типах вакуолей: в «солевых» вакуолях она осталась практически на том же уровне, что и в вакуолях из не-инфицированных тканей, но более чем в 3 раза возросла в «сахарных» вакуолях (табл. 1). При этом выход цАМФ в среду инкубации значительно снизился в обоих типах органелл. Суммарный пул цАМФ (вакуолярный + в среде инкубации), по сравнению с контролем, понизился почти в два раза в обоих типах вакуолей (табл. 1). Вторичные мессенджеры других сигнальных систем также вызвали неодинаковую реакцию АСС вакуолей обоих типов. Так, в «солевых» вакуолях все концентрации кальция не влияли на содержание цАМФ, а добавление пероксида водорода привело к несущественному понижению его уровня. При этом в среде инкубации «солевых» вакуолей изменение концентрации цАМФ было незначительным и соотношение уровня цАМФ в среде инкубации к вакуолярному соку мало отличалось от такового в варианте «неинфицированные» (табл. 1). Интересно, что кальций во всех концентрациях снизил уровень цАМФ в «сахарных вакуолях» примерно на 50% относительно контроля, а пероксид водорода уменьшил его почти до фоновых значений. В среде инкубации также произошло снижение концентрации цАМФ, в наибольшей степени под воздействием пероксида водорода (табл. 1).

В фазе глубокого покоя были выявлены принципиальные отличия динамики концентраций цАМФ от аналогичных показателей, полученных в период начала покоя. Так, этот мессенджер почти весь находился в «солевых» вакуолях, тогда как в «сахарных» цАМФ присутствовал в меньших количествах, чем во вневакуолярном пространстве (табл. 2). Кроме того, на данной стадии покоя уровень цАМФ под воздействием всех испытанных концентраций кальция и пероксида водорода не изменялся в вакуолях обоих типов, но резко возрастал в среде инкубации (табл. 2).

Инфицирование не столь значительно отразилось на изменении содержания цАМФ в обоих типах вакуолей на данной фазе покоя. В «солевых вакуолях» в контроле и под воздействием различных концентраций кальция и пероксида водорода его уровни практически не изменились, также как и в «сахарных» вакуолях (табл. 2). При этом обращает на себя внимание изменение количества цАМФ в среде инкубации: у «солевых» вакуолей наблюдалось резкое его возрастание при малых концентрациях кальция и пероксида

водорода и существенное снижение уровня по мере возрастания концентраций этих агентов (табл. 2).

Таблица 2. Влияние Са2+ и Н202 на содержание цАМФ в вакуолях и в среде их инкубации на стадии глубокого покоя (февраль-март), а также на фоне биотического стресса

Варианты опыта Содержание цАМФ, нмоль/мг белка

«Солевые» вакуоли «Сахарные» вакуоли

вакуоли среда инкубации среда инкубации/ вакуоли вакуоли среда инкубации среда инкубации/ вакуоли

Начало покоя: а) неинфицированные ткани

контроль 1 250 ±13 I 3±0,14 | 0,01 | 14Ш2 | 248±П | 1,8

Са/+

ЮОнМ 253±13* 250±12*** 1,0 141±12 248±11 1,8

500нМ 251±12 225±11*** 0,9 143±12 250±12* 1,7

1мкМ 250±13 75±4*** 0,3 143±12 253±12* 1,8

ЮмкМ 248±12 75±5*** 0,3 143±12 255±13** 1,8

Н202

ЮОнМ 250±12 ■75-1-4*** 0,3 142±11 251±11* 1,8

350нМ 252±14 125±7*** 0,5 143±12 252±11* 1,8

700нМ 254±14* 250±12*** 0,9 143±12 251±11* 1,8

7мкМ 253±13* 250±12*** 0,9 143±11 250±11* 1,7

б) инфицированные ткани

контроль | 250±12 | 25±1,1 | 0,1 | 168±8 | 0,3±0,01 | 0,001

Са/+

ЮОнМ 252±13 225±12*** 0,9 167±9 03±0,01 0,002

500нМ 252±12 225±7*** 0,9 167±9 0,3±0,01 0,002

1мкМ 253±13* 75±5** 0,3 167±9 0,3±0,01 0,002

ЮмкМ 254±13* 75±5** 0,3 167±9 0,2±0,01 0,002

Н202

ЮОнМ 251±12 75±5** 0,3 167±8 0,2±0,01 0,001

500нМ 251±12 7±0,3*** 0,02 167±8 0,2±0,01 0,001

1мкМ 251±12 8±0,6*** 0,03 167±7 0,2±0,01 0,001

ЮмкМ 252±12 5±0,2*** 0,01 167±8 0,3±0,01 0,001

Приведены средние значения из 8 аналитических повторностей ± ошибка средней. * Р < 0,05; * * Р < 0,01; * * * р < 0,001, сравнение с контролем.

Напротив, в среде «сахарных» вакуолей уровень цАМФ понижался уже в контроле практически в 1000 раз относительно «неинфицированных» и вторичные мессенджеры других сигнальных систем на его содержание не влияли (табл. 1, 2). Суммарый пул цАМФ, также как и соотношение внева-куолярного цАМФ к внутривакуолярному, существенно снизился только в «сахарных» вакуолях.

Ранее работами некоторых авторов было установлено, что в различных органеллах растительных клеток функционирует аденилатциклазная сигнальная система. В частности, она была обнаружена в ядрах и хлоропластах (Ломоватская и др., 2010; Witters et al, 2004, 2005).

Показанное нами присутствие цАМФ в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы свидетельствует о том, что данные органеллы активно участвуют в трансдукции и преобразовании внутриклеточных сигналов. Об этом можно судить по динамике изменения соотношения концентраций цАМФ в вакуолях и среде инкубации в различные периоды покоя (табл. 1, 2). По-видимому, в фазе начала покоя, несмотря на замирание метаболических процессов, сохраняется определенная функциональная активность ключевых ферментов сигнальных систем, в частности, аденилатциклазной. При этом большая часть цАМФ в качестве сигнальной молекулы переносится из вакуолей обоих типов через тонопласт в цитозоль, где при отсутствии необходимости в трансдукции сигнала, может элиминироваться, например, с участием фосфодиэстеразы (ФДЭ). Напротив, в период максимального (глубокого) покоя корнеплода основной пул цАМФ сосредоточен в вакуолях (в «сахарных» вакуолях в меньшей степени, чем во вневакуолярной среде). Возможно, это связано с тем, что в конце данного периода «спящие» метаболические процессы в клетках корнеплодов начинают пробуждаться, поэтому для подготовки к запуску трансдукции сигнала требуется синтез этой сигнальной молекулы. Вероятно, в качестве переносчиков цАМФ могут выступать присутствующие на тонопласте Са2+-регулируемые АВС-транспортёры, имеющие сайт связывания с нуклеотидами (Орлов, Максимова, 1999).

Весьма интересно влияние экзогенных Са2+ и Н202 на активность АСС вакуолей. В большей степени модулирующий эффект оказывали ионы кальция, чем пероксида водорода и реакция этой системы, локализованной в «солевых» вакуолях была более интенсивной, но только в период начала покоя (табл. 1); в фазе глубокого покоя влияние кальция сводилось к увеличению пула вневакуолярного цАМФ только в «солевых» вакуолях (табл. 2).

Можно отметить еще одну тенденцию - в начале покоя, независимо от воздействия кальцием или пероксидом водорода, содержание цАМФ внутри «солевых» вакуолей было явно ниже по сравнению с таковым во вневакуо-лярном пространстве. Напротив, в «сахарных» вакуолях уровень цАМФ был предельно мал, но зато весьма высок во вневакуолярном пространстве (табл. 1). С учетом почти полного отсутствия в «сахарных» вакуолях активности рАЦ (рис. 3), вероятно, синтез цАМФ в таких органеллах мог происходить только за счет активности тАЦ (рис. 4), причем, практически весь пул этого мессенджера тут же выводился за пределы тонопласта (табл. 1).

Совершенно иначе выглядит реакция АСС вакуолей на долговременный биотический стресс (заражение фитопатогенным грибом Botritis cinerea). В этом случае, на стадии начала покоя, уровень цАМФ по сравнению с контролем (неинфицированные ткани) менялся значительно и разнонаправлено в

обоих типах вакуолей (91% «солевые», 338% - «сахарные» вакуоли), тогда как в глубоком покое в «солевых» и «сахарных» вакуолях уровень цАМФ был на уровне контроля (рис. 2).

з х

Р

"§■ х X 01 х X

г*

о

I =

II =Г о.

350 300 250 200 150 100

начало покоя

■

глубокий покой

начало покоя

■

глубокий покой

солевые вакуоли сахарные вакуоли

■ контроль

□ 100нМСа2+

□ 500нМСэ2+

□ 1мкМ Са2+

□ ЮмкМ Са2+

□ 100нМН202

□ 350нМН202

□ 700НМН202 В7мкМ Н202

Рис. 2. Изменение относительных уровней цАМФ под влиянием инфицирования, ионов кальция и пероксида водорода в вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы на различных этапах покоя.

Можно утверждать, что метаболиты грибного фитопатогена на активность аденилатциклазной сигнальной системы влияли опосредованно, поскольку в экспериментах использовали ткань корнеплода, свободную от гифов гриба.

2. Активности растворимой и тонопластной аденилатциклаз на стадии начала покоя корнеплода.

Ативность рАЦ, неинфицированные ткани. В вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы была выявлена активность двух форм аденилатцик-лазы (АЦ): локализованной в тонопласте и являющейся аналогом мембра-носвязанной формы фермента (тАЦ), и растворимой (рАЦ). Подтверждения тому, что исследуемые ферменты принадлежат к вышеназванным формам аденилатциклаз, были получены при применении специфического ингибитора и активаторов аденилатциклаз. В качестве ингибитора тАЦ использовали 10 мкМ сурамина, специфически подавляющего активности мембраносвя-занных АЦ (Ломоватская и др., 2010) за счет прерывания связи С-белков с лигандом. В нашем случае ингибирование этим агентом активности тАЦ составляло 90-93%. В качестве активаторов для тАЦ использовали ЮмМ специфически взаимодействующий с С-белком. Стимуляция тАЦ фторидом натрия составляла 50-60%. Для вакуолярной рАЦ была выявлена существенная (в 1,5 раза) активация ионами Мп+2, и незначительная (в 1,2 раза) стиму-

ляция что также характерно для растворимой формы фермента

(Катег^ку, 2006).

Прежде всего, следует отметить, что в начальный период покоя исходные (базовые) уровни активностей рАЦ в обоих типах вакуолей были небольшими, но сравнительно более высокая ее активность наблюдалась в «солевых» вакуолях (рис. 3), что согласуется с повышенным уровнем цАМФ в них (табл. 1). Однако, под влиянием даже небольшой концентрации кальция (100 нМ) активность рАЦ в «солевых» вакуолях резко возрастала - в сотни раз. Напротив, в «сахарных» вакуолях активность рАЦ почти не менялась. Пероксид водорода практически не оказывал никакого влияния на рАЦ из обоих типов вакуолей (рис. 3).

s

х в

S %

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Mit

/

/

/

1

/

/

1 ■ . . ■

- солевые вакуоли

- сахарные вакуоли

12345 6789

Рис. 3. Изменение активности рАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях, выделенных из клеток неинфицированных тканей столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода, период начала покоя (октябрь-ноябрь).

1 - Контроль; 2 - ЮОнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1мкМ Са2+; 5 - ЮмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202. Здесь и на рис. 4-10 приведены средние значения из 8 аналитических повторностей. *Р < 0,05; **Р < 0,01; ***р < 0,001 (для вариантов 2, 3, 4, 5 в солевых вакуолях), сравнение с контролем.

Активность тАЦ, неинфицированные ткани. Обращает на себя внимание то, что, во-первых, исходные активности тАЦ в обоих типах вакуолей в начальный период покоя были гораздо выше относительно таковых рАЦ (в 12 раз у «солевых» и в 188 раз у «сахарных», соответственно, рис. 3, 4) и, во-вторых, уровень активности тАЦ «солевых» вакуолей в 1,4 раза превосходил активность тАЦ «сахарных» вакуолей (рис. 4). Характер влияния различных концентраций кальция существенно отличался в двух типах вакуолей: в «солевых» вакуолях он описывался классической колоколообразной кривой, из которой следует, что максимальный активирующий эффект кальций оказывал в концентрации 100 нМ. В то же время для тАЦ из «сахарных» вакуолей

все испытанные концентрации данного катиона оказались неэффективными (рис. 4). Что касается пероксида водорода, то его концентрации в пределах 100-700 нМ на активность тАЦ из «солевых» вакуолей не влияли, а 7 мкМ ингибировали. Для тАЦ из «сахарных» вакуолей, судя по графику, активирующими должны быть концентрации пероксида водорода менее ЮОнМ. Интересно, что в этом случае даже самый высокий уровень Н202 снижал ее активность только до уровня контроля (рис. 4).

Рис. 4. Изменение активности тАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях, выделенных из клеток неинфицированных тканей корнеплода столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода, период начала покоя.

1 - Контроль; 2 - 1 ООнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1 мкМ Са2+; 5 - 1 ОмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0,05; **Р<0,01;***Р< 0,001, сравнение с контролем.

Активность рАЦ, инфицированные ткани. При длительном инфицировании корнеплода в «солевых» вакуолях исходная активность рАЦ практически не менялась по сравнению с вариантом «неинфицированные корнеплоды». Все экзогенные концентрации кальция, как и пероксида водорода в диапазоне концентраций 100-700 нМ, не оказывали на неё никакого эффекта; только 7 мкМ Н202 несколько повышал активность рАЦ (рис. 5). В «сахарных» вакуолях, напротив, весьма слабая исходная активность рАЦ возрастала в 2 раза (0,8 нМ цАМФ/мг белка в мин в контроле - см. рис. 3, и 1,5 нМ цАМФ/мг белка в мин при инфицировании). Все концентрации Са:+ и Н202 практически не оказывали воздействия на изменение ее активности (рис. 5).

♦ солевыевакуоли, рАЦ —сахарныевакуоли, рАЦ

S 16 го 14 * £ * 4 i *** ***

S 12 VO

Ü 10

е 4 ^ 2 **

ZT

12345 6789

Рис. 5. Изменение активности рАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода на фоне инфицирования корнеплода Botritis cinerea, период начала покоя.

1 - Контроль; 2 - 1 ООнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1 мкМ Са2+; 5 - 1 ОмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0,05; **Р < 0,01; ***Р < 0,001, сравнение с контролем.

Активность тАЦ, инфицированные ткани. В начальный период покоя исходные активности тАЦ как «солевых», так и «сахарных» вакуолей в условиях инфицирования были гораздо ниже относительно таковых в варианте без инфицирования (в 3 и 4,5 раз соответственно, рис. 4, 6). В «солевых» вакуолях кальций в диапазоне от 100 нМ до 1мкМ несколько повышал активность тАЦ, а пероксид водорода незначительный активирующий эффект проявлял в концентрации 700 нМ (рис. 6). В «сахарных» вакуолях оба экзогенных агента (кальций и пероксид водорода) на активность тАЦ оказывали несущественное модулирующее влияние (рис. 6).

Рис. 6. Изменение активности тАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода на фоне инфицирования корнеплода Botritis cinerea, период начала покоя.

1 - Контроль; 2 - 1 ООнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - I мкМ Са2+; 5 - 1 ОмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700пМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0,05; **Р <0,01; ***р< 0,001, сравнение с контролем.

15

3. Активности растворимой и тонопластной аденилатциклаз на стадии глубокого покоя корнеплода.

Активность рАЦ, неинфицированные ткани. В период глубокого покоя базовые активности рАЦ остались на низком уровне, и как в начальном периоде покоя, активность фермента в «солевых» вакуолях была несколько выше (рис. 7).

Рис. 7. Изменение активности рАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода, период глубокого покоя (февраль-март).

1 - Контроль; 2 - ЮОнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1мкМ Са2+; 5 - ЮмкМ Са2+; 6 - ШОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202. *Р < 0.05 (для варианта 6 в сахарных вакуолях); **р< 0.01; ***Р <0,001,сравнение с контролем.

Ионы кальция стимулировали ее активность концентрационнозависимо: судя по графику, 10 мкМ Са2+ оказывал сильный стимулирующий эффект на рАЦ в обоих типах вакуолей, хотя в «сахарных» вакуолях интенсивность этого процесса была ниже. Напротив, пероксид водорода почти не влиял на ее активность в обоих типах вакуолей (рис. 7).

Активность тАЦ, неинфицированные ткани. В фазе глубокого покоя значительно возросли исходные уровни активности тАЦ в обоих типах вакуолей относительно начальной фазы покоя, в особенности (в 157 раз) опять же в «солевых» вакуолях (рис. 8). Это согласуется с данными по уровню цАМФ в вакуолях в этот период, где он также возрастал (табл. 1, 2). В этих условиях на тАЦ из «солевых» вакуолей ионы кальция оказывали стимулирующее влияние начиная с концентрации 1 мкМ: 10 мкМ Са2+ были наиболее •эффективны (стимуляция активности в 10 раз), но судя по тренду кривой, это не предел и действие более высоких концентраций должно быть выражено еще ярче. В то же время пероксид водорода почти не оказывал влияния на активность тАЦ «солевых» вакуолей (рис. 8). Интересно, что в «сахарных» вакуолях кальций в используемых концентрациях не влиял на активность тАЦ, тогда как пероксид водорода существенно (в 8 раз) снижал ее активность (рис. 8).

Рис. 8. Изменение активности тАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода, период глубокого покоя.

1 - Контроль; 2 - 1 ООнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1 мкМ Са2+; 5 - I ОмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0.05; **Р < 0,01; ***р < 0,001, сравнение с контролем.

Активность рАЦ, инфицированные ткани. Инфицирование весьма незначительно повлияло на активность рАЦ в обоих типах вакуолей, но при этом чувствительность к кальцию этой формы фермента из «солевых» вакуолей изменилась: максимальный стимулирующий эффект на активность фермента оказывал 500 нМ Са2+ (рис. 9). В «сахарных» вакуолях активирующее влияние кальция на рАЦ было выражено заметно слабее. При этом общая картина Са2+-зависимой кинетики активности фермента почти полностью соответствовала таковой в варианте «неинфицированные корнеплоды» (рис. 7, 9). Пероксид водорода в диапазоне испытанных концентраций преимущественно угнетал активность рАЦ в обоих типах вакуолей.

Рис. 9. Изменение активности рАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода на фоне инфицирования корнеплода Botritis cinerea, период глубокого покоя.

1 - Контроль; 2 - ЮОнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1 мкМ Са2+; 5 - ЮмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0.05: **Р < 0,01; ***Р<0.001. сравнение с контролем.

17

Однако, для рАЦ из «сахарных» вакуолей проявлялся активирующий эффект Н202 при минимальной концентрации 100 нМ (стимуляция активности в 5 раз, рис. 9). Судя по тренду кинетики, концентрации пероксида водорода менее 100 нМ должны стимулировать активность рАЦ в большей степени.

Активность тАЦ, инфицированные ткани. Инфицирование корнеплода в стадии глубокого покоя существенно ингибировало активность тАЦ из вакуолей «солевого» типа (рис. 10). Кальций в различной степени, но активировал эту форму фермента в обоих типах вакуолей. Интересно, что для тАЦ «сахарных» вакуолей максимальный активирующий эффект оказала более низкая концентрация кальция, чем для «солевых», где, судя по графику, максимум активности еще не достигнут. Пероксид водорода в «солевых» вакуолях проявлял явный активирующий эффект, достигающий максимума при концентрации 700 нМ (рис. 10). В то же время в «сахарных» вакуолях, начиная с концентрации 350 нМ, Н202 наблюдалось подавляющее его действие, характеризующееся нисходящей ветвью кривой, отражающей кинетику ферментативной реакции. Это указывает на то, что концентрации пероксида водорода, необходимые для активации этой формы фермента в «сахарных» вакуолях, должны лежать в пределах, не превышающих 100 нМ (рис. 10).

Рис. 10. Изменение активности тАЦ в «солевых» и «сахарных» вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы под влиянием различных концентраций ионов кальция и пероксида водорода на фоне инфицирования корнеплода Botritis cinerea, период глубокого покоя.

1 - Контроль: 2 - ЮОнМ Са2+; 3 - 500нМ Са2+; 4 - 1мкМ Са2+; 5 - ЮмкМ Са2+; 6 - ЮОнМ Н202; 7 - 350нМ Н202; 8 - 700нМ Н202; 9 - 7мкМ Н202 . *Р < 0,01; **Р < 0.001. сравнение с контролем.

Из представленных в этом разделе результатов можно сделать следующие выводы:

1) Во всех исследуемых периодах покоя более высокая активность рАЦ и тАЦ наблюдалась в «солевых» вакуолях.

2) В начале покоя неинфицированных корнеплодов кальций в большей степени, чем пероксид водорода оказывал модулирующий (при малых кон-цен- трациях стимулирующий) эффект на эти формы фермента в «солевых» вакуолях и почти не влиял на рАЦ и тАЦ «сахарных» вакуолей.

3) Инфицирование фитопатогенным грибом Botritis cinerea в период начала покоя ингибировало активность тАЦ, но не рАЦ в обоих типах вакуолей. В «сахарных» вакуолях наблюдалась незначительная стимуляция рАЦ, обладающей весьма слабой исходной активностью. При этом на активность тАЦ кальций и пероксид водорода оказывали разнонаправленное действие, а рАЦ к этим агентам в обоих типах вакуолей была почти не чувствительной.

4) Инфицирование в период глубокого покоя заметно повышало слабую исходную активность рАЦ «сахарных» вакуолей и сильно ингибировало активность тАЦ «солевых» вакуолей. На активность рАЦ «солевых» и тАЦ «сахарных» вакуолей инфицирование никакого влияния не оказывало. В «сахарных» вакуолях наблюдалась сильная, более чем в 10 раз, активация тАЦ под воздействием ионов кальция и пероксида в отличие от варианта «неинфи-цированные ткани». На активность рАЦ в обоих типах вакуолей пероксид водорода оказывал более существенное стимулирующее влияние, чем кальций.

ОБСУЖДЕНИЕ

Для корнеплодов свеклы, как для покоящихся органов, характерны несколько стадий покоя: начала, глубокого покоя и выхода из него. Регуляция глубины состояния покоя в основном осуществляется с помощью фитогор-монов, уровень и качественный состав которых индивидуален для каждой стадии (Ладыженская, Проценко, 2002; Озолина и др., 2005). К числу агентов, способствующих выходу из покоя, относят и экзометаболиты фитопато-генных микроорганизмов, например, элиситоров грибов. Биохимические процессы, происходящие на плазмалемме при регуляции гормонами состояния покоя и действии элиситоров, имеют много общего (Ладыженская, Проценко, 2002). Наиболее ранними реакциями растительной клетки в этом случае является изменение транспорта ионов и величины трансмембранного потенциала плазмалеммы (Медведев, 2005). Благодаря этому в любом органе растения по сосудистой системе распространяется системный сигнал, представляющий собой потенциал действия (ПД), связывающий этап рецепции с эффекторным ответом растений (Arazi, 2001).

По литературным данньм, активность мембраносвязанной аденилатцик-лазы активируется как экзогенными фитогормонами, так и экзометаболитами фитопатогенов, в частности, элиситорами (Ichikawa et al., 1997; Kurosaki et al., 1997), которые могут конкурировать за сайты связывания (рецепторы) на клеточной мембране (Ладыженская Проценко, 2002). При этом, каждой фазе состояния покоя корнеплода соответствует индивидуальное соотношение фитогормонов, присутствующих в апопласте (Ладыженская, Проценко, 2002; Озолина и др., 2005). Все это вместе взятое кардинальным образом способно

преобразовывать активность ферментов, локализованных в плазмалемме, в том числе мембраносвязанной аденилатциклазы. Таким образом, в клетке, в ответ на раздражение, формируется определенный пул сигнальных молекул, в частности, цАМФ, который запускает каскад сигналов, декодирущих внешний импульс в адекватные внутриклеточные ответные реакции.

Если компоненты различных сигнальных систем, локализованные в плазмалемме, более или менее хорошо охарактеризованы (Тарчевский, 2001), то активность присутствующих во внутриклеточных компартментах сигнальных каскадов изучена явно недостаточно. Трудность в интерпретации результатов заключается еще и в том, что органеллы, кроме опосредованного влияния факторов внешней среды, испытывают и воздействие внутриклеточных компонентов, тех же фитогормонов, концентрация и состав которых также варьируют в различные периоды роста и покоя растений. Поэтому внутриклеточный сигнал является интегральным, включающим взаимодействие многих компонентов разных сигнальных систем и регуляторных факторов белковой и гормональной природы. Существенные коррективы в такую картину внутриклеточной трансдукции сигналов вносят и внешние факторы, в нашем случае, экзометаболиты грибного патогена, хотя их воздействие, как уже отмечалось, имеет опосредованный характер. Кроме того, вакуоль, занимающая в клетке до 90% ее объема, содержит компоненты про- и антиокси-дантной защиты, активируемые вторичными мессенджерами кальциевые ионные каналы, что подтверждает существенную роль этого компартменга в регуляции метаболизма клетки (Прадедова, 2009; Андреев, 2012; Рейег, 2011). Поэтому весьма важно рассмотрение механизмов модуляции активности АСС, в частности, в вакуолях и на тонопласте.

Исследования показали, что, несмотря на отличающиеся абсолютные значения концентрации цАМФ в вакуолях, можно выделить ряд общих тенденций. Так, ионы кальция в большей степени, чем пероксид водорода, влияли на активность компонентов АСС в обоих типах вакуолей, причем, было более ярко выражено в период глубокого покоя. Инфицирование грибным патогеном существенно подавляло активность АСС; в «солевых» вакуолях экзогенные кальций и пероксид водорода активировали только тАЦ, но в меньшей степени, чем это наблюдалось для этой формы АЦ из неинфициро-ванных тканей. В то же время в «сахарных» вакуолях инфицирование оказывало существенное активирующее воздействие на рАЦ и тАЦ, но только в присутствии вторичных мессенджеров, и только при глубоком покое.

Это еще раз подтверждает, что «солевые» и «сахарные» вакуоли имеют серьезные качественные отличия в структуре компонентов АСС, скорее всего связанные с функциональными задачами каждого типа этих органелл. Представляет интерес рассмотреть возможные функции цАМФ в вакуолях. Анализ литературных данных позволяет предположить, что данный вторичный мессенджер может регулировать углеводный обмен путем активации ключевых ферментов в растительных клетках (Выскребенцева, Иванов, 1982), и, в

частности в вакуолях (Озолина и др., 2005; Прадедова и др., 2009). Здесь уместно упомянуть, что и другие ферменты, встроенные в тонопласт, меняют свою активность на разных этапах онтогенеза под воздействием различных фитогормонов (Озолина и др., 1996; Прадедова и др., 1999). Есть также сведения, что модуляция активности К+каналов клеток растений осуществляется с участием цАМФ и кальция (Li et al., 1994; Kurosaki, 1997).

Можно полагать, что механизм воздействия вторичных мессенджеров (ионов кальция и пероксида водорода) на аденилатциклазы, различен. По данным, полученным для клеток животных, ионы кальция влияют на кинети-чес-кие параметры аденилатциклаз (Kamenetsky et al., 2006), модулируя степень связывания фермента с субстратом. Проведенные нами ранее исследования активности аденилатциклаз растений дают основания предполагать существование такого же механизма регуляции и у растений (Ломоватская и др., 2010).

Известно, что пероксвд водорода, являясь сигнальной молекулой (Кре-славский и др., 2012; Ткачук и др., 2012), не только сам подвергается влиянию компонентами других сигнальных систем, но также способен изменять их уровень и активность. Так, есть данные, что, с одной стороны, повышение концентрации кальция и цАМФ приводило к возрастанию в цитозоле уровня пероксида водорода (Максимов и др., 2010) а, с другой стороны, повышенная концентрация Н202 стимулировала активность кальциевых каналов (Pei et al., 2000).

Проведенные исследования позволяют заключить, что физиологическое состояние и поддержание метаболизма на необходимом уровне клеток корнеплода столовой свеклы во многом определяются активностью сигнальных систем, присутствующих в вакуолях. Это следует из анализа результатов по динамике концентраций внутри- и вневакуолярного цАМФ. Так, если в начальной фазе покоя подавляющая часть цАМФ находится за пределами вакуолей обоих типов, то в состоянии глубокого покоя уровень внутривакуо-лярного цАМФ значительно возрастает, а выход во вневакуолярное пространство сокращается до минимума, но только в вакуолях «солевого» статуса. Тем самым это может быть одной из причин предотвращения в глубоком покое: а) запуска несвоевременной активации синтетических процессов в цитоплазме клеток межпучковой паренхимы, содержащих такие вакуоли; б) опосредуемого через Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы тонопласта транспорта Сахаров из клеток с «сахарными» вакуолями, поскольку есть сведения об ингибировании этих ферментов экзогенным цАМФ (Прадедова и др., 2006). Наши и литературные данные еще раз подтверждают специфические функции каждого типа вакуолей, выполняемые в клетках, принадлежащих к различным тканям корнеплода свеклы. Частичное моделирование в наших экспериментах подготовки клеток к выходу из глубокого покоя (варьирование концентраций вторичных мессенджеров - кальция, пероксида водорода) выявило как существенные изменения в активности вакуолярных ключевых

ферментов аденилатциклазного сигналинга - рАЦ и тАЦ, так и ощутимые различия в содержании цАМФ, конечное количество которого определяется скоординированным функционирова- нием аденилатциклаз и фосфодиэсте-раз. Впрочем, присутствие последних в вакуолях растительных клеток еще предстоит доказать.

Таким образом, проведенный комплекс исследований позволяет придти к заключению, что вакуоли растительных клеток являются компартментом, содержащим компоненты сигнальных систем, в частности, аденилатциклаз-ной. Центральная вакуоль растительной клетки, депонируя активные молекулы, в том числе вторичные мессенджеры, выполняет роль модулятора внутриклеточных сигнальных каскадов растений.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в вакуолях клеток паренхимы столовой свеклы функ-

ционирует аденилатциклазная сигнальная система, поскольку в этих ор-ганеллах присутствуют ключевые компоненты этой системы: две формы аденилатциклаз - тонопластная (тАЦ), растворимая (рАЦ), а также продукт их реакции - цАМФ, выполняющий роль вторичного мессенджера.

2. Соотношение уровней цАМФ в вакуолях двух типов: «солевых» и «сахар-

ных» и во вневакуолярном пространстве значительно отличалось в различные периоды покоя: в начале покоя уровень этой молекулы во вневакуолярном пространстве преобладал над внутривакуолярным, тогда как в глубоком покое основной пул этой сигнальной молекулы был сосредоточен в вакуолях.

3. Вакуоли на всех этапах покоя отличались по уровню активности адени-

латциклазной сигнальной системы: более высокая концентрация цАМФ, активности рАЦ и тАЦ наблюдались в «солевых» вакуолях.

4. Ионы кальция в различных концентрациях оказывали более сильный эф-

фект на активность исследуемых компонентов аденилатциклазной сигнальной системы, чем пероксид водорода.

5. В период глубокого покоя активность тАЦ обоих типов вакуолей значи-

тельно возрастала (шах 300 мкмоль/мг белка в мин) по сравнению с периодом начала покоя (шах 90 нмоль/мг белка в мин).

6. Инфицирование Botritis cinerea модулировало активность АСС вакуолей: в

начальный период покоя ингибировало тАЦ и почти не влияло на рАЦ в обоих типах вакуолей. При глубоком покое инфицирование подавляло тАЦ в «солевых» и стимулировало активность рАЦ в «сахарных» вакуолях.

7. При инфицировании степень активации тАЦ и рАЦ экзогенными ионами

кальция и пероксидом водорода существенно снижалась на разных фазах покоя. Исключение составляло повышение активности обоих форм АЦ в «сахарных» вакуолях при глубоком покое.

8. Центральная вакуоль растительной клетки участвует трансдукции и пре-

образовании внутриклеточных сигналов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рыкун О.В.. Ишеева О.Д. Влияние различных концентраций кальция и перекиси водорода на содержание цАМФ во фракциях «тяжелых» и «легких» вакуолей красной столовой свеклы //14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых: Биология - наука 21 века. Сборник тезисов. -Пущино, 2010. - Т.2. - С. 333-334.

2. Рыкун О.В.. Ишеева О.Д. Активность аденилатциклазной сигнальной системы клеток корнеплодов красной столовой свеклы в стрессовых условиях // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. - Воронеж - 2011. - Т.2. - С.145-147.

3. Ломоватская JI.A., Романенко A.C., Филинова Н.В., Рыкун О.В. Аде-нилатциклазная сигнальная система растений // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия: Биология. - 2011. - Вып. 2 (23). - С. 6-25.

4. Lomovatckaya L.A., Romanenko A. S., Filinova N. V. and Rvkun O.V. A modified enzyme immunoassay method for determination of cAMP in plant cells. In: Trends in immunolabelled and related techniques. Chapter 10. - Croatia: In Tech.-2012.-P.161-169.

5. Рыкун O.B. Влияние биотического стресса, кальция и пероксида водорода на содержание цАМФ в вакуолях корнеплодов столовой свеклы в различные периоды покоя»//Вестник ИрГСХА. - 2013.-№54.-С. 20-26.

Подписано к печати 14.02.2013 г. Формат 60*84/16. Объем 1,4 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 581. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыкун, Ольга Васильевна, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

РАСТЕНИЙ

СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201356114

Рыкун Ольга Васильевна

Участие аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей столовой свеклы в трансдукции внутриклеточных сигналов при биотическом

стрессе

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Романенко Анатолий Сидорович

Иркутск-2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................9

2.1. Стадии покоя корнеплодов столовой свеклы................................9

2.2. Реакция клеток корнеплодов и клубней на инфицирование

фитопатогенными микроорганизмами..............................................12

2.2.3. Фитопатоген Botrytis cinerea - возбудитель серой гнили корнеплодов столовой свеклы......................................................14

2.3. Вакуоль столовой свеклы - полифункциональный компартмент растительной клетки.................................................................15

2.3.1. Вакуолярное содержимое растительной клетки........................16

2.3.2. Вакуолярная мембрана - тонопласт.......................................17

2.3.3. Функции центральной вакуоли.............................................19

2.4. Сигнальная сеть растений......................................................26

2.4.1. Рецепторы.......................................................................27

Рецепторы, сопряженные с G белками (GPCR).................................27

Рецепторы - ионные каналы........................................................28

Рецепторы, ассоциированные с ферментативной активностью.............29

2.4.2. G белки...........................................................................30

2.4.3. Протеинкиназы и протеинфосфатазы.....................................32

2.4.4. Факторы регуляции транскрипции.........................................33

2.4.5. Сигнальные системы растений..............................................34

МАР-киназная сигнальная система................................................34

Липоксигеназная сигнальная система.............................................35

Фосфатидатная сигнальная система.............................................35

N0- синтазная сигнальная система.............................................36

Протонная сигнальная система...................................................37

Кальциевая сигнальная система..................................................38

НАДФН - оксидазная сигнальная система.....................................40

Активные формы кислорода в растениях......................................41

Аденилатциклазная сигнальная система.......................................45

Аденилатциклазы....................................................................45

Аденилатциклазы растений........................................................46

цАМФ - вторичный мессенджер..................................................53

Фосфодиэстераза.....................................................................55

цАМФ - зависимые протеинкиназы.............................................58

цАМФ - связывающие белки......................................................59

2.4.6. Взаимодействие сигнальных систем.....................................59

2.4.7. Внутриклеточный ретроградный сигналинг у растений.............61

2.4.8. Ретроградный транспорт из вакуолярного компартмента..........63

2.5. Выводы из обзора литературы..............................................63

2.6. Постановка цели и задач исследования..................................64

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................66

3.1. Растительный материал......................................................66

3.2. Выделение вакуолей..........................................................67

3.3. Выделение тонопласта........................................................69

3.4. Проверка стабильности вакуолей под воздействием ионов кальция и пероксида водорода...................................................70

3.5. Определение Н202 в вакуолях и среде их инкубации..................70

3.6. Метод определения общего кальция.......................................71

3.7. Определение уровня цАМФ в вакуолях и среде их инкубации......71

3.7.1. Очистка образцов от примесей других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия....................72

3.7.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)......................................72

3.8. Определение активности «растворимой» и связанной

с тонопластом форм аденилатциклазы.........................................74

3.9. Статистическая обработка результатов....................................74

3.10. Используемые в работе реактивы...........................................75

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................76

4.1. Влияние ионов кальция и пероксида водорода на стабильность вакуолей.........................................................................................................76

4.2. Концентрация ионов кальция и пероксида водорода в вакуолях и среде их инкубации в различные периоды покоя под воздействием инфицирования (Botritis cinerea)..................................................77

4.3. Уровень цАМФ в вакуолях клеток столовой свеклы на стадии начала покоя корнеплодов (октябрь-ноябрь). Влияние ионов кальция и пероксида водорода на этот показатель на фоне биотического стресса {Botritis cinerea)..................................................................................81

4.4. Уровень цАМФ в вакуолях клеток столовой свеклы на стадии глубокого покоя корнеплодов (февраль-март). Влияние ионов кальция и пероксида водорода на этот показатель на фоне биотического стресса {Botritis cinerea)..................................................................................85

4.5. Динамика изменения активности рАЦ и тАЦ вакуолей клеток столовой свеклы под влиянием ионов кальция и пероксида водорода на стадии начала покоя корнеплода (октябрь-ноябрь).............................................93

4.6. Динамика изменения активности рАЦ и тАЦ вакуолей клеток столовой свеклы под влиянием ионов кальция и пероксида водорода на стадии начала покоя корнеплода (октябрь-ноябрь) на фоне инфицирования Botritis cinerea....................................................................................97

4.7. Динамика изменения активности рАЦ и тАЦ вакуолей клеток столовой свеклы под влиянием ионов кальция и пероксида водорода на стадии глубокого покоя корнеплода (февраль-март).................................99

4.8. Динамика изменения активности рАЦ и тАЦ вакуолей клеток столовой

свеклы под влиянием ионов кальция и пероксида водорода на стадии

глубокого покоя корнеплода (февраль-март) на фоне инфицирования Botritis

cinerea.................................................................................101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................111

ВЫВОДЫ..............................................................................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................120

4

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АСС - аденилатциклазная сигнальная система;

АЦ - аденилатциклаза;

ГЖА - протеинкиназа А;

рАЦ - растворимая аденилатциклаза;

тАЦ - аденилатциклаза, локализованная на тонопласте;

цАМФ - аденозин 3-5'- циклический монофосфат;

ABC - транспортер - АТФ-связывающий кассетный транспортер (от англ. ATP - binding cassette transporter); АФК - активные формы кислорода.

1. ВВЕДЕНИЕ

Одной из самых актуальных проблем, как в физиологии человека и животных, так и в физиологии растений, остается устойчивость организмов к стрессу. Известно, что феномен устойчивости реализуется на всех уровнях организации клеточного метаболизма, но лучше всего в настоящее время изучены процессы, происходящие на начальном и конечном этапах восприятия и ответной реакции растительного организма на стрессовое воздействие (Kasperska, 2004; Swindell, 2006; Akram,2008). В то же время внутриклеточные процессы, связующие эти два этапа, остаются мало исследованными и понятными. Установлено, что у растений имеются сигнальные системы, во многом аналогичные таковым животных, которые активно откликаются на воздействие любых внешних факторов (Тарчевский, 2001). Также известно, что индукция активности тех или иных генов связана со степенью активности различных интермедиатов растительной клетки (Xiong et al., 2002; Swindell, 2006). Следует отметить, что в настоящее время методами биоинформатики создаются схемы сигнальных путей, организованных в информационную сеть, дешифрующие и дифференцирующие входящие сигналы для индукции экспрессии определенных генов (Genoud et al., 2001; Klamt et al., 2003; Peleg-Grossman et al., 2007; Klamt, Kamp, 2011; Ballerstein et al., 2012), но отсутствие биохимических данных по исследуемым сигнальным системам пока не позволяет создать полноценную модель. При этом, весьма актуальным остается вопрос о молекулярных механизмах, обеспечивающих восприятие и трансдукцию внутриклеточных сигналов на различных этапах покоя соответствующих органов растений. Это связано с тем, что с углублением уровня покоя повышается степень устойчивости к фитопатогенам, а значит и происходят качественные изменения в функционировании сигнальных систем. Одной из причин этого является то, что экзометаболиты грибных патогенов способны оказывать влияние на плазмалемму растительных

клеток (Ладыженская, Проценко, 2002).

6

В рамках этой проблемы возникает вопрос о возможном участии внутриклеточных структур в трансдукции сигналов. В последние годы появились данные о прямом и ретроградном сигналингах, функционирующих в несущих геном компартментах, таких как ядра, хлоропласты и митохондрии (Юрина, Одинцова, 2007). Известно, что все сигнальные системы растений испытывают взаимовлияние (Genoud et al., 2001; Pastori, Foyer, 2002; Chinnusamy et al., 2004; Li et al., 2009) и, рассматривая активность какого-либо компонента одного из сигнальных путей, необходимо учитывать этот факт. В то же время, в литературе это явление почти не обсуждается; имеются лишь несистематизированные данные о пересечении некоторых сигнальных путей растений (Колупаев, 2007; Климов, 2008). Что касается органелл клеток растений, то эта тема является совершенно неразработанной, хотя очевидно, что «сигнальный статус» клетки складывается из работы отдельных сигнальных компартментов. Вероятно, поэтому даже при одном виде стресса активируется не один сигнальный путь, а сложная сеть передачи сигналов, что стало понятным при анализе экспрессии перекрывающихся генов (Chinusamy et al., 2004; Takahashi et al., 2004; Swindell, 2006).

В литературе пока только для клеток животных фигурирует термин

«сигнальные микродомены», подразумевающий наличие компонентов

одной или нескольких сигнальных систем в одном внутриклеточном

компартменте. Однако у растений роль органелл во внутриклеточной

трансдукции сигналов остается весьма мало изученной. В полной мере это

относится к вакуолям растительных клеток. Традиционно считается, что

одной из важных функций вакуоли является запасание каких-либо

метаболитов. Однако имеется ряд литературных данных, указывающих на

то, что в вакуолях функционируют компоненты аденилатциклазного

сигналинга (Ломоватская и др., 2010), антиоксидантной защиты, входящие

в состав нескольких сигнальных систем (Прадедова и др., 2011; Андреев,

2012). В связи с этим, весьма актуальным является изучение вакуоли

7

растительной клетки с точки зрения участия в трансдукции внутриклеточных сигналов, поскольку она может занимать до 90% пространства клетки, контактируя при этом со всеми внутриклеточными мембранами, что позволяет ей достаточно быстро обмениваться сигнальными молекулами с другими компартментами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Стадии покоя корнеплодов столовой свеклы

Для растительного организма свойственна ритмичность процессов роста и развития, когда период активного роста сменяется периодом покоя. Физиологическое состояние, во время которого у растения или отдельных его органов (почки, семена, клубни, луковицы) отсутствует видимый рост, носит название периода покоя. Данный период выработался у растений как важное приспособительное свойство к перенесению неблагоприятных для роста условий внешней среды.

Покоящиеся органы многих видов растений характеризуются вынужденным покоем, их прорастание подавляется неблагоприятными условиями среды - температурой, влажностью, освещенностью.

Индукция состояния покоя и его продолжительность у запасающих органов растений зависит от вида растений, условий формирования органов и условий хранения.

Например, онтогенез столовой свеклы можно поделить на несколько периодов:

1. Первый год вегетации связан с интенсивным ростом корнеплодов, который характеризуется высокой активностью метаболизма;

2. Период покоя (сентябрь - июнь). Этот период условно подразделяют на три фазы: фаза начала покоя (сентябрь - ноябрь), фаза глубокого покоя (январь - март) и выход из покоя (май - июнь).

3. Второй год вегетации. В этот период образуются цветоносные побеги и семена.

К числу факторов, контролирующих состояние покоя, относятся фитогормоны, регулирующие активность локализованных на плазмалемме ферментов (Кулаева, 1995; Ладыженская, Проценко, 2002; Васюкова, Озерецковская, 2007; Колупаев, Карпец, 2010; Шугаев и др., 2011).

Транспорт фитогормонов через плазмалемму зависит от

функционирования компонентов мембраны - белков-переносчиков,

9

АТРазы, ионных каналов, активность которых может изменяться при переходе от покоя к росту и под действием метаболитов гриба (Ладыженская, Проценко, 2002).

В настоящее время различают пять типов фитогормонов. Три из них - ауксины, гиббереллины и цитокинины - чаще всего действуют как стимуляторы роста. Два других - абцизовая кислота (АБК) и этилен - чаще проявляют ростингибирующее действие. Данные типы физиологически активных веществ регулируют не только ростовые и морфогенетические процессы, но и выполняют регуляторную роль в процессах покоя, созревания, старения, поглощения и транспорта веществ, устойчивости к различного рода неблагоприятным факторам (Озолина, 2005).

Так, обработка проростков кукурузы абсцизовой кислотой (АБК) приводила к существенному увеличению в листьях активности мембранной НАДФН-оксидазы, активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, аскорбатпероксидазы, глютатионредуктазы) и увеличению содержания антиоксидантных соединений (аскорбата, восстановленного глутатиона) (Jiang et al., 2005). Предполагается, что механизм влияния АБК на активность НАДФН-оксидазы связан с влиянием АБК на кальциевые каналы, что приводит к увеличению цитозольного уровня Са (Murata et al., 1997).

Из гиббереллинов самым важным фитогормоном в регуляции покоя корнеплодов и клубней растений является гибберелловая кислота (ГК). Ее количество незначительно во время глубокого покоя и возрастает при его окончании. ГК, являясь в большинстве случаев антагонистом АБК, стимулирует прерывание покоя и прорастание корнеплодов столовой свеклы.

Содержание индол ил-3-уксусной кислоты (ИУК), судя по имеющимся сведениям, не претерпевает резких изменений во время глубокого покоя, но заметно увеличивается на стадиях активного роста (Озолина, 2005).

Обнаружены в покоящихся органах растений и цитокинины. В частности, в корнеплодах столовой свеклы их активность возрастает после окончания покоя. Необходимо отметить, что в регуляции покоя клубней и корнеплодов принимают участие и негормональные регуляторы роста -фенольные соединения, в частности, кофейная и ванилиновая кислоты, скополетин. В зависимости от концентрации кофейная кислота и скополетин оказывают либо ингибирующее, либо стимулирующее действие на рост и длительность глубокого покоя клубней и корнеплодов (Ладыженская, Проценко, 2002).

Сдвиг гормонального статуса приводит к перестройке основных метаболических процессов - синтеза РНК, синтеза белка, функциональной активности мембран (Кораблева, Ладыженская, 1995).

Изучение механизмов передачи гормонального сигнала в растительную клетку привело исследователей к предположению о том, что данный процесс осуществляется путем связывания регуляторных молекул со специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране, в результате чего изменяется функциональная активность мембран и активируются те или иные пути индукции физиологического ответа (Ладыженская, 2000).

Рядом исследователей (Кораблева, Ладыженская, 1995; Ладыженская, Проценко, 2002; Ладыженская, Кораблева, 2010) доказано, что гиберелловая и абсцизовая кислоты связываются с поверхностными рецепторными белками плазмалеммы клубней картофеля. Это влияет на структуру и физико-химические свойства мембраны, что приводит к изменению активности ряда внутриклеточных процессов (Ладыженская, Кораблева, 2008).

К прорастанию покоящихся органов может также привести

заражение фитопатогенными микроорганизмами. Известно, что

устойчивость к заражению изменяется в зависимости от физиологического

состояния растения. Покоящиеся клубни и корнеплоды более устойчивы к

11

поражению фитопатогенными микроорганизмами, чем прорастающие (Кораблева, Ладыженская, 1995; Ладыженская, Проценко, 2002; Шугаев и др., 2011).

2.2. Реакция клеток корнеплодов и клубней на инфицирование фитопатогенными микроорганизмами

При паразитировании фитопатогенных грибов на растениях важнейшим процессом является поглощение питательных веществ из клетки растения-хозяина. Большая группа грибов имеет специализированные органы поглощения - гаустории, которые внедряются в клетку хозяина. При этом существенно видоизменяется функционирование растительной мембраны, окружающей гаусторий (Ладыженская, 2002; Колупаев, 2010; Ладыженская, Кораблева, 2010). На этой мембране не обнаруживается активность фермента АТРазы, обеспечивающего транспорт ионов внутрь клетки (Bach et al., 1993; Axelsen et al., 1998; Ebel, 1998).

С помощью электронно-микроскопических исследований были

выявлены