Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная идентификация и транспортные свойства Cl-/H+-антипортера мембран аппарата Гольджи клеток корня галофита Suaeda altissima(L.)Pall.

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Функциональная идентификация и транспортные свойства Cl-/H+-антипортера мембран аппарата Гольджи клеток корня галофита Suaeda altissima(L.)Pall."

На правах рукописи

Шувалов Алексей Витальевич

Функциональная идентификация и транспортные свойства CI /Н+-антипортера мембран аппарата Гольджи клеток корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall.

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва-2013

005540562

005540562

Работа выполнена в лаборатории транспорта ионов и солеустойчивости Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Научные руководители:

доктор биологических наук,

профессор Балнокин Юрий Владимирович

кандидат биологических наук Беляев Денис Вадимович

Официальные оппоненты: Трофимова Марина Сергеевна,

доктор биологических наук, лаборатория мембран растительных клеток, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, заведующий лабораторией

Булычев Александр Александрович,

доктор биологических наук, доцент, кафедра биофизики, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Защита состоится 24 декабря 2013 г. в 11 часов на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальности 03.01.05 - "Физиология и биохимия растений" (Биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инстшуге физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии паук, Москва

Автореферат разослан.«23» ноября [2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

Актуальность темы. Одной из ключевых проблем современной биологии растений является поиск и исследование механизмов, лежащих в основе устойчивости растений к высоким концентрациям солей в почве. Среди этих механизмов важнейшую роль играет способность клеток поддерживать ионный гомеостаз. Эта способность реализуется за счет функционирования мембранного комплекса растительной клетки. Ионный гомеостаз поддерживается функцией локализованных в мембранах транспортеров и каналов. Исследование этих белков раскрывает пути адаптации растений к почвенному засолению. При высоких концентрациях NaCl в среде растения должны поддерживать низкие концентрации Na+ и СГ в цитоплазме, чтобы избегать токсических эффектов. Поддерживая низкие концентрации ионов Na+ и СГ в цитоплазме, клетки транспортируют их в вакуоль и/или внеклеточное пространство с затратой метаболической энергии.

Несмотря на то, что трансмембрашшй электрический потенциал па плазматической мембране (ПМ) препятствует транспорту СГ в цитоплазму, в условиях засоления СГ может поступать в клетку по градиенту электрохимического потенциала (Teakle, Tyerman, 2010). Механизмы транспорта СГ в клетке, в отличие от механизмов транспорта Na+, слабо изучены. Известно, что в трансмембранный перенос анионов вовлечены мембранные белки семейства CLC (chloride channel), которое включает анионные каналы и анион/протонные антипортеры. Гены семейства CLC и их продукты обнаружены у бактерий, животных и растений (Marmagne et al„ 2007; Jentsch, 2008). К представителям этого семейства относятся СГЯГ-аптипортеры, которые осуществляют вторично активный транспорт СГ в обмен на Н+, используя энергию градиента электрохимического потенциала протонов.

Функционирование С17Н+-антипортера продемонстрировано в ПМ прокариот (Accardi, Miller, 2004; Jayaram et al., 2008) и внутренних мембранах клеток животных (Graves et al., 2008; Pusch, Zifarelli, 2009). Как на функциональном, так и молекулярно-генетическом уровне CLC-белки у растений исследованы хуже, чем у животных и бактерий. CiC-гены клонированы из растений Arabidopsis thaliana, риса, табака, и сои (De Angeli et al., 2007). В геноме A. thaliana идентифицировано семь генов (AtCLCa-g), кодирующих CLC-белки (Ilechenberger et al., 1996; Lv et al., 2009). Продукты этих генов локализованы в разных мембранах, в частности, в тоиопласте - AtCLCa, bs с и g (Geelen et al., 2000; Harada et al., 2004; De Angeli et al., 2006; 2010; Monachello et al., 2009; von der Fecht-Bartenbach et al., 2010), везикулах аппарата Гольджи (АГ) - AtCLCd и AtCLCf и тилакоидах - AtCLCe (von der Fecht-Bartenbach et al., 2007; Marmagne et al., 2007).

Длительное время исследования функций растительных CLC белков отставали от идентификации кодирующих их генов, хотя в нескольких ранних работах были обнаружены С1 Л Г и N037H' обменные транспортные активности через тонопласт клеток корней красной свеклы и овса (Blumwald, Poole, 1985; Shumaker, Sze, 1987). В последнее время наблюдается повышенный интерес к исследованию функций и физиологической

з

роли растительных CLC. В ряде работ показано, что локализованные в тонопласте AtCLCa и AtCLCb являются Ж)37Нь-аитипортерами и вовлечены в транспорт нитрата из цитоплазмы в вакуоль (Geelen et al., 2000; Harada et al., 2004; De Angeli et al., 2006; Monachello et al., 2009). Крайне мало исследований посвящено функциям СГ/НГ-антипортеров в растениях. Показано, что AtCLCc, локализованный в тонопласте замыкающих клеток устьиц Arabidopsis thaliana, является СГЯГ-антипортером и вовлечен в накопление СГ вакуолями, тем самым регулируя работу устьичного аппарата (Jossier et al., 2010). Было установлено, что GmCLCl, кодирующий локализованный в тонопласте клеток сои СГ транспортер, вовлечен в накопление СГ в вакуолях. Экспрессия этого гена в клетках табака BY-2 повышала их устойчивость к NaCl (Li et al., 2006: Wang et al., 2012).

Мы предположили, что СГ/ЬГ-аптипортер играет важную роль у галофитов, где он участвует в регуляции концентраций СГ в цитоплазме в условиях засоления. Предполагаемая роль этого антипортера состоит в экспорте ионов СГ из цитоплазмы в вакуоль и/или апопласт. Основанием для этого предположения послужили данные, полученные ранее в лаборатории транспорта ионов и солеустойчивости ИФР РАН, о распределении ионов СГ в клетках и тканях соленакапливающего галофита Suaeda altissima (Балнокин с соавт., 2007; Халилова, 2008).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в функциональной идентификации, определении локализации и исследовании свойств СГ/Н+-антипортсра в клетках корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall..

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. С помощью оптического ДрН-индикатора акридинового оранжевого (АО) и флуоресцентного рН-индикатора пиранина в мембранах, выделенных из клеток корня S. altissima, продемонстрировать трансмембранный СГ/ЬГ-обмен.

2. Определить мембранную локализацию С17Н+-обмена путем разделения выделенных мембран в непрерывном градиенте плотности йодиксанола.

3. Исследовать свойства СГЛГ-обмена (электрогенная активность, зависимость от трансмембранного электрического потенциала, рН-зависимость, чувствительность к ингибиторам анионного транспорта, ионная специфичность, сродство к Cl")

Научная новизна. Впервые было продемонстрировано функционирование С17Н+-антипортера в мембранах АГ, выделенных из растительного организма и изучены свойства этого СГ-транспортера.

Теоретическая и практическая значимость паботы. Функциональная идентификация С17Н+-антипортера в мембранах АГ и исследование его свойств позволили высказать гипотезу об участии клеточных систем везикулярного транспорта в перекосе СГ из цитоплазмы в вакуоль и/или апопласт и, таким образом, в регуляции концентрации ионов в клетках галофитов. Полученные результаты вносят существенный вклад в

понимание механизмов, лежащих в основе солеустойчивости растений, и могут быть использованы в учебных курсах биологических факультетов университетов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в устных докладах на следующих конференциях: 53-ей научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Долгопрудный, 2010), XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011 (Москва, 2011), 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011), межинститутском научном молодежном семинаре «Актуальные проблемы физиологии, молекулярной биологии и биотехнологии растений» (Москва, 2012), XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), 16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012), Международной научно-практической конференции «Адаптационные стратегии живых систем» (Новый Свет, Украина, 2012), IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), II (X) Международной Ботанической Конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2012), V Всероссийском с международным участием медико-биологическом Конгрессе молодых ученых "Симбиоз-Россия 2012" (Тверь, 2012), XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013), Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложпых систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013) и других. Кроме того были сделаны стендовые сообщения на следующих конференциях: Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), VII съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из которых 1 - в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были 50-60-дневные растения Suaeda altissima (L.) Pall., выращенные в водной культуре на среде Робинсона и Даунтона (Robinson, Downton, 1985), содержавшей дополнительно 100 мМ NaCl.

Получение мембранных препаратов из корней S. altissima. Исследования проводили на фракции частично очищенных мембран и фракции, обогащенной

мембранами АГ. Фракцию частично очищенных мембран (ЧОМ) получали центрифугированием микросом в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (0/30 %), отбирая мембраны с границы этих двух слоев.

Фракцию, обогащенную мембранами аппарата Гольджи (МАГ), получали разделением частично очищенной мембранной фракции в линейном градиенте плотности йодиксанола (0-30 %).

Определение состава мембранных фракций проводили путем определения активностей соответствующих ферментов-маркеров. Содержание ПМ оценивали по активности ортованадатчувствительной АТФазы (АТФазы Р-типа), тонопласта -нитратчувствительной АТФазы (АТФазы V-типа), АГ - латентной ИДФазы, эндоплазматнческого ретикулума (ЭПР) - антимицин А-нечувствительной НАД(Ф)Н-цитогфом с редуктазы, мембран митохондрий - цитохром с окзидазы (Hodges, Leonard, 1974). Концентрацию белка определяли методом Симпсона и Зонне (Simpson, Sonne, 1982). Неорганический фосфат определяли методом Сахеки (Saheki et al., 1985). Плавучую плотность мембран определяли по калибровочной зависимости коэффициента преломления раствора йодиксанола от его плотности.

Концентрации Na+ и К* в люмене полученных мембранных везикул оценивали по концентрациям этих ионов в надосадочной жидкости, оставшейся после центрифугирования шмогената разрушенных клеток, т.е. в среде, где происходило формирование везикул. Концентрации Na+ и К* в надосадочной жидкости определяли с помощью пламенного фотометра Leki FP 640 (Финляндия).

Загрузку мембранных везикул средами заданного состава проводили гипоосмотическим шоком, с последующей отмывкой везикул от наружного пиранина на колонке с сефадексом G-50. Загрузку пиранином контролировали по интенсивности флуоресценции этого зонда (при Х^=458 нм, Хега=510 нм) в разбавленной суспензии везикул.

рН в везикулярном люмене определяли по отношению интенсивностей флуоресценции 510 нм) непроникающего через мембраны рН-индикатора пиранина (8-hydroxy-l,3,6-pyrene trisulfonate), находящегося внутри везикул, при двух возбуждающих длинах волн 405 нм и Хех= 458 нм). Для этой цели был использован построенный нами калибровочный график зависимости этого отношения от рН внутри везикул.

АрН на мембране регистрировали по изменению разности поглощения (А^ - Аио) проникающего в везикулы АрН-индикатора акридинового оранжевого (АО) (Palmgren, 1991).

Изменения Дуг на везикулярной мембране регистрировали с помощью потенциал-чувствительных индикаторов, сафранина О (Akerman, Wikstrom, 1976) или оксонола VI (Bashford et al., 1979). Генерацию Aip со знаком «минус» внутри везикул регистрировали

как уменьшение разности поглощения сафранина О (А554-А524), а генерацию Ау/ со знаком «плюс» - как уменьшение разности поглощения оксонола VI (Ai2i - А582).

Для записи дифференциального поглощения оптических зондов АО, сафранина О и оксонола VI использовали спектрофотометр Hitachi 557, работающий в двухволновом режиме.

Ингибмторнын анализ С1/Н+-обмсна проводили с использованием ингибиторов анионного транспорта DIDS (4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbene-disulfbnic acid) и NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid).

Диффузионные потенциалы Na+ или К+ создавали, задавая концентрационные градиенты этих ионов на мембране в присутствии ионофоров ЕТН157 (15 мкМ) или валиномицина (300 нМ), соответствешго. В ряде экспериментов на везикулярной мембране создавали нулевой диффузионный потенциал К+, для чего выравнивали концентрации К+ по обе стороны мембраны в присутствии валиномицина в среде.

Статистика. Эксперименты проводили в 3-5 кратных биологических повторностях. На графиках представлены результаты типичных экспериментов или даны среднеарифметические значения измерявшихся параметров и их стандартные отклонения.

Структура н объем диссертации. Работа изложена на _ страницах

машинописного текста и содержит _ рисунков. Список литературы включает _

источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Регистрация СГЛТ^-обмена на везикулах фракции ЧОМ.

Основной подход в функциональной идентификации хлоридно-протонного антипортера в клетках корня галофита S. altissima состоял в демонстрации ДрС1-зависимого транспорта протонов через мембраггу, который регистрировали на выделенных из корней мембранных везикулах. Предварительные эксперименты были проведены на фракции частично очищенных мембран (ЧОМ). Фракция ЧОМ, как показало определение активностей ферментов-маркеров, содержала мембраны различных клеточных органелл: ПМ, тонопласта, АГ и ЭПР, но в ней практически отсутствовали мембраны митохондрий (таблица 1). Транспорт Н+ через мембраны ЧОМ регистрировали с помощью оптического ДрН-индикатора акридинового оранжевого, флуоресцентного рН-индикатора пиранина и индикатора электрического потенциала (Ду/) сафранина О. Создание на мембране ДрС1, направленного из наружной среды внутрь везикул, приводило к защелачиванию везикулярного люмена, которое сопровождалось генерацией на мембране А у, отрицательного внутри везикул. Полученные результаты указывали па СГ/Н+-о6мен в везикулах фракции ЧОМ и возможное вовлечение в этот обмен СГ/ЬГ-антипортера.

Необходимо было выяснить мембранную локализацию предполагаемого С1 /Н+-антипортера.

Разделение мембран центрифугированием в градиенте плотности йодиксанола

Для того чтобы выяснить, в мембранах какого типа осуществляется СГ/ЬГ-обмен, фракция ЧОМ была разделена в линейном градиенте плотности йодиксанола (рис. 1 а). Йодиксанол, как вещество, используемое для создания градиентов плотности, имеет ряд преимуществ по сравнению с сахарозой. Йодиксанол обладает низкой вязкостью и за счет относительно высокого молекулярного веса растворы йодиксанола при одинаковых с растворами сахарозы плотностях обладают гораздо более низкой тоничностью. Фракции, отобранные с линейного градиента йодиксанола, а также исходная микросомальная фракция и фракция ЧОМ, были исследованы на активность ферментов-маркеров мембран (таблица 1).

Типичное распределение белка, активностей ферментов-маркеров и СПН+-обмена в градиенте показано на рисунке 1 б, в. Два небольших белковых пика соответствовали мембранам с плавучей плотностью 1,08-1,10 и 1,13-1,14 г/см3. Нижнему белковому пику соответствовали максимумы активностей нитрат- и ванадат-чувствителыюй АТФаз (маркеры тонопласта и ПМ соответственно), а верхнему пику - активность латентной ИДФазы (маркер мембран АГ).

Все мембранные фракции, собранные с градиента йодиксанола, были тестированы на активность С17Н+-обмена- ДрС1-зависимое защелачивание везикулярного люмена определяли с помощью флуоресцентного рН-зонда пирашша, загруженного внутрь везикул на первом этапе выделения мембран во время гомогенизации корней. СГЛГ-обмсн регистрировали при нулевом значении К+ диффузионного потенциала. Для этого концентрации К+ снаружи и внутри везикул выравнивали, а в среду впосили валиномицин. Создание ДрС1 осуществляли внесением в среду С1-ВТР в конечной концентрации 70 мМ. Изменение рН внутри везикул в ответ на добавление СГ рассчитывали, как разность между значением рН внутри везикул до и после добавления С1-ВТР.

Наибольшая активность СГ/Н+-обмена наблюдалась во фракциях мембран, отобранных из верхней части градиента йодиксанола. Профиль этой активности по существу совпадал с профилем активности латентной ИДФазы. Этот результат указывает на то, что активность СГ/йТ-обмена, в основном, ассоциирована с мембранами АГ. В последующих экспериментах мы объединяли верхние 6 фракций, собранные с градиента йодиксанола, которые характеризовались наибольшими активностями латентной ИДФазы и С17Н+-обмена, в одну, которую назвали фракцией, обогащенной мембранами аппарата Гольджи (МАГ). О степени загрязнения этой фракции другими мембранами можно судить по данным, представленным в таблице 1. Содержание мембранного белка во фракции МАГ составило лишь 19% и 5,4% от его количеств во фракциях ЧОМ и микросомальной

8

Таблица 1. Активности ферментов-маркеров в мембранных фракциях, выделенных из корней галофита 5иаес!а аИкзШа

Общиг активности ванадат-чувствцтельной АТФазы, Нитрат-чувствительной АТФазы н латентной ИДФазы выражены в (нмоль РО-фрахшит'-с-1; удельные активности этих ферментов выражены в (нмоль Р0 (мкг белка)"1^1. Общие активности антишщпн А нечувствительной НАД(Ф)Н щггохром с редуктазы п цитохром с оксидазы выражены в (нмоль шлохрома £)-фракцня",-<г1; удельные активности этих ферментов выражены в (нмоль щггохрома с)-(мкг бедка)-1 т1.

Исходные микроеомы чом МАГ

Общая | Удельная Общая ( Удельная Общая | Удельная

Белок (мг-фракцг1) 35,1 ±3,9 10,1 ± 1,7 1,9 ± 0,5

Ванадат-чувстввтельная АТФаза 49,4 ±7,8 5,4 ±0,5 40,5 ± 4,6 12,8 ±1,5 2,9 ± 0,8 5,4 ± 0,8

Нитрат-чувствительная АТФаза 50,3 а 6,2 6,1 ±0,4 36,5 ± 4,6 11,5 ± 1,4 1,3 ±0,5 2,5 ±0,6

Ладентная ВДФаза 9,6 ±1,3 1,1 ± 0,2 9,6 ±1,5 2,9 ± 0,3 1,4 ± 0,2 2,7 ± 0.6

Антпмпшш А нечувствительная НАД(Ф)Н-днтохром с редуктам 1131 ±161 124 = 9 383 ± 34 121 ± 11 41,9 ±6,1 79,7 ± 9,2

Цитохром с оксвдаза 6105 ±495 686 ±35 492 ±46 156 ± 15 7,2= 1,6 13,7 ±2,3

фракции, соответственно. Общие и удельные активности нитрат-чувствительной АТФазы, ванадат-чувствительной АТФазы и антимицин А нечувствительной НАД(Ф)Н цитохром с редуктазы были существенно ниже во фракции МАГ, чем во фракции ЧОМ. Лишь 1,5 и 8,9% общей и удельной активностей цитохром с оксидазы сохранялось от соответствующих активностей во фракции ЧОМ. Хотя общая активность латентной ИДФазы во фракции МАГ после центрифугирования в градиенте йодиксанола снижалась, ее удельная активность сохранялась на уровне активности фракции ЧОМ и была в 2,5 раза выше, чем в микросомальной фракции. Таким образом, фракция МАГ обогащена мембранами АГ и содержит относительно небольшие количества других мембран.

Эксперименты по определению активности латентной ИДФзы позволяют предположить наличие, преимущественно, правильной ориентации мембран АГ. Об этом свидетельствует тот факт, что активность этого фермента проявлялась преимущественно в присутствии в среде тритона XI00, делающего мембрану проницаемой для субстрата (ИДФ) и была относительно небольшой в отсутствие детергента (не более 25%). Это указывает на то, что активный центр фермента находился внутри везикул и, лишь когда детергент открывал доступ субстрата к активному центру, происходил гидролиз ИДФ. Такая локализация активного центра латентной ИДФазы характерна для нормально ориентированных везикул АГ (Klohs, Goff, 1980). Следует отметить, что при нормальной ориентации полученных везикул мембран АГ, в ходе выделения они подвергались перезамыканию. Об этом свидетельствует загрузка везикул непроникающим через мембраны рН-индикатором пиранином. Везикулы перезамыкались и в ходе гипоосмотического шока, о чем говорит наличие в них пирами на. Везикулы, подвергавшиеся шоку, также сохраняли преимущественно нативную ориентацию.

В дальнейшем все эксперименты проводили на фракции МАГ.

Регистрация электрогеиного СГЛ1+-обмена во фракции МАГ

Защелачивание везикулярного люмена, вызванное С17Н+-обменом во фракции МАГ, обнаруживали с помощью ДрН-индикатора АО. В экспериментах с АО требовалось предварительное закисление везикулярного люмена, так как этот краситель позволяет регистрировать ДрН только с более кислым рН внутри везикул, чем в среде (Palmgren, 1991). Для создания градиента рН такого направления было использовано наличие внутри везикул ионов Na+. Выделенные везикулы содержали ионы Na+, которые попадали в везикулярный люмен на начальной стадии процедуры выделения везикул при гомогенизации корней. Внесение в суспензию везикул На+/Н+-антипортера, моненсина, (Овчинников, Иванов, Шкроб, 1974), приводило к закислению люмена, (рис. 2 а). Встраивающийся в мембрану экзогешцдй Na+/11+-антипортср вызывал обмен находящихся внутри ионов Na+ на наружные протоны и, соответственно, приводил к генерации АрН с более кислым рН внутри везикул, чем в среде, что регистрировалось как снижение

разности поглощения ЛО. С1-ВТР, добавленный к суспензии везикул после генерации ДрН, не привод™ к диссипации последнего. Другими словами, создание на мембране ДрС1 не приводило к защелачиванию везикулярного люмена и выходу протонов из везикул (рис. 2 а). Диссипация ДрН наблюдалось только после добавления к реакционной среде липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+). Эффект ТФФ+ усиливался с увеличением его концентрации. Мы предположили, что генерация трансмембранного электрического потенциала, отрицательного внутри везикул, происходящая при работе электрогенного СГЛГ-антипортсра ингибировала дальнейший С17Н+-обмен. Хорошо проникающий через мембрану ТФФ+, нейтрализовал отрицательные заряды внутри везикул и тем самым поддерживал функционирование С171 Г-антипортсра.

Предположение об ингибировании С171 Г-антипортсра отрицательными зарядами, накапливающимися внутри везикул, согласуется с результатами наших экспериментов, в которых при создании на мембране ДрС1 наблюдали генерацию трансмембранного электрического потенциала, отрицательного внутри везикул. В этом эксперименте (рис 2 б), условия которого соответствуют условиям эксперимента с ДрН зондом АО (рис 2 а), использовали Ду/-чувствитсльный индикатор сафранин О, позволяющий регистрировать Ду/, отрицательные внутри везикул (Акегтап апс! \Vikstrom, 1976). После генерации такого Ау/ (снижение дифференциальной абсорбции сафранина О) в ответ на добавление С1-ВТР, внесенный в суспензию ТФФ+ приводил к быстрому сдвигу Дц/ в положительную сторону с последующим его медленным возвращением к более отрицательным значениям до достижения определенного уровня (рис 2 б).

Двухфазная кинетика изменений Ду/, которые происходили в ответ на добавление ТФФ+, находит объяснение в рамках предположения о функционировании С1ЛГ-антипортера. Быстрое смещение Д|// к менее отрицательным значениям, вызванное добавлением ТФФ+, по-видимому, включало антипортер, заблокированный накопившимися внутри везикул отрицательными зарядами. Смещение потенциала к менее отрицательным значениям (при добавлении ТФФ+) активировало антипортер, который снова смещал потенциал в отрицательную область, что опять тормозило его работу. В присутствии СГ и ТФФ+ Ау/ на везикулярной мембране, по-видимому, определялся балансом двух процессов, а именно электрогенным СГЛГ-обмепом, смещающим Ау/ к более отрицательным значениям, и генерацией положительного диффузионного тетрафенилфосфониевого потенциала. По мере повышения концентрации ТФФ+ в среде вклад второго процесса в формирование потенциала становился всё больше и равновесное значение Ау/ становилось все менее отрицательным (рис. 2 б).

Чтобы проверить, что наблюдаемые резкие сдвиги дифференциального поглощения сафранина О в ответ на внесение ТФФ+ действительно отражают изменения в Ау/, мы сравнили изменения в дифференциальном поглощении сафранина О при добавлении С1-ВТР с таковым при внесении С1-ВТР совместно с ТФФ+ (рис 3 б). Снижение

ДЛ524-554 было меньше, в ответ на (С1-ВТР + ТФФ+), чем в ответ на С1-ВТР, что указывает на сдвиг Ду к более отрицательным значениям в ответ на С1-ВТР, чем на (С1-ВТР + ТФФ+). Внутривезикулярные изменения рН в ответ на С1-ВТР или (С1-ВТР + ТФФ+) соответствовали различиям в сдвигах Ау/ (рис. 3 а). Защелачивание везикулярного люмена наблюдалось при внесении СГ совместно с ТФФ+, но не наблюдалось защелачивания при добавлении ионов СГ без проникающего катиона (рис. 3 б).

Полученные результаты свидетельствуют в пользу функционирования в мембранах АГ С17Н+-антипортера.

Элск-грогенпые свойства СГ/Н+-антипортера

Очевидно, что обмен аниона на катион, сопровождается разделением зарядов на мембране и генерацией трансмембранной разности электрических потенциалов. В наших экспериментах СГЯТ-обмен на мембране сопровождался генерацией отрицательного внутри везикул. Этот результат не согласуется с транспортом СГ через анионные каналы или переносом посредством С17Н+-симпортера, поскольку в этих случаях в ответ на внесение СГ должно наблюдаться закисление внутривезикулярного люмена. В соответствии с моделью функционирования в мембране СГЛгГ-антипортера ДрС1-зависимое защелачивание люмена тем интенсивнее, чем эффективнее нейтрализуются отрицательные заряды внутри везикул. Нейтрализация зарядов может осуществляться за счет проникновения внутрь везикул катионов, вносимых в среду вместе с С1.

Это предположение было подтверждено нами в экспериментах, где наблюдали ДрС1-зависимое защелачивание везикулярного люмена при внесении С1 с катионами, различающимися по способности проникать через биологические мембраны. В этих экспериментах изменения рН в везикулярном люмене регистрировали с помощью АО и пирашша.

В экспериментах с АО, после генерации на мембране ДрН (с более кислым значением внутри везикул, чем в среде) с помощью моненсина, в ответ на последующее внесение в суспензию С Г в форме различных солей наблюдали диссипацию предварительно созданного ДрН, т.е. происходил отток Н+ из везикул наружу. Скорость диссипации ДрН была разной при внесении СГ в среду в форме С1-ВТР, холинхлорида или Cl-Tris. Наибольшая скорость диссипации наблюдалась, если СГ добавляли в форме Tris-соли. В присутствии слабо проникающего ВТР+ скорость диссипации была едва заметной. С холином+ скорость разрядки была промежуточной (рис. 4 а). Такой же результат был получен в экспериментах с пиранином (рис 4 б.).

Исследовали также действие ионов СГ, вносимых в среду с разными катионами (Tris, холин, ВТР), на трансмембранный электрический потенциал (рис. 4 в). Добавление С1 к среде в форме разных солей приводило к изменениям Ду на везикулярной мембране.

1,04

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

номер фракции

Рис. 1. Результаты центрифугирования в непрерывном градиенте плотности йодиксанола мембран клеток корня 5. а/йганиа, отобранных с одноступенчатого сахарозного градиента, (а) Вид градиента плотности йодиксанола после центрифугирования мембран. Часть градиента, визуально содержавшая мембраны, была разобрана на фракции, (б) Распределение активностей ферментов-маркеров мембран и активности СГ/Н+-обмена в градиенте плотности йодиксанола: латентная ИДФаза (черный), ванадат-чувствительная АТФаза (красный), нитрат-чувствительная АТФазя (зеленый), СГ/Н -обмен (циан). Для всех ферментов наибольшая активность во фракциях принята за 100, что соответствует 18,2 нмоль мин"1 фр"1 для латентной ИДФазы, 38,9 нмоль Р1 мин"1 фр"1 для ванадат-чувствительной АТФазы, 63,2 нмоль Р, мин"1 фр"1 для нитрат-чувствительной АТФазы. СГ /Н+-обмен регистрировали в стандартной реакционной среде (см. рис. 2) с помощью флуоресцентного рН-индикатора пиранина (200 мкМ), загруженного в везикулы на начальной стадии процедуры выделения мембран при гомогенизации корней, (в) Распределение белка (синий цвет) и плотность фракции (темный циан).

мон

(а)

С1-ВТР

С1-ВТР

ТФФ+

5 мин

Рис. 2. Индукция ДрС1-зависимого зашелачивания везикулярного люмена внесением в суспензию мембран хорошо проникающего катиона ТФФ+ после С1-ВТР. Изменения (а) АрН и (б) Ау/ при последовательном внесении в среду моненсина (300 нм), С1-ВТР (70 мМ, рН 7,5) и ТФФ+ (0,5 мМ (красный цвет), 1 мМ (зеленый) или 2 мМ (синий)) наблюдались с помощью АрН-индикатора АО (10 мкМ АО) и А((/-индикатора сафранина О (8 мкМ), соответственно. Реакцию проводили в стандартной реакционной среде: 0,5 М сахароза, 20 мМ ВТР-МЕв (рН 7,5), 3 мМ ЕвТА, 2 мМ 1У^804, везикулы (40-100 мкг мембранного белка).

Рис. 3. Индукция АрС1-зависимого зашелачивания везикулярного люмена путем внесения в суспензию мембран хорошо проникающего катиона ТФФ+ одновременно с С1-ВТР. Изменения (а) \ц/ и (б) АрН в ответ на добавление С1-ВТР или (С1-ВТР + ТФФ+) наблюдали с АрН-индикатором АО (10 мкМ) и А^-индикатором сафранином О (8 мкМ), соответственно. С1-ВТР (красный) и (С1-ВТР + ТФФТ) (зеленый) вносили в суспензию везикул после закисления люмена моненсином (300 нм). С1-ВТР (рН 7,5) и ТФФ+ были добавлены в концентрациях 70 мМ и 1 мМ соответственно. Реакцию проводили в стандартной реакционной среде.

мон

<" 5 мин

Рис. 4. ApCl-зависимое защелачивание везикулярного люмена и АрС1-за виси мая генерация трансмембраиного электрического потенциала в ответ на добавление 70 иМ СГ вместе с катионами, обладающими разной проникающей способностью через мембрану (Tris -зеленый цвет, холин+ - красный, ВТР+ - синий), (а) Защелачивание везикулярного люмена регистрировали с помощью АО (10 мкМ). Предварительную генерацию ápH с более кислым значением рН внутри везикул, чем в среде осуществляли путем добавления моненсина (300 нм). (б) Защелачивание везикулярного люмена регистрировали с помощью флуоресцентного рН-индикатора пиранина (200 мкМ), загруженного в везикулы на начальной стадии процедуры выделения мембран при гомогенизанни корней, (в) Генерацию электрического потенциала, отрицательного внутри везикул регистрировали с помощью оптического Ai//-индикатора сафранина О (8 мкМ). Реакцию проводили в стандартной реакционной среде.

Рис. 5. Защелачивание везикулярного люмена в ответ на создание на мембране ApCI разной величины при разных значениях диффузионного потенциала К+.

Защелачивание регистрировали с помощью пиранина, загруженного в везикулы. Загрузку осуществляли с помощью гипотонического шока в средах: 200 мкМ пиранин, 70 (среда I) или 165 (среда II) мМ сахароза, 25 (среда I) или 2,5 (среда II) мМ K2S04, 2 мМ Mg2S04, 2,5 мМ ЕСТ А, 3 мМ BTP-MES, 1 мМ CI-BTP, pH 7,5. Реакционные среды были идентичны загрузочным средам, за исключением того что они не содержали пиранин и концентрации K2SO4 и С1-ВТР в них варьировали в соответствии с задаваемыми значениями ДрС1 и диффузионного потенциала К+. Реакционные среды содержали также валиномицин (300 нм). В трех вариантах эксперимента наружные и внутренние концентрации К+, выраженные в мМ, были следующими: 50/5, 50/50 или 5/50, что согласно уравнению Нернста соответствовало значениям диффузионного калиевого потенциала +58, 0 и -58 vi В.

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100105

[С1]0Ц/[С1],П

рн

Рис. 6. рН-зависимость СГ/Н+-антипортера. ДрС1-зависимое защелачивание везикулярного люмена наблюдали с помощью АрН-индикатора АО. Везикулы загружали с помощью гипоосмотического шока в средах, идентичных среде I (см. рис. 5), но забуференными 25 мМ ВТР-МЕ8 с разными значениями рН. рН реакционных сред были такими же, как внутри везикул. Предварительно с помощью моненсина генерировали ДрН с более кислым значением рН внутри везикул, чем в среде. Последующее защелачивание везикулярного люмена инициировали добавлением к суспензии везикул 25 мМ С1-Тп« с рН, соответствующими рН загрузочных и реакционных сред. Скорости С17Н+-обмена определяли по первичным наклонам кинетических кривых, отражавших защелачивание. Максимальная скорость СГ/Н+-обмена, наблюдавшаяся при рН 7,5, была принята за 100

Рис. 7. Влияние ингибиторов анионного транспорта ЭЮ8 (черный цвет) и ^РВ (фиолетовый) на активность С17Н+-антипортера. Скорость СГ/Н+-обмена регистрировали при нулевом значении диффузионного потенциала К+ с помощью флуоресцентного рН-индикатора пиранина, загруженного в везикулы гипотоническим шоком в составе среды I (см. рис. 5). Реакционная среда была идентична загрузочной среде I, за исключением того, что в ней отсутствовал пиранин и дополнительно был внесен валиномицин (300 нм). Защелачивание везикул инициировали внесением в реакционную среду 25 мМ С1-ВТР (рН 7,5). В качестве отрицательного контроля вносили МЕв-ВТР.

10 20 30

Концентрация ингибитора

С1"

N0 ,

Вг малат ацетат

Рис. 8. Изменение рН внутри везикул в ответ на внесение в реакционную среду 25 мМ анион-ВТР (рН 7,5): хлорида (красный), нитрата (синий), бромида (оранжевый), малага (зеленый) и ацетата (циан). Изменения рН наблюдали при нулевом значении диффузионного потенциала К+ с помощью флуоресцентного рН-индикатора пиранина, загруженного в везикулы гипотоническим шоком в составе среды I (см. рис. 5).

Рис. 9. Зависимость скорости изменения концентрации Н+ от концентрации С1- в реакционной среде. Изменение [Н+| регистрировали при нулевом значении диффузионного потенциала К+ с помощью флуоресцентного рН-иидикатора пиранина, загруженного в везикулы гипотоническим шоком в составе среды I (см. рис. 5). Реакционная среда была идентична загрузочной среде I.

-------

____—г 0.35

0.30 •

г г 0.20

0.15 0.10 0.05^^

•0,1 0.0 0.1 0.2 0.1

16

Концентрация СГ в среде, мМ

Наибольшее смещение Ai// в отрицательную область наблюдалась в присутствии ионов СГ, добавленных в комбинации с плохо проникающим через мембрану ВТР, тогда как СГ в комбинации с проникающим катионом Tris+ сдвигал Ai// в отрицательную область заметно слабее. Ионы СГ, внесенные в среду вместе с холином, приводили к генерации промежуточного Ai//.

СГ/Н+-антнпортер характеризуется односторонней проводимостью

Так как С17Н+-антипортер является электро генным, то трансмембранпый электрический потенциала должен оказывать влияние на его работу. Следующий эксперимент показал, что ApCl-зависимый транспорт ТГ действительно находится под контролем A\¡/. Электрический потенциал той или иной величины задавали, поддерживая на мембране соответствующий диффузионный калиевый потенциал. Для этого внутри (с помощью гипоосмотического шока) и снаружи везикул задавали различные концентрации (мМ) К+: 5/50, 50/50 или 50/5. При этом в наружную среду был также внесен валиномицин. Согласно уравнению Нернста при указанных отношениях концентраций К+ внутри везикул и снаружи на мембране поддерживались следующие диффузионные калиевые потенциалы: +58, 0, и -58 мВ, соответственно. При трех заданных значениях диффузионного К+ потенциала и разных отношениях концентраций СГ снаружи и внутри везикул с помощью пиранина и калибровочного графика определяли внутривезикулярный pH (рис. 5).

Этот эксперимент показал, что защелачивание люмена тем больше, чем больше концентрационный градиент СГ, направленный из наружной среды в везикулы. Скорость защелачивания характеризовалась насыщением при 25-кратном градиенте С1 на мембране.

Защелачивание везикулярного люмена зависело не только от ДрС1 на везикулярной мембране, но и от А у/ (рис. 5). Отрицательные значения диффузиошюго калиевого потенциала («минус» внутри везикул) подавляли защелачивание, а положительные значения, напротив, его усиливали.

При отрицательных значениях Ау/ и небольших концентрационных градиентах СГ на мембране должно происходить обращение направления транспорта Н* и С1 . В этой ситуации защелачивание везикулярного люмена должно сменяться закислением. Однако закисления не наблюдалось ни при каких условиях данного эксперимента (рис. 5). Одна из наиболее вероятных причин этого состоит в том, что СГЛГ-антипортер S. altissima обладает выпрямляющими свойствами, т.е. работает только в одном направлении. Аниопно-протонные антипортеры, обладающие односторонней проводимостью, были показаны в тонопласте A. thaliana (De Angelí et al. 2006, von der Fecht-Bartenbach et al., 2010).

Следует отметить, что наблюдение односторонней проводимости С1 /НГ-антипортера возможно только, если вся популяция везикул, или подавляющая ее часть имеет

одинаковую ориентацию. В связи с этим, полученный в этом эксперименте результат может быть еще одним доводом в пользу того, что преобладающая часть везикул мембран АГ, перезамыкаясь, принимает правильную ориентацию.

рН-зависимость СГ7Н+-антнпортера

Концентрация Н+ является важным фактором, регулирующим активность белков. В связи с этим рН-зависимость является важной характеристикой СГ/ТГ-антипортсра. С помощью ДрН-зонда АО исследовали рН-зависимость скорости ДрС1-зависимого защелачивания везикулярного люмена.

Чтобы избежать возникновения исходных рН-градиентов на мембране, везикулы с помощью гипоосмотического шока загружали растворами с теми же значениями рН, что и в наружной среде. После генерации ДрН на мембране с помощью моненсина и последующего внесения в реакционную среду Cl-Tris, регистрировали скорость диссипации ДрН. О скорости реакции судили по первичному наклону части кривой, отражающей ДрС1-зависимое защелачивание везикулярного люмена.

Обмен наблюдается в диапазоне значений рН от 7 до 8,5 с оптимумом при рН 7,5 (рис. б). Следует отметить, что рН оптимум СГ/Н^-обмена соответствует цитоплазматическому значению рН растительных клеток.

Иигнбиторный анализ СГ/Н+-антипортера

Исследования действия ингибиторов транспорта анионов на С1 ЛГ-обмеп во фракции МАГ проводили с помощью рН-индикатора пиранина, создавая на мембране нулевой диффузионный К+ потенциал. В этих условиях отрицательные заряды, накапливающиеся при СГ/Н+-обмсне внутри везикул, нейтрализуются и не происходит ингибирования этого обмена.

Результаты экспериментов, в которых исследовали эффект ингибиторов, согласуются с представлениями о СГ/Т-Г-обмене, осуществляемом антипортером. DIDS (4,4'-diisoth¡ocyanatostylbene-2,2'-disulfonic acid) - известный ингибитор хлоридных транспортеров и анионных каналов в клетках млекопитающих и растений (Matulef, 2005; Tavares et al., 2011; Garcia-Celma ct al., 2013) подавлял СГЯТ-обмен с 1С50=7 мкМ. В концентрации 50 мкМ этот ингибитор полностью подавлял СГ/Н+-обмен (рис. 7). NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid) - ингибитор шшонных каналов (Barbier-Brygoo et al., 2000) не оказывал ингибирующего действия на СГ/Н+-обмен в мембранной фракции МАГ в диапазоне концентраций от 0 до 50 мкМ (рис. 7). Более высокие концентрации NPPB также не оказывали ингибирующего действия.

Анионная специфичность антипортсра

Важное значение для выяснения природы ионных транспортеров имеет изучение их ионной специфичности.

Изучали анионную специфичность защелачивапия люмена везикул фракции МАГ с заданным составом люмена. На везикулярной мембране задавали направленный внутрь концентрационный градиент анионов: СГ, N03~, Br , малата или ацетата (25 мМ снаружи и 1 мМ внутри). Направленные внутрь 25-кратные градиенты СГ, N03~, или Вг~ вызывали защелачивание везикулярного люмена, в то время как градиенты малата и ацетата приводили к закисленшо везикул (рис 8 а).

Закисление люмена при создании на мембране градиентов малата и ацетата указывает на вовлечение в наблюдавшийся протонный транспорт, не анион-протонных антипортеров, а каких-то других белков. В частности, были продемонстрированы анион-селективные каналы, активирующиеся при отрицательных значениях потенциала на цитоплазматической стороне вакуолярной мембраны растительных клеток, участвующие в накоплении малата в вакуоли (Hafke et al., 2003; Hurtu et al., 2005).

Зависимость скорости защелачивания везикулярного люмена от концентрации С1 в наружной среде продемонстрировала насыщающию кинетику с наблюдаемой Км равной 18.5 ±1.7 мМ (п = 4) (рис 8 б). Это значение Км лежит в диапазоне цитоплазматических концентраций СГ у близкого объекту исследования вида Siiaeda marítima (Hajibagheri, Flowers, 1989).

Заключение

Результаты работы показывают, что активность СГ/ЬГ-обмсна в мембранах, выделенных из корней S. altissima, преимущественно локализована в мембранах АГ.

В настоящее время локализация CLC белков показана в тонопласте, мембранах АГ и тилакоидах, но не в других мембранах растительных клеток (von der Fecht-Bartenbach et al., 2007; Marmagne et al., 2007; Barbier-Brygoo et al., 2011). Принимая это во внимание и предполагая такую же локализацию CLC белков в клетках S. altissima, можем заключить, что СГ/ТГ-обмен, наблюдавшийся в МАГ, осуществляется СГ/Н'-антипортером мембран АГ.

Способность МАГ обменивать на ГТ также N03~ и ВГ свидетельствует о низкой селективности СГЛГ-антипортера. Низкая избирательность CLC транспортеров по отношению к анионам показана для Arabidopsis thaliana (De Angelí et al. 2006, Bergsdorf et al., 2009, von der Fecht-Bartenbach et al., 2010).

Встает вопрос, какова физиологическая роль СГ/1 Г-аптипоргера мембран аппарата АГ в клетках S. altissima. Кроме часто упоминаемых в литературе функций нейтрализации отрицательных зарядов, накапливающихся в цитоплазме при работе протонных насосов, и регулирования pH внутри органелл (Kornak et al., 2001; Kasper et al., 2005; Miller, 2006;

19

Graves et al., 2008, Barbier-Brygoo et al., 2011; Pittman, 2012), C171 Г-антипортср может вносить вклад в солеустойчивость растений. При высоких концентрациях соли в среде равновесный потенциал СГ на ПМ может быть более отрицательным, чем трансмембранный электрический потенциал, то есть возможны ситуации, когда ионы СГ поступают из внеклеточной среды в цитоплазму по градиенту электрохимического потенциала (Teakle, Tyerman, 2010). В этих случаях С17Н+-антипортер может транспортировать СГ из цитоплазмы в апопласт или внутриклеточные компартменты, в частности, в вакуоли, используя энергию протонного градиента. Зависимость скорости защелачивания везикулярного люмена от концентрации СГ (рис 86) обнаруживает Км, лежащую в миллимолярном диапазоне, что соответствует концентрациям СГ в цитоплазме близкого вида Suaeda maritima (Hajibagheri, Flowers, 1989). Наши результаты lie исключают, что С ГЛГ-ai ггипорте р функционирует и в тонопласте. Относительно высокая активность СГЛГ-обмена наблюдалась во фракциях 8-11 градиента йодиксанола, где активность нитрат- чувствительной АТФазы была максимальной.

Теоретически, транспорт СГ из цитоплазмы в вакуоль может осуществляться непосредственно СГЛГ-антипортером тонопласта или с участием везикулярного транспорта. В последнем случае накопление СГ в везикулярном люмене также предполагается с участием СГЛ1+-аптипортера. Внутриклеточный перенос СГ в вакуоль согласуется с данными литературных источников о внутриклеточном везикулярном транспорте ионов Na+. Вовлечение везикулярного транспорта в компартментализацию "Na+ в вакуолях было показано в клетках корня A. thaliana (Hamaji et al., 2009; Krebs et al., 2010). Было показано также, что изоформы №+/Н*-антипортера NHX5 и NHX6 ассоциированы с транс-Гольджи сетью и ранними эндосомами. Двойной нокаут-мутант по nhx5 и пкхб А. thaliana характеризовался замедленным ростом и повышенной чувствительностью к NaCl (Bassil et al., 2011). В пользу везикулярного транспорта СГ свидетельствуют электронно-микроскопические исследования S. altissima, проведенные ранее в лаборатории транспорта ионов и солеустойчивости ИФР РАН (Балнокин с соавт., 2007; Халилова, 2008). Эти исследования показали стимуляцию хлористым натрием, присутствующим в питательном растворе, образования везикул и мультивезикулярных тел в клетках листьев и корней S. altissima. Такие структуры были обнаружены преимущественно на границах цитоплазмы и центральной вакуоли, а также цитоплазмы и ПМ. Локальное накопление СГ в этих зонах было продемонстрировано методом электронно-микроскопической цитохимии, основанном на формировании электронно-плотных гранул AgCl в местах локализации СГ после обработки растительных тканей ионами Ag4. Встает вопрос о том, является ли везикулярный транспорт ионов в вакуоль более предпочтительным по сравнению с прямой закачкой этих ионов с помощью ионных транспортеров тонопласта. Выдвинуто с соавторами выдвинул предположение, что везикулярный транспорт Na+ в вакуоль выгоднее прямого транспорта, так как мембраны мелких везикул энергизуются более

эффективно, поскольку у них больше отношение площади поверхности к объему (МаПпклайа!., 2012).

ВЫВОДЫ

1. Из клеток корней галофита Suaeda altissima выделена мембранная фракция, обогащенная везикулами аппарата Гольджи, которые имеют, преимущественно, нативную ориентацию, то есть обращены цитоплазматической стороной наружу.

2. В мембранах аппарата Гольджи из клеток корней галофита Suaeda altissima функционирует С17Н+-антипортер, чувствительный к ингибитору СГ транспортеров и СГ каналов DIDS (4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbene-disulfomc acid) и не чувствительный к ингибитору СГ каналов NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid).

3. СГ/ГТ-обмен, осуществляемый С1 /ТГ-антипортсром мембран аппарата Гольджи, сопровождается генерацией трансмембранного электрического потенциала, отрицательного внутри везикул.

4. С17Н+-антипортер обладает выпрямляющими свойствами, то есть характеризуется односторонней проводимостью: СГ транспортируется внутрь везикул, а Н1" — из везикул в наружную среду.

5. Активность СГЛГ-антипортера регулируется траисмембранным электрическим потенциалом. СГ/НТ-обмен, осуществляемый антипортером, усиливается при более положительных значениях потенциала и подавляется при более отрицательных.

6. Активность С171 Г-аптипоргера обнаруживает pH-зависимость с максимумом при pH 7,5, что соответствует значению цитоплазматического pH растительной клетки.

7. С17Н+-антипортер мембран аппарата Гольджи S. altissima обменивает ГТ на другие неорганические анионы (N03~, Вг~), то есть характеризуется низкой анионной селективностью, подобно СГ/Н+-аптипортсрам внутриклеточных мембран млекопитающих, цитоплазматической мембраны прокариот и внутриклеточных мембран Л. thaüana.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Мясоедов H.A., Беляев Д. В., Халилова Л.А., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Функциональная идентификация С17Н+-антипортера в мембранной фракции клеток корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall. // Труды МФТИ, Долгопрудный, 2012. - Т.4, №3 - С.285-289.

2. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Андреев И.М., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. Функциональная идентификация СГ/Н+-антипортера в мембранной фракции, обогащенной

плазмалеммой, из клеток корней галофита Suaeda altissima (L.) Pall. // Материалы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва, 2010. - С.397.

3. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Беляев Д.В., Андреев И.М., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. С17Н+-антипортер в плазмалемме клеток корня галофита Suaeda altissima II Труды 53-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Часть IV «Молекулярная и биологическая физика. Москва-Долгопрудный, 2010. - С.ЗЗ.

4. Шувалов A.B., Орлова Ю.В. С17Н+-обмен в мембранах клеток корня Suaeda altissima И Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2011». Секция «Биология». Москва, 2011. — С. 227.

5. Шувалов A.B., Орлова Ю.В. ApCl-зависимый перенос протонов через мембраны клеток корня галофита Suaeda altissima // Материалы 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Секция «Биология». Пущино, 2011. -С. 117.

6. Шувалов A.B. Функциональная идентификация СГ-транспортера в мембранах клеток корня галофита // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» Воронеж, 2011,- том 1., С. 126.

7. Балнокин Ю.В., Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Мясоедов H.A., Андреев И.М. С17Н+-антипортеры у бактерий, животных и растений: функциональная характеристика и физиологическая роль // VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Материалы докладов. Часть I. - Нижний Новгород, 2011. - С. 68.

8. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Андреев И.М., Мясоедов H.A., Беляев Д.В., Балнокин Ю.В. СГДТ-антипортер как механизм устойчивости растений к засолению. // Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии». Материалы докладов. — Москва, 2011. - С. 164.

9. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова JI.A. Функциональная и генетическая идентификация семейства CLC растения галофита Suaeda altissima II Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012». Секция «Биология». Москва, 2012. - С.241-242.

10. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова Л.А. СГДТ-антипортер в мембранах клеток корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall, и его функциональная характеристика // Материалы 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - паука XXI века». Секция «Биология». Пущино, 2012. - С.484-485.

11. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова Л.А., Мясоедов H.A., Беляев Д. В., Балнокин Ю.В. Молекулярная идентификация экспрессирующихся в условиях засоления генов семейства CLC у галофита Suaeda altissima (L.) Pall. II Тезисы докладов научно-

22

практической конференции «Адаптационные стратегии живых систем». Новый Свет, Украина, 2012.-С.123.

12. Балнокин Ю.В., Шувалов A.B., Халилова Л.А., Орлова Ю.В., Мясоедов H.A., Беляев Д. В., Андреев И.М. Транспорт СГ у галофитов на клеточном уровне и уровне целого растения // Тезисы докладов научно-практической конференции «Адаптационные стратегии живых систем». Новый Свет, Украина, 2012. — С.363.

13. Орлова Ю.В., Халилова Л.А., Козгунова Е.К., Андреев И.М., Шувалов A.B., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. Функциональная идентификация С17Н+-антипортеров в мембранах клеток корней различающихся по солеустойчивости растений // Материалы II Международной научно-практической конференции «Ботанические чтения», Ишим 2012. -С. 59-60.

14. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова JI.A., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. Идентификация и характеристика СГ/Н+-антипортера в мембранах клеток корня галофита Siiaeda altissima (L.) Pall. // IV съезд биофизиков России. Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток». Материалы докладов. — Нижний Новгород, 2012. - С.324.

15. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова JI.A., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. Идентификация и исследование свойств С17Н+-антипортера в мембранах аппарата Гольджи галофита Suaeda altissima (L.)Pall. // V Всероссийский с международным участием медико-биологический Конгресс молодых ученых "Симбиоз-Россия 2012". Материалы докладов. — Тверь, 2012. - С.445-448.

16. Шувалов A.B. С17Н+-антипортер галофита Suaeda altissima (L.) Pall. // Материалы XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2013». Секция «Биология». Москва, 2013. — С 312.

17. Шувалов A.B. Орлова Ю.В., Халилова Л.А. СГЛГ-обмсн па мембранах аппарата Гольджи галофита Suaeda altissima // Материалы 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Секция «Биология». Пущино, 2013.-С. 505

18. Шувалов A.B., Орлова Ю.В., Халилова Л.А., Мясоедов H.A., Балнокин Ю.В. Хлорцдный транспортер галофита Suaeda altissima (L.)Pall. //Материалы докладов Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы». Воронеж, 2013. - С 94-98.

19. Балнокин Ю.В., Орлова Ю.В., Шувалов A.B., Халилова Л.Ф, Куркова Е.Б., Мясоедов H.A., Беляев Д.В., Андреев И.М. Возможная роль аппарата Гольджи во внутриклеточном транспорте СГ у галофита Suaeda altissima (L.) Pall. // Годичное собрание общества физиологов растений России. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений», 2013. - С 137

20. Балнокин Ю.В., Орлова Ю.В., Халилова Л.Ф, Мясоедов H.A., Беляев Д.В. Идентификация генов CLC Suaeda altissima (L.) Pall. // Годичное собрание общества физиологов растений России. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений», 2013. - С 357-358

Подписано в печать: 20.11.2013

Заказ № 9177 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefcrat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шувалов, Алексей Витальевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук

Шувалов Алексей Витальевич

Функциональная идентификация и транспортные свойства С1 /Н+-антипортера мембран аппарата Гольджи клеток корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall.

(03.01.05 - физиология и биохимия растений)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович

кандидат биологических наук, Беляев Денис Вадимович

Москва-2013

На правах рукописи

04201451624

Оглавление

Введение.............................................................................................................................6

1. Обзор литературы..........................................................................................................9

1.1. Растения в условиях почвенного засоления......................................................9

1.2. Значение СГ для растений в норме и повреждающее действие СГ в условиях засоления......................................................................................................13

1.3. Движущие силы транспорта анионов через мембраны клеток растений.....17

1.4. Семейство белков CLC (ChLoride Channel) и их распространенность в живых организмах........................................................................................................18

1.5. Семейство CLC в Arabidopsis thaliana: гены, функции и физиологическая роль................................................................................................................................22

1.5.1. AtCLCa - нитратный транспортер, вовлеченный в накоплении нитрата в вакуолях.....................................................................................................................24

1.5.2. AtCLCb - нитратный транспортер, экспрессирующийся в вакуолях на ранних стадиях развития..........................................................................................25

1.5.3. AtCLCc - хлоридный транспортер, вовлеченный в регуляцию работы устьичного аппарата и солеустойчивость..............................................................26

1.5.4. AtCLCd - хлоридный транспортер, колокализованный с АТФазой V-типа в мембранах аппарата Гольджи...............................................................................27

1.5.5. AtCLCe -анионный канал или транспортер, локализованный в тилакоидах хлоропластов.........................................................................................30

1.5.6. AtCLCf- канал или транспортер с неизвестной функцией, локализованный в мембранах аппарата Гольджи..................................................31

1.5.7. AtCLCg - хлоридный транспортер, локализованный в тонопласте..........32

1.6. Семейство CLC у других растений......................................................................32

1.7. Структурная организация CLC транспортеров..................................................34

1.8. Предполагаемый молекулярный механизм СГ/Н+-обмена...............................40

1.9. Физиология солеустойчивости галофита Suaeda altissima...............................42

2. Объекты и методы исследования...............................................................................47

2.1. Объект исследования............................................................................................47

2.2. Культивирование 5. аШяята...............................................................................47

2.3. Выделение частично очищенной микросомальной фракций из клеток корня & а1Шзта......................................................................................................................47

2.4. Разделение фракции ЧОМ в непрерывном градиенте плотности йодиксанола и получение фракции обогащенной мембранами аппарата Гольджи.....................49

2.5. Регистрация С17Н+-обмена через везикулярную мембрану.............................50

2.6. Обнаружение генерации трансмембранного электрического потенциала......54

2.7. Оценка внутривезикулярных концентраций К+ и .......................................54

2.8. Аналитические методы.........................................................................................54

2.9. Статистика..............................................................................................................55

3. Результаты и обсуждение............................................................................................56

3.1. Регистрация С17Нт-обмена во фракции частично очищенных мембран (ЧОМ), выделенной из клеток корня 5. ......................................................56

3.1.1. Доказательства компетентности фракции ЧОМ для обнаружения трансмембранного С17Н+-обмена............................................................................56

3.1.2. Регистрация СГ /Н+-обмена во фракции ЧОМ с помощью ДрН-индикатора АО и А^-индикатора сафранина 0.....................................................61

3.1.3. Регистрация СГ/Н+-обмена во фракции ЧОМ с помощью рН-индикатора пиранина.....................................................................................................................64

3.2. Разделение мембран центрифугированием в градиенте плотности йодиксанола..................................................................................................................66

3.3. Регистрация электрогенного СП/НГ-обмена во фракции МАГ.........................71

3.4. Свойства СПТГ-антипортера...............................................................................79

3.4.1. Электрогенные свойства СГ/КГ-антипортера..............................................79

3.4.2. С 17Н+-антипортер характеризуется односторонней проводимостью.......82

3.4.3. рН-зависимость СГ/ЬГ-антипортера.............................................................84

3.4.4. Влияние ингибиторов анионного транспорта на С17Н+-обмен.................87

3.4.5. Анионная специфичность СГ/Н+-антипортера............................................89

Заключение.......................................................................................................................92

Список литературы..........................................................................................................97

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

АГ - аппарат Гольджи АО - акридиновый оранжевый АДФ - аденозиндифосфат ИДФ - инозиндифосфат

МАГ - фракция, обогащенная мембранами аппарата Гольджи МВТ - мультивезикулярные тела ПИ - пиноцитозные инвагинации ПМ - плазматичекая мембрана

ЧОМ - фракция частично очищенных клеточных мембран

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ВТР - l,3-bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propane

С1ССР - carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone

DIDS - 4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbene-disulfonic acid

DTT - (2S, 3S)-1,4-bis(sulfanyl)butane-2,3-diol (dithiothreitol)

EDTA - 2-({2-[Bis(carboxymethyl)amino]ethyl}(carboxymethyl)amino)acetic acid (Ethylenediaminetetraacetic acid)

EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-A^,//,/Vr',/V'-tetraacetic acid

ETH-157 - 2,2'-[l,2-phenylenebis(oxy)]bis(n-benzyl-n-phenylacetamide)

FCCP - carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone

MES - 2-(1Ч-морфолино)этансульфонат

NPPB - 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid

PMSF - phenylmethanesulfonylfluoride

Tris - tris(hydroxymethyl)aminomethane

ApH - трансмембранный градиент pH

Ац/ - трансмембранный градиент электрического потенциала

Одной из ключевых проблем современной биологии растений является поиск и исследование механизмов, лежащих в основе устойчивости растений к высоким концентрациям солей в почве. Среди этих механизмов важнейшую роль играет способность клеток поддерживать ионный гомеостаз. Эта способность реализуется за счет функционирования мембранного комплекса растительной клетки. Ионный гомеостаз поддерживается функцией локализованных в мембранах транспортеров и каналов. Исследование этих белков раскрывает пути адаптации растений к почвенному засолению. При высоких концентрациях NaCl в среде растения должны поддерживать низкие концентрации NaT и СГ в цитоплазме, чтобы избегать токсических эффектов. Поддерживая низкие концентрации ионов Na+ и СГ в цитоплазме, клетки транспортируют их в вакуоль и/или внеклеточное пространство с затратой метаболической энергии.

Несмотря на то, что трансмембранный электрический потенциал на плазматической мембране (ПМ) препятствует транспорту СГ в цитоплазму, в условиях засоления СГ может поступать в клетку по градиенту электрохимического потенциала (Teakle, Tyerman, 2010). Механизмы транспорта СГ в клетке, в отличие от механизмов транспорта Na+, слабо изучены. Известно, что в трансмембранный перенос анионов вовлечены мембранные белки семейства CLC (ChLoride Channel), которое включает анионные каналы и анион/протонные антипортеры. Гены семейства CLC и их продукты обнаружены у бактерий, животных и растений (Marmagne et al., 2007; Jentsch, 2008). К представителям этого семейства относятся С17Н+-антипортеры, которые осуществляют вторично активный транспорт СГ в обмен на Нт, используя энергию градиента электрохимического потенциала протонов.

Длительное время исследования функций растительных CLC белков отставали от идентификации кодирующих их генов, хотя в ранних работах были обнаружены С17Н+ и ЫОз~/Н+ обменные транспортные активности через тонопласт клеток корней красной свеклы и овса (Blumwald, Poole, 1985; Shumaker, Sze, 1987).

В последнее время наблюдается повышенный интерес к исследованию функций и физиологической роли растительных CLC. В ряде работ показано, что локализованные в тонопласте Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля) AtCLCa и AtCLCb являются М037Н+-антипортерами и вовлечены в транспорт нитрата из цитоплазмы в вакуоль (Geelen et al., 2000; Harada et al., 2004; De Angelí et al., 2006; Monachello et al., 2009). Крайне мало исследований посвящено функциям С17Н+-антипортеров в растениях. Показано, что AtCLCc, локализованный в тонопласте замыкающих клеток устьиц A. thaliana, является С17Н+-антипортером и вовлечен в накопление СГ вакуолями, тем самым регулируя работу устьичного аппарата (Jossier et al., 2010). Было установлено, что GmCLCl, кодирующий локализованный в тонопласте клеток сои СГ транспортер, вовлечен в накопление СГ в вакуолях. Экспрессия этого гена в клетках табака BY-2 повышала их устойчивость к NaCl (Li et al., 2006: Wang et al., 2012).

Мы предположили, что Cl /Н'-антипортер играет важную роль у галофитов, где он участвует в регуляции концентраций СГ в цитоплазме в условиях засоления. Предполагаемая роль этого антипортера состоит в экспорте ионов СГ из цитоплазмы в вакуоль и/или апопласт. Основанием для этого предположения послужили данные, полученные ранее в лаборатории транспорта ионов и солеустойчивости ИФР РАН, о распределении ионов СГ в клетках и тканях соленакапливающего галофита Suaeda altissima (Балнокин с соавт., 2007; Халилова, 2008).

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в функциональной идентификации, определении локализации и исследовании свойств С17Н+-антипортера в клетках корня галофита Suaeda altissima (L.) Pall..

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. С помощью оптического АрН-индикатора акридинового оранжевого (АО) и флуоресцентного рН-индикатора пиранина в мембранах, выделенных из клеток корня 5. altissima, продемонстрировать трансмембранный СГ/Н+-обмен.

2. Определить мембранную локализацию С17Н+-обмена путем разделения выделенных мембран в непрерывном градиенте плотности йодиксанола.

3. Исследовать свойства С17Н+-обмена (электрогенная активность, зависимость от трансмембранного электрического потенциала, рН-зависимость, чувствительность к ингибиторам анионного транспорта, ионная специфичность, сродство к СГ)

lo Обзор литературы

1.1. Растения в условиях почвенного засоления

Важной проблемой с точки зрения обеспечения населения планеты продовольствием является проблема засоления почв. По данным Food and Agriculture Organization (FАО, 2008) до 800 млн. га почв в мире засолены, что составляет более 6 % от общей площади земель. Засоленные почвы чаще всего встречаются в пустынных и полупустынных зонах земного шара. Засоление возникает преимущественно в результате естественных причин (Rengasamy, 2002). Выветривание родительских пород высвобождает растворимые соли разного типа, большей частью хлориды натрия, кальция, и магния, и, в меньшей степени, сульфаты и карбонаты (Szabolcs, 1989). Наибольший вклад в засоление вносит NaCl, поскольку является наиболее растворимой солью. Другой причиной засоления является отложение в почвах океанических солей, приносимых с ветром и дождем. Дождевая вода, выпадающая на морское побережье, содержит 6-50 мг/кг хлорида натрия. Его концентрация снижается по мере удаления от берега. Дождь, содержащий 10 мг/кг хлорида натрия, вносит 10 кг/га соли на каждые 100 мм осадков в год (Munns and, Tester, 2008).

Значительная часть возделываемых сельскохозяйственных земель подверглась засолению вследствие расчистки земель или орошения, что привело к поднятию уровня грунтовых вод и увеличению концентрации солей в корневой зоне. Из 1500 млн. га земель, обрабатываемых в засушливых регионах, 32 млн. га (2 %) в различной степени страдают от вторичного засоления. Из 230 млн. га орошаемых земель, 45 млн. га (20 %) засолены (FAO, 2008). Орошаемые земли составляют лишь 15 % от общей площади обрабатываемых земель, но урожайность на них, по крайней мере, в два раза выше, чем на богарных землях. Вследствие этого на орошаемые земли приходится треть мировой растениеводческой продукции.

На засоленных почвах растения естественной флоры адаптированы к NaCl. В процессе эволюции у них сформировались механизмы, поддерживающие гомеостаз ионов Na+ и СГ. У большинства растений, Na+ и СГ эффективно выводятся корнями, в то время как вода поглощается из почвы (Munns, 2005). Из-за того, что засоление, как правило, характерно для почв засушливых регионов, происходит коэволюция в направлении соле- и засухоустойчивости.

Почвы считаются незаселенными, если суммарное содержание неорганических ионов в ней в расчете на сухую массу не превышает 0,2 %. Слабозасоленными считаются почвы с содержанием ионов 0,2-0,4 %, среднезасоленными - 0,4-0,7 %, сильнозасоленными - 0,7-1 %. Почвы, содержащие свыше 1 % неорганических ионов, называют солончаками. Основными ионами,

I 2+ — 7 ■

вносящими вклад в засоление почв, являются Na , К , Mg , Са" , CI , SO4" и С032".

Растения, адаптированные к высокому содержанию солей в почве, называются галофитами (от греческого galos - соль, phyton - растение), а растения, не способные нормально расти на засоленных почвах, - гликофитами (от греческого glycos - сладкий, phyton - растение). Подавляющее большинство культурных растений относится к гликофитам. Экспериментальные данные, полученные Б. А. Келлером с сотрудниками в полевых исследованиях солеустойчивых растений (Keller, 1951), легли в основу классификации галофитов, предложенной П.А. Генкелем (Генкель, 1982). По этой классификации галофиты делятся на 4 группы:

— соленепроницаемые - растения, основная стратегия солеустойчивости которых основана на избегании попадания избытка ионов в клетки;

— солевыводящие - растения, транспортирующие избыток поглощаемых корнями неорганических ионов в надземные органы и выделяющие их на поверхности листьев с помощью солевых желез;

— солелокализующие - растения, накапливающие избыток поглощаемых ионов в специальных резервуарах - крупных пузыревидных клетках на поверхности листьев;

— соленакапливающие - растения, аккумулирующие избыток неорганических ионов, поступающих из окружающей среды, в вакуолях, преимущественно надземных органов, и создающие за счет этих ионов градиент водного потенциала, который обеспечивает поглощение воды корнями из почвы и движение воды в восходящем направлении в побег в условиях засоления.

Основными повреждающими факторами солей, присутствующими в избытке в почве, являются осмотическое и токсическое действие. При сильном засолении ионы могут накапливаться в листьях до токсичного уровня. Накапливающиеся ионы могут дезинтегрировать клеточные мембраны, подавлять активность ферментов, приводить к нарушению клеточного деления, ингибировать ассимиляцию углерода, поглощение элементов минерального питания. Повреждающее действие ЫаС1 оказывает уже при концентрации до 100 мМ. Токсические эффекты С Г могут заключаться в его конкуренции с РНК и анионными метаболитами, такими, как бикарбонат, карбоксилаты и фосфаты Сахаров, за анионные сайты связывания. Ыат может взаимодействовать с катионными сайтами биополимеров, вовлеченными в связывание К+, Са2+ и (Балнокин, 2007).

Не менее серьезным повреждающим фактором почвенного засоления является осмотическое действие солей. Оно вызвано тем, что низкий водный потенциал почвенного раствора затрудняет поступление воды в растения. Чтобы поглощать воду клетки должны поддерживать водный потенциал на более низком уровне, чем в почвенном растворе. В системе целого растения осмотические эффекты проявляются в снижении скорости роста надземных органов. Внезапное засоление почв вызывает потерю воды клетками листьев и уменьшение их размеров. Однако в течение нескольких часов после засоления клетки восстанавливают свой первоначальный объем и тургор вследствие осмотической

корректировки, но, несмотря на это, рост клеток растяжением тормозится (Cramer, 2002; Fricke, Peters, 2002; Passioura, Munns, 2000; Yeo et al., 1991). При этом, замедляется появление новых листьев, уменьшаются размеры растений. В частности, уменьшается площадь поверхности листьев, происходит их утолщение, подавляется развитие боковых побегов и наблюдаются нарушения в репродуктивной системе, выражающиеся в более раннем цветении растений и уменьшении количества цветков.

Вероятнее всего, ингибирование роста растений регулируется гормональными сигналами. Об этом свидетельствуют данные, показывающие, что снижение скорости роста листьев не зависит от углеродного питания (Munns et al., 2000) и водного статуса растения (Fricke, Peters, 2002; Munns et al., 2000). Уменьшение скорости роста происходит в отсутствие дефицита питательных элементов (Ни et al., 2007) и ионной токсичности, о чем свидетельствует низкие концентрации Na+ и СГ в растущих клетках и тканях (Fricke et al., 2006., Hu et al., 2005., Neves-Piestun, Bernstein, 2005). АБК также не может быть причиной ингибирования роста растений при засолении, так как ее концентрация, увеличиваясь в первые часы после действия стресса, уже через 24 часа возвращается к исходному уровню, в то время как скорость роста листьев по-прежнему остается сниженной (Fricke et al., 2004