Редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы

Трухан, Ирина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы"

На правах рукописи

ТРУХАН Ирина Сергеевна

редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы

{Beta vulgaris l.)

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Иркутск-2013

005540739

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Прадедова Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Дударева Любовь Виссарионовна

доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс: (3952) 51-07-54; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан 16 ноября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 003.047.01 кандидат биологических наук

oJ/frlJU/?/^

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Глутатион (С8Н)-многофункциональный трипептид, обнаруженный практически у всех живых организмов (Noctor et al., 2012). У растений, продуцирующих активные формы кислорода в процессе фотосинтеза, клеточного дыхания или фотодыхания, глутатион в составе аскорбат-глутатионового цикла играет важную роль в нейтрализации Н202 (Foyer, Noctor, 2011). Помимо антиоксидантной функции глутатион участвует в детоксикации ксенобиотиков и тяжелых металлов (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998; Jozefczak et al., 2012), в трансдукции сигналов при абиотическом и биотическом видах стресса, а также является основным редокс-буфером в большинстве компартмен-тов растительной клетки (Noctor et al., 2012). В редокс-систему глутатиона помимо самого трипептида входят глутатион-зависимые ферменты (глутатион-8-трансферазы, глутатионпероксидазы) и фермент, обеспечивающий его восстановление (глутатионре-дуктаза). Несмотря на то, что роль глутатиона в качестве антиоксиданта была выявлена исторически первой и активно исследуется с момента открытия глутатиона, в последние десятилетия больше внимания привлекает участие редокс-системы глутатиона в детоксикации ксенобиотиков (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998; Tausz et al., 2004). В связи с этим глутатион и элементы его редокс-системы интенсивно изучаются в таких компар-тментах растительной клетки, как цитозоль, хлоропласта, митохондрии, пероксисомы и ядра (Noctor et al., 2012). Однако сведения о глутатионовой системе вакуолей до сих пор крайне скудны и носят отрывочный характер. На сегодняшний день известно, что в вакуоль посредством ABC-транспортеров депонируются глутатионовые конъюгаты ксенобиотиков и эндогенных метаболитов (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998). При участии этих же переносчиков в вакуоль избирательно транспортируется глутатион в окисленной форме (GSSG). Тем не менее, вакуолярный пул глутатиона мало исследовался, и присутствие этого трипептида в вакуолях считается тканеспецифичным или видоспецифичным, поскольку у некоторых видов растений содержание вакуолярного глутатиона было незначительным или недоступным для детекции (Zechmarm, Mttller, 2010; Noctor et al., 2012). Практически ничего не известно и о ферментах редокс-системы глутатиона вакуолярной локализации. Об активности вакуолярной глутатионредукта-зы (GR, К.Ф. 1.8.1.7) упоминается только в связи с изучением транспорта аскорбата в вакуоли протопластов листьев ячменя (Rautenkranz et al., 1994), и наличие нескольких вакуолярных изоформ глутатион-8-трансфераз (GST, К.Ф. 2.5.1.18) было показано при помощи протеомного анализа у Arabidopsis thaliana L. (Carter, 2004). Однако свойства и кинетические характеристики этих ферментов ранее не исследовались. В связи с возрастающим интересом к участию центральной вакуоли растительной клетки в детоксикации ксенобиотиков и поддержании клеточного редокс-гомеостаза мы посчитали важным исследовать в данном компартменте компоненты редокс-системы глутатиона, выполняющей ключевую роль в антиоксидантной защите и детоксикации в других клеточных органеллах. Полученные результаты расширят представление об участии центральной вакуоли в основных метаболических процессах растительной клетки и обеспечении нормальной жизнедеятельности растения в изменяющихся условиях среды.

Цель и задачи исследования

Цель представляемой работы заключалась в изучении элементов редокс-системы глутатиона в вакуолях корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в сравнении с относительно хорошо изученной системой глутатиона такого компартмента как пластиды.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание окисленного и восстановленного гаутагиона во фракциях вакуолей и пластид, а также в тканевом экстракте корнеплодов столовой свеклы.

2. Изучить активность, рН-оптимум, кинетические характеристики, изофер-ментный состав, взаимодействие с ингибитором и зависимость уровня активности от стадии развития глутатионредуктазы и глутатион-8-трансферазы вакуолей, пластид и тканевого экстракта корнеплодов столовой свеклы.

3. Определить концентрацию пероксида водорода как соединения, активно взаимодействующего с глутатионом и истощающего его пул в экстрактах вакуолей, пластид, а также в тканевом экстракте корнеплодов столовой свеклы.

4. Исследовать содержание свободных аминокислот, входящих в состав глута-тиона, в вакуолях и тканевом экстракте корнеплодов столовой свеклы.

Научная новизна

В результате проведенной работы получены новые данные о компартментации компонентов редокс-системы глутатионав клетках запасающей паренхимы корнеплодов столовой свеклы {Beta vulgaris L.). В вакуолях клеток корнеплодов выявлена довольно высокая концентрация глутатиона (в среднем 30-40 мкМ/мг белка). Показано, что ваку-олярный пул глутатиона представлен главным образом восстановленной формой (GSH), при этом соотношение GSH/GSSG составляло 8,4. В вакуолях клеток корнеплодов впервые обнаружена и исследована активность глутатионредуктазы - фермента, поддерживающего глутатионовый пул в восстановленном состоянии. Восстанавливаемый внутри вакуоли глутатион, вероятно, вовлекается в процессы локальной утилизации активных форм кислорода (АФК) или детоксикации высокореактивных метаболитов. В последнем случае большое значение имеют реакции конъюгации, катализируемые глутатион-З-трапсферазами, активность которых также впервые выявлена в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы. Специфичность активности глутатион-зависимых ферментов вакуолярной локализации была подтверждена при помощи ингибиторного анализа, зимографического исследования ферментативной активности в полиакрила-мидном геле, иммуноферментного исследования (вестерн-блот анализа), а также при сравнении со свойствами аналогичных ферментов пластид клеток корнеплодов столовой свеклы. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что транспортируемый в вакуоли глутатион не утилизируется, как полагали ранее, а активно вовлекается в метаболические процессы, происходящие в вакуолярном компартменте и опосредующие его роль в поддержании клеточного редокс-гомеостаза.

Теоретическая и практическая значимость

Глутатион, глутатионредуктаза и глутатион-Б-трансфераза, обнаруженные в вакуолях, являются частью общеклеточной редокс-системы глутатиона, которая стоит на первых рубежах защиты от негативного действия АФК, эндогенных токсичных соединений и ксенобиотиков. Исследования вакуолярной системы глутатиона значительно расширят представление о вкладе этого компартмента в процессы детоксикации цитотоксичных соединений в растительной клетке. Особое значение изучение данной системы приобретает в связи с возрастающими количествами пестицидов, вносимых ежегодно в почву для повышения урожая сельскохозяйственных культур. Поэтому исследование внутриклеточных механизмов детоксикации опасных для здоровья человека соединений в растениях, употребляемых в пищу, имеет большую практическую значимость. Кроме того, сейчас широко обсуждается роль антиокси-

дантов, поступающих с продуктами питания, в профилактике заболеваний человека разной этиологии, что также указывает на необходимость изучения компартментации и аккумуляции антиоксидантов в клетках запасающей паренхимы корнеплодов.

Материалы диссертации могут быть включены в курсы лекций по физиологии и биохимии растений, использоваться в профильных научно-исследовательских институтах РАН.

Связь с научными программами

Исследования проводились в соответствии с приоритетными направлениями СИФИБР СО РАН (проект VI.56.1.3., № гос. регистрации 01201353696), поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований (грант№ 12-04-31383 мол-_а) и Министерством образования и науки Российской Федерации (соглашение 8266).

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 в российских рецензируемых журналах из списка ВАК РФ.

Результаты исследования были представлены на III Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013), Всероссийской научной конференции «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2013), I Международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013).

Структура и объем работы

Диссертация, изложенная на 183 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе представлено 27 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 273 источника, в том числе 240 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо, выращенные на опытном участке СИФИБР СО РАН. Корнеплоды отбирали на разных фазах онтогенеза, условно обозначенных как стадия активного роста (август - сентябрь), стадия глубокого покоя (сентябрь - апрель) и поздняя стадия покоя (май - июнь). В зимний период корнеплоды хранили при температуре +4 °С.

Выделение органелл. Вакуоли изолировали из клеток корнеплодов столовой свеклы {Beta vulgaris L.) при помощи модифицированного макрообъемного метода (Саляев и др., 1981). Обогащенную фракцию пластид получали общепринятым методом согласно Boyle et al. (1986). Содержание глутатиона в образцах измеряли спектрофо-тометрически (Smith et al., 1984) с модификацией для окисленного глутатиона (Behr, 1997) и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Rellän-Alvarez et al., 2006). В последнем случае измерения проводили на жидкостном микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» (Россия). Активность глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически согласно Anderson et al. (1990). Ингибиторный анализ

глутатионредуктазы с 1 -хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) проводили методом, предложенным Bilzeret al. (1984). Глутатион-в-трансферазную активность исследовали спекгрофотометрически с субстратами ХДНБ (Habig et al., 1974) и флуородифеном (Pascal, Scalla, 1999). Ингибиторный анализ глутатион-8-трансфераз проводили с 0,5 мМ этакриновой кислотой (Kilili et al., 2004). Содержание НАДН и НАД+ в образцах определяли спектрофотометрическим методом, описанным Heber, Santarius (1965). Содержание иероксида водорода измеряли при помощи FOX-метода (Galletti et al., 2008). Содержание аминокислот в образцах определяли на автоматическом анализаторе аминокислот AAA 339 (Чехия) согласно протоколу. Электрофоретическими методами исследовали изоферментный состав белков. Для сохранения ферментативной активности белки разделяли в неденатурирующих условиях согласно общепринятому методу (Гааль и др., 1982). Использовали 7,5% и 10% полиакриламидный гель (ПААГ). Маркером перемещения белка служил калибровочный КИТ (Sigma). Изоэлектрическое фокусирование белков (ИЭФ) проводили в ПААГ (Т 5%; С 3%), содержащем 10 % глицерина и 3 % амфолита (рН 3,5-10,5). Анолитом служила 0,06 N Н3Р04, католитом - 0,1 N NaOH (Ригетти, 1986). В качестве маркера перемещения белка использовали калибровочный КИТ для ИЭФ, содержащий белки, изоэлектрические точки (р!) которых находились в пределах рН от 3,75-9,3. В полученных гелях выявляли активность глутатион-Б-трансферазы и глутатионредуктазы или использовали их для переноса белка на нитроцеллюлозную мембрану и последующего иммуноблоттинга. Визуализацию активности в ПААГ глутатионредуктазы (Левитес, 1986; Aravind et al., 2005), глутатион-8-трансферазы (Gupta, Rathaur, 2005), малатдегидрогеназы (Левитес, 1986) и каталазы (Гааль и др., 1982) проводили общепринятыми методами. Для вестерн-блот анализа изоформ глутатионредуктазы использовали поликлональные антитела мыши, полученные на GR пекарских дрожжей (Sigma). Иммунизацию мышей проводили в 2 этапа, вводя антиген внутрибрюшинно дваяеды с двухнедельным интервалом. 100 мкг вводимого антигена объединяли с равным количеством полного адъюванта Фрейнда. После 50-60 дней иммунизации мышей осуществляли забор крови, содержащей поликлональные антитела (Кэтти и др., 1991). Перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану проводили описанным ранее методом (Побежимова и др., 2004) с незначительными модификациями.

Исследования проводили в 3—5 аналитических и 3—5 биологических повторностях. При статистической обработке материала использовали общепринятые показатели: среднее арифметическое значение, стандартное или квадратическое отклонение (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение оргапелл и проверка чистоты полученных фракций

Центральная вакуоль растительной клетки считается многофункциональным компартментом, который играет основную роль в поддержании клеточного гомеостаза, обеспечивая депонирование, детоксикацию или деградацию ксенобиотиков и эндогенных метаболитов, а также участвует в клеточном сигналинге (Carter et. al., 2004; Андреев, 2012). Однако исследования ферментативных систем или низкомолекулярных соединений вакуолей не так многочисленны, как можно было бы ожидать. Это связано со сложностью изолирования интактных вакуолей и получения чистой фракции в количествах, достаточных для проведения биохимических анализов. В СИФИБР СО РАН в 80-е годы был модифицирован макрообъемный метод (Leigh, Branton, 1976),

основанный на последовательных этапах дифференциального центрифугирования и очистке в градиенте плотности сахарозы. Данный метод позволяет получать чистые фракции интактных вакуолей из корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.), достаточные для проведения биохимических исследований как вакуолярного сока, так и тонопласта (Саляев и др., 1981; Пузанова и др., 1982; Кузеванов и др., 1985). Для вакуолей корнеплодов столовой свеклы характерно формирование двух фракций в градиенте плотности сахарозы, которые условно были обозначены как «легкие» и «тяжелые» (Кузеванов и др., 1985) (рис. 1, А). Ранее было высказано предположение, что эти фракции образованы двумя популяциями вакуолей. Вакуоли с меньшей плавучей плотностью, так называемые «легкие» (в градиенте сахарозы располагаются на границе 1,050 и 1,080 г/см3), предположительно относятся к клеткам зоны межкольцевой паренхимы корнеплода и содержат больше ионов калия, натрия, органических кислот и аминокислот. Тогда как вакуоли с большей плавучей плотностью и преобладающим содержанием сахарозы и бетацианинов, или «тяжелые» (располагаются на границе 1,080 и 1,145 г/см3), относятся к клеткам зоны кольцевой паренхимы, содержащей сосудисто-волокнистые пучки (Кузеванов и др., 1985; Катков и др., 1990).

В настоящей работе данный метод использовали для получения общей фракции изолированных вакуолей, объединяя популяции «тяжелых» и «легких» вакуолей. Чистоту полученных фракций и интактность вакуолей контролировали при помощи световой микроскопии и биохимических методов (рис. 1 и 2). В результате анализ при помощи светового микроскопа NU-2E («Carl Zeiss», Германия) показал, что во фракции из нижних слоев градиента плотности присутствовали элементы клеточных стенок и более мелкие органеллы, структурированные внутри, вероятно, ядра (рис. 1, Б). Однако

во фракциях «тяжелых» и «легких» вакуолей, подобные примеси не обнаружены.

Подтверждение чистоты общей фракции и интактности изолированных вакуолей также получали путем зимо-графического определение активности маркерных ферментов в полиакрила-мидном геле (рис. 2).

Пероксисомы не являются потенциальными контаминантами вакуолярной фракции из-за малого размера органелл и, следовательно, высокой скорости седиментации. Однако, чтобы исключить вероятность взаимодействия пероксисом и вакуолей с последующим слиянием мембран или везикуляции тонопласта с одновременным захватом цитоплаз-матического содержимого в процессе выделения, мы исследовали в геле активность маркерного фермента пероксисом - каталазы (К.Ф. 1.11.1.6) (Chandlee et al., 1983). Зимографическим методом ката-градиента, 2 - фракция «тяжелых» вакуолей, лазная акгивность была визуализирована 3 - фракция «легких» вакуолей. в тканевом экстракте (рис. 2, б), однако

яш шт

А_Б

Рисунок 1. Анализ чистоты фракций изолированных вакуолей: А - разделение вакуолярной фракции в градиенте плотности сахарозы, Б - анализ чистоты фракции под световым микроскопом. 1 - нижний слой

в вакуолярном экстракте активность данного фермента не проявлялась, что подтверждает чистоту и интактность полученной фракции вакуолей (рис. 2, а).

Кроме того, для подтверждения интактности изолированных вакуолей использовали определение НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназной активности (МДГ) в геле. НАДФ-МДГ (К.Ф. 1.1.1.82) специфична для пластид (Edwards et al., 1985), тогда как НАД-МДГ (К.Ф. 1.1.1.37) была обнаружена во многих клеточных компартментах: митохондриях, цитозоле, глиоксисомах, пероксисомах, микросомах, а также в пластидах (Yudina, 2012). Например, известно, что этиопласты, выделенные из листьев выращенного в темноте ячменя, и амилопласты, выделенные из корней гороха, содержали оба типа МДГ (Neuhaus et al., 1993). Зимографический анализ вакуолярной и пластидной фракций, а также экстракта ткани на присутствие НАД- и НАДФ-МДГ показал активность этих ферментов в тканевом экстракте и в обогащенной фракции пластид (рис. 2, б, в). В вакуолях специфическая активность как НАД-, так и НАДФ-МДГ отсутствовала (рис. 2, а), что исключает контаминацию полученных изолированных вакуолей двумембранными или одномембранными органеллами, а также повреждение и последующую везикуляцию вакуолярных структур, сопровождающуюся захватом цитоллазматического содержимого.

Содержание глутатиона в образцах

Глутатион является неотъемлемым компонентом всех органов растений, но его содержание в значительной степени зависит от типа исследуемой ткани, вида растения, стадии его развития, условий произрастания (т.е. доступности серы и азота, воздействия стрессовых факторов, наличия симбионтов) и во многом от метода анализа. Были определены как десятки наномолей глутатиона на грамм сырого веса, так и несколько миллимолей в протопластах отдельных клеток (Noctor, Foyer, 19986; Meyer et al., 2001; Rellán-Álvarez et al., 2006).

В вакуолях, пластидах и тканевом экстракте покоящихся корнеплодов столовой свеклы содержание глутатиона определяли двумя способами (табл. 1). Первый - спектрофотометрический метод, основанный на применении 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ или реактива Эллмана) (Tietze, 1969). Второй, более чувствительный и специфичный метод - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (Vignaud et al., 2004). В отличие от спектрофотометриче-ского метода ВЭЖХ позволяет определять содержание глутатиона в образцах без предварительной дериватизации и не требует восстановления GSSG, что упрощает процедуру подготовки образца и позволяет избежать изменений в редокс-состоянии глутатиона. Однако ферментативный циклический метод с ДТНБ до сих пор является наиболее широко используемой техникой для определения GSH и GSSG из-за достаточной чувствительности и доступности.

абв абвабк

Рисунок2. Визуализация активности маркерных ферментов в ПААГ: НАДФ-МДГ - НАДФ-малатдегидрогеназы, НАД-МДГ - НАД-мапатдегидрогензы, каталазы; а - вакуоли, б - экстракт ткани, в - обогащенная фракция пластид, к - каталаза из бычьей сыворотки.

Таблица 1. Содержание глупмтиопа в кампарптептах корнеплодов столовой свеклы, определенное разными методами__

Компарт-мент Спектрофотометрический метод с ДТНБ, мкМ/мг белка Хроматографический метод, мкМ/мг белка

GSH GSSG GSG+ GSSG GSH/ GSSG GSH GSSG GSH+ GSSG GSH/ GSSG

Вакуоли 31,3 0,43 ±0,13 31,73 ± 9,1 72,8 39,7 ± 5,1 4,7 ±0,9 44,4 8,4

Пластиды 6,3 0,87 ±0,2 7,17 ± 0,5 7,2 3,6 ±0,14 0,2 ±0,08 3,8 18

Тканевой экстракт 54,3 3,2 ±0,8 57,5 ± 15,3 17 106,3 ±29,1 9,3 ±0,6 115,6 11,4

Результаты, полученные двумя методами, несколько различались (табл. 1). Тем не менее, при сопоставлении данных были очевидны общие тенденции: наибольшим содержанием GSH характеризовались водные экстракты ткани, а самым низким - обогащенные фракции пластид. Из литературных источников известно как о высоких концентрациях глутатиона в пластидах (62-76 % от суммарного содержания в клетке) (Noctor and Foyer 1998а, Foyer et al. 2001), так и о низких (на 80-90 % меньше, чем в других компартмен-тах) (Müller et al., 2004; Zechmann et al., 20066; Kolb et al., 2010; Zechmann, Müller, 2010).

В то же время в вакуолях содержание глутатиона было достаточно высоким, что не совпадало с полученными ранее результатами биохимических и иммуногистохи-мических исследований. Присутствие глутатиона в вакуолях по-прежнему вызывает дискуссии, поскольку в некоторых тканях и видах растений его не удавалось определить. Так в нескольких работах в вакуолях листьев и корней A. thaliana, Nicotiana íabacum и Cucurbita pepo иммуногистохимическим методом не было обнаружено или было обнаружено незначительное количество глутатиона (Müller et al., 2004; Zechmann et al., 2006; Kolb et al., 2010; Zechmann, Müller, 2010). Отсутствие вакуолярного глутатиона в данных исследованиях объясняли его быстрой деградацией после транспорта через тонопласт (Müller et al., 2004; Kolb et al., 2010). Однако этим же методом глутатион был показан в вакуолях клеток-спутниц флоэмы и сосудистых клеток паренхимы (Zechmann, Müller, 2010). Глутатион также был обнаружен в вакуолях листьев А. thaliana в концентрации, в 100 раз меньшей, чем в других компартментах, что соответствовало 5,4 % от суммарного содержания глутатиона в клетке (Queval et al., 2011). А вычисленная с учетом занимаемого объема концентрация глутатиона в вакуолях клеток мезофилла N. tabacum соответствовала 17 % от общего содержания (Rennenberg, 1982). При безводном фракционировании листьев А. thaliana было показано, что концентрация глутатиона в вакуолях была в 4 раза меньше, чем в пластидах (Krueger et al., 2009). В протопластах мезофилла листьев ячменя Hordeum vulgare L. содержание пиутатиона в сульфгидрильной форме (GSH) в вакуолях было 0,9 % от общеклеточного содержания восстановленного глутатиона, а в дисульфидной форме (GSSG) - 12 % от общего содержания GSSG в клетке (Dietz et al., 1992). В этом случае отмечали низкое соотношение GSH/GSSG в вакуолях (1,3), что считается характерной особенностью этого компартмента. Что касается результатов исследования компартментации глутатиона в клетках корнеплодов столовой свеклы, то они показали не только высокое его содержание в вакуолях, но и довольно высокое соотношение GSH/GSSG, при определении хроматографическим методом сопоставимое с пластидным и общетканевым GSH/ GSSG, хотя оно было незначительно ниже последних (табл. 1).

Анализ литературы показал, что немаловажное значение при изучении содержания глутатиона в вакуолях, по всей видимости, имеет специфическая функция

исследуемых органов и тканей. Ранние исследования проводились главным образом на вакуолях корней или мезофилла листа A. thaliana, табака, ячменя, тыквы и т.п. Мы же имели дело с корнеплодами, состоящими преимущественно из запасающей паренхимы, богатой сосудистыми пучками. При этом известно, что в вакуолях клеток-спутниц флоэмы С. pepo глутатион был обнаружен иммуногистохимическим методом, которым не удалось выявить глутатион в вакуолях листьев и корней некоторых видов растений (Zechmann, Müller, 2010). Поэтому, можно предположить, что вакуоль как основной запасающий компартмент в клетках паренхимы и проводящих пучков корнеплода может аккумулировать гораздо большие количества метаболитов, и в том числе глутатиона, чем другие ткани.

Глутатионредуктаза

Обращает на себя внимание преимущественно восстановленное состояние глута-тионового пула вакуолей корнеплодов столовой свеклы (табл. 1). Ранее при помощи биохимических методов в вакуолях также обнаруживали как окисленный, так и восстановленный глутатион, и, хотя соотношение GSH/GSSG в вакуолях изолированных протопластов листьев ячменя было более окисленным (1,3), чем в протопластах в целом (17), концентрация глутатиона восстановленного превышала концентрацию окисленной формы (Dietz et al., 1992). В то же время на сегодняшний день установлено, что в вакуоли растительных клеток глутатион транспортируется либо в окисленной форме, либо в виде глутатионовых конъюгатов (Foyer et al., 2001). По поводу физиологической роли транспорта окисленного глутатиона преобладают два мнения. Согласно первому, перенос окисленного глутатиона в вакуоль необходим для поддержания редокс-гомео-стаза в цитозоле, особенно в условиях стресса (Foyer et al., 2001). Вторая точка зрения основана на том, что дисульфид глутатиона является менее реакционноспособной молекулой и потому окисленная форма более предпочтительна для транспорта (Noctor et al., 2011). Тем не менее, восстановление глутатиона под действием глутатионредуктазы в вакуолях ранее не обсуждалось (Noctor et al., 2011), и GR вакуолей отдельно до сих пор не исследовалась. Так, как в нашем случае содержание восстановленного глутатиона в вакуолях значительно превышало содержание окисленной формы, предстояло установить присутствие GR в данном компартменте.

Глутатионредуктаза является флавопротеиновой оксидоредуктазой, которая катализирует восстановление глутатионового дисульфида (GSSG) до сульфгидрильной формы (GSH), используя в качестве восстановителя НАДФН/НАДН.

В ходе проведенного исследования в вакуолях была определена довольно высокая GR-активность. Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемой реакции, исследования проводили в сравнении с пластидами и тканевым экстрактом, присутствие GR в которых не вызывало сомнения (Edwards et al., 1990; Madamanchi et al., 1992).

В наших образцах уровень активности, определяемый спектрофотометрически, был выше в пластидах (рис. 3), что согласуется с литературными данными о том, что до 80 % клеточной активности GR принадлежит хлоропластным изоформам (Edwards et al., 1990; Yousuf, 2012). Однако уровень активности GR вакуолей был также достаточно высок и превышал общетканевой (рис. 3), хотя из полученных ранее результатов было известно лишь о следовой активности GR в вакуолях протопластов листьев ячменя, где она составляла примерно 1 % от суммарной активности GR протопласта (Rautenkranz et al., 1994). В целом уровень активности GR из разных компартментов клеток корнеплодов столовой свеклы был сопоставим с данными об активности этого фермента у других видов растений: от 30 до 150 нмоль

of S

I n

s e

< X

160 140 120 100 80 60 40 20 0

1 —

ж Ж т —

вакуоли

экстракт пластиды ткани

Рисунок 3. Активность глутатионредуктазы во фракциях вакуолей,пластид и в экстракте ткани.

-О

с;

о Е

НАДФН/мг белка/мин в листьях томата (Kuzniak, Sklodowska, 2001); от 35 до 55 нмоль НАДФН/мг белка/мин в проростках кукурузы (Edwards et al., 1990).

Как показали дальнейшие исследования, активность GR вакуолей зависела от стадии развития корнеплода и возрастала почти в 2 раза на поздней стадии покоя (рис. 4), когда в корнеплодах столовой свеклы с одной стороны наблюдается возобновление ростовых процессов, а с другой - поражение корнеплодов грибковыми и бактериальными патогенами. Старение тканей, как правило, сопровождается окислительным стрессом, что связано с нарушением баланса и компартментации окислительно-восстановительных реакций в клетке (del Rio et al., 1998), такие изменения возможны и при длительном хранении корнеплодов. В то же время участие GR в ответах растений на окислительный стресс подтверждается множеством сообщений о высокой активности глутатионредуктазы в устойчивых к стрессу и трансгенных растениях со сверхэкспрессией GR (Liu et al., 2012; Yousuf, 2012). Например, известно, что GR активность в листьях повышается при увеличении концентрации кислорода, низкой температуре, засухе, обработке гербицидами и воздушными поллютанта-ми (Kubo et al., 1993; Edwards et al., 1994). Также сообщалось о значительном повышении активности GR после заражение листьев томата возбудителем серой гнили Botrytis cinerea (до 211 %) (Kuzniak, Sklodowska, 2001).

Для GR из разных организмов характерна ярко выраженная зависимость активности фермента от условий pH и природы пиридиннуклеотида. Большинство изоформ GR растений обладают высоким сродством к НАДФН (<10 мкМ), хотя в качестве донора электронов могут также использовать НАДН, несмотря на то, что сродство к этому пиридиннуклеотиду ниже в десятки раз (Halliwell, Foyer, 1978). При этом оптимальными условиями pH для реакции с НАДФН являются нейтральные и слабощелочные (Halliwell, Foyer, 1978; Hausladen, Alscher, 1994a; Kubo et al., 1993), а для реакции с НАДН - кислые (Halliwell, Foyer, 1978). Результаты наших экспериментов подтвердили эту зависимость (рис. 5). Реакции восстановления дисульфида глутатиона в наших образцах протекали более активно с НАДФН при pH 7,0-8,0, а с НАДН - при pH 5,0. Однако даже при оптимальных условиях реакция с НАДН протекала в среднем в 4-5 раз медленнее, чем с НАДФН, что объясняется меньшим сродством фермента к НАДН.

160 I 140

-i120 о аИоо

80 60 40 20 0

_ □ вакуоли _ Оэкстракт ткани

1 -

- пЬ 1 1

стадия роста

поздняя стадия покоя

стадия глубокого покоя

Рисунок 4. Активность глутатионредуктазы вакуолей, пластид и экстракта ткани на разных стадиях развития корнеплода.

2 —А—экстракт ткани^ 135

Si 00 ■ * пластиды / m

- ё / of S

ее ,2 / п

0^80- / j jg 25

si60" / ^ 1|20

ä 40 • # J* £ х

< ^ т ^У У ё 10

¡20- -* |5

pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0 pH 8.0

Рисунок 5. Зависимость активности глутатионредуктазы экстракта корнеплодов столовой свеклы от условий рН (слева) и 0,1 мМ НАДН (справа).

В— вакуоли

экстракт ткани пластиды

pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0 pH 8.0

вакуолей, пластид и тканевого в присутствии 0,1 мМ НАДФН

Исследование GR-активности при разных концентрациях GSSG показало ярко выраженную концентрационную зависимость, которая соответствовала зависимости Михаэлиса-Ментен. При расчете Km и Vmax для GSSG было установлено, что кинетические параметры GR вакуолей, пластид и тканевого экстракта были сопоставимы (табл. 2). Однако Vmax была наивысшей у фермента из обогащенной фракции пластид на обеих стадиях развития корнеплода. Вакуолярный фермент также показал достаточно высокую Vmax, в то время как максимальная скорость фермента тканевого экстракта была в 1,5-2,0 раза меньше, чем Vmax GR вакуолей и в 2,5-4,0 раза меньше, чем Vmax GR пластид. Таким образом, данные по Vmax для ферментов разной локализации строго коррелируют с уровнем активности GR в данных компартментах. В то же время на поздней стадии покоя Vmax ферментов вакуолей и тканевого экстракта возрастала в 2-3 раза, что, однако, не было связано с изменением значений Km, так как константы Михаэлиса ферментов различались незначительно и соответствовали данным литературы, из которых известно, что кажущиеся и истинные значения Km для GSSG варьируют в довольно широких пределах - от 15 до 200 мкМ (Halliwell, Foyer, 1978; Anderson et al., 1990; Edwards et al., 1990; Kubo et al., 1993; Chalapathi Rao, 2008). Более объективным показателем сродства фермента к субстрату можно считать кинетическую константу первого порядка (Vmax/Km).

Таблица 2. Кинетические параметры глутатионредуктазы вакуолей, пластид и экстракта ткани корнеплодов столовой свеклы на разных стадиях покоя

Объект исследования Стадия глубокого покоя Поздняя стадия покоя

Km, мкМ Vmax, мкМ GSSG мин-1 Vmax/ Km Km, мкМ Vmax, мкМ GSSG мин"1 Vmax/ Km

Вакуоли 13,1 ± 2,1 41,8 ± 10,1 3,19 16,2 ± 2,9 113,4 ± 18,5 7,0

Пластиды 22,8 ± 3,6 114,5 ± 11,2 5,02 24,7 ±5,8 157,2 ± 27,8 6,36

Экстракт ткани 15,7 ±2,3 28,4 ± 5,7 1,8 20,6 ± 4,9 60,9 ±9,2 2,96

Сопоставление значений Vmax/Km показало, что набольшим сродством к вЗвв на стадии глубокого покоя, по всей видимости, обладал фермент из обогащенной фракции пластид (табл. 2). С увеличением активности на поздней стадии покоя заметно

возросло также сродство к субстрату у ОЯ из вакуолярной фракции (константа Ушах/ Кш повысилась почти в 2 раза и несколько превысила Утах/Кт фермента пластид). В то же время СЯ тканевого экстракта показала наименьшее сродство к вЗвО на обеих стадиях развития.

Специфических природных ингибиторов или активаторов для ОЯ не обнаружено. Установлен ингибирующий эффект на активность фермента нитрофуранов и 1 -хлор-2,4-динитробензола (ХДНБ) (ВПгег й а1., 1984). В вязи с этим мы исследовали влияние ХДНБ на активность ОЯ вакуолей, пластид и экстрактов тканей. При добавлении ХДНБ в реакционные среды происходило выраженное ингибирование ферментативной активности, которое зависело от концентрации Оввй (табл. 3). Таблица 3. Кинетические параметры глутатионредуктазы вакуолей, пластид и экстракта ткани корнеплодов столовой свеклы в контрольных условиях

и в присутствии ингибитора

Объект исследования Контроль ХДНБ (2 мМ)

Km, мкМ Vmax, мкМ мин 1 Km, мкМ Vmax, мкМ мин-1

Вакуоли 16,2 ±2,9 113,4 ± 18,5 16,3 ± 1,6 78,7 ±6,9

Пластиды 24,7 ± 5,8 157,2 ± 27,8 22,8 ± 0,5 78,3 ± 3,1

Экстракт ткани 20,6 ± 4,9 60,9 ± 9,2 21,1 ±2,9 36,7 ± 6,1

Расчет кинетических параметров показал значительное снижение максимальной скорости как у вакуолярной GR, так и у изоферментов пластид и тканевого экстракта. Однако несмотря на снижение скорости реакций, сродство к субстрату у GR всех исследуемых объектов оставалось прежним. Это указывает на неконкурентный тип ингибирования, что было также продемонстрировано на глутатионредуктазе животных с ХДНБ (Bilzer et al., 1984).

Специфичность GR-активности, обнаруженной в тканевом экстракте и фракциях вакуолей и пластид, была подтверждена зимографическим методом, т.е. визуализацией ферментативной активности в ПААГ после электрофореза белков в неденатурирующих условиях. В результате проведенного исследования во всех образцах были выявлены по две изоформы GR (данные представлены в диссертации). Также было проведено зимографическое исследование активности фермента после изоэлектрофокусирования

белков в ПААГ (рис. 6, а). Как видно из рисунка, во фракциях вакуолей, пластид, а также в тканевом экстракте присутствовало по 2 изоформы фермента, которые раздваивались в силу особенностей метода. Все выявленные изоформы располагались в области рI ~ 4,0-5,0, что близко к значениям, полученным для других видов растений, у которых было обнаружено от 2 до 8 изо-форм этого фермента разной локализации с р/от 4,1 до 4,9 (Edwards et al., 1990; Anderson et al., 1995; Marty et a!., 2009).

Присутствие двух изоформ также подтвердилось результатами вестерн-блот анализа с антителами, полученными на

экстракт

контроль вакуоли ткани пластиды pi

3,75

4,55

Щ ш - if ф ш -

w 5,«5

7,35

аб абаб абм

Рисунок в. Активность глутатионредуктазы вакуолей, пластид и тканевого экстракта с ДТНБ после изоэлектрофокусирования белка в ПААГ (а) и вестерн блоттинг после разделения белка методом ИЭФ (б). Кон-

тпш__па ппп^щой

GR пекарских дрожжей (Sigma) (рис. 6, б). Так как способ получения экстракта ткани предполагал, что он не включает содержимое двумембранных органелл, можно предположить, что в корнеплодах столовой свеклы присутствует 4 изоформы GR, две из которых содержатся в пластидах и две в вакуолях. Последние также определяются в тканевом экстракте, состоящем преимущественно из вакуолярного сока. Однако в отличие от предыдущих исследований, проводимых на проростках кукурузы и листьях гороха, где хлоропластные изоформы значительно отличались от цитоплазматических и митохондриальных по характеру разделения в ПААГ и при ИЭФ (Anderson et al., 1995; Edwards et al., 1990), изоформы GR пластид корнеплодов столовой свеклы не показали существенных отличий от вакуолярных по электроподвижиости, т.е. по молекулярной массе, и практически не отличались зарядом полипептида. Сходство в электроподвижности и взаимодействие с антителами указывает на то, что вакуолярные изоформы GR близки по первичной и третичной структуре не только аналогичным изо-формам пластид, но и ферменту дрожжей. Высокая гомология GR разных организмов считается отличительной особенностью этого фермента (Contour-Ansel et al., 2006).

Проведенные исследования подтверждали специфичность ферментативной активности GR, однако важным вопросом оставалось присутствие в вакуолях пири-динну клеотидов, необходимых для активности фермента. Так как НА ДФН образуется преимущественно в анаболических путях, мы предположили, что в вакуолях может присутствовать НАДН, более распространенный в клеточных компартментах и восстанавливающийся в катаболических путях. Также в пользу этого предположения говорит кислая вакуолярная среда, в которой активность GR с НАДН выше, чем в щелочных условиях. Мы исследовали спектрофотомегрическим методом содержание НАД восстановленного и окисленного во фракциях вакуолей, пластид и в тканевом экстракте (рис. 7), в результате чего обнаружили в вакуолях микромолярные количества НАД+, сопоставимые с содержанием в тканевом экстракте, но гораздо меньшие, чем в обогащенных фракциях пластид. В то же время количество восстановленного НАД мало отличалось в разных компартментах и было крайне низким, что соотносится с литературными данными (Igamberdiev, Gardestrom, 2003; Queval, Noctor, 2007) и может быть связано с тем, что НАДН в клетках находится преимущественно в связанной с белками форме (Heber, Santarius, 1965).

вакуоли экстракт пластиды ткани

Рисунок 7. Концентрация НАДН (справа) и НАД+ (слева) в вакуолях, пластидах и экстрактах ткани корнеплодов столовой свеклы, мкМ/мг белка.

Таким образом, в вакуолях может присутствовать небольшое количество свободного НАДН, сопоставимое с количеством в пластидах и в тканевом экстракте в целом, что указывает на возможность восстановления окисленного глутатиона вакуолярной (Ж, хотя и с гораздо меньшей эффективностью, чем при использовании НАДФН в качестве кофермента. Восстановленный глутатион может использоваться для нейтрализации внутривакуолярных АФК или для конъюгации с ксенобиотиче-скими или эндогенными соединениями, пересекающими тонопласт в силу своей гидрофобности. Открытыми остаются вопросы о восстановлении НАД+в вакуолях и его транспорте в этот компартмент.

Пероксид водорода

Обнаруженный в вакуолях корнеплодов столовой свеклы глутатион наряду с другими антиоксидантами способен регулировать содержание пероксида водорода, продуцируемого в вакуолях или депонируемого в них при окислительном стрессе. Ранее в вакуолях корнеплодов столовой свеклы обнаружены ферменты, способные продуцировать АФК: Си,7п-супероксиддисмутаза, катализирующая дисмутацию супероксид-радикалов с образованием пероксида водорода (Прадедова и др., 2009), и фенолзависимая пероксидаза, обладающая оксидазной (тирозиназной) активностью ■и способная также продуцировать АФК (Прадедова и др., 20136). В настоящее время АФК-генерирующая активность этих ферментов подробно исследована в апопласте (ВоКусИ й а!., 1999; 1л е1 а1., 2010). Что касается вакуолей, то данная активность обсуждается только в рамках гипотетических процессов (Епс1е, УаПиги, 2009). Поэтому до сих пор доминирует представление, согласно которому Н202 транспортируется в вакуоль и этот транспорт становится особенно интенсивным при окислительном стрессе (Реггсгсз еХ а1., 2011).

Содержание Н202 в вакуолях корнеплодов столовой свеклы ранее не исследовалось, поэтому необходимо было установить его наличие в данном компартменте и определить относительную концентрацию. Это имело особое значение в случае корнеплодов, которые длительный период находились под воздействием пониженных температур и других стрессирующих факторов (таких как обезвоживание, патогенез), что, согласно сложившимся представлениям, приводит к развитию окислительного стресса и сопровождается увеличением концентрации активных форм кислорода. По результатам исследования можно говорить о том, что концентрация Н202 в вакуолярном, пластидном и тканевом экстрактах составляла примерно 50 нмоль/мг белка (данные представлены в диссертации). Однако следует отметить, что так как процедуры выделения органелл и получения экстрактов вакуолей и пластид занимают достаточно много времени, определяемый уровень Н202 отражает скорее динамическое равновесие между процессами его образования и нейтрализации, осуществляемыми ферментативными и низкомолекулярными системами данных компартментов. Так как в вакуолях корнеплодов столовой свеклы были определены микромолярные концентрации глутатиона (табл. 1) и наномо-лярные концентрации Н202, то можно предположить, что глутатион функционирует в рамках антиоксидантной системы вакуолей, эффективно нейтрализуя Н202, локально генерируемый или диффундирующий в вакуоли из других клеточных компартментов.

Глутатион Б-трансферазы

Глутатион-Б-трансферазы — суперсемейство мультифункциональных белков, которые катализируют конъюгацию электрофильных эндобиотических и ксенобиоти-ческих соединений с С8М. Получившиеся в результате глутатионовые 8-конъюгаты,

как правило, растворимы в воде и менее токсичны, и у растений подвергаются депонированию из-за отсутствия эффективных систем выделения. Помимо конъюгиру-ющей активности некоторые GST обладают глутатионпероксидазной и изомеразной активностью, а также могут функционировать в качестве лигандина, неферментативно связывая различные соединения.

Активность GST вакуолей, пластид и тканевого экстракта определяли спектрофо-тометрическим методом с двумя субстратами: наиболее широко используемым ХДНБ и гербицидом флуородифеном (рис. 8). С ХДНБ глутатион-8-трансферазная активность в вакуолях была сопоставима с активностью в пластидах и тканевом экстракте. В то же время активность с флуородифеном значительно превышала GST-активность фракции пластид и была сопоставима с активностью тканевого экстракта.

170

m 60

ь §50

сп ю

сэ л ^ 40

Б о x 30

X m s ^ 20

£ M c;

< I 10

s 0

! sSS 1 T

¡1 1 1 n

1 1

ь- *

W С £ s

< 2

1 1 1 1

—

вакуоли пластиды тканевой вакуоли пластиды экстракт

экстрат ткани

Рисунок8. Глутатион-З-трансферазная активность вакуолей, пластид и тканевого экстракта с 1-хлор-2,4-динитробензолом (слева) и с флуородифеном (справа).

Специфическая активность GST с разными субстратами является характеристикой отдельных изоформ фермента, локализованных в разных тканях или экспрессирующих-ся в разных условиях (Marrs, 1996; Dixon et al., 1998a). Из полученных нами данных очевидно, что пластидная популяция ферментов отличается от вакуолярной и общетканевой по субстратной специфичности. Более низкую конъюгирующую активность пластидных GST с флуородифеном можно объяснить тем, что гаутатион-Я-трапсферазы пластид обладают более узкой субстратной специфичностью по отношению к ксено-биотическим соединениям. Возможно, GST пластид участвуют не столько в процессах детоксикации экзогенных токсичных соединений, сколько необходимы для конъюгации с глутатионом эндогенных метаболитов, образующихся в пластидах под действием АФК или во время активных биосинтетических процессов.

Известно, что активность GST проявляет зависимость от условий рН. Оптимальными условиями для GST вакуолей с ХДНБ в качестве субстрата были рН 7,0-7,5, а для пластид и тканевого экстракта — рН 7,5 (рис. 9). Следует отметить, что при рН 7,0, оптимальном для GST вакуолей, активность изоферментов пластид снижалась практически в 3 раза, что также подтверждает отличие популяций GST из разных ком-партментов клетки. Установлено, что оптимумы рН для GST из других растительных объектов варьировали в пределах 7,0-8,0 (Irzyk, Fuerst, 1993; Gronwald, Plaisance, 1998; Pascal, Scalla, 1999; Zeng et al., 2005), хотя встречаются сообщения о более низких

200 180

■а 160

| 140

* X s ¡120

|a'S и»

C9 * £ § 80

о 60 x s

f 40 < 20

-вакуоли -экстракт ткани - пластиды

6 6,5 7 7,5 8 Рисунок 9. Зависимость активности глута-тион-Э-трансфераз вакуолей, пластид и экстракта ткани от условии рН.

140

Рост Стадия Поздняя глубокого стадия покоя покоя Рисунок 10. Активность глутатион-З-транс-фераз в вакуолях и тканевом экстракте корнеплодов столовой свеклы на разных стадиях онтогенеза с ХДНБ.

вакуоли пластиды тканевой экстрат

Рисунок 11. Ингибирование глутатион-Б-трансферазной активности вакуолей, пластид и тканевого экстракта этакриновой кислотой (0,5 мМ).

значениях рН для оптимальной активности некоторых изоформ фермента (Deng et al., 1996; Deng, Hatzios, 2002). Предполагается, что рН-оптимум фермента также зависит от используемого субстрата и сродства фермента к нему (Deng, Hatzios, 2002).

GST-активность вакуолей изменялась в зависимости от стадии развития и была наибольшей на стадии активного роста (рис. 10), что может быть связано с участием фермента вакуолей в деток-сикации цитотоксичных эндогенных соединений, возникающих в процессе активного метаболизма. Незначительные изменения в активности GST тканевого экстракта говорят о стабильном уровне суммарной активности, однако изменение количества изоформ, их состава и активности в отдельных компартментах клетки (вакуолях, цитозоле, ядре, перок-сисомах и т.п.) могут происходить, не влияя на суммарную активность ферментов тканевого экстракта в целом. Снижение активности вакуолярных изоформ на стадии глубокого покоя и некоторое повышение их активности на последней стадии покоя свидетельствует о том, что изоферменты этого компартмента регулируются в зависимости от изменений в метаболизме корнеплода и подтверждает их роль в детоксикации токсичных соединений, накапливающихся в активно функционирующей клетке.

Еще одним субстратом GST являет ся этакриновая кислота (ЭК) - производное фенилуксусной кислоты, которое содержит электрофильную группу, подобную а-Р-алкеналям, генерируемым в растительных клетках при окислительном стрессе (Kilili et al., 2004). В сочетании с ХДНБ этакриновая кислота проявляет свойства ингибитора. В наших исследованиях ЭК (0,5 мМ) подавляла реакции с ХДНБ более, чем на 90 % (рис. 11). Результаты по разным компартментам варьировали незначительно. Как было

отмечено и для ферментов, выделенных из растений других видов (Droog et al., 1995; Pascal, Scalla, 1999), для GST корнеплодов столовой свеклы ЭК оказалась сильным ингибитором, конкурируя с ХДНБ за активный центр или воздействуя на аллостерический сайт фермента (Phillips, Mantle, 1991).

ХДНБ не является природным субстратом фермента, что определяет низкое сродство к нему GST. При исследовании кинетических параметров с ХДНБ для GST вакуолей, пластид и тканевого экстракта корнеплодов столовой свеклы были получены довольно высокие значения константы Михаэлиса (табл. 4), что соответствовало полученным ранее данным, согласно которым кажущееся значение Km для ХДНБ могут варьировать от 0,12 до 4,5 мМ, а для GSH- от 0,12 до 0,6 мМ (Dixon et al., 19986; Gron-wald, Plaisance, 1998; Pascal, Scalla, 1999; Deng, Hatzios, 2002). Однако если учитывать такую характеристику фермента, как Vmax/Km, то наибольшее сродство к ХДНБ и GSH проявляли GST вакуолей и тканевого экстракта, а наименьшее — ферменты пластид (табл. 4). Более высокое значение константы Vmax/Km может свидетельствовать о том, что суммарно ферменты с конъюгирующей активностью количественно преобладают над GSTc пероксидазной или изомеразной активностями. Таким образом, вакуолярные изоформы, показывающие достаточно высокую конъюгирующую активность с разными субстратами (рис, 8) и высокое сродство к ХДНБ, являются более вероятными кандидатами на активное участие в процессах детоксикации как ксенобиотических, так и эндогенных метаболитов, чем ферменты фракции пластид.

Таблица 4. Кинетические характеристики GST из вакуолей, пластид

и тканевого экстракта корнеплодов столовой свеклы

ХДНБ GSH

исследования Km, Vmax, Vmax/ Km, Vmax, Vmax/

мкМ мкМ/мин Km мкМ мкМ/мин Km

Вакуоли 295,62 ±63,35 75,07 ±11,7 0,26 130,23 ± 12,34 120,50 ± 18,3 0,93

Пластиды 134,52 ±28,1 13,75 ± 1,51 0,102 112,18 ± 21,19 62,62 ± 10,93 0,56

Экстракт ткани 407,08 ±43,3 95,51 ±4,4 0,23 167,28 ±23,2 126,54 ± 126,54 0,75

Изоферментный состав GST вакуолярной и пластидной фракций, а также тканевого экстракта исследовали при помощи зимографического метода выявления активности в полиакриламидном геле (рис. 12). Изоферментный состав GST варьировал в зависимости от используемого субстрата. Контрольный вариант не содержал ни ХДНБ, ни гербицидов (рис. 12, а). При этом с GSH без второго субстрата наблюдали неспецифическое окрашивание, которое указывало на присутствие других глутатион-зависимых ферментов. При добавлении ХДНБ, глифосата или флуородифена появлялись одна или две изоформы GST, специфичные к используемому субстрату (рис. 12, б, в, г). В присутствии ХДНБ и ЭК число полос сокращалось и оставалась только неспецифическая активность, что также указывало на ингибирование фермента этакриновой кислотой (рис. 12, д). По результатам зимографического исследования можно говорить о 1 -2 изо-формах GST вакуолей и 3 изоформах пластид с разной субстратной специфичностью. В тканевом экстракте также присутствовали изоформы, не относящиеся к пластидным и локализованные, вероятно, в вакуолях, цитозоле, пероксисомах или ядрах. Следует отметить, что в вакуолях были продемонстрированы изоформы GST, активные по отношению ко всем использованным субстратам, два из которых являются гербицидами.

Присутствие GSTs в вакуолях, специфичность активности которых подтверждена спектрофотометрическим и зимографическим методами, указывает на вклад

Рисунок 12. Активность GST вакуолей, пластид и экстрактов ткани в полиакриламидном геле: а - с глутатионом, б - с глутатионом и ХДНБ, в - с глутатионом и глифосатом, г - с глутатионом и флуородифеном, д - с глутатином, ХДНБ и этакриновой кислотой. Негативное изображение.

центральной вакуоли в процессы детоксикации ксенобиотиков и эндогенных метаболитов и обеспечении нормальной жизнедеятельности растительных клеток.

Содержание аминокислот

Согласно сложившимся на сегодняшний день представлениям, глутатион транспортируется в вакуоль в дисульфидной форме главным образом для дальнейшей деградации. Таким образом контролируется редокс-соотношение глутатиона в цитозоле и редокс-статутус цитоплазмы клетки в целом (Foyer et al. 2001 ; Noctor et al., 2011). Для деградации глутатиона в растениях было предложено два механизма. Первый включает отщепление глутамата с образованием цистенилглицина, катализируемое у-глутамилтранспептидазами (GGT) (Ohkamu-Ohtsu et al., 2009). Второй начинается с отщепления глицина и катализируется карбоксипептидазой или фитохелатинсинтазой (Beck et al., 2003; Wolf et al., 1996), в результате чего образуется у-глутамилцистеин. При этом последовательность реакций, приводящая к гидролизу глутатиона у растений, может быть видоспецифичной (Martin, Slovin, 2000). В вакуолях A. thaliana была обнаружена GGT4 (Ohkama-Ohtsu et al, 20076), а в вакуолях ячменя - карбок-сипептидаза (Wolf et al., 2006), которые предположительно также могут участвовать в деградации глутатионовых конъюгатов.

Вопрос о деградации глутатиона в вакуолях столовой свеклы до сих пор не исследовался. В связи с этим было решено определить в вакуолях концентрацию свободных аминокислот, входящих в состав глутатиона. В результате было установлено, что в вакуолях накапливается значительное количество глутаминовой кислоты (в среднем 1 мкМ), некоторое количество глицина и цистеина в окисленной форме (цистина, цистеиновой кислоты) (в среднем 0,250 мкМ) (данные представлены в диссертации). Обращало на себя внимание то, что концентрация восстановленного глутатиона в вакуолях была на два-три порядка выше, чем концентрация входящих в его состав аминокислот.

Несмотря на то, что в последнее время в литературе широко обсуждается возможность деградации глутатиона в вакуолях, концентрационное соотношение глутамат : глицин : цистеин (с учетом того, что в состав цистина входит две молекулы цистеина), соответствующее в данном компартменте 5:1:2, не может служить фактическим подтверждением этого предположения. Кроме того, следует отметить,

что глутамат при деградации глутатионовых конъюгатов и дисулт>фида глутатиона у-глутамилтранспептидазами может переноситься на другие соединения с образованием ди- и трипептидов (Ohkamu-Ohtsu et al., 2009). Это указывает на то, что более предпочтительным является иной путь поступления глутамата в вакуоль. Следует отметить, что в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы было обнаружено высокое содержание глутамина, а также аспарагина, аланина, серина и аргинина (данные представлены в диссертации). Таким образом, можно предположить, что глутамат не имеет отношения к деградации глутатиона, а транспортируется через тонопласт или образуется из глутамина и накапливается в вакуолях наряду с другими аминокислотами в качестве пула свободных аминокислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Центральная вакуоль растительной клетки является мультифункциональным ком-партментом. Классическими функциями, определившими классификацию вакуолей в клетках растений, считаются запасание различных метаболитов и лизис (Полевой, 1989). В последние годы также обсуждается участие вакуоли в таких процессах, как поддержание клеточного гомеостаза, редокс-защита и детоксикация ксенобиотиков (Андреев, 2012; Carter et al., 2004; Ende, Valium, 2009). Тем не менее, вакуоль по-прежнему рассматривают как пассивный компартмент, необходимый для депонирования выведенных из метаболизма соединений (GSH-конъюгатов с ксенобиотиками и т.п.) или для накопления антиоксидантов (аскорбата, сахарозы, фруктанов, фенолов), которые служат для детоксикации проникающего через тонопласт пероксида водорода (Андреев, 2012; Ferreres et al., 2011). Однако на сегодняшний день уже накоплено достаточное количество данных, свидетельствующих в пользу довольно высокой метаболической активности вакуолей. Так, в вакуолях выявлены ферменты, способные выполнять как антиоксидантные, так и прооксидантные функции (фенол-зависимая пероксидаза и Си,2п-супероксиддисмутаза) (Kristensen et al., 1999; Carter et al., 2004; Прадедова и др., 2009, 2011). В связи с этим можно полагать, что вакуолярный компартмент служит не только для детоксикации поступающих в него АФК, но также способен продуцировать пероксид водорода, который с одной стороны может вовлекаться в окислительную модификацию транспортируемых в вакуоль соединений, а с другой стороны пересекать тонопласт и поступать в цитозоль. Для предотвращения неконтролируемого выхода Н202 в цитозоль, в вакуолярном компартменте должны присутствовать антиоксидантные системы, регулирующие концентрацию локально генерируемых АФК и не образующие при этом активных радикалов (как это происходит в случае Сахаров и фенолов) и в тоже время способные быстро регенерировать восстановленное состояние. Таким требованиям соответствует редокс-система глутатиона, которая в других клеточных компартментах участвует в антиоксидантной защите, детоксикации ксенобиотиков и эндотоксинов, а также выполняет сигнальную функцию (Noctor et al., 2011). В вакуолях корнеплодов столовой свеклы мы выявили такие компоненты редокс-системы глутатиона, как сам глутагион, глутатионредуктаза и глутатион-8-трансфераза. В ходе проведенного исследования мы установили, что соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона, активность и кинетические характеристики GR и GST соответствовали таковым глутатиона и ферментов пластид, характерной особенностью которых является высокая активность системы глутатиона (Полесская, 2009; Noctor et al., 2011).

На сегодняшний день наиболее популярна гипотеза, согласно которой основной метаболический путь глутатиона внутри вакуолей - деградация (рис. 13). Эта гипотеза основывается на приоритетности транспорта в вакуоль окисленной формы глутатиона посредством ABC-транспортеров тонопласта. Подкрепляют ее и факгы, демонстрирующие присутствие в вакуолях ферментов, катализирующих распад глутатиона (у-глутамилтранспептидазы или карбоксипептидазы) ( Wolf et al., 1996; Ohkamu-Ohtsu et al., 2009). Однако в нашем исследовании значительное содержание глутатиона, сопоставимое с концентрацией в тканевом экстракте и превышающее содержание глутатиона в пластидах, а также крайне восстановленное состояние глутатионового пула вакуолей и присутствие глутатион-зависимых ферментов свидетельствуют о том, что в вакуолях столовой свеклы транспортируемый глутатион не подвергается полному распаду, а, по всей видимости, восстанавливается специфичными GR и используется в реакциях детоксикации HjOj, экзо- и эндотоксинов (рис. 13). В то же время значительное содержание глутатиона и высокая активность глутатион-зависимых ферментов в вакуолях запасающей паренхимы корнеплодов столовой свеклы могут быть связаны с особенностями данного объекта исследования, который способен противостоять длительному воздействию стрессирующих факторов (пониженной температуры, водного дефицита и т.п.) и возобновлять ростовые процессы после продолжительного периода покоя. Поэтому наблюдаемая в нашем исследовании высокая активность компонентов глутатионовой системы, не обнаруженная в некоторых органах и тканях других растительных объектов (Dietz et al., 1992; Rautenkranz et al., 1994), может быть как видо-, так и органо- или тканеспецифичной.

онредуктаза; GST - глутатион-5-трансфераза; РОХ - пероксидаза; Cu,Zn-SOD - Cu,Zn-супероксиддисмутаза.

выводы

Полученные в ходе проведенного исследования результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. В вакуолях корнеплодов столовой свеклы показано присутствие компонентов редокс-системы глутатиона: самого глутатиона, глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы.

2. Глутатион в вакуолях содержится в микромолярных количествах и преимущественно в восстановленном состоянии, что соотносимо с содержанием глутатиона в тканевом экстракте и превышает его содержание в обогащенной фракции пластид корнеплодов столовой свеклы.

3. Активность, а также кинетические характеристики изоформ GR вакуолей сопоставимы с активностью и характеристиками аналогичных изоформ пластидной фракции. рН условия, оптимальные для активности вакуолярного фермента с НАДФН в качестве кофактора, находятся в нейтральной и слабощелочной области (7,5-8,0). GR вакуолей проявляет активность с НАДН в качестве кофактора в кислых условиях, при этом оптимальным для реакции является рН 5,0. Кроме того, в вакуолях показано присутствие НАДН в микромолярных количествах, однако вакуолярный пул, также, как и пластидный и общий тканевой, в большей степени окислен. GR вакуолей, как и фермент пластид, ингибируется 1-хлор-2,4-динитробензолом по неконкурентному типу. В вакуолях обнаружено 2 изоформы GR, которые, предположительно, также присутствуют в тканевом экстракте. В пластидной фракции также обнаружены 2 изоформы глутатионредуктазы.

4. Активность глутатион-8-трансферазы с ХДНБ в качестве субстрата сопоставима с GST-активностыо пластид, в то время как активность вакуолярного фермента с флуородифеном в качестве субстрата значительно превышает аналогичную активность пластид, но соотносима с тканевой GST-активностью. Оптимальные значения рН для вакуолярных изоформ GST находятся в области 7,0-8,0. Этакриновая кислота, соединение, которое также может служить субстратом для GST, является сильным ингибитором глутатион-Б-трансферазной активности вакуолей и пластид. Кинетические характеристики вакуолярных изоформ GST сопоставимы с характеристиками изоформ пластид с более высоким сродством к природному субстрату глутатиону и меньшим сродством к ХДНБ в обоих случаях. В вакуолях выявлено 2 изоформы GST с разной субстратной специфичностью к ХДНБ, глифосату и флуородифену.

5. Активность GR и GST вакуолей изменялась в зависимости от стадии развития корнеплода, при этом активность антиоксидантного фермента GR повышалась на поздней стадии покоя, а активность GST, участвующей в детоксикации ксенобиотиков или эндогенных метаболитов, была выше на стадии роста.

6. Аминокислотный анализ показал в вакуолях корнеплодов столовой свеклы значительное содержание глутаминовой кислоты и гораздо меньшую концентрацию глицина и цистеина в окисленной форме (цистина).

7. Полученные данные, вероятно, могут указывать на участие редокс-системы глутатиона в антиоксидантной защите и процессах детоксикации, происходящих в вакуолях корнеплодов столовой свеклы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Прадедова Е.В., Ишеева О.Д., Трухан И.С.. Саляев Р.К. Образование перекиси водорода в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы // Материалы III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений». Казань (28 июня - 1 июля 2011 г.).-С. 146-148.

2. Прадедова Е.В.. Трухан И.С.. Ишеева О.Д.. Саляев Р.К. Редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы // Материалы VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 4—10 июля 2011 г.).-Н. Новгород, 2011.-Т. 2.-С. 574-575.

3. Прадедова Е.В., Трухан И.С.. Нимаева О.Д., Саляев Р.К. Детоксикация - одна из основных функций центральной вакуоли клеток растений И Всероссийская научная конференция с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2-6 июня 2013 г.). - М., 2013. - С. 150.

4. Прадедова Е.В., Трухан И.С.. Нимаева О.Д., Мурач У.А., Саляев Р.К. Вакуоль как главное звено системы детоксикации растительной клетки // Всероссийская научная конференция «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 10-13 июня 2013 г.). - Иркутск, 2013. - С. 200-203.

5. Трухан И.С.. Прадедова Е.В., Нимаева О.Д., Саляев Р.К. Редокс-система глутатиона вакуолей и пластид клеток корнеплодов столовой свеклы // Всероссийская научная конференция «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 10-13 июня 2013 г.). - Иркутск, 2013. - С. 203-207.

6. Прадедова Е.В., Трухан И.С.. Нимаева О.Д., Саляев Р.К. Механизмы вакуолярной детоксикации, на примере вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) II Материалы I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 17-20 сентября 2013 г.). - Казань, 2013. - С. 49.

7. Прадедова Е.В., Трухан И.С.. Нимаева О.Д., Саляев Р.К. Образование пероксида водорода в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы // ДАН. - 2013. - Т. 449, № 5. -С. 614-617.

8. Трухан И.С.. Прадедова Е.В., Нимаева О.Д., Саляев Р.К. Глутатион и птутатин-редуктаза вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы II Вестник ИрГСХА. — 2013. -Вып. 55. - С. 29-36.

9. Нимаева О.Д., Трухан И.С. Механизмы нейтрализации токсичных соединений в центральной вакуоли клеток растений // Сборник статей молодых ученых Иркутского научного центра Сибирского отделения РАН. - 2013. - Вып. 2. - С. 66-68.

Подписано в печать 04.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60x84'/,6-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0

_Тираж 100 экз. Заказ № 095-13._

РИОНЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трухан, Ирина Сергеевна, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

(

04201454118

Трухан Ирина Сергеевна

РЕДОКС-СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА ВАКУОЛЕЙ КОРНЕПЛОДОВ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ {Beta vulgaris L.)

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с. Прадедова Елена Владимировна

Иркутск - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ..............................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................9

2.1. Гл у тати он.......................................................................................................9

2.2. Биосинтез глутатиона.................................................................................10

2.3. Компартментализация глутатиона............................................................13

2.4. Функции глутатиона...................................................................................17

2.4.1. Роль глутатиона в антиоксидантной защите......................................20

2.4.2. Глутатионредуктаза..............................................................................23

2.4.3. Глутатионпероксидазы.........................................................................29

2.4.4. Участие глутатиона в детоксикации ксенобиотиков и эндогенных метаболитов. Глутатион-8-трансферазы......................................................32

2.4.5. Роль глутатиона в детоксикации альдегидов. Глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназа..........................................................................42

2.4.6. Роль глутатиона в детоксикации тяжелых металлов. Фитохелатины и фитохелатинсинтаза....................................................................................44

2.4.7. Сигнальная функция глутатиона.........................................................49

2.5. Распад глутатиона.......................................................................................54

2.5.1. Гамма-глутамилтранспептидаза..........................................................55

2.5.2. у-Глутамилциклотрансфераза и 5-оксопролиназа.............................58

2.5.3. Цистенилглициндипептидаза..............................................................59

2.6. Центральная вакуоль клеток растений.....................................................60

2.7. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования...................................................................................................66

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................68

3.1. Растительный материал..............................................................................68

3.2. Выделение органелл....................................................................................68

3.2.1. Метод выделения вакуолей.................................................................68

3.2.2. Метод выделения пластид...................................................................69

3.3. Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл...............................................................................................................70

3.4. Определение концентрации глутатиона...................................................71

3.5. Определение активности глутатионредуктазы........................................73

3.6. Определение активности глутатион-Б-трансферазы...............................74

3.7. Определение концентрации НАД+ и НАДН.............................................75

3.8. Определения пероксида водорода.............................................................76

3.9. Метод определения аминокислот..............................................................76

3.10. Метод определения белка по Бредфорд..................................................76

3.11. Получение антител....................................................................................77

3.11.1. Иммунизация мышей.........................................................................77

3.11.2. Обработка антисыворотки.................................................................77

3.12. Электрофоретические методы определения активности ферментов ..77

3.12.1. Электрофорез нативных белков........................................................77

3.12.2. Изоэлектрофокусирование белков....................................................78

3.12.3. Визуализация активности глутатионредуктазы в ПААГ...............78

3.12.4. Определение активности глутатион-Б-трансферазы в ПААГ.......79

3.12.5. Визуализация активности малатдегидрогеназы в геле...................79

3.12.6. Визуализация активности каталазы в геле.......................................79

3.13. Вестерн-блоттинг......................................................................................79

3.14. Статистическая обработка данных..........................................................80

3.15. Использованные реактивы.......................................................................80

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................81

4.1. Выделение органелл и проверка чистоты полученных фракций.........81

4.2. Содержание глутатиона в образцах..........................................................87

4.3. Глутатионредуктаза....................................................................................98

4.4. Содержание пероксида водорода............................................................120

4.5. Глутатион-Б-трансферазы........................................................................124

4.6. Содержание аминокислот.........................................................................141

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................149

6. ВЫВОДЫ.........................................................................................................152

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................154

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода;

МДГ - малатдегидрогеназа;

НАД - никотинамидадениндинуклеотид;

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат;

НСТ - нитросиний тетразолий;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПВП - поливинилпирролидон;

СОД - супероксиддисмутаза;

ФМС - феназинметасульфат;

АРХ - аскорбатпероксидаза;

Си^п-СОД - медь-цинковая супероксиддисмутаза;

DHAR, ДГАР - дегидроаскорбатредуктаза;

у-ЕС - у-глутамилцистеин;

y-ECS - у-глутамилцистеинсинтетаза;

GGC - у-глутамилциклотрансфераза;

GGT - у-глутамилтранспептидаза;

GPX или GPOX - глутатионпероксидаза;

GR - глутатионредуктаза;

GRX - глютаредоксин;

GSH - восстановленная форма глутатиона;

GSH-S - глутатионсинтетаза;

GSNO - S-нитрозоглутатион;

GSSG - окисленная форма глутатиона;

GST - глутатион-8-трансфераза;

5-OPase - 5-оксопролиназа;

ОРТ - олигопептидные транспортеры;

PHGP - фосфолипид гидропероксид глутатионпероксидаза;

PMSF - фенилметилсульфофторид;

TRX - тиоредоксин.

1. ВВЕДЕНИЕ

Глутатион - многофункциональный трипептид, обнаруженный практически у всех живых организмов (Noctor et al., 2012). У растений, продуцирующих активные формы кислорода в процессе фотосинтеза, клеточного дыхания или фотодыхания, глутатион в составе аскорбат-глутатионового цикла играет важную роль в нейтрализации Н20? (Foyer, Noctor, 2011). Помимо антиоксидантной функции глутатион участвует в детоксикации ксенобиотиков и тяжелых металлов (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998; Jozefczak et al., 2012), в трансдукции сигналов при абиотическом и биотическом видах стресса, а также является основным редокс-буфером в большинстве компартментов растительной клетки (Noctor et al., 2012).

В редокс-систему глутатиона помимо самого трипептида входят глутатион-зависимые ферменты (глутатион-Б-трансферазы,

глутатионпероксидазы) и фермент, обеспечивающий его восстановление (глутатионредуктаза) (Кулинский, Колесниченко, 1990; Seth et al., 2001). Несмотря на то, что роль глутатиона в качестве антиоксиданта была выявлена исторически первой и активно исследуется с момента его открытия, в последние десятилетия больше внимания привлекает участие редокс-системы глутатиона в детоксикации вносимых в окружающую среду пестицидов, поллютантов и тяжелых металлов (Tausz et al., 2004). В связи с этим глутатион и элементы его редокс-системы интенсивно изучаются в таких компартментах растительной клетки, как цитозоль, хлоропласты, митохондрии, пероксисомы и ядра (Noctor et al., 2012). Однако сведения о глутатионовой системе вакуолей до сих пор крайне скудны и носят отрывочный характер (Rautenkranz et al., 1994; Carter, 2004; Zechmann, Muller, 2010). На сегодняшний день известно, что в вакуоль посредством АВС-транспортеров депонируются глутатионовые конъюгаты ксенобиотиков и эндогенных метаболитов (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998). При участии этих же переносчиков в вакуоль избирательно транспортируется глутатион в окисленной форме (GSSG). Тем не менее, вакуолярный пул

глутатиона мало исследовался, и присутствие этого трипептида в вакуолях считается тканеспецифичным или видоспецифичным, поскольку у некоторых видов растений содержание вакуолярного глутатиона было незначительным или недоступным для детекции (Zechmann, Müller, 2010; Noctor et al., 2012). Что касается ферментов редокс-системы глутатиона, то об активности глутатионредуктазы упоминается только в связи с изучением транспорта аскорбата в вакуоли протопластов листьев ячменя (Rautenkranz et al., 1994), и наличие нескольких вакуолярных изоформ глутатион-Б-трансфераз было показано при помощи протеомного анализа у Arabidopsis thaliana L. (Carter, 2004). Однако свойства и кинетические характеристики этих ферментов ранее не исследовались. В связи с возрастающим интересом к участию центральной вакуоли растительной клетки в детоксикации ксенобиотиков и поддержании клеточного редокс-гомеостаза представляется важным исследовать компоненты редокс-системы глутатиона в данном компартменте. Полученные результаты позволят сформировать представление об участии центральной вакуоли в основных метаболических процессах растительной клетки и обеспечении нормальной жизнедеятельности растения в изменяющихся условиях среды. Поэтому данная работа была посвящена редокс-системе глутатиона в вакуолях корнеплодов столовой свеклы в сравнении с таким относительно хорошо изученным компартментом, как пластиды. В двух компартментах, а также в тканевом экстракте было определено содержание глутатиона, показана глутатионредуктазная и глутатион-Э-трансферазная активность, а также исследованы основные свойства изоформ, специфичных для разных компартментов. Полученные данные указывали на присутствие в вакуолях, также как и в пластидах корнеплодов столовой свеклы, глутатиона в микромолярной концентрации и преимущественно в восстановленном состоянии, активных изоформ глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы, а также НАДН, необходимого для функционирования глутатионредуктазы. Внутривакуолярные изоформы ферментов обладали

некоторыми отличиями в активности, условиях функционирования, кинетических характеристиках и взаимодействии с ингибиторами по сравнению с пластидными изоферментами, но в целом по своим основным свойствам они соответствовали последним. Кроме того, активность ферментов изменялась в зависимости от стадии развития корнеплода столовой свеклы. В результате был сделан вывод о присутствии в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы {Beta vulgaris L.) функционирующих компонентов редокс-системы глутатиона, что подтверждает активное участие данного компартмента во внутриклеточных метаболических процессах.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2Л. Глутатион

История открытия и исследования глутатиона (С8Н, у-Ь-глутамил-Ь-цистенилглицина) насчитывает более ста лет. Обнаруженный еще в 1888 г. 11еу-РаП11ас1е в дрожжевых клетках и описанный сначала как "филотион" (соединение, которое самопроизвольно реагирует с элементарной серой с образованием сероводорода), глутатион до сих пор активно исследуется. Он был выделен в кристаллической форме в 1921 г., что позволило определить его структуру. Так оказалось, что в8Н является трипептидом глутаминовой кислоты, цистеина и глицина. Особенностью его строения является присоединение у-карбоксильной группы глутамата к аминогруппе цистеина, что отличает эту связь от пептидных связей в белках. Такая связь придает стабильность молекуле, так как может подвергаться деградации только при помощи специфичных трансфераз аминокислот (№>с1:ог е1 а1., 2011).

На сегодня установлено широкое распространение в8Н в животных и

растительных тканях. В некоторых организмах, таких как галобактерии

глутатион может быть заменен другим серосодержащим соединением,

например у-глутамилцистеином или тиосульфатом. Другим примером

1 8

является трипанотион (К -бис(глутатионил)спермидин), соединение, которое выполняет похожие функции у некоторых паразитических простейших (1Чос1;ог е1 а1., 2011, 2012).

Характерной особенностью в8Н является его высокая концентрация относительно других клеточных тиолов. Как правило, глутатион накапливается в клетке в миллимолярных концентрациях (0,5-10 мМ), и его содержание в ткани превышает свободный цистеин в 10-50 раз. Второй ключевой характеристикой клеточного пула в8Н является его высокое восстановленное состояние. При отсутствии стресса в тканях листа соотношение 08Н:088С обычно поддерживается на уровне 20:1 (1ч!ос1:ог е1 а1., 2012). Необходимо отметить, что это среднее значение в ткани, и

соотношение GSH:GSSG в специфичных субклеточных компартментах может быть выше (в цитозоле) или ниже (в вакуоли) (Meyer et al. 2007; Queval et al., 2011).

В некоторых растительных таксонах помимо GSH обнаружены соединения, содержащие вместо глицина другие С-терминальные аминокислоты, такие как серин, ß-аланин или глутамат (Klapheck, 1988). У бобовых, у которых на ряду с глутатионом можно обнаружить гомоглутатион (у-глу-цис-Р-ала), два гомолога синтезируются отдельными ферментами, кодируемыми разными генами (Galant et al, 2011). Путь гидроксиметилглутатиона (у-глу-цис-сер), который встречается у некоторых злаковых, таких как пшеница, менее изучен. Гидроксиметилглутатион может появляться в результате модификаций GSH, катализируемых ферментами с транспептидазной активностью, таких как карбоксипептидаза У. У кукурузы синтез глутатион-подобных пептидов с глутаматом вместо глицина индуцируется исключительно обработкой кадмием (Galant et al, 2011). Дисульфидная форма гомоглутатиона и у-глу-цис-сер восстанавливается глутатионредуктазой (Klapheck, 1988).

2.2. Биосинтез глутатиона

Синтез GSH происходит в два АТФ-зависимых этапа. В первой реакции у-глутамилцистеинсинтетаза (y-ECS; также известная как глутамат-цистеинлигаза или GCL; ЕС 6.3.2.2) катализирует образование у-глутамилцистеина (у-ЕС). На втором этапе глутатионсинтетаза (GSH-S; ЕС 6.3.2.3) катализирует присоединение глицина к у-глутамилцистеину с образованием глутатиона (Meister, 1995).

Локализация ферментов синтеза. Предыдущие исследования показали, что у резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana L.) y-ECS локализована исключительно в хлоропластах, в то время как GSH-S обнаружена как в хлоропластах, так и в цитозоле (Noctor et al., 2002; Wächter et al., 2005). Первый фермент y-ECS кодируется GSH1 геном (At4g23100),

тогда как ген GSH2 (/4i5g27380) с альтернативными сайтами инициации транскрипции, кодирует два белка. Наиболее распространенной является более короткая форма транскрипта, которая кодирует цитозольную GSH-S, в то время как более длинная форма кодирует белок, направляемый в хлоропласты. В связи с этим GSH-S в основном присутствует в цитозоле, и менее 10% активности GSH-S обнаружено в пластидах (Wächter et al., 2005).

Пластидные y-ECS и цитозольные GSH-S связаны транспортом у-ЕС через оболочку хлоропластов, что соответствует более ранним данным о том, что экспорт восстановленной серы из пластид происходит главным образом в форме у-глутамилцистеина, предшественника глутатиона (Pasternak et al., 2008). Недавно были описаны транспортеры, которые способны осуществлять транспорт как у-ЕС, так и GSH. У A. thaliana эти транспортеры кодируются тремя генами CLT1 (^r5gl9380), CLT2 (^i4g24460) и CLT3 (^i5gl2160/12170) и названы хлорохинон-подобными транспортерами (Galant et al, 2011).

у-глутамилцистеинсинтетаза. y-ECS катализирует АТФ-зависимое образование пептидной связи между глутаматом и цистеином в первой реакции синтеза глутатиона. Клонирование y-ECS из A. thaliana, люцерны {Medicago truncatula Gaertn.j, горчицы сарептской {Brassica juncea L.) и хориспоры Бунге (Chorispora bungeana Fisch. & С.А. Меу.) показало, что растительный фермент значительно отличается по последовательности от ферментов млекопитающих, дрожжей и бактерий (Hothorn et al., 2006).

y-ECS регулируется редокс-окружением (Hothorn et al., 2006; Galant et al., 2011). Растительные y-ECS функционируют в виде гомодимерных ферментов с двумя межмолекулярными дисульфидными мостиками (Hothorn et al., 2006), но восстанавливающие условия переводят белок в менее активную мономерную форму (Hothorn et al., 2006). Когда концентрация GSH увеличивается, клеточная среда сдвигается к более восстановленному потенциалу и активность y-ECS снижается. При окисляющих условиях потребность в глутатионе увеличивается и y-ECS активируется (Galant et al.,

2011). Кинетический анализ y-ECS из A. thaliana показал, что фермент использует произвольный трех-реагентный кинетический механизм с предпочтительным порядком связывания для катализа (Galant et al., 2011).

Глутатионсинтетаза. На втором этапе синтеза глутатиона GSH-S катализирует АТФ-зависимое присоединение глицина к у-глутамилцистеину. GSH-S из бактерий и эукариот образуют два различных семейства, которые не имеют гомологии в аминокислотной последовательности. Структурная и функциональная характеристика GSH-S бактерий показала, что эти ферменты функционируют в виде тетрамеров, тогда как GSH-S млекопитающих, дрожжей и растений активны в виде димеров (Jez, Cahoon, 2004). GSH-S из A. thaliana, пшеницы (Triticum aestivum L.), кукурузы {Zea mays L.) и различных бобовых обладают почти 40% гомологией аминокислотных последовательностей с соответствующими генами человека и дрожжей (Galant et al., 2011).

Три структурные особенности - домен-крышечка

Информация о работе

Трухан, Ирина Сергеевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Редокс-система глутатиона вакуолей корнеплодов столовой свеклы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы