Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация гена вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Идентификация гена вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений"
Васекина Анастасия Владимировна
Идентификация гена вакуолярного
Ка+/Н+- антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений
03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 /, ДПР 2011
Москва 2011
4843898
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).
Научный руководитель:
докторбиологических наук, профессор
Бабаков Алексей Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук кандидат биологических наук
Носов Александр Владимирович Воронина Ольга Львовна
Ведущая организация:
Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.
Защита состоится «. 2011 г. в М на заседании
диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42. Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: iab@iab.ac.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Автореферат разослан
» о Ъ 2011 г., размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Меликова С.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Засоление почв является одним из неблагоприятных факторов внешней среды, который в настоящее время значительно лимитирует производство сельскохозяйственной продукции в южных регионах и на орошаемых угодьях (FAO 2008, http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush1. Современная стратегия получения солеустойчивых растений базируется на знании молекулярно-биологических и биохимических механизмов, участвующих в формировании устойчивости. Способность растений выживать в условиях высоких концентраций NaCl связана с имеющимися у них возможностями транспортировки, компартментации, выделения и мобилизации ионов Na+ [Apse & Blumwald 2007]. Среди большого набора ионных транспортеров и каналов, опосредующих эти процессы, важная роль принадлежит Na+/H+-антипортерам плазмалеммы и тонопласта. Эти белки удаляют ионы натрия из цитозоля в апопласт либо компартментируют их в вакуоль в обмен на протоны, используя протонный градиент, генерируемый Н+- насосами плазмалеммы и тонопласта [Niu et al. 1995]. Имеются данные о том, что сверхэкспрессия генов вакуолярных Na+/H+- антипортеров приводит к значительному повышению солеустойчивости как растений Arabidopsis thaliana, так и целого ряда культурных растений [Munns & Tester 2008]. Вакуолярные Na+/H+- антипортеры представлены мультигенным семейством родственных изоформ (NHXs), имеющих сходную двухдоменную структуру, но различающихся, по-видимому, спецификой регуляции экспрессии, транспортной активности и ионной селективности, а также локализацией [Rodríguez-Rosales et al. 2009]. Особенности- экспрессии и функции отдельных NHX-изоформ недостаточно исследованы.
Цель данной работы заключалась в идентификации кДНК гена Na+/H+-антипортера в ячмене, изучении локализации и особенностей транспортной активности продукта гена, в определении взаимосвязи между изменением
экспрессии гена при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя, а также в оценке возможности использования гена для повышения солеустойчивости растений.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Определить нуклеотидную последовательность кДНК изоформы Ыа7Н+- антипортера в ячмене;
• Исследовать внутриклеточную локализацию №+/Н+-антипортера и локализацию в различных органах и тканях;
• Показать транспортную активность данной изоформы и оценить ее вклад в общий Ыа7н+-обмен на тонопласте;
• Установить особенности регуляции экспрессии идентифицированной изоформы Ыа+/Н+-антипортера при солевом стрессе в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя;
• Экспрессировать полученный ген в модельном растении АгаЫс1ор.из гкаИапа и оценить солеустойчивость трансгенных растений.
Научная новизна. В данной работе была идентифицирована нуклеотидная последовательность, кодирующая новую изоформу вакуолярного На7Н+-антипортера ячменя НуЫНХ2 (ГенБанк, Acc.No. АУ247791). Показано, что данная изоформа вносит значительный вклад в общий Ыа+/Н+-обмен на тонопласте клеток ячменя. Показано, что экспрессия НуИНХ2 в условиях солевого стресса характеризуется органо- и сортоспецифичностью и регулируется на пост-транскрипционном уровне. Впервые обнаружена взаимосвязь между увеличением количества белка Ну>ЩХ2 при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя к засолению. Обоснована возможность использования геца Н\ЫНХ2 для получения трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к солевому стрессу.
Апробация работы. Копии кДНК идентифицированного нами гена Н\>N¡1X2 были переданы в Институт молекулярной биологии и биохимии им.
МЛ. Айтхожина (Алматы, Казахстан) и в Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия) для проведения работы по трансформации растений табака (Nicotiana tabacum L.) и картофеля (Solarium tuberosum L.) соответственно. В результате было продемонстрировано значительное повышение солеустойчивости трансгенных растений табака [Низкородова и др. 2009] и картофеля [Баят и др. 2010], несущих ген HvNHX2 вакуолярного Ка+/Н+-антипортера ячменя. Полученные данные подтверждают практическую значимость наших результатов, т.к. свидетельствуют о способности гена HvNHX2 улучшать солеустойчивость некоторых видов культурных растений.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 201 источник. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 30 рисунков.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В качестве объекта исследования использовали корни и листья 7-дневных проростков ячменя (Hordeum vulgare L.) разных сортов из коллекции Всероссийского института растениеводства имени Н.И. Вавилова: Белогорский (К-22089), QB60.1 (К-30369) - чувствительные к засолению; Эло (К-29006), Эквадор (К-21576) - солеустойчивые; Московский 121 (К-19417) - средней устойчивости.
Выращивание растений. Растения ячменя выращивали в водной культуре в климатической камере Gallenkamp Fitotron 600Н (Великобритания) 7 суток при температуре 25°С и 12-часовом фотопериоде на 0,2х среде Кнопа. Для выделения мембран и РНК из корней проростков ячменя солевой стресс создавали добавлением в среду 150 мМ NaCl
продолжительностью 1 сутки, а из листьев - ступенчатым добавлением NaCl и общей продолжительностью 4 суток.
Выделение плазматических и вакуолярных мембран из растительного материала. Плазматические мембраны очищали распределением микросомальной фракции в двухфазной полимерной системе декстран Т500/ПЭГ 3350 [Widell et al. 1982]. Вакуолярные мембраны очищали флотационным методом [Maeshima & Yoshida 1989].
Тотальную РНК выделяли, используя реактив Тризол («Invitrogen», США), в соответствии с рекомендацией производителя. Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» [Sambrook & Russell 2001]. Реакции 3 '-RACE-ПЦР проводили по методике фирмы «Clontech» (США) в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия).
Экспрессию гена HvNHX2 измеряли ОТ-ПЦР в реальном времени, используя пару ген-специфичных праймеров, подобранных к фрагменту 3'-нетранслируемого участка кДНК HvNHX2. Для нормализации исходного количества кДНК амплифицировали фрагмент гена актина (ГенБанк, Асс. No. AY145451). Определение количества ПЦР-продукта в образцах в режиме реального времени осуществляли при помощи флуоресцентно меченных гибридизационных зондов TaqMan («Синтол», Россия) на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Россия).
Плазмидную ДНК выделяли, используя набор Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System («Promega», США). Нуклеотидную последовательность определяли на автоматическом секвенаторе AhFexpress II («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания) в группе анализа геномов ВНИИСБ.
Получение рекомбинантного белка, состоявшего из целлюлозо-связы-вающего домена из Anaerocellum thermophilum и С-концевого фрагмента HvNHX2 (57 а.о.), проводили по методике, разработанной в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ.
Рекомбинантный белок экспрессировали в клетках Е. coli (штамм М15), выделяли из бактерий и очищали на целлюлозе. Конъюгат белка с целлюлозой использовали для иммунизации кролика.
Вестерн-блоттинг. SDS-электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в мини-камере SE-250 («Hoefer», США). Электрофоретически разделенные полипептиды переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super™ («Amersham», Великобритания) на приборе Multiphor II («LKB», Швеция). Полипептидные полосы визуализировали, используя систему усиления хемилюминесцентного сигнала ECL+, («Amersham», Великобритания).
Na /Н*-обменную активность в мембранных везикулах регистрировали по изменению разности поглощения при 492 и 540 нм проникающего дрН-чувствительного индикатора акридинового оранжевого [Palmgren 1991]. Оптические измерения проводили на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония).
Локализацию HvNHX2 в клетках корней проростков ячменя определяли путем инкубирования полутонких срезов корня с антителами против HvNHX2 и антикроличьими антителами, конъюгированными с флуорохромом СуЗ («Sigma», США), и последующего анализа срезов с помощью микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия).
Ооциты гладкой шпорцевой лягушки (Xenopus laevis L.J подготавливали согласно [Colman 1984] и экспрессировали в них ген HvNHX2 как описано Miller и Zhou (2000). Функциональную активность Ыа+/Н+-антипортера ячменя в мембранах ооцитов подтверждали путем измерения закисления внешней среды ооцитами согласно методу, описанному ранее [Towle et al. 1991].
Трансгенные растения Arabidopsis thaliana L. получали стандартным методом «floral dip» [Zhang et al. 2006].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация кДНК гена вакуолярного Ка+/Н+-антипортера ячменя.
В известных аминокислотных последовательностях вакуолярных Na+/H+-антипортеров из различных растений нами были найдены наиболее консервативные участки и сконструированы вырожденные праймеры для амплификации методом ОТ-ПЦР центрального фрагмента (404 п.н.) Na+/H+-антипортера Hordeum vulgare. Далее, методом З'-ЯАСЕ-ПЦР амплифицировали З'-фрагмент кДНК (816 п.н.). Используя высокую гомологию полученных фрагментов к TaNHX пшеницы, методом последовательных ОТ-ПЦР амплифицировали недостающий 5'-фрагмент (981 п.н) кодирующей части кДНК. Суммарная нуклеотидная последовательность кДНК была получена после секвенирования и объединения 5'-, 3'- и центрального фрагментов. кДНК представлена олигонуклеотидом размером 1941 п.н. (без 5'-нетранслируемого участка), имеет одну открытую рамку считывания (стартовый кодон - 1; стоп кодон -1639; размер нетранслируемого 3'- концевого участка равен 300 п.н.) и кодирует белок из 546 аминокислотных остатков.
Идентифицированная нами нуклеотидная последовательность, названная HvNHX2, занесена в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером Асс. No. AY247791, белок-Асс. No. АА091943.
Анализируя профиль гидрофильности и гидрофобности аминокислотной последовательности, компьютерные программы предсказали наличие у HvNHX2 10-12 трансмембранных сегментов на N-конце и гидрофильного С-концевого домена длиной 108 а.о. Профиль гидрофобности HvNHX2, приведенный на рис. 1, совпадает с общими представлениями о структуре катион/протонных антипортеров растений, животных, дрожжей: N-терминальный гидрофобный и С- терминальный гидрофильный домены [Rodriguez-Rosales et al. 2009]. Выбор между возможными положениями HvNHX2 в вакуолярной мембране был сделан нами в пользу
цитоплазматической ориентации С-конца, которая подтверждена данными эксперимента по изучению действия антител против НуЫНХ2 на Иа+/1-Г-обменную активность везикул тонопласта (см. далее).
В аминокислотной последовательности КМЧНХ2 обнаружены некоторые функциональные мотивы и сайты посттрансляционной модификации (рис. 1), в частности, консервативный домен 84 1РР1У1ХРР1 94, определяющий сайт связывания амилорида - специфичного ингибитора многих Иа7Н+-антипортеров [СоипШоп (Н а1.1993].
ЦИТОПЛАЗМА
• v ' ~ (
^т ро т^ ^ М Рв \zvvr ^ррр КрМкрМ
к
ВАКУОЛЬ "эт-рр
Рис. 1. Модель укладки аминокислотной последовательности НуN11X2 в вакуолярной мембране клеток ячменя, созданная на основе предсказанного трансмембранного строения ШМНХ2 программами ТМНММ (\\'\\"Л'.сЬз.ёШ.с1к/5егу1сс5/ТМНММ_2.0) и ТМРКЕБ (http://wvw.ch.embnet.orgЯMPRED). 11т1у1л.1'1ч - предсказанный амилорид-связывакяций сайт; ККЕЬНР - предсказанный сайт связывания белков 14-3-3; Ц(ЖИ\ШШ\'1.СУ,1,и;1Х - «лейциновая молния»; Б, Т, V - аминокислотные остатки в сайтах фосфорилирования; N - остаток аспарагина в сайтах КГ-гликозилирования; С - остатки цисгеина, способные сформировать дисульфидные связи.
Далее, в области цитоплазматической петли между X и XI трансмембранными сегментами обнаружена последовательность 371
KKESHP 376, характерная для сайтов связывания белков 14-3-3 [Sehnke et al. 2002], что позволяет предположить возможный механизм регуляции HvNHX2 путем фосфорилирования/дефосфорилирования. Подобный механизм с участием белков 14-3-3 показан в активации На+/Н+-антипортера млекопитающих [Lehoux et al. 2001]. В VII-м трансмембранном сегменте имеется мотив «лейциновая молния», посредством которого возможно образование димеров белковых молекул [Dang et al. 1989]. Доказано, что Ыа+/Н+-антипортер Escherichia coli NhaA функционирует в мембране в виде гомодимера [Gerchman et al. 2001, Hilger et al. 2007].
HvNHXl: HvNHX3: HVNHX2: HVNKX4:
MAFEWAAQ^RIiSDAgSTS
----------mg|gl|dpp|
■MGPDLGÄSfcRYTpSvsgjDj -mEYlJGQv:
HvNHXl HVNHX3 HVNHX2 HVNHX4
HvNHXl: HVNHX3: HVNHX2 : HvNHX 4 :
jjiEgFLFLYVC:
iIeIflflyvg i|f|flflyvg ¡t.|r|fvfiymc:
ррдшжр 414 Jlq3vhelpeghg|| 3 97
HvNHXl HvNHX3 HvNHX2 HvNHX4
460 *
||jASSN----GDPgEPSj
e|HLTREVSAL^B|
BgpJfpG------TAADlI
[dvigde------n|sie|
HvNHXl HVNHX3 HvNHX2 HvNHX4
:ednn(
UKUHCPGISTSE,:
560
---538
— 541 ürs 546 510
Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей HvNHX2 и других ШХ-изоформ ячменя: НуШХ1 (Асс. Ыо. ВАС56698), НуШХЗ (Асс. Ыо. АВ062853), НуЫНХ4 (Асс. N0. АВС42029). Трансмембранные спирали обозначены римскими цифрами.
Как видно из выравнивания аминокислотных последовательностей HvNHX2 и HvNHXl, 3, 4 (рис. 2), наблюдается значительная консервативность N-концевого домена и вариабельность С-концевого домена этих изоформ. По всей вероятности, гидрофобный N-концевой домен отвечает за ионный обмен [Wiebe et al. 2003], а с С-терминальным доменом связана регуляция транспортной активности и катионной селективности ионных транспортеров [Hamada et al. 2001а, Waditee et al. 2001]. Высокая степень вариабельности С-терминальных доменов изоформ вакуолярного Na+/H+-aiiTiinopTepa ячменя, по-видимому, указывает на специфическую регуляцию активности этих транспортеров в разных тканях и органах или на разных стадиях онтогенеза.
Аминокислотная последовательность HvNHX2 имеет высокую гомологию с вакуолярными Ыа+/Н+-антипортерами из других растений (более 70%), меньшую гомологию - с эндосомальными антипортерами человека, животных, грибов и бактерий (около 30%). Парная гомология аминокислотных последовательностей NHX-изоформ ячменя составляет около 70% для HvNHXl, 2 и 3 и около 30% - между HvNHXl-З и HvNHX4.
На рис. 3 представлен филогенетический анализ последовательности HvNHX2. Согласно филогенетическому дереву, HvNHX2 наиболее близки TaNHXl и TaNHX3 пшеницы и OsNHXl и OsNHX2 риса. HvNHX2 также близкородственна изоформам HvNHXl,3. При этом изоформы HvNHXl-3 кластеризуются с AtNHXl-AtNHX4 арабидопсиса, в то время как HvNHX4 входит в кластер с AtNHX5-AtNHX6 и LeNHX2. Известно, что изоформа AtNHXl способна обменивать протоны на ионы как Na, так и К [Apse et al. 1999], в то время как LeNHX2 с гораздо большей эффективностью обменивает ионы Н на ионы К, чем на Na+ [Venema et al. 2003].
Таким образом, согласно данным анализа структуры белка и филогенетического анализа последовательности, идентифицированная нами изоформа HvNHX2 принадлежит к группе NHX-белков класса I
(вакуолярные) семейства СРА1 катион/протонных антипортеров (по классификации Saier с соавт. (1999)).
ClustalH «lsm-ithn PHYLOGENETIC TREE rhslojpan
Рис. 3. Филогенетическое дерево NHX - родственных №+(К+)/Н+-аитипортеров растений: HvNHXl (Асс. No. ВАС56698), HvNHX2 (Асс. No. АА091943), HvNHX3 (Асс. No. ABD62853), HvNHX4 (Асс. No. ABC42029) - [Hordeum vulgare]; TaNHXl (Асс. No. AAK76737), TaNHX2 (Acc. No. AAK76738), TaNHX3 (Acc. No. AAP55209) - [Triticum aeslivum]; OsNHXl (Acc. No. AAQ63678), OsNHX2 (Acc. No. AAT93981) - [Oryza sativa]; LeNHXl (Acc. No. CAC84522), LeNHX2 (Acc. No. CAC83608), LeNHX3 (Acc. No. CAK12754) - [Lycopersicon esculentum] ([Solanum lycopersicum]); ZmNHXl (Acc. No. AAP20428), ZmNHX2 (Acc. No. AAP20429), ZmNHX3 (Acc. No. AAP20430), ZmNHX4 (Acc. No. AAP20431) - [Zea mays]\ AtNHXl (Acc. No. AAD16946), AtNHX2 (Acc. No. AAM08403), AtNHX3 (Acc. No. AAM08404), AtNHX4 (Acc. No. AAM08405), AtNHX5 (Acc. No. AAM08406 ), AtNHX6 (Acc. No. AAM08407) - [Arabidopsis thaliana]; AgNHXl (Acc. No. В AB 11940) - [A triplex gmeliní\\ HbNHX (Acc. No. AA025547) - [Hordeum brevisubulatum]; ThNHX (Acc. No. ABJ97691) - [Thellungiella halophila].
Исследование внутриклеточной локализации белка Ну1ЧНХ2.
Предположительную локализацию Ну1МНХ2 в вакуолярных мембранах было решено проверить экспериментальным путем. Полученные нами поликлональные антитела к С-концевому участку НуЫНХ2 были использованы для вестерн-анализа везикул тонопласта, изолированных из корней проростков ячменя, выращенных при нормальных условиях.
12
Электрофоретическая подвижность HvNHX2 в ПААГ с SDS оказалась аномальной: кажущийся молекулярный вес белка составляет около 47 кД при расчетном весе 59,69 кД. Как показано в работах Apse с соавт. (1999) и Fukuda с соавт. (20046), вакуолярные Ыа7Н+-антипортеры арабидопсиса и риса с рассчитанными молекулярными массами 58-60 кД имеют аномальную электрофоретическую подвижность в ПААГ с SDS, которая соответствует молекулярному весу в пределах 42-50 кД.
Вестерн-анализ показал, что HvNHX2 обнаруживается в вакуолярной мембране и практически отсутствует в плазматической мембране (рис. 4).
47 кД
Рис. 4. Вестерн-анализ HvNHX2 (сорт Московский 121, контроль): 1 - тонопласт, 2 - плазмалемма.
Следовые количества HvNHX2 во фракции плазматических мембран, вероятно, обусловлены примесями тонопласта в исследуемом образце.
Есть основания полагать, что локализация HvNHX2 в вакуолярных мембранах тесно связана с функцией компартментации Na+ и (или) К+ в вакуоль посредством Na+/H+- и (или) К+/Н+-обмена, поскольку по литературным данным известно, что гомолог HvNHX2 - AtNHXl -расположен в вакуолярных мембранах и осуществляет Na+/H - и К+/Н+-обмен [Venema et al. 2002].
Экспрессия гена HvNHX2 в ооцитах гладкой шпорцевой лягушки (.Xenopus laevis L.) и подтверждение Na+/H+-o6MCHiioft функции белка.
NaVl-Г-обменную активность HvNHX2 устанавливали с помощью его экспрессии в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Схема экспрессии включала в себя синтез полной копии кДНК гена HvNHX2; получение мРНК методом транскрипции in vitro с последующей инъекцией мРНК в цитоплазму ооцита. Наличие HvNHX2 в мембранах ооцитов проверяли методом вестерн-анализа. Для подтверждения функциональной активности HvNHX2 был проведен
эксперимент по определению степени закисления (ДрН) внешней среды (содержащей ионы Ыа+), происходящего во времени в результате работы НуЫНХ2 в мембранах ооцитов. В качестве контроля также исследовалась динамика закисления внешней среды для ооцитов, инъецированных Н20ОЕрс. В эксперименте использовался рН-метр с точностью до 0,001 ед. рН. Для подавления функционирования собственного Ыа+/Н+-антипортера ооцитов Хепорт в среду измерения добавляли амилорид [Т\ж1е е! а\. 1991]. Ранее было показано, что амилорид не влиял на Ка+/Н+-обмен в системе везикул тонопласта, выделенных из корней ячменя [ХЗагЬаппо & БиРоШ 1988].
По результатам эксперимента оказалось, что в среде без добавления амилорида интенсивность оттока протонов из контрольных и опытных ооцитов одинакова (табл. 1). Однако, после ингибирования собственного №+/Н+-антипортера ооцитов амилоридом закисление среды экспрессирующими ЯуМЖ ооцитами происходит интенсивнее, чем в контроле.
Табл. 1. Степень закисления среды (ДрН) контрольными и опытными
ооцитами после первых 100 мин инкубации.
Вариант опыта Ооциты, инъецированные
НгОэЕРС мРНК НуЖХ2
Без амилорида 0,39 ± 0,04 0,41 ±0,03
0,5 мМ амилорида 0,22 ± 0,02 0,34 ±0,02
По всей видимости, разница, наблюдаемая нами в динамике изменения рН среды в присутствии амилорида, обусловлена работой Ыа+/Н+-антипортера ячменя НуЫНХ2 в мембранах ооцитов и свидетельствует в пользу того, что белок НуЫНХ2 действительно является функционально активным мембранным белком, осуществляющим №+/Н+-обмен.
Изучение действия антител против НуГШХ2 на №+/Н+-обменную активность везикул тонопласта.
Чтобы выяснить, в какой мере измеряемый на тонопласте клеток ячменя Ыа7Н+-обмен связан с идентифицированной нами изоформой НуЫНХ2, мы проверили действие антител, полученных к фрагменту НуЫНХ2, на закисление изолированных везикул тонопласта, обусловленное работой вакуолярной Н+-АТФазы и индуцируемое добавлением в среду измерения М§2+-АТФ. Результаты этих измерений показаны на рис. 5. Видно, что закисление везикул существенно уменьшается в присутствии в среде измерения ЫаС1, а добавление антител к везикулам в этих условиях приводит к возрастанию закисления. Этот результат, с одной стороны, указывает на существование в везикулах Ыа+/Н+-обмена и на способность антител его ингибировать, с другой стороны, говорит о том, что изоформа №7Н+-антипортера НуЫНХ2, по-видимому, вносит существенный вклад в измеряемый нами на везикулах Ыа7Н+-обмен. Одновременно данный результат свидетельствует в пользу предположения о цитоплазматической ориентации С-конца молекулы НуЫНХ2 в мембране, поскольку эффект антител может проявляться только на правильно ориентированных везикулах с обращенным в среду измерения активным центром У-АТФазы.
■и 2+
г.
1чн4
контроль солевой стресс
Рис. 5. №+/Н+-обменная активность в везикулах тонопласта, изолированных из корней ячменя: 1 - везикулы + \^2+-АТФ; 2 - везикулы + \^2+-АТФ + №С1; 3 - везикулы + 1^:+-АТФ + ЫаС1 + антитела.
Падение действия антител на Ыа+/Н+-обмен в везикулах, выделенных после солевого стресса, может быть обусловлено усилением роли в Ма+/Н+-обмене других изоформ вакуолярного Ка+/1-Г-антипортера или (и) некоей модификацией Ну1ЧНХ2, приводящей, например, к затруднениям при ее взаимодействии с антителами.
Регуляция экспрессии гена НгИНХ2 на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях в проростках ячменя контрастных сортов при солевом стрессе.
Нами было показано методом ОТ-ПЦР, что ген ШМНХ2 конститутивно экспрессируется в корнях, стеблях и листьях растений ячменя при нормальных условиях выращивания. Следующим шагом являлось изучение экспрессии НгЫНХ2 в проростках ячменя сортов Эло и Белогорский, контрастных по солеустойчивости, при солевом стрессе. Экспрессию НуННХ2 измеряли методом ОТ-ПЦР в реальном времени.
Согласно полученным данным, в условиях солевого стресса ген ШИНХ2 имеет постоянную экспрессию, которая практически не меняется в корнях и незначительно увеличивается в листьях обоих сортов. Таким образом, в профиле экспрессии ШЫНХ2 при солевом стрессе не было обнаружено каких бы то ни было сортовых различий.
Количественные изменения уровня белка НуМНХ2 в вакуолярных мембранах при солевом стрессе изучали с помощью вестерн-анализа. В работе использовали везикулы тонопласта, выделенные из корней и надземной части проростков ячменя 4 сортов.
Согласно результату анализа, представленному на рис. 6, в корнях чувствительных сортов количество НуЫНХ2 не меняется, хотя и наблюдается незначительный его рост в листьях при солевом стрессе. Напротив, количество НуМНХ2 при солевом стрессе резко возрастает в корнях и листьях проростков солеустойчивого сорта Эло - в 3,5 и 5,1 раза соответственно.
Солечувствительные сорта Белогорский
Корни Листья
К С К С
Солеустойчивые сорта Эло
Корни Листья
К С К С
1 1,3 1 2,1 + i 1,7
Рис. 6. Вестерн-анализ HvNHX2 в вакуолярных мембранах, выделенных из корней и надземной части (листьев) 4 сортов ячменя. Цифрами обозначена интенсивность окраски белковой полосы в относительных единицах. К - контроль, С - солевой стресс.
Сорт Эквадор демонстрирует следующую картину экспрессии HvNHX2: в контрольном образце корней белок вообще не детектируется, однако появляется после воздействия солевого стресса; в надземной части количество антипортера незначительно растет.
Результаты эксперимента свидетельствуют о наличии органо- и сорто-специфичности регуляции экспрессии HvNHX2 при солевом стрессе на посттранскрипционном уровне. Такая регуляция особенно ярко выражена в корнях устойчивых сортов ячменя. Известно, что в тонопласте растений Atriplex gmelini [Hamada et al. 20016] и Beta vulgaris [Xia et al. 2002] в ответ на солевой стресс также возрастает количество молекул одной из изоформ №+/Н+-антипортера. Данные факты указывают на существование взаимосвязи между солеустойчивостью растения и возрастанием в нем количества вакуолярных Na+/H+- антипортеров при солевом стрессе.
Локализация HvNHX2 в клетках корней проростков ячменя двух сортов.
Чтобы установить, как распределяется данная изоформа вакуолярного Ыа+/Н+-антипортера по тканям корня и меняется ли ее распределение при стрессовом воздействии, мы провели оценку локализации HvNHX2 иммуноцитохимическим методом. Для этого антителами к HvNHX2 обрабатывали серийные поперечные срезы корней, проходящие на уровне зон растяжения и первичной дифференциации корня. Оказалось, что белок удается визуализировать во всех тканях корня двух сортов. Проведенные ранее исследования распределения AtNHXl в тканях растения выявили, что белок присутствует во всех тканях, за исключением апикальной меристемы кончика корня [Shi & Zhu 2002, Apse et al. 2003].
На срезах корней проростков наблюдаются многочисленные мелкие глобулы одинакового размера, которые локализованы большей частью в периферических областях клеток метаксилемы, флоэмы, эндодермы как сорта Белогорский (рис. 1а,в), так и сорта Эло (рис. 16,г).
в г
Рис. 7. Иммунолокализация изоформы HvNHX2 в клетках корня 7-дневных проростков ячменя в контрольных условиях: а - Белогорский; б - Эло; после солевого стресса (150 мМ NaCl в течение 24 ч): в - Белогорский; г - Эло; цс - центральный цилиндр, мк - метаксилема, энд - эндодерма. Масштаб 10 мкм.
Наиболее интенсивно метятся клетки метаксилемы. Флуоресцирующие глобулы белка НуЫНХ2 выявляются в основном в мембранах тонопласта. Это согласуется с результатом определения внутриклеточной локализации Ну1ЧНХ2 методом вестерн-анализа. С другой стороны, иммуноцитохимическая локализация НуЫНХ2 в изучаемых зонах корня не подтвердила результатов вестерн-анализа об увеличении количества белка в корнях солеустойчивого сорта Эло при солевом стрессе.
Такое несоответствие результатов можно объяснить тем, что для вестерн-анализа использовали целый корень, тогда как иммуноцитохимическим методом изучались лишь некоторые зоны корня. Вероятно, положительная регуляция экспрессии НуИНХ2 при солевом стрессе происходит в более зрелых тканях таких корневых зон как зоны поглощения и проведения.
Экспрессия кДНК гена Н\>МНХ2 в растениях АгаЫйоря'и ЛаИапа Ь. и оценка солеустойчивости трансгенных растений.
Растения арабидопсиса трансформировали бинарным вектором рСатЫа2000 (РББ) и конструкцией рСатЫа2000- НуШХ2 (РБв-МИХ). Затем оценивали солеустойчивость трансгенных растений на стадии раннего развития проростков. Результаты анализа солеустойчивости трансгенных проростков арабидопсиса, контрольных и экспрессирующих НуN11X2, представлены на рис. 8.
Из рисунка видно, что в условиях солевого стресса растения, экспрессирующие ген Ыа7Н+-антипортера, нормально развиваются, тогда как рост контрольных проростков существенно замедлен.
При оценке выживаемости проростков в условиях засоления через неделю после отбора и пересадки трансгенов было зафиксировано в среднем около 65 (±10)% выживших растений РЕБ-ИНХ, по сравнению с 25 (±7)% контрольных выживших проростков. Еще через неделю стресса - 50 (±10)% и 6 (±3)% соответственно. Выживаемость обоих вариантов трансгенных растений в отсутствие ЫаС1 -100 %.
РЗБ РвЗ-ШХ
О мМ ЫаС1
Рис. 8. Сравнительная оценка солеустойчивости трансгенных растений А.1ИаНапа. РЭЭ - проростки, несущие вектор рСатЫа2000, РБЗ-ЫНХ - несущие конструкцию рСатЫа2000 со вставкой НчШХ2. Семена поколения Т1 выращивали в течение 7 дней на среде М5, содержащей 50 мг/л канамицина, 250 мг/л цефотаксима и 0 или 150 мМ №С1, затем отбирали трансгенные растения и пересаживали на свежую среду в количестве 4060 шт. на чашку. Представлен типичный результат эксперимента из 3-х повторностей.
Полученные результаты, совместно с результатами по гетерологичной экспрессии гена Н\ЫНХ2 в растениях табака [Низкородова и др. 2009] и картофеля [Баят и др. 2010], позволяют сделать вывод о способности гена НуЫНХ2 повышать солеустойчивость некоторых видов растений, в т.ч. культурных.
выводы
1. Идентифицирован ген Н\ЫНХ2, экспрессирующийся в корнях, стеблях и листьях ячменя, кодирующий изоформу вакуолярного Ма+/Н+-антипортера, которая вносит существенный вклад в общий Ыа+/Н+-обмен на тонопласте клеток ячменя.
2. Аминокислотная последовательность НуЫНХ2 имеет типичное для вакуолярных №+/Н+-антипортеров распределение гидрофобных и гидрофильных участков с мотивом «лейциновая молния» в одном из гидрофобных доменов, что указывает на вероятное функционирование НуЫНХ2 в вакуолярной мембране в виде гомодимера.
3. Экспрессия НуЫНХ2 органо- и сортоспецифична и регулируется на пост-транскрипционном уровне.
4. Обнаружена взаимосвязь между изменением экспрессии НуЫНХ2 при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя и установлено, что увеличение количества НуЫНХ2 в ответ на солевой стресс, по-видимому, является одной из адаптационных характеристик растений ячменя.
5. Показана перспективность использования генаТ/уЛУЖ? для повышения солеустойчивости растений в эксперименте по его гетерологичной экспрессии в АгаЫ&рз15 ¡каИапа.
Список опубликованных работ, в которых отражено основное содержание диссертации
1. Васекина A.B., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков A.B. Вакуолярный Na+/H+ -антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс // Биохимия. 2005. Т. 70, № 1. С. 123-132.
2. Ершов П.В., Васекина A.B., Вобликова В.Д., Таранов В.В., Рослякова Т.В., Бабаков A.B. Идентификация гомолога К+/Н+- антипортера в ячмене: экспрессия в сортах, отличающихся по устойчивости к NaCl // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 16-24.
3. Рослякова Т.В., Молчан О.В., Васекина A.B., Лазарева Е.М., Соколик А.И., Юрин В.М., де Бур А.Х., Бабаков A.B. Солеустойчивость ячменя: взаимосвязь экспрессии изоформ вакуолярного Na+/H+ -анти'портера с накоплением 22Na+ // Физиология растений. 2011. Т. 58, №1. С. 1-12.
4. Васекина A.B., Ершов П.В., Решетова О.С., Кулагина H.H., Шанько A.B., Трофимова М.С., Бабаков A.B. Ионные транспортеры плазмалеммы и тонопласта в проростках ячменя при солевом стрессе // Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 15-21 сентября 2003 г. Тезисы докладов. С. 255-256.
5. Ершов П.В., Васекина A.B., Бабаков A.B. Ионные транспортеры и их реакция на солевой стресс // Всероссийская конференция «Стрессовые белки растений». Иркутск, 6-10 сентября 2004 г. Тезисы докладов. С. 5357.
6. Бабаков A.B., Васекина A.B., Рослякова Т.В., Леонова Т.Г., Гончарова Э.А. Ионные транспортеры в ячмене: роль в сортовой устойчивости к солевому стрессу // II Вавиловская международная конференция «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке». Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007 г. Тезисы докладов. С. 238-239.
7. Рослякова Т.В., Васекина A.B., Ершов П.В., Таранов В.В., Вобликова В.Д. Идентификация изоформ вакуолярного Na+/H+- антипортера в ячмене и исследование их регуляции при солевом стрессе // VI съезд общества физиологов растений России. Сыктывкар, 2007 г. Тезисы докладов. С. 350-351.
8. Низкородова A.C., Васекина A.B., Бабаков A.B., Искаков Б.К. Растения табака, экспрессирующие ген NHX2 из Hordeum vulgare, демонстрируют повышенную устойчивость к натриевому засолению при культивировании in vivo II Всероссийская научная конференция «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды». Иркутск, 24-28 августа 2009 г. Тезисы докладов. С. 324-327.
9. Рослякова Т.В., Васекина A.B., Лазарева Е.М., Бабаков A.B. О вкладе вакуолярных Na+/H+- антипортеров в устойчивость растений к солевому стрессу // Всероссийский симпозиум "Растение и стресс". Москва, 2010 г. Тезисы докладов.
Подписано в печать 16.03.11
Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васекина, Анастасия Владимировна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Солевой стресс и солеустойчивость растений.
1.1.1. Определение солеустойчивости.
1.1.2. Воздействие солевого стресса на растение.
1.1.3. Клеточные детерминанты солеустойчивости.
1.2. Механизмы солеустойчивости растений.
1.2.1. Поступление Na+ в корень.
1.2.2. Отток Na+ из клеток корня.
1.2.3. Радиальный транспорт в корне.
1.2.4. Транспорт ионов Na+ в ксилему и отток из ксилемы.
1.2.5. Рециркуляция Na+ из листьев по флоэме.
1.2.6. Внутриклеточная компартментация ионов Na+.
1.2.7. Адаптация к соли при помощи анатомических образований или неравномерного распределения ионов в клетках разных типов.
1.2.8. Усиленная аккумуляция совместимых осмолитов.
1.2.9. Сигналы трансдукции солевого стресса в растениях.
1.2.10. Восприятие сигнала повышенной концентрации Na+ во внешней среде. SOS-путь передачи сигналов.
1.2.11. АБК-зависимые цепи передачи стрессовых сигналов.
1.2.12. Регуляция экспрессии генов.
1.3. Ыа+/Н+-антипортеры - важная детерминанта солеустойчивости растений.
1.3.1. Сравнительная характеристикаЫа+/Н+-антипортеров из различных организмов.
1.3.2. Филогенетический анализ.
1.3.3. Семейство SOS-Like плазмалеммарных Ыа+/Н+-антипортеров растений.
1.3.4. Семейство NHX внутриклеточных Ка+/Н+-антипортеров растений.
1.3.4.1. Внутриклеточная локализация.
1.3.4.2. Биохимические свойства.
1.3.4.3. Структура.
1.3.4.4. Особенности экспрессии.
1.3.4.5. Регуляция активности.
1.3.4.6. Функции.
1.4. Цели и задачи работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Объект исследования.
2.2. Получение растительного материала.
2.3. Выделение РНК.
2.4. Синтез первой цепи кДНК.
2.5. ПЦР.
2.5.1. Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена вакуолярного Ка+/Н+-антипортера ячменя (HvNHX2).
2.5.2. Исследование экспрессии HvNHX2 в корнях, стеблях и листьях взрослых растений ячменя.
2.6. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning.
2.7. Выделение плазмидной ДНК.
2.8. ОТ-ПЦР в реальном времени.
2.9. Получение поликлональных антител к HvNHX2.
2.9.1. Выбор фрагмента антигена (HvNHX2), конструирование праймеров, ПЦР.
2.9.2. Наращивание рекомбинантного белка.
2.9.3. Определение растворимости рекомбинантного белка.
2.9.4. Препаративное выделение рекомбинатного белка и его очистка на целлюлозе
2.10. Выделение плазматических мембран из растений ячменя.
2.11. Выделение вакуолярных мембран из растений ячменя.
2.12. Измерение ионного обмена на везикулах тонопласта.
2.13. Электрофорез белков в ПААГ с SDS.
2.14. Вестерн блоттинг HvNHX2.
2.15. Экспрессия HvNHX2 в ооцитах гладкой шпорцевой лягушки (Xenopus laevis L.).
2.15.1. Синтез полной копии кДНК HvNHX2.
2.15.2. Клонирование полной копии кДНК HvNHX2 в плазмиде pT7TS.
2.15.3. Синтез мРНК in vitro.
2.15.4. Подготовка ооцитов и их микроинъекция мРНК.
2.15.5. Определение степени закисления (рН) внешней среды, происходящего в результате работы HvNHX2 в мембранах ооцитов.
2.15.6. Выделение микросомальной фракции ооцитов.
2.16. Иммунохимическая локализация HvNHX2 в клетках корней проростков ячменя.
2.17. Экспрессия кДНК гена HvNHX2 в растениях Arabidopsis thaliana L. и оценка солеустойчивости трансгенных растений.
2.18. Реактивы.
2.19. Статистика.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Идентификация кДНК гена вакуолярного №+/Н+-антипортера ячменя.
3.1.1. Анализ структуры белка НуННХ2.
3.1.2. Филогенетический анализ.
3.2. Исследование экспрессии НчТЯНХ! в различных органах растений ячменя.
3.3. Исследование внутриклеточной локализации белка Ну1ШХ2.
3.4. Экспрессия гена НуИНХ2 в ооцитах гладкой шпорцевой лягушки (Хепорш 1аеум Ь.) и подтверждение Ыа+/Н+-обменной функции белка НуЫНХ2.
3.5. Изучение действия антител против Иу>ШХ2 на Ыа+/Н+-обменную активность везикул тонопласта.
3.6. Исследование экспрессии НхЫНХ2 в корнях и надземной части проростков ячменя контрастных сортов при солевом стрессе.
3.7. Изучение количественных изменений НуМНХ2 в вакуолярных мембранах проростков ячменя контрастных сортов при солевом стрессе.
3.8. Иммунохимическая локализация Ну1ЯНХ2 в клетках корней проростков ячменя двух сортов.
3.9. Экспрессия кДНК гена Н\>ЫНХ2 в растениях АгаЫс1ор51$ (каПапа Ь. и оценка солеустойчивости трансгенных растений.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация гена вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений"
В мире более 800 млн. га земель в той или иной степени подвержено засолению (по данным FAO 2008; http://www.fao.org/ag/agI/aglI/spush). Это количество составляет более 6% от общей площади суши. Помимо естественных засоленных территорий, многие гектары сельскохозяйственных земель считаются засоленными вследствие длительного промывания или орошения почв. Из 1500 млн. га сельскохозяйственных земель засушливых районов 32 млн. га (2%) подвержено вторичному засолению. Из 230 млн. га орошаемых угодий 45 млн. га (20%) являются засоленными. Площадь орошаемых земель составляет лишь 15 % от всех культивируемых земель, но, так как орошаемое земледелие является по крайней мере в 2' раза продуктивнее обычного, на этих землях производится около трети мировой сельскохозяйственной продукции [Munns & Tester 2008].
За последние годы наблюдается всплеск активности в области изучения механизмов солеустойчивости растений [Hasegawa et al. 2000, Zhu 2002], что происходит во многом благодаря использованию методов молекулярной генетики и биологии. Повышенный интерес к данной области также можно объяснить стремлением науки о растениях внести практический вклад в производство сельскохозяйственной продукции в условиях все возрастающих масштабов засоления почв и глобального изменения климата [Zhu 2001].
NaCl - наиболее распространенная соль, отличающаяся высокой растворимостью, при этом ионы натрия оказывают неблагоприятное воздействие на1 калийное питание растений, активность ферментов в цитозоле и метаболизм. Неудивительно, что все растения развили механизмы, регулирующие ее накопление и ограничивающие поступление в пользу других питательных веществ, обычно присутствующих в низких концентрациях, таких как К+ и NO3". Способность растений выживать в условиях высоких концентраций NaCl связана с имеющимися у них возможностями транспортировки, компартментации, выделения и мобилизации ионов Na+. Удаление Na+ из транспирационного тока, его распределение в растении и энергичная аккумуляция в вакуолях определяют способность противостоять токсическому эффекту Na+ [Apse & Blumwald 2007]. Среди большого набора ионных транспортеров и ионных каналов, обеспечивающих эти процессы, важная роль принадлежит протонным насосам и Na+/H+-антипортерам плазмалеммы и тонопласта. №+/Н+-антипортеры используют ДрН, генерируемый протонными насосами, для удаления Na+ из цитоплазмы либо в апопласт, либо в вакуоль [Niu et al. 1995]. Ка+/Н+-антипортеры растений представляют собой мембранные белки, имеющие сходные структуру и функции. Это было установлено в опытах, проведенных в гетерологичной системе дрожжей и в опытах по сверхэкспрессии
Ка+/Н+-антипортеров в растениях [Zhang & Blumwald 2001].
Хотя высокие концентрации Na+ в цитоплазме токсичны для растительных клеток, растения активируют механизмы высокоаффинного поглощения Na+ в условиях дефицита К+, что говорит о том, что Na+ способен в некоторой степени функционально заменять К+, по крайней мере, в качестве осмолита в вакуоли [Garciadeblas et al. 2003, Horie et al. 2007]. Очевидно, что в условиях сильного засоления одним из важнейших механизмов адаптации к солевому стрессу является аккумуляция излишнего цитоплазматического Na+ в вакуолях, что способствует снижению его количества в цитоплазме и обеспечению осмотического давления. В этот механизм непосредственным образом вовлечены вакуолярные На+/Н+-антипортеры.
Первый ген вакуолярного Na+/H+- антипортера, идентифицированный в арабидопсисе, кодирует белок AtNHXl [Gaxiola et al. 1999], гомологичный плазмалеммарным Na+/H+-антипортерам животных и антипортеру дрожжей ScNHXl. Гетерологичная экспрессия AtNHXl в дрожжах компенсировала чувствительность к соли, вызванную дисфункцией соответствующего дрожжевого гомолога ScNHXl. Сверхэкспрессия AtNHXl привела к повышению солеустойчивости как растений арабидопсиса [Apse et al. 1999], так и других видов растений [Zhang & Blumwald 2001, Zhang et al. 2001]. Внутриклеточные NHX-подобные антипортеры стали первым семейством катион/протонных транспортеров, изучаемым в растениях. Впоследствии целый ряд членов данного семейства был идентифицирован в растениях, грибах и животных [Rodriguez-Rosales et al. 2009].
Хотя физиологические и биохимические данные уже давно свидетельствовали о том, что Na+/H+- и К+/Н+-антипортеры вовлечены в регуляцию концентрации ионов и рН внутри клеток, понадобилось много времени, чтобы идентифицировать гены, кодирующие эти антипортеры. К настоящему времени проекты по секвенированию геномов выявили, что растения содержат огромное количество гомологов предполагаемых катион/протонных антипортеров, функции и особенности экспрессии которых еще не достаточно исследованы. Вакуолярные Ма+/Н+-антипортеры обнаружены во всех изучаемых видах растений, большинство изоформ экспрессируется в нормальных условиях во всех органах растения. Дифференциальная экспрессия NHX-генов в разных видах и сортах растений, которые либо аккумулируют Na+, либо ограничивают его поступление, говорит о том, что NHX-антипортеры, скорее всего, являются ключевым фактором данных различий.
В последнее время при изучении механизмов устойчивости культурных растений к солевому стрессу в качестве объектов сравнительного исследования стали использовать сорта, отличающиеся по солеустойчивости. При этом удалось в ответ на солевой стресс установить прямую корреляцию между солеустойчивостью сорта и возрастанием уровня экспрессии генов вакуолярных Ка+/Н+-антипортеров е1 а1. 2004, Saqib й а1. 2005]. Изучение регуляции экспрессии отдельно взятой ЫНХ-изоформы на разных уровнях и в разных органах растения при солевом стрессе позволяет получить информацию о роли данной изоформы в общей солеустойчивости того или иного сорта.
Ранее в нашей лаборатории были охарактеризованы по солеустойчивости и накоплению ионов Ыа+ и К+ несколько контрастных сортов ячменя, и возник вопрос, существует ли взаимосвязь между сортовой устойчивостью ячменя к засолению и особенностями экспрессии вакуолярного На+/Н+-антииортера. Таким образом, в настоящей работе внимание было уделено идентификации гена вакуолярного Ка+/Н+-антипортера в ячмене и изучению его экспрессии в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя при повышенных концентрациях №С1 в среде, изучению вклада продукта гена в общий Ыа+/Н+-обмен на тонопласте, исследованию локализации данного белка и, в конечном итоге, обоснованию возможности использования нового гена для повышения солеустойчивости растений.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Васекина, Анастасия Владимировна
ВЫВОДЫ
1. Идентифицирован ген HvNHX2, экспрессирующийся в корнях, стеблях и листьях ячменя, кодирующий изоформу вакуолярного Ма+/Н+-антипортера, которая вносит существенный вклад в общий Ыа+/Н+-обмен на тонопласте клеток ячменя.
2. Аминокислотная последовательность HvNHX2 имеет типичное для вакуолярных На+/Н+-антипортеров распределение гидрофобных и гидрофильных участков с мотивом «лейциновая молния» в одном из гидрофобных доменов, что указывает на вероятное функционирование HvNHX2 в вакуолярной мембране в виде гомодимера.
3. Экспрессия HvNHX2 органо- и сортоспецифична и регулируется на посттранскрипционном уровне.
4. Обнаружена взаимосвязь между изменением экспрессии HvNHX2 при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя и установлено, что увеличение количества HvNHX2 в ответ на солевой стресс, по-видимому, является одной из адаптационных характеристик растений ячменя.
5. Показана перспективность использования гена HvNHX2 для повышения солеустойчивости растений в эксперименте по его гетерологичной экспрессии в Arabidopsis thaliana.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования подтверждают предположение о дифференциальной органо- и сортоспецифичной регуляции экспрессии вакуолярного ^+/Н+-антипортера в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя. Более высокая активность ионного обмена на мембранах тонопласта, характеризующая устойчивые сорта, в большой степени зависит от уровня экспрессии антипортеров, в частности, изоформы НуЫНХ2. Вклад этой изоформы в общий Ыа+/Н+-обмен является весьма значительным, т.к. при ее инактивации антителами наблюдалось почти полное ингибирование обмена на мембранах тонопласта.
Регуляция экспрессии данной изоформы, по-видимому, происходит на посттранскрипционном уровне. Солеустойчивые сорта характеризует резкое повышение количества НуЫНХ2 в корнях при солевом стрессе. Это наблюдение подтверждает сделанный ранее вывод о том, что солеустойчивые сорта, демонстрирующие повышенное количество транскриптов и/или молекул №+/Н+ - антипортеров в корнях при солевом стрессе, по-видимому, накапливают больше На+ в вакуолях клеток корней, ограничивая поступление этих ионов в фотосинтезирующие ткани.
Итак, в результате наших экспериментов нашла свое подтверждение гипотеза о наличии взаимосвязи между сортовой солеустойчивостью ячменя и изменением экспрессии изоформы НуЫНХ2 вакуолярного Иа+/Н+ - антипортера под действием солевого стресса.
Кроме этого, полученные нами результаты указывают также на то, что, во-первых, нужно очень осторожно связывать солеустойчивость сорта с возрастанием в растениях этого сорта уровня экспрессии генов в ответ на стрессовое воздействие, и, во-вторых, результаты по измерению уровня экспрессии генов, полученные на растениях одного сорта, нельзя автоматически переносить на растения других сортов.
Дальнейшее накопление данных по изучению и сравнительному анализу экспрессии генов ИНХ-антипортеров в контрастных по солеустойчивости сортах может служить основой для изучения ключевых механизмов регуляции экспрессии этих генов при солевом стрессе. Кроме того, такая база данных может быть использована для выявления главных тенденций и характеристик солеустойчивых сортов с целью последующего создания молекулярных маркеров солеустойчивости.
Далее, в нашей работе было показано, что растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие ген HvNHX2, демонстрируют повышенную солеустойчивость на стадии раннего развития проростков. Помимо этого, копия кДНК идентифицированного нами гена HvNHX2 была передана в Институт молекулярной биологии и биохимии им М.А. Айтхожина (Алматы, Республика Казахстан) и в Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия) для проведения работы по трансформации растений табака и картофеля соответственно. Низкородова с соавт. (2009) экспрессировали кДНК гена HvNHX2 в растениях табака (Nicotiana tabacum L.) и показали, что трансгенные растения демонстрируют повышенную устойчивость к натриевому засолению при культивировании in vivo. Аналогично, Баят с соавт. (2010) экспрессировали HvNHX2 в нескольких сортах картофеля (Solanum tuberosum L.). В результате они наблюдали значительное повышение солеустойчивости одного из сортов, при этом трансгенные растения отличались повышенным содержанием калия в корнях. Всё вышесказанное позволяет сделать вывод о способности гена HvNHX2 повышать солеустойчивость некоторых видов растений, в т.ч. культурных.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васекина, Анастасия Владимировна, Москва
1. Ершов П.В., Решетова О.С., Трофимова М.С., Бабаков A.B. (2005) Активность ионных транспортеров и солеустойчивость ячменя. Физиология растений. 52; 6: 867875.
2. Ершов П.В., Васекина A.B., Вобликова В.Д., Таранов В.В., Рослякова Т.В., Бабаков A.B. (2007) Идентификация гомолога К+/Н+-антипортера в ячмене: экспрессия в сортах, отличающихся по устойчивости к NaCl. Физиология растений. 54; 1: 22-30.
3. Леонова Т.Г., Гончарова Е.А., Ходоренко A.B., Бабаков A.B. (2005) Характеристика солеустойчивых и солечувствительных сортов ячменя. Физиология растений. 52; 2: 774-778.
4. Маргулис Б.А., Гужова И.В. (2000) Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42; 4: 323-341.
5. Рослякова Т., Лазарева Е., Кононенко Н., Бабаков A.B. (2009) Новая изоформа HvNHX3 вакуолярного На+/Н+-антипортера в ячмене: экспрессия и иммунолокализация. Биохимия. 74; 5: 549-556.
6. Alexander R.T. & Grinstein S. (2006) Na+/H+ exchangers and the regulation of volume. Acta Physiol (Oxf). 187(1-2): 159-67.
7. Antosiewicz D.M. & Hennig J. (2004) Overexpression of LCT1 in tobacco enhances the protective action of calcium against cadmium toxicity. Environ. Pollut. 129: 237-245.
8. Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., Blumwald E. (1999) Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis. Science. 285(5431): 12568.
9. Apse M.P. & Blumwald E. (2007) Na+ transport in plants. FEBS Letters. 581: 2247-2254.
10. Apse M.P., Sottosanto J.B., Blumwald E. (2003) Vacuolar cation /Hf1" exchange ion^ homeostasis and leaf development are altered in a T-DNA insertion mutant of AtNHXl, the arabidopsis vacuolar NaTH* antiporter. Plant J. 36; 2: 229-39.
11. Barkla B. J., Zingarelli L., Blumwald E., Smith J.A.C. (1995) Tonoplast NaW Antiport Activity and Its Energization by the Vacuolar H+-ATPase in the Halophytic Plant Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Physiol. 109; 2: 549-556.
12. Bartels D., Hanke C., Schneider K., Michel D., Salamini F. (1992) A desiccation-related Elip-like gene from the resurrection plant Craterostigma plantagineum is regulated by light and ABA. EMBO J. 11: 2771-2778.
13. Batelli G, Verslues PE, Agius F, Qiu Q, Fujii H, Pan S, et al. (2007) SOS2 promotes salt tolerance in part by interacting with the vacuolar H+-ATPase and upregulating its transport activity. Mol. Cell. Biol. 27: 7781-90.
14. Bers DM, Barry WH, Despa S. (2003) Intracellular Na+ regulation in cardiac myocytes. Cardiovasc. Res. 57: 897-912.
15. Blumwald E., Aharon G.S., Apse M.P. (2000) Sodium transport in plant cells. Biochim. Biophys. Acta. 1465: 140-151.
16. Blumwald E. & Poole R.J. (1985) Na/H antiport in isolated tonoplast vesicles from storage tissue of Beta vulgaris. Plant Physiol. 78: 163-167.
17. Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of dye-binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
18. Braun Y., Hassidim N., Lerner H.R., Reinhold L. (1988) Evidence for a Na+/H+ antiporter in membrane vesicles isolated from roots of the halophyte Atriplex nummularia. Plant Physiol. 87: 104-108.
19. Brett CL, Donowitz M, Rao R. (2005) Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288: 223-39.
20. Brini F, Hanin M, Mezghani I, Berkowitz GA, Masmoudi K. (2007) Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHX1 and H+-pyrophosphatase TVP1 improve salt- and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. J. Exp. Bot. 58: 301-8.
21. Bustin S.A. (2000) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25: 169-193.
22. Byrt CS, Platten JD, Spielmeyer W, James RA, Lagudah ES, et al. (2007) HKT1 ;5-like cation transporters linked to Na+ exclusion loci in wheat, Nax2 and Knal. Plant Physiol. 143: 1918-28.
23. Carden D.E., Walker D.J., Flowers T.J., Miller A.J. (2003) Single cell measurements of the contributions of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiol. 131: 676-683.
24. Chauhan S, Forsthoefel N, Ran Y, Quigley F, Nelson DE, Bohnert HJ. (2000) Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in Mesembryanthemum crystallinum. Plant J. 24: 511-22.
25. Chen H, An R, Tang J-H, Cui X-H, Hao F-S, et al. (2007) Over-expression of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in an upland rice. Mol. Breed. 19: 215-25.
26. Chen Z., Pottosin I., Cuin T., Fuglsang A., Tester M., Jha D., Zepeda-Jazo I., Zhou M., Palmgren M., Newman I. Shabala S. (2007) Root Plasma Membrane Transporters Controlling K+/Na+ Homeostasis in Salt-Stressed Barley. Plant Physiol. 145: 1714-1725.
27. Cleaver O., Patterson K.D., Krieg P.A. (1996) Overexpression of the tinman-related genes XNkx-2.5 and XNkx-2.3 in Xenopus embryos results in myocardial hyperplasia. Development. 122: 3549-3556.
28. Colman A. (1984) Translation of eucaryotic messenger RNA in Xenopus oocytes. B. Hames and S.J. Higgins (Eds.), Transcription and Translation a Practical Approach. IRL Oxford. 271-302.
29. Colmer TD, Munns R, Flowers TJ. (2005) Improving salt tolerance of wheat and barley: future prospects. Aust. J. Exp. Agric. 45: 1425-43.
30. Counillon L., Noel J., Reithmeier R.A., Pouyssegur J. (1997) Random mutagenesis reveals a novel site involved in inhibitor interaction within the fourth transmembrane segment oftheNa+/H+ exchanger-1. Biochemistry. 36: 2951-59.
31. Counillon L. & Pouyssegur J. (1993) Nucleotide sequence of the Chinese hamster Na+/H+exchanger NHE1. Biochim. Biophys. Acta. 1172; 3: 343-5.
32. Counillon L. & Pouyssegur J. (2000) The expanding family of eucaryotic Na+/H+ exchangers. J. Biol. Chem. 275; 1: 1-4.
33. Counillon L., Scholz W., Lang H.J., Pouyssegur L. (1993) Pharmacological characterization of stably transfected Na+/H+ antiporter isoforms using amiloride analogs and a new inhibitor exhibiting antiischemic properties. Mol. Pharmacol. 44: 1041-45.
34. Cuin TA, Miller A J, Laurie SA, Leigh RA. (2003) Potassium activities in cell compartments of salt-grown barley leaves. J. Exp. Bot. 54(383): 657-61.
35. Darley C.P., Van Wuytswinkel O.C.M., Van der Woude K., Mager W.H., De Boer
36. A.H. (2000) Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae NHX1 genes encode amiloride sensitive electroneutral Na+/H+ exchangers. Biochem. J. 351: 241-249.
37. Dang C.V., McGuire M., Buckmire M., Lee W.M. (1989) Involvement of the 'leucine zipper1 region in the oligomerization and transforming activity of human c-myc protein. Nature. 6208; 337: 664-6.
38. Davenport R.J., Munoz-Mayor A., Jha D., Essah P.A., Rus A., Tester M. (2007) The Na+ transporter AtHKTl;l controls retrieval of Na+ from the xylem in Arabidopsis. Plant Cell Env. 30: 497-507.
39. Demidchik B., Essah P.A., Tester M. (2004) Glutamate activates cation currents in the plasma membrane of Arabidopsis root cells. Planta. 219: 167—175.
40. Ding J, Rainey JK, Xu C, Sykes BD, Fliegel L. (2006) Structural and functional characterization of transmembrane segment VII of the Na+/H+ exchanger isoform 1. J. Biol. Chem. 281(40): 29817-29.
41. DuPont FM & Morrissey PJ. (1992) Subunit composition and Ca(2+)-ATPase activity of the vacuolar ATPase from barley roots. Arch. Biochem. Biophys. 294; 2: 341-6.
42. Epstein E. (1966) Dual pattern of ion absorption by plant cells and by plants. Nature. 212: 1324-1327.
43. Flowers T.J. & Hajibagheri M.A. (2001) Salinity tolerance in Hordeum vulgare: Ion concentration in root cells of cultivars differing in salt tolerance. Plant Soil. 231: 1-9.
44. Flowers T.J., Hajibagheri M.A., Clipson N.J.W. (1986) Halophytes. The Quarterly Review of Biology. 61: 313-337.
45. Flowers T.J., Troke P.F., Yeo A.R. (1977) The mechanisms of salt tolerance in halophytes. Annu. Rev. Plant Physi ol. 28: 89-121.
46. Foat B.C., Houshmandi S.S., Olivas W.M., Bussemaker H.J. (2005) Profiling condition-specific, genome-wide regulation of mRNA stability in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(49): 17675-80.
47. Fricke W, Leigh RA, Tomos AD. (1996) The intercellular distribution of vacuolar solutesin the epidermis and mesophyll of barley leaves changes in response to NaCl. J. Exp. Bot. 47: 1413-26.
48. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., Tanaka Y.20046) Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice. Plant Cell Physiol. 45(2): 146-59.
49. Fukuda A., Nakamura A., Tanaka Y. (1999) Molecular cloning and expression of the Na/H exchanger gene in Oriza sativa. Biochim. Biophys. Acta. 1446: 149-155.
50. Fukuda A., Yasaki Y., Ishikawa T., Koike S., Tanaka Y. (1998) Na+/H+ antiporter in tonoplast vesicles from rice roots. Plant Cell Physiol. 39: 196-201.
51. Garbarino J. & DuPont F. (1988) NaCI induces a Na+/H+ antiport in Tonoplast vesicles from barley roots. Plant Physiol. 86: 0231-0236.
52. Garbarino J. & DuPont F. (1989) Rapid induction of Na/H exchange activity in barley root tonoplast. Plant Physiol. 89: 1-4.
53. Garciadeblás B, Senn ME, Bañuelos MA, Rodríguez-Navarro A. (2003) Sodium transport and HKT transporters: the rice model. Plant J. 34: 788-801.
54. Gaxiola R., Li J., Undurraga S., Dang L.M., Allen G.J., Alper S.L., Fink G.R. (2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVR1 H+ pump. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 11444-11449.
55. Gaxiola R., Rao R., Sherman A., Grisafi P., Alper S. L., Fink G.R. (1999) The Arabidopsis thaliana proton transporters, AtNhxl and Avpl, can function in cation detoxification in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96; 4: 1480-1485.
56. Gerchman Y., Rimon A., Venturi M. and Padan E. (2001) Oligomerization of NhaA, the Na+/H+ Antiporter of Escherichia coli in the Membrane and Its Functional and Structural Consequences. Biochemistry. 40: 3403-3412.
57. Gobert A., Park G., Amtmann A., Sanders D., Maathuis F.J.M. (2006) Arabidopsis thaliana cyclic nucleotide gated channel 3 forms a non-selective ion transporter involved in germination and cation transport. J. Exp. Bot. 57: 791-800.
58. Greenway H. & Osmond C.B. (1972) Salt responses of enzymes from species differing in salt tolerance. Plant Physiol. 49: 256-59.
59. Hager A, Frenzel R, Laible D. (1980) ATP-dependent proton transport into vesicles of microsomal membranes of Zea mays coleoptiles. Z. Naturforsch. 35: 783-93.
60. Churchill KA, Holaway B, Sze H. (1983) Separation of two types of electrogenic H+-pumping ATPases from oat roots. Plant Physiol. 73: 921-8.
61. Halfter U, Ishitani M, Zhu JK.,(2000) The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 3735-40.
62. Hall D., Evans A.R., Newbury J.J., Pritchard J. (2006) Functional analysis of CHX21: a putative sodium transporter in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 57: 1201—1210.
63. Hamada A., Hibino T., Nakamura T., Takabe T. (2001a) Na+/H+ Antiporter from Synechocystis Species PCC 6803, Homologous to SOS1, Contains an Aspartic Residue and Long C-Terminal Tail Important for the Carrier Activity. Plant Physiol. 125(1): 437-446.
64. Hamada A., Shono M., Xia T., Ohta M., Hayashi Y., Tanaka A., Hayakawa T. (20016) Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini. Plant Mol. Biol. 46: 32-42.
65. Hanana M, Cagnac O, Yamaguchi T, Hamdi S, Ghorbel A, Blumwald E. A. (2007) Grape berry (Vitis vinifera L.) Cation/proton antiporter is associated with berry ripening. Plant Cell Physiol. 48: 804-11.
66. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J-K., Bohnert H.J. (2000) Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 463499.
67. High S., Flint N., Dobberstein B. (1991) Requirements for the membrane insertion of signal-anchor type proteins. The Journal of Cell Biology. 113: 25-34.
68. Higinbotham N. (1973) Electropotentials of plant cells. Annu. Rev. Plant Physiol. B24: 25-46.
69. Hilger D„ Polyhach Y., Padan E., Jung H., Jeschke G. (2007). High resolution structure of a Na+/H+ antiporter dimer obtained by pulsed EPR distance measurements. Biophys. J. 93: 3675-3683.
70. Horie T, Costa A, Kim TH, Han MJ, Horie R, Leung HY, et al. (2007) Rice OsHKT2;l transporter mediates large Na+ influx component into K+-starved roots for growth. EMBO J. 26: 3003-14.
71. Horie T. & Schroeder J.I. (2004) Sodium transporters in plants. Diverse genes and physiological functions. Plant Physiol. 136; 1: 2457-62.
72. Hua X.J., Cotte V., Montagu V.B., Verbruggen N. (2001) The 5' untranslated region of the At-P5R gene is involved in both transcriptional and post-transcriptional regulation. Plant J. 26: 157-169.
73. Hunte C., Screpanti E., Venturi M., Rimon A., Padan E., Nichel H. (2005) Structure of a Na+/H+ antiporter and insights into mechanism of action and regulation by pH. Nature. 435; 30: 1197-1202.
74. Ishitani M, Liu JP, Halfter U, Kim CS, Shi WM, Zhu J-K. (2000) SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation and calcium binding. Plant Cell. 12: 166777.
75. James R.A., Davenport R.J., Munns R. (2006a) Physiological characterization of two genes for Na+ exclusion in Durum wheat, Naxl and Nax2. Plant Physiol. 142: 1537-1547.
76. Kader M.A., Seidel T., Golldack D., Lindberg S. (2006) Expressions of OsHKTl, OsHKT2 and OsVHA are differently regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salttolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars. J. Exp. Bot. 57: 4257-4268.
77. Kang T.J. & Yang M.S. (2004) Rapid and reliable extraction of genomic DNA from various wild-type and transgenic plants. BMC Biotechnology. 4: 20-32.
78. Kiegle E, Moore C, Haseloff J, Tester M, Knight M. (2000) Cell-type specific calcium responses to drought, NaCl, and cold in Arabidopsis root: a role for endodermis and pericycle in stress signal transduction. Plant J. 23: 267-78.
79. Knetch M.L.W., Wang M., Snaar-Jagalska B.E., Heimovaara-Dijkstra S. (1996) Abcisic acid unduces mitogen-activated protein kinase activation in barley aleurone protoplasts. Plant Cell. 8: 1061-1067.
80. Knight H. (2000) Calcium signaling during abiotic stress in plants. Int. Rev. Cytol. 192: 269-324.
81. Koorneef M., Leon-Kloosterziel K.M., Schwartz S.H., Zeevaart J.A.D. (1998) The genetic and molecular dissection of abscisic acid biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis. Plant Physiol. Biochem. 36: 83-89.
82. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
83. Landau M, Herz K, Padan E, Ben-Tal N. (2007) Model structure of the Na+/H+ exchanger 1 (NHE1). Functional and clinical implications. J. Biol. Chem. 282: 37854-63.
84. Lauchli A. (1984) Salt exclusion: an adaptation of legumes for crops and pastures under saline conditions. Salinity Tolerance in Plants: Strategies for Crop Improvement, ed. RC Staples. New York: Wiley. 171-87.
85. Laurie S., Feeney K.A., Maathuis F.J.M., Heard P.J., Brown S.J., Leigh R.A. (2002) A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots. Plant J. 32: 139-149.
86. Lehoux S, Abe Ji, Florian JA, Berk BC. (2001) 14-3-3 Binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. Biol. Chem. 276; 19: 15794-800.
87. Leng Q., Mercier R.W., Hua B.G., Fromm H., Berkowitz G.A. (2002) Electrophysiological analysis of cloned cyclic nucleotide-gated ion channels. Plant Physiol. 128: 400-419.
88. Li X., Borsics T., Harrington H.M., Christopher D.A. (2005) Arabidopsis ArCNGCIO rescues potassium channel mutants of E. coli, yeast and Arabidopsis and is regulated by calcium/calmodulin and cyclic GMP in E. coli. Funct. Plant Biol. 32: 643-653.
89. Li WY, Wong FL, Tsai SN, Phang TH, Shao G, Lam HM. (2006) Tonoplast-located GmCLCl and GmNHXl from soybean enhance NaCl tolerance in transgenic bright yellow (BY)-2 cells. Plant Cell Environm. 29: 1122-37.
90. Lohaus G., Hussmann M., Pennewiss K., Schneider H., Zhu J-J., Sattelmacher B.2000) Solute balance of a maize source leaf as affected by salt treatment with special emphasis on phloem retrotranslocation and ion leaching. J. Exp. Bot. 51: 1721-1732.
91. Maeshima M. & Yoshida S. (1989) Purification and properties of vacuolar membrane proton-translocating inorganic pyrophosphatase from mung bean. J. Biol. Chem. 264; 33: 20068-73.
92. Malo M.E. & Fliegel L. (2006) Physiological role and regulation of the Na+/H+ exchanger. Can. J. Physiol. Pharmacol. 84; 11: 1081-95.
93. Mariaux J.-B, E. Fisher-Schliebs, U. Luttge, R. Ratajczak. (1997) Dynamics of activity and structure of the tonoplast V-type H+-ATPase in plants with different expression of CAM and in a C3 plant under salt stress. Protoplasma. 196: 181-189.
94. Martinez-Atienza J., Jiang X., Garciablades B., Mendoza I., Zhu J.K., Pardo J.M., Quintero F.J. (2007) Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice. Plant Physiol. 143: 1001-1012.
95. Matoh T., Ishikawa T., Tanahashi E. (1989) Collapse of ATP -induced pH gradient by sodium ions in microsomal membrane vesicles prepared from Atriplex gmelini leaves. Plant Physiol. 86: 180-183.
96. Maurel C. (1997) Aquaporins and water permeability of plant membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 399-429.
97. Millar D.G. & Shore G.C. (1994) Mitochondrial Mas70p signal anchor sequence. Mutations in the transmembrane domain that disrupt dimerization but not targeting or membrane insertion. J. Biol. Chem. 269; 16: 12229-12232.
98. Miller A.J. & Zhou J.J. (2000) Xenopus oocytes as an expression system for planttransporters. Biochim. et Biophys. Acta. 1465: 343-358.
99. Mukerjee S, Kallay L, Brett CL, Rao R. (2006) Mutational analysis of the intramembranous H10 loop of yeast Nhxl reveals a critical role in ion homeostasis and vesicle trafficking. Biochem J. 398: 97-105.
100. Munns R. & Tester M. (2008) Mechanisms of Salinity Tolerance. Annu. Rev. Plant Biol. 59:651-81.
101. Nakamura N., Tanaka S., Teko Y., Mitsui K., Kanazawa H. (2005) Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J. Biol. Chem. 28: 1561-72.
102. Nass R. & Rao R. (1998) Novel Localization of a Na+/H+ Exchanger in a Late Endosomal Compartment of Yeast. J. Biol. Chem. 273; 33: 21054-21060.
103. Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo J.M. (1995) Ion homeostasis in NaCl stress environments. Plant Physiol. 109: 735-742.
104. OrlowsKi J. & Grinstein S. (1997) Na+/H+ exchangers of mammalian cells. J.Biol.Chem. 272; 36: 22373-22376.
105. Padan E., Kozachkov L., Herz K., Rimon A. (2009) NhaA crystal structure: functional-structural insights. J. Exp. Biol. 212(11): 1593-603.
106. Palmgren M.G. (1991) Acridine orange as a probe for measuring pH gradients across membrane: mechanisms and limitations. Anal. Biochem. 192: 316-321
107. Pardo J., Cubero B., Leidi E. and Quintero F. (2006) Alkali cation exchangers: roles in cellular homeostasis and stress tolerance. J. exp. Bot. 57; 5: 1181-1199.
108. Porat R., Pavoncello D., Ben-Hayyim G., Lurie S. (2002) A heat treatment induced the expression of a Na+/H+ antiport gene (cNHXl) in citrus fruit. Plant Science. 162; 6: 957963.
109. Prior C., Potier S., Souciet J. L., Sychrova H. (1996) Characterization of the NHA1 gene encoding a Na+/H+-antiporter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 387: 8993.
110. Putney L.K., Denker S.P., Barber D.L. (2002) The changing face of the Na+/H+ exchanger, NHE1: structure, regulation and cellular actions. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 527-552.
111. Qiu Q.S., Barkla B.J., Vera-Estrella R., Zhu J.-K., Schumaker K. (2003) NaW exchange activity in the plasma membrane of Arabidopsis Plant Physiol. 132: 1041-1052.
112. Qiu Q.S., Guo Y, Dietrich MA, Schumaker KS, Zhu J-K. (2002) Regulation of SOS 1, a plasma membrane Na+/H+ exchanger in Arabidopsis thaliana, by SOS2 and SOS3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 8436-41.
113. Qiu Q.S., Guo Y., Quintero F.J., Pardo J.M., Schumaker K.S., Zhu J.K. (2004) Regulation of vacuolar Na+/H+ exchange in Arabidopsis thaliana by the salt-overly-sensitive (SOS) pathway. J. Biol. Chem. 279; 1: 207-15.
114. Quintero FJ, Blatt MR, Pardo JM. (2000) Functional conservation between yeast and plant endosomal Na+/H+ antiporters. FEBS Lett. 471: 224-8.
115. Rarus G. E., Dietrich M.A., Schumaker K. S. (2002) Increased vacuolar Na+/H+ exchange activity in Salicornia bigelovii Torr. In response to NaCl. J. Exp. Bot. 53; 371: 1055-1056.
116. Rasmussen A A, Eriksen M., Gilany K., Udesen C., Franch T., Petersen C., ValentinHansen P. (2005) Regulation of ompA mRNA stability: the role of a small regulatory RNA in growth phase-dependent control. Mol. Microbiol. 58; 5: 1421-9.
117. Ratajczak R. (2000) Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 1465: 17-36.
118. Raven JA. (1985) Regulation of pH and generation of osmolarity in vascular plants: A cost-benefit analysis in relation to efficiency of use of energy, nitrogen and water. New Phytol. 101: 25-77.
119. Reddy T, Ding J, Li X, Sykes BD, Rainey JK, Fliegel L. (2008) Structural and functional characterization of transmembrane segment IX of the NHE1 isoform of the Na+/H+ exchanger. J. Biol. Chem. 283; 32: 22018-30.
120. Ren ZH, Gao JP, Li LG, Cai XL, Huang W, et al. (2005) A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter. Nat. Genet. 37: 1141-46.
121. Rodriguez-Navarro A. & Rubio F. (2006) High-affinity Potassium and Sodium Transport Systems in Plants. J. Exp. Bot. 57: 1149-1160.
122. Rodríguez-Rosales M.P., Galvez F.J., Huertas R., Aranda M.N., Baghour M., Cagnac O., Venema K. (2009) Plant NIIX cation/proton antiporters. Plant Signaling & Behavior. 4: 265-276.
123. Rodríguez-Rosales M.P., Jiang X.J., Galvez F.J., Aranda MN, Cubero B, Venema K.2008) Overexpression of the tomato K+/H+ antiporter LeNHX2 confers salt tolerance by improving potassium compartmentalization. New Phytol. 179: 366-77.
124. Rubio F., Gassmann W., Schroeder J J. (1995) Sodiumdriven potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1 and mutations conferring salt tolerance. Science. 270: 1660-1663.
125. Saier MH, Eng BH, Fard S, Garg J, Haggerty DA, Hutchinson WJ, et al. (1999) Phylogenic characterization of novel transport protein families revealed by genome analyses. Biochim. Biophys. Acta. 1422: 1-56.
126. Sakano K. (1998) Revision of biochemical pH-Stat: Involvement of alternative pathway metabolisms. Plant Cell Physiol. 39: 467-73.
127. Sambrook J., Russel D.W. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2001. New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vol.3. 1-672.
128. Saneoka H., Nagasaka C., Hahn D.T.,Yang W.-J., Premachandra G.S., Joly R.J., Rhodes D. (1995) Salt tolerance of glycinbetain deficient and containing maize lines. Plant Physiol. 107: 631-638.
129. Saqib M., Zorb C., Rengel Z., Schubert S. (2005) The Expression of the Endogenous Vacuolar Na+/H+ Antiporters in Roots and Shoots Correlates Positively with the Salt Resistance of Wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci. 169: 959-965.
130. Sato Y. & Sakaguchi M. (2005) Topogenic properties of transmembrane segments of Arabidopsis thaliana NHX1 reveal a common topology model of the Na+/H+ exchanger family. J. Biochem. 138: 425-31.
131. Schachtman D.P., Kumar R., Schroeder J.I., Marsch E.L. (1997) Molecular and functional characterisation of a novel low-affinity cation transporter (LCT1) in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 11079-11084.
132. Sehnke P.C., Rosenquist M., Alsterfjord M., DeLille J., Sommarin M., Larsson C., Ferl R.J. (2002) Evolution and isoform specificity of plant 14-3-3 proteins. Plant Mol. Biol. 50; 6: 1011-1018.
133. Shabala L., Cuin T.A., Newman I.A., Shabala S. (2005) Salinity-induced ion flux patterns from the excised roots of Arabidopsis sos mutants. Planta. 222: 1041-1050.
134. Sheen J. (1996) Ca2+-dependent protein kinases and stress signal transduction in plants. Science. 274(5294): 1900-2.
135. Shi H., Ishitani M., Kim C., Zhu J-K. (2000) The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na^YH* antiporter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 68966901.
136. Shi H., Lee B.H., Wu S.J., Zhu J.K. (2003) Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana. Nat. Biotechnol. 21(1): 81-85.
137. Shi H., Quintero F. J., Pardo J. M., Zhu J.K. (2002) The putative plasma membrane Na+/H+-antiporter SOS1 controls long-distance Na+ transport in plants. Plant Cell. 14: 465477.
138. Shi H. & Zhu J.-K. (2002) Regulation of expression of the vacuolar Na/H antiporter gene AtNHXl by salt stress and abscisic acid. Plant Mol. Biol. 50: 543-550.
139. Shinozaki K. & Shinozaki-Yamaguchi K. (1997) Gene Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response. Plant Physiol. 115: 327—334.
140. Shinozaki K. & Yamaguchi -Shinozaki K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature differences and cross-talk between two stress signal pathways. Current opinion in Plant Biology. 3: 217-223.
141. Sickler CM, Edwards GE, Kiirats O, Gao Z, Loescher W. (2007) Response of mannitolproducing Arabidopsis thaliana to abiotic stress. Funct. Plant Biol. 34: 382-91.
142. Slepkov E.R., Rainey J.K., Li X., Liu Y., Cheng F.J., Lindhout D.A., Sykes B.D., Fliegel L. (2005) Structural and functional characterization of transmembrane segment IV of the NHE1 isoform of the Na+/H+exchanger. J. Biol. Chem. 6; 280; 18: 17863-72.
143. Staal M., Maathuis F.J.M., Elzenga T.M., Overbeek H.M., Prins H.B.A. (1991) Na+/H+ antiporter activity in tonoplast vesicles from roots of the salt tolerant Plantago maritima and salt-sensitive Plantago media. Physiologia Plantarum. 82: 179-184.
144. Steudle E. (2000) Water uptake by roots: effects of water deficit. J. Exp. Bot. 51: 1531— 1542.
145. Storey R. & Walker R.R. (1999) Citrus and salinity. Sci. Hortic. 78: 39-81.
146. Sunkar R. & Zhu J-K. (2007) Micro RNAs and short-interfering RNAs in plants. J. Integr. Plant Biol. 49: 817-26.
147. Sze H. (1983) Proton-pumping adenosine triphosphatase in membrane vesicles of tobacco callus. Sensitivity to vanadate and K+. Biochim. Biophys. Acta. 732: 586-94.
148. Sze H., Li X., Palmgren M.G. (1999) Energization of Plant Cell Membranes by H+-Pumping ATPases: Regulation and Biosynthesis. Plant Cell. 11:677-690.
149. Talke I.N., Blaudez D., Maathuis F.J.M., Sanders D. (2003) CNGCs: prime targets of plant cyclic nucleotide signaling? Trends Plant Sci. 8: 286-293.
150. Tester M. & Davenport R. (2003) Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants. Ann. Bot. 91: 503-527.
151. Towle D.W., Baksinski A., Richard N.E., Kordylewski M. (1991) Characterization of an endogenous Na+/H+ antiporter in Xenopus laevis oocytes. J. exp. Biol. 159: 359-369.
152. Tracy FE, Gilliham M, Dodd AN, Webb AAR, Tester M. (2008) Cytosolic free Ca2+ in Arabidopsis thaliana are heterogeneous and modified by external ionic composition. Plant Cell Environm. 8: 1063-73.
153. Utsugi J., Inaba K., Kuroda T., Tsuda M., Tsuchiya T. (1998) Cloning and sequencing of a novel Na+/H+ antiporter gene from Pseudomonas aeruginosa. Biochim. Biophys. Acta. 1398(3): 330-4.
154. Venema K., Belver A., Marin-Manzano M.C., Rodríguez-Rosales M.P., Donairo J. P.2003) A novel Intracellular K+/H+ antiporter related to Na+/H+ antiporters is important for K+ ion himeostasis in plants J. Biol. Chem. 278; 25: 22453-22459.
155. Venema K., Donairo F. J., Pardo J.M. (2002) The Arabidopsis Na+/H+ exchanger AtNHXl catalized low affinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes. J. Biol. Chem. 273; 4: 2413-2418.
156. Vera-Estrella R, Barkla B. J., Garcia-Ramirez L., Pantoja O. (2005) Salt Stress in Thellungiella halophila Activates Na+ Transport Mechanisms Required for Salinity Tolerance. Plant Physiol. 139: 1507-1517.
157. Volkov V. & Amtmann A. (2006) Thellungiella halophila, a salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana, has specific root ion channel features supporting K+/Na+ homeostasis under salinity stress. Plant J. 48: 342-353.
158. Wakabayashi S., Pang T., Su X., Shigekawa M. (2000) A novel topological model of the human Na+/H+ exchanger isoform 1. J. Biol. Chem. 275: 7942-9.
159. Wakabayashi S., Shigekawa M., Pouyssegur J. (1997) Molecular physiology of vertebrate Na+/H+ exchangers. Physiol. Rev. 77: 51-74.
160. Wang B., Davenport R.J., Volkov V., Amtmann A. (2006) Low unidirectional sodium influx into root cells restricts net sodium accumulation in Thellungiella halophila, a salttolerant relative of Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 57: 1161-1170.
161. Wells K.M. & Rao R. (2001) The yeast Na+/H+ exchanger Nhxl is an N-linked glycoprotein. Topological implications. J. Biol. Chem. 276: 3401-7.
162. Widell S., Lundborg T., Larsson C. (1982) Plasma membranes from oats prepared by partition in an aqueous polymer two phase system. Plant Physiol. 70: 1429.
163. Wiebe C.A., Rieder C., Young P.G., Dibrov P., Fliegel L. (2003) Functional analysis of amino acids of the Na+/H+exchanger that are important for proton translocation. Mol. Cell Biochem. 254(1-2): 117-24.
164. Winter D, Vinegar B, Nahal H, Ammar R, Wilson GV, Provart NJ. (2007) An "electronic fluorescent pictograph" browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets. PloS ONE. 8: 718.
165. Wise A.A, Liu Z, Binns A.N. (2006) Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium. Methods Mol Biol. 343: 43-53.
166. Wu C.A., Yang G.D., Meng Q.W., Zheng C.C. (2004) The cotton GhNHXl gene encoding a novel putative tonoplast Na^/H^ antiporter plays an important role in salt stress. Plant Cell Physiol. 45; 5: 600-7.
167. Xia T., Apse M.P., Aharon G.S., Blumwald E. (2002) Identification and characterization of a NaCl-inducible vacuolar Na+/H+ antiporter in Beta vulgaris. Physiol. Plant. 116; 2: 206-212.
168. Xiong L., Ishitani M., Zhu J.K. (2002a) Regulation of osmotic stress-responsive gene expression by the LOS6/ABA1 locus in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 277: 8588-8569.
169. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.-K. (20026) Cell signaling during cold, drouth, and salt stress. Plant Cell. 14 Suppl: 165-83.
170. Yamaguchi T., Aharon GS, Sottosanto JB, Blumwald E. (2005) Vacuolar Na+/H+ antiporter cation selectivity is regulated by calmodulin from within the vacuole in a Ca2+-and pH-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 16107-12.
171. Yamaguchi T., Apse M.P., Shi H., Blumwald E. (2003) Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+ antiporter reveals a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 12510-5.
172. Yamaguchi-Shinozaki K. & Shinozaki K. (2006) Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 781-803.
173. Yang Q, Chen ZZ, Zhou XF, Yin HB, Li X, Xin XF, et al. (2009) Overexpression of SOS (Salt Overly sensitive) genes increases salt tolerance in transgenic Arabidopsis. Mol. Plant; 2; 1:22-31.
174. Yokoi S., Quintero F.J., Cubero B., Ruiz M.T., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo
175. J.M, (2002) Differential expression and function of Arabidopsis thaliana NHX Na+/H+ antiporters in the salt stress response. Plant J. 30: 529-39.
176. Zahran H.H., Marín-Manzano MC, Sánchez-Raya A J, Bedmar EJ, Venema K, Rodríguez-Rosales MP. (2007) Effect of salt stress on the expression of NHX-type ion transporters in Medicago intretexta and Melilotus indicus plants. Physiol. Plant. 131: 12230.
177. Zhang H.-X. & Blumwald E. (2001) Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nature biotech 19: 765-768.
178. Zhang H-X, Hodson JN, Williams JP, Blumwald E. (2001) Engineering salt-tolerant Brassica plants: characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 12832-6.
179. Zhang X., Henriques R., Lin S., Niu Q., Chua N. (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1; 2: 1-6.
180. Zhu J-K. (2001) Plant salt tolerance. Trends Plant Sci. 6: 66-71.
181. Zhu J-K. (2002) Salt and drought signal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53: 247-73.
182. Zhu J-K, Liu J, Xiong L. (1998) Genetic analysis of salt tolerance in arabidopsis. Evidence for a critical role of potassium nutrition. Plant Cell. 10: 1181-1191.
183. Zorb C., Noll A., Karl S., Leib K, Yan F., Schubert S. (2005) Molecular characterization of Na+/H+ antiporters (ZmNHX) of maize (Zea mays L.) and their expression under salt stress. J. Plant Physiol. 162: 55-66.
-
Васекина, Анастасия Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.06
- Получение и анализ солеустойчивости трансгенных растений арабидопсиса и картофеля, экспрессирующих гетерологичные гены вакуолярных антипортеров HvNHX2 или HvNHX3
- Влияние экспрессии гена мембранной H+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости растений табака
- Исследование ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта ячменя
- Функциональная идентификация и транспортные свойства Cl-/H+-антипортера мембран аппарата Гольджи клеток корня галофита Suaeda altissima(L.)Pall.
- Na+-АТФазы галотолерантных водорослей
