Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности распределения осмотически активных компонентов в растительных тканях

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности распределения осмотически активных компонентов в растительных тканях"

На правах рукописи

Ланкевич Светлана Владимировна

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск.

Научный руководитель: чл.-корр. РАН,

доктор биологических наук, профессор Р.К. Саляев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. К. Глянько г.Иркутск

доктор биологических наук, профессор О. П. Родченко г. Иркутск

Ведущая организация: Институт биохимии и биофизики КНЦ РАН,

Защита диссертации состоится "27" декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: lank@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан "ЛЦ" ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.003.047.01

г.Казань

кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

f^ 12.45990

i

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что центральные вакуоли, состоящие из вакуолярнош сока и вакуолярной мембраны (тонопласта) определяют специфику растительных клеток и не встречаются у организмов не относящихся к растениям. Они активно участвуют во внутриклеточном накоплении и распределении веществ, что находит отражение во многих их функциях (Саляев, 1969; Matile, 1975; Андреев, 2001).

Одной из таких функций является участие в поддержании осмотического потенциала клетки. Осмотическая функция определяет не только создание упругости клеток, но и поддержание постоянства внутриклеточной среды (равновесия между вакуолярным и цитоплазматическим компартментами) в режиме оптимального метаболического функционирования всей клетки, т. е. участвует в поддержании осмотического гомеостаза. В настоящее время очевидно, что осмотическая регуляция в растительной клетке осуществляется накоплением осмотически активных компонентов в вакуолях и отчасти в других компартментах. Эти компоненты могут определять специфику растительных клеток, играя особую роль в их структурной и функциональной организации Общая стратегия, свойственная осморегуляции растительных клеток с участием вакуоли, состоит в том, что всегда соблюдается сопряженность поступления в вакуоль и выхода из нее тех ионов и метаболитов, которые участвуют в регуляции клеточного тургора. Хорошо известно, что в ряде случаев такой осмотический баланс может достигаться благодаря аккумуляции внутри вакуолярного и цитозольного компартментов осмолитов различной природы. Изучение закономерностей распределения осмотикообразующих компонентов в клетке, лежащих в основе формирования осмотической концентрации в растительных тканях представляют несомненный интерес для изучения механизмов поддержания гомеостатического равновесия в растениях. В настоящее время динамику распределения и накопления осмотически активных компонентов изучают в связи с различными физиологическими состояниями растений, например, с устойчивостью к различным стрессам (Keller, Ludlow, 1993; Yuncai Ни, Schmidhalter, 1998), с осмотической функцией замыкающих клеток устьиц (Poffenroth, 1992; Talbott, 1996; Talbott, 1998), водным режимом, минеральным питанием (Leigh, 1993) и целым рядом других физиологических процессов. В представляемой работе мы попытались по - новому взглянуть на закономерности перераспределения осмотически активных компонентов в тканях растений и представить полученные данные на графиках, названных нами "фазовыми портретами". А также установить возможную связь между балансом осмотически активных компонентов в тканях и процессами роста и морфогенеза. Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы было изучение компонентов, вносящих решающий вклад в осмотический потенциал клетки, а также возможные закономерности распределения

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* I БИБЛИОТЕКА I

"» т

осмотически активных компонентов в растительных тканях и связь такого распределения с физиологическими и морфологическими процессами. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести качественный и количественный анализ состава основных осмотикообразующих компонентов клеточного сока в тканях корнеплода красной столовой свеклы. 2 Изучить качественный и количественный состав осмотически активных компонентов клеточного сока в культуре ткани пшеницы.

3. Разработать графический метод анализа неравномерного распределения осмотически активных компонентов в тканях растений.

4. Изучить неравномерное распределение основных осмотикообразующих компонентов клеточного сока в тканях корнеплода красной столовой свеклы и в культуре ткани пшеницы.

5. Изучить возможную связь неравномерного распределения осмотически активных компонентов в клетках культуры ткани пшеницы с морфогенетическими процессами

Научная новизна. Впервые предложен оригинальный методологический подход для анализа закономерностей распределения Сахаров и ионов в тканях растений, на примере корнеплодов красной столовой свеклы Beta vulgaris L. и культуры ткани пшеницы Triticum aestivum L., с помощью которого массивы полученных данных рассматриваются как динамическая система на фазовой плоскости ("фазовые портреты"). В рассматриваемой системе выявлены устойчивые и неустойчивые состояния. Показано, что в процессе дифференцировки клеток изменяется вклад Сахаров и калия в осмотический потенциал. Происходит это путем перехода из одного устойчивого состояния в другое. Показано, что волнообразное возникновение в каллусах зон вторичной дифференцировки сопровождалось ритмичным изменением соотношения основных осмотикообразующих компонентов (сахаров и ионов). Так в каллусах, имеющих зоны вторичной дифференцировки было показано увеличение концентрации сахаров. А при разрушении этих зон в осмотическом потенциале каллусной ткани начинали доминировать ионы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть полезными для понимания закономерностей, лежащих в основе накопления и перераспределения осмотически активных веществ в клетках и тканях растений. Тот факт, что молодые клетки имеют "сахарный" статус, а клетки дифференцированные "солевой", также может иметь большое значение для изучения процессов развития на разных уровнях. Рассматривая распределение сахаров и ионов в тканях как динамическую систему, мы показали, что процесс формирования осмотического потенциала в клетках на разных стадиях дифференцировки имел не плавный характер, а дискретный, формировались устойчивые и неустойчивые состояния. Такое наблюдение согласуется с уже имеющимися сведениями о характерных чертах процесса развития сложных

биологических систем и, возможно, сможет в некоторой степени их дополнить. Показана динамика "фазового портрета" корнеплода при водном стрессе и, также, на некоторых фазах онтогенеза. "Фазовые портреты" изучены в каллусной культуре пшеницы, что возможно будет иметь значение для регулирования морфогенных процессов в культуре ткани. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей. Результаты исследований были представлены на TV Всесоюзной конференции по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), на VII международном Конгрессе «Plant Tissue and Cell Culture» (Амстердам, 1990), на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений, (Минск, 1991), на международном симпозиуме «Golden Jubilee Symposium on Genetic Research and Education (Current Trends and the Next Fifty Years)» (Дели, 1991), на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений, (Минск, 1990), на III Всероссийском симпозиуме «Новые методы в биотехнологии» (Пущино, 1995), на научных семинарах и сессиях СИФиБР СО РАН.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 16 рисунков и 5 таблиц. Список литературы состоит из 130 источников, в том числе 95 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследований. В качестве растительного материала использовали объекты, принадлежащие к разным семействам: корнеплоды красной столовой свеклы и культуру ткани пшеницы.

Красная столовая свекла, Beta vulgaris L Использовали зрелые и растущие корнеплоды, сорта Бордо. Растущие корнеплоды снимали на разных стадиях вегетации, отбирая с каждого участка (размером 10x10 м) по 100 случайных растений. Корнеплоды, имеющие средние по весу и диаметру значения использовали для экспериментов.

Культура ткани пшеницы Triticum aestivum h. сорта Скала

Для получения культуры ткани пшеницы в качестве экспланта

использовали зрелые зерновки.

Инициация каллусов из зрелых зародышей: В качестве среды культивирования использовали среду Мурасиге-Скуга (Murashige Т., Skoog F. 1962) с добавлением 2,4-Д в концентрации 2 мг/л и 2% сахарозы, рН 6.0. При приготовлении смеси макро- и микросолей использовали реактивы фирмы SIGMA (США). Экспланты, стерилизовали 10-15 мин.. Для лучшей индукции каллусогенеза удаляли 1/2 эндосперма и скальпелем надсекали зародыш, чтобы предупредить массовое образование побегов. Пробирки с эксплантами инкубировали при температуре 2В°С, в темной кондиционированной комнате.

Наличие зон вторичной дифференцировки (ВД-зон) определяли визуально, с помощью стереоскопического микроскопа МБС-2 (Россия). Изучение динамики роста культуры клеток пшеницы. Из популяции каллусов (300 шт.), пересаженной на первый пассаж, каждые пять дней отбирали по 5 каллусов, для которых определяли: сырой и сухой вес (лабораторный лиофилизатор 960/2, Венгрия), % сухого от сырого веса, концентрацию водорастворимых Сахаров и неорганических ионов К+, Na+. Экстракция клеточного сока из тканей корнеплодов красной столовой свеклы. Экстракцию клеточного сока из гетерогенных зон корнеплодов проводили следующим образом. Из поперечного среза корнеплода, толщиной 5 мм, расположенного на стекле, подсвеченном снизу, вырезали "темные " и "светлые" зоны. Каждую зону (кусочек ткани) измельчали, гомогенат отжимали через капроновую ткань и центрифугировали 1 ч. при 22000g. После того, как были показаны различия в химическом составе клеточного сока "темных" и "светлых" зон, применяли другой способ выделения. Из центральной части зрелого корнеплода специально заточенным цилиндром в радиальном направлении вырезали столбики диаметром 10,5 мм. Затем нарезали их на диски, толщиной от 0,6 до 1 мм. Каждый диск взвешивали, замораживали в жидком азоте и помещали в пробирку с дистиллированной водой (1 мл). Пробирку встряхивали на качалке (110 об/мин.) в течение 2 часов. Далее в экстракте, разведенном в 500 раз дистиллированной водой, определяли концентрацию водорастворимых Сахаров и ионов калия, натрия, хлора, магния, а также концентрацию бетацианина.

Измерение осмотического потенциала и гипотонический стресс. Осмотический потенциал измеряли на криоскопическом осмометре ОМКА-1Ц-01 (Россия). Микропипеткой (20 мкл) наносили исследуемый образец на электрод. В качестве калибровочных растворов использовали фирменные стандарты (SIGMA, США) 100-300 мОсм/кг Н20, 500 мОсм/кг Н20 , 900 мОсм/кг Н20. Гипотонический стресс осуществляли экспонированием высечек из корнеплода в отстоянной водопроводной воде в течение 48 ч. Определение водорастворимых Сахаров. Для определения концентрации водорастворимых Сахаров использовали антроновый метод (Павлинова, 1971). К 1 мл исследуемого раствора (разведение в 500 раз) клеточного сока добавляли 5 мл антронового реактива. Далее пробирки инкубировали 15 минут на водяной бане. После этого измеряли поглощение на фотоколориметре ФЭК-56М (Россия) при длине волны 620 нм, с красным светофильтром. Для приготовления антронового реактива использовали антрон фирмы Serva и 66% серную кислоту (х.ч.). Антрон перекристаллизовывали из смеси очищенных бензола и петролейного эфира, 3:1.

Определение неорганических ионов. Ионы К*, Na+ измеряли методом пламенной фотометрии на фотометре Flapho-4 (Carl Zeiss Jena, Германия). Ионы Mg2* измеряли агомно-абсорбционным методом на спектрофотометре

AAS-1 (Carl Zeiss Jena, Германия). Расчет концентрации элемента проводили

по формуле (Алексеевский В.Б., 1988).

Расчет концентрации метаболитов и ионов в клеточном соке.

Расчет концентраций Сахаров и ионов в исследуемых тканях производили в

программе КАЛЛУС (см. Приложение), разработанной в лаборатории, с

использованием формулы:

VH о

С = С^х( 1 + - "г°

а )х к,, где [С]11р0ба- концентрация вещества в разбавленном экстракте; к,- коэффициент разбавления экстракта;

Vh2o- объем воды, в которую помещают диск ткани для экстракции;

^диоа-сырой вес диска ткани; а- сырой вес контрольного кусочка ткани; Ь- сухой вес контрольного кусочка ткани; (1-Ь/а)- доля воды в контрольном кусочке ткани; Статистическая обработка данных и построение "фазовых портретов". Результаты химических анализов обрабатывали с помощью компьютерных пакетов STATIST1CA, GRAPHER, SURFER (Golden Software Inc.) Для изучения закономерностей дифференциального распределения Сахаров и ионов в тканях растений рассматривали полученные массивы экспериментальных данных как динамическую систему, используя модифицированный нами метод построения "фазовых портретов". Это один из методов, с помощью которых характеризуют периодические процессы. (Kaplan D, Glass L., 1993; Mosekilde E„ O.G. Mouritsen O.G., 1995;). Предлагаемое нами рассмотрение системы полученных данных на фазовой плоскости, дает возможность определить, имеются ли в этой системе стационарные состояния (устойчивые и неустойчивые) и описать их. Традиционно, "фазовые портреты" строят с учетом времени, на основании решения системы дифференциальных уравнений, т.е. на основании моделей. В нашем случае мы строили "фазовый портрет" на основании результатов химических анализов с учетом их частоты встречаемости (вероятности) и отображали эти величины в координатах концентраций, на фазовой плоскости. Для этого в нашей лаборатории была разработана программа преобразования полученных концентраций в вероятностные величины с использованием ортогонального разбиения плоскости на квадраты (сетка 16x16 квадратов) и подсчета вероятности попадания в ту или иную область (%). Текст программы МА7РИКС приводится в Приложении. Данные после такой обработки использовали для построения "фазовых портретов" в пакете программ SURFER. Статистическую обработку данных проводили с помощью программных пакетов «GRAPHER V.l.06» и «STATTSTICA V.5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Химический состав гетерогенных тканей корнеплода

Известно, что для анатомического строения корнеплода красной столовой свеклы характерны чередующиеся зоны: проводящих пучков и клеток паренхимы к ним прилегающих - ПП; и зоны межкольцевой паренхимы- МП. Визуально эти зоны представляются "темными" и "светлыми". Логично было предположить, что клетки в зонах проводящих пучков и межкольцевой паренхимы различаются между собой, в первую очередь по химическому составу. В пользу этого предположения свидетельствовал установленный нами ранее факт о разделении вакуолей в линейном градиенте плотности на "тяжелые" и "легкие" (Саляев и др., 1985). Изучение этих отличий представляется весьма актуальным, поскольку может раскрыть функциональные особенности клеток в тканях корнеплодов. Поэтому задачей данного раздела работы было проведение сравнительного анализа химического состава клеточного сока из МП и ПП зон корнеплода, а также размеров клеток из этих зон. В клеточном соке определяли содержание пигмента, водорастворимых Сахаров, белков, органических кислот, аминокислот, а также неорганических ионов. Было показано, что в корнеплодах красной столовой свеклы содержатся пигменты класса беталаинов: красно-фиолетовый бетацианин и желтый бетаксантин. Также было установлено, что клеточный сок из "темных" зон содержал пигмента почти в два раза больше, чем в "светлых" зонах. Кроме того, в клетках паренхимы, прилегающей к проводящим пучкам содержалось относительно большее количество бетацианина (максимум поглощения 18570 см"1 ), а в клетках межкольцевой паренхимы- бетаксантина (максимум поглощения 20680 см"1).

В "темных" зонах концентрация Сахаров была в полтора, а в некоторых случаях в два раза выше, чем в "светлых" зонах. В распределении органических кислот, аминокислот, белков и неорганических ионов наблюдали обратную картину. Концентрации органических кислот и аминокислот в 1,5 - 2 раза выше в "светлых" зонах. Линейные размеры клеток в "светлых" зонах почти в два раза превышали размеры клеток в "темных" зонах, а объем их был больше в 5 раз (Таблица 1). Значительная разница в размерах и объеме этих клеток объясняется тем, что клетки "темных" и "светлых" зон находятся на разных стадиях дифференцировки. На рис. 1,2,3 приведены кривые, отражающие распределение вышеперечисленных компонентов в гетерогенных зонах корнеплода. Распределение значений параметров по радиусу корнеплода имеет вид периодических колебаний и хорошо отражает распределение Сахаров и ионов, абсолютные значения которых показаны в таблице. Исходя из полученных результатов, далее мы именовали "темные" зоны "сахарными", а "светлые"- "солевыми".

Таблица 1

Характерные соотношения осмотической концентрации, размеров клеток, суммы Сахаров и ионов в зонах 1111 и МП зрелого корнеплода красной столовой свеклы

Параметры Зона пучковой паренхимы (ПП) Зона межпучковой паренхимы (Mil)

Суммарная осмотическая концентоацнн. мОсМ Ла 483±28 0.116 чтг 0.107

Сумма Сахаров, мМ 304120 167±12

[Калий], мМ 82±4 175±3

[Натрий], мМ 26±3 39±3

[Хлор], мМ 23±1 56 ±3

Средний диаметр клеток, мкм 54±3 95±4

200 160 5 |ио й V !» h 0 1 1 1 I I 1 4» 10 j г i 1,0 0

О Ю 20 30 40 50 60

Номер лисп

Рис. 1. Распределение концентраций Сахаров и пигментов в тканях корнеплода (в направлении от центра к периферии).

500 г

-— -• Сумма сахаро»

---- [Мд2+]

—>[к+1

—• [Ма+]

Гма+]

мМ

[Мд'Ч

30 40 Номер диска

Рис. 2. Распределение Сахаров и неорганических ионов К*' Ыа+,

в тканях корнеплода (в направлении от центра к периферии), имеющего осмотический потенциал около 500 мОсм.

но \ со

I

а „ 80

20 30

Номер диска

Рис. 3. Распределение концентраций К+ в тканях корнеплода (от центра к

периферии).

Степень соотношения содержания Сахаров и бетацианинов в клеточном соке имеет высокий положительный коэффициент корреляции (г = 0.9), и высокий отрицательный между содержанием Сахаров и калия (г = - 0.86). Изменение осмотической концентрации связано с изменением концентрации Сахаров -чем выше Роем, тем выше была концентрация Сахаров. Что касается ионов калия, то связь между приростом [К+] и увеличением осмотической концентрации были значительно ниже, чем в случае с сахарами. Связь между концентрацией ионов натрия и хлора и осмотической концентрацией незначительна.

Таким образом, было выявлено, что клетки корнеплода красной столовой свеклы, находясь на разных стадиях дифференциации, отличаются не только размерами, но и концентрациями метаболитов и ионов, находящихя в клеточном соке. Клетки, прилегающие к проводящим элементам ("темные" зоны), являются активно делящимися, с высокой аттрагирующей способностью. Можно предполагать, что значительные концентрации сахарозы в них обеспечивают протекание высокоэнергетических процессов, характерных для таких клеток. Помимо этого, сахароза также играет роль и "запасного" метаболита в корнеплоде, что связано с особенностями онтогенеза красной столовой свеклы. В литературе последних лет (Зшеекепв Б., 2000) также отмечается важная роль сахарозы в процессах связанных с экспрессией генов. Помимо всего вышесказанного, обнаруженные высокие концентрации сахарозы в вакуолях также свидетельствуют и о том, что этот дисахарид принимает участие в поддержании осмотического потенциала клетки. Его высокие концентрации (клеточный сок являлся фактически 10% раствором сахарозы), значительно превышающие концентрацию калия, указывают на то, что сахара могут быть в клетках "темных" зон основным осмотически активным компонентом.

Интересна также обнаруженная закономерность в распределении бетацианинов в клеточном соке "темных" и "светлых" зон, заключающаяся в высокой положительной корреляции с концентрацией Сахаров (рис. 1). В отличие от многих других пигментов, бетаксантин и бетацианин аккумулируются не в пластидах, а в вакуолях, придавая им яркую окраску. И, как нередко бывает, о функциях этих пигментов в растениях известно намного меньше, чем об их метаболизме в животных организмах. Известно, что они обладают антиоксидантными свойствами. Например, перекисное окисление линолевой кислоты с помощью цитохрома С ингибируется бетанином (а также бетанидином). Исходя из имеющихся в литературе данных, мы можем предположить, что в быстрорастущих клетках антиоксидантная система должна быть более эффективной, чем в дифференцированных. С этим фактом может быть связана и относительно более высокая концентрация бетацианина. Возможно, также, что антиоксидантными свойствами в большей степени обладает бетацианин, а не бетаксантин.

Таким образом, при анализе полученных результатов нами было обнаружено существенное отличие как в химическом составе клеточного сока из различных зон корнеплода, так и в размерах клеток из МП и ПП зон. Полученные данные позволили говорить о "сахарных" и "солевых" типах клеток, вакуолей и, вообще, о "сахарном" и "солевом" статусе клеток проводящих пучков и межпучковой паренхимы.

Осмотически активные компоненты в тканях корнеплода красной

столовой свеклы.

Представленные в предыдущей главе результаты дали основание предположить, что основными осмотикообразующими компонентами в клетках запасающей паренхимы корнеплода красной столовой свеклы являются водорастворимые сахара и неорганические ионы. Для того чтобы подтвердить это предположение, необходимо было изучить вклад каждого из этих метаболитов в осмотический потенциал клетки. Поэтому задачей данного раздела работы было проведение расчета процентного вклада Сахаров и неорганических ионов в создание осмотической концентрации в клетках разных зон корнеплода.

Из данных представленных на рисунке 4 видно, что в "темных " зонах доля Сахаров составляет 62%, а в "светлых" 37%. Доля ионов калия в осмотической концентрации клеточного сока "светлых" зон составляет

Рис. 4. Схема процентного вклада метаболитов и ионов в осмотический потенциал клетки. "X" - неидентифицированные компоненты.

25.5%, что почти в два раза выше, чем в "темных" зонах. Доля натрия и хлора также больше в "светлых" зонах и равняется 6.5% и 9.3% соответственно. В "темных" зонах доля натрия и хлора составила 4% и 3.5%. На следующем рисунке (рис. 5) представлено изменение вклада Сахаров и ионов в осмотическую концентрацию клетки с учетом увеличения ее объема в различных зонах (при росте растяжением).

МЕЖПУЧКОВАЯ ПАРЕНХИМА

ПУЧКОВАЯ ПАРЕНХИМА

Рис. 5. Схема изменения вклада Сахаров и ионов в осмотический потенциал с учетом увеличения объема клеток.

Хотя процентный вклад Сахаров в клетках светлых зон уменьшился с 62 % до 37 %, с учетом изменения объема при росте, содержание Сахаров в пересчете на клетку увеличивается почти в три раза. Вклад ионов К+ возрастает в 11 раз, в восемь, СГ в тринадцать раз. Другими словами, становится очевидным, что осмотический потенциал клеток запасающей паренхимы корнеплода поддерживается достаточно сложным перераспределением Сахаров и ионов в процессе дифференциации. Таким образом, в результате проведенной оценки вкладов Сахаров и ионов в осмотический баланс, было подтверждено наличие двух гомеостатических состояний "сахарного" и "солевого". А также показано, как в процессе дифференцировки, при увеличении объема клеток, меняется соотношение Сахаров и ионов и формируется осмотический потенциал.

Распределение Сахаров и ионов на фазовой плоскости

В двух предыдущих главах было показано, что существует асимметрия в распределении осмотически активных метаболитов и ионов в тканях корнеплода. Проведенный корреляционный и регрессионный анализы, не объясняют закономерностей такого распределения. Поэтому нами был предложен графический метод отражения полученных данных в координатах концентраций с учетом частоты встречаемости определенных сочетаний концентраций. В результате мы получили графические изображения, позволившие нам представить полученные данные в виде биохимической карты, которая отражает процесс формирования осмотической концентрации в тканях корнеплода. Преимуществом такого подхода является возможность наблюдать динамику формирования осмотического потенциала и рассмотреть массивы полученных данных как единую систему. На рис. 6 А, Б представлен "фазовый портрет" соотношений концентраций Сахаров и калия, проанализированных в корнеплоде с низким осмотическим потенциалом (около 200 мОсм). На этом рисунке видно, что есть области, где частота встречаемости определенных соотношений Сахаров и калия высока (стрелки, пики), и где частота встречаемости определенных соотношений этих компонентов низкая (впадины). Согласно терминологии метода, который мы используем, такие области на фазовой плоскости называют устойчивыми стационарными состояниями (указаны стрелками) и неустойчивыми, соответственно.

Наблюдаемое распределение свидетельствует о том, что изменения соотношений Сахаров и калия в осмотическом потенциале, происходят не плавно, а дискретно, переходя из одного устойчивого состояния в другое. Такие переходы, согласно использованному методу, должны иметь триггерный характер. По зонам наименьшей частоты встречаемости можно провести разделительные линии, которые называются сепаратрисами, и отделить устойчивые стационарные состояния друг от друга (в качестве примера сепаратриса проведена на рис. 6 Б).

Таким образом, представление полученных данных в виде "фазовых портретов" позволяет охватить все возможные изменения концентраций Сахаров и калия.

О 100 200

КАЛИЙ, им

Рис. 6. А - "фазовый портрет" распределения Сахаров и калия в тканях корнеплода красной столовой свеклы с осмотическим потенциалом 200 мОсм; Б - трехмерное изображение с проведенной сепаратрисой.

Соотношение Сахаров и калия в ткани корнеплода после гипотонического

стресса.

°0 100 200 ° 0 100 200 КОНЦЕНТРАЦИЯ КАЛИЯ,мМ

Рис. 7. А - "фазовый портрет" распределения Сахаров и калия до гипотонического шока; В- "фазовый портрет" после гипотонического шока.

Можно предположить, что если отмеченные закономерности справедливы, то они должны сохраняться в тканях не только в нормальных условиях, но и при резких их изменениях. На рис. 7 представлены "фазовые портреты" распределения Сахаров и калия в корнеплоде, одна половина которого служила контролем (Рис. 7 А), а другая подвергалась гипотоническому стрессу (Рис. 7 В). При анализе результатов видно, что основная закономерность, заключающаяся в наличии устойчивых и неустойчивых состояний и присутствии "сахарных" и "солевых" областей сохраняется. Заметно сдвигается пик "сахарной" зоны и выявляется большой пик в "солевой" зоне (отмечено стрелкой), что свидетельствует о том, что в осмотической концентрации начинают доминировать неорганические ионы, а содержание Сахаров уменьшается, что на наш взгляд свидетельствует о "старении" клеток.

Соотношение Сахаров и калия и Сахаров и натрия в растущих корнеплодах.

Чтобы подтвердить характер выявленных закономерностей, нами были проведены опыты на растущих корнеплодах (рис. 8). Рассматривали три временных варианта - корнеплоды через месяц после посева, через 1,5 месяца и через 2 месяца.

На рисунке 8 А видно, что популяция имеет одно устойчивое стационарное состояние, в котором находится большинство клеток корнеплода с координатами около 100 мМ для сахара и калия (указано стрелкой). Во втором случае (рис.8 В) в части клеток увеличивается концентрация Сахаров,

при прежних концентрациях калия, а в большей части исследуемого клеточного сока увеличивается концентрация калия при тех же концентрациях Сахаров. Таким образом формируются два устойчивых стационарных состояния, но большинство значений все же находится в "солевой" области. В третьем случае (рис. 8С) концентрация Сахаров продолжает увеличиваться, и формируются два устойчивых стационарных состояния: одно, как в первом случае (рис. 8 А), а другое в области более высоких концентраций Сахаров. На основании вышесказанного можно предположить возможную схему (рис. 9), отражающую траекторию формирования осмотического потенциала в процессе роста корнеплодов. Этот процесс проходит, как видим, путем образования одного устойчивого состояния за другим, за счет изменения соотношения Сахаров и калия в осмотической концентрации, периодического увеличения концентраций Сахаров, а затем калия. С таких же позиций, как и рис. 8 А, В, С, можно рассматривать и данные, полученные для соотношения Сахаров и натрия в онтогенезе (рис. 8 Б, Е, Р). На рис. 8 О показано, что основная часть популяции клеток находится в области с координатами примерно 100 мМ (сахара) и 50 мМ (натрий). Во второй точке онтогенеза (рис. 8 Е) на "фазовом портрете" уже четко видны два устойчивых состояния, в области высоких концентраций Сахаров и в области более высоких концентраций натрия. На рисунке 8 Р видно, что в результате дальнейшего накопления углеводов формируется уже три устойчивых стационарных состояния. Первое, в области высоких концентраций Сахаров и низких концентраций натрия. Второе, с координатами, как на рисунке 8 О. Третье, находившееся в "солевой" области перемещается также в область более высоких концентраций Сахаров. Вышесказанное свидетельствует о том, что и для ионов натрия сохраняются те же закономерности: устойчивые состояния и области неустойчивости. При анализе значительного количества корнеплодов были определены координаты устойчивых состояний на "фазовом портрете" каждого, что показывает возможные пути, по которым может формироваться осмотический потенциал у разных корнеплодов, в зависимости от его величины и под действием различных эндогенных и экзогенных факторов.

Таким образом, используя "фазовые портреты", мы можем охарактеризовать динамику формирования осмотического статуса в процессе роста и развития в растительных тканях. Этот процесс имеет дискретный характер с переходами из одного устойчивого состояния в другое. По всей вероятности то, что мы называем устойчивыми состояниями соответствует определенным состояниям при дифференциации клетки. Еще один важный момент, который можно увидеть на "фазовых портретах"- это минимально и максимально возможные концентрации Сахаров и ионов. Возможно эти границы генетически детерминированы для разных видов растений.

Рис. 9. Схема накопления Сахаров и калия в тканях корнеплодов красной столовой свеклы в онтогенезе.

Осмотически активные компоненты в каллусах пшеницы

После того, как было показано, что существует ряд закономерностей в формировании осмотической концентрации в тканях корнеплодов красной столовой свеклы, возник вопрос, сохраняются ли подобные закономерности в тканях других растительных объектов. Поэтому для дальнейших исследований использовали культуру ткани пшеницы. Наряду с осмотически активными компонентами, анализировали и кинетику роста каллусной культуры, измеряя сырую и сухую массу каллусов и анализируя образование зон вторичной дифференцировки (ВД-зоны). Это дало возможность соотнести изменения концентраций осмотически активных компонентов с процессами роста и развития в каллусной культуре.

В течении периода наблюдений (50 дней) происходило естественное увеличение сырой массы каллусов. Была отмечена ритмичность нарастания сырой массы каллусов, имеющая 3-4 волны с периодом 17 ± 1-2 дня (12,9± 2 дней). На каллусах в течении цикла культивирования отмечалось волнообразное появление и разрушение ВД-зон, связанное с ризогенезом и регенерацией, т.е. были обнаружены обратимые появления и исчезновения этих зон, соответствующие моментам торможения и ускорения волнообразного роста каллусов (Рис. 10 Б). Было определено, что осмотический потенциал клеточного сока каллусов имел невысокие, по сравнению с тканью корнеплода, значения и колебался от 130± 7.4 до 195±10 мОсм.

Концентрации осмотически активных компонентов были значительно ниже, чем в корнеплодах красной столовой свеклы. Наряду с колебаниями значений сырой и сухой массы, мы наблюдаем изменения концентраций Сахаров и ионов в течении пассажа. Максимальная концентрация Сахаров, зарегистрированная нами, составляла 100±12 мМ. Концентрации ионов калия в обоих видах каллусов распределялись от 28 до 50 мМ. Концентрация ионов натрия колебалась от 2 до 21 мМ. При снижении концентрации Сахаров наблюдалось увеличение концентрации ионов натрия и калия. На основе полученных данных построен график на рисунке 10 А, Б. В первой части рисунка (рис. 10 А) - колебания концентраций Сахаров, калия и натрия (данные предварительно сглажены 3- точечным способом) в клеточном соке каллусов пшеницы, в течении пассажа. Во второй части рисунка (рис. 10 Б) отражена динамика образования ВД- зон в течении этого же пассажа. Мы видим, что также как и в тканях корнеплода, распределение Сахаров и ионов имеет колебательный характер. Интересно, что высокие концентрации Сахаров наблюдаются в небольших каллусах, сразу после пересадки на свежую питательную среду. Этот период характеризуется интенсивным ростом культуры, что позволяет говорить о наличии в ней большого количества меристематических клеток, которые, также как в тканях корнеплода, имеют "сахарный" статус. Этот отрезок времени характеризуется формированием первого пика ВД-зон. Другими словами, мы

можем говорить о том, что для клеток в этот период развития характерен "сахарный" статус. Тем более, что второй пик образования зон вторичной дифференцировки также совпадает с увеличением концентрации Сахаров. На рисунке 10 наблюдается также довольно резкое снижение концентрации Сахаров. Очевидно клетки приобретают "солевой" статус, при этом разрушаются имеющиеся ВД-зоны. Используя полученные значения концентраций Сахаров и ионов мы построили "фазовый портрет", демонстрирующий наличие трех устойчивых стационарных состояний (рис. 11 А, Б), разделенных сепаратрисами.

Рассматривая и сопоставляя весь фактический материал можно сказать, что осмотический потенциал в разных тканях поддерживается изменением соотношений Сахаров и ионов в процессе роста и морфогенеза. Закономерности таких изменений, продемонстрированные ранее на "фазовых портретах" тканей корнеплода свеклы, как видим, имеют место и в каллусной культуре пшеницы.

Рис. 10. А - концентрации Сахаров и ионов в каллусах, в течении периода культивирования; Б- образование ВД- зон.

Рис, 11. А- "фазовый портрет" распределения Сахаров и калия в каллусах; Б- "фазовый портрет" распределения Сахаров и натрия в каллусах.

Тот факт, что в каллусах, имеющих зоны вторичной дифференцировки, основной вклад в осмотический потенциал вносят водорастворимые сахара, возможно, может иметь и практическое значение, связанное с подбором условий культивирования для различных биотехнологических целей, в том числе для получения регенерантов.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что в двух изучаемых нами растительных объектах основными осмотикообразующими компонентами являются сахара и водорастворимые ионы. Показано, что увеличение и снижение концентраций этих осмолитов связано с физиологическими и морфогенетическими процессами, дифференцировкой клеток и образованием морфогенных зон (зон вторичной дифференцировки).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для удобства обсуждения полученные результаты можно разделить на три части: а), биохимическую, в которой был изучен состав и соотношение осмотикообразующих компонентов в растительной ткани, б), методологическую, в которой был предложен и апробирован вероятностный метод построения "фазовых портретов" для более глубокого изучения закономерностей формирования осмотического потенциала и, наконец, в), анализ связей выявленных закономерностей с процессами роста и морфогенеза.

В первой части было показано, что клетки различных тканей корнеплодов красной столовой свеклы отличаются по химическому составу клеточного сока. Обнаруженные высокие концентрации сахарозы и калия, сопоставимые с показателями осмотической концентрации, дали основание предположить, что эти компоненты могут участвовать в поддержании осмотического потенциала клеток. Участие неорганических ионов, в частности калия, в регуляции осмотических процессов в растениях считается установленным фактом, современные представления отводят им роль основных осмотикообразующих компонентов. В литературе имеются единичные упоминания (Leigh, 1993; Talbott, 1998) феномена, когда поглощение калия в клетках сопровождалось выходом из них сахарозы. Есть также данные по солеустойчивым видам растений, когда при аккумуляции высоких концентраций натрия в вакуолях, наблюдали снижение в них концентрации Сахаров (Hu Yuncai, 1998). Наиболее детально этот вопрос рассматривался в цикле работ, посвященных процессам сахаронакопления в корнеплодах сахарной свеклы (Zeiger, et al., 1985, 1989, 1990). В некоторых статьях, посвященных этим вопросам, указывалось, что сахароза и калий участвуют в регуляции осмотического давления (Репу, 1987). Ранее, как правило, рассматривались относительные величины, а не абсолютные концентрации этих компонентов и приводилось средние значения для ткани корнеплода, т. е. отсутствовали данные по отдельным тканям и зонам. Полученные нами результаты позволили детализировать картину и объяснить, почему в

некоторых случаях наблюдалось сопряжение выхода калия из вакуоли и накопления Сахаров, а в некоторых нет. Удалось показать, что увеличение значений осмотического потенциала было достоверно связано с увеличением концентрации сахарозы. Кроме того, нам удалось рассчитать процентный вклад каждого из осмотикообразующих компонентов в клетках на разных стадиях дифференцировки этих клеток и оценить каков их вклад в пересчете на клетку.

При анализе распределения Сахаров и ионов в запасающей паренхиме корнеплода нами была отмечена его полимодальность. Распределение вышеназванных компонентов не подчинялось нормальному закону распределения, поэтому стало очевидным, что применение стандартных методов статистики для дальнейшей оценки будет недостаточно информативным. Так например, проведенный регрессионный анализ мало что говорил об искомых закономерностях распределения и взаимодействии осмотически активных компонентов. По этой причине мы попытались найти иной подход к анализу неравномерного распределения Сахаров и ионов в тканях корнеплода. Этому вопросу посвящена вторая часть наших исследований. Для поиска закономерностей в регуляции осмотического потенциала клеток нами было предложено рассмотреть массивы полученных концентраций как изменяющуюся, динамическую систему. Используя терминологию теории динамических систем, такой способ отображения процесса назвали "фазовым портретом". А сами системы триггерными, т. е. обладающими двумя или несколькими устойчивыми стационарными состояниями, к которым стремится система. Между этими состояниями возможны переходы. Способность триггерной системы к переключению явилась основной предпосылкой ее использования как модели части процессов, ведущих к дифференцировке клеток в ткани. С этой точки зрения каждая клетка обладает определенным набором возможных устойчивых стационарных состояний (в нашем случае на примере осмотически активных веществ), но фактически, в данный момент времени функционирует лишь в одном из них. В процессе дифференциации при росте и развитии происходит "переключение" статуса клетки из одного стационарного режима функционирования в другой путем дискретного перехода. В данной работе при использовании такого подхода проявились закономерности, в соответствии с которыми происходит изменение соотношений сахара/калий в осмотическом балансе клеток. Мы полагаем, что найденные закономерности являются фундаментальными для понимания взаимосвязи осмотической регуляции и развития популяции клеток и тканей различных видов растений.

Чтобы подтвердить этот постулат, в третьей части работы мы провели серию экспериментов на каллусной культуре пшеницы. Полученные результаты позволили установить, что каллусы, в которых образовывались ВД- зоны, имели "сахарный" статус и меняли его на "солевой" в случае разрушения зон вторичной дифференцировки. Этот факт свидетельствует в

пользу предположения о том, что регуляция осмотического баланса в этих зонах идет путем увеличения концентрации Сахаров. Полученные на каллусной культуре ткани пшеницы результаты хорошо согласуются с данными, полученными на красной столовой свекле. Это дает нам основание предполагать, что выявленные закономерности распределения осмотикообразующих компонентов достаточно универсальны и присущи различным видам растений.

Полученные результаты, помимо фундаментального, могут иметь и прикладное значение. Наблюдения за индукцией каллусов из ткани корнеплода красной столовой свеклы показали, что каллусообразование происходит исключительно из клеток зон, имеющих "сахарный" статус. Этот факт может быть использован как для выбора оптимальных условий индукции каллусогенеза и ВД- зон, так и для диагностики состояния эксплантов, с точки зрения их морфогенного потенциала.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что клетки запасающей паренхимы корнеплода красной столовой свеклы, находясь на разных стадиях дифференцировки, отличаются не только размерами, но и химическим составом клеточного сока.

2. Показано, что основными осмотикообразующими компонентами являются водорастворимые сахара и ионы калия, рассчитан процентный вклад этих компонентов в осмотический потенциал клетки.

3. Показано, что для клеток запасающей паренхимы, в зависимости от стадии дифференцировки, характерны два пути поддержания осмотического потенциала. Первый характерен для молодых клеток (зоны ПП), где главными осмотикообразующими компонентами являются водорастворимые сахара (в большей степени сахароза), а второй для более дифференцированных клеток, основными осмолитами в них являются ионы калия.

4. Впервые предложен оригинальный методологический подход для анализа закономерностей распределения Сахаров и ионов в тканях. С помощью этого метода массивы полученных данных рассматриваются как динамическая система на фазовой плоскости ("фазовые портреты").

5. С помощью "фазовых портретов" показано, что в процессе дифференцировки клеток изменяется вклад сахаров и калия в осмотический потенциал. Происходит это путем перехода из одного устойчивого состояния в другое. Переходы осуществляются не плавно, а дискретно, минуя области неустойчивости. Таким образом меняется статус клеток от "сахарного" к "солевому".

6. Установлено, что в клетках запасающей паренхимы после гипотонического стресса сохраняются особенности распределения осмотически активных компонентов в тканях, сохраняются устойчивые и неустойчивые состояния.

7. Подтверждено наличие отмеченных закономерностей в тканях растущих корнеплодов. Предложена схема возможного пути накопления осмотически активных веществ на разных фазах онтогенеза, демонстрирующая формирование устойчивых состояний поочередно в "сахарной" и "солевой" областях.

8. Показано, что волнообразное возникновение зон вторичной дифференцировки в каллусах пшеницы и нарастание их сырой массы сопровождается ритмичным изменением соотношения основных осмотикообразующих компонентов (сахаров и ионов). Это подтверждает наличие двух путей поддержания осмотического потенциала, связанных со степенью дифференциации клеток.

9 Построен "фазовый портрет" распределения Сахаров и ионов в культуре ткани пшеницы. Показано наличие устойчивых стационарных состояний и областей неустойчивости между ними. Подтверждено, что закономерности накопления осмотикообразующих компонентов являются общими для различных растительных объектов

10. Полученные данные о связи морфогенетических процессов (образовании ВД-зон, регенерации) в культуре пшеницы и химической дифференцировки, могут служить основой для разработки методов регуляции морфогенетических процессов в культуре ткани.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Кузеванов В. Я., Лобохо С. В., Труфанова 3. А., Дударева Л. В. Различное соотношение Сахаров и ионов в связи с гетерогенностью клеток красной столовой свеклы// II Всесоюзная конференция по физиологии растительной клетки. Москва, 1986. ИФР АН СССР, С.55. Кузеванов В. Я., Ланкевич С. В., Саляев Р. К. Накопление Сахаров и ионов в растительных тканях// X Сабининский семинар. ИФР АН СССР. 1989. С. 74.

Кузеванов В. Я., Ланкевич С. В., Брук Т. А. Компьютерный анализ химической дифференцировки в тканях растений и каллусах// IV Конференция по физиологии растительной клетки. Минск, 1990. С. 25. Kuzevanov V. Ya. , Nefed'ev L. V., Sumtsova V. M., Lankevich S. V., Salyaev R. K. Growth rhytmicty and chemical differentiation of cells in wheat seedlings and calluses// Abstract of VHth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam June 24-29,1990. P. 300. Кузеванов В. Я., Ланкевич С. В, Брук Т. А., Саляев Р. К. Аккумулирующая функция вакуолей и химическая дифференцировка клеток// II съезд Всесоюзного общества физиологов растений. 1990. Минск. С. 61.

Kuzevanov V. Ya., Sumtsova V. М., Sizych S. V., Lankevich S. V., Brook T. A., Salyaev R. K. Morphogenesis and growth rhythmicity in wheat callus- In:

1.

2.

3.

4.

5.

Golden Jubilee Symposium on Genetic Research and Education (Current Trends and the Next Fifty Years) 1991. New Delhi. V. Ill, P. 856-857.

7. Кузеванов В. Я., Нефедьев JI. В., Сумцова В. М., Ланкевич С. В., Саляев Р. К. Влияние температуры на ригмы роста проростков и каллусов пшеницы// Всесоюзная конференция по генетическим механизмам устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, Новосибирск, 1991. С. 27.

8. Nefed'ev L. V., Kuzevanov V. Ya., Lankevich S. V., Brook T. A., Salyaev R. K. The effect of temperature on growth and circum- nutations of wheat seedlings// Abstracts of Golden Jubilee Simposium on Genetic Research and Education : Current Trends and the next Fifty Years , (New Delhi, February 12-15) New Delhi, 1991. P. 219.

9. Саляев P. К., Ланкевич С. В., Дударева Л. В., Сумцова В. М., Макаренко С. П. Изучение влияния кинетина и низкоинтенсивного лазерного облучения на морфогенез и регенерацию в каллусах пшеницы.// Ш Всероссийский симпозиум «Новые методы в биотехнологии», Пущино, 1995. С. 57.

10. Саляев Р. К., Ланкевич С. В, Кузеванов В. Я., Брук Т. А., Дударева Л. В. Сахарный и солевой статус корнеплода Beta vulgaris L.// ДАН. 1997 Т. 354, №5, С. 710-712.

11. Саляев Р. К., Ланкевич С. В., Сумцова В. М. Сравнительная характеристика процессов морфогенеза и регенерации культуре ткани пшениц и дикорастущих злаков. Влияние некоторых регуляторов роста на эти процессы/ V Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург//Цитология. 1998. Т. 41. № 3\4. С. 308.

12. Саляев Р. К., Ланкевич С. В., Кузеванов В. Я., Дударева Л. В. Закономерности формирования сахарного и солевого статуса клеток в растительной ткани// ДАН. 1999. Т. 364. № 1. С. 140- 142.

13. Саляев Р. К., Дударева Л. В., Ланкевич С. В., Сумцова В. М. Влияние низкоинтенсивного когерентного излучения на морфогенетические процессы в каллусной культуре пшеницы// ДАН. 2001. Т. 376. (6). С. 830-832.

14. Salyaev R. К., Dudareva L. V., Lankevich S. V., and Sumtsova V. M. Low-power laser irradiation as a possible morphogenesis inductor in wheat cultivar callus// Annual Wheat Newsletter. 2002. V. 48. P. 140-141.

»23708

РНБ Русский фонд

2006-4 27199

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ланкевич, Светлана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Вакуоль - гомеостатический компартмент растительной клетки.

Глава 2. Функции вакуоли.

2.1. Лизосомальная функция вакуолей.

2.2. Запасающая функция вакуолей.

2.3. Защитная функция вакуолей.

2.4. Роль вакуоли в трансдукции сигналов в растительных клетках.

2.5. Гомеостатическая регуляция ионного состава цитозоля растительных клеток.

2.6. Осмотическая функция вакуолей.

Глава 3. Методы выделения вакуолей.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы.

4. 1. Растительный материал.

4.1.1. Красная столовая свекла, Beta vulgaris L.

4.1.2. Культура ткани пшеницы Triticum aestivum L. сорта Скала.

4.2. Изучение динамики роста культуры клеток пшеницы.

4.3. Экстракция клеточного сока из тканей корнеплодов красной столовой свеклы.

4.4. Измерение осмотического потенциала и гипотонический стресс.

4.5. Определение водорастворимых Сахаров.

4.6. Определение неорганических ионов.

4.7. Расчет концентрации метаболитов и ионов в клеточном соке.

4. 8. Статистическая обработка данных и построение "фазовых портретов".

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Химический состав клеточного сока из гетерогенных тканей корнеплода.

Глава 6. Осмотически активные компоненты в тканях корнеплода красной столовой свеклы.

Глава 7. Распределение Сахаров и ионов на фазовой плоскости.

7.1. Соотношение сахара/ калий в ткани корнеплода после гипотонического стресса.

7.2. Соотношение сахара/ калий и сахара/ натрий в растущих корнеплодах.

Глава 8. Осмотически активные компоненты в каллусах пшеницы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности распределения осмотически активных компонентов в растительных тканях"

Известно, что центральные вакуоли, состоящие из вакуолярного сока и вакуолярной мембраны (тонопласта) определяют специфику растительных клеток и не встречаются у организмов не относящихся к растениям. Занимая до 90 и более процентов от объема клетки, большие центральные вакуоли играют особую роль в структурной и функциональной организации растительного организма. Они активно участвуют во внутриклеточном накоплении и распределении веществ, что находит отражение во многих их функциях (Саляев, 1969; МаШе, 1975; Андреев, 2001).

Одной из таких функций является участие в поддержании осмотического давления клетки. Об этой функции центральной вакуоли известно достаточно давно. В то время как эта органелла была еще недостаточно изучена, уже было известно, что в регуляции внутриклеточного осмотического давления участвует центральная вакуоль. Позднее было выяснено, что осмотическая функция определяет не только создание упругости клеток, но и поддержание постоянства внутриклеточной среды (равновесия между вакуолярным и цитоплазматическим компартментами) в режиме оптимального метаболического функционирования всей клетки, т. е. участвует в поддержании гомеостаза. Осмотическая регуляция в растительной клетке осуществляется накоплением не только воды, но и осмотически активных компонентов в вакуолях. Эти компоненты могут определять специфику растительных клеток, играя особую роль в их структурной и функциональной организации. Общая стратегия, свойственная осморегуляции растительных клеток с участием вакуоли, состоит в том, что всегда соблюдается строгая сопряженность поступления в вакуоль и выхода из нее тех ионов и метаболитов, которые участвуют в регуляции клеточного тургора. Хорошо известно, что в ряде случаев такой осмотический баланс может достигаться благодаря аккумуляции внутри вакуолярного и цитозольного компартментов осмолитов различной природы.

Изучение закономерностей распределения осмотикообразующих компонентов в клетке, лежащих в основе формирования осмотического потенциала в растительных тканях представляют несомненный интерес для изучения механизмов поддержания гомеостатического равновесия в растениях. Кроме того, эти закономерности тесно связаны с толерантностью растений к различного рода стрессам. Ведь известно, что осмотический потенциал клетки - это форпост, который принимает первый удар неблагоприятных условий, при этом по его изменению можно судить о том, насколько клетка смогла этим условиям противостоять (Андреев, 2001). В настоящее временя динамику распределения и накопления осмотически активных компонентов изучают в связи с различными физиологическими состояниями растений, например с устойчивостью к различным стрессам (Keller, Ludlow, 1993; Yuncai Ни, Schmidhalter, 1998), с осмотической функцией замыкающих клеток устьиц [Poffenroth, 1992; Talbott, 1996; Talbott,

1998), водным режимом, минеральным питанием (Leigh, 1993) и целым рядом других физиологических процессов.

В представляемой работе мы попытались по новому взглянуть на закономерности перераспределения осмотически активных компонентов в тканях растений в процессе формирования гомеостаза и представить полученные данные в виде графических 2-х и 3- мерных изображений, названных нами "фазовыми портретами". А также провести параллель между балансом осмотически активных компонентов в тканях и процессами роста и морфогенеза.

Работа была выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, в лаборатории физиологии растительной клетки. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю чл.- корр. РАН Р. К. Саляеву за постоянное внимание и всестороннюю поддержку.

Автор благодарит также за плодотворную совместную работу JL В. Дудареву и В. М. Сумцову, С. В. Осипову, а также коллектив лаборатории и Н.В. Озолину.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ланкевич, Светлана Владимировна

выводы

1. Установлено, что клетки запасающей паренхимы корнеплода красной столовой свеклы, находясь на разных стадиях дифференцировки, отличаются не только размерами, но и химическим составом клеточного сока.

2. Показано, что основными осмотикообразующими компонентами являются водорастворимые сахара и ионы калия, рассчитан процентный вклад этих компонентов в осмотический потенциал клетки.

3. Показано, что для клеток запасающей паренхимы, в зависимости от стадии дифференцировки, характерны два пути поддержания осмотического потенциала. Первый характерен для молодых клеток (зоны 1Ш), где главными осмотикообразующими компонентами являются водорастворимые сахара (в большей степени сахароза), а второй для более дифференцированных клеток, основными осмолитами в них являются ионы калия.

4. Впервые предложен оригинальный методологический подход для анализа закономерностей распределения Сахаров и ионов в тканях. С помощью этого метода массивы полученных данных рассматриваются как динамическая система на фазовой плоскости ("фазовые портреты").

5. С помощью "фазовых портретов" показано, что в процессе дифференцировки клеток изменяется вклад Сахаров и калия в осмотический потенциал. Происходит это путем перехода из одного устойчивого состояния в другое. Переходы осуществляются не плавно, а дискретно, минуя области неустойчивости. Таким образом меняется статус клеток от "сахарного" к "солевому".

6. Установлено, что в клетках запасающей паренхимы после гипотонического стресса сохраняются особенности распределения осмотически активных компонентов в тканях, сохраняются устойчивые и неустойчивые состояния.

7. Подтверждено наличие отмеченных закономерностей в тканях растущих корнеплодов. Предложена схема возможного пути накопления осмотически активных веществ на разных фазах онтогенеза, демонстрирующая формирование устойчивых состояний поочередно в "сахарной" и "солевой" областях.

8. Показано, что волнообразное возникновение зон вторичной дифференцировки в каллусах пшеницы и нарастание их сырой массы сопровождается ритмичным изменением соотношения основных осмотикообразующих компонентов (сахаров и ионов). Это подтверждает наличие двух путей поддержания осмотического потенциала, связанных со степенью дифференциации клеток.

9. Построен "фазовый портрет" распределения Сахаров и ионов в культуре ткани пшеницы. Показано наличие устойчивых стационарных состояний и областей неустойчивости между ними. Подтверждено, что закономерности накопления осмотикообразующих компонентов являются общими для различных растительных объектов.

10. Полученные данные о связи морфогенетических процессов (образовании ВД-зон, регенерации) в культуре пшеницы и химической дифференцировки, могут служить основой для разработки методов регуляции морфогенетических процессов в культуре ткани.

СПИСОК ПРИВОДИМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АБК - абсцизовая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

В Д-зоны - зоны вторичной дифференцировки

1111 - паренхима прилегающая к проводящим пучкам

МП - межкольцевая паренхима

ПКС - программированная клеточная смерть

Роем - осмотическое давление

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты для удобства обсуждения можно разделить на три части: а) биохимическую, в которой был изучен состав и соотношение осмотикообразующих компонентов в растительной ткани, б) методологическую, в которой был предложен и апробирован вероятностный метод построения "фазовых портретов" для более глубокого изучения закономерностей формирования осмотического потенциала и, наконец, в) анализ связей выявленных закономерностей с процессами роста и морфогенеза.

В первой части было показано, что клетки различных тканей корнеплодов красной столовой свеклы отличаются по химическому составу клеточного сока. Обнаруженные высокие концентрации сахарозы и калия, сопоставимые с показателями осмотической концентрации, дали основание предположить, что эти компоненты могут участвовать в поддержании осмотического потенциала клеток. Участие неорганических ионов, в частности калия, в регуляции осмотических процессов в растениях считается установленным фактом, современные представления отводят им роль основных осмотикообразующих компонентов. В литературе имеются единичные упоминания (Zeigert et al., 1983; Leigh et al., 1993; Talbott et al., 1998) феномена, когда поглощение калия в клетках сопровождалось выходом из них сахарозы. Есть также данные по солеустойчивым видам растений, когда при аккумуляции высоких концентраций натрия в вакуолях, наблюдали снижение в них концентрации Сахаров (Ни Yuncai, 1998). Наиболее детально, этот вопрос рассматривался в цикле работ, посвященных процессам сахаронакопления в корнеплодах сахарной свеклы (Эллиот, 1996). В некоторых статьях посвященных этим вопросам указывалось, что сахароза и калий участвуют в регуляции осмотического давления (Perry, 1986, 1987). К сожалению, рассматривались относительные величины, а не абсолютные концентрации этих компонентов и приводилось средние значения для ткани корнеплода, т. е. отсутствовали данные по отдельным тканям и зонам. Полученные нами результаты позволили детализировать картину и объяснить, почему в некоторых случаях наблюдалось сопряжение выхода калия из вакуоли и накопления Сахаров, а в некоторых нет. Удалось показать, что увеличение значений осмотического потенциала было достоверно связано с увеличением концентрации сахарозы. Кроме того, нам удалось рассчитать процентный вклад каждого из осмотикообразующих компонентов в клетках на разных стадиях дифференцировки этих клеток и оценить каков их вклад в пересчете на одну клетку.

При анализе распределения Сахаров и ионов в запасающей паренхиме корнеплода нами была отмечена его полимодальность. Распределение вышеназванных компонентов не подчинялось нормальному закону, поэтому стало очевидным, что применение стандартных методов статистики для дальнейшей оценки будет недостаточно информативным. Так например, проведенный регрессионный анализ (Рис. 10, 11) мало что говорил об искомых нами закономерностях распределения и взаимодействии осмотически активных компонентов. По этой причине мы попытались найти иной подход к анализу неравномерного распределения Сахаров и ионов в тканях корнеплода. Этому вопросу посвящена вторая часть наших исследований. Известно, что различные биофизические методы уже давно и с успехом применяются для анализа многих биологических процессов (Карманенко, 1997; Кравацкий, 1998) Для поиска закономерностей в регуляции осмотического потенциала клеток нами было предложено рассмотреть массивы полученных концентраций как изменяющуюся, динамическую систему. Используя терминологию теории динамических систем, такой способ отображения процесса назвали "фазовым портретом". А сами системы триггерными, т. е. обладающими двумя или несколькими устойчивыми стационарными состояниями, к которым стремится система. Между этими состояниями возможны переходы. Способность триггерной системы к переключению явилась основной предпосылкой ее использования как модели процессов, ведущих к дифференцировке клеток в ткани (Малкина, 1988; Веселова, 1990). С этой точки зрения каждая клетка обладает определенным набором возможных устойчивых стационарных состояний (в нашем случае на примере осмотически активных веществ), но фактически, в данный момент, времени функционирует лишь в одном из них. В процессе дифференциации при росте и развитии происходит "переключение" клетки из одного стационарного режима функционирования в другой путем дискретного перехода. В данной работе при использовании такого подхода проявились закономерности, в соответствии с которыми происходит изменение соотношений сахара/калий в осмотическом балансе клеток. Помимо исследования на отдельно взятом, зрелом корнеплоде был проведен анализ осмотической регуляции в тканях растущих корнеплодов. В результате мы получили картину формирования осмотического потенциала на разных фазах онтогенеза. Примечательно то, что динамика "фазового портрета" на фазовой плоскости имеет колебательный характер (Рис.13), т. е. наблюдается переход из сахарной области в солевую, затем опять в сахарную, но уже с более высокими концентрациями Сахаров. Такая динамика может служить определенным отражением роста и дифференцировки клеток, т.е. указывать на какой стадии находятся клетки паренхимы корнеплода на данной фазе онтогенеза (Батыгин, 1986).

Полученные результаты дали основание предположить, что найденные закономерности, являются фундаментальными для понимания взаимосвязи осмотической регуляции и дифференциации клеток в тканях различных видов растений.

Чтобы подтвердить этот постулат, в третьей части работы мы провели серию экспериментов на каллусной культуре пшеницы. Был проведен анализ изменений концентраций Сахаров и калия (как отражение осмотического потенциала), были изучены характеристики ростовых процессов (масса калусов), а также образование зон вторичной дифференцировки и регенерантов, как показатели морфогенетических процессов. Полученные результаты позволили нам установить, что каллусы, в которых образовывались ВД-зоны, имели "сахарный" статус и меняли его на солевой" в случае разрушения зон вторичной дифференцировки. Этот факт свидетельствует в пользу предположения о том, что регуляция осмотического баланса в этих зонах идет путем увеличения концентрации Сахаров. Т. е. мы можем утверждать, что процессы морфогенеза и регенерации идут из участков (ВД-зон), в которых концентрация Сахаров выше, т.е. они имеют "сахарный" статус. Полученные на каллусной культуре ткани пшеницы результаты хорошо согласуются с данными по красной столовой свекле. Это дает нам основание предполагать, что выявленные закономерности распределения осмотикообразующих компонентов достаточно универсальны и присущи различным видам растений. Полученные результаты, помимо фундаментального имеют и прикладное значение. Наблюдения за индукцией каллусов из ткани корнеплода красной столовой свеклы показали, что каллусообразование происходит исключительно из клеток зон, имеющих "сахарный" статус. Этот факт может быть использован как для выбора оптимальных условий индукции каллусов и ВД- зон, так и для диагностики состояния эксплантов, с точки зрения их морфогенного потенциала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ланкевич, Светлана Владимировна, Иркутск

1. Андреев И. М. Функции вакуоли в клетках высших растений// Физиология растений. 2001. Т. 48. № 5. С. 777-787.

2. Веселова Т. В., Веселовский В. А., Власенко В. В., Мацкивский В.И., Пеньков Ф.М., Чернавский Д.С. Вариабельность как тест перехода клетки в состояние стресса в условиях интоксикации // Физиология растений. 1990. Т. 37.N.4. С. 32-38.

3. Карманенко Н.М., Платонова JI.C. Моделирование накопления и траты углеводов растениями озимой пшеницы в процессе перезимовки.// Агрохимия, 1997. N. 9. С. 34-37.

4. Кравацкий Ю.В., Полетаев А.И. Двухпараметрический флуоресцентный анализ хромосом человека в потоке. Количественная обработка // Биофизика. 1998. Т.43. N. 2. С. 264- 275.

5. Либберт Д. Физиология растений. М.: Мир. 1976. 345 с. Малкина И. Г., Пых Ю. А. Об одном методе оценки минимального времени прохождения межфазных периодов высшими растениями // Физиология растений. 1988. Т. 35. N. 4. С. 56-60.

6. Павлинова O.A., Прасолова М.Ф. О физиологической роли сахарозосинтазы в корне сахарной свеклы // Физиология растений. 1972. Т. 19. В. 5. С. 920925.

7. Полевой В. В. Физиология растений / М.: Высшая школа. 1989. 464 с. Полевой В.В. Физиология целостности растительного организма // Физиология растений. 2001. Т. 48. №. 14. С. 631- 643.

8. Резников В.М. Философско-методологический анализ понятия независимости в вероятностной теории причинности и в теории вероятностей// Философия науки. 1998. №. 4. С. 60- 65.

9. Рубин А.Б., Пытьева Н.Ф., Ризнеченко Г.Ю. Кинетика биологических процессов / М.: МГУ. 1977. 327с.

10. Саляев Р.К. Поглощение веществ растительной клеткой/ М.: Наука. 1969. 205 с.

11. Саляев Р.К., Козаренко Т.Д., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я. Аминокислотный состав белков изолированной вакуолярной мембраны // Физиология растений. 1983. Т. 30. В. 3. С. 487-491.

12. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В., Каменкова Л.Д., Пузанова H.A. Содержание липидов, белков и углеводов в мембране изолированных вакуолей красной свеклы // Физиология растений. 1982. Т. 29. В. 5. С. 933940.

13. Саляев Р.К., Ланкевич С.В., Кузеванов В.Я., Брук Т.А., Дударева Л.В.// ДАН. 1997. Т. 354. N. 5. С. 710-712.

14. Саляев Р.К., Пузанов В.И. Свободное пространство и гомеостаз растительной клетки // ДАН. 1984. Т. 276. N. 4. С. 1022-1024.

15. Физико-химические методы анализа. / Под ред. В.Б. Алексеевского. Л.: Химия. 1988. 138 с.

16. Хаптагаева Е.А., Корзун A.M., Саляев Р.К. Радиальное распределение ионов и бетанина в ткани корнеплода красной столовой свеклы // Оперативные информационные материалы/ АН СССР, Сибирский институт физиологии и биохимии ратений. Иркутск. 1982. С. 13-16.

17. Salyaev R.K. Plant vacuole membrane: structure and properties // Biochem. and function of vacuolar adenosine-triphosphatase in fungi and plants/ SpringerVerlag. N.Y. 1985. P. 3-13.

18. Akita, T., Y. Hina V., Nishi T. New medium composition for high betacyanin production by a cell suspension culture of table beet (Beta vulgaris L.) // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 2002. V.66. N. 4: P. 902-905.

19. Albert G., Carrasco A., Boudet A. M. Chenges in biochemical composition of vacuoles isolated from Acer pseudoplatanus L. during cell culture // Biochimica et Biophysica Acta. 1982. V. 721. P. 22-29.ry j

20. Alexandre J., Lassales J.P., Kado R.T. Opening of Ca Channels in Isolated Red Beet Vacuole membrane by Inositol- 1,4,5-trisphosphate// Nature. 1990. V. 343. P. 567-570.

21. Tonoplast Aquaporin BobTIP26-l in Cauliflower Cells // Planta. 1999. V. 209. P. 77-86.

22. Beers E. P., Freeman T.B. Proteinase Activity during Tracheary Element Differentiation in Zinnia Mesophyll Cultures // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 873 -880.

23. Bergs A. R., Peacock K. Growth patterns in nutating and nonnutating sunflower (Helianthus annuus) hypocotyls // American Journal of Botany. 1992. V.79. N. 1. P. 77- 85.

24. Blumwald E., Poole R.J. Salt Tolerance in Suspension Cultures of Sugar Beet. Induction of Na+/ H+ Antiport Activity at the Tonoplast by Growth in Salt //Plant Physiol. 1987. V. 83. P. 884- 887.

25. Bohnert H.J., Jensen R.G. Strategies for Engineering Water- Stress Tolerance in Plants // Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 89- 97.

26. Boiler T., Kenge H. Hydrolytic enzymes in the central vacuole of plant cells // Plant Physiol. 1979. V. 63. N. 6. P. 1123- 1132.

27. Buvat R. Vesicules "alveolees" et vesicules "epineuses" dans les racines de l'Orge (.Hordeum sativum)/! C. r. Acad. Sci. 1981. Ser. 3. V. 292. N. 13. P. 825832.

28. Canut H., Alibert G., Boudet A.M. Hydrolysis of Intracellular Proteins in Vacuoles Isolated from Acer pseudoplatanus L. Cells // Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 10901093.

29. Canut H., Alibert G., Carrasco A., Boudet A.M. Rapid Degradation of Abnormal Proteins in Vacuoles from Acer pseudoplatanus L. Cell // Plant Physiol. 1986.V. 81. P. 460-463.

30. Chrispeels M. J. Sorting of proteins in the secretory system // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1991. V. 42. P. 21-53.

31. Chrispeels M.J., Daniels M.J., Weig A. Aquaporins and Water Transport

32. Across the Tonoplast // Adv. Bot. Res. 1997. V. 25. P. 420-432.

33. Cocking E.C. A method for isolation of plant protoplasts and vacuolrs // Nature.1960. V. 187. N. 4741. P. 962-963.

34. Conditions // Planta. 1998. V. 204. P. 212-219.

35. Evans H.J., Sorger G.J. Role of Mineral Elements with Emphasis on the Univalent

36. Cations// Annu. Rev. Plant Physiol. 1966. V. 17. P. 271-303.

37. Flowers T.J., Yeo A.R. Ion Relations of Salt Tolerance // Solute Transport in Plant

38. Cells and Tissues / Eds Baker D.A., Hall J.L. N.Y.: Longman. 1988. P. 392-416.

39. Garbarino J., DuPont E.M. Rapid Induction of Na+/H+ Exchange Activity in

40. Barley Root Tonoplast // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 1-4.

41. Gilrou S., Read N.D., Trewavas A.J. Evaluation of Cytoplasmic Calcium by Caged

42. Calcium or Caged Inositol Trisphosphate Initiates Stomatal Closure // Nature.1990. V. 346. P. 769-771.

43. Girod P.A., Zryd J.P. Clonal variability and light induction of betalain synthesis in red beet cell cultures // Plant Cell Reports. 1987. V. 6. P. 27-30.

44. Grob K., Matile P. Vacuolar location of glucosinolates in horseradish root cells // Plant Sci. Lett. 1979. V. 14. N. 4. P. 327-336.

45. Groover A., Jones A.M. Tracheary Element Differentiation Uses a Novel Mechanism Coordinating Programmed Cell Death and Secondary Cell Wall Synthesis // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 375- 384.

46. Hartmann C., Dronet A., Cormier F., Nivet C., Riganet C. Aging of cilinders excised from pulp tissues of the Golden delicious apple // Plant Physiol. 1984. V. 74. N. 2. P. 280-384.

47. Higgins C.F. ABC Transporters: from Microorganisms to Man // Annu. Rev. Cell Biol. 1992. V. 8. P. 67-113.

48. Hortensteiner S., Vogt E., Hagenbuch B., Meier P.J., Amrhein N., Martinoia E. Direct Energization of Bile Acid Transport into Plant Vacuoles // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1844-1849.

49. Huang C.X.,Van Steveninck R.F.M., Longitudinal and Transverse Profiles of K+ and CI" Concentrations in "Low"- and "High- Salt" Barley Roots // New Phytol. 1989. V. 112. P. 475-480.

50. Jeschke W.D., Stelter W. Measurement of Longitudinal Ion Profiles in Single Roots of Hordeum and Atriplex by Use of Flameless Atomic Absorption Spectroscopy//Planta. 1976. V. 128. P. 107-112.

51. Kaplan D., Glass L. Understanding nonlinear dynamics : Springer- Verlag, 1993.

52. Kime M.J., Ratcliffe R.G., Loughman B.C. The Application of 31P Nuclear Magnetic Resonance to Higher Plant Tissues. II. Detection of Intracellular Changes// J. Exp. Bot. 1982. V. 33. P. 670- 681.

53. Kreuz K., Tommasini R., Martinoia E. Old Enzymes for a New Job: Herbicide Detoxifications in Plant // Plant Physiol. 1996. V. 111. P.349-353.

54. Kujala T.S., Loponen J.M., Pihlaja K. Betalains and phenolics in red beetroot {Beta vulgaris) peel extracts: Extraction and characterization // Z. Naturforsch. 2001. V. 56. P. 343-348.

55. Kujala T.S., Vienola M.S., Klika K.D. Loponen J.M., Pihlaja A.K. Betalain and phenolic compositions of four M.S. beetroot {Beta vulgaris) cultivars // European Food Research and Technology.2002. Y.214. P. 505-510.

56. Kuriyama H. Loss of Tonoplast Integrity Programmed in Tracheary Element Differentiation // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 763-774.

57. Z.-S., Lu Y.-P., Zhen R.G., Szczypka M., Thiele D.J., Rea P.A. A New Pathway for Vacuolar Cadmium Sequestration in Saccharomyces cerevisiae :YCF1-Catalyzed Trasport of bis(glutathionato) cadmium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 42-47.

58. Z.-S., Zhao Y., Rea P.A. Magnesium Adenosine 5'-Trisphosphate-Energized Transport of Glutathione S-Conjugates by Plant Vacuolar Membrane Vesicles // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1257-1268.

59. Mannervik B., Danielson U.H. Glutathione Transferases: Structure and Catalytic Activity// CRC Crit. Rev. Biochem. 1988. V. 23. P. 237-283 Marinos N.G. Vacuolation in plant cells // J. Ultrastr. Res. 1963. V. 9. N. 1-2. P.177-185.

60. Martinoia E., Grill E., Tommasini R., Kreuz K., Amrhein N. An ATP-dependent glutathione S-conjugate "Export" pump in the vacuolar membrane of plants // Nature. 1993. V. 364. P. 247-249.

61. Martinoia E., Heck U., Wiemken A. Vacuoles as Storage Compartments for

62. Nitrate in Barley Leaves // Nature. 1981. V. 289. P. 292- 293.

63. Marty F. Dissemblance des faces golgiennes et activité des dictyosomes dans lescellules en cours de vacuolization de la racine d'jEuphorbia characias L. Il

64. Comptes Rendus de 1' Academie des Sciences (Paris). 1975. V. 277. P. 1749-1752.

65. Marty F. Microscopie électronique a haute tension de l'appareil provacuolaire dansles cellules meristematiques des raciness de radis (Raphanus sativus L.). Annalesdes Sciences Naturelles, Botanique (Paris). 1983. V. 5. P. 245-260.

66. Marty F., Branton D., Leigh R.A. Plant vacuoles // Biochemistry of plants / Ed.

67. Tolbert. N.Y. Acad. Press. 1980. V. 1. P. 625-658.

68. Marty F., Plant Vacuoles// The Plant Cell. 1999. V.l 1. P. 587-599.

69. Marty F., The Biogenesis of Vacuoles: Insights from Microscopy // Advances in Botanical Research V. 25. Academic Press L., 1997.

70. Matile P. Biochemistry and Function of Vacuoles // Plant Physiology. 1978. V. 29. P. 193-213.

71. Matile P. Enzymologie pflanzlicher Zellkompartimente //Ber. Dtsch. Bot. Gez. 1969. V. 82. N. 5/6. P. 397-405.

72. Matile P. Lysosomes Dynamic aspects, of plant ultrastructure // Plant. Physiol. 1974. V. 6. N. 10. P. 178-218.

73. Matile P. The litic compartment of plant cells// Cell Biology monographs.- Wien, N.Y.: Springer-Verlag. 1975. V. 1.

74. Matile P. Vacuoles // Plant Biochem., Third Edition Acad. Press inc. 1976. Matile P. Vacuoles come of age // Physiologia Vegetarum. 1982. V. 20. P. 303310.

75. Matile P., Aleurone vacuoles as lysosomes// Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie. 1968. V. 58. P. 365-368.

76. Matile P., Jons B., Rickenbacher R. Vacuoles of Chelidonium latex: lysosomal properties and accumulation of alkaloids// Biochem. Physiol. Pflanzen. 1970. V. 161. N. 3. P. 447-458.

77. Matile P., Lysosomes of root tip cells in corn seedlings // Planta. 1968. V.79. Matile P., Moor H. Vacuolation: origin and development of the lysosomal apparatus in root-tip cells // Planta. 1968. V. 80. N. 2.

78. Matile P., Wiemlcen A. Interactions between Cytoplasm and Vacuole // Encyclopedia of Plant Physiologi.New Series. 1976. V. 3.

79. Matile P., Wiemken A. The vacuoles as lysosome of the yeast cells // Arch. Microbiol. 1967. V. 56. N. 2. P. 148-155.

80. Matile P., Winkenbach F. Function of Lysosomes and Lysosomal Enzymes in the Senescing Corolla of the Morning Glory (Ipomoea purpurea) // J. Exp. Bot. 1971. V. 22. P. 759-771.

81. Matsumoto H., Chung G.C. Increase in Proton-Transport Activity as an Adaptive Response of Barley Roots to NaCl Stress // Plant Cell Physiol. 1988. V. 29. P. 1133-1140.

82. Maurel C., Tacnet F., Guclu J., Guern J., Ripoche P. Purified Vesicles of Tobacco Cell Vacuolar and Plasma Membranes Exhibit Dramatically Different Water permeability and Water Channel Activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.7103-7108.

83. Mettler I. J., Leonard R. T. Isolation and partial characterization of vacuoles from tobacco protoplasts // Plant Physiol. 1979. V. 64. K 6. P. 1114-1120.

84. Mitchell, S.C. Food idiosyncrasies: Beetroot and asparagus // Drug Metabolism and Disposition. 2001. V. 29. N. 4. P. 539-543.

85. Mosekilde E., Mouritsen O.G., Modelling the dynamics of biological systems:

86. Nonlinear phenomena a pattern formation, Springer, Berlin, 1995. 294 p.

87. Moskowitz A.H., Hrazdina G. Vacuolar contents of fruit subepidermal cells from

88. Vitis species II Plant Physiol. 1981. V. 68. N. 5. P. 686-692.

89. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue culture // Phys. Plant. 1962. N. 15. P. 473-497.1. N. 3,P. 181-196.

90. Niedermeyer W., Parisch G. R., Moor H. The elasticity of the yeast cell tonoplast related to its ultrastracture and chemical composition // Cytobiologie. 1976. V. 13. P. 364-379.

91. Nishimura M., Beevers H. Hydrolysis of protein in vacuoles isolated from higher plant tissue // Nature. 1979. V. 277. N. 5695. P. 412-413.

92. Nishimura M., Beevers H. Hydrolases in vacuoles from Castor Bean endosperm // Plant Physiol. 1978. V. 62. N. 1. P. 44-48.

93. Owens T., Poole R.J. Regulation of Cytoplasmic and Vacuolar Volumes by Plant Cells // Plant Physiol. 1979. V. 64. P. 900- 904.

94. Pantoja O., Dainty J., Blumwald E. Ion Channels in Vacuoles from Halophytes and Glyocophytes // FEBS Lett. 1989. V. 255. P. 92-96.

95. Pantoja O., Gelly A., Blumwald E. Voltage- Dependent Calcium Channels in Plant Vacuoles // Science. 1992. V. 255. P. 1567- 1570.

96. Poffenroth M., Green D.B., Tallman G. Sugar concentrations in guard cells of Vicia faba illuminated with red or blue light // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 14601471.

97. Preisser J. , Sprugel H., Komor E. Solute distribution between vacuole and cytosol of sugarcane suspension cells: Sucrose is not accumulated in the vacuole // Planta. 1992. V. 186. P. 203-211.

98. Raush T., Kirsch M., Low R., Lehr A., Vierech R., Zhigang A. Salt Stress Responses of Higher Plants: the Role of Proton Pumps and Na+/H+ Antiporter // J. Plant Physiol. 1996. V. 148. P. 425-433.

99. Rea P.A., Li Z.-S., Lu Y.-P., Drozdowicz Y.M., Martinoia E. From vacuolar GS-X Pumps to Multispecific ABC Transporters // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 727-760.

100. Rea P.A., Sanders D. Tonoplast Energization: Two Ii+ Pumps, One Membrane // Physiol. Plant. 1987. V. 71. P. 131-141.

101. Rebeille F., Bligny R., Martin J.B., Douce R. Effect of Sucrose Starvation on Sycamore {Acer pseudoplatanus) Cell Carbohydrate and P; Status// Biochem. J. 1985. V. 226. P. 679-684.

102. Rebeille F., Bligny R., Martin J.B., Douce R. Relationship between the Cytoplasm and the Vacuole Phosphate Pool in Acer pseudoplatanus Cells // Arch. Biochem. Biophys. 1983. V. 225. P. 143- 148.

103. Reuveni M., Bennet A.B., Bressan R. A., Hasegawa P.M. Enhanced H+ Transport Capacity and ATP Hydrolysis Activity of the Tonoplast H+-ATPase after NaCl Adaptation // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 524-530.

104. Roberts J. K. M., Wemmer D., Ray P. M., Jardetzky O. Regulation of Cytoplasmic and Vacuolar pH in Maize Root Tips under Different Experimental Condition // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 1344-1347.

105. Ryan C.A., Walker- Simmons M. Plant Vacuoles // Metods in Enzymology. 1983. V. 69. P. 69-84.

106. Sanders D., Brownlee C., Harper J. F. Communicating with Calcium // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 691-706.

107. Saunders G. A. Investigation of vacuoles isolated from tobacco. I. Quantification of nicotine // Plant Physiol. 1979. V. 64. P. 74-78.

108. Smart C.M. Gene Expression During Leaf Senescence // New Phytol. 1994. V. 126. P. 419- 448.

109. Smeelcens S. Sugar- Induced Signal Transduction in Plants Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000, 51: 49-81. Springer-Verlag, 1995.

110. Steffens J.C. The Heavy Metal-binding Peptides of Plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 553-575.

111. Strasser H., Tietjen K.G., Himmelspach K., Mattern U. Rapid Effect of an Elisitor on Uptake and Intracellular Distribution of Phosphate in Cultured Parsley Cells // Plant Cell Rep. 1983. V. 2. P. 140-143.

112. Talcahashi K., Isobe M., Knight M.N., Trewavas A.J., Muto S. Hypo-Osmotic Shock Induces Increases in Cytosolic Ca2+ in Tobacco Suspension Culture Cells // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 587-594.

113. Talbot L.D., Zeiger E. The role of sucrose in guard cell osmoregulacion // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 329-337.

114. Wagner G. J. Content and vacuole/extravacuol distribution of neutral sugars, free amino acids, and anthocyanin in protoplasts // Plant Physiol. 1979. V. 64. N. l.P. 88-93.

115. Wagner G.J., Siegelman H.W. Large-scale isolation of intact vacuoles and isolation of chloroplast from protoplast of mature plant tissues // Science. 1975. V. 190. N. 4221. P. 1298-1299.

116. Wiebe H. H. The Significance of plant vacuoles // Biosceince. 1978. V. 28. N. 65. P. 327-331.

117. Willenbrinlc J. Die pflanzliche Vacuole als Speicher// Naturwissenschaften. 1987. V. 74. P. 22-29.

118. Wink M. The Plant Vacuole: A Multifunctional Compartment// J. of Experimental Botany. 1993. V. 44. P. 231-246.

119. Wu Y., Kuzma J., Marechal E., Graeff R., Lee H.C., Foster R., Chua N.-H. Abscisic Acid Signaling Through Cyclic ADP-Ribose in Plant // Science. 1997. V. 278. P. 2126-2130.

120. Wyn Jones R.G., Pollard A., Proteins, Enzymes and Inorganik Ions // Encyclopedia of Plant Physiology. New series/Eds Lauchli A., Pirson A., Berlin: Springer, 1983.V. 15B. P. 528- 562.

121. Yancey P.H. Compatibl and Counteracting Solutes // Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation/ Ed. Strange K. Boca Raton: CRC Press, 1994. P. 82-109.

122. Yu S. M. Cellular and Genetic Responses of Plants to Sugar Starvation // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 687- 693.

123. Yuncai Hu, Schmidhalter U. Spacial distributions and net deposition rates of mineral elements in the elongating wheat (Triticum aestivum L.) leaf under saline soil

124. Zeiger E. The biology of stomatal guard cells // Annu. Rev. Plant Physiol. 1983. V. 34. p. 441-475.

125. Zimmermann U. Physics of Turgor- and Osmoregulation// Annu. Rev. Plant Physiol. 1978. V. 29. P. 121- 148.

126. Zimmermann U., Steudle E. Physical Aspects of Water Relation of Plant Cells // Adv. Bot. Res. 1968. V. 6. P. 45-117.