Ферменты первичной защиты от окислительного стресса у вакуолей клеток растений

Ишеева, Оксана Дамбинимаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферменты первичной защиты от окислительного стресса у вакуолей клеток растений
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ферменты первичной защиты от окислительного стресса у вакуолей клеток растений"

На правах рукописи

□□3491976

ИШЕЕВЛ Оксана Дамбинимаевна

ФЕРМЕНТЫ ПЕРВИЧНОЙ ЗАЩИТЫ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО

СТРЕССА У ВАКУОЛЕЙ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ФЕБ 2010

Иркутск - 2010

003491976

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, с.н.с. Прадедова Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Верхотуров Василий Владимирович

доктор биологических наук Ломоватская Лидия Арнольдовна

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Защита диссертации состоится "2" марта 2010 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН. Текст автореферата размещен на сайте совета: http://www.sifibr.irk.ru.

Автореферат разослан

января 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 003.047.01

кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Растительные организмы обладают высокой устойчивостью к окислительному стрессу. В их клетках осуществляется защита, по меньшей мере, на трех уровнях (антикислородном, шггирадикалыюм, антиперекисном) и это обусловлено функционированием в клеточных компартмеитах эффективной антиоксидантной системы, способной удалять, как избыточный кислород, так и его активные формы. Системы защиты от акта иных форм кислорода (АФК) таких клеточных структур, как ядра, пластиды, митохондрии, пероксисомы и клеточные стенки, в настоящее время активно исследуются (Бараненко, 2006; Полесская, 2007). Что же касается антиоксидантной системы центральной вакуоли, то ей уделяется незаслуженно мало внимания. Следует отметить, что содержимое вакуолярного сока достаточно "агрессивно" для клетки, поскольку включает литические фермешы, токсичные соединения, высокие концентрации осмотически активных веществ и т.д. Вакуолярная мембрана, отграничивает содержимое вакуолей и тем самым обеспечивает защиту клетки. Если рассмотреть структуру этой мембраны, то можно сказать, что она достаточно уязвимый барьер, особенно со стороны лшшдного состава. При окислительном стрессе тонопласт может быть хорошей "стартовой площадкой" для цепных реакций ПОЛ, поскольку па 70-80% состоит из липидов, большая часть из которых содержит остатки ненасыщенных жирных кислот (до 80%) (Макаренко и др., 2007). Тем не менее, тонопласт остается единственным и достаточно надежным барьером. Есть все основания полагать, что вакуоль, в частности ее содержимое и мембрана, обладают эффективными механизмами защиты от окислительных повреждений. Однако такие механизмы, т.е. системы участвующие в деградации АФК, в самой вакуоли не изучены. Мало сведений даже о ферментах первичной антиоксидантной системы, таких как СОД и пероксидаза, которые стоят на первых рубежах защиты от АФК. Если еще можно встретить информацию о пероксидазе (гваяколовой или фенольной) центральной вакуоли (Andrews et al., 2002; Газарян и др., 2006), то о СОД вакуолярного происхождения практически ничего не известно (Carter et al., 2004). Долгое время обсуждение локализации фермента в этом компартменте носило предположительный характер.

В последние годы СОД и пероксидаза клеток растений вызывают большой интерес и акппшо изучаются в таких клеточных структурах, как пероксисомы и клеточные стенки (Бараненко, 2006; Минибаева, 2009). Пристальное внимание эти ферменты заслужили из-за своей способности не только утилизировать АФК, но и генерировать их. Так, пероксидаза (гваяколовая) может проявлять оксидазную активность, что приводит к образованию супероксида и перекиси водорода (Минибаева, Гордон, 2003). CUjZn-СОД, наряду с супероксиддисмутазной (т.е. пероксидгснерирующей), обладает пероксидазной активностью (Liochev, Fridovich, 2004; Kim et al., 2006). В связи с этим, пероксидазу и СОД относят к редокс-фермеитами и полагают, что они могут поддерживать концентрацию АФК в клетке на физиологическом уровне (Lamb, Dixon, 1997; Bolwell et al., 1999). Указанные вопросы являются важным звеном в изучении антиоксидантных систем центральной вакуоли. Работа в направлении решения этих вопросов позволит сформировать представления о функционировании редокс-системы в вакуолях и вовлечении этой системы в поддержание внутриклеточного редокс-гомеосгаза

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в исследовании ферментативной системы шгшоксидантиой защиты у центральной вакуоли клеток растений.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) идентифицировать во фракции изолированных вакуолей корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) ферменты первичной системы защиты: СОД и пероксидазу;

2) определить изоферментный состав вакуолярной СОД и пероксидазы;

3) изучить динамику активности и изоферментный состав СОД и пероксидазы вакуолей на разных стадиях развития корнеплодов столовой свеклы;

4) изучить динамику активности и изоферментный состав СОД и пероксидазы при воздействии стрессорных факторов (обезвоживание и патогенез).

Научная новизна. В настоящей работе получены новые данные о ферментах первичной антиоксидантной системы центральной вакуоли. Было установлено, что вакуоль, как и другие клеточные структуры, содержит СОД. В ней локализована одна из молекулярных форм СОД -Си,/п-СОД, представленная тремя изоформами. Выявлено, что активность вакуолярной СОД значительно выше активности СОД ядерного, пластидного и митохондриального происхождения. Установлено, что идентифицированная в вакуолях пероксидаза имеет высокое сродство к бензидинам и оптимум активности в условиях с низкими значениями рН (рН 5.0-6.0). Впервые показано, что изоферментный состав пероксидазы вакуолей разнообразен, он представленный не только катионными, но и анионными изоформами. Установлено, что уровень активности и изоферментный состав вакуолярных СОД и пероксидазы изменяются в зависимости от стадии развития растения и при воздействии стрессорных факторов абиотической и биотической природы. Полученные данные свидетельствуют о том, что СОД и пероксидаза вакуолярной локализации, могут быть частью системы защиты растительной клетки от окислительного стресса.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят определенный вклад в понимание роли антиоксидантной системы вакуолей в защите клетки при окислительном стрессе, а также расширяют и дополняют имеющиеся знания о ферментах антиоксидантной системы клеток растений. Они дают возможность сформировать первые представления о функционировании в вакуолях редокс-системы, вовлечении ее в ответные защитные реакции и в поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза. В целом, полученный экспериментальный материал открывает перспективы для дальнейших исследований в области изучения механизмов защиты растений от окислительного стресса.

Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в учебном процессе, при чтении лекций по физиологии и биохимии растений для студентов биологических факультетов высших учебных заведений.

Апробация работы. Результаты исследования по теме диссертации были представлены на: VI съезде общества физиологов растений России "Современная физиология растений: от молекул до экосистем" (Сыктывкар, 2007); Всероссийской научной конференции "Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды" (Иркутск, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Всероссийской научпой конференции "Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды" (Иркутск, 2009); научных семинарах и отчетных научных сессиях СИФИБР СО РАН (2007-2009 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит I таблицу и 30 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиография включает 247 наименований, из них 77 на русском языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект. Объектом исследования служили корнеплоды столовой свёклы (Beta vulgaris L.) сорт Бордо. Растения выращивали на опытном участке института.

Корнеплоды отбирали на следующих фазах онтогенеза растения: 1) в первый год вегетации (август) - период интенсивного роста корнешюдов, характеризующийся высокой активностью метаболизма; 2) в период покоя (сентябрь-май) (корнеплоды хранили при температуре +4°С). Этот

период условно поделили на три фазы: фаза начало покоя (сентябрь-ноябрь), фаза глубокого покоя (январь-март) и выход из покоя (май-июнь).

В настоящей работе исследовали влияние на корнеплоды свеклы таких стрессорных факторов, как обезвоживание и воздействие патогенных микроорганизмов.

Обезвоживание тканей корнеплода происходило, если их выдерживали на открытом воздухе при комнатной температуре в течение 5 суток. При этих условиях отмечались увядание и потеря в весе до 15-17% от изначального. Повышалась осмотичность сока корнеплода: до увядания - 730750 мОсм, после - 910-930 мОсм, что могло приводить к развитию осмотического стресса

При изучении влияния патогенных микроорганизмов на ферментативную активность отбирали корнеплоды, с выраженными признаками заболеваний: ризоктониоза (возбудитель Rhizoctonia solani Kuehn (syn. Rh. aderholdii Kolosch)), серой гнили (возбудитель Botrytis cinerea Pers. ex Fr.) и фомоза (возбудитель Phoma betae Frank). Заболевания определяли по симптомам, характерным для каждого возбудителя.

Выделение вакуолей. Выделение вакуолей из ткани корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) проводили макрообъемным методом, модифицированным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Leigh, Branton, 1976; Саляев и др., 1981). Используемые растворы были следующего состава: 1) раствор для изолирования вакуолей - 50 мМ Na-K-фосфатный буфер (pH 8.0), 0.8 M KCl, 20 мМ ЭДТА; 2) раствор ресуспендирования - 6.5 мМ трис/HCl (pH 7.4), 1 M KCl, 1 мМ MgCl2. Получали фракцию вакуолей с незначительными включениями клеточных стенок, ядер и пластид, которую подвергали дополнительной очистке в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (1.050, 1.080, 1.145, 1.180 г/см3), составленном из смеси растворов 1 M KCl и 1.8 M сахарозы, содержащих 20 мМ трис-HCl (pH 7.4).

Выделение тонопласта. Фракцию изолированных вакуолей использовали для получения везикул тонопласта. Для этого вакуоли подвергали осмотическому шоку в гипотоническом растворе: 1 мМ трис/HCl (pH 7.4), 1 мМ MgCl2, 1 мМ р-меркаптоэтанол (ß-МЭ) (Саляев и др., 1981). ,

Выделение пластид. Фракцию пластид из ткани корнеплода столовой свеклы получали, используя следующие растворы: 1) для изолирования пластид - 10 мМ пирофосфат Na/HCl (pH 7.8), 330 мМ сорбит, 5 мМ MgCh, 2 мМ ЭДТА, 3 мМ цисгеин, 5 мМ ß-МЭ; 2) ресуспендирования -50 мМ HEPES/KOH (pH 7.6), 330 мМ сорбит, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мМ КН2РО4 Дополнительную очистку органелл осуществляли в ступенчатом градиенте перколла (10, 30, 40, 70 и 90%). Наиболее чистую фракцию пластид собирали на границе 30 и 40% перколла (Asada, Badger, 1984).

Выделение ядер. Для получения фракции ядер из ткани корнеплода применяли: 1) раствор для изолирования ядер - 50 мМ K-фосфатный буфер (pH 7.5), 300 мМ сахароза, 1 мМ MgCh, 0.5 мМ СаС12, 50 мМ KCl, 3 мМ ЭДТА, 0.05% цисгеин, 2 мМ ДТТ, 0.3% БСА, 0.5% поливишшшрролидон (ПВП), 12 мМ ß-МЭ; 2) среду ресуспендирования - 50 мМ трис/HCl (pH 7.2), 250 мМ сахароза, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ KCl, 0.5 мМ СаС12, 5 мМ цистеин. Очистку фракции ядер осуществляли в ступенчатом градиенте сахарозы (1.0, 1.3, 1.5 и 1.6 М), который готовился на основе раствора, содержащего 50 мМ трис/HCl (pH 7.2), 1 мМ ЭДТА, 70 мМ KCl. Ядра проходили через слой 1.6 M сахарозы и оседали (Методы изучения мембран растительных клеток, 1986).

Выделение митохондрий. Фракции митохондрий из ткани корнеплодов получали, применяя растворы: 1) для изолирования митохондрий - 90 мМ K-фосфатный буфер (pH 7.5), 0.6 M сахароза, 6 мМ ЭДТА, 0.5% ПВП, 150 мг глицина на 400 мл среды, 12 мМ ß-МЭ; 2) ресуспендирования - 10 мМ K-фосфатный буфер (pH 7.5), 0.5 M сахароза, 1 мМ ЭДТА, 0.1% БСА, 150 мг глицина на 400 мл среды. Очистку органелл проводили в ступенчатом градиенте перколла

(18, 23 и 35%). Фракцию митохондрий собирали на границе 23 и 35% перколла (Шугаев, Выскребенцева, 1982; Miszalski et al., 1998; Побежимова и др., 2004).

Оценка степени загрязнения фракций органелл. Основными загрязнителями изолированных вакуолей могли быть пластиды и ядра, маркером которых является ДНК (Гудвин, Мерсер, 1986). По присутствию ДНК в вакуолярной фракции можно судить о загрязнении ДНК-содержащими органелл ами.

Экстракцию ДНК осуществляли при помощи реагентов из набора Nucleón Extraction and Purification Kit или Nucleón Phytopure ("Ameisham Life Science", Англия) согласно приложенному протоколу. Для анализа отбирали по 0.3-0.5 мл суспензии вакуолей разной степени очистки, содержание белка в пробах составляло 0.8-0.9 мг. Количество белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Полученные после экстракции образцы исследовали на присутствие ДНК при помощи электрофореза (Гааль и др., 1982).

Чистоту фракций исследуемых органелл устанавливали по активности таких маркерных ферментов, как цитохром-с-оксидаза (КФ.1.9.3.1), НАДФ- и НАД-малатдегидрогеназы (КФ.1.1.1.37, КФ.1.1.1.40) и каталаза (КФ.1.11.1.6). Активность ферментов определяли общепринятыми методами (Левитес, 1986; Методы биохимического исследования растений, 1987; Побежимова и др., 2004).

Получение водных экстрактов из ткани корнеплода'и выделенпых органелл. Ткани корнеплода растирали в среде для экстракции в соотношении 1:2 (масса : объем), при этом использовали растворы разного состава. Если исследовали пероксидазную активность, то среда для экстракции содержала 100 мМ Na-K-фосфатный буфер (рН 7.8), 1 мМ ЭДТА и 0.1% тритон X-100 (или без него). При изучении активности СОД среда содержала 100 мМ Na-K-фосфатного буфера (рН 7.8), 2.5 мМ ДГТ, 2 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА, 1% нерастворимого ПВП (от сырой массы пробы) и 0.1% тритона Х-100 (или без него).

Выделенные органеллы (пластиды, ядра и митохондрии) разрушали в среде для экстракции (50 мМ Na-K-фосфатного буфера (рН 7.4), 2.5 мМ ДТТ) при помощи многократного замораживания-оттаивания, используя для этих целей жидкий азот. В тех случаях, когда требовалось получить белки, ассоциированные с мембраной, в среду вносили 0.1% тритон Х-100.

Вакуолярные экстракты получали в тех же условиях, за исключением замораживания-оттаивания. Вакуоли - очень "хрупкие" органеллы, поэтому легко шокируются в гипотонической среде.

Для извлечения белков из везикул тонопласта использовали 0.05%-0.1% тритон Х-100.

Определение активности исследуемых ферментов. Активность СОД определяли спектрофотометрическим способом, модифицированным Nishikimi с соавт. (1972).

Пероксидазную активность выявляли согласно общепринятой методике (Лебедева и др., 1977; Ranieri et al., 2001). Для определения сродства пероксидазы к субстрату (3.3-диаминобензидин-4-НС1 и гваяколу) исследовали активность фермента при разных концентрациях субстратов. Расчеты К„, Vm и константы скорости второго порядка производили общепринятым способом (Диксон, Уэбб, 1982). Активность ферментов выражали в мкмолях субстрата на мг белка за время инкубации. Количество белка в пробах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Электрофоретические методы определения активности ферментов. Электрофорез нашивных белков. Применяли метод электрофореза при неденатурирующих условиях (Гааль и др., 1982). Использовали 5%, 7%, 10% и градиентный (от 5 до 15%) ПААГ. Маркером перемещения белка служил КИТ для градиентного геля (Sigma).

Изоэлектрофокусирование белков. Изоферментный состав ферментов исследовали при помощи нзоэлектрического фокусирования (ИЭФ). Использовали ПААГ (Т 5%; С 3%),

содержащий 10% глицерин и 3% амфолит (рН 3.5-10.5) ("ЬКВ", Швеция). Анолит - 0.06 N Н3РО4, католит - 0.1 N ЫаОН (Ригетти, 1986).

Визуализация активности СОД. Активность СОД в ПААГ после электрофореза или ИЭФ определяли общепринятым методом (ВеаисЬатр, РпскмсЬ, 1971). Для выявления разных молекулярных форм СОД использовали ингибиторы: КСЫ (3 мМ) и Н2О2 (3 мМ).

Определение активности пероксидазы в ПААГ. Активность пероксидазы выявляли общепринятым методом (Лебедева и др., 1977; Яашеп е! а1., 2001).

Исследования проводили в 3-5 аналитических повторностях при 3-5 биологических. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение чистоты фракции вакуолей. Вакуоли клеток запасающей паренхимы корнеплодов представляют собой крупные структуры, окрашенные пигментом бетацианином, поэтому чистоту фракции изолированных органелл можно контролировать под световым микроскопом (Саляев и др., 1981; Кузеванов и др., 1985). Наряду с традиционным способом контроля, предприняли попытку оценить степень загрязнения изолированных вакуолей пластидами и ядрами по присутствию ДНК. Исследовали несколько фракций разной степени очистки: фракция 1 - изолированные вакуоли до очистки в градиенте плотности, которые как было установлено ранее, загрязнены незначительными количествами клеточных стенок, пластид и, возможно, ядер; фракция 2 - фракция из нижнего слоя градиента, загрязненная более мелкими клеточными структурами; фракция 3 - очищенные в градиенте плотности так называемые "тяжелые" вакуоли; фракция 4 - очищенные в градиенте плотности вакуоли, называемые "легкими" (рис. 1, А, Б). Ранее Кузеванов и соавт. (1985), получавшие такие же зоны "тяжелых" и "легких" вакуолей в том же градиенте плотности, исследовали их химический состав и плавучую плотность, и пришли к заключению, что, скорее всего, эти фракции образованы двумя

популяциями вакуолей. Ткань корнеплода свеклы морфологически неоднородна, имеются хорошо выраженные участки крупных и мелких клеток, соответствующие зонам межкольцевой паренхимы и паренхимы сосудисто-волокнистых пучков (кольцевой паренхимы). В столовой свекле клетки зоны межкольцевой паренхимы содержат вакуоли с меньшей плавучей плотностью (в пределах 1.0301.060 г/см3), то есть более "легкие", потому что в них больше ионов калия, натрия, органических кислот и аминокислот. А клетки зоны кольцевой паренхимы имеют вакуоли с большей плавучей плотностью (1.060-1.110 г/см, "тяжелые"), в них больше сахарозы и бетацианинов. Используя тот же градиент для очистки и фракционирования вакуолей, мы получали те же две популяции (Кузеванов и др., 1985; Катков и др., 1990).

Как показали результаты исследования во фракциях "тяжелых" и "легких" вакуолей ДНК отсутствовала (рис. 1, В). Следовательно, в них не было ДНК-содержащих структур (ядер и пластид) 7

Рисунок 1. Анализ чистоты фракций изолированных вакуолей: 1. фракция неочищенных вакуолей (помещалась на дно пробирки (А), после центрифугирования в этой зоне оставались везикулы органелл и клеточные стенки); 2. загрязненная фракция вакуолей; 3. фракция "тяжелых" вакуолей; 4. фракция "легких" вакуолей; м. маркеры Ladder 1 kb. А Разделение вакуолярной фракции в градиенте плотности. Б. Анализ чистоты фракции под световым микроскопом. В. Агарозный гель после электрофореза ДНК, выделенной из фракций вакуолей разной степени очистки.

или их количества были незначительны, особенно если учесть объем анализируемого образца. Загрязнение, по-видимому, кольцевой или фрагментами линейной ДНК, отмечены во фракции 1, т.е. в неочищенных вакуолях и во фракции 2, в которой оставалась основная масса примесных органелл. Таким образом, было установлено, что изолированные вакуоли из фракции 3 -"тяжелые" вакуоли и 4 фракции - "легкие" вакуоли были чистыми и пригодными для проведения биохимических исследований.

2. Исследование активности СОД и пероксидазы в вакуолярном компартменте. 2.1. Идентификация супероксиддисмутазы в вакуолях. Основной вклад в защиту от Ог вносит СОД, которая является одним из главных компонентов антирадикального уровня защиты. Известно, что СОД в клетках растений может быть представлена тремя молекулярными формами - Cu,Zn-, Мп- и Fe-СОД (Бараненко, 2006).

Во всех вакуолярных фракциях, за исключением фракции 2 (загрязненной),

электрофоретическим методом (10% ПААГ), исследовали активность СОД. Ее определяли и в тканевых экстрактах корнеплода без детергента и с 0.1% тритоном Х-100. Параллельно определяли активность пероксидазы, которая может замедлять накопление формазана, проявляя СОД-подобную активность (Giannopolitis, Ries, 1977). В результате в тканевых экстрактах были выявлены три изоформы СОД (рис. 2, дорожки 3 и 4). По результатам ингибиторного анализа быстро движущуюся форму СОД (Rf 0.61) можно было отнести к Си,гп-СОД, поскольку она ингибировалась KCN и Н2Ог (рис. 3, I дорожки 3, 4, 5, 6). СОД, локализованная в зоне с Rf 0.49, была Fe-СОД, так как она не проявляла активности в присутствии Н2Ог. Другая форма с Rf 0.35, идентифицирована как Mn-СОД, так как не имела чувствительности к KCN и Н2О2 (рис. 3, дорожки 4 и 6). Все обнаруженные изоформы были найдены и в "общей" (неочищенной) фракции вакуолей. Только Mn-СОД выявлялась при экстракции белка в присутствии тритона Х-100 (рис. | 2, дорожки 5 и 6). Во фракции "тяжелых" вакуолей обнаружили Mn-СОД и Cu,Zn-COfl, причем Мп-СОД также появлялась при экстракции с 0.1% тритоном Х-100 (рис. 2, дорожки 7 и 8). Во фракции "легких" вакуолей была найдена Cu,Zn-COfl, которая проявлялась, как и в других фракциях, независимо от способа экстракции (с детергентом или без него) (рис. 2, дорожки 9 и 10). Таким образом, в клетках корнеплода были выявлены три формы СОД: Mn-, Fe- и Cu,Zn-COfl. Во фракциях очищенных вакуолей, полученных без детергента, присутствовала Cu,Zn-СОД. Обращало на себя внимание значительное отличие в ширине полос СОД на электрофореграммах (рис. 2, 3) . Хорошо заметно,

и 1 23456789 10

Рисунок 2. Пероксидаза и СОД экстракта ткани, и СОД во фракциях вакуолей разной степени очистки: 1 - пероксидаза; 2 -пероксидаза с 0.1% тритоном Х-100; 3 - СОД экстракта ткани; 4 - СОД экстракта ткани с 0.1% тритоном Х-100; 5 - общая фракция вакуолей, 6 - обшая фракция вакуолей с 0.1% тритоном Х-100; 7 - фракция '^тяжелых" вакуолей; 8 - фракция "тяжелых" вакуолей с 0.1% тритоном Х-100; 9 - фракция "легких" вакуолей; 10 фракция "легких" вакуолей с 0.1% тритоном Х-100.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Звлраст'ташя'а^т ЭкстЕекгтга*

Рисунок 3. Ингибигорный анализ активности СОД в ПААГ (5-15%) после электрофореза экстрактов ткани и "тяжелых" вакуолей: 1 - без детергента; 2 - с 0.1% тритоном Х-100; 3 - без детергента и с 3 мМ КСЫ; 4 - с 0.1% тритоном и 3 мМ КСЫ; 5 - без детергента и с 3 мМ Н2Ог; 6 - с 0.1% тритоном и 3 мМ Н2Ог.

1 2 3 рНЗ

Cu.Zn-ООД

Cu.Zn-СОД

Cu.Zn-СОД _ щ i I рНЮ

Рисунок 4. Ингибигорный анализ активности СОД в ПААГ после ИЭФ: 1 - фракция "тяжелых" вакуолей; 2 - фракция "тяжелых" вакуолей с 0.1% тритоном; 3 - фракция "тяжелых" вакуолей с 0.1% тритоном и 3 мМ КС№

Rf 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

сцмед

Рисунок 5. Электрофорез СОД из фракций изолированных органелл в 10% ПААГ. 1 -фракция "тяжелых" вакуолей; 2 - фракция вакуолей с 0.1% тритоном; 3 - экстракт ткани; 4 -экстракт ткани с 0.1% тритоном; 5 — фракция митохондрий; 6 - фракция митохондрий с 0.1% тритоном; 7 - фракция пластид; 8 - фракция пласщц с 0.1% тритоном; 9 - фракция ядер; ТО - фракция ядер с 0.1 % тритоном.

что Мп- и Fe-СОД, например, в градиентном ПААГ представлены минорными тонкими полосами, a Cu,Zn-СОД - широкой полосой (рис. 3). Эффект "размытого" пятна на зимограммах зачастую создают изоформы фермента, зоны которых в геле расположены очень близко. Разделить близко расположенные зоны и определить их количество можно при помощи метода изоэлектрофокусировання белков. Методом ИЭФ исследовали экстракты "тяжелых" вакуолей, полученные в присутствии 0.1 % тритона Х-100, в которых выявлялись две формы СОД (Мп- и Cu,Zn-СОД). В результате визуализации ферментативной активности в ПААГ после ИЭФ были выявлены четыре изоформы СОД, три из которых ингибировались KCN, что позволило отнести их к Cu,Zn-COfl (рис. 4). Следует отметить, что в вакуолях обнаружили только анионные формы фермента, величины pi которых находились в пределах от 4.5 до 3. Выявляемые в других растительных объектах изоформы Cu,Zn-COfl тоже были анионными ферментами, например, у Pinus sylvestris L. идентифицированные изоформы цитозольной Cu,Zn-СОД имели низкие значения pi (4.5-4.9) (Wingsle et al., 1991). Известно, что для Cu,Zn-COfl характерна микрогетерогенность, вьивляемая при электрофорезе и ИЭФ. Например, в клетках листьев Zea mays L. обнаружены четыре Cu,Zn-COfl, в Pinus sylvetris L. -до пяти изоформ (Бараненко, 2006). Множественные формы фермента являются, по-видимому, результатом посттрансляционной окислительной модификации, не затрагивающей активный центр (Bordanovic et al., 2006).

Известно, что клеточные структуры в пределах

одной клетки различаются по составу СОД (Бараненко, 2006). Для того чтобы выявить отличия изоферментного состав СОД вакуолей, исследовали изоформы фермента таких органелл, как пластиды, ядра и митохондрии (рис. 5).

Как и следовало ожидать, согласно имеющимся на сегодня сведениям, Мп-СОД была выявлена в митохондриях, Ре-СОД - в пластидах, а Си^п-СОД - во всех исследуемых органеллах (Бараненко, 2006). При сопоставлении И! всех изоформ СОД обнаружили, что ЯГ Мп-СОД из фракции митохондрий совпадал с ЯГ фермента из тканевого экстракта и "тяжелых" вакуолей. Совпадения отмечены и для ЯГ Ре-СОД из фракции пластид и тканевого экстракта. Что касается Си,2п-СОД, установили, что фермент из вакуолей имел Rf0.61-0.72, а из исследуемых органелл -ЯГ 0.68. Полоса Си^п-СОД вакуолей была значительно шире из-за того, что она состояла из трех близко расположенных изоформ (рис. 4). Полученные таким образом факты, указывали на то, что некоторые изоформы Си,гп-СОД, по-видимому, могли быть локализованы исключительно в вакуолях.

При сравнении уровня активности СОД вакуолей и других органелл оказалось, что активность вакуолярного фермента была почти в 2 раза выше, чем митохондриального, пластидного и ядерного (рис. 6). Известно, что Си,гп-СОД обладает наибольшей активностью по сравнению с другими молекулярными формами СОД (Меньшикова, Зенков, 1993). Поэтому высокий уровень ферментативной активности в вакуолях можно было объяснить: во-первых, тем, что в них присутствовала только Си,7п-СОД, активность которой выше; во-вторых, что в них содержалось больше активного фермента, чем в других органеллах.

2.2. Идентификация во фракциях изолированных вакуолей ферментов, утилизирующих перекись водорода. Антирадикальная и антиперекисная система функционируют взаимосвязано (Колупаев, 2007). Такие формы СОД, как Ие-СОД и Си,гп-СОД, ингибируются Н2О2. Уровень пероксида снижают пероксид-утилизирующие ферменты, предупреждая, таким образом, инактивацию этих СОД. Антиперекисная защита осуществляется разнообразными ферментами, среди которых важная роль в утилизации Н2О2 отводится каталазе. Результаты нашего исследования не подтвердили присутствия катапазы в вакуолях корнеплодов свеклы (данные не приводятся). Возможно, в вакуолях клеток корнеплода главная роль в утилизации избыточной

Н2О2 отводится другому ферменту - пероксидазе.

В вакуолях корнеплода столовой свеклы была выявлена пероксидазная активность. Оптимальные условия катализа для пероксидаз различной природы и локализации не всегда одинаковы, поэтому были исследованы оптимумы рН для активности пероксидазы вакуолярных и тканевых экстрактов в присутствии двух различных субстратов (3.3-диаминобензидина (ДАБ) и гваякола (ГВ)). Максимальный уровень активности фермента вакуолей регистрировали при низких значениях рН (рис. 7, А). Наибольший уровень активности отмечался при рН 5.0, если в качестве субстрата использовали ГВ, если же субстратом служил ДАБ, то оптимальным был рН 6.0. Кинетические характеристики фермента показали, что пероксидаза вакуолей имеет большее сродство к ДАБ: для ДАБ - Ут/Кт= 0.25 мин'1, для ГВ -Уга/Кт= 0.037 мин"1. Таким образом, установили, что в вакуолях корнеплодов свеклы присутствовала пероксидаза, предпочитающая в гости при низких значениях рН. Активность пероксидазы из экстрактов ткани была в 1.5-2 раза выше активности пероксидазы вакуолей, и имела два оптимума рН, которые также зависели от природы субстрата (рис. 7, Б). Пик пероксидазной активности с ГВ приходился на рН 5.0, а с ДАБ - на рН 8.0.

вакуоги ндра ггвстщы мигохоеадрш экстракт ткани

Рисунок 6. Активность СОД во фракциях изолированных органелл.

гваякол

диамшобензвдин

рНЗ рН4 рН5 рНб рН7 рН8 рН9рН10рН11

-В- гваякол -й-диамтобеют»г

рНЗ рН4 рН5 рНб рН7 рН8 рН9 рН10рН11 Б

Рисунок 7. Динамика активности пероксидазы вакуолей (А) и экстрактов ткани (Б) в зависимости от значений рН. качестве субстрата бензидины, с оптимум актив«

Величины Vm/fCm для ГВ и ДАБ у пероксидазы экстрактов ткани были практически равными, 0.23 и 0.22 мин"1, по-видимому, пероксидаза имела высокое сродство и к бензидинам и фенолам, что позволило сделать предположение о существовании в клетках корнеплода широкого спектра изоформ пероксидазы разной природы. Действительно, в тканевых экстрактах выявляли от 15 до 23 разнообразных изоформ фермента (рис. 8). Из них от 12 до 17 - "анионных" изоформ, от 3 до 7 -"катионных". Большинство из этих изоформ были локализованы в вакуолях (в среднем 16) (рис. 8). На электрофореграммах белков из фракции "тяжелых" вакуолей проявлялось 9-10 "анионных" изоформ, а количество "анионных" изоформ из фракции "легких" вакуолей варьировало в пределах от 8 до 10. От 1 до 7 изоформ "катионных" пероксидаз обнаруживалось в обеих фракциях.

Подобные спектры изоформ были получены для тотальной пероксидазы проростков Picea omorika (Рапс.) Риг к., у которых также выявляли восемь "кислых" изоформ с р! между 3.2 и 6.5, и пять "основных" изоформ фермента с величинами pl от 7.5 до 9.1 (Prodanovic et al., 2007).

Ранее было установлено, что "катионные" пероксидазы имеют двойную локализацию - в клеточных стенках и вакуолях (Kristensen et al., 1999; Escribano et al., 2002). Поэтому, когда Escribano и соавт. (2002) в водных экстрактах корнеплодов сахарной свеклы выявили множество изоформ пероксидазы (примерно 11) "щелочной" и "кислой" природы, то высказали предположение, что "катионные" изоформы фермента, локализованы в вакуолях. Результаты нашего эксперимента продемонстрировали в вакуолях корнеплодов столовой свеклы широкий спектр пероксидаз, не только "щелочных", но и "кислых".

3. Динамика активности и изменение изоферментного состава СОД и пероксидазы в зависимости от стадии развития растения.

3.1. Активность и изоферментный состав СОД в онтогенезе растения. В цикле развития

корнеплода свеклы различают такие основные фазы, как первый год вегетации и период покоя. Рост и развитие корнеплода происходит в летний период в условиях высоких температур и влажности (первый год вегетации). В зимнее время он переживает стадию покоя, которая протекает при низких температурах и пониженной влажности, то есть корнеплод подвергается низкотемпературному стрессу и обезвоживанию. На этих фазах исследовали активность вакуолярной СОД (рис. 9) и установили, что наибольшая активность фермента была в период покоя, в первые недели II

Рисунок 8. Активность пероксидазы в ПААГ после ИЭФ: А - фракция "легких" вакуолей в начале фазы покоя; В - фракция "тяжелых" вакуолей в начале фазы покоя; С - фракция "легких" вакуолей в фазу глубокого покоя; Б - фракция "тяжелых" вакуолей в фазу глубокого покоя; Е - экстракт ткани в начале фазы покоя; К - экстракт ткани в фазу глубокого покоя; в-маркер ИЭФ. 1. Катионная пероксидаза; 2-9. Анионные пероксидазы.

ЕЭ вакуоли S экстракт ткани

первый начало год покоя вегетации

глубокий выход из покой покоя

Рисунок 9. Активность СОД в вакуолярных и тканевых экстрактах в онтогенезе растения.

покоя сразу после уборки и в течение последующего месяца хранения корнеплодов при пониженных температурах. На других стадиях покоя она несколько снижалась и становилась сопоставимой с активностью во время роста.

У СОД из тканевого экстракта была противоположная динамика активности. Высокая активность отмечалась в первый год вегетации, низкая - в период покоя. Обращало внимание, что активность СОД вакуолярных экстрактов на всем протяжении периода покоя была выше активности тотального фермента. Возможно, одной из причин высокой активности вакуолярной СОД во время хранения корнеплодов было длительное воздействие низких температур.

В зависимости от стадии развития растения наблюдались изменения и в изоферментном составе Си,2п-СОД. Так, в первый год вегетации появлялись новые дополнительные изоформы: во фракции "легких" вакуолей - одна (рис. 10, А), во фракциях "тяжелых" вакуолей и тканевом экстракте - две (рис. 10, В, С). Тогда как в период покоя в вакуолярных и тканевых экстрактах присутствовали только три изоформы Си,2п-СОД (рис. 10). Появление дополнительных изоформ Си,гп-СОД в период роста, вероятно, обусловлено участием вакуолярного фермента в интенсивных метаболических процессах, связанных с ростом и развитием корнеплода.

3.2. Активность и изоферментный состав пероксидазы в онтогенезе растения. Одновременно с активностью СОД на разных стадиях развития корнеплода в вакуолярных и тканевых экстрактах исследовали активность пероксидазы. В отличие от вакуолярной СОД, наивысшая активность пероксидазы, была выявлена во время роста корнеплода (рис. 11). Высокая активность фермента на этой стадии наблюдалась и в экстрактах ткани. В начале периода покоя уровень активности резко снижался, и в вакуолярных (более чем в 2 раза) и в тканевых экстрактах (практически в 3 раза). Независимо от субстрата активность пероксидазы вакуолей за все время покоя оставалась низкой, тогда как активность пероксидазы тканевых экстрактов повышалась на последних этапах покоя.

Период роста Период покоя

Рисунок 10. Изоформы СОД в ПААГ после ИЭФ: А - фракция "легких" вакуолей; В - фракция "тяжелых" вакуолей; С - экстракт ткани; Б -маркер ИЭФ. 1. Мп-СОД; 2. Ре-СОД; 3-7. Си^п-СОД.

А Б

Рисунок И. Динамика активности пероксидазы в онтогенезе растения: А. 3.3-диаминобензидин, Б. гваякол.

первый начало глубокий выход из год покоя покой покоя вегетации

0 вакуоли К экстракт ткани

В вакуоли Н экстракт ткани -

первый начало глубокий выход из год покоя покой покоя

вегетации

Наблюдаемые нами изменения активности пероксидазы вакуолей на разных фазах развития указывали на ее участие в метаболических процессах, поскольку самый высокий уровень активности приходился на период роста (рис. 11). Такое изменение активности фермента в зависимости от стадии роста и развития было выявлено у многих растений. Например, в листьях РЫ1а(1ерки$ согапагшх Ь. высокая активность пероксидазы отмечалась в фазе активного роста, а в фазе вторичного роста и при вызревании побегов ее активность снижалась (Долгова, 2004). Такие же изменения были отмечены в корнях четырёх-восьмидневных проростков ТгШсит аеьиит Л., у которых активность пероксидазы клеточной стенки снижалась по мере роста (Олюнина и др., 2009).

В зависимости от стадии развития корнеплода изменялась чувствительность пероксидазы к условиям среды (кислым или щелочным). В первый год вегетации наибольшая активность вакуолярной пероксидазы отмечалась при рН 5.0-7.0, как с ДАБ, так и с ГВ (рис. 12, А, Б). В период покоя оптимумы рН для пероксидазы вакуолей сдвигались в сторону низких значений. Особенно заметны эти изменения были, если субстратом служил ГВ. В период покоя высокая активность пероксидазы отмечалась при рН 4.0 и 5.0 (рис. 12, Б). При выходе из покоя оптимальным был рН 5.0-6.0.

Такие же изменения активности в зависимости от рН среды и фазы развития были отмечены и у пероксидазы тканевых экстрактов (рис. 12, В, Г). Во время роста корнеплода наивысшая активность была при значениях рН от 4 до 7 (рис. 12, В, Г). Вскоре после уборки, в первые недели хранения корнеплодов, оптимальными становились рН 6.0 и 7.0, если субстратом был ДАБ, если

-в-няатпскоя -в-гг\бокийгаюи -*-выодюпскоя -А-первьй год вегета^и

-в-даагогсхм -в-гт^бсюмгаой -*-вьеодюгаюя -А- гервьй год вегегадо

О (НЗ рН4 рН5 рН6 рН7 рН8 рН9 рНЮ рН11

О рНЗ рН4 [Н5 рН6 рН7 рН9 (НТО рН11

-В-даегогткж

-*-ВЬМЭДИ1ГШМ с,

л л

А генный пэдвегегац« ^ ^ о ш

0 рНЗ рН4 рН5 рН6 рН7 рН8 рНЭ рНТОрНН

□ юашпоим -в-пубаом покой -*-вы>рд из покоя -й- первый год вегетаци

О рНЗ рН4 рН5 рН6 рН7 рН8 рН9 рН 10 рН11

В г

Рисунок 12. Изменение оптимума рН для пероксидаз в онтогенезе растения: А. Активность пероксидазы вакуолей (ДАБ); Б. Акгавносгь пероксидазы вакуолей (ГВ); В. Активность пероксидазы экстрактов ткани (ДАБ); Г. Активность пероксидазы экстрактов ткани (ГВ).

же ГВ, то оптимальным был рН 5.0. В фазу глубокого покоя пик активности приходился на рН 6.0 с ДАБ и на рН 4.0 с ГВ, а на последнем этапе покоя (в весенне-летнее время) оптимальными были условия с высоким значением рН (рН 8.0), если субстратом служил ДАБ. Если же субстратом был ГВ, то пероксидаза имела пик активности при рН 5.0 (рис. 12, Г).

Одна из причин изменения чувствительности фермента к рН, вероятно, заключалась в изменении условий "существования". В период покоя были зафиксированы самые низкие

значения рН вакуолярного сока (рН 5.6), и именно в этот период отмечали сдвиг оптимума рН для пероксидаз к низким значениям. Другая причина изменения чувствительности к рН среды могла быть связана с изменением спектра изоформ пероксидаз, то есть с появлением или преобладанием изоформ, активность которых повышается при условиях с низкими значениями рН. Наряду с изменениями активности и ее оптимумарН на разных стадиях онтогенеза были отмечены изменения и в спектре изоформ пероксидазы. В первый год вегетации во фракциях "легких" и "тяжелых" вакуолей, и в тканевом экстракте вновь появлялись дополнительно к девяти "постоянным" (на рисунках от 1 до 9 обозначены изоформы, постоянно встречаемые как в вакуолях, так и в экстрактах ткани) катионные изоформы: три - во фракции вакуолей, и четыре - в экстракте ткани (рис. 13, А, В; рис. 14, А). Появление дополнительной анионной изоформы в фазу роста было отмечено во фракции "тяжелых" вакуолей (рис. 13, В). Как правило, все перечисленные "дополнительные" изоформы у вакуолей на начальной стадии покоя исчезали. Только у пероксидазы экстрактов ткани в этот период можно было увидеть новые изоформы в области с наименьшими значениями р1 (от 4 до 3) (рис. 14, В). В фазу глубокого покоя отмечали появление новых изоформ анионных пероксидаз в области низких значениях рН ПААГ уже в обеих фракциях вакуолей (рис. 13, Е, Р), количество анионных пероксидаз в вакуолях могло достигать 10 изоформ. Расширялся спектр анионных пероксидаз и в экстрактах ткани (рис. 14, С), вновь появлялись 6-7 дополнительных изоформ, с низкими значениями р1.

Что касается катионных изоформ, то их спектр проявлялся в полном своем разнообразии в фазу глубокого покоя. Отмечали появление до семи катионных изопероксидаз как в тканевых, так и в вакуолярных экстрактах (рис. 13, Е, Р; рис. 14, С). На этой же фазе происходил сдвиг оптимума рН для активности фермента в сторону меньших значений 14

Рисунок 13. Изоформы пероксидазы вакуолей в ПААГ после ИЭФ в онтогенезе растения: А -фракция "легких" вакуолей в период роста, В -фракция "тяжелых" вакуолей в период роста; С

- фракция "легких" вакуолей в начало покоя; И

- фракция "тяжелых" вакуолей в начало покоя; Е - фракция "легких" вакуолей в фазе глубокого покоя; Р - фракция "тяжелых" вакуолей в фазе глубокого покоя, С. маркер для ИЭФ. 1. Катионная пероксидаза; 2-9. Анионные пероксидазы.

Рисунок 14. Изоформы пероксидазы тканевого экстракта в ПААГ после ИЭФ в онтогенезе растения: А - фаза роста; В - фаза начало покоя корнеплода; С - фаза глубокого покоя; О -маркер для ИЭФ. 1. Катионная пероксидаза; 29. Анионные пероксидазы.

(рис. 12). Вероятно, изменения чувствительности пероксидазы к условиям pH были связаны с появлением большого числа дополнительных изоформ. В таком случае "щелочные" по своей природе катионные пероксидазы должны были предпочитать "кислые" условия. Действительно, установлено, что катионные пероксидазы Cynara scolymus L., Raphanus sativus L., Citrus jambhiri Lush, с высокими pi имели оптимум pH в диапазоне 4.5 и 5.0 (Lopez-Molina et al., 2003; Kim, Lee, 2005; Mohamed et al., 2008).

4. Динамика активности и изменение изоферментного состава СОД и пероксидазы при стрессовых условиях.

4.1. Активность и изоферментный состав СОД при стрессе. Самый распространенный вид абиотического стресса, которому подвержены наземные растения - водный дефицит. В настоящей работе исследовали влияние обезвоживания на активность СОД и пероксидазы вакуолей.

Эксперименты проводили на покоящихся корнеплодах, дефицит влаги в их тканях создавали

Другой вид стрессорного воздействия, исследуемый в работе, который сопровождается изменением активности антиоксидантных ферментов - патогенез.

Было установлено, что состав изоформ вакуолярной Cu,Zn-COfl в условиях дефицита влаги оставался неизменным. Увеличение числа форм фермента происходило только в экстрактах ткани - появлялась одна изоформа (рис. 15). Несмотря на постоянный изоферментный состав, уровень активности СОД изменялся. Активность вакуолярного фермента резко снижалась и становилась в 4 раза ниже, чем в контрольном варианте, и в 3 раза ниже активности фермента из тканевого экстракта (рис. 16). При этом активность СОД тканевого экстракта оставалась на уровне контрольных значений. Такой эффект наблюдали у Роа pratensis L., Ctenanthe setosa Rose. (Fu, Huang, 2001; Terzi,. Kadioglu, 2006). Хотя большинство исследователей в условиях водного дефицита, наоборот, отмечали увеличение активности СОД (Бараненко, 2006; Романова, 2008; Zhou et al., 2009). Возможно, инактивация СОД при обезвоживании вызвана повышением

осмотичности и вязкости вакуолярного сока, которое происходит при оттоке воды из вакуолей. При этом водный баланс цитозоля и других клеточных структур должен поддерживаться на физиологически оптимальном уровне. Вероятно, по этой причине и наблюдалась такая разница в уровнях активности СОД вакуолей и экстрактов ткани при увядании корнеплода (рис. 16).

При поражении корнеплода патогенами,

вышеупомянутым способом.

54 3 А

Рисунок 15. Изоформы СОД в ПААГ после ИЭФ при обезвоживании. А - фракция "легких" вакуолей; В - фракция "тяжелых" вакуолей; С -экстракт ткани, контрольный вариант; И -экстракт ткани при обезвоживании; Е - маркер перемещения (кровь человека). 1. Мп-СОД; 2. Ие-СОД; 3-6. Си,гп-СОД.

патогенами

Рисунок 16. Активность СОД в стрессовых условиях.

напротив, активность СОД вакуолей резко повышалась. Достоверных изменений в активности СОД из тканевых экстрактов не выявлено (рис. 16). Другие исследователи тоже наблюдали повышение активности СОД при инфицировании растений грибными патогенами, например, при поражении Hordeum vulgare L. мучнистой росой (Blumeria graminis f. sp. Hordel) возрастала активность апопластной СОД (Vanacker et al., 1998).

Изоферментный состав СОД (вакуолярной и тотальной) при патогенезе оставался неизменным и был таким же, как в фазу покоя (данные не приводятся). Подобные результаты были получены и для тотальной СОД семян Prunus armeniaca L. при поражении патогеном, вызывающим некротическую кольцевую пятнистость (Prunus necrotic ringspot virus) (Amaría et al., 2007).

4.2. Активность и изоферментный состав пероксидазы при стрессе. Одновременно с СОД, у корнеплодов, подвергшихся обезвоживанию, и инфицированию исследовали активность и изоферментный состав пероксидазы. Для анализа брали экстракты "тяжелых" вакуолей и тканей корнеплода. Пероксидазную активность определяли с ДАБ.

У корнеплодов, испытывающих дефицит влаги, не было выявлено каких либо выраженных изменений в уровне активности пероксидазы (рис. 17, А, Б). Во всех опытных вариантах активность пероксидазы вакуолей и экстракта ткани была одинаковой. Однако хорошо был заметен сдвиг оптимума pH к низким значениям: он перемещался с pH 6.0 на pH 5.0. Такой же эффект выявляли в клетках Роа pratensis L., однако в клетках Phaseolus vulgaris L., Otyza sativa L. и Olea europaea L. отмечали повышение активности пероксидазы при водном дефиците (Fu, Huang, 2001; Cruz de Carvalho, 2008).

У корнеплодов, пораженных патогенными микроорганизмами, активность пероксидазы вакуолей, также как активность вакуолярной СОД, возрастала (в 2 раза) (рис. 17, В). При этом не происходило выраженного сдвига оптимума рН, оптимальными оставались значения в области рН 5.0-6.0. Иная картина наблюдалась у пероксидазы из тканевых экстрактов. Активность фермента

в Г

Рисунок 17. Активность пероксидазы при стрессе: А. Активность пероксидазы вакуолей при обезвоживании; Б. Активность пероксидазы из экстрактов ткани при обезвоживании; В. Активность пероксидазы вакуолей при патогенезе; Г. Активность пероксидазы из экстрактов ткани при патогенезе.

-е-юэнтршъ -^обезвоживание

рНЗ рН4 fH5 рН6 рЦ7 рН8 (Я9 рН10 рН11

-е-контро/ъ

рНЗ f*H4 рН5 рН6 рН7 рН8 рН9 рН10 рН11

3 14

SS 12 ^ <в ovo 10 о t

Q) LÜ

ss 6

У Í

-9-контроль

рНЗ рН4 рН5 fH6 рН7 рН8 рН9 рН10рН11

рНЗ рН4 рН5 рН6 рН7 рН8 рН9 pH 1D pH 11

контроль -А-патогенез

резко снижалась (в 2 раза), но сдвига оптимума pH, как и в случае с вакуолярной пероксидазой, не происходило (рис. 17, Г).

Всплеск активности вакуолярных пероксидазы и СОД при патогенезе, дает возможность предположить, что ферменты вовлечены в защитные реакции клетки. Если судить по уровню активности, то это предположение справедливо только для ферментов вакуолярной локализации. Динамика активности ферментов из тканевых экстрактов не позволяет сделать такое заключение. Такой эффект, возможно, обусловлен тем, что корнеплоды, используемые в опытах, находились на поздних стадиях заболевания (отмечались обширные некрозы тканей), когда резерв антиоксидантной системы в других клеточных компартментах, был уже исчерпан.

Изоферментный состав пероксидазы при обезвоживании оказался таким же лабильным, как и в онтогенезе растения (рис. 1 В). Появлялись дополнительные анионные изоформы, значение pi которых было близко к нейтральному: во фракциях вакуолей - одна, в тканевом экстракте - до пяти изоформ. Появление анионных изопероксидаз при водном дефиците прежде не обнаруживали, например, в листьях Zea mays L. дополнительные анионные пероксидазы не выявлялись (Thakur et al., 1981). Кроме того, в вакуолях и тканевых экстрактах были отмечены дополнительные катионные изопероксидазы (5-6 изоформ) (рис. 18, А, С). При обезвоживании,

также как и в случае онтогенетических изменений, отмечался сдвиг оптимума pH фермента в сторону меньших значений (рис. 17). Одна из причин изменения чувствительности пероксидазы к условиям pH могла заключаться в появлении дополнительных катионных изоформ, которые активно функционируют при низких значениях pH.

Известны случаи, когда в определенные периоды развития растения и при стрессовых воздействиях появляются катионные пероксидазы, ассоциированные с мембранами, в том числе, и с тонопластом. Так, в клетках мезофилла Catharanthus roseus L., плодах Solanum lycopersicum L., апикальных меристемах Spinacia oleracea L. выявили ассоциацию пероксидазы с тонопластом (Sottomayor, Ros Barcelo, 2003; Andrews et al., 2002; Crevecoeur et al., 1997). Мы тоже обнаружили дополнительные 4 катионные и 2 анионные изоформы пероксидазы в везикулах тонопласта, выделенных из корнеплодов, испытывающих дефицит влаги (рис. 18, В). Следует заметить, что в мембранных фракциях некоторых растительных объектов обнаруживали анионные пероксидазы с низкими значениями pi (pi 4.8-4.7 или 3.6). При изучении пероксидазной активности в плодах Capsicum annum L. и Vitis vinifera L., на тонопласте и в вакуолярном соке, были обнаружены В6 и В5 изоформы фермента (Bernal et al., 1994; Lopez-Serrano et al., 1995). В нашем случае вновь появившиеся анионные изоформы, выявленные во фракции тонопласта, имели значения pi близкие к нейтральным.

У корнеплодов, пораженных патогенами, изоферментный спектр пероксидазы вакуолей был таким же, как в первую фазу периода покоя (рис. 19, 13). И на этом этапе покоя, и при патогенезе в вакуолях не выявлялись дополнительные изоформы. Дополнительные изопероксидазы появлялись в 17

Рисунок 18. Изоформы пероксидазы при обезвоживании: А - фракция "тяжелых" вакуолей; В - везикулы тонопласта; С -экстракт ткани; О - маркер ИЭФ.

_д

Я1

с 9 876 5 43 1

lAiy^^UdJ

I § ЧМШ ill

Рисунок 19. Изоформы пероксидазы при патогенезе: А -фракция "легких" вакуолей, В -фракция "тяжелых" вакуолей; С -экстракт ткани.

тканевом экстракте: две катионные с невысокой активностью; одна или две анионные изоформы, pl которых варьировал между 4-3 (рис. 19, С). Появление катионных и анионных пероксидаз у растений, пораженных патогенами, отмечали другие исследователи (Dowd, Johnson, 2005). Активацию биосинтеза анионных форм пероксидазы наблюдали, когда запускались механизмы синтеза лигнина (Хайруллин и др., 2000). В вакуолях в этой ситуации не были выявлены дополнительные изоформы пероксидазы, зато активность уже существующих изоформ значительно возрастала (рис. 17, В). Известно, что увеличение активности антиоксидантных ферментов при различных стрессовых воздействиях может происходить или за счет активации их латентных форм и (или) синтеза новых молекул фермента (Бараненко, 2006). В случае СОД и пероксидазы вакуолей мы не отмечали появления новых изоформ, однако активация уже существующих могла происходить указанными способами.

Характер изменений активности и изоферментного состава исследуемых ферментов указывал на то, что вакуолярные пероксидаза и СОД чрезвычайно "отзывчивы" к изменениям условий существования, несмотря на то, что активность ферментов изменялась разнонаправлено. Как и все гваяколовые пероксидазы, пероксидаза вакуолей корнеплодов столовой свеклы, судя по динамике ее активности и изоферментного состава, вовлечена в метаболические и защитные процессы. Можно предположить, что и СОД в вакуолях корнеплода выполняла метаболическую и защитную функции, так как количество ее изоформ увеличивалось в период интенсивных ростовых процессов, а активность изменялась в стрессовых условиях.

Защитные функции СОД обьино связывают со структурами, содержащими электрон-транспортные цепи, например, с хлоропластами и митохондриями. Однако на сегодня установлено, что СОД присутствует в клетках растений там, где происходят окислительно-восстановительные процессы, то есть практически во всех клеточных структурах. Наиболее представлена в клетках растений Cu,Zn-COfl. Этот фермент обнаружили в ядрах, пероксисомах, ЭПР, пластидах, митохондриях, а также в апопласте. Цитозольная форма Cu,Zn-COfl выявлена возле или на цитоплазматической мембране, а в хлоропластах Си^п-СОД локализована на мембранах тилакоидов (Ogawa et al., 1996; Alscher et al., 2002; Бараненко, 2006). Ранее иммуноцитохимическим методом было показано присутствие Cu.Zn-СОД на тонопласте (Ogawa et al., 1996). Авторы работы предположили, что фермент может находиться на мембране с цитоплазматической стороны. Вопреки этому мнению результаты настоящего исследования показывают другую локализацию фермента. Если Cu,Zn-COfl и присутствует в примембранном пространстве, то, скорее всего, находится не на поверхности тонопласта, а внутри вакуоли и непрочно связана с мембраной, поскольку ее активность выявлена в водных вакуолярных экстрактах в отсутствие детергента.

Относительно роли вакуолярной Cu,Zn-COfl, можно предположить, что она выполняет те же функции, что и любые другие "цитозольные" симпластные Си^п-СОД. В вакуолях, как показано нами, существуют "свои" изоформы фермента, возможно, адаптированные к "среде обитания". pH вакуолярного сока у большинства растений находится в области низких значений. В этих условиях эффективно может функционировать только Си^п-СОД, так как не зависит от pH среды в области от 5 до 9, тогда как активность Mn-, Fe-СОД снижается при значениях pH ниже нейтральных (Miszalski et al., 1998; Alscher et al., 2002).

Полученные нами факты позволяют взглянуть на центральную вакуоль с новой стороны. Поскольку, в вакуолях обнаружена Cu,Zn-COfl, которой отводится важная роль в защите клеток от окислительных повреждений во время роста и развития растений, и при действии неблагоприятных факторов, становится ясно, что центральная вакуоль способна самостоятельно защищать свои молекулярные структуры от супероксидного радикала. Однако при работе СОД

образуется пероксид водорода. Перекись водорода может генерировать и утилизировать гваяколовая пероксидаза, локализованная в вакуолях. Наличие этих ферментов в вакуолярном пространстве указывает на то, что внутри вакуоли поддерживается и регулируется "вакуолярный" редокс-гомеосгаз.

В настоящей работе отмечалось, что СОД и пероксидаза вакуолярной локализации наиболее активно реагировали на воздействие «рессорных факторов, в отличие от ферментов другой локализации. Высокая активность вакуолярных ферментов могла быть обусловлена участием центральной вакуоли в общей регуляции внутриклеточного редокс-равновесия.

Таким образом, появляются основания полагать, что вакуоль может вовлекаться в поддержание не только водного, pH-, осмотического- и ионного гомеосгаза, но и редокс-гомеостаза клетки.

ВЫВОДЫ

1. В вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы (Beta vulgaris L.) присутствует ферментативная система защиты от окислительного стресса, представленная Си,7п-СОД и пероксидазой.

2. Во фракции изолированных вакуолей выявлена Си,7п-С0Д. Фермент представлен тремя изоформами, величины pi которых находятся в пределах от 5 до 3. Изоферментный состав вакуолярной Си,7п-С0Д изменяется в зависимости от стадии развития корнеплода, но остается неизменной в стрессовых ситуациях;

3. Уровень активности СОД в вакуолях выше, чем в других органеллах клетки (ядрах, пластидах и митохондриях);

4. Динамика активности СОД зависит от стадии развития корнеплода и воздействия стрессорных факторов;

5. Пероксидаза вакуолей имеет наиболее высокое сродство к З.З'-диаминобензидину и оптимальные условия для активности при низких значениях pH (pH 5.0-6.0), а ее изоферментный состав разнообразен, и представлен широким спектром анионных и катионных изоформ;

6. В зависимости от стадии развития корнеплода и стрессовых нагрузок оптимальные значения pH для активности и изофермешяый состав пероксидаз вакуолей изменяются;

7. СОД и пероксидаза, локализованные в вакуолях, являются элементами системы защиты растительной клетки от окислительного стресса.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Прадедова, Е.В. Системы зашиты от окислительного стресса у центральной вакуоли клеток растений / Е.В. Прадедова, О.Д. Ишеева, Р.К. Саляев // Матер, докладов Междунар. конф. "Современная физиология растений: от молекул до экосистем" (18-24 июня 2007 г.). - Сыктывкар. -2007. -С.ЗЗ 1-333.

2. Прадедова, Е.В. Системы защиты от окислительного стресса у вакуоли корнеплода столовой свеклы / Е.В. Прадедова, О.Д. Ишеева, Р.К. Саляев, Д.М. Прокопьева // Матер. Всероссийской науч. конф. "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды" (16-19 сентября 2007 г.) - Иркутск. - 2007 г. -С.207-211.

3. Ишеева, О.Д. Супероксдддисмутаза и пероксидаза вакуолей клеток растений / О.Д. Ишеева, Е.В. Прадедова, Р.К. Саляев // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г.). -Новосибирск. -2008. -С. 183.

4. Ишеева, О.Д. Множественность вакуолярных изоформ пероксидаз у высших растений на примере столовой свеклы (Beta vulgaris L.) // О.Д. Ишеева, Е.В. Прадедова, Р.К. Саляев // ДАН. - 2009. - Т.424, №6. - С.824-826.

5. Прадедова, Е.В. Супероксиддисмутаза вакуолей клеток растений / Е.В. Прадедова, О.Д. Ишеева, Р.К. Саляев // Биол. мембраны. - 2009. - Т.26, №1. - С.21-30.

6. Прадедова, Е.В. Оксидоредукгазы вакуолей клеток высших растений на примере столовой свеклы (Beta vulgaris L.) / Е.В.Прадедова, О.Д. Ишеева, Р.К. Саляев // Матер. Всероссийской науч. конф. "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды" (24-28 августа 2009 г.). - Иркутск. - 2009. - С.384-388.

Подписано в печать 19.01.10. Формат 210x147 1/16. Бумага писчая белая. Печать RIZO .Усл.печ.л. 1.6. Отпечатано в типографии ИП Овсяшшков Л. А. Тираж 100 экз. Заказ № 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ишеева, Оксана Дамбинимаевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Окислительный стресс.

2.1.1. Генерация активных форм кислорода.

2.1.2. Сенсоры АФК.

2.1.3. Антиоксидантная защита.

2.1.3.1. Классификация антиоксидантной системы.

2.1.3.2. Антикислородная система защиты.

2.1.3.3. Антирадикальная система защиты.

2.1.3.4. Антиперекисная система защиты.

2.1.4. Роль пероксидазы и СОД в регуляции редокс-статуса.

2.2. Центральная вакуоль клеток растений.

2.2.1. Вакуолярное содержимое.

2.2.2. Вакуолярная мембрана - тонопласт.

2.2.3. Функции центральной вакуоли.

2.2.4. Антиоксидантная система вакуолей клеток растений.

2.3. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Растительный материал.

3.2. Выделение органелл.

3.2.1. Метод выделения вакуолей.

3.2.2. Выделение пластид.

3.2.3. Выделение ядер.

3.2.4. Выделение митохондрий.

3.3. Оценка степени загрязнения изолированных органелл.

3.3.1. Оценка степени загрязнения фракции вакуолей.

3.3.2. Оценка степени загрязнения фракций пластид и митохондрий .70 3.4. Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл.

3.5. Метод определения белка по Бредфорд.

3.6. Определение активности супероксиддисмутазы.

3.7. Определение активности пероксидазы.

3.8. Электрофоретические методы определения активности ферментов.

3.8.1. Электрофорез нативных белков.

3.8.2. Изоэлектрофокусирование белков.

3.8.3. Визуализация активности СОД в ПААГ.

3.8.4. Определение активности пероксидазы в ПААГ.

3.8.5. Определение активности каталазы в ПААГ.

3.9. Статистическая обработка данных.

3.10. Использованные реактивы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Определение чистоты фракции вакуолей.

4.2. Исследование супероксиддисмутазы во фракциях изолированных органелл.

4.2.1. Идентификация супероксиддисмутазы в вакуолях.

4.2.2. Идентификация активности супероксиддисмутазы в пластидах, ядрах и митохондриях.

4.3. Исследование во фракциях изолированных вакуолей ферментов, утилизирующих перекись водорода.

4.3.1. Идентификация каталазы в вакуолях.

4.3.2. Идентификация и исследование активности пероксидазы во фракциях изолированных вакуолей.

4.3.3. Исследование способности пероксидазы окислять бетацианины вакуолей корнеплодов свеклы.

4.4. Динамика активности и изменение изоферментного состава СОД и пероксидазы в зависимости от стадии развития растения.

4.4.1. Активность и изоферментный состав СОД в онтогенезе растения.

4.4.2. Активность и изоферментный состав пероксидазы в онтогенезе растения.

4.5. Динамика рН клеточного сока корнеплодов в онтогенезе растения

4.6. Динамика активности ферментов и изменение изоферментного состава в зависимости от стрессовых условий.

4.6.1. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при абиотическом стрессе.

4.6.2. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при биотическом стрессе.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферменты первичной защиты от окислительного стресса у вакуолей клеток растений"

Растительные организмы в силу особенностей своего существования вынуждены постоянно приспосабливаться к действию стрессорных факторов абиотического и биотического происхождения. Воздействие различных факторов зачастую интегрируется в растительной клетке в ответную реакцию сверхпродукции активных форм кислорода (АФК), приводящую к развитию окислительного стресса. Возникающие при окислительном взрыве АФК, с одной стороны вовлекаются в окислительные реакции, выполняют защитные и сигнальные функции, с другой стороны могут быть источником повреждения клеточных структур. Поэтому в клетках осуществляется защита от избыточного кислорода и его активных форм с помощью различных компонентов антиоксидантной системы.

Система детоксикации активных форм кислорода у растений представлена низко- и высокомолекулярными соединениями. Компоненты антиоксидантной системы, особенно ферменты-антиоксиданты вызывают наибольший интерес и активно изучаются. Особое внимание уделяется таким ферментам, как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза и пероксидаза, поскольку они стоят на первых рубежах защиты от АФК. Так, СОД с высокой скоростью катализирует дисмутацию супероксидрадикалов с образованием пероксида водорода (Бараненко, 2006). В свою очередь перекись водорода нейтрализуется каталазой и пероксидазами (Газарян и др., 2006). Однако каталитический цикл пероксидутилизирующих ферментов может находиться в различных редокс-состояниях. Поэтому пероксидаза, например, способна проявлять оксидазную активность, что приводит к образованию супероксида и перекиси водорода (Минибаева, Гордон, 2003). Имеются данные, что Си,2п-СОД может обладать пероксидазной активностью (Liochev, Fridovich, 2004; Kim et al., 2006). Таким образом, пероксидаза и СОД являются не только ферментами антиоксидантной системы защиты, но и редокс-ферментами. Они поддерживают концентрацию АФК в клетке на физиологически допустимом уровне, т.е. осуществляют контроль редокс-статуса клетки. Следует отметить, что в настоящее время СОД и пероксидазы активно исследуются в таких клеточных структурах, как пластиды, митохондрии, пероксисомы, клеточные стенки и т.д. (Бараненко, 2006; Газарян и др., 2006). В тоже время, обращает на себя внимание слабый интерес к этим ферментам у центральной вакуоли. О пероксидазе и СОД вакуолярной локализации мало сведений, как и об остальных ферментах антиоксидантной системы вакуолей. Если еще можно встретить информацию о пероксидазе центральной вакуоли (вакуолярного сока и тонопласта) (Газарян и др., 2006; Andrews et al., 2002), то о СОД вакуолярного происхождения практически ничего не известно (Ogawa et al., 1996; Carter et al., 2004). До сих пор обсуждение локализации этого фермента в вакуолях носит предположительный характер.

Указанные вопросы являются важным звеном в изучении антиоксидантных систем центральной вакуоли. Работа в направлении решения этих вопросов представляется интересной и необходимой, поскольку полученные результаты позволят сформировать представление о функционировании в вакуолях редокс-системы, вовлечении ее в ответные защитные реакции клетки и в поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза.

Поэтому настоящая исследовательская работа была посвящена изучению ферментативной системы антиоксидантной защиты у центральной вакуоли клеток растений. Поскольку вопрос о присутствии СОД в этом компартменте оставался открытым, основные усилия были направлены на идентификацию СОД в вакуолях, и изучение динамики ее активности и изоферментного состава. Известно, что эффективное функционирование СОД в клетках растений в значительной степени определяется функционированием пероксидутилизирующих ферментов - каталазы и пероксидазы. В связи с этим представлялось интересным и необходимым исследовать вакуолярные ферменты, способные удалять перекись водорода.

В результате были получены новые данные о ферментах антиоксидантной системы вакуолей. В частности, установлено, что центральная вакуоль, как и другие компартменты клеток растений, содержит супероксиддисмутазу. СОД вакуолярной локализации - Си^п-СОД, представленная несколькими изоформами. Из ферментов, утилизирующих перекись водорода в вакуолях на сегодня выявлена гваяколовая пероксидаза.

Идентифицированные в вакуолях корнеплодов свеклы {Beta vulgaris L.) Си^п-СОД и пероксидаза изменяли свою активность и изоферментный состав в стрессовых ситуациях, в связи с чем сделано заключение, что ферменты вакуолярной локализации могут быть частью системы антиоксидантной защиты клетки.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, кандидату биологических наук Елене Владимировне Прадедовой за постоянное внимание, всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Сердечная благодарность за помощь в работе научному руководителю лаборатории члену-корреспонденту РАН Рюрику Константиновичу Саляеву и доктору биологических наук Наталье Игоревне Рекославской. Кроме того, автор благодарит сотрудников лаборатории физиологии растительной клетки и института за обсуждение результатов, за дружеское участие и поддержку.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ишеева, Оксана Дамбинимаевна

7. ВЫВОДЫ

1. В вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы {Beta vulgaris L.) присутствует ферментативная система защиты от окислительного стресса, представленная Си,2п-СОД и пероксидазой.

2. Во фракции изолированных вакуолей выявлена Си,7п-СОД. Фермент представлен тремя изоформами, величины pi которых находятся в пределах от 5 до 3. Изоферментный состав вакуолярной Си,2п-СОД изменяется в зависимости от стадии развития корнеплода, но остается неизменным в стрессовых ситуациях;

3. Уровень активности СОД в вакуолях выше, чем в других органеллах клетки (ядрах, пластидах и митохондриях);

4. Динамика активности СОД зависит от стадии развития корнеплода и воздействия стрессорных факторов;

5. Пероксидаза вакуолей имеет наиболее высокое сродство к 3.3'-диаминобензидину и оптимальные условия для активности при низких значениях рН (рН 5.0-6.0), а ее изоферментный состав разнообразен, и представлен широким спектром анионных и катионных изоформ;

6. В зависимости от стадии развития корнеплода и стрессовых нагрузок оптимальные значения рН и изоферментный состав пероксидаз вакуолей изменяются;

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все вышеизложенное позволяет взглянуть на центральную вакуоль с новой стороны, поскольку, в вакуолях обнаружена Си,2п-СОД, которой отводится важная роль в защите клеток и тканей от окислительных повреждений в процессах роста и развития растений, а также при действии неблагоприятных факторов. Становится ясно, что центральная вакуоль способна самостоятельно защищать свои молекулярные структуры от супероксидного радикала.

Однако при работе СОД образуется пероксид водорода. Перекись водорода способна продуцировать и гваяколовая пероксидаза, локализованная в вакуолях. Наличие этих ферментов в вакуолярном пространстве указывает на то, что вакуоль в состоянии самостоятельно поддерживать и регулировать внутренний вакуолярный редокс-гомеостаз.

В настоящей работе отмечалось, что СОД и пероксидазы вакуолярной локализации наиболее активно реагировали на воздействие стрессорных факторов, в отличие от ферментов другой локализации. Высокая активность вакуолярных ферментов, возможно, обусловлена тем, что центральная вакуоль вовлечена в общую регуляцию внутриклеточного редокс-равновесия (рис. 30).

Известно, что в регуляции редокс-гомеостаза клетки главную роль играет перекись водорода, которая образуется в таких клеточных структурах, как митохондрии, пластиды, пероксисомы, клеточные стенки и др. (Октябрьский, Смирнова, 2007). Благодаря функционированию Си,2п-СОД и гваяколовой пероксидазе, Н202 должна продуцироваться и в вакуолях. Возможно, она используется для окислительных реакций и редокс-регуляции метаболических процессов в самой вакуоли, но не исключено, что участвует в поддержании тех же процессов и в цитозоле, и других компартментах клетки. Н2О2, продуцируемая вакуолью, может служить не только редокс-регулятором, но сигналом, выступая в качестве мессенджера сигнальной системы, называемой НАД(Ф)Н-оксидазной. Сигнал передачи информации с ее участием будет осуществляться в результате активации МАР-киназ (Колупаев, 2007), которые, в свою очередь, влияют на факторы транскрипции генов антиоксидантных ферментов и PR-белков (Тарчевский, 2002).

С другой стороны, образовавшийся в цитозоле при окислительном взрыве избыток перекиси водорода может транспортироваться в вакуоль, где будет происходить его нейтрализация (рис. 30).

Рисунок 30. Гипотетическая схема участия вакуоли в редокс-гомеостазе клетки: POXcat - катиониая пероксидаза; РОХап - анионная пероксидаза; NOX - НАДФ-оксидаза плазмалеммы; Cu,Zn-SOD - Си^п-СОД вакуолей и апопласта.

Таким образом, появляется основание полагать, что вакуоль можег вовлекаться в поддержание не только водного, рН-, осмотического- и ионного гомеостаза, но и редокс-гомеостаза клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ишеева, Оксана Дамбинимаевна, Иркутск

1. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. Т.З. / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. / под ред. Г.П. Георгиева, Ю.С. Ченцова. -М.: Мир, 1994.-504 с.

2. Андреев, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений / В.А. Андреев. М.: Наука, 1988. - 128 с.

3. Андреев, И.М. Функции вакуоли в клетках высших растений / И.М. Андреев // Физиол. растений. 2001,- Т.48, №5. - С.777-787.

4. Бараненко, В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений / В.В. Бараненко // Цитология. 2006. - Т.48, № 6. - С.465-474.

5. Болдырев, А.А. Окислительный стресс и мозг / А.А. Болдырев // СОЖ. 2001. - Т.7, №4. - С.21-28.

6. Быстрова, М.Ф. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации / М.Ф. Быстрова, Е.Н. Буданова // Биол. мембраны. 2007. - Т.24, №2. - С. 115-125.

7. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров // СОЖ. 2000. - Т.6, №12. - С. 13-19.

8. Воденев, В.А. Дистанционные электрические сигналы у растений / В.А. Воденеев, В.А. Опритов, С.А. Мысягин и др. Нижний Новгород, 2007. - 97 с.

9. Гааль, Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медбети, Л. Верецкеи. М.: Мир, 1982. - 448 с.

10. Газарян, И .Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / И.Г. Газарян, Д.М. Хушпульян, В.И. Тишков // Успехи биол. хим. 2006. - Т.46. - С.303-322.

11. Гудвин, Т. Введение в биохимию растений: В 2-х т. Т.1. / Т. Гудвин, Э. Мерсер / под ред. B.JI. Кретовича. — М.: Мир, 1986. 393 с.

12. Диксон, М. Ферменты: В 3-х т. Т.1. / М. Диксон, Э. Уэбб / под ред. В.К. Антонова, А.Е. Браунштейна. — М.: Мир, 1982. 392 с.

13. Долгова, Л.Г. Активность пероксидазы — показатель устойчивости растений-интродуцентов в условиях степной зоны Украины / Л.Г. Долгова // Вестник Днепропетровского национального университета. -2004. Вып. 12, №1. - С.38-41.

14. Жолкевич, В.Н. Водный обмен растений / В.Н. Жолкевич, Н.А. Гусев, А.В. Капля и др. М.: Наука, 1989. - 256 с.

15. Зубо, Я.О. Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома / Я.О. Зубо, В.В. Кузнецов // Физиол. растений. 2008. - Т.55, №1. - С. 114-122.

16. Катков, Б.Б. Сохранение нативных свойств изолированных вакуолей корнеплода красной свеклы, выделенных в растворах на основе КС1 и сорбита / Б.Б. Катков, A.M. Корзун, Р.К. Саляев // Физиол. растений. -1990. Т.37, вып.2. - С.362-370.

17. Козаренко, Т.Д. Аминокислотный состав белковых фракций вакуолярной мембраны красной столовой свеклы / Т.Д. Козаренко, Н.В. Озолина, Р.К. Саляев и др. // Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. Иркутск. - 1982. - С.32-35.

18. Колупаев, Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стессоров: образование и возможные функции / Ю.Е. Колупаев // Вестник Харьковского национального аграрного университета, Серия Биология. 2007. - Вып.З, №12. - С.6-26.

19. Колупаев, Ю.Е. Регуляция активности каталазы в колеоптилях пшеницы: возможная роль ионов Са~ и кальмодулина / Ю.Е. Колупаев, Ю.В.

20. Карпец // Вестник Харьковского национального аграрного университета, Серия Биология. 2008. - Вып.1, №13. - С. 15-21.

21. Коржов, В.И. Роль системы глутатиона в процессах детоксикации и антиоксидантной защиты / В.И. Коржов, В.Н. Жадан, М.В. Коржов // "Журн. АМН Укра'ши". 2007. - Т. 13, №1. - С.3-19.

22. Красновский, А. А. Первичные механизмы фотоактивации молекулярного кислорода. История развития и современное состояние исследований / А.А. Красновский // Биохимия. 2007. — Т.72, вып. 10. — С.1311-1331.

23. Кузеванов, В .Я. Общие принципы выделения вакуолей и вакуолярных мембран / В .Я. Кузеванов, Б.Б. Катков, Р.К. Саляев // Структура и функции биологических мембран растений / под ред. Р.К. Саляева, В.К. Войникова. Новосибирск: Наука, 1985. - С.93-107.

24. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // СОЖ. 1999. - №1. - С.2-7.

25. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

26. Лебедева, О.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена / О.В.Лебедева, Н.Н. Угарова, И.В. Березин // Биохимия. 1977. - Т.42, №8. -С.1372-1379.

27. Левитес, Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. -Новосибирск: Наука, 1986. 146 с.

28. Лущак, В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. 2001. - Т.66, вып.5. - С.592-609.

29. Лю, Б.Н. Антиоксидантная система клетки и канцерогенез / Б.Н. Лю, МЛ. Ефимов // Успехи совр. биол. 1976. - Т.82, вып.2. - № 5. - С.236-251.

30. Ляхович, В.В. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент / В.В. Ляхович, В.А, Вавилин, Н.К. Зенков и др. // Биохимия. 2006. - Т.71, вып.9. - С.1183-1197.

31. Мазо, В.К. Глутатион как компонент антиоксидантной системы желудочно-кишечного тракта / В.К. Мазо // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, калопроктологии. 1998. — №1. - С.47-53.

32. Макаренко, С.П. Химический состав и структура липидов вакуолярных мембран / С.П. Макаренко, Т.А. Коненкина, Р.К. Саляев // Биол. мембраны. 1992. - Т.9, №3. - С.290-300.

33. Макаренко, С.П. Особенности жирнокислотного состава липидов вакуолярных мембран высших растений / С.П. Макаренко, Т.А. Коненкина, Р.К. Саляев // Биол. мембраны. 1999. - Т. 16, №5. - С.556-562.

34. Макаренко, С.П. Жирнокислотный состав липидов вакуолярных мембран корнеплодов / С.П. Макаренко, Т.А. Коненкина, С.В. Хотимченко // Физиол. растений. 2007. - Т.54, №2. - С.223-228.

35. Медведев, С.С. Кальциевая сигнальная система растений / С.С. Медведев // Физиол. растений. 2005. - Т.52, №2. - С.282-305.

36. Меныцикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меныцикова, Н.К. Зенков // Успехи совр. биол. 1993. - Т.113, вып.4. - С.442-455.

37. Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки / М.Н. Мерзляк // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Серия Физиология растений. 1989. - Т.6. - С. 1-168.

38. Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений / А.Н. Мерзляк // СОЖ. 1999. - №9. - С.20-26.

39. Методы биохимического исследования растений / под ред. А.И. Ермакова. Л.: Агропромиздат, 1987. - 430 с.

40. Методы изучения мембран растительных клеток / под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова, Н.Ф. Синютиной. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1986.- 192 с.

41. Минибаева, Ф.В. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе / Ф.В. Минибаева, Л.Х. Гордон // Физиол. растений. 2003. - Т.50, №3. - С.459-464.

42. Наумов, Н.А. Болезни сельскохозяйственных растений (фитопатология) / Н.А. Наумов. — М: "Сельхозгиз", 1940. - 566 с.

43. Октябрьский, О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова//Биохимия. -2007. Т.72, вып.2. - С.158-174.

44. Пахомова, В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений / В.М. Пахомова// Цитология. 1995. - Т.37, №1-2. - С.66-91.

45. Побежимова, Т.П. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / Т.П. Побежимова, А.В. Колесниченко, О.И. Грабельных. М.: "НПК Промэкобезопасность", 2004. - 98 с.

46. Полевой, В.В. Физиология растений / В.В. Полевой. М.: Высш. шк., 1989.-464. с.

47. Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / О.Г. Полесская. М.: Книжный Дом Университет, 2007. - 140 с.

48. Пузанова, Н.А. Изучение химического состава вакуолярного сока корнеплодов красной столовой свеклы. / Н.А. Пузанова, С.В. Лобохо, Т.Д.

49. Козаренко и др. // Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. -Иркутск. 1982. - С.16-19.

50. Пузанова, Н.А. Буферная емкости вакуолярного сока корнеплодов красной столовой свеклы (Beta vulgaris L.) / Н.А. Пузанова, В.И. Пузанов, Р.К. Саляев // Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. -Иркутск. 1982. - С.25-28.

51. Радюкина, H.JI. Гомеостаз полиаминов и антиоксидантные системы корней и листьев Plantago major при солевом стрессе / H.JI. Радюкина, С. Мапелли, Ю.В. Иванов и др. // Физиол. растений. — 2009. — Т.56, №3. С.359-368.

52. Рейвн, П. Современная ботаника: В 2-х т. Т.1. / П. Рейвн, Р. Эверт, С. Айкхорн / под ред. A.JI. Тахтаджяна. М.: Мир, 1990. - 348 с .

53. Ригетти, П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение / П. Ригетти; пер. JI.A. Остермана, А.Л. Остермана. М.: Мир, 1986.-398 с.

54. Рогожин, В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин. СПб.: ГИОРД, 2004. - 240 с.

55. Романова, Е.В. Ферменты в антиокислительной системе растений: супероксидцисмутаза / Е.В. Романова // Агро XXI. 2008. - №7-9. - С.27-30.

56. Саляев, Р.К. Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений / Р.К. Саляев, В.Я. Кузеванов, В.Я. Хаптагаев и др. // Физиол. растений. 1981. - Т.28, №6. - С. 1295-1305.

57. Саляев, Р.К. Содержание липидов, белков и углеводов в мембране изолированных вакуолей красной свеклы / Р.К. Саляев, В.Я. Кузеванов, Н.В. Озолина и др. // Физиол. растений. 1982. - Т.20, вып.5. - С.933-939.

58. Саляев, Р.К. Об ультраструктуре изолированных вакуолярных мембран / Р.К. Саляев., С.Б. Хаптагаев, В.Я. Кузеванов и др. // Цитология. -1983. Т.35, №6. - С.643-648.

59. Серегин, И.В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений / И.В. Серегин // Успехи биол. хим. 2001. - Т.41. - С.283-300.

60. Скулачев, В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // СОЖ. 1996. - №3. - С.4-10.

61. Тарчевский, И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. М.: Наука, 2002. - 294 с.

62. Тиунов, JI.A. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / JI.A. Тиунов // Вестн. РАМН. 1995. - №3. - С.9-13.

63. Тихонова, JI. И. Ионные каналы вакуолярной мембраны высших растений / Л.И. Тихонова // Биол. мембраны. 1998. - Т.15, №3. - С.245-258.

64. Физиология растений / Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко / под ред. И.П. Ермакова. М.: Издательский центр "Академия", 2007. - 640 с.

65. Хавинсон, В.Х. Свободно-радикальное окисление и старение / В.Х. Хавинсон, В.А. Баринов, А.В. Арутюнян и др. СПб.: Наука, 2003. - 327 с.

66. Ху, Ю.Ф. Ферменты антиоксидантной защиты и физиологические характеристики двух сортов топинамбура при солевом стрессе / Ю.Ф. Ху, Ж.П. Лиу // Физиол. растений. 2008. - Т.55, №6. - С.863-868.

67. Чеснокова, Н.П. Общая характеристика источников образования свободных радикалов и антиоксидантных систем / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи совр. естест. 2006. - №7. - С.37-41.

68. Чупахина, Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений / Г.Н. Чупахина. — Калининград: Калинингр. ун-т, 1997. 120 с.

69. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция / Ф.М. Шакирова. М.: Гилем, 2001. — 160 с.

70. Шижнева, И.А. Аквапорины тонопласта и плазмалеммы из осевых органов семян бобов в процессе прорастания / И.А. Шижнева, Г.В. Новикова, Н.В. Обручева // Доклады АН. 2007. - Т.413, №1. - С. 116-119.

71. Шугаев, А.Г. Выделение интактных митохондрий из корнеплода сахарной свеклы / А.Г. Шугаев, Э.И. Выскребенцева // Физиол. растений. — 1982. Т.29, вып.4. - С.799-803.

72. Янковский, О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы (эволюционные, экологические и медико-биологические аспекты) / О.Ю. Янковский. СПб.: Игра, 2000. - 296 с.

73. Ahmad, P. Reactive oxygen species, antioxidants and signaling in plants / P. Ahmad, M. Sarwat, S. Sharma//J Plant Biol. 2008.-V.51,№3.-P. 167-173.

74. Alfenito, MR. Functional complementation of anthocyanin sequestration in the vacuole by widely divergent glutathione-S-transferases / MR. Alfenito, E. Souer, CD. Goodman et al. //Plant Cell. 1998. - V. 10, №7. - P. 1135-1149.

75. Almagro, L. Class III peroxidases in plant defence reactions / L. Almagro, L.V. Gomez Ros, S. Belchi-Navarro et al. // J Exp. Bot. 2009. - V.60, №2. - P.377-390.

76. Alscher, R.G. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants / R.G. Alscher, N. Erturk, L.S. Heath // J Exp. Bot. -2002. V.53, №372. -P.1331-1341.

77. Amaria, K. Oxidative stress induction by Prunus necrotic ringspot virus infection in apricot seeds // K. Amaria, P. Diaz-Vivancosb, V. Pallas et al. // Physiologia Plantarum. 2007. - V.131, №2. -P.302-310.

78. Anderson, M.D. Differential gene expression in chilling-acclimated maize seedlings and evidence for the involvement of abscisic acid in chilling tolerance / M.D. Anderson, Т.К. Prasad, B.A. Martin et al. // Plant Physiol. 1994. - V.105, №1. -P.331-339.

79. Andrews, J. Subcellular localization of peroxidase in tomato fruit skin and the possible implications for the regulation of fruit growth / J. Andrews, S.R. Adams, K.S. Burton et al. // J Exp. Bot. 2002. - V.53, №378. - P.2185-2191.

80. Apel, K. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction / K. Apel, H. Hirt // Annu Rev Plant Biol. 2004. - V.55. -P.373-399.

81. Arora, A. Oxidative stress and antioxidative system in plants / A. Arora, R.K. Sairam, G.C. Srivastava // Current science. 2002. - V.82, №10. -P.1227-1238.

82. Asada, K. Photoreduction of 1802 and H2I802 with concomitant evolution of l602 in intact Spinach chloroplasts: evidence for scavenging of hydrogen peroxide by peroxidase / K. Asada, M.R. Badger // Plant & Cell Physiol. 1984.-V.25, №7.-P.l 169-1179.

83. Asai, S. МАРК signaling regulates nitric oxide and NADPH oxidase-dependent oxidative bursts in Nicotiana benthamiana / S. Asai, K. Ohta, H. Yoshioka // Plant Cell. 2008. - V.20, №5. - P. 1390-1406.

84. Barata-Soares, A.D. Ascorbic acid biosynthesis: a precursor study on plants / A.D. Barata-Soares, ML. P.A. Gomez, C.H. de Mesquita et al. // Braz. J. Plant Physiol. 2004. - V. 16, №3. - P. 147-154.

85. Barondeau, D.P. Nickel superoxide dismutase structure and mechanism / D.P. Barondeau, C.J. Kassmann, C.K. Bruns et al. // Biochem. -2004. V.43, №25. - P.8038-8047.

86. Beauchamp, C. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels / C. Beauchamp, I. Fridovich // Anal. Biochem. -1971. V.44, №1. - P.276-287.

87. Beebo, A. Life with and without AtTIPl;l, an Arabidopsis aquaporin preferentially localized in the apposing tonoplasts of adjacent vacuoles / A. Beebo, D. Thomas, C. Der et al. // Plant Mol Biol. 2009. - V.70, №1-2. - P. 193-209.

88. Bindschedler, LV. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance / LV. Bindschedler, J. Dewdney, KA. Blee et al. // Plant J. 2006. - V.47, №6. - P.851-863.

89. Blokhina, O. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review / O. Blokhina, E. Virolainen, KV. Fagerstedt // Ann Bot (Lond). -2003. V.91, №2.-P.179-194.

90. Bolwell, GP. The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three-component system / GP. Bolwell, LV. Bindschedler, KA. Blee et al. //J Exp. Bot. 2002.-V.53, №372.-P.1367-1376.

91. Bordanovic, J. Multiple of superoxide dismutase in apoplast and whole-needle extract of Serbian spruce (Picea omorica (Panz) Purkyne) / J. Bordanovic, R. Prodanovic, N. Milosavic et al. // Arch. Biol. Sci. 2006. - V.58, №4. - P.211-214.

92. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilising the principal of protein-dye binding / M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V.72, №1-2. - P.248-254.

93. Brandes, R.P. Vascular NADPH oxidases: molecular mechanisms of activation / R.P. Brandes, J. Kreuzer // Cardiovascular Research. — 2005. V.65, №1.-P. 16-27.

94. Buettner, G.R. A new paradigm: manganese superoxide dismutase influences the production of H202 in cells and thereby their biological state / G.R. Buettner, C.F. Ng, M. Wang et al. // Free Radic Biol Med. 2006. - V.41, №8. -P.1338-1350.

95. Canovas, D. The role of thiol species in the hypertolerance of Aspergillus sp. P37 to Arsenic / D. Canovas, R. Vooijs, H. Schat et al. // J Biol. Chem. 2004. - V.279, №49. - P.51234-51240.

96. Carol, R.J. The role of reactive oxygen species in cell growth: lessons from root hairs / R.J. Carol, L. Dolan // J Exp. Bot. 2006. - V.57, №8. - P. 1829-1834.

97. Carter, С. The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins / C. Carter, S. Pan, J. Zouhar et al. // Plant cell. 2004. - V.16, №12. - P.3285-3303.

98. Chang, CC.C. Arabidopsis chloroplastic glutathione peroxidases play a role in cross talk between photooxidative stress and immune responses / CC.C. Chang, I. Slesak, L. Jorda et al. // Plant Physiol. 2009. - V. 150, №2. - P.670-683.

99. Chanson, A. Active transport of proton and calcium in higher plant cell / A. Chanson // Plant Physiol. Biochem. 1993. - V.31, №6. - P.943-955.

100. Chaumont, F. Characterization of a maize tonoplast aquaporin expressed in zones of cell division and elongation / F. Chaumont, F. Barrieu, EM. Herman et al. // Plant Physiol. 1998. - V.l 17, №4. - P.l 143-1152.

101. Chen, Z. Differential accumulation of salicylic acid and salicylic acid-sensitive catalase in different rice tissues / Z. Chen, S. Lyer, A. Caplan et al. // Plant Physiol. 1997. - V. 114, №1. - P. 193-201.

102. Costa, MMR. Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus / MMR. Costa, F. Hilliou, P. Duarte et al. // Plant Physiol. -2008. V.146, №2. - P.403-417.

103. Couee, I. Involvement of soluble sugars in reactive oxygen species balance and responses to oxidative stress in plants / I. Соиёе, С. Sulmon, G. Gouesbet, A. El Amrani // J Exp. Bot. 2006. - V.57, №3. - P.449-459.

104. Crevecoeur, M. Peroxidase activity in shoot apical meristem from Spinacia / M. Crevecoeur, M. Pinedo, H. Greppin et al. // Acta Histochem. 1997. - V.99, №2. - P.177-186.

105. Cruz de Carvalho, M. Drought stress and reactive oxygen species / M. Cruz de Carvalho // Plant Signal Behav. 2008. - V.3, №3. - P.l56-165.

106. Culotta, V.C. Activation of superoxide dismutases: putting the metal to the pedal / V.C. Culotta, M. Yang, T.V. O' Halloran // Biochim Biophys Acta. -2006. V.1763, №7. - P.747-758.

107. Dat, J. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses / J. Dat, S. Vandenabeele, E. Vranova et al. // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2000. - V.57, №5. - P.779-795.

108. Davey, M.W. Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing / M.W. Davey, M.V. Montagu, D. Inze et al. // J Sci. Food & Agriculture. 2000. - V.80, №7. - P.825-860.

109. Davies, K.J.A. Intracellular proteolytic systems may function as a secondary antioxidant defences: an hypothesis / K.J.A. Davies // J Free Rad. Biol. Med. 1986,- V.2.-P.155-173.

110. Del Rio, L.A. The activated oxygen role of peroxisomes in senescence / L.A. Del Rio, G.M. Pastori, J.M. Palma et al. // Plant Physiol. 1998. - V.116, №4.-P. 1195-1200.

111. Droillard, M. Isozymes of superoxide dismutase in mitochondria and peroxisomes isolated from petals of Carnation (Dianthus caryophyllus) during senescence / M. Droillard, A. Paulin // Plant Physiol. 1990. - V.94, №3. -P.1187-1192.

112. Durner, J. Salicilic acid is a modulator of tobacco and mammalian catalases / J. Durner, D.F. Klessig // J Biol. Chem. 1996. - V.271, №45. -P.28492-28501.

113. Escribano, J. Subcellular localization and isoenzyme pattern of peroxidase and polyphenol oxidase in beet root (Beta vulgaris L.) / J. Escribano, F. Gandia-Herrero, N. Caballero et al. // J Agric Food Chem. 2002. - V.50, №21. -P.6123-6129.

114. Faraci, F.M. Vascular protection: superoxide dismutase isoforms in the vessel wall / F.M. Faraci, S.P. Didion // Arterioscler Thromb Vase Biol. -2004. V.24, №8. -P.1367-1373.

115. Foyer, C.H. Oxidant and antioxidant signaling in plants: a re-evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context / C.H. Foyer, G. Noctor//Plant Cell & Envirom. -2005. V.28, №8. -P. 1056-1071.

116. Fu, J. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress / J. Fu, B. Huang // Environ. Exp. Bot. 2001. - V.45, №2. - P. 105-114.

117. Gao, F. Extracellular superoxide dismutase in pulmonary fibrosis / F. Gao, V.L. Kinnula, M. Myllarniemi et al. // Antioxid Redox Signal. 2008. -V. 10, №2. - P.343-354.

118. Geiszt, M. NADPH oxidases: new kids on the block / M. Geiszt // Cardiovasc Res. 2006. - V.71, №2. - P.289-299.

119. Gerbeau, P. Aquaporin Nt-TIPa can account for the high permeability of tobacco cell vacuolar membrane to small neutral solutes / P. Gerbeau, J. GQ9IU, P. Ripoche et al. // Plant J. 1999. - V. 18, №6. - P.577-587.

120. Ghamsari, L. Kinetics properties of guaiacol peroxidase activity in Crocus sativus L. corm during rooting / L. Ghamsari, E. Keyhani, S. Golkhoo //' Iranian Biomed. J. 2007. - V. 11, №3. - P. 137-146.

121. Giannopolitis, C.N. Superoxide dismutases: I. Occurrence in higher plants / C.N. Giannopolitis, S.K. Ries // Plant Physiol. 1977. - V.59, №2. -P.309-314.

122. Gomez, L. The intercellular distribution of glutathione synthesis and its response to chilling an mase / L. Gomez, H. Vanacker, P. Buchner et al. // Plant Pysiol. 2004. - V.134, №4. - P. 1662-1671.

123. Griesen, D. Localization of an ascorbate-reducible cytochrome b561 in the plant tonoplast / D. Griesen, D. Su, A. Berczi et al. // Plant Physiol. 2004. -V.134, №2.-P.726-734.

124. Guan, L. Two structurally similar maize cytosolic superoxide dismutase genes, sod4 and sod4A, respond differentially to abscisic acid and high osmoticum / L. Guan, J.G. Scandalios // Plant Physiol. 1998. - V.117, №1. -P.217-224.

125. Guan, L. Effects of the plant growth regulator abscisic acid and high osmoticum on the developmental expression of the maize catalase genes / L. Guan, J.G. Scandalios//Physiol, plantarum. 1998. - V. 104, №3. - P.413-422.

126. Guan, L. Hydrogen peroxide-madiated catalase gene expression in response to woundibg / L. Guan, J. Scandalios // Free Rad. Boil. Med. 2000. -V.28, №8. - P.1182-1190.

127. Guoyao, W. Glutathione metabolism and its implications for health / W. Guoyao, F. Yun-Zhong, Y. Sheng et al. // J Nutr. 2004. - V.134, №3. -P.489-492.

128. Irani, NG. Light-induced morphological alteration in anthocyanin-accumulating vacuoles of maize cells / NG. Irani, E. Grotewold // BMC Plant Biol. -2005. V.5, №7. -P.1-15.

129. Jaing, M. Effects of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings / M. Jaing, J. Zhang // Plant &cell physiol. 2001. - V.42, № 11. - p.1265-1273.

130. Jaleel, CA. Physiological basis of defense mechanisms in Withania somnifera under water Deficit Stress / CA. Jaleel // Global J. Environ. Res. — 2009. V.3, №2. - P.82-86.

131. Jaquinod, M. A proteomics dissection of Arabidopsis thaliana vacuoles isolated from cell culture / M. Jaquinod, F. Villiers, S. Kieffer-Jaquinod et al. // Mol Cell Proteomics. 2007. - V.6, №3. - P.394-412.

132. Jauh, G.Y. Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions / G.Y. Jauh, Т.Е. Phillips, J.C. Rogers // Plant cell. 1999. -V.l 1, №10. - P. 1867-1882.

133. Jones, M.A. NADPH oxidase-dependent reactive oxygen species formation required for root hair growth depends on ROP GTPase / M.A. Jones, M.J. Raymond, Z. Yang et al. //J Exp. Bot. 2007. - V.58, №6. - P. 1261-1270.

134. Kaiser, G. Polypeptide pattern and enzymic character of vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts / G. Kaiser, E. Martinoia, J.M. Schmitt, et al. // Planta. 1986. - V. 169, №3. - P.345-355.

135. Ken, C.F. Characterization of Fe/Mn-superoxide dismutase from diatom thallassiosira weissflogii: cloning, expression, and property / C.F. Ken, T.M. Hsiung, Z.X. Huang et al. // J Agric. Food Chem. 2005. - V.53, №5. -P.1470-1474.

136. Kim, YM. Cu,Zn-Superoxide dismutase is an intracellular catalyst for the FbCb-dependent oxidation of dichlorodihydrofluorescein / YM. Kim, JM. Lim, ВС. Kim et al. //Mol. Cells. -2006. -V.21, №1. P. 161-165.

137. Kim, SS. Purification and characterization of a cationic peroxidase Cs in Raphanus sativus / SS. Kim, DJ. Lee // Plant Physiol. 2005. - V.162, №6. -P.609-617.

138. Kirkman, HN. Catalase: a tetrameric enzyme with four tightly bound molecules of NADPH / HN. Kirkman, GF. Gaetani // Proc. Natl. Acad. Sci. -1984. V.81, №14. - P.4343-4347.

139. Kirkman, HN. The function of catalase-bound NADPH / HN. Kirkman, S. Galiano, GF. Gaetani //J Biol. Chem. 1987. - V.262, №2. - P.660-666.

140. Kitajima, S. Hydrogen peroxide-mediated inactivation of two chloroplastic peroxidases, ascorbate peroxidase and 2-cys peroxiredoxin / S. Kitajima //Photochem Photobiol. -2008. V.84, №6. - P. 1404-1409.

141. Kobayashi, M. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase / M. Kobayashi, I. Ohura, K. Kawakita et al. //Plant Cell. 2007. - V.l 9, №3. - P. 1065-1080.

142. Kolodziejczak, M. Variability of cathodic peroxidases in sugar beet (Beta vulgaris L.) cultivars / M. Kolodziejczak, M. Krzakowa // J Appl. Genet. -2003. V.44, №1. - P.55-62.

143. Kristensen, B.K. Barley coleoptile peroxidases. Purification, molecular cloning, and induction by pathogens / B.K. Kristensen, H. Bloch, S.K. Rasmussen // Plant Physiol. 1999. - V.120, №2. - P.501-512.

144. Lambeth, JD. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen / JD. Lambeth //Nat Rev Immunol. 2004. - V.4, №3. - P. 181-189.

145. Li, GW. Transport functions and expression analysis of vacuolar membrane aquaporins in response to various stresses in rice / GW. Li, YH. Peng, X. Yu et al. / J Plant Physiol. 2008. - V. 165, №18. - P. 1879-1888.

146. Li, M. The influence of drought stress on the activity of cell protection enzymes and lipid peroxidation in plantlets of Glycyrrhiza uralensis / M. Li, G.-X. Wang // Acta Ecol. Sin. 2002. - V.22, №4. - P. 503-507.

147. Lien, A.PH. Free radicals, antioxidants in disease and health / A.PH. Lien, H. Hua, PH. Chuong // J Biomed Sci. 2008. - V.4, №2. - P.89-96.

148. Lin, W. Membrane-bound ATPase of intact vacuoles and tonoplasts isolated from mature plant tissue / W. Lin, G.J. Wagner, H.W. Siegelman et al. // BBA. 1977. - V.465, №1. - P.l 10-117.

149. Liochev, S.I. Copper- and zinc-containing superoxide dismutase can act as a superoxide reductase and a superoxide oxidase / S.I. Liochev, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 2000. - V.275, №49. - P.38482-38485.

150. Liochev, S.I. C02, not HC03 , facilitates oxidations by Cu,Zn superoxide dismutase plus H202 / S.I. Liochev, I. Fridovich // PNAS. 2004. -V.101, № 3. — P.743-744.

151. Liso, R. Localization of ascorbic acid, ascorbic acid oxidase, and glutathione in roots of Cucurbita maxima L. / R. Liso, MC. De Tullio, S. Ciraci et al. // J Exp. Bot. 2004. - V.55, №408. - P.2589-2597.

152. Loque, D. Tonoplast intrinsic proteins AtTIP2;l and AtTIP2;3 facilitate NH3 transport into the vacuole / D. Loque, U. Ludewig, L. Yuan et al. // Plant physiol. 2005. - V.137, №2. - P.671-680.

153. Lopez, F. Characterization in maize of ZmTIP2-3, a root-specific tonoplast intrinsic protein exhibiting aquaporin activity / F. Lopez, A. Bousser, I. Sissoeff et al. // J Exp. Bot. 2004. - V.55, №396. - P.539-541.

154. Lopez-Molina, D. Purification and characterization of a new cationic peroxidase from fresh flowers of Cynara scolymus L. / D. Lopez-Molina, H.A. Heering, G. Smulevich et al. // J Inorg Biochem. 2003. - V.94, №3. - P.243-254.

155. Lopez-Serrano, M. Effect of fosetyl-Al on peroxidase from grapevine (Vitis vinifera) cells / M. Lopez-Serrano, MA. Ferrer, A. Ros Barcelo et al. // Eur J Histochem. 1995. - V.39, №1. -P.69-74.

156. Maeshima, M. Tonoplast transporters: organization and function / M. Maeshima // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. - V.52. - P.469-497.

157. Magbanua, ZV. Is catalase activity one of the factors associated with maize resistance to Aspergillus flavus? / ZV. Magbanua, CM. De Moraes, TD. Brooks et al. // Mol Plant Microbe Interact. 2007. - V.20, №6. - P.697-706.

158. Margis, R. Glutathione peroxidase family an evolutionary overview / R. Margis, C. Dunand, FK. Teixeira et al. // FEBS J. - 2008. - V.275, №15. -P.3959-3970.

159. Martinez-Parra, J. Characterization of betacyanin oxidation catalyzed by a peroxidase from Beta vulgaris L. roots. / J. Martinez-Parra, R. Munoz // J Agric. Food Chem. 2001. - V.49, №8. - P.4064-4068.

160. Martinoia, E. Transport processes of solutes across the vacuolar membrane of higher plants / E. Martinoia, N. Frangne // Plant Cell Physiol. 2000- V.41, №11. P. 1175-1186.

161. Martinoia, E. Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism / E. Martinoia, M. Maeshima, HE. Neuhaus // J Exp. Bot. 2007. -V.58, №1. - P.83-102.

162. Mendosa-Cozatl, D. Sulfur assimilation and glutathione metabolism under cadmium stress in yeast, protists and plants / D. Mendosa-Cozatl, H. Losa-Tavera, A. Hernandez-Navarro et al. // FEMS Microbiol Rev. 2005. - V.29, №4.- P.653-671.

163. Miller, AF. Superoxide dismutases: active sites that save, but a protein that kills / AF. Miller // Current Opinion in Chemical Biology. 2004. - V.8, №2.- P.162-168.

164. Minibayeva, F. Wound-induced apoplastic peroxidase activities: their roles in the production and detoxification of reactive oxygen species / F. Minibayeva, O. Kolesnikov, A. Chasov et al. // Plant Cell Environ. 2009. - V.32, №5. - P.497-508.

165. Mohamed, SA. Properties of a cationic peroxidase from Citrus jambhiri cv. Adalia / SA. Mohamed, MO. El-Badry, EA. Drees et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2008. - V. 150, №2. - P. 127-137.

166. Moran, JF. Functional characterization and expression of a cytosolic iron-superoxide dismutase from cowpea root nodules / JF. Moran, EK. James, MC. Rubio et al. // Plant Physiol. 2003. -V.33, №2. - P.773-782.

167. Moreau, F. Electron transport in the membrane of lutoids from the Latex of Hevea brasiliensis / F. Moreau, J. Jacob, Dupont et al. // Biochem. Biophis. Acta. 1975.-V.396, №1. - p. 116-124.

168. Miintz, K. Protein dynamics and proteolysis in plant vacuoles / K. Muntz // J Exp. Bot. 2007. - V.58, №10. - P.2391-2407.

169. Nakamae, H. Effects of metabolic inhibitors on anthocyanin accumulation in petals of Rosa hybrida Hort. ev. Ehigasa / H. Nakamae, N. Nakamura // Plant cell physiol. 1983. - V.24, №6. - P.995-1002.

170. Nishikimi, M. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen / M. Nishikimi, N. Appaji, K. Yagi // Biochem Biophys Res Commun. 1972. - V.46, №2. - P.849-854.

171. Nozik-Grayck, E. Extracellular superoxide dismutase / E. Nozilc-Grayck, H.B. Suliman, C.A. Piantadosi // J Biochem Cell Biol. 2005. - V.37, №12. - P.2466-2471.

172. Ogawa, K. Intra- and extra-cellular localization of "Cytosolic" Cu,Zn-superoxide dismutase in Spinach leaf and hypocotyl / K. Ogawa, S. Kanematsu, K. Asada // Plant Cell Physiol. 1996. - V.37, №6. - P.790-799.

173. Okubo-Kurihara, E. Acceleration of vacuolar regeneration and cell growth by overexpression of an aquaporin NtTIPl;l in tobacco BY-2 cells / E. Okubo-Kurihara, T. Sano, T. Higald et al. // Plant Cell Physiol. 2009. - V.50, №1.-P.151-160.

174. Olbrich, A. Newly formed vacuoles in root meristems of barley and pea seedlings have characteristics of both protein storage and lytic vacuoles / A.

175. Olbrich, S. Hillmer, G. Hinz et al. // Plant Physiol. 2007. - V.145, №4. -P.1383-1394.

176. Ono, E. Localization of a flavonoid biosynthetic polyphenol oxidase in vacuoles / E. Ono, M. Hatayama, Y. Isono et al. // Plant J. 2006. - V.45, №2. -P.133-143.

177. Otani, M. Characterization of vacuolar transport of the endogenous alkaloid berberine in Coptis japonica / M. Otani, N. Shitan, K. Sakai et al. // Plant Physiol. -2005. -V. 138, №4. P. 1939-1946.

178. Ozga, JA. Hormone and seed-specific regulation of pea fruit growth / JA. Ozga, R. van Huizen, DM. Reinecke // Plant Physiol. 2002. - V.128, №4. -P.1379-1389.

179. Paris, N. Plant cells contain two functionally distinct vacuolar compartments / N. Paris, C.M. Stenley, R.L. Jones et al. // Cells. 1996. - V.85, №4. - P.563-572.

180. Pei, Z.M. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediated abscisic acid signaling in gusrd cells / Z.M. Pei, Y. Muraya, G. Benning et al. // Nature. 2000. - V.406, №6797. - P.731-734.

181. Pham-Huy, L.A. Free radicals, antioxidants in disease and health / L.A. Pham-Huy, H. He, C. Pham-Huy // J Biomed Sci. 2008. - V.4, №2. - P.89-96.

182. Pietta, PG. Flavonoids as antioxidants / PG. Pietta // J Nat. Prod. -2000. V.63, №7. - P.1035-1042.

183. Prodanovic, O. Antioxidative enzymes during germination of two lines of Serbian spruce Picea omorika (Рапс.) Ригкупё. / О. Prodanovic, R. Prodanovic, J. Bogdanovic et al. // Arch. Biol. Sci. 2007. - V.59, №3. - P.209-216.

184. Quan, LJ. Hydrogen peroxide in plants: a versatile molecule of the reactive oxygen species network. / LJ. Quan, B. Zhang, WW. Shi et al. // J Integr Plant Biol. -2008. -V.50, №1. -P.2-18.

185. Rahman, I. Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation / I. Rahman, W. MaeNee // Eur Respir J. 2000. - V.16, №3. -P.534-554.

186. Ramachandra, A. Water stresmediated changes in antioxidant enzyme activities of mulberry (Morus alba L.) / A. Ramachandra, K.V. Reddy, K.V. Chaitanya et al.//J. Seric. Sci. Jpn. 2000. - V.69, №3. -P. 169-175.

187. Ranieri, A. Iron deficiency differently affects peroxidase isoforms in sunflower / A. Ranieri, A. Castagna, B. Baldan et al. // J Exp. Bot. 2001. - V.52, №354. - P.25-35.

188. Rausch, T. Novel insight into the regulation of GSH biosynthesis in higher plants / T. Rausch, R. Gromes, V. Liedschulte et al. // Plant Biol (Stuttg). -2007. -V.9, №5. P.565-572.

189. Rea, P.A. Tonoplast energisation: two H^-pumps? One membrane / P.A. Rea, D. Sanders //Physiol. Plantarum. 1987. - V.71, №1. -P. 131-141.

190. Roach, T. An oxidative burst of superoxide in embryonic axes of recalcitrant sweet chestnut seeds as induced by excision and desiccation / T. Roach, M. Ivanova, RP. Beckett et al. // Physiol Plant. 2008. - V.133, №2. -P.131-139.

191. Rogers, JC. Multiple vacuoles in plant cells / JC. Rogers // Plant Physiol. 2008. - V.146, №3. - P. 1024-1025.

192. Sagi, M. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases / M. Sagi, R. Fluhr // Plant Physiol. 2006. - V. 141, №2. - P.336-340.

193. Saroussi, S. The little we know on the structure and machinery of V-ATPase / S. Saroussi, N. Nelson // J Exp. Biol. 2009. - V.212, № 11. - P. 1604-1610.

194. Schmidt, UG. Novel tonoplast transporters identified using a proteomic approach with vacuoles isolated from cauliflower buds / UG. Schmidt, A. Endler, S. Schelbert et al. // Plant Physiol. 2007. - V.l45, №1. - P.216-229.

195. Schopfer, P. Hydroxyl radical-induced cell-wall loosening in vitro and in vivo: implications for the control of elongation growth / P. Schopfer // Plant J. -2001. V.28, №6. - P.679-688.

196. Schopfer, P. Plasma membrane-generated reactive oxygen intermediates and their role in cell growth of plants / P. Schopfer, A. Liszkay //' Biofactors. 2006. - V.28, №2. -P.73-81.

197. Sekhar, P.N. In silico modeling and hydrogen peroxide binding study of rice cayalase / P.N. Sekhar, P.B.K. Rishor, L.A. Reddy et al. // ISB. 2006. -V.6, №5.-P.435-447.

198. Shao, HB. Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells / HB. Shao, LY. Chu, ZH. Lu et al. // J Biol. Sci. 2008. -V.4, №1. - P.8-14.

199. Shimaoka, T. Isolation of intact vacuoles and proteomic analysis of tonoplast from suspension-cultured cells of Arabidopsis thaliana / T. Shimaoka, M. Ohnishi, T. Sazuka et al. // Plant cell physiol. 2004. - V.45, №6. - P.672-683.

200. Shigeoka, S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes / S. Shigeoka, T. Ishikawa, M. Tamoi et al. // J Exp. Bot. 2002. -V.53, №372. - P. 1305-1319.

201. Smirnoff, N. Ascorbic acid in plants: biosynthesis and function / N. Smirnoff, GL. Wheeler // Crit Rev Biochem Mol Biol. 2000. - V.35, №4. -P.291-314.

202. Sohn, EJ. The shoot meristem identity gene TFL1 is involved in flower development and trafficking to the protein storage vacuole / EJ. Sohn, M. Rojas-Pierce, S. Pan et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. - V.104, №47. -P.18801-18806.

203. Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species / H. Sumimoto // FEBS J. — 2008. V.275, №13. - P.3249-3277.

204. Sottomayor, M. Peroxidase from Catharanthus roseus (L.) G. Don and the biosynthesis of alpha-3',4'-anhydrovinblastine: a specific role for a multifunctional enzyme / M. Sottomayor, A. Ros Barcelo // Protoplasma. 2003. -V.222, №1-2. — P.97-105.

205. Sutka, M. Tonoplast vesicles of Beta vulgaris storage root show functional aquaporins regulated by protons / M. Sutka, K. Alleva, M. Parisi et al. // Biol Cell. 2005. - V.97, №11. - P.837-846.

206. Tepperman, JM. Transformed plants with elevated levels of chloroplastic SOD are not more resistant to superoxide toxicity / JM. Tepperman, P. Dunsmuir // Plant Mol Biol. 1990. - V. 14, №4. - P.501-511.

207. Terzi, R. Tolerance to drought stress in relation to changes of antioxidant enzyme system in Ctenanthe setosa // R. Terzi, A. Kadioglu // Acta Biol. Cracow. Ser. Bot. 2006. - V.48, №2. - P.89-96.

208. Tester, M. Plant ion channels: whole-cell and single-channel studies / M. Tester //Now Phytol. 1990. - V.l 14, №3. - P.305-340.

209. Thakur, PS. Peroxidase isozymes in relation to developing water deficits in two Zea mays L. cultivars / PS. Thakur, G. Singh, VK. Rai // New Phytologist. 1981. - V.89, №. 1. - P.25-32.

210. Thom, M. Vacuoles from sugarcane suspension cultures / M. Thom, A. Maretzki, E. Komor//Plant. Physiol. 1982. - V.69, №6. - P. 1315-1319.

211. Thomas, SR. Coantioxidants make alpha-tocopherol an efficient antioxidant for low-density lipoprotein / SR. Thomas, J. Neuzil, D. Mohr et al. // Am J Clin Nutr. 1995. -ЛЛ62, №6. — P. 1357S-1364S.

212. Tsukamoto, S. A novel cis-element that is responsive to oxidative stress regulates three antioxidant defense genes in rice / S. Tsukamoto, S. Morita, E. Hirano et al. // Plant Physiol. 2005. -V. 137, №1. - P.317-327.

213. Upston, JM. Tocopherol-mediated peroxidation of lipoproteins: implications for vitamin E as a potential antiatherogenic supplement / JM. Upston, AC. Terentis, R. Stacker // FASEB J. 1999. - V.13, №9. - P.977-994.

214. Unyayar, S. Changes in antioxidative enzymes of young and mature leaves of tomato seedlings under drought stress / S. Unyayar, F.O. Cekic // Turk J Biol. 2005. - V.29, №4. - P.211-216.

215. Ushio-Fukai, M. Redox signaling in angiogenesis: role of NADPH oxidase / M. Ushio-Fukai // Cardiovasc Res. 2006. - V.71, №2. - P.226-235.

216. Vanacker, H. Pathogen-induced changes in the antioxidant status of the apoplast in Barley leaves / H. Vanacker, TL.W. Carver, CH. Foyer // Plant Physiol. 1998. - V.l 17, №3. - P. 1103-1114.

217. Van den Berg, B.M. A comparative study of a cationic peroxidase from peanut and an anionic peroxidase from petunia / B.M. van den Berg, R.N. Chibbar, R.B. van Huystee // Plant Cell Rep. 1983. - V.2, №6. - P.304-307.

218. Verhoek, B. Lipids and enzymatic activities in vacuolar membranes isolated via protoplasts from oat primary leaves / B. Verhoek, R. Haas, K. Wrage et al. 1983. - V.38. №9-10. - P.770-777.

219. Vetrano, A.M. Characterization of the oxidase activity in mammalian catalase / A.M. Vetrano, D.E. Heck, T.M. Mariano et al. // J Biol. Chem. 2005. -V.280, №42. - P.35372-35381.

220. Wagner, G.J. Enzymes and protein character of tonoplast from Hippeatrum vacuoles / G.J. Wagner // Plant physiol. 1981. - V.81, №2. - P.497-499.

221. Wang, L. Purification and cloning of a Chinese red radish peroxidase that metabolise pelargonidin and forms a gene family in Brassicaceae / L. Wang, K. Burhenne, BIC. ICristensen et al. // Gene. 2004. - V.343, №2. - P.323-335.

222. Watanabe, M. An anthocyanin compound in buckwheat sprouts and its contribution to antioxidant capacity / M. Watanabe // Biosci Biotechnol Biochem. 2007. - V.71, №2. - P.579-582.

223. Wingsle, G. Isolation, purification, and subcellular localization of isozymes of superoxide dismutase from scots pine (Pinus sylvestris L.) Needles1 / G. Wingsle, P. Gardestrom, JE. Haligren et al. // Plant Physiol. 1991. - V.95, №1. - P.21-28.

224. Wolf, A.T. Degradation of glutathione S-conjugates by a carboxypeptidase in the plant vacuole / A.T. Wolf, K.J. Dietz, P. Schroder // FEBS Lett. 1996.- V.384,№l.-P.31-34.

225. Wudick, MM. A look inside: localization patterns and functions of intracellular plant aquaporins / MM. Wudick, DT. Luu, C. Maurel // New Phytol. -2009. V. 184, №2. - P.289-302.

226. Zechmann, B. Immunocytochemical localization of glutathione precursors in plant cells / B. Zechmann, G. Zellnig, M. Muller // J Elec. Micros. -2006.-V.55, №3.-P.173-181.

227. Zhou, H. Effects of water stress in spring on membrane lipid peroxidation in in leaves of Ligusticum chuanxiong / H. Zhou, Q. Fan, S. Zheng et al. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2009. - V.34, №2. - P132-137.

228. Zimmermann, P. The correlation between oxidative stress and leaf senescen during plant development / P. Zimmermann, U. Zentgraf // Cell. Mol. Boil. Lett. 2005. - V. 10, №3. - P.515-534.

Информация о работе

Ишеева, Оксана Дамбинимаевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Ферменты первичной защиты от окислительного стресса у вакуолей клеток растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы