Механизмы и регуляция транспорта ионов через вакуолярную и перибактероидную мембраны растительных клеток

Андреев, Игорь Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы и регуляция транспорта ионов через вакуолярную и перибактероидную мембраны растительных клеток
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Механизмы и регуляция транспорта ионов через вакуолярную и перибактероидную мембраны растительных клеток"

На правах рукописи

АНДРЕЕВ Игорь Михайлович

МЕХАНИЗМЫ И РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСПОРТА ИОНОВ ЧЕРЕЗ ВАКУОЛЯРНУЮ И11ЕРИБАКТЕРОИДНУЮ МЕМБРАНЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

(03.00.12 - физиология и биохимия растений)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бухов Николай Георгиевич

доктор биологических наук Медведев Сергей Семенович

доктор биологических наук Бабаков Алексей Владимирович

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, г. Москва.

Защита состоится 24 октября 2006 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К. Л. Тимирязева РЛН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 977 8018, электронная почта: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан Ф сентября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук

Актуальность проблемы. Одна из фундаментальных проблем современной биологии состоит в выяснении механизмов, ответственных за поддержание ионного гомеостаза животных и растительных клеток. Действие этих механизмов во многом зависит от активности ион-транслоцирующих систем, локализованных в клеточных мембранах, в том числе в эндомембранах, ограничивающих некоторые внутриклеточные органеллы.

В растительных клетках в гомеостатической регуляции ионного состава их цитозоля очень важную роль играет вакуоль - уникальная мультифункциональная органеяла, активность которой тесно интегрирована с активностями остальной части клетки (Matile, 1978; Wink, 1993; Marty, 1999; Андреев, 2001).

К настоящему времени установлено, что вакуолеподобный компартмент часто образуется и в ходе взаимодействия микроорганизмов с эукариотами, например, при заражении ряда животных клеток патогенами, что приводит к установлению симбиотических взаимоотношений между ними (Sinai and Joiner, 1997; Meresse et al., 1999; Pamiske, 2000; Verhaert, 2005). Этот внутриклеточный компартмент является для микросимбионта местом его обитания, роста и размножения (Sinai, Jonier, 1997; Pamiske, 2000). Согласно данным, имеющимся в настоящее время в литературе, в растениях примером вакуолеподобного компартмента рассматриваемого типа могут быть присутствующие в клетках корпевых клубеньков бобовых симбиосомы, которые содержат бактероиды и ответственны за сим-биотическую фиксацию атмосферного азота (Mellor, 1989; Mylona et al., 1995; Измайлов, 1996; Verhaert et al., 2005). Вместе с тем роль симбиосом в клетках, инфицированных почвенными бактериями — ризобиями, вероятно не ограничивается только этой функцией и, скорее всего, включает в себя и другие, свойственные вакуолям обычных растительных клеток. До недавнего времени данные в пользу этой гипотезы были представлены лишь сообщениями о литическом характере перибактероидного пространства (ПБП) симбиосом (Mellor, 1989; Verhaert et al., 2005) и она не имела каких-либо убедительных экспериментальных подтверждений, в том числе основанных на характеристиках обмена ионами между макро- и микросимбионтом.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выяснении механизмов транслокации основных физиологически важных ионов (Н+, К+, Са2+) через тонопласт и ПБМ

растительных клеток, а также способов эндогенной регуляции этих процессов. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ барьерных свойств исследуемых мембран для основных физиологически важных ионов (Н+, К+, Са21"), то есть оценить их способность удерживать трансмембранные ионные градиенты.

2. Провести функциональную идентификацию основных генераторов трансмембранного протошгого градиента (Д|1н+) в тонопласте и ПБМ растительных клеток и установить их природу.

3. Выяснить механизмы активного транспорта Саг+ через вакуолярную и симбиосомаль-пую мембраны, а также факторы, контролирующие активность соответствующих Са2*-транспортирующих систем.

4. Провести экспериментальную проверку гипотезы о том, что симбиосомы в инфицированных клетках клубеньков бобовых ведут себя как внутриклеточные Са-запасаю-щие компартменты.

5. Исходя из известного участия вакуоли в осморегуляции растительных клеток, выяснить, чувствительна ли активность ион-транспортирующих систем тонопласта к осмотическому сжатию этой мембраны.

6. Исследовать механизм транспорта через ПБМ ионов К+ как одного из основных осмотически-активных компонентов симбиосом.

7. Исследовать возможную роль АТФ и других адениновых нуклеотидов в аллостериче-ской регуляции транспорта ионов через тонопласт.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Симбиосомальная мембрана растительных клеток, также как и вакуолярная, снабжена только одним АТФ-зависимым протонным насосом, активность которого как генератора Дин+ ответственна за энергообеспечение процессов транслокации через эту мембрану ряда ионов и метаболитов.

2. Подобно вакуолям, симбиосомы в инфицированных растительных клетках ведут себя как Са-запасающие компартменты, что во многом обусловлено функционированием на ограничивающих их мембранах системы активного транспорта Са2+, стимулируемого кальмодулином.

3. На тонопласте вакуолей высших растений функционируют анионные транспортеры, активность которых может модулироваться осмотическим сжатием этой мембраны, а также адевиновыми нуклеотидами.

4. Вакуоли и симбиосомы во многом сходны между собой в отношении направленности и характера переноса через ограничивающие их мембраны основных физиологически важных ионов

5. Поведение кальция в симбиосомах, активности ионных транспортеров в ПБМ, а также известный литический характер ПБП согласуются с потенциальной способностью этих клеточных структур выполнять в инфицированных клетках корневых клубеньков функции вакуоли.

Научная новизна работы. Выполненные исследования - это одна из первых работ, где на тонопласте высших растений выявлено и охарактеризовано несколько ион-транспор-тирующих систем, представленных как генераторами (М$2+-зависимые АТФаза и неорганическая пирофосфатаза), так и потребителями (анионные транспортеры и Са2+/пН+ антипортер) энергии трансмембранного протонного градиента (Дцн+).

Обнаружено сильное стимулирующее действие кальмодулина - известного Са2+-связыва-ющего белка на активность Са^/пН^антипортера.

Впервые установлено, что ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых содержит только одну

Н'-АТФазу Р -типа, блокируемую ванадатом и ионами Са + и ответственную за энергизацию этой мембраны.

Обнаружено, что симбиосомы в инфицированных клетках клубеньков ведут себя как Са-запасающие компартменты, которые снабжены М§2+-зависимой Са2*-АТФазой, локализованной в ПБМ и катализирующей трансмембранный перенос ионов Са2+ из цитозоля внутрь симбиосом.

Показано, что на ПБМ функционируют также

Са2+- и К -транспортеры, которые катализируют выход Са2+ и К+ из симбиосом, активируются при деполяризации ПБМ и блокируются верапамилом и тетраэтиламмонием, соответственно.

Установлено, что активность анионного транспортера, выявленного в тонопласте корнеплода сахарной свеклы, чувствительна к осмотическому сжатию этой мембраны, тогда как анион-транспортирующая система, функционирующая в тонопласте листовых клеток мезофилла гороха, аллостерически активируется АТФ, а также другими адениновыми нуклеотидами.

Научная и практическая ценность. Полученные данные существенно расширяют наши знания о характере транспорта ионов через тонопласт и ПБМ растительных клеток. Ре-

зультаты работы, особенно те, что касаются влияния кальмодулина на сродство Ca2VnH+ антипортера на тонопласте к ионам Са2+, а также чувствительности анион-транспорти-рующих систем в этой мембране к ее осмотическому сжатию и аллостерическому действию АТФ, имеют приоритетный характер и вносят значительный вклад в решение проблемы регуляции ионного транспорта через тонопласт в условиях его нативного окружения in situ. Обнаружение того, что симбиосомы в инфицированных клетках корневых клубень-коз бобовых ведут себя как Са-запасающие компартменты и содержат на ПБМ Са2+-транслоцирующую АТФазу, может быть важным в плане выяснения факторов,, определяющих эффективность симбиоза у бобовых и тем самым активность симбиотической азотфиксирующей системы.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Из результатов исследований, проведенных в соавторстве с коллегами, в диссертационную работу включены и вынесены на защиту только те, в получении которых автору принадлежит определяющая роль. Значительная часть работы проведена в тесной кооперации с сотрудниками лаборатории азотного обмена ИФР. В экспериментах, связанных с изучением механизмов ионного транспорта через вакуодярную мембрану растений, участвовали В. Д. Кореньков и М. С. Орлова. В. В. Крылова и П. Н. Дуброво принимали участие в выделении симбиосом и везикул ПБМ и проведении на них соответствующих исследований. И. Н. Андреева и Г. М. Кожаринова проводили электронно-микроскопические исследования симбиосом in vivo и in vitro. Автор выражает всем участникам настоящей работы глубокую благодарность за сотрудничество.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на международных и всесоюзных симпозиумах, семинарах и съездах: Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям биологических мембран (Иркутск, 1983), III Международном симпозиуме по регуляции метаболизма у растений (Варна, 1983), Сабининских семинарах "Ионный обмен н физиология корня" (Москва, 1986, 1988), III Международном симпозиуме "Структура и функции корней" (Нитра, 1987), семинаре "Физиология мембран, проблемы и перспективы" (Чернигов, 1989), VII Конгрессе Европейской Федерации Обществ физиологов растений (Умео, 1990), Международном симпозиуме по ростовым веществам у растений (Амстердам, 1991), Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999) и Международных симпозиумах "Plant under Environmental Stress" (Москва, 2001) и "Plant-Microbe Interaction" (Санкт-Петербург, 2003), V съезде физиологов растений России (Пенза, 2003).

Структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы. Работа изложена на 171 страницах и содержит 34 рисунка. Список цитированной литературы включает в себя 225 наименований. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, список которых приведен в конце автореферата.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение вакуолей и получение из них везикул тонопласта.

Вакуоли из корнеплодов кормовой и сахарной свеклы выделяли путем механической резки растительной ткани, используя методику, первоначально описанную Leigh и Bran-ton (1976) и в дальнейшем модифицированную Саляевьтм и сотр. (1981). Везикулы тонопласта из вакуолей сахарной свеклы получали путем осмотического лизиса очищенных ор-ганелл в гипотонической среде с последующим ультрацентрифугированием лизата (Андреев и др., 1990; Андреев, 1992).

Выделение вакуолей из тканей мезофилла листьев гороха, их очистку, а также получение из них везикул тонопласта проводили после предварительного выделения из этих растительных тканей протопластов. Последние для получения из них вакуолей были подвергнуты ультрацентрифугированию на подложке фиколла (Андреев и др., 1985, 1987).

Чистоту препаратов вакуолей и вакуолярных мембран оценивали на основе измерения активностей соответствующих маркерных ферментов примесных мембран, а также чувствительности ЛТФ-гидролазной и АТФ-зависимой Н^транслоцирующей активностей выделенных органелл и мембран к известным ингибиторам мембранных АТФаз.

Выделение симбиосом и получение из них везикул ПБМ.

Симбиосомы выделяли из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого, выращенных после инокуляции семян растений эффективными штаммами Rhizobium leg-uminosarum bv viciae 501 и Rhizobium lupini 359®, соответственно. Методика выделения симбиосом включала в себя их очистку в ступенчатом градиенте плотности перколла (Дуброво и др., 1992; Ал dreev et al., 1997; Андреев и др., 2001). Везикулы ПБМ получали путем гипотонического лизиса симбиосом и последующего центрифугирования лизата в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Чистоту препаратов симбиосом оценивали на основании прямой визуализации их с помощью электронной микроскопии, а также чувст-

вительности МяАТФ-зависимых электрогенной и протонтранслоцируюшей активностей изолированных клеточных структур к ряду известных ингибиторов мембранных АТФаз.

Низкоскоростное цетрифугирование лизата симбиосом в той же гипотонической среде было использовано для получения фракции бактероидов (Дуброво и др., 1992; Andreev et al., 1998).

Определение АТФ-гидролазной активности препаратов вакуолярных и еимбиосома-льных мембран

Об АТФ-гидролазной активности препаратов вакуолярных и симбиосомальных мембран судили по увеличению неорганического фосфата в реакционной среде, содержание ко-трого определяли методом Rathbun и Betlach (1969) или Ames (1966), соответственно (Андреев и др., 1987; Дуброво и др., 1992). Концентрацию белка в препаратах определяли по методу Bradford (1976).

Регистрация мембранного потенциала на мембране выделенных вакуолей, симбиосом и полученных m них везикул тонопласта и ПБМ.

За генерацией мембранного потенциала (трансмембранной разности электрических потенциалов, Ai(/) на мембране выделенных вакуолей, симбиосом и везикул тонопласта и ПБМ следили с помощью потенциал-чувствительных индикаторов Ду - оксонола VI и diS-Сэ-(5), часто используемых для регистрации мембранных потенциалов положительной (Apell, Bersch, 1987) и отрицательной (Waggoner, 1974) полярностей, соответственно. При использовании оксонола VI следили за изменением разности оптических поглощений этого индикатора при 590 и 610 нм на спектрофотометре Hitachi-557 в двухволновом режиме работы прибора. Флуоресценцию diS-C3-(5) измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi-850. Измерения проводили при комнатной температуре в стандартных 1 см кюветах без перемешивания суспензий исследуемых препаратов мембран или орга-нелл в ходе экспериментов.

Регистрация трансмембранного градиента pH на мембране выделенных органелл и полученных из них везикул (тонопласте н ПБМ)

За сдвигом pH внутри выделенных вакуолей и симбиосом или везикул исследуемых мембран следили по изменению разности поглощений при 492 и 540 нм проникающего через мембраны АрН-индикатора акридинового оранжевого (Palmgren, 1991). Спектрофо-тометрические измерения проводили на том же названном выше спектрофотометре в

даухволновом режиме работы прибора и в тех же экспериментальных условиях, что использованы для экспериментов с оксонолом VI.

Цитохимическая визуализация кальция в симбиосомах in vivo и in vitro и выявление в них Са-дспо

О локализации кальция в симбиосомах инфицированных клеток клубеньков бобовых судили по наличию электронно-плотных гранул — продукта его цитохимической реакции с пироантимонатом калия (Wick, Hepler, 1982; Андреева и др., 1995), легко наблюдаемых с помощью электронной микроскопии. Ультратонкие срезы образцов получали на ультрамикротоме OmU3 ("Reichert", Австрия), контрастировали на сеточках цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM 1000 СХ ("Jeol", Япония). Ту же методику использовали для выявления кальция в препаратах изолированных симбиосом.

О присутствии Са-депо в исследуемых клеточных структурах судили также по аккумуляции в них проникающего через мембраны флуоресцентного Са2+-индапсатора хлортетра-циклияа (Dixon et al., 1984; Andreev et al., 1999). Его флуоресценцию регистрировали при 530 нм на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi-850, возбуждая ее светом при 380 нм.

Регистрация поглощения кальция симбиосомами и везикулами ПБМ, изолированными из корневых клубеньков бобовых.

За поглощением Са2+ изолированными симбиосомами и везикулами ПБМ следили по изменению разности поглощений при 720 и 650 нм (А720 - Aeso) непроникающего через мембраны металлохромного Са2+-индикатора арсепазо III (Scarpa, 1979), добавляемого к реакционной смеси. Измерения проводили при комнатной температуре на указанном выше спектрофотометре, действующем в двухволновом режиме. За активным транспортом Са2+ через ПБМ следили также по изменению флуоресценции при 530 нм хлортетрацик-лина - проникающего через мембраны Са2+ -индикатора (Dixon et al., 1984; Андреев и др., 2001), возбуждая ее светом при 380 нм.

Регистрация осмотически-ивдуцированных изменений объема симбиосом.

За осмотическим изменением объема симбиосом, обусловленным выходом из них ионов 1С в бескалиевую среду, следили по изменению мутности суспензии этих клеточных структур, регистрируемой как изменение ее оптической плотности при 550 нм на ука-

занном выше спектрофотометре в двухлучевом режиме работы прибора (Андреев и др. 2004). Согласно полученным данным наблюдаемые изменения мутности суспензии сим-биосом реально отражали изменения интенсивности их светорассеяния, поскольку в выбранной спектральной области не обнаруживалось каких-либо специфических полос поглощения исследуемых клеточных структур.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИI1X ОБСУЖДЕНИЕ

I. Функциональная идентификация, характеристика и выяснение некоторых факторов контроля активности ион-транспортирующих систем в вакуолярной мембране растений

1.1 Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей для ряда основных физиологически важных ионов и функциональная идентификация в этой мембране АТФ- и пирофосфатзавнсимого протонных насосов-

Хорошо известно, что ионная проницаемость биологических мембран является важным фактором, определяющим их способность генерировать тем или иным путем транс-мембранпые электрохимические ионные градиенты, используемые для энергообеспечения трансмембранной транслокации других ионов и метаболитов. Поэтому первая задача настоящей работы состояла в изучении барьерных свойств тонопласта изолированных вакуолей для ряда физиологически важных ионов. В исследованиях, проведенных нами в этом направлении, были использованы вакуоли, выделенные из запасающей ткани корнеплодов кормовой свеклы модифицированным Саляевым и сотр. (Саляев и др., 1981) методом Ли и Брэнтона (Leigh, Branton, 1976), а также везикулы тонопласта, приготовленные из тканей мезофилла листьев гороха после предварительного получения из них протопластов, а затем вакуолей (Андреев и др., 19S5). Указанные растительные ткани были выбраны для выделения из них вакуолей не только по причине успешной применимости к ним использованных нами методических приемов, но и с целью сравнения исследуемых свойств вакуолярной мембраны из гетеротрофных и фотосинтезирующих растительных клеток. Судя по активностям маркерных ферментов различных клеточных мембран, чувствительности их АТФазной активности к известным ингибиторам мембранных АТФаз и некоторым другим характеристикам, полученные нами препараты вакуолей и вакуолярных мембран были практически свободны от примесей других клеточных мембран. Как будет показано ниже, они обнаруживали активность, присущую ряду белков тонопласта. При этом большая часть везикул этой мембраны сохраняла ориентацию исходной мембраны интактных вакуолей.

Прежде всего мы попытались оценить проницаемость вакуолярной мембраны из выбранных растительных объектов для ионов К*, которыми, как хорошо известно, обогащены как цитозсшь, так и вакуоль растительных клеток.

Первые эксперименты такого рода были проведены нами на вакуолях, выделенных из корнеплодов кормовой свеклы и помещенных в изотоническую буферную среду, содержащую проникающий через мембраны ДрН-индикатор акридиновый оранжевый, но лишенную ионов К+. Мы следили здесь за кинетикой образования и удерживания трансмембранного рН-градиента, генерируемого на тонопласте добавлением к вакуолям ниге-рицина, известного {СТН^-обменника, или К+-ионофора валиномицина и протопофора карбонилцианид-и-трифторметоксифенилгидразона (БССР) - двух соединений, способных в комбинации имитировать действие нигерицина. Из данных, представленных на рис. 1, следует, что нигерицин вызывает значительное уменьшение рН внутренней водной фазы вакуолей и этот эффект имитируется при совместном добавлении к вакуолям валиномицина и РССР и обращается внесением в среду высоких концентраций КС1 или Ш4С1.

Эти результаты говорят о низкой проницаемости мембраны выделенных вакуолей для ионов ¥5* и К*. Такой вывод подтверждается и демонстрацией образования на тонопласте мембранного потенциала ("минус" внутри органелл), генерируемого добавлением к вакуолям валиномицина или KSCN и регистрируемого по изменению флуоресценции цианинового красителя Л5-Сг-(5) (Рис. 2). Поляризация тонопласта, обусловленная здесь выходом ионов К* из вакуолей или, напротив, поступлением внутрь органелл проникающих анионов 5СМ", в свою очередь указывает на относительно низкую проницаемость вакуолярной мембраны и для компенсирующих заряд противоионов, представленных внутривакуолярными анионами, такими как СГ. В противном случае происходил бы электрофоретический выход их из вакуолей, сопровождаемый исчезновением мембранного потенциала. Согласно нашим наблюдениям во многом аналогичные барьерные свойства тонопласта по отношению к рассмотренным выше ионам свойственны и вакуолям, выделенным тем же упомяпутым выше методом механической резки ткани из корнеплодов сахарной свеклы.

Результаты подобных экспериментов, проведенных на везикулах тонопласта, изолированных из фотосинтезирующих растительных клеток мезофилла листьев гороха, показали, что проницаемость его для ионов К1" гораздо выше калийной проницаемости тонопласта из клеток запасающей ткани корнеплода кормовой свеклы. В этом случае добавление только одного протонофора РССР к везикулам тонопласта, нагруженным сульфа-

том калия и помещенным в бескалиевую буферную среду, немедленно инициировало снижение рН их внутренней водной фазы (Рис. 3).

/ ЫКцСЪ

Рис. 1 Снижение рН внутренней водной фазы изолированных вакуолей кормовой свеклы под влиянием нигерицина и имитация его действия совместным добавлением к вакуолям РССР и валиномицина (Андреев и др., 1985, Биологические мембраны, т. 2,996-1002).

Этот феномен проще всего объясняется электрофоретическим движением протонов внутрь везикул, которое облегчается в присутствии протонофора и происходит в результате образования на везикулярной мембране диффузионного потенциала ионов К+ за счет их пассивного выхода из везикул по трансмембранному электрохимическому градиенту в наружную среду. Вместе с тем данные, представленные на рис. 3, указывают также на относительно низкую протонную проводимость тонопласта, то есть способность данной мембраны удерживать трансмембранный градиент рН.

Наблюдаемое поведение вакуолярной мембраны как малопроницаемого барьера для ионов Н+ проявлялось и в ее способности генерировать трансмембранный рН градиент в присутствии в инкубационной среде ионов М^2* и АТФ или пирофосфата благодаря функционированию в этой мембране двух \^2+-зависимых протонных насосов, Н+-АТФазы и Н^-пирофосфатазы. Их функциональная активность, регистрируемая по снижению рН внугривакуолярной среды в присутствии АТФ или пирофосфата и ионов М§2+ в реакционной смеси, наблюдалось нами в вакуолях, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы, но лишь в везикулах тонопласта из мезофилла листьев гороха (Рис. 3 и 4).

Вакуоли, изолированные из последнего растительного объекта, как выяснилось, были не способны в тех же экспериментальных условиях к Л^АТФ-зависимому снижению рН их внутренней водной фазы, что вероятнее всего объясняется как высокой буферной емкостью, так и исходно низкой величиной рН внутривакуолярной среды. Существенно отметить здесь, что подобные результаты были получены и другими авторами в экспе-

Рис. 2 Формирование на тонопласте вакуолей из корнеплодов кормовой свеклы К+- и ЗОИ" -диффузионных потенциалов в присутствии валиномицина и тиоцианата калия, соответственно (Андреев и др., 1.985, Биологические мембраны, т. 2,996-1002).

2 мин

А Л„,.,„-'•« .-►

Рис. 3 Закисление среды внутри везикул тонопласта из мезофилла листьев гороха, обусловленное функционированием вакуолярной Н+-АТФазы (1, 2) или действием протоно-фора КЦФФГ (3). В случаях 1 и 3 везикулы тонопласта были нагружены 50 мМ Кг504 и помещены в бескалиевую буферную среду. (Андреев и др., 1987, Физиология растений, т. 34, 1045-1056).

Рис. 4 Снижение рН внутренней водной фазы везикул тонопласта из мезофилла листьев гороха, обусловленное действием вакуолярной пирофосфатазы, и диссипация трансмембранного градиента рН в присутствии ионов Са2+ (Андреев и др., ¡989, Биологические мембраны, т. 6,153-158).

риментах того же типа, проведенных на целых вакуолях, выделенных из фотосинтези-рующих тканей других растительных объектов. Вместе с тем успешное выявление транспортных активностей Mg2+-3aBHCHMux Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы в везикулах тонопласта, полученных из тех же изолированных вакуолей (рис. 3 и 4), находится в соответствии с данной выше интерпретацией неспособности целых органелл рассматриваемого типа к MgATO-saBHciiMOMy закислению их внутренней водной фазы.

В случае вакуолей из клеток мезофилла листьев гороха (Pisum sativum L.) было найдено, что характеристики, свойственные вакуолярной Н+-АТФазе (Н+-АТФазе V-типа), отражаются в соответствующем поведении кинетики \^АТФ-зависимого закисления везикул тонопласта. Этот процесс стимулировался проникающими анионами, такими как Cl", Вг" и NO3" (самая начальная фаза ответной реакции), ингибировался анионами NO3', дициклогексилкарбодиимидом, кверцетином, мерсалилом, но был не чувствителен к ва-надату, азиду, а также анионам SO4', НРО4' и НСОз", плохо проникающим через тоноп-ласт (Рис. 5).

Кроме того, рН-оптимум К^АТФ-зависимого снижения рН внутривезикулярной водной фазы обнаруживался в области щелочных значений рН (8,0) и соответствовал рН-оп-тимуму АТФ-гидролазной активности тех же препаратов тонопласта, измеренной в тех же условиях, но в присутствии грамицидина D. Использование последнего соединения в

рассматриваемых экспериментах обеспечивало снятие на везикулярной мембране химической и электрической составляющих трансмембранного протонного градиента и, тем самым, протонного контроля вакуолярной Н+-АТФазы, как фактора, способного лимитировать активность этого фермента.

Согласно полученным данным стимуляция анионами протонтраяслоцирующей активности топопластных везикул обусловлена как снятием на тонопласте мембранного потенциала, генерируемого в ходе гидролиза АТФ, так и прямым активирующим влиянием их на вакуолярную Н^АТФазу. На действие первого механизма стимуляции анионами кинетики процесса указывает наличие линейного компонента зависимости начальной скорости М§АТФ-индуцируемого снижения внутривезикулярного рН от концентрации анионов СГ в реакционной смеси (данные не приведены).

Этот компонент вероятнее всего отражает функционирование в вакуолярной мембране анионпроводящего пути или канала и свидетельствует об электрогенном характере трансмембранного переноса протонов вакуолярной Н+-АТФазой. Электрогенность данного процесса скорее всего выявляется здесь в его стимуляции в везикулах тонопласта, нагруженных 50 мМ сульфатом калия (Рис. 3), ибо пассивный выход из них ионов К4" в бескалиевую среду способен обеспечивать диссипацию мембранного потенциала, генерируемого ЬГ^-АТФазой. С другой стороны, прямое стимулирующее действие анионов на активность этого фермента выражается в наличии также насыщаемого компонента вышеупомянутой зависимости и, кроме того, в активации анионами С1" скорости гидролиза АТФ в присутствии грамицидина О (данные не приведены). Из полученных результатов также следует, что концентрационная зависимость анионной стимуляции АТФ-гидролаз-ной активности тонопластных везикул практически совпадает с соответствующей концентрационной зависимостью, характеризуемой насыщением, отражающей стимуляцию анионами начальной скорости транслокации протонов через тонопласт вакуолярной Н+-АТФазой.

Рис. 5 Действие анионов на кинетику М^АТФ-зависимого снижения рН внутренней водной фазы везикул тонопласта из мезофилла листьев гороха (Андреев и др., 1987, Физиология растений, т. 34, 1045-1056).

1. 2 Са2+/пН+-антипортер на тонопласте и стимуляция его активности кальмодули-ном

Давно предполагалось, что вакуоль как самый большой внутриклеточный компарт-мент растительной клетки участвует в ее ионном гомеостазе, в том числе в регуляции уровня свободного Cai+ в цитозоле, достигающего в большинстве клеток субмикромо-лярных концентраций. Исследования, исходно проведенные на клеточном уровне, показали, что включение вакуоли во внутриклеточный Са-гомеостаз во многом базируется на ее способности накапливать ионы Са2+ до тотальных концентраций 1-10 мМ и удерживать на тонопласте очень большой по величине градиент концентрации свободного Са2+ (Bush, 1995). Это указывало на существование в тонопласте системы активпого. транспорта Са2+ в вакуоль и стимулировало поиск в вакуолярной мембране соответствующей Са2+-транслоказы. В настоящей работе исследования такого рода были проведены на вакуолях и везикулах тонопласта, выделенных указанными выше методами из корнеплодов сахарной свеклы и мезофилла листьев гороха.

Из данных, представленных на рис. 6 А, следует, что добавление ионов Са2+ к вакуолям сахарной свеклы после генерации на мембране органелл трансмембранного рН градиента (ДрН) в присутствии АТФ и ионов Mg2+ и Cl" вызывает выраженную диссипацию

ДрН, причем ее начальная скорость в существенной степени зависит от концентрации добавленного катиона и достигает максимальных значений при [Са2+], превышающих 50 мкМ. Полученная зависимость скорости процесса от концентрации свободного Са1+ в среде удовлетворительно описывается кинетикой Михаэлиса-Ментен с кажущейся Км = 10 мкМ (Рис. 6 В).

АТР

а <

•5 3

= 1СГ/.М

50 100 гоо 500 ■

tlr.lH i.-i w

-~н ¡Со J, *м

Рис. 6 А: Кинетика формирования трансмембранного градиента рН на тоноплаете изолированных вакуолей из корнеплодов сахарной свеклы вакуолярной Н+-АТФазой и обращения этого процесса в присутствии ионов Са2+ и грамицидина D. В: Зависимость начальной скорости Са-зависимой диссипации ДрН от концентрации кальция в среде. (Ап-dreev et al., J. Plant Physiol., 1990, vol. 136, 3-7).

Са2+-зависимая диссипация ДрН наблюдалась в тех же условиях также в везикулах тонопласта, приготовленных из выделенных вакуолей, и полностью подавлялась в присутствии катионов La3+ (Рис. 7). Последний эффект свидетельствует о том, что сдвиг рН внутри вакуолей и везикул тонопласта, наблюдаемый в присутствии ионов Са2+, вызван транспортом данного катиона через вакуолярную мембрану.

Мы обнаружили, что при ненасыщающих концентрациях экзогенного кальция в инкубационной смеси добавление кальмодулина к везикулам тонопласта приводит к существенному ускорению Са2+-зависимой диссипации трапсмембранного рН градиента, генерированного в присутствии АТФ и ионов Mg2+ (Рис. 7). Такой эффект кальмодулина наблюдался нами и при отсутствии экзогенного кальция в среде, когда его эндогенная концентрация составляла 12 мкМ, причем добавление к везикулам насыщающих концентраций этого катиона (100 мкМ) уже не вызывало увеличения скорости Са-зависимой диссипации ДрН (Рис. 7). Рис. 7 также показывает, что эффект кальмодулина блокируется в присутствии катионов Ьа3т или хелатора Са2+ (ЭГТА), то есть тех же агентов, что подавляют Са-зависимую диссипацию ДрН на тоноплаете в отсутствие кальмодулина.

Важно отметить, что подобное действие этого биорегулятора наблюдалось нами и в экспериментах, проведенных на целых вакуолях, когда рН градиент на тонопласте был создан просто помещением выделенных органелл в слабощелочную инкубационную среду. Этот результат показывает, что наблюдаемый эффект кальмодулина не опосредован активностью мембрансвязанных протеинкиназ и, скорее всего, сводится к непосредственному взаимодействию данного белка с Са3+/пН+ антипортером. Тот факт, что значительный эффект кальмодулина наблюдается даже при отсутствии экзогенного кальция в

Рис. 7 Стимуляция кальмодулином Са-зависимой диссипации трансмембранного градиента рН в везикулах тонопласта корнеплода сахарной свеклы, генерированного вакуо-лярной Н+-АТФазой, и подавление этого эффекта катионами La3+ и хелатором Са2+ ЭГТА (Andreev et al., J. Plant Physiol., 1990, vol. 136,3-7).

среде дает основание полагать, что он обусловлен существенным снижением кажущейся Км антипортера для ионов Са2+. Это предположение нашло прямое подтверждение в серии экспериментов, в которых начальная скорость Са-зависимой диссипации АрП в MgATO-3iieprn30BaHHbix везикулах тонопласта в присутствии кальмодулина была измерена при разных концентрациях свободного кальция в инкубационной смеси (lO^-lO"4 М), создаваемых с помощью Са^-ЭГТА-буфера. Было найдено, что изменение кинетики исследуемого процесса в присутствии кальмодулина в основном обусловлено 1000-кратным снижением кажущейся Км антипортера для Са2*, которая сдвигается от Ю'! М в область 10"7-10"8 М (Рис. 8). Такое изменение Км свидетельствует о том, что при субми-кромолярных концентрациях свободного кальция Ca2+/nlT аптипортер должен катализировать Са2+/пН+ обмен через тонопласт так же эффективно, как и при насыщающих концентрациях переносимого катиона. Важная особенность действия кальмодулина в данном случае заключается в том, что оно проявляется даже при крайне низких концентрациях кальция в среде (< 10"6 М) , которые явно не достаточны для образования

функционально-активного комплекса Са2+-кальмодулин (Ко « 1 мкМ). В этой связи мы предполагаем, что наблюдаемая модификация кинетических свойств Са2+/пН+ антипортера в присутствии кальмодулина является результатом его прямого взаимодействия со специфическим доменом рассматриваемого переносчика. В пользу такого механизма действия кальмодулина свидетельствуют имеющиеся в литературе данные, демонстрирующие Са-независимое влияние этого белка на активность ряда ферментов как в животных, так и в растительных клетках (Niggli et al. 1981; Ambudkar et al., 1989; Rhoads, Friedberg, 1997; Jurado et al., 1999; Reddy, 2001; Chin, Means, 2000).

Рис. 8 Зависимость начальной скорости Са2+-зависимой диссипации ДрН, генерированного Н+-АТФазой в везикулах тонопласта из клеток корнеплода сахарной свеклы, от концентрации свободного Са2+ в среде в отсутствие (1) и в присутствии (2) кальмодулина. Теоретические кривые 1 и 2, проведенные через экспериментальные точки, рассчитаны исходя из оценок К„, полученных путем линеаризации наблюдаемых зависимостей, представленной на вставке рисунка. (Andreev et al., J. Plant Physiol., 1990, vol. 136, 3-7).

Качественно подобные результаты, касающиеся стимулирующего действия кальмодулина на активность Са2+/пН* антипортера, были получены нами и в экспериментах того же типа, выполненных на везикулах тонопласта из мезофилла листьев гороха. Было найдено, что наблюдаемый в присутствии кальмодулина Са-зависимый сдвиг рН внутри-везикулярной водной фазы предотвращается верапамилом, известным блокатором Са2+-каналов клеточных мембран, также подавляющим Са27пН+ антипорт в исследуемых мембранах и в отсутствие кальмодулина. Хотя в рассматриваемой серии экспериментов мы не проводили детального исследования влияния кальмодулина на кинетику Са-зависи-мой диссипации ДрН на тонопласте, полученные результаты вполне объяснимы также на основе существенного снижения кажущейся К„ антипортера для Са2+. Это обстоятельство может указывать на определенную общность механизмов, посредством которых осуществляется регуляция кальмодулином кинетических свойств Са2+/п1-Г антипортера на тонопласте растительных клеток.

1. 3 Функциональная идентификация в тонопласте анион-транспортируницей системы как сенсора, определяющего чувствительность MgATФ-зaвиcимoй генерации трансмембранного градиента рН к осмотическому сжатию вакуолярной мембраны.

К настоящему времени установлено, что способность вакуоли включаться в осмо-регуляторные ответные реакции растительной клетки во многом обусловлена соответствующей модуляцией активности ион-транспортирующих систем тонопласта в условиях осмотического стресса. Однако, несмотря на интенсивно ведущиеся исследования в этом направлении, механизмы, лежащие в основе такой модуляции до сих пор остаются неясными.

В настоящей работе мы попытались внести вклад в решение этой проблемы, исследуя действие осмолярности инкубационной среды на кинетику МдАТФ-зависимой генерации трансмембранного протонного градиента на тонопласте изолированных вакуолей, а также полученных из них везикул тонопласта. Проведение описанных здесь экспериментов было стимулировано обнаружением того обстоятельства, что в препаратах вакуолей и везикул тонопласта, изолированных из тканей корнеплода сахарной свеклы, процесс АТФ-зависимой аккумуляции ионов II* чувствителен к тоничности среды инкубации и в заметной степени подавляется в гипертонической среде (Андреев и др., 1990). Такое действие ее на кинетику понижения рН водной фазы внутри вакуолей и везикул тонопласта показано на рис. 9.

Обращает на себя внимание гораздо более сильный эффект, наблюдаемый в препаратах изолированных вакуолей. С целью идентификации компонента вакуолярной мембраны, чувствительного к изменению физического состояния тонопласта в результате увеличения осмолярности инкубационной среды, наши дальнейшие эксперименты были проведены на везикулах тонопласта, позволяющих в отличие от вакуолей изменять в ходе их выделения состав их внутренней водной фазы. Хлорид-анионы существенно стимулировали \^АТФ-зависимую НГ'-транслоцирующую активность везикул, причем в везикулах, помещенных в гипертоническую среду, кинетика этого процесса заметно замедлялась (Рис. 10). Последний эффект может быть обусловлен подавлением каталитической активности вакуолярной Н^АТФазы или уменьшением анионной проводимости везикулярной мембраны, способным приводить к снижению величины химической составляющей (ДрН) трансмембранного протонного градиента (Дцн+). генерируемого Н+-АТФазой, в результате увеличения его электрической составляющей (Д\;). Иначе говоря,

в случае реализации второй возможности следует ожидать соответствующей осмотической модуляции М§АТФ-зависимой электрогенной активности везикул. В эксперимен-

Рис. 9 Влияние осмотического потенциала инкубационной среды на кинетику АТФ-зави-симого трансмембранного переноса протонов в везикулах тонопласта (А) и вакуолях (Б), изолированных из корнеплодов сахарной свеклы. Инкубационная среда содержала 100 (1), 50 (2), 300 (3), 500 (4), 800 (5), 900 (6) и 1400 (7) мМ сорбита. (Андреев и др., Физиология растений, 1990, т. 37,432-440).

тах, проведенных на препаратах везикул тонопласта, мембрана которых была предварительно деполяризована в присутствии валиномицина и эквимолярных концентраций ионов К+ внутри и снаружи везикул, было найдено, что в этих условиях рассматриваемый процесс существенно ускоряется, но при инкубации везикул в гипертонической среде кинетика его начальной стадии остается практически неизменной (рис. 10). Это означает, что, хотя скорость генерации ДрН на тонопласте сильно возрастает в результате его деполяризации и тем самым конверсии Ац/ в ДрН, активность протонного насоса на тонопласте не претерпевает каких-либо существенных изменений с увеличением осмолярности инкубационной среды. Таким образом, торможение процесса М£АТФ-зависимого закисления везикул тонопласта, инкубированных в гипертонической среде в отсутствие в ней валиномицина и ионов 1С1", вероятнее всего объясняется уменьшением в таких условиях анионной проводимости вакуолярной мембраны. С этой интерпретацией согласуется и то наблюдение, что в везикулах, помещенных в гипертоническую среду

АТФ

АТР

1 мин

Рис. 10 Влияние валиномицина' в присутствии ионов К+ на кинетику АТФ-зависимого формирования трансмембранного градиента рН на тонопласте из клеток корнеплода сахарной свеклы и ее чувствительность к'осмолярности инкубационной среды. Везикулы тонопласта, нагруженные 15 мМ КгБСЧ и помещенные в среду инкубации, содержащую 30 мМ КС1 (1) или 30 мМ КС1 и 0, 7 М сорбит (2). В случае (б) среда инкубации была дополнена 0, 5 мкМ валиномицина. (Андреев^ - ■ . Биологические мембраны, 1992, т. 9, 19-25).

заметно возрастает величина MgATФ-зaвиcимoгo мембранного потенциала, генерируемого на везикулярной мембране вакуолярной Н+-АТФазой (рис. 11).

АТР Грвмицивин И

гмин

■ ■ *--- •

Рнс. 11 Кинетика MgATФ-зaвиcимoй генерации мембранного потенциала в везикулах тонопласта, изолированных из корнеплодов сахарной свеклы и помешенных в изотоническую (1) или гипертоническую (дополнительно содержащую 0, 7 М сорбит) (2) среду. (Андреев, Биологические мембраны, 1992, т. 9,19-25).

Наше заключение о роли анионной проводимости тонопласта в осмотической модуляции МдАТФ-зависимой электрогенной активности везикул подтверждается также результатами, полученными при искусственной генерации на везикулярной мембране К+-диффузионного потенциала. За его образованием следили косвенно по снижению рН внутривезикулярной среды, вызванному добавлением валиномицина к везикулам, нагруженным КС1 и помещенным в бескалиевую среду, содержащую ДрН-индикатор акридиновый оранжевый (Андреев, 1992). Эти эксперименты ясно показали, что максимальная величина создаваемого таким путем трансмембранного градиента рН, определяемая здесь в основном величиной Д\|/ на везикулярной мембране, не чувствительна к протонной проводимости тонопласта, но существенно зависит от тоничности инкубационной среды и заметно возрастает с ее увеличением.

В целом, совокупность приведенных выше данных позволяет заключить, что некая анион-транспортирующая система тонопласта способна выступать в роли сенсора трансмембранного осмотического градиента, возникающего на вакуолярной мембране после помещения везикул тонопласта в гипертоническую среду. Вероятно, их осмотическое сжатие из-за выхода из них воды приводит к механической деформации тонопласта или определенной модуляции в нем белково-лшшдных взаимодействий и, тем самым, к кон-формациенным изменениям мембранных белков, участвующих в транспорте анионов через тонопласт. Хотя молекулярная идентификация обнаруженной анион-транспортирую-щей системы не проведена в настоящей работе, нельзя исключить возможность, что за наблюдаемые феномены ответственен механосенсорный ионный канал в тонопласте. Представляется вероятным, что действие в тонопласте анион-проводящих путей, чувствительных к изменению физического состояния этой мембраны в условиях осмотического стресса, может лежать в основе механизмов, ответственных за соответствующую модуляцию процессов вакуолярной компартментации ионов и метаболитов, участвующих в клеточной осморегуляции. Предполагается, что такая осмотическая модуляция способна базироваться на изменении в рассматриваемых условиях степени энергизации тонопласта в форме Д47 или ДрН как движущих сил транспорта тех или иных осмолитов через вакуолярную мембрану.

1,4 Выявление в тонопласте анион-транспортирующей системы, аллостерически активируемой адениновыми нуклеотидами

В ходе исследований, связанных с функциональной идентификацией вакуолярной Н+-АТФазы в клетках мезофилла листьев гороха, нами было обнаружено, что добавление

АТФ к выделенным вакуолям, помещенным в слабощелочную инкубационную среду, вызывает частичную диссипацию трансмембранного градиента рН на тонопласте, причем этот эффект не зависит от наличия в среде ионов М^. Механизм, лежащий в основе такого действия АТФ, был детально исследован нами на везикулах тонопласта из того же растительного объекта после искусственной генерации на этой мембране трансмембранного градиента рН (кислая среда внутри везикул). Для формирования последнего везикулы тонопласта нагружали слабозабуференным раствором сульфата калия (25 мМ) и далее помещали их в бескалиевую среду с относительно высокой буферной емкостью, содержащую ДрН-индикатор акридиновый оранжевый. Было установлено, что закисление среды внутри везикул, которое имело место в этих условиях (рис. 12), происходит в результате генерации К+-диффузионного потенциала на тонопласте, обусловленной пассивным выходом ионов К+ в наружную среду по градиенту концентрации, и последующего электрофоретического поглощения ионов Н* везикулами как ответной реакции на поляризацию везикулярной мембраны. Такое объяснение механизма закисления везикул согласуется с существенным ускорением этого процесса протонофором БССР (рис. 12).

Последующее добавление АТФ или АДФ к суспензии везикул приводило к быстрому обращению сдвига рН внутри везикул. Действие, подобное таковому адениновых нуклео-тидов, не наблюдалось при добавлении ЭДТА к везикулам, хотя это соединение имеет та-

кой же заряд и такие же хелатирующие свойства по отношению к М^ и Саг+, что и АТФ (рис. 13).

Рис. 12 Действие АТФ (а) и АДФ (б) на кинетику пассивной аккумуляции ионов Н+ в везикулах тонопласта из мезофилла листьев гороха, нагруженных 50 мМ сульфатом калия и помещенных в бескалиевую среду. (Андреев и Кореньков, Биологические мембраны, 1995, т. 12,247-253).

вникши

Везикули

Более того, эффект АТФ/АДФ не обнаруживал какой-либо чувствительности к ионам М^2+ в среде инкубации, но заметно подавлялся в присутствии хлорид-анионов или в гипертонической среде (рис. 13). С другой стороны, такое же дяссипирующее действие на величину ДрН оказывало снятие мембранного ОС-диффузионного) потенциала на везикулярной мембране в присутствии легко проникающих через мембрану липофильных катионов или анионов, таких как тетрафеяилфосфоняй или роданид, соответственно (данные не приведены).

Рис. 13 а: Кинетика АТФ-индуцируемой диссипации ДрН в везикулах тонопласта гороха б контроле (1) и в той же инкубационной среде, дополненной 2 мМ 1^80« (2), 30 мМ бис-трис-пропан-С1 (3) или 0, 3 М сорбитом (4); б: Действие на пассивное формирование ДрН ЭДТА й АТФ в отсутствие протонофоров. (Андреев и Кореньков, Биологические мембраны, 1995, т. 12, 247-253)

Трансмембранный градиент рН на тонопласте снижался под действием АТФ или АДФ также при генерации его в присутствии неорганического пярофосфата и ионов М02+ и N03" в инкубационной смеси. В этом случае поляризация везикулярной мембраны или принимала положительное значение ("плюс" внутри везикул) или, скорее всего, отсутствовала (рис. 14), В этих условиях, однако, скорость диссипации ДрН была значительно меньше, что вероятно связано с продолжением работы на тонопласте Л%-гтрофосфат-за-

/ы икум'

] \

НН*С1

Рис. 14 АДФ/АТФ-индуцярованная диссипация градиента рН на тонопласте из клеток мезофилла листьев гороха в случае его генерации вакуолярной Н*-пирофосфатазоЙ. (Андреев и Коренько», Биологические мембраны, 1995, т. 12,247-253).

висимого протонного насоса, но не ^^-зависимой АТФазы ввиду присутствия в среде инкубации относительно высоких концентраций анионов нитрата.

Обращаясь к интерпретации обнаруженного эффекта адер.иновых нуклеотндов, важно отметить прежде всего, что он не сводится ни к активации вакуолярной Н+-АТФазы или какой-либо протеинкиназы, возможно связанной с тонопластом, ни к увеличению протонной проводимости вакуолярной мембраны. Такое заключение следует из тех наблюдений, что этот эффект проявляется и в отсутствие ионов Мц2^ в инкубационной среде и не имитируется действием протонофора РССР, который вызывал обратный эффект. Диссипация ДрН под действием АТФ или АДФ скорее всего обусловлена здесь быстрой деполяризацией тонопласта в присутствии нуклеотидов, так как такое же действие оказывали липофильные катионы и анионы, снимающие мембранный потенциал на везикулярной мембране. В этой связи резонно полагать, что ее деполяризация, связанная с исчезновением на ней К+-диффузионяого потенциала, обусловлена открыванием в вакуолярной мембране ионного канала, проницаемого для анионов, находящихся внутри везикул. В роли таких, анионов могут выступать ионы С1", ибо увеличение их концентрации во внешней среде в существенной степени подавляло АТФ-индуцируемую диссипацию трансмембранного рН градиента. Полученные нами результаты говорят также о специфическом характере действия адениновых нуклеотидов, ибо оно не связано с хелатирующими свойствами таких соединений по отношению к двухвалентным катионам или их способностью изменять поверхностный заряд мембраны. Кроме того, представляется обоснованным говорить также о физиологической значимости обнаруженных эффектов этих со-

единений. Их концентрации, использованные в описанных выше экспериментах, сходны с эндогенными концентрациями АТФ и АДФ в цитозоле растительных клеток. Подобное аллостерическое действие адениновых нуклеотидов ранее было обнаружено в отношении транспортных систем, участвующих в переносе через тонопласт некоторых аминокислот (Gorlach, Willms-Hoff, 1992). Эффекторное действие адениновых нуклеотидов, хорошо известное в отношении мембран ряда животных клеток (Bean, 1992; Szewczyk, Pikuta, 1998), к настоящему времени выявлено как на плазмалемме (Katsuhara et al., 1990; Spalding,Goldsmith, 1993), так и натонопласте (Dietz et al., 1994; Davies, Sanders, 1995) растительных клеток. В последней из цитируемых здесь работ продемонстрирована активация под действием АТФ выхода К+ из вакуолей, которая обусловлена открыванием в тоно-пласте быстро активируемых ионных каналов. В нашей работе, однако, не проведена молекулярная идентификация анион-транспортируюгцей системы тонопласта, предположительно ответственной за наблюдаемые эффекты. Поэтому трудно дать определенный ответ на вопрос о том, какой конкретно ионный канал тонопласта функционирует в исследованных транспортных процессах и в чем состоит его функциональное назначение. Тем не менее, функция рассматриваемого транспортера могла бы состоять в контроле процесса закисления среды внутри вакуолей в ходе работы протонного насоса тонопласта (Wada et al., 1992), если предположить, что его активность отражает действие вышеупомянутых быстро активируемых ионных каналов тонопласта.

Заканчивая данный раздел настоящей работы, важно отметить, что высокая калийная проницаемость вакуолярных мембран из клеток мезофилла листьев гороха не является универсальной особенностью тонопласта растительных клеток. Согласно приведенным выше результатам вакуоли из клеток запасающих тканей растений (корнеплоды кормовой и сахарной свеклы), помещенные в бескалиевую среду, не способны к генерации на тонопласте в таких условиях К+-диффузионного потенциала (Андреев и др., 1985; Андреев, 1992), что указывает на поведение этой мембраны как существенного барьера для ионов К+.

II. Идентификация и характеристика ион-транспортирующих систем в перибакте-роидной мембране симбиосом - азотфиксируюших компартментов в инфицированных клет ках корневых клубеньков бобовых

Как уже выше отмечалось, другой предмет исследований, проведенных в настоящей работе, это выяснение механизмов транспорта ионов через перибактероидную мембрану (ПБМ) симбиосом инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых растений, где происходит симбиотическая фиксация атмосферного азота. Симбиосомы представляют собой особые структуры, где бактероиды (дифференцированные клетки почвенных бак-

терий - ризобий, обладающие нитрогеназной активностью), отделены от цитозоля растительной клетки ПБМ и перибактероидным пространством (ПБП) (Bergersen, 1982). Сим-биосомальная или ПБМ имеет растительное происхождение (Verma, Hong, 1996) и, как установлено к настоящему времени, играет доминирующую роль в контроле обмена метаболитами между макро- и микросимбионтом и тем самым нитрогеназной активности симбиосом (Измайлов, 1996; Udvardi, Day, 1997; Whitehead, Day, 1997). Исследования, проведенные в последние годы, показали, что этот контроль осуществляется благодаря строго координированному переносу через ПБМ ряда неорганических ионов, прежде всего тех, что способны включаться в энергизацию данной мембраны, а также в регуляцию рН и уровня Са2+ в ПБП симбиосом. Однако до недавнего времени механизмы, лежащие в основе этих процессов, оставались во многом неясными, и до сих пор многие аспекты их функционирования еще являются предметом интенсивных исследований. В настоящей работе мы попытались внести вклад в решение этих проблем, акцентируя особое внимание на выяснении механизмов переноса через ПБМ основных физиологически важных ионов, таких как П+, Са2+ и К+.

Исследования в данном направлении были начаты нами с выявления в ПБМ активности Н+-АТФазы, фермента, играющего ключевую роль в энергизации этой мембраны, но до сих пор только слабо охарактеризованного, как в отношении его природы, так и в плане его каталитической и транспортной функций (Whitehead, Day, 1997; Fedorova et al., -1599J.

2. 1 Функциональная идентификация электрогенной Н+-АТФазы Р-тнпа в перибак-тероидной мембране симбиосом п ингибированис ее активности ионами Саг+.

Хотя давно предполагалось, что ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых снабжена ион-транслоцирующей АТФазой, долгое время оставались неясными как природа, так и число разного рода АТФаз в симбиосомальной мембране, и сообщения на эту тему носили во многом противоречивый характер (Bassarab et al., 1986; Дуброво и др., 1992; Szafran, Haaker, 1995). Существенный прогресс в решении этой проблемы достигнут только в самые последние годы, причем в заметной степени и благодаря результатам наших исследований, проведенных совместно с В. В. Крыловой и П. Н. Дуброво.

Эксперименты, проведенные нами на симбиосомах, а также везикулах ПБМ, изолированных из корневых клубеньков люпина желтого, показали, что только одна Mg^-зави-симая Н+-АТФаза Р-типа локализована в этой мембране и что она функционирует как электрогенный протонный насос. Результаты экспериментов, демонстрирующие способность выделенных симбиосом к MgATФ-зaвиcимoй генерации мембранного потенциала (Ау) на

ПБМ ("плюс" на внутренней поверхности ПБМ), регистрируемого с помощью анионного потенциал-чувствительного красителя оксонола VI (Appel, Bersch, 1987), представлены на рис. 15.

Рис. 15 Генерация Н^-АТФазой мембранного потенциала на ПБМ симбиосом из корневых клубеньков люпина желтого и чувствительность этого процесса к проникающим анионам и катионам, ионам Са2+ и ванадату - ингибитору Р-типа АТФаз. Показаны MgATO-m-my-цированное изменение спектра поглощения оксонола VI (А) и кинетика этого процесса (В). (Andreev et al.„ J. Plant Physiol., 1997, vol. 151, 563-569).

Обращает на себя внимание относительно быстрое снятие мембранного потенциала на ПБМ в присутствии ванадата, анионов NO3", а также катионов Са2+. Чувствительность Mg-АТФ-зависимой электрогенпой активности симбиосом к анионам NO3" обусловлена, как выяснилось, действием их как проникающих ионов, а не ингибировапием действия Mg2+-зависимой Н+-АТФазы на ПБМ. Такое заключение подтверждается данными, демонстрирующими MgATi>-3aBircnMoe закисление ПБП симбиосом в присутствии анионов NOj", когда среда инкубации дополнена ЭГТА - хелатором Са2+ (Рис. 16).

Важно отметить здесь, что при отсутствии ЭГТА, несмотря на наличие в инкубационной среде проникающих анионов NO3", кинетика сдвига рН внутри симбиосом развивается крайне медленно. Это обстоятельство очевидно отражает ингибирующее действие Са2+ на активность протонного насоса на ПБМ, поскольку в везикулах ПБМ из того же растительного объекта протонтранслоцирующая активность Н+-АТФазы легко обнаруживается и в отсутствие ЭГТА (Ряс. 17).

All"

Рис. 16 Стимуляция Н+-транслоцирующей активности Н^-АТФазы на ПБМ симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов, обусловленная снижением концентрации свободного Са2'г в реакционной смеси с помощью хелатора Са2+ ЭГТА.

АТР

Рис. 17 Кинетика снижения рН внутри везикул ПБМ из корневых клубеньков люпина желтого в ходе функционирования на этой мембране Н+-АТФаэы. (Andreev et al., J. Plant Physiol., 1997, vol. 151, 563-569). •

Из результатов, полученных при варьировании уровня свободного Са2+ в среде инкубации симбиосом с помощью Са2*-ЭГТА буфера, следует, что полумаксимальное подавление Н+-транслоцирующей активности Н^-АТФазы на ПБМ наступает уже при микромолярных концентрациях свободного кальция (Ко,5 ~ 4 мкМ). Выявленные характеристики М§АТФ-зависимого закисления внутренней водной фазы везикул ПБМ хорошо согласуются с соответствующими характеристиками MgATФ-зaвиcимoй электрогенной активно-

сти симбиосом. Согласно нашим наблюдениям снижение уровня свободного Са2+ в среде с помощью ЭГТА приводит также к выраженной стимуляции Mg-АТФ-зависимой электрогенной активности симбиосом (данные не приведены).

Описанные выше результаты свидетельствуют о том, что ионы Са2+ включаются в регуляцию активности М^-зависимой Н+-АТФазы на ПБМ. Однако механизм, лежащий в основе Са2+-зависимой модуляции активности этого фермента, остается неясным. Вместе с тем быстрое снятие Са2+-зависимого ингибирования протонного насоса в присутствии Са2*-хелатора ЭГТА, а также быстрое обращение такого эффекта последующим добавлением к симбиосомам ионов Са2+ вероятнее всего говорят в пользу прямого действия этих катионов на Н+-ЛТФазу. Как показывают данные литературы, модулирующее или регулирующее влияние Са2+, прямое или опосредованное действием локализованной в ПБМ Са2+-зависимой протеишагаазы, распространяется и на некоторые другие транспортные системы в ПБМ, катализирующие перенос через нее дикарбоновых кислот (Ouyang et al., 1991), ионов NH4+ (Tyerman et al., 1995), a также молекул воды (Guenther et al., 2003).

2. 2 Поведение симбиосом как Са-запасаюпшх компартментов в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых.

Отмеченные выше эффекты Са2+ на ряд транспортных процессов, происходящих на симбиосомальной мембране, а также рассмотренные выше результаты, касающиеся модулирующего действия этих катионов на активность функционирующего в ней АТФ-зависи-мого протонного насоса, указывают на участие кальция в контроле метаболического взаимодействия между партнерами симбиоза в клетках корневых клубеньхов бобовых. Более того, важная роль Са2+ в функционировании симбиосом подтверждается и рядом других данных, косвенно свидетельствующих об аккумуляции кальция внутри этих компартментов, в частности внутри бактероидов, где с участием нитрогеназы и происходит симбио-тическая фиксация азота (Andreeva et al., 1995; Vincent, Hnmprey, 1963). Важно отметить в этой связи, что, например, клетки корневых волосков сои, инфицируемые почвенными бактериями Rhizobium japonicum, характеризуются весьма высоким уровнем кальция, примерно в 7 раз превышающим уровень этого катиона в других частях корневой си-стемы растений, что соответствует повышенному требованию кальция для нормального функционирования ризобий (Werner et al., 1985; Trinick, 1982). Все это дает основание пред полагать, что симбиосомы ведут себя как Са-депо в инфицированных клетках клубеш ков. Кроме того, становится очевидной также актуальность выяснения особенностей п< ведения кальция в симбиосомах, в том числе механизмов его транспорта через ПБМ и а кумуляции внутри этих компартментов.

Гипотеза о поведении симбиосом как Са-депо в клетках корневых клубеньков бобовых была протестирована нами с использованием двух основных экспериментальных подходов, позволяющих выявлять относительно высокие уровни Са;+ в тех или иных внутриклеточных компартментах. Один из этих подходов основан на применении хлортетрацяк-лина (ХТЦ), проникающего через мембраны флуоресцентного Са2+-индикатора с относительно низким сродством к этому катиону (Ко » ¡00 мкМ) и поэтому способному накапливаться в областях с достаточно высокой концешрацией ионов Caz+ (Dixon et al., 1984). Результаты, полученные с использованием ХТЦ и демонстрирующие наличие кальциевого пула внутри симбиосом и бактероидов, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов, показаны на рис. 18.

a231s7 а23187

4 4-

symbtosomes ЪкЖяш<1з

Рис, 18 Кинетика пассивного распределения Са2 '-индикатора хлортетрациклияа между средой инкубации и эндогенным Са-пулом внутри симбиосом (1) и бактероидов (2), выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов. (Andreev et al., FEBS Lett., 1999,447,4952).

Можно видеть, что добавление этих структур к среде, содержащей ХТЦ и лишенной экзогенного кальция, инициирует постепенное увеличение флуоресценция Са^индикатора, отражающее его пассивное проникновение внутрь Са-содержащих компартментов, причем наблюдаемый флуоресцентный сигнал в сильной степени обращается при последующем добавлении к среде Са2+-ионофора А23187. Из данных рис. 18 также следует, что в случае бактероидов амплитуда Са-зависимого флуоресцентного сигнала близка к соответствующей величине, наблюдаемой для симбиосом. С учетом того, что концентрация

общего добавляемого белка в обоих случаях была одинаковой, можно заключить, что основная часть Са-пула внутри симбиосом связана с бактероидами.

Независимое подтверждение Са-запасающей способности симбиосом, причем in situ, получено нами с использованием другого экспериментального подхода, основанного на прямой цитохимической визуализации кальция внутри азотфиксирующих единиц с помощью пироантимоната (ПА), Са2+-иидикатора, способного к образованию электронно-плотных комплексов с ионами Са2+ (Wick, Hepler, 1982). Согласно результатам электронно-микроскопических наблюдений инфицированных клеток корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого, фиксированных в присутствии ПА, выраженная аккумуляция этого индикатора наблюдалась в ряде внутриклеточных компартментов, в том числе внутри симбиосом и бактероидов (Andreeva et al., 1999; Андреев и др., 2001). Обработка корневых клубеньков Са2+-хелатором ЭГТА в присутствии или отсутствии Са2+-ионофора А23187 приводила к существенному снижению степени аккумуляции ПА в указанных внутриклеточных компартментах, что ясно указывает на ее зависимость от размера их Са-пула (Андреев и др., 2001).

Еще одно свидетельство в пользу наличия Са-пула внутри симбиосом получено нами в экспериментах, в которых следили за выходом ионов Са2+ из этих азотфиксирующих единиц, выделенных из корневых клубеньков люпина желтого и помещенных в среду, лишенную экзогенного кальция, но содержащую непроникающий через мембраны Са2+-индика-тор арсеназо III. Выход Са2+ из симбиосом был индуцирован в этих экспериментах добавлением к среде инкубации Са2+-ионофора А23187. Кинетика изменения спектра поглощения арсеназо III в результате образования комплекса его с ионами Cai+ (Thomas, 1982), а также сопутствующего А23187-индуцированного снижения рН водной фазы внутри ПБП симбиосом в результате вызываемого ионофором электронейтралыюго Са2+/Н''-обмена представлены на рис. 19. При этом, сдвиг рН внутри симбиосом выявлялся в наибольшей степени, если среда инкубации симбиосом была дополнена хелатором Са2+ ЭГТА.

Все эти наблюдения свидетельствуют о том, что значительный по величине градиент концентрации ионов Са2+ способен удерживаться на ПБМ симбиосом, то есть она обладает низкой проницаемостью для данных катионов.

А23187 I

A23187 i

ДА720-650 " 0.004 J_

2mia

t • EGTA

(NH^jSOi

Рис. 19 Данные, демонстрирующие А23187-индуцированный выход Са2+ из симбиосом люпина желтого в наружную среду, содержащую Са2+-индикатор арсеназо III (слева), и сопутствующее ему снижение рН внутри этих клеточных структур (справа). (Andreeva et al., J. Plant Physiol., 1999, vol. 155, 357-363).

2.3 Механизмы транспорта Ca2+ через ПБМ симбиосом.

Наличие эндогеннного Са-пула внутри симбиосом дает основание полагать, что ионы Са2+ играют существенную роль в функционировании этих азотфиксирующих клеточных структур, и, вероятнее всего, как-то включаются в процессы, происходящие внутри бактероидов. Последние очевидно требуют доставки этого катиона из цитозоля растительной

I клетки, происходящей в результате транспорта его через симбиосомальную и бактероид-ную мембраны симбиосом. Выяснение механизмов этих процессов, которые долгое время оставались совершенно неясными, явилось одной из задач настоящей работы.

В свете описанных выше результатов наша рабочая гипотеза состояла в том, что поглощение кальция симбиосомами происходит путем активного транспорта этого катиона через ПБМ. Два возможных механизма могли бы лежать в основе такого процесса: действие Са2+/пН+ антипортера или Са2+-транслоцирующей АТФазы. Однако рассмотренные выше данные, свидетельствующие об ингибировании активности ЬГ^-АТФазы в ПБМ ионами Са2+, позволяют исключить из рассмотрения Са2*/пН+ обмен как возможный механизм поглощения Са2+ симбиосомами. Более того, такое заключение подтверждается и тем наблюдением, что добавление к симбиосомам этих катионов даже в миллимолярных концентрациях не вызывало какой-либо заметной диссипации градиента рН, искусственно создаваемого на ПБМ (Andreev et al., 1997).

Вместе с тем положительные результаты были получены нами в ходе поиска возможного присутствия на ПБМ Са2+ -транслоцирующей АТФазы. Ее функциональная идентификация была проведена нами в экспериментах, в которых за МцАТФ-зависимым погло-

щением Са2+ симбиосомами, а также везикулами ПБМ следили по снижению уровня этого катиона в среде инкубации, детектируемого с помощью арсеназо III, непроникающего через мембраны Са2+-индикатора (Thomas, 1982). Как следует из данных рис. 20 и 21, как в выделенных симбиосомах люпина желтого, так и в полученных из них везикулах ПБМ этот процесс развивается достаточно медленно и, как выяснилось, он не чувствителен к соединениям, снимающим мембранный потенциал (валиномицин в присутствии ионов К*) или трансмембранный рН градиент ((NH^SC^) на ПБМ, но быстро останавливается в присутствии ванадата - известного блокатора катион-транспортирующих АТФаз Р-типа.

Можно также видеть, что М§АТФ-зависимое поглощение Са2+ везикулами ПБМ из корневых клубеньков люпина желтого быстро обращалось в присутствии Са2+-ионофора А23187, тогда как в симбиосомах, выделенных из того же растительного объекта, его кинетика оставалась неизменной в присутствии данного катион/Н+-антипортера. Этот результат может говорить о том, что кальций, поглощаемый симбиосомами люпина желтого, по-видимому, не накапливается в ПБП, так как, скорее всего, он быстро транспортируется внутрь бактероидов. Поглощение ионов Са2+ в присутствии АТФ и ионов Mg2* в инкубационной среде наблюдалось нами как в симбиосомах, так и в везикулах ПБМ, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов, причем в обоих растительных объектах активная транслокация Са2+ через ПБМ быстро обращалась Са2+-ионофором А23187 (Andreev et al., 1999).

Независимое подтверждение способности симбиосом к МеАТФ-индуцированному поглощению Са2+ получено в экспериментах, в которых проведепа прямая электропио-мик-роскопическая визуализация кальция внутри этих изолированных клеточных структур с помощью Са-индикатора пироантимоната (Andreeva et al., 1999), способного образовывать электронно-плотные комплексы с тестируемыми катионами (Wick, Hepler, 1982). С использованием и такого экспериментального подхода было установлено, что в соответствии с вышеупомянутыми результатами процесс активного поглощения кальция симбиосомами существенно ингибируется в присутствии ванадата, блокирующего, как мы полагаем, активность Mg2+-3aBHCHMOH Са2+-транслоцирующей АТФазы на ПБМ. Согласно нашим наблюдениям действие АТФ-зависимого Са2+-насоса на ПБМ симбиосом отражалось и в заметном ускорении развития в них флуоресцентного сигнала Са2+-ипдикатора хлор-тетрациклина, выявляющего наличие в них Са-депо, если инкубационная среда была дополнена АТФ и ионами Mg2+. Важно отметить, что в случае симбиосом люпина желтого дальнейшая стимуляция этого процесса наблюдалась в присутствии кальмодулина - из-

Рис. 20 Кинетика М§АТФ-зависимого поглощения Са2+ симбиосомами, изолированными из корневых клубеньков люпина желтого и помещенными в среду, содержащую Са2+-ин-дикатор арсеназо III. Эффекты АТФ и ионов Mg2+ на кинетику спектральных изменений арсеназо III, наблюдаемые во фракции бактероидов, представлены на кривой (5). (Andreev et al., J. Plant Physiol., 1998, vol. 153,610-614).

A23J87

Рис. 21 Кинетика М§АТФ-энергизованного поглощения Са2+ везикулами ПБМ из корневых клубеньков люпина желтого, нагруженными 50 мМ K2SO4, регистрируемая с помощью Са2+-индикатора арсеназо III, находящегося в реакционной смеси. Реакционная смесь дополнена 30 мМ бистриспропан-1\ГОз" (2) или не содержала этой соли (1). (Andreev et al., J. Plant Physiol., 1998, vol. 153, 610-614).

■ АТФ

Рис. 22 MgATФ-зaвиcимaя активация поглощения Са2+ симбиосомами люпина желтого, нагруженными Са2+-нндикатором хлортетрациклином, и стимулирующее действие на этот процесс экзогенного кальмодулина. (Андреев и др., Физиология растений, 2001, т. 48, 364374).

вестного Са-связывающего белка животных и растительных клеток (Рис. 22).

Хотя механизм стимулирующего действия кальмодулина в данном случае остается еще неясным, в настоящее время известны некоторые прецеденты подобного действия этого биорегулятора на активность Са2+-АТФаз (типа IIB) в животных и растительных клетках (Harper et al., 1998; Carafoli, Brini, 2000). Как выяснилось, оно обусловлено снятием каль-модулином в присутствии ионов Са2+ частичного ингибирования активности этих ферментов под действием их автоингибиторного домена (Luoni et al., 2006).

Поведение симбиосом как Са-запасающих компартментов инфицированных клеток клубеньков бобовых наводило на мысль о том, что наряду с действием в ПБМ Са2+-насоса в этой мембране должна, по-видимому, функционировать и другая транспортная система, ответственная за экспорт из симбиосом ионов Са2+ или снижение внутри них активности рассматриваемых катионов. В пользу этой гипотезы свидетельствовали ранее наши результаты, демонстрирующие снижение уровня кальция в симбиосомах in situ после длительной инкубации корневых клубеньков в буферной среде, содержащей хелатор Ca2t ЭГТА (Андреев и др., 2000). Наши дальнейшие эксперименты, проведенные с использованием Са-индикатора пироантимоната показали, что выход кальция из симбиосом in vivo в заметной степени предотвращается, если среда инкубации корневых клубеньков содержит известные блокаторы Са2+-каналов - верапамил и рутеневый красный, причем эффект последних сопровождался заметным возрастанием нитрогеназной активности клубеньков. Подобное действие верапамила было выявлено нами и в симбиосомах, изолированных из корневых клубеньков кормовых бобов. С помощью непроникающего через мембраны индикатора Са2+ арсеназо П1 было также обнаружено, что деполяризация ПБМ симбиосом в

присутствии валиномицина и ионов КГ1" или липофильного катиона тетрафенилфосфония вызывает быстрый выход из них ионов Са2+, который в сильной степени подавляется вера-памилом (Рис.23).

(6)

Рис. 23 Выход Са из симбиосом кормовых бобов, запускаемый деполяризацией ПБМ в присутствии валиномицина и ионов К+ в реакционной смеси и регистрируемый с помощью Са2+-индикатора арсеназо III, и его чувствительность к вераламилу. Показаны изменение спектра поглощения арсеназо III (2) и кинетика этого процесса (5) в отсутствие ве-рапамила. В случаях (3) и (6) к суспензии симбиосом было добавлено 100 мкМ верапами-ла. Для сравнения показано изменение спектра поглощения арсеназо III, вызываемое добавлением к суспензии симбиосом в тех же условиях 50 мкМ СаСЬ (4). (1) - базовая линия (контроль). (Крылова и др., Физиология растений, 2002, т. 49, 839-846).

Эти наблюдения свидетельствуют об электрогенности данного процесса и позволяют предположить, что он обусловлен открыванием Са2+-канала в ПБМ, чувствительного к вераламилу. Рассмотренные выше данные не исключают возможности, что обеднение симбиосом кальцием in vivo в результате длительной обработки корневых клубеньков Са2+-хелатором ЭГТА вызвано выходом Са2+ из симбиосом через такой канал в ПБМ, поскольку ее деполяризация возможно происходит и в условиях развивающегося Са-дефицита инфицированных клеток клубеньков. В целом, совокупность полученных нами результатов говорит о функционировании Са2+-экспортирующей транспортной системы в ПБМ симбиосом. Хотя назначение этого транспортера пока не ясно, можно высказать два предположения относительно его возможной функции. Во-первых, выход Са2+ из симбиосом в цитозоль растительной клетки мог бы выполнять сигнальную роль, то есть включаться в трансдукцию тех или иных сигналов в инфицированных клетках клубенька. Это предположение принимает во внимание как хорошо известную медиаторную роль Са2+ в проведении различных сигналов в растительных клетках (Bush, 1995), так и выявленное нами функционирование симбиосом как внутриклеточного источника Са2+. Во-вторых, выходящий из симбиосом Са2+ мог бы включаться в процессы слияния везикул с ПБМ в ходе уве-

личения площади поверхности этой мембраны на поздних стадиях становления симбиоза, связанных с ростом и размножением бактероидов внутри симбиосом (Андреев, 1993; Ver-haert et al., 2005). Следует отметить в этой связи, что активная роль Са2+ к настоящему времени надежно установлена в процессах, протекающих как на ранних, так и на поздних стадиях формирования симбиосом (Harris et al., 2003; Verhaert et al., 2005).

2. 4 Пассивный транспорт K+ через ПБМ симбиосом

В рамках настоящей работы исследования транспорта ионов через ПБМ симбиосом включали и изучение механизма пассивного переноса через нее ионов К+, которыми в наибольшей степени обогащены клетки как эу-, так и прокариот. Согласно результатам проведенных нами экспериментов и некоторым данным, имеющимся в литературе, симбио-сомы корневых клубеньков бобовых также содержат значительный по размеру пул ионов калия. Вместе с тем механизмы переноса К+ через ПБМ симбиосом до недавнего времени оставались полностью неясными. Наши исследования, проведенные на симбиосомах, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого, вносят определенный вклад в решение этой проблемы. Они посвящены выяснению механизма пассивного выхода ионов К из симбиосом в бескалиевую изотоническую среду.

В ходе наших предыдущих исследований, посвященных функциональной идентификации электрогенной Н+-АТФазы в ПБМ симбиосом люпина желтого было обнаружено, что эти азотфиксирующие структуры нагружены ионами К+ и претерпевают закисление ПБП при их инкубации в бескалиевой среде (Andreev et al., 1997). Эксперименты показали, что подобный процесс наблюдается и в случае симбиосом, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов и помещенных в бескалиевую инкубационную среду с рН 7, 0, содержащую ДрН-индикатор акридиновый оранжевый (рис. 24). Наблюдаемый сдвиг рН внутри симбиосом, как выяснилось, существенно ускоряется К+-ионофором в&чино-мицином и протонофорами, такими как карбопилцианид-«-трифторметоксифенилгид-разон (FCCP), катализирующими электрогеиный перенос через мембрану ионов К+ и Н+, соответственно, также как антибиотиком нигерицином, катализирующим электронейтральный К+/Н+ обмен. Вместе с тем можно видеть, что закисление симбиосом быстро обращалось аммонием ((NH^SOi), а также сантимолярными концентрациями ионов К+ (K2S04).

symbiosomes ■ 1

-k2so4:

ДАш-ио" 0.0063

1 min

■ t ■ (nh,>,so4

(NH4bS04

Рис. 24 Пассивное закисление ПБП симбиосом, изолированных из корневых клубеньков кормовых бобов и помещенных в бескалиевую среду, содержащую ДрН-индикатор акридиновый оранжевый, и чувствительность этого процесса к протонофорам, валиномицину и сантимолярным концентрациям экзогенного К"1" (Андреев и др., Физиология растений, 2004, 51, 80-85; Andreev et al., Plant Science, 2005, vol. 168, 1005-1010).

Исходя из этих данных, было высказано предположение о том, что в основе наблюдаемых эффектов лежит пассивный выход ионов К+ из симбиосом по градиенту концентрации и генерация на ПБМ трансмембранного К*-диффузионного потенциала. Можно полагать, что создаваемая таким путем поляризация ПБМ и является движущей силой транспорта ионов Н* внутрь симбиосом. Как показали наши последующие эксперименты, такая интерпретация подтверждается теми результатами, что кинетика пассивного закисле-ния симбиосом заметно подавляется в присутствии тетраэтиламмония — известного бло-катора К+-каналов клеточных мембран и быстро обращается после деполяризации ПБМ симбиосом липофильными катионами тетрафенилосфония, легко проникающими через мембраны (Рис. 25).

Снятие мембранного потенциала на ПБМ должно облегчать выход ионов К+ из симбиосом. Поэтому в присутствии тетрафенилфосфония можно ожидать существенного обеднения симбиосом калием как, вероятнее всего, их наиболее массовым катионом, а в результате этого и осмотического выхода воды из исследуемых клеточных структур, то есть Осмотического уменьшения их объема. Такой эффект действительно наблюдался нами, если судить об этом по существенному увеличению мутности суспензии симбиосом в присутствии выбранного липофильного катиона (Рис. 26).

• symbiosomes- .

control

NH4C1

IAA492-SM - 0.0045

r—

2 min

J AA4M.5M=0.0068

Рис. 25 Ингибирование пассивного закисления ПБП симбиосом в присутствии тетраэтил-аммония (А), в результате снижения уровня свободного Са2+ в инкубационной смеси с помощью ЭГТА (В) и обращение этого процесса тетрафенилфосфонием (A) (Andreev et al., Plant Science, 2005, vol. 168,1005-1010).

Важно отметить, что выявленное увеличение мутности снмбиосомальной суспензии значительно блокировалось в присутствии тетраэтиламмония и наблюдалось при тех же концентрациях (мюшимолярных) ингибитора, которые подавляли процесс закисления ПБП симбиосом (Рис. 25).

Процесс закисления среды внутри ПБП симбиосом существенно ингибировался и после удаления примесного кальция из инкубационной среды с помощью ЭГТА и в заметной степени обращался после добавления Са2'1" к симбиосомам в присутствии этого хела-тора (Рис. 27). Вместе с тем ингибирующий эффект хелатора Са2+ на кинетику осмотического сжатия симбиосом проявлялся только в очень слабой степени, что может быть связано с переходом соответствующих Са2+-связывающих сайтов на ПБМ в условиях осмотического стресса в другое состояние, отличное от того, которое реализуется в отсутствие тетрафенилфосфония.

Рис. 26 Увеличение мутности суспензии симбиосом кормовых бобов в бескалиевой среде, запускаемое тетрафенилфосфонием (ТРР4), и ингибирование этого процесса тетра-этиламмонием (TEA) (а).В случае (Ь) среда инкубации симбиосом дополнительно содержала 8 мМ TEA и его ингибирующий эффект снимался в присутствии валиномицина. (Andreev et al.. Plant Science, 2005, vol. 168, 1005-1010).

Хотя результаты, описанные в этом разделе настоящей работы, получены с использованием косвенных экспериментальных подходов для идентификации выхода К+ из симбиосом, они позволяют заключить, что данный процесс является электрогенным и осуществляется благодаря функционированию в ПБМ ионных каналов, блокируемых тет-раэтиламмонием и вероятно активируемых ионами Са2+. Наличие в ПБМ такого типа К+-проницаемого канала дает вероятное объяснение относительно высокой проницаемости этой мембраны для ионов К+. В отношении возможной роли транспорта этих катионов через ПБМ предполагается, что этот процесс способен включаться в контроль степени поляризации или энергизации данной мембраны, а также участвовать в осморегуляции инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых.

Последнее предположение согласуется с недавно полученными данными, демонстрирующими способность симбиосом люцерны к аккумуляции К4', также как пролинбетаина и ионов Na* в условиях солевого стресса (Trinchant et al. 2004). Эти результаты указывают также на заметное увеличение в данных условиях объема симбиосом, но не находящихся внутри них бактероидов, при сохранении общих размеров инфицированных клеток. Иначе говоря, вариабельность размера или объема ПБП симбиосом лежит в основе изменения их объема в стрессовых условиях. Наблюдаемое осмотическое поведение симбиосом in vivo соответствует полученным ранее данным, характеризующим изменения в тех же условиях морфологии этих азотфиксирующих единиц в инфицированных клетках кор-

symbiosomes С i

Рис. 27 Действие экзогенного Са'1+ в присутствии ЭГТА на кинетику пассивного закисле-ния симбиосом, инкубируемых в бескалиевой среде. Симбиосомы были добавлены к этой среде в отсутствие (1) или в присутствии в ней 2, 5 мМ ЭГТА (2), или к той же среде, содержащей 2, 5 мМ ЭГТА и 1 мМ СаС12 (3) (Andreev et al., Plant Science, 2005, vol. 168, 1005-1010).

невых клубеньков других растений (Ou Yang et al., 1992; Trinchant et al., 1998). Таким образом, возможно, что эти изменения отражают универсальную особенность осмотической модуляции объема симбиосом в ходе осморегуляции инфицированных клеток клубенька.

Подобные изменения способны претерпевать и центральные вакуоли в клетках высших растений. В последние годы выяснилось, что их морфологические характеристики существенно изменяются в условиях гипертонического или солевого стресса. Так, в клетках суспензионной культуры табака под действием такого стресса наблюдалось значительное увеличение площади поверхности тонопласта и, следовательно, величины отношения этого параметра к объему цитозоля [Reisen et al., 2005]. Очевидно, что такая ответная реакция вакуоли может обусловливать перераспределение воды, ионов и метаболитов между двумя компартментами, разделенными тонопластом, отражая тем самым участие этой органеллы в клеточной осморегуляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе, выполненной на вакуолях и вакуолярных мембранах, изолированных из тканей высших растений, а также на симбиосомах и везикулах ПБМ, выделенных из корневых клубеньков бобовых, проведена функциональная идентификация ря-

да ион-транспортирующих систем, локализованных в этих мембранах. Охарактеризована функциональная активность таких систем в условиях in vitro и найдены некоторые факторы цитозольной природы, способные контролировать их функционирование в условиях in vivo.

Помимо выявления индивидуальных ион-транспортирующих свойств вакуолярной и ПБМ, одна из существенных задач проведенных исследований состояла в проверке гипотезы о том, что эти мембраны сходны между собой по ряду общих качественных характеристик транспорта через них основных физиологически важных ионов (Н+, Са?*, К*).

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты. Фактором, обеспечивающим энергизадию как вакуолярной, так и симбиосомальной мембран является формирование на них трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Н+ в ходе работы соответствующей Н+-АТФазы. Однако, протонные насосы, функционирующие в этих мембранах, существенно различаются по своим свойствам. Н^АТФаза в ПБМ симбиосом характеризуется кислым оптимумом рН (5, 6), ин-гибируется ванадатом и ионами Са2+ и не чувствительна к анионам нитрата. Вакуолярная Н^-АТФаза, напротив, достигает максимальной активности в области слабощелочных значений рН (8, 0), не чувствительна к ванадату и ионам Са2т и ингибируется анионами нитрата. Существенно отметить в этой связи, что полученные нами данные не подтверждают ранних сообщений в литературе о наличии в ПБМ симбиосом двух Н+-АТФаз, Р- и V-типов, ингибируемых соответственно ванадатом и нитратом (Bassarab et al., 1986; Дуб-рово и др., 1992), и говорят о функционировании в симбиосомальной мембране корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого только одной, ванадат-чувствительной Н+-АТФазы. Это заключение находится в соответствии с результатами, получеными недавно другими авторами на симбиосомах сои с использованием для решения данной проблемы качественно другого методического подхода, основанного на иммунодетекции рассматриваемой Н+-АТФазы Р-типа (Fedorova et al., 1999). Вместе с тем существенно отметить два обстоятельства. Во-первых, детальный анализ биохимических свойств данного фермента пока отсутствует. Во-вторых, несмотря на тот факт, что в ПБМ симбиосом к настоящему времени не обнаружена протонтранслоцирующая активность вакуолярной Н+-АТФазы, на присутствие в симбиосомальной мембране этого фермента указывают данные, недавно полученные с помощью протеомики (Catalano et al., 2004). Вопрос о том, почему транспортная -функция Н^-АТФазы V-типа не выявляется в изолированных симбиосомах или везикулах ПБМ, остается пока открытым. Между тем наличие в ПБМ вакуолярной АТФазы могло бы быть результатом слияния везикул эндосом с этой мемб-

раной на поздних стадиях становления симбиоза, связанных с формированием симбиосом (Verhaert et al., 2005).

Как вакуоли, так и симбиосомы также активно поглощают ионы Са2+ в ходе функционирования Са2+/пН+ антипортера на тонопласте и Мд2+-зависимой Са2+-транслоцирующей АТФазы на ПБМ, соответственно. Более того, симбиосомы, как выяснилось, подобно вакуолям ведут себя как Са-депо и накапливают, по меньшей мере, миллимолярные концентрации кальция. Однако точная картина распределения Са-пула внутри симбиосом, а именно между ПБП и бактероидами, остается неясной. Вместе с тем, полученные нами данные позволяют заключить, что симбиосомы кормовых бобов и люпина желтого заметно различаются по уровню кальция, накапливаемого в их ПБП, поскольку в случае симбиосом из корневых клубеньков растений последнего типа, известных как Са-фобы, Mg-АТФ-энергизованное поглощение ими ионов Са2+ не обращалось Са2+-ионофором А23187.

Активность вторично-энергизованных иоп-транспортирующих систем, функционально идентифицированных в тонопласте in vitro, чувствительна к некоторым факторам, входящим в состав их цитозольного окружения in situ. К ним относится Са-связьтвающий белок кальмодулин, сильно стимулирующий активность Са2+/пН -антипортера в вакуоляр-ной мембране клеток корнеплода сахарной свеклы, и адениновые нуклеотиды (АТФ, АДФ), способные аллостерически активировать или, иначе говоря, открывать анионный канал в тонопласте фотосинтезирующих меток растений гороха. Показано, что эффект кальмодулина обусловлен существенным снижением кажущейся К„ антипортера для Са2+ и является результатом прямого взаимодействия этого белка с данным переносчиком, ибо оно не опосредовано образованием комплекса Са2+-кальмодулип. Эффект адениновых ну-клеотидов скорее всего также отражает их прямое взаимодействие с ионным каналом в тонопласте, так как он не включает в себя ни их гидролиза, ни активности мембрансвя-занных протеинкиназ.

Как тонопласт из фотосинтезирующих клеток мезофилла листьев гороха, так и ПБМ симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого характеризуются относительно высокой проницаемостью для ионов К+. Это проявляется в закислении внутренней водной фазы симбиосом (ПБП) и вакуолей, когда они помещены в бескалиевую слабощелочную инкубационную среду. Наблюдаемый сдвиг рН обусловлен электрогенным выходом ионов К*" из данных клеточных структур по градиенту его электрохимии-ческого потенциала и образованием на ограничивающих их мембранах К+-диффузион-ного потенциала как движущей силы для последующего электрофоретического поглощения ими протонов. В случае ПБМ симбиосом трансмембранный перенос К+ осуществ-

ляется по ионному каналу, блокируемому ТЭА и, вероятно, активируемому ионами Са2+, тогда как выход К+ из вакуолей скорее всего происходит в результате функционирования в тонопласте так называемого медленно активируемого ионного канала. ПБМ симбиосом снабжена верапамил-чувствительным Са2+-транспортером, наиболее вероятно, Са2+-каналом, который быстро активируется при деполяризации этой мембраны и обеспечивает транзиторный пассивный выход Са2+ из симбиосом по градиенту электрохимического потенциала данного катиона. Необходимость деполяризации ПБМ для экспорта кальция из симбиосом, а также очень быстрое прекращение такого процесса после его запуска дают основание предполагать, что наблюдаемая мобилизация Са2+ из симбиосом выполняет скорее всего сигнальную роль, то есть способна включаться в трансдукцию тех или иных сигналов в инфицированных клетках клубенька. Известно, что подобный процесс реализуется при деполяризации плазмалеммы растительных клеток различного происхождения, в том числе при тепловом шоке (Kuznetsov et al., 1998; Trofimova et al., 1999; Андреев, 2005). Как уже выше отмечалось, деполяризация ПБМ приводила также к выходу ионов 1С из симбиосом и их осмотическому сжатию. Поэтому нельзя исключить возможность того, что экспорт Са2+ из симбиосом опосредован активацией в тех же условиях механочувствительного Са2+-канала в ПБМ. В основе этого предположения лежит то обстоятельство, что ионные каналы такого типа могут активироваться и при деполяризации биологических мембран, как это недавно показано нами в случае механочувствительного Са2+-канала в плазматической мембране пресноводной цианобактерии Synechocystis РСС 6803 (Nazarenko et al., 2003), а также другими авторами при исследовании ряда характеристик таких каналов в мембранах некоторых животных клеток (Reifarth et al., 1999). Интересно отметить, что совсем недавно в тонопласте клее-ток дрожжей установлено наличие ионного канала, обеспечивающего освобождение Са2+ из вакуоли при механических деформациях вакуолярной мембраны в условиях гиперосмотического стресса (Zhou et al., 2003). Хотя к настоящему времени Са+-канал подобного типа не идентифицирован в тонопласте клеток высших растений, имеются данные, хотя и крайне ограниченные, о существовании механочувствителышх ионных каналов и в этой растительной мембране (Alexandre, Lassalles, 1991; Ding, Pickard, 1993; MacRobbie, 2006). Результаты настоящей работы, касающиеся функциональной идентификации в тонопласте корнеплодов сахарной свеклы механочувствительного анионного транспортера или канала, также свидетельствуют о чувствительности трансмембранного ионного обмена на этой мембране к созданию на ней осмотического градиента. Механо-чувствительный анионный канал недавно выявлен и в плазматической мембране мезофилла растительных клеток (Kishigami et al., 2004).

В перечисленных выше характеристиках ионного транспорта через вакуолярную и ПБМ растительных клеток обращают на себя внимание некоторые сходные черты, присущие выявленным нами ионным транспортерам в обеих мембранах. Несмотря на заметные различия в организации их функционирования, это сходство состоит в общности выполняемых ими функций и в одной и той же направленности процессов трапемемб-ранной транслокации ионов (Рис. 28). Данное обстоятельство находится в соответствии с нашей гипотезой о поведении симбиосом как функционального аналога вакуолей в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых и, на наш взгляд, заслуживает особого внимания в свете других полученных к настоящему времени результатов, подтверждающих такую гипотезу. Эти результаты состоят в следующем.

1. В инфицированных клетках корневых клубеньков, объем которых практически полностью заполняется симбиосомами, происходит редукция или полное исчезновение вакуолей литического типа (Kijne, 1975; Peiter et al., 2003).

2. ПБП симбиосом содержит литические ферменты, свойственные вакуолям обычных растительных клеток (Mellor, 1989; Roth, Stacey, 1989).

3. Симбиосомы также как и вакуоли способны накапливать, по меньшей мере, милпимо-лярные концентрации кальция, то есть ведут себя как внутриклеточные Ca-депо.

4. Процессы биогенеза вакуолярной и ПБМ реализуются при участии во многом качественно сходных внутриклеточных систем адресной доставки к ним соответствующих белков и слияния с ними везикул эндомембран в ходе этих процессов (Verma, Hong, 1995; Son et al., 2003; Verhaert et al., 2005).

5. Мажорные интегральные белки как вакуолярной, так. и ПБМ ведут себя как аквапори-ны, что обусловливает возможность участия их наряду с другими транспортными системами симбиосом и вакуолей в осморегуляции растительных клеток (Martinoia et al., 2000; Rivers et al., 1997).

6. Адресная доставка многих белков после их синтеза к вакуолярной и ПБМ определяется наличием в них терминальных сигнальных последовательностей аминокислот (Verma, Hong, 1995).

7. Состав как вакуолярной, так и ПБМ характеризуется относительно низкой величиной отношения [белок]/[липид] (Hernandez, Cooke, 1996).

Вместе с тем важно отметить, что, несмотря на наше заключение о способности симбиосом в инфицированных клетках корневых клубеньков принимать на себя функции вакуоли, различия между этими уникальными внутриклеточными структурами растительных клеток достаточно очевидны. Они проявляются не только в особенностях оргаииза-

цин и поведения исследованных ион-транслоцирующих систем соответствующих мембран, но и в других характеристиках рассматриваемых растительных объектов.

Рис. 28 Процессы ионного транспорта через вакуолярную и симбиосомальную мембраны с участием функционирующих в них ионных транспортеров (на основании данных, приведенных в настоящей работе).

В целом совокупность полученных в настоящей работе результатов позволяет заключить, что исследованные ион-транслоцирующие системы вакуолярной и симбиосома-льной мембран выполняют сходные функции, придающие симбиосомам потенциальную способность включаться подобно вакуолям в регуляцию внутриклеточного ионного го-меостаза. Принимая на себя как эту, так и другие важные функции вакуолей, симбио-сомы могут осуществлять таким путем регуляцию метаболизма инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых и играть ключевую роль в этом процессе.

1. На ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых, как и на тонопласте растительных клеток, функционирует только одна электрогенная Н+-АТФаза, причем симбиосома-

Г-ЛТФя*а

ВЫВОДЫ

льная 1Г-АТФаза, в отличие от вакуолярной, принадлежит к классу АТФаз Р-тшта. Участвуя в генерации трансмембранного протонного градиента, эти прогонные насосы вносят существенный вклад в энергизацию соответствующих мембран, то есть энергообеспечение транспорта через них других ионов и метаболитов.

2. Тонопласт из фотосинтезирующих клеток мезофилла листьев гороха и ПБМ симбио-сом из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого характеризуются относительно высокой проницаемостью для ионов К+. Она обусловлена действием в ПБМ симбиосом потенциал-зависимого К+-канала, активируемого ионами Са2+, а в случае тонопласта, скорее всего, связана с активностью так называемого медленно активируемого ионного канала.

3. Симбиосомы из инфицированных клеток клубеньков бобовых ведут себя как Са-депо, активно накапливая, по меньшей мере, миллимолярные концентрации кальция, что во многом объясняется функционированием на ПБМ Mg2',"-зaвиcимoй Са2+-транслоциру-ющей АТФазы, ингибируемой ванадатом и обеспечивающей электронейтральный перенос ионов Са2+ через ПБМ.

ПБМ симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого снабжена верапамил-ингибируемым Са2+ транспортером, который обеспечивает быстрый выход Са2+ из симбиосом при деполяризации ПБМ и поэтому способен включаться в трансдукцию тех или иных сигналов в инфицированных клетках клубенька. Тонопласт в клетках растений снабжен Са2+/пН+ антипортером, активность которого сильно стимулируется Са-связывающим белком кальмодулином в результате существенного снижения кажущейся Км Са2+/пН+ антипортера для Са2+ благодаря прямому взаимодействию его с кальмодулином.

На тонопласте растительных клеток функционируют анионные переносчики или каналы, одни из которых чувствительны к осмотическим деформациям вакуолярной мембраны, тогда как другие аллостерически активируются адениновыми нуклеотидами (АТФ, АДФ).

Аккумуляция кальция внутри симбиосом, активности ионных транспортеров в ПБМ, а также известный литический характер ПБП согласуются с поведением этих азотфик-сирующих единиц как функционального аналога вакуолей в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых.

Поведение симбиосом как Са-депо, а также наличие в ПБМ идентифицированных Са2+-транслоцирующих систем указывают на потенциальную роль этих клеточных структур в поддержании кальциевого гомеостаза инфицированных клеток клубенька, в обеспечении Са-зависимой регуляции тех или иных процесссов внутри симбиосо-

малыюго компартмента, а также процессов формирования симбиосом на поздних стадиях становления симбиоза.

9 Вакуоли и симбиосомы во многом сходны в отношении направленности и характера переноса через ограничивающие их мембраны основных физиологически важных ионов, таких как Н*, 1С и Са2+, несмотря на тот факт, что конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе функционирования исследованных ион-транспортирую-щих систем тонопласта и ПБМ, заметно различаются между собой.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Андреев И. М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. (1985) Выделение и АТФ-азная активность интактных вакуолей и вакуолярных мембран из листьев гороха. Физиология растений, т. 32, 5-14.

2. Андреев И. М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. (1985) Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей из корнеплода кормовой свеклы. Искусственная генерация трансмембранных ионных градиентов. Биологические мембраны, т. 2, 996-1002.

3. Андреев И. М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. (1985) АТФазная активность вакуолярных мембран из листьев гороха (Pisum sativum L.) В сборнике: "Структура и функции биологических мембран растений", Новосибирск, Изд.-во "Наука", 107112.

4. Koren'kov V., Andreev I. (1987) Comparative studies of barrier properties of the tonop-last from fodder crop beet and pea leaf mesophyll: artificial generation of transmembrane pH gradient Abstracts of 3rd International Symposium "Structure and Function of Roots", Nitia, p. 70.

5. Андреев И. M., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. (1987) АТФ-зависимый трансмембранный перенос протонов в везикулах тонопласта из листьев гороха. Физиология растений, т. 34, 1045-1056.

6. Андреев И. М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. (1989) Са37пН+ антипорт в везикулах тонопласта из листьев гороха. Биологические мембраны, т. б, 153-158.

7. Андреев И. М., Кореньков В. Д. (1990) Стимуляция кальмодулином Са2+/пН+ антипорта через вакуолярную мембрану клеток корнеплода сахарной свеклы. Тезисы докладов II съезда Всесоюзного общества физиологов растений, Москва, с. И.

8. Andreev I. М., Koren'kov V., Molotkovsky Yu. G. (1990) Calmodulin stimulation of Ca2+/nH+ antiport across the vacuolar membrane of sugar beet taproot. J. Plant Physiol., vol. 136,3-7.

9. Andreev I. M-, Koren'kov V. D. (1990) Calmodulin action on the activity of Ca2+/nH+ antiporter in tonoplast vesicles from sugar beet taproots. Abstracts of 7th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Umea, Sweden, SI 8,493.

10. Андреев И. M., Кореньков В. Д., Орлова М. С. (1990) Сахароза/Н4 антипорт через тонопласт и возможная роль вакуолярной Н+-ЛТФазы в тургорном контроле транспорта сахарозы в клетках корнеплода сахарной свеклы. Физиология растений, т. 37,432-440.

11. Андреев И. М., Кореньков В. Д. (1991) Ускорение кальмодулином трансмембранного Са2+/Н+ обмепа в везикулах тонопласта из листьев гороха. Биологические мембраны,!. 8,1028-1033.

12. Андреев И. М. (1992) Роль анионпроводящих систем тонопласта Beta vulgaris в чувствительности АТР-зависимой генерации ДрН к осмотическому сжатию вакуо-лярной мембраны. Биологические мембраны, т. 9,19-25.

13. Андреев И. М. (1993) Роль осмотических факторов в контроле вакуолярной аккумуляции Сахаров в запасающих клетках высших растений. Физиология растений, т. 40, 323-326.

14. Андреев И. М. (1993) Роль механических свойств мембран в динамике поведения мембранных систем в растительных клетках. Физиология растений, т. 40,475-484.

15. Андреев И. М., Кореньков В. Д. (1995) Активируемый нуклеотидами транспорт анионов через вакуолярную мембрану мезофилла листьев гороха. Биологические мембраны, т. 12, 247-253.

16. Андреев И. М., Дуброво П. Н., Кореньков В. Д., Крылова В. В., Сорокин Е. М., Измайлов С. Ф. (1996) АТФ-зависимый электрогенньгй перенос протонов и транспорт метаболитов через перибактероидную мембрану клубеньков люпина желтого. Физиология растений, т. 43, 874-882.

17. Andreev I., Dubrovo P., Krylova V., Andreeva I. N.. Koren'kov V. D., Sorokin E. M. and Izmailov S. F. (1997) Characterization of ATP-hydrolyzing and ATP-driven proton-translocating activities associated with the peribacteroid membrane from root nodules of Lupinus luteus L. J. Plant Physiol., vol. 151, 563-569.

18. Andreev I. M., Dubrovo P. N.. Krylova V. V. and Izmailov S. F. (1998) Calcium uptake by symbiosomes and the peribacteroid membrane vesicles isolated from yellow lupin root nodules. J. Plant Physiol., vol. 153, 610-614.

19. Kuznetsov VI. V., Andreev I. M., Trofimova M. S. (1998) The synthesis of HSPs in sugar beet suspension culture cells under hyperthermia exhibits differential sensitivity to calcium. Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 45,269-278.

20. Trofimova M. S., Andreev I. M., Kuznetsov VI. V. (1999) Calcium is involved in regulation of the synthesis of HSPs in suspension-cultured sugar beet cells under hyperthermia. Physiol. Plant., vol. 105, 67-73.

21. Andreeva I. N., Andreev I. M., Dubrovo P. N., Kozharinova G. M., Krylova V. V., and Izmailov S. F. (1999) Calcium stores in symbiosomes from yellow lupin root nodules. J. Plant Physiol., vol. 155, 357-363.

22. Андреев И. M„ Дуброво П. Н., Крылова В. В., Измайлов С. Ф. (1999) Ионы CaJ+ ингибируют АТФ-зависимую транслокацию протонов через перибактероидную мембрану корневых клубеньков бобовых. Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России, Москва, т.1, с. 202.

23. Andreev I. М., Dubrovo Р. N.. Krylova V. V., Izmailov S. F. (1999) Functional identification of ATP-driven Ca2+ pump in the peribacteroid membrane of broad bean root nodules. FEBS Lett., vol. 447,49-52.

24. Андреев И. M., Андреева И. Н., Кожаринова Г, М., Дуброво П. Н., Крылова В. В., Измайлов С. Ф. (2000) Аккумуляция кальция и его включение в контроль нитро-геназной активности в симбиосомах корневых клубеньков кормовых бобов. Физиология растений, т. 47, 14-20.

25. Андреев И. М., Андреева И. Н., Дуброво П. Н., Крылова В. В., Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф. (2001) Кальциевый статус симбиосом люпина желтого как потенциальный регулятор их нитрогеназной активности. Физиология растений, т. 48, 364-374.

26. Андреев И. М. (2001) Функции вакуоли в клетках высших растений. Физиология растений, т. 48, 777-787.

27. Крылова В. В., Андреев И. М., Андреева И. Н., Дуброво П. Н., Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф. (2002) Верапамил-чувствительный кальциевый транспортер в пе-рибактероидной мембране симбиосом из корневых клубеньков Vicia faba. Физиология растений, т. 49, 839-846.

28. Andreev I. M., Kxylova V. V., Dubrovo P. N.. Izmailov S. F. (2003) Functional identification of K+-transporter in the peribacteroid membrane from broad bean root nodules. Abstracts of 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, PRZ313, p. 294.

29. Izmailov S. F., Krylova V. V., Dubrovo P. N., Andreev I. M. (2003) Ca2+ is involved in regulation of the symbiotic partnership in legume root nodules. Abstracts of 11111 International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, PRZ314, p. 294.

30. Крылова В. В., Андреев И. М., Дуброво П. Н., Измайлов С. Ф. (2003) Выход К+ из симбиосом корневых клубеньков Vicia faba L., активируемый деполяризацией пе-рибактероидной мембраны. Тезисы докладов V съезда Общества физиологов растений России, Пенза, с. 181.

31. Nazarenko L. V., Andreev I. М., Lyukevich A. A., Pisareva Т. V., Los D. А. (2003) Calcium release from Synechocystis cells induced by depolarization of the plasma membrane: MscL as an outward Ca2+ channel. Microbiology, vol. 149,1147-1153.

32. Крылова В. В., Андреев И. М., Дуброво П. Н., Измайлов С. Ф. (2004) Кальций в контроле нитрогеназной активности корневых клубеньков Vicia faba L.: выход кальция из симбиосом и сопутствующее ему снижение их нитрогеназной активности блокируются верапамилом. Известия АН, Серия биологическая, N 2, 173-

33. Андреев И. М., Крылова В. В., Дуброво П. Н., Измайлов С. Ф. (2004) Изменения интенсивности светорассеяния симбиосом из корневых клубеньков Vicia faba как индикатор транспорта ионов и метаболитов через перибактероидную мембрану. Физиология растений, т. 51, 80-85.

34. Андреев И. М., Тимофеева Г. В., Ковалева JI. В. (2005) Генерация кальциевого сигнала в пыльцевых зернах, запускаемая деполяризацией плазматической мембраны. Доклады АН, т. 400,693-696.

35. Andreev I., Kxylova V., Dubrovo P., Izmailov S. (2005) Passive potassium transport by symbiosomes from broad bean root nodules. Plant Science, vol. 168, 1005-1010.

181

Подписано в печать • 41, 09. 200.6г. Тираж 4О О экз Заказ № т"3

ООО «Тедсполиграфцешр»

Формат 60x84/16. Усл. печ. л. Тел./факс: (095) 151-26-70

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Андреев, Игорь Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

Вакуолярная и перибактероидная мембраны ограничивают в растительных клетках компартменты, которые сходны друг с другом по некоторым характеристикам биогенеза и функциональной активности, что, возможно, отражается и в ион-транспортирующих свойствах этих мембран

1. Функции вакуоли, транспорт ионов через тонопласт и его регуляция в клетках высших растений.

1.1 Транспорт К+ и Са2+ через тонопласт.

1.2 Регуляторные аспекты транспорта ионов через тонопласт.

1.2.1 Участие кальмодулина в регуляции транспорта ионов через мембраны растительных клеток.

1.2.2 Потенциальная роль адениновых нуклеотидов в регуляции транспорта ионов через тонопласт.

1.2.3 Модуляция транспорта ионов через тонопласт при осморегуляции растительных клеток.

2. Транспорт ионов через ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых.

3. Общие характеристики становления эндосимбиоза, связанного с формированием в эукариотических клетках-хозяина вакуолеподобного компартмента при инфицировании их микроорганизмами.

4. Общие характеристики биогенеза вакуолярной и симбиосомальной мембран.

5. Роль Са2т в процессах бобово-ризобиального эндосимбиоза, связанных с инфицированием клеток корневых волосков ризобиями, формированием, созреванием и функционированием симбиосом.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава II.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение вакуолей и получение из них везикул тонопласта.

Выделение симбиосом и получение из них везикул ПБМ.

Определение АТФ-гидролазной активности препаратов вакуолярных и симби-осомальных мембран.

Регистрация мембранного потенциала на мембране выделенных вакуолей, симбиосом и полученных из них везикул тонопласта и ПБМ.

Регистрация трансмембранного градиента рН на мембране выделенных орга-нелл и полученных из них везикулярных мембранах (тонопласте и ПБМ).

Цитохимическая визуализация кальция в симбиосомах in vivo и in vitro и выявление в них Са-депо.

Регистрация осмотически-индуцированных изменений объема симбиосом.

Глава III.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функциональная идентификация, характеристика и некоторые факторы контроля активности ион-транспортирующих систем в вакуоляр-ной мембране растений.

1.1 Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей для ряда основных физиологически важных ионов и функциональная идентификация в этой мембране АТФ- и пирофосфат-зависимого протонных насосов.

1.2 Са27п1-Г-антипортер на тонопласте и его регуляция кальмодулином

1.3 Функциональная идентификация в тонопласте анион-транспортирующей системы как сенсора, определяющего чувствительность

§АТФ-зависи-мой генерации трансмембранного градиента рН к осмотическому сжатию вакуолярной мембраны.

1.4 Выявление в тонопласте анион-транспортирующей системы, аллостериче-ски активируемой адениновыми нуклеотидами.

2. Идентификация и характеристика ион-транспортирующих систем в пе-рибактероидной мембране симбиосом - азотфиксирующих компарт-ментов в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых

2.1 Функциональная идентификация электрогенной Н+-АТФазы Р-типа в перибактероидной мембране симбиосом и ингибирование ее активности ионами Са2+.

2.2 Поведение симбиосом как Са-запасающих компартментов в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых.

2.3 Механизмы транспорта Са2+ через ПБМ.

2.4 Пассивный транспорт К+ через ПБМ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы и регуляция транспорта ионов через вакуолярную и перибактероидную мембраны растительных клеток"

Одна из фундаментальных проблем современной биологии состоит в выяснении механизмов, ответственных за поддержание ионного гомеостаза животных и растительных клеток. Действие этих механизмов во многом определяется активностью ион-транслоцирующих систем, локализованных в клеточных мембранах, в том числе в эндомембранах, ограничивающих определенные внутриклеточные органеллы.

В растительных клетках в гомеостатической регуляции ионного состава их цитозоля очень важную роль играет вакуоль - уникальная мультифунк-циональная органелла, активность которой тесно интегрирована с активностями остальной части клетки. К настоящему времени установлено, что ва-куолеподобный компартмент часто образуется и в ходе взаимодействия микроорганизмов с эукариотами, в частности, при заражении ряда животных клеток патогенами, что приводит к установлению симбиотических взаимоотношений между ними. Этот внутриклеточный компартмент является для микросимбионта местом его обитания, роста и размножения. Согласно данным, имеющимся в настоящее время в литературе, в растениях примером вакуоле-подобного компартмента рассматриваемого типа могут быть присутствующие в клетках корневых клубеньков бобовых симбиосомы, которые содержат бактероиды и ответственны за симбиотическую фиксацию атмосферного азота. Вместе с тем роль симбиосом в клетках, инфицированных почвенными бактериями - ризобиями, вероятно не ограничивается только этой функцией и скорее всего включает в себя и другие, свойственные вакуолям обычных растительных клеток. До недавнего времени данные в пользу этой гипотезы были представлены лишь сообщениями о литическом характере перибактеро-идного пространства (ПБП) симбиосом, и она не имела каких-либо убедительных экспериментальных подтверждений, в том числе основанных на характеристиках обмена ионами между макро- и микросимбионтом.

В этой связи в настоящей работе проведена проверка справедливости рассматриваемой гипотезы на основе исследований механизмов транспорта основных физиологически важных ионов (Н+, К+, Са2+) через вакуолярную и симбиосомальную (перибактероидную (ПБМ)) мембраны. Был проведен сравнительный анализ барьерных свойств исследуемых мембран по отношению к указанным ионам, а также изучены характер, транспортные активности и способы регуляции первично- и вторично-энергизованных ион-транслоциру-ющих систем, локализованных в этих мембранах. Необходимость выполнения настоящей работы определялась и ограниченностью информации, особенно в самом начале наших исследований, о механизмах и способах регуляции транспорта ионов через вакуолярную мембрану растительных клеток.

Полученные в работе результаты вносят заметный вклад в понимание механизмов действия, а также особенностей функционирования и способов регуляции активности ионных транспортеров, идентифицированных в мембране органелл того или иного типа. Выявленные характеристики ионного обмена через ПБМ симбиосом во многом указывают на поведение их как функционального аналога вакуолей. В свою очередь это может свидетельствовать о мультифункциональности симбиосом и их потенциальной роли в регуляции ионного состава цитозоля и осморегуляции инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых. Иначе говоря, подобно вакуолям симбиосомы вероятно активно включаются в регуляцию метаболизма инфицированных клеток клубенька и их активности тесно интегрированы с активностями остальной части таких клеток. Очевидно, что наиболее активное метаболическое взаимодействие между симбиотическими партнерами реализуется в случае эффективного симбиоза. На основании результатов, полученных в настоящей работе, предполагается, что эффективность такого взаимодействия существенным образом зависит от функционирования ион-транслоцирующих систем, локализованных в ПБМ симбиосом.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Андреев, Игорь Михайлович

выводы

1. На ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых, как и на тонопласте растительных клеток, функционирует только одна электрогенная Н+-АТФаза, причем симбиосомальная Н+-АТФаза, в отличие от вакуолярной, принадлежит к классу катион-транслоцирующих АТФаз Р-типа. Участвуя в генерации трансмембранного протонного градиента, эти протонные насосы вносят существенный вклад в энергизацию соответствующих мембран, то есть энергообеспечение транспорта через них других ионов и метаболитов.

2. Тонопласт из фотосинтезирующих клеток мезофилла листьев гороха и ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых характеризуются относительно высокой проницаемостью для ионов К+. Она обусловлена действием в ПБМ симбиосом потенциал-зависимого К+-канала, активируемого ионами Са2+, тогда как в случае тонопласта она, скорее всего, связана с с активностью так называемого медленно активируемого ионного канала.

3. Симбиосомы из инфицированных клеток клубеньков бобовых ведут себя как Са-депо, активнЪ накапливая, по меньшей мере, миллимолярные концентрации кальция, что во многом объясняется функционированием на ПБМ М£2+-зависимой Са2т-транслоцирующей АТФазы, ингибируемой ва-надатом и обеспечивающей электронейтральный перенос ионов Са"т через ПБМ.

4. ПБМ симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого снабжена верапамил-ингибируемым Са2+ транспортером, который обеспечивает быстрый выход Са2+ из симбиосом при деполяризации ПБМ и поэтому способен включаться в трансдукцию тех или иных сигналов в инфицированных клетках клубенька.

5. Тонопласт в клетках растений снабжен Са27пЬГ антипортером, активность которого сильно стимулируется Са-связывающим белком кальмо-дулином в результате существенного снижения кажущейся Км Са27-пНт антипортера для Са2+ благодаря прямому взаимодействию его с кальмо-дулином.

6. На тонопласте растительных клеток функционируют анионный переносчики или каналы, одни из которых чувствительны к осмотическим деформациям вакуолярной мембраны, тогда как другие аллостерически активируются адениновыми нуклеотидами (АТФ, АДФ).

7. Аккумуляция кальция в симбиосомах, активности ионных транспортеров в их ПБМ, а также известный литический характер их ПБП согласуются с поведением симбиосом как функционального аналога вакуолей в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых.

8. Поведение симбиосом как Са-депо, а также наличие в ПБМ идентифицированных Са2т-транслоцирующих систем указывают на потенциальную роль этих клеточных структур в поддержании кальциевого гомеостаза инфицированных клеток корневых клубеньков, в обеспечении Са-зависимой регуляции тех или иных процессов внутри симбиосомального компартмента, а также процессов формирования симбиосом на поздних стадиях становления симбиоза.

9. Вакуоли и симбиосомы во многом сходны в отношении направленности и характера переноса через эти мембраны основных физиологически важных ионов, таких как 1-Г, Ю и Са2+, несмотря на тот факт, что конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе функционирования исследованных ион-транспортирующих систем тонопласта и ПБМ заметно различаются между собой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе, выполненной на препаратах вакуолей и вакуоляр-ных мембран, полученных из тканей высших растений, а также симбиосомах и везикулах ПБМ, выделенных из корневых клубеньков бобовых, проведена функциональная идентификация ряда ион-транспортирующих систем, локализованных в этих мембранах. Охарактеризована функциональная активность таких систем в условиях in vitro и найдены некоторые факторы цито-зольной природы, способные контролировать их функционирование в условиях in vivo.

Помимо выявления индивидуальных ион-транспортирующих свойств вакуолярной и симбиосомальной (перибактероидной) мембран, одна из существенных задач проведенных исследований состояла в проверке гипотезы о том, что эти мембраны сходны между собой по ряду общих качественных характеристик транспорта через них основных физиологически важных ионов (Н+, Са2+, К+).

Полученные в работе результаты показали, что:

1) Фактором, обеспечивающим энергизацию как вакуолярной, так и ПБМ является формирование на них трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Нт в ходе работы соответствующей ЬГ-АТФ-азы. Однако, протонные насосы, функционирующие в этих мембранах, существенно различаются по своим свойствам. Нт-АТФаза в ПБМ симбиосом характеризуется кислым оптимумом рН, ингибируется ванадатом и ионами Са и не чувствительна к анионам нитрата. Вакуолярная Нт-АТФаза, напротив, достигает максимальной активности в области слабощелочных значений рН, не чувствительна к ванадату и ионам Са2+ и ингибируется анионами нитрата. Существенно отметить в этой связи, что полученные нами данные не подтверждают ранних сообщений в литературе о наличии в ПБМ симбиосом двух Н+-АТФаз, Р- и V-типов, ини-гибируемых соответственно ванадатом и нитратом (Bassarab et al., 1986; Дуброво и др., 1992), и говорят о функционировании в симбиосомальчой мембране корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого только одной, ванадат-чувствительной Н+-АТФазы. Это заключение находится в соответствии с результатами, полученными недавно другими авторами на симбиосомах сои с использованием для решения данной проблемы качественно другого методического подхода, основанного на иммуно-детекции рассматриваемой НГ-АТФазы Р-типа (Fedorova et al., 1999). Вместе с тем существенно отметить два обстоятельства. Во-первых, детальный анализ биохимических свойств данного фермента пока отсутствует. Во-вторых, несмотря на тот факт, что в ПБМ симбиосом к настоящему времени не обнаружена протонтранслоцирующая активность вакуолярной tf-АТФазы, на присутствие в симбиосомальной мембране этого фермента указывают данные, недавно полученные с помощью протео-мики (Catalano et al., 2004). Вопрос о том, почему транспортная функция Н+-АТФазы V-типа не выявляется в изолированных симбиосомах или везикулах ПБМ, остается пока открытым. Между тем наличие в ПБМ вакуолярной АТФазы могло бы быть результатом слияния везикул эндосом с этой мембраной на поздних стадиях становления симбиоза, связанных с формированием симбиосом (Verhaert et al., 2005).

2) Как вакуоли, так и симбиосомы также активно поглощают ионы Са2+ в ходе функционирования Са27пНт антипортера на тонопласте и Mg2r-3a-висимой Са" -транслоцирующей АТФазы на ПБМ, соответственно. Более того, симбиосомы, как выяснилось, подобно вакуолям ведут себя как Са-депо и накапливают, по меньшей мере, миллимолярные концентрации кальция. Однако точная картина распределения Са-пула внутри симбиосом, а именно между их ПБП и бактероидами, остается неясной. Вместе с тем, полученные нами данные позволяют заключить, что симбиосомы кормовых бобов и люпина желтого заметно различаются по уровню кальция, накапливаемого в их ПБП, поскольку в случае симбиосом из корневых клубеньков растений последнего типа, известных как Са-фобы, МдАТФ-энергизованное поглощение ими ионов Са т не обращается Са" -ионофором A23I87. Наши результаты о поведении симбиосом как Са-де-по находятся в соответствии с недавно полученными данными, свидетельствующими о присутствии Са-связывающих, кальмодулин-подобных белков в ПБП симбиосом и наличии в геноме клеток корневых клубеньков соответствующих генов, кодирующих такого рода белки сопряжено с нодулинами 22 и 25 (Liu et al., 2006). Вместе с тем, хотя хорошо известно, что Са-связывающие белки присутствуют и внутри растительных вакуолей (Yuasa and Maeshima, 2000; Heyen et al., 2002), только совсем недавно выявлено наличие среди них и кальмодулин-подобных белков (Yama-guchi et al., 2005).

3) Активность вторично-энергизованных ион-транспортирующих систем, функционально идентифицированных в тонопласте in vitro, чувствительна к некоторым факторам, входящим в состав их цитозольного окружения in situ. К ним относится Са-связывающий белок кальмодулин, сильно стимулирующий активность Са2+/пН+-антипортера в вакуолярной мембране клеток корнеплода сахарной свеклы и мезофилла листьев гороха, и аде-ниновые нуклеотиды (АТФ, АДФ), способные аллостерически активировать или, иначе говоря, открывать анионный канал в тонопласте тех же фотосинтезирующих клеток растений гороха. Показано, что эффект кальмодулина обусловлен существенным снижением кажущейся Км антипортера для Са2+ и является результатом прямого взаимодействия этого белка с данным переносчиком, ибо оно не опосредовано образованием комплекса Са2т-кальмодулин. Эффект адениновых нуклеотидов скорее всего также отражает их прямое взаимодействие с ионным каналом в тонопласте, так как он не включает в себя ни их гидролиза, ни активности мем-бран-связанных протеинкиназ.

4) Как тонопласт из фотосинтезирующих клеток мезофилла листьев гороха, так и ПБМ симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов и люпина желтого характеризуются относительно высокой проницаемостью для ионов К+. Это проявляется в закислении внутренней водной фазы симбиосом (ПБП) и вакуолей, когда они помещены в бескалиевую слабощелочную инкубационную среду. Наблюдаемый сдвиг рН обусловлен электрогенным выходом ионов Кт из данных клеточных структур по градиенту концентрации и образованием на ограничивающих их мембранах ^-диффузионного потенциала как движущей силы для последующего электро-форетического поглощения ими протонов. В случае ПБМ симбиосом трансмембранный перенос К+ осуществляется по ионному каналу, блокируемому ТЭА и, вероятно, активируемому ионами Са2г, тогда как выход К+ из вакуолей скорее всего происходит в результате функционирования в тонопласте так называемого медленно активируемого ионного канала.

5) ПБМ симбиосом снабжена верапамил-чувствительным Са -транспортером, наиболее вероятно, Са2+-каналом, который быстро активируется при деполяризации этой мембраны и обеспечивает транзиторный пассивный выход Са2т из симбиосом по градиенту концентрации данного катиона. Необходимость деполяризации ПБМ для экспорта кальция из симбиосом, а также очень быстрое прекращение такого процесса после его запуска дают основание предполагать, что наблюдаемая мобилизация Са2" из симбиосом выполняет скорее всего сигнальную роль, то есть способна включаться в трансдукцию тех или иных сигналов в инфицированных клетках клубенька. Такой процесс сходен с тем, что часто наблюдается при деполяризации плазмалеммы растительных клеток, приводящей к активации в ней Са2+-каналов, выполняющих сигнальную роль, то есть ответственных за транзиторное увеличение уровня внутриклеточного кальция в цитозоле. Это происходит, в частности, в пыльцевых зернах петунии (Андреев, 2005), а также в клетках суспензионной культуры сахарной свеклы в условиях гипертермии и инициирует в них синтез белков теплового шока (Kuznetsov et al., 1998; Trofimova et al., 1999). Как уже выше отмечалось, в условиях наших экспериментов деполяризация ПБМ приводила также к выходу ионов К+ из симбиосом и их осмотическому ежа-тию. Поэтому нельзя исключить возможность, что экспорт Са из симбиосом опосредован активацией в тех же условиях механочувствительного Са2+-канала в ПБМ. В основе этого предположения лежит то обстоятельство, что ионные каналы такого типа могут активироваться и при деполяризации биологических мембран, как это недавно показано нами в случае механочувствительного Са2+-канала в плазматической мембране пресноводной цианобактерии Synechocystis РСС 6803 (Nazarenko et al., 2003), а также другими авторами при исследовании ряда характеристик таких каналов в мембранах некоторых животных клеток (Reifarth et al., 1999). Интересно отметить здесь, что совсем недавно в тонопласте клеток дрожжей установлено наличие ионного канала, обеспечивающего освобождение Са из вакуоли при механических деформациях вакуолярной мембраны в условиях гиперосмотического стресса (Zhou et al., 2003). Хотя к настоящему времени Са+-канал подобного типа не идентифицирован в то-нопласте клеток высших растений, имеются данные, хотя и крайне ограниченные, о существовании механочувствительных ионных каналов в этой растительной мембране (Alexandre and Lassalles, 1991; Ding and Pi-ckard, 1993; Ramahaleo et al., 1996) и чувствительности к осмотическому стрессу открывания в ней Са" -каналов, активируемых инозитол-1,4,5-трисфосфатом (Allen and Sanders, 1994). В целом, однако, данные о меха-ночувствительности ионных, в том числе Са т-, каналов в мембранах клеток высших растений крайне ограничены (Falke et al., 1988; Cosgrove and Hedrich, 1991; Ding and Pickard, 1993; Dutta and Robinson, 2004; Hay-ashi et al., 2006). Результаты настоящей работы, касающиеся функциональной идентификации механочувствительного анионного транспортера или канала в тонопласте клеток корнеплода сахарной свеклы, также свидетельствуют о чувствительности трансмембранного ионного обмена к механическим деформациям вакуолярной мембраны.

В перечисленных выше характеристиках ионного транспорта через вакуолярную и ПБМ растительных клеток обращают на себя внимание некоторые сходные черты, присущие выявленным нами ионным транспортерам в обеих мембранах. В целом это сходство состоит как в общности выполняемых ими функций, несмотря на заметные различия в организации их ф>нк-ционирования, так и в одной и той же направленности процессов трансмембранной транслокации ионов (Рис. 34). Данное обстоятельство находится в соответствии с нашей гипотезой о поведении симбиосом как функционального аналога вакуолей в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых и, на наш взгляд, заслуживает особого внимания в свете других полученных к настоящему времени результатов, ее подтверждающих. Эти результаты состоят в следующем.

ВАКУОЛЬ

Рис. 34 Процессы ионного транспорта через вакуолярную и симбиосомаль-ную мембраны растительных клеток с участием функционирующих в них ионных транспортеров (на основании данных, приведенных в настоящей работе).

2. ПБП симбиосом содержит литические ферменты, свойственные вакуолям обычных растительных клеток (Mellor, 1989).

3. Симбиосомы также как и вакуоли способны накапливать, по меньшей мере, миллимолярные концентрации кальция, то есть ведут себя как внутриклеточные Са-депо.

4. Процессы биогенеза вакуолярной и ПБМ реализуются при участии во многом качественно сходных внутриклеточных систем адресной доставки к ним соответствующих белков и слияния с ними везикул эндомембран в ходе этих процессов (Mellor and Werner, 1987; Verma and Hong, 1995; Son et al., 2003; Verhaert et al., 2005).

5. Мажорные интегральные белки как вакуолярной, так и ПБМ ведут себя как аквапорины, что обусловливает возможность участия их наряду с другими транспортными системами симбиосом и вакуолей в клеточной осморегуля-ции (Martinoia et al., 2000; Rivers et al., 1997).

6. Адресная доставка многих белков после их синтеза к вакуолярной и ПБМ определяется наличием в них терминальных сигнальных последовательностей аминокислот (Verma and Hong, 1995).

7. Состав как вакуолярной, так и ПБМ характеризуется относительно низкой величиной отношения [белок]/[липид] (Hernandez and Cooke, 1996).

Наблюдаемая аналогия в определенных аспектах функциональной активности симбиосом и вакуолей может иметь важное значение в фундаментальном отношении, поскольку в перспективе сравнительный анализ особенностей поведения тех или иных компонентов этих двух внутриклеточных компартментов растительных клеток мог бы составить основу многообещающего методического подхода, позволяющего получить новую информацию об их структуре и функциях.

Вместе с тем важно отметить, что, несмотря, на наше заключение о способности симбиосом в инфицированных клетках корневых клубеньков принимать на себя функции вакуоли, различия между этими уникальными внутриклеточными структурами растительных клеток достаточно очевидны. Они проявляются не только в особенностях организации и поведения исследованных ион-транслоцирующих систем соответствующих мембран, но и в других характеристиках рассматриваемых растительных объектов.

Важно отметить, что особое внимание в проведенных исследованиях уделено транспорту ионов Са2т через вакуолярную и симбиосомальную мембраны и поведению данного катиона в симбиосомах. Это вызвано тем обстоятельством, что Са21" играет ключевую роль во многих ответных реакциях растительных клеток, опосредованных активностью вакуоли, и, как выяснилось в последние годы, требуется для реализации фактически всех стадий формирования симбиосом (начиная от инфицирования клеток корневых волосков ризобиями и кончая поздними стадиями созревания симбиосом (Harris et al., 2003; Verhaert et al., 2005)) и включается в контроль их функционирования.

В целом совокупность полученных в настоящей работе результатов позволяет заключить, что исследованные ион-транслоцирующие системы вакуолярной и симбиосомальной мембран выполняют сходные функции, придающие симбиосомам потенциальную способность включаться подобно вакуолям в регуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза. Принимая на себя как эту, так и другие важные функции вакуолей, симбиосомы могут осуществлять таким путем регуляцию метаболизма инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых и играть ключевую роль в этом процессе.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Андреев, Игорь Михайлович, Москва

1. Андреев И. М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей из корнеплода кормовой свеклы. Искусственная генерация трансмембранных ионных градиентов // Биологические мембраны, 1985, том 2, N 10, С. 996-1002.

2. Андреев И. М, Кореньков В. Д, Молотковский Ю. Г АТФ-зависимый трансмембранный перенос протонов в везикулах тонопласта из листьев гороха // Физиология растений, 1987, том 34, N 6, С. 1045-1056.

3. Андреев И. М, Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. Са /пН антипорт в везикулах тонопласта из листьев гороха // Биологические мембраны, 1989, том 6, N2, С. 153-158.

4. Андреев И. М, Кореньков В. Д., Орлова М. С. Сахароза/Hf антипорт через тонопласт и возможная роль вакуолярной Н^-АТФазы в тургорном контроле транспорта сахарозы в клетках корнеплода сахарной свеклы // Физиология растений, 1990, том 37, N 3, С. 432-440.

5. Андреев И М Роль анионпроводящих систем тонопласта Beta vulgaris в чувствительности АТР-зависимой генерации АрН к осмотическому сжатию вакуолярной мембраны // Биологические мембраны, 1992, том 9, N 1, С. 19-25.

6. Андреев И М Роль осмотических факторов в контроле вакуолярной аккумуляции Сахаров в запасающих клетках высших растений // Физиология растений, 1993, том 40, N 2, С. 323-326.

7. Андреев И. М. Роль механических свойств мембран в динамике поведения мембранных систем в растительных клетках // Физиология растений, 1993, том 40, N3, С. 475-484.

8. Андреев И. М., Кореньков В Д. Активируемый нуклеотидами транспорт анионов через вакуолярную мембрану мезофилла листьев гороха // Биологические мембраны, 1995, том 12, N 3, С. 247-253.

9. Андреев И. М. Функции вакуоли в клетках высших растений // Физиология растений, 2001, том 48, N 5, С. 777-787.

10. Андреев И. М, Тимофеева Г. В, Ковалева Л. В. Генерация кальциевого сигнала в пыльцевых зернах, запускаемая деполяризацией плазматической мембраны // Доклады АН, 2005, том 400, N 5, С. 693-696.

11. Андреева И И, Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф Компартментация кальция в корневых клубеньках бобовых: электронно-микроскопическое исследование//Доклады АН, 1995, том 344, N 3, С. 402-406.

12. Бейер Т. В., Свежова Н. В., Радченко А. И., Сидоренко Н. В. Пути формирования паразитофорных вакуолей и их разнообразие у паразитических простейших. Кокцидии (sporozoa, apicomplexa) // Цитология, 2003, том 45, N 4, С. 339-356.

13. Дуброво П Н., Крылова В. В., Ливанова Г. И, Жизневская Г. Я, Измайлов С Ф. Свойства АТФаз перибактероидной мембраны корневых клубеньков люпина желтого // Физиология растений, 1992, том 39, N 3, С. 503-513.

14. Измайлов С. Ф. Физиология симбиотических взаимоотношений в клубеньках бобовых: биогенез и роль перибактероидной мембраны // Физиология растений, 1996, том 43, N С. 773-791.

15. Саляев Р К, Кузеванов В. Я., Хаптагаев С Б., Копытчук В. Н. Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений // Физиология растений, 1981, том 28, N6, С. 1295-1305.

16. Allen G J., Sanders D. Osmotic stress enhances the competence of Beta vulgaris vacuoles to respond to inositol 1,4,5-trisphosphate // Plant J., 1994, Vol. 6, P. 687695.

17. Allen G J, Sanders D Control of ionic currents in guard cell vacuoles by cytoso-lic and luminal calcium // Plant J., 1996, Vol. 10, P. 1055-1069.

18. Amodeo G., Stuka M., Dorr R., Parisi M. Protoplasmic pH modifies water and solute transfer in Beta vulgaris root vacuoles // J. Membrane Biol., 2002, Vol. 187, P. 175-184.

19. Alexandre J., Lassales J.-P. Hydrostatic and osmotic pressure activated channel in plant vacuole // Biophys. J., 1991, Vol. 60, P. 1326-1336.

20. Alexandre J, Lassales J.-P. Effect of D-wyo-inositol 1, 4, 5-triphosphate on the electrical properties of the red beet vacuolar membrane // Plant Physiol., 1990, Vol. 93, P. 837-840.

21. Allen G J., Sanders D Vacuolar ion channels in higher plants // Adv. Bot. Res., 1997, Vol. 25, P. 217-252.

22. Allen G. J., Sanders D Calcineurin, a type 2B protein phosphatase, modulates the Ca2+-permeable slow vacuolar ion channel of stomatal guard cells // Plant Cell, 1995, Vol. 7, P. 1473-1483.

23. Ambudkar I. S., Horn V. J., Baum B. J. ATP-dependent Ca transport in the rat parotid basolateral plasma membrane is regulated by calmodulin // Arch. Biochem. Biophys., 1989, Vol. 268, P. 576-584.

24. Ames В N. Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases // Methods Enzymol., 1966, Vol. 8, P. 115-116.

25. Andreev I. M., Koren'kov V. D., Molotkovsky Yu. G Calmodulin stimulation of Са /nH antiport across the vacuolar membrane of sugar beet taproot // J. Plant Physiol., 1990, Vol. 136, P. 3-7.

26. Andreev I. M., Dubrovo P. N., Krylova V. V., Izmailov S. F. Calcium uptake by symbiosomes and the peribacteroid membrane vesicles isolated from yellow lupin root nodules//J. Plant Physiol., 1998, Vol. 153, P. 610-614.

27. Andreev I., Krylova V., Dubrovo P., Izmailov S Passive potassium transport by symbiosomes from broad bean root nodules // Plant Science, 2005, Vol. 168, P. 1005-1010.

28. Andreeva I. N., Andreev I. M, Dubrovo P. N., Kozharinova G. M., Krylova V. V., Izmailov S. F. Calcium stores in symbiosomes from yellow lupin root nodules // J. Plant Physiol., 1999, Vol. 155, P. 357-363.

29. Appel H-J, Berch B. Oxonol VI as an optical indicator for membrane potentials in lipid vesicles // Biochem. Biophys. Acta, 1987, Vol. 903, P. 480-494.

30. Apse M P., Sottosanto J В, Blumwald E Vacuolar cation/IT exchange, ion homeostasis, and leaf development are altered in a T-DNA insertional mutant of AtNHXl, the Arabidopsis vacuolar NaTlT antiporter // Plant J., 2003, Vol. 36, P. 229-239.л,

31. Askerlund P. Calmodulin-stimulated Са -ATPases in the vacuolar and plasma membranes in cauliflower // Plant Physiol., 1997, Vol. 114, P. 999-1007.

32. Axelsen К. В., Palmgren M. G. Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis I I Plant Physiol., 2001, Vol. 126, P. 696-706.

33. BassarbS, Mellor R В, Werner D. Evidence for two types of Mg++-ATPase in the peribacteroid membrane from Glycine max root nodules // Endocyt. C. Res., 1986, Vol.3, P. 189-196.

34. Beakgaard L , Luoni L, Michelis M. I.-D., Palmgren M G. The plant plasma membrane Ca2+ pump ACA8 overlapping as well as physically separated autoinhibi-tory and calmodulin-binding domains // J. Biol. Chem., 2006, Vol. 281, P. 10581065.

35. Bean В P. Pharamacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels // Trends Pharm. Sci., 1992, Vol. 13, P. 87-90.

36. Berecki G., Eijken M, Van Iren F., Van Diujn B. Tonoplast anion channel activity modulation by pH in Chara corralina H J. Membrane Biol., 2001, Vol. 184, P. 131-141.

37. Bergersen F J In: Root Nodules: Structure and Function, Research Studies Press, Chichester, 1982, pp. 23-50.1. Ч 1

38. Bethke Р. С., Jones R. L. Ca -calmodulin modulates ion channel activity in storage protein vacuoles of barley aleurone cells // Plant Cell, 1994, Vol. 6, P. 277285.

39. Beyenbach К W., Wieczorek H. The V-type H+-ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation // J. Exp. Biol., 2006, Vol. 209, P. 577589.2+

40. Blackford. S, Rea P. A., Sanders D. Voltage sensitivity of H /Са antiport in higher plant tonoplast suggests a role in vacuolar calcium accumulation // J. Biol. Chem., 1990, Vol. 265, P. 9617-9620.

41. Blumwald E, Gelli A. Secondary inorganic transport at the tonoplast I I Adv. Bot. Res., 1997, Vol. 25, P. 401-416.

42. Bradford M. M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Bio-chem., 1976, Vol. 72, P. 248-254.

43. Bruggemann L /., Pottosin I. I., Schonknecht G. Cytoplasmic polyamines block the fast-activating vacuolar cation channel // Plant J., 1998, Vol. 16, P. 101-105.

44. Bush D S Calcium regulation in plant cells and its role in signaling // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1995, Vol. 46, P. 95-122.

45. Carafoli E, Brini M. Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport// Curr. Opin. Chem. Biol., 2000, Vol. 4, P. 152-161.

46. Carpaneto A , Cantu A M, Gambale F. Redox agents regulate ion channel activity in vacuoles from higher plant cells//FEBS Lett., 1999, Vol. 442, P. 129-132.

47. Carpaneto A., Cantu A. M., Gambale F. Effects of cytoplasmic Mg2+ on slowly activating channels in isolated vacuoles of Beta vulgaris II Planta, 2001, Vol. 213, P. 457-468.

48. Catalano С. M., Lane W. S, Sherrier D J. Biochemical characterization of symbi-osome membrane proteins from Medicago truncatula root nodules // Electrophoresis, 2004, Vol. 25, P. 519-531.

49. Cheng S-H, Willmann M. R., Chen H.-C., Sheen J Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family // Plant Physiol., 2002, Vol. 129, P. 469-485.

50. Chin M J, Means A R Calmodulin: a prototypical calcium sensor // Trends in Cell Biology, 2000, Vol. 10, P. 322-328.

51. Clarkson D. Т., Hanson J. B. The mineral nutrition of higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol., 1980, Vol. 31, P. 239-298.

52. Colcombet J., Thomine S., Guern J., Frachisse J. M, Barbier-Brygoo H. Nucleotides provide a voltage-sensitive gate for the rapid anion channel of Arabidopsis hypocotyl cells//J. Biol. Chem, 2001, Vol. 276, P. 36139-36145.

53. Cos grove D. J., Hedrich R. Stretch-activated chloride, potassium, and calcium channels coexisting in plasma membranes of guard cells of Vicia faba L. // Planta, 1991, Vol. 186, P. 143-153.

54. Coyaud L., Kurkdjian A., Kado R., Hedrich R. Ion channels and ATP-driven pumps involved in ion transport across the tonoplast of sugarbeet vacuoles // Biophys. Biochim. Acta, 1987, Vol. 902, P. 263-268.

55. Crivici A., Ikura M. Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin // Annu. Rev. Biomol. Struct., 1995, Vol. 24, P. 85-116.

56. Dauwalder M, Roux S. J., Hardison L. Distribution of calmodulin in pea seedlings : immunocytochemical localization in plumules and root apices // Planta, 1986, Vol. 168, P. 461-470.

57. Davies J. M., Sanders D. ATP, pH and Mg modulate a cation current in Beta vulgaris vacuoles: a possible shunt conductance for the vacuolar ATPase // J. Membr. Biol., 1995, Vol. 145, P. 75-86.

58. Dean R. M., Rivers R. L., Zeidel M. L., Roberts D. M Purification and functional reconstitution of soybean nodulin 26: an aquaporin with water and glycerol transport properties // Biochemistry, 1999, Vol. 38, P. 347-353.

59. Denis V., Cyert M. S., Internal Ca2+ release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue // J. Cell Biol., 2002, Vol. 156, P. 29-34.

60. Ding J, Pickard B. Mechanosensory calcium-selective cation channels in epidermal cells // Plant J., 1993, Vol. 3, P. 83-110.

61. Dobrovinskaya 0. R., MunizJ., Pottosin /./. Inhibition of vacuolar ion channels by polyamines //J. Membrane Biol., 1999, Vol. 167, P. 127-140.

62. DuPont F. M, Hurkman W. J Separation of the Mg2+-ATPases from the Са2т-phosphatase activity of microsomal membranes prepared from barley roots // Plant Physiol., 1985, Vol. 77, P. 857-862.

63. Dutta R, Robinson K. R. Identification and characterization of stretch-activated ion channels in pollen protoplasts // Plant Physiology, 2004, Vol. 135, P. 1398-1406.

64. Ehrhardt D. W, Atkinson E M., Long S. R. Depolarization of alfalfa root hair membrane-potential by Rhizobium meliloti Nod factors // Science, 1992, Vol. 256, P. 998-1000.

65. Ehrhardt D. W., Wais R, Long S. R. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulation signals // Cell, 1996, Vol. 85, P. 673-681.

66. Evans H. J., Russel S II The Chemistry and Biochemistry of Nitrogen Fixation, p. 191 (J. Postgate, ed.), Plenum Press, London, 1971.

67. Evans D E, Williams L. E P-type calcium ATPases in higher plants biochemical, molecular and functional properties // Biochim. Biophys. Acta, 1998, Vol. 1376, P. 1-25.

68. Falke L. С., Edwards К., Pickard В. G., Misler S A stretch-activated anion channel in tobacco protoplasts // FEBS Lett., 1988, Vol. 237, P. 141-144.

69. Fedorova E., Thomson R., Whitehead L F., Maudoux 0., Udvardi M. K., Day D. A. Localization of H+-ATPase in soybean root nodules // Planta, 1999, Vol. 209, P. 25-32.

70. Fraysse N, Conderc F., Poinsot V. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis // Eur. J. Biochem., 2003, Vol. 270, P. 1365-1380.

71. Gao X. Q., Li C. G., Wei P. C., Zhang X. Y., Chen J., Wang X. С The dynamic changes of tonoplasts in guard cells are important for stomatal movement in Vicia faba//Plant Physiol., 2005, Vol. 139, P. 1207-1216.

72. Garin J., Diez R., Kieffer S., Dermine J. F., Duclos S, Gagnon E, Sadoul R, Rondeau C., Desjardins M. The phagosome proteome: Isight into phagosome functions //J. Cell Biol., 2001, Vol. 152, P. 165-180.

73. Gazarini M. L., Thomas A P, Pozzan Т., Garcia C. R. S Calcium signaling in a low calcium environment: how the intracellular malaria parasite solves the problem//J. Cell Biol., 2003, Vol. 161, P. 103-110.

74. Geisler M., Axelsen К В., Harper J. F., Palmgren M. G. Molecular aspects of higher plant P-type Ca2+-ATPases // Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1465, P. 52-78.

75. Goerlach J., Willms-Hoff I. Glycine uptake into barley mesophyll vacuoles is regulated but not energized by ATP // Plant Physiol., 1992, Vol. 99, P. 134-139.

76. Gong X. Q., Bisson M. A. Acetylcholine-activated СГ channel in the Chara tonoplast//J. Membr. Biol., 2002, Vol. 188, P. 107-113.

77. Goodchild D. J., Bergersen F. J. Electron microscopy of the infection and subsequent development of soybean nodule cells // J. Bacterid., 1966, Vol. 92, P. 204213.

78. Hara-Nishimura /., Hatsugai N., Nakaune S., Kuroyanagi M., Nishimura M. Vacuolar processing enzyme: an executor of plant cell death // Curr. Opin. Plant Biol., 2005, Vol. 8, P. 404-408.

79. Harper J F., Hong В. M., Hwang I. D., Guo H. Q., Stoddard R, Huang J F, Pal-mgren M G., Sze H. A novel calmodulin-regulated Ca2+-ATPase (ACA2) from Arabidopsis with an N-terminal autoinhibitory domain // J. Biol. Chem., 1998, Vol. 273, P. 1099-1106.

80. Harris J. M., Wais R., Long S. R Rhizobium-induced calcium spiking in Lotus ja-ponicus // Mol. Plant Microbe Interact., 2003, Vol. 16, P. 335-341.

81. Hatsugai N, Kuroyanagi M, Nishimura M, Hara-Nishimura I A cellular suicide strategy of plants: vacuole-mediated cell death // Apoptosis, 2006.

82. Hayashi Т., Harada A., Sakai T, Takagi S Ca2r transient induced by extracellular changes in osmotic pressure in Arabidopsis leaves: differential involvement of cell wall-plasma membrane adhesion // Plant, Cell Envir., 2006, Vol. 29, P. 661-672.

83. Hedrich R., Flugge U. I., Fernandez J. M, Patch-clamp studies of ion transport in isolated plant vacuoles // FEBS Lett., 1986, Vol. 204, P. 228-232.

84. Hedrich R., Neher E. Cytoplasmic calcium regulates voltage-dependent ion channels in plant vacuoles //Nature, 1987, Vol. 329, P. 833-836.

85. Hernandez L. E., Cooke D T. Lipid composition of symbiosomes from pea root nodules // Phytochemistry, 1996, Vol. 42, P. 341-346.

86. Heyen B.J., Alsheikh M K, Smith E. A., Torvik С F., Seals D. F, Randall S. К The calcium-binding activity of a vacuolar-associated, dehydrin-like protein is regulated by phosphorylation // Plant Physiol., 2002, Vol. 130, P. 675-687.

87. Hirschi К Vacuolar H /Са transport: who's directing the traffic? // Trends Plant Sci., 2001, Vol. 6, P. 100-104.

88. Hong В., IchidaA., Wang Y., Gens J. S., Pickard B. G., Harper J F. Identification of a calmodulin-regulated Ca2+-ATPase in the endoplasmic reticulum // Plant Physiol., 1999, Vol. 119, P. 1165-1176.

89. James P, Vorherr Т., Carafoli E. Calmodulin-binding domains: just two-faced or multifaceted?//TrendsBiochem. Sci., 1995, Vol. 20, P. 38-42.

90. Jurado L. A , Chockalingam P S, Jarrett H W Apocalmodulin // Physiol. Rev., 1999, Vol. 79, P. 661-682.

91. Kaiser B.N., Moreau S., Castelli J., Thompson R., Lambert A., Boglioto S., Puppo A , Day D. A. The soybean NRAMP homologue GmDMTl, is a symbiotic divalent metal transporter capable of ferrous iron transport // Plant J., 2003, Vol. 35, P. 295304.

92. Katsuhara M, Mimura Т., Tazawa M ATP-regulated ion channels in the plasma membrane of a characeae alga Nitellopsis obtuse II Plant Physiol., 1990, Vol. 93, P. 343-346.

93. Katz D В, Suss man M R, Mierzwa R. J., Evert R. F. Cytochemical localization of ATPase activity in oat roots localizes a plasma membrane-associated soluble phosphatase, not the proton pump // Plant Physiol., 1988, Vol. 86, P. 841-847.

94. Kijne J. W. The fine structure of pea root nodules. I. Vacuolar changes after endo-cytotic host cell infection by Rhizobium leguminosarum. II Physiol. Plant Pathol., 1975, Vol. 5, P. 75-79.

95. Kim K. J., Na Y. E., Jeon К W. Bacterial endosymbiont-derived lipopolysaccarides and a protein on symbiosome membranes in newly infected amoebae and their roles in lysosome-symbiosome fusion // Infect Immun., 1994, Vol. 62, P. 65-71.

96. Kurosaki F., Role of inward Ю channel located at carrot plasma membrane in signal cross-talking of cAMP with Са2т cascade // FEBS Lett., 1997, Vol. 408, P. 115-119.

97. Kutsuna N., Hasezawa S. Morphometrical study of plant vacuolar dynamics in single cells using three-dimensional reconstruction from optical sections // Mic-rosc. Res. Tech., 2005, Vol. 68, P. 296-306.

98. Kuznetsov VI. V., Andreev I. M., Trofimova M. S The synthesis of HSPs in sugar beet suspension culture cells under hyperthermia exhibits differential sensitivity to calcium //Biochem. Mol. Biol. Int., 1998, Vol. 45, P. 269-278.

99. Maathuis F. J. M., Sanders D. Mechanisma of potassium absorption by higher plant roots // Physiol. Plant., 1996, Vol. 96, P. 158-168.

100. MacRobbie E A. C. Osmotic effects on vacuolar ion release in guard cells // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 2006, Vol. 103, P. 1135-1140.

101. Maeshima M, Poole R J. Vacuolar H+-translocating pyrophosphatase // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1993, Vol. 44, P. 157-180.

102. Maeshima M, Vacuolar ^-pyrophosphatase // Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1465, P. 37-51.

103. Maeshima M. Tonoplast transporters: organization and function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 2001, Vol. 52, P. 469-497.

104. Malmstrom S., Askerlund H E., Askerlund P. Regulatory role of the N terminus of the vacuolar calcium-ATPase in cauliflower // Plant Physiol., 2000, Vol. 22, P. 517-526.

105. Malmstrom S, Askerlund P., Palmgren M. G A calmodulin-stimulated Ca2+-ATP-ase from plant vacuolar membranes with a putative regulatoiy domain at its N-ter-minus// FEBS Lett., 1997, Vol. 400, P. 324-328.

106. Martinoia E., Massonneau A., Frangne N. Transport processes of solutes across the vacuolar membrane of higher plants // Plant Cell Physiol., 2000, Vol. 41, P. 1175-1186.

107. Maser P, Thomine S, Schroeder J. I., Ward J M, Hirschi К, Sze H, Talke I N, Amtmann A , Maathuis F. J M, Sanders D et al Phylogenic relationships within cation transporter families of Arabidopsis // Plant Physiol., 2001, Vol. 126, P. 1646-1667.

108. Masuda E. S., Imamura R., Amasaki Y., Arai K., Arai N. Signalling into the T-cell nucleus: NFAT regulation // Cell Signal., 1998, Vol. 10, P. 599-611.

109. Matile P. Biochemistry and function of vacuoles // Annu. Rev. Plant Physiol., 1978, Vol. 29, P. 193-213.

110. Mellor R B. Bacteroids in the Rhizobium-legumQ symbiosis inhabit a plant internal lytic compartment: implications for other microbial endosymbioses // J. Exp. Bot., 1989, Vol.40, P. 831-839.

111. Mellor R В., Werner D. Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules// Symbiosis, 1987, Vol. 3, P. 75-100.

112. Meresse S, Steele-Mortimer O., Finlay В. В., Gorvel J.-P. The rab7 GTPase controls the maturation of Salmonella typhimurium-containing vacuoles in HeLa cells // EMBO J., 1999, Vol. 18, P. 4394-4403.

113. Meresse S., Steele-Mortimer O., Moreno E., Desjardins M., Finlay В, Gorvel J P Controlling the maturation of pathogen-containing vacuoles: a matter of life and death//Nat. Cell Biol., 1999, Vol. 1, P. E183-E188.

114. Miao G H., Hong Z, Verma D. P. S Topology and phosphorylation of soybean nodulin-26, an intrinsic protein of the peribacteroid membrane // J. Cell Biol., 1992, Vol. 118, P. 481-490.

115. Mithofer A Suppression of plant defence in rhizobia-legume symbiosis // Trends Plant Sci., 2002, Vol. 7, P. 440-444.

116. Мог гаи S, Thompson R. М., Kaiser В. N., Trevaskis В., Guerinot M. L , Udvardi M. K, Puppo A., Day D. A. GmZIPl encodes a symbiosis-specific zinc transporter in soybean // J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, P. 4738-4746.

117. Mylona P., Pawlowski K., Bisseling T. Symbiotic nitrogen fixation // The Plant Cell, 1995, Vol. 7, P. 869-885.

118. Natalie С, Strynadka J., James M. N. G. Crystal structure of the helix-loop-helix calcium-binding proteins // Annu. Rev. Biochem., 1989, Vol. 58, P. 951-958.

119. Nazarenko L. V, Andreev I M., Lyukevich A. A., Pisareva Т. V., Los D A. Calcium release from Synechocystis cells induced by depolarization of the plasma membrane: MscL as an outward Ca2+ channel // Microbiology, 2003, Vol. 149, P. 1147-1153.

120. Niggli V., Adunyah E. S, PennistonJ. Т., Carafoli E Purified (Ca2+-Mg2+)-ATPase of the erythrocyte membrane. Reconstitution and effect of calmodulin and phospholipids//J. Biol. Chem., 1981, Vol. 256, P. 395-401.

121. Ou Yang L -J., Day D A Transport properties of symbiosomes isolated from sirat-ro nodules // Plant Physiol. Biochem., 1992, Vol. 30, P. 613-623.

122. Ouyang L -J. Whelan J, Weaver C. D, Roberts D M, Day D A Protein phosphorylation stimulates the rate of malate uptake across the peribacteroid membrane of soybean nodules//FEBS Lett., 1991, Vol. 293, P. 188-190.

123. Palmgren M. G. Acridine orange as a probe for measuring pH gradients across membranes: mechanism and limitations // Anal. Biochem., 1991, Vol. 192, P. 316321.

124. Panter S, Thomson R., de Bruxelles G., Laver D., Trevaskis В., Udvardi M. Identification with proteomics of novel proteins associated with the peribacteroid membrane of soybean root nodules // Mol. Plant-Microbe Interact., 2000, Vol. 13, P. 325-333.

125. Parniske M Intacellular accommodation of microbes by plants: a common developmental program for symbiosis and disease? // Curr. Opin. Plant Biol., 2000, Vol. 3, P. 320-328.

126. Pei Z. M, Ward J. M., Schroeder J. I. Magnesium sensitizes slow vacuolar channels to physiological cytosolic calcium and inhibits fast vacuolar channels in fava bean guard cell vacuoles // Plant Physiol., 1999, Vol. 121, P. 977-986.

127. Peiter E., Imani J, Yan F., Schubert S. A novel procedure for gentle isolation and separation of intact infected and uninfected protoplasts from the central tissue of Vicia faba L. root nodules // Plant, Cell and Environment, 2003, Vol. 26, P. 11171126.

128. Pittman J. K., Shigaki Т., Cheng N.-H, Hirschi K. D. Mechanism of N-terminal autoinhibition in the Arabidopsis Ca2+/H^ antiporter CAX1 // J. Biol. Chem., 2002a, Vol. 277, P. 26452-26459.

129. Pittman J. К, Sreevidya С S, Shigaki Т., Ueoka-Nakanishi H, Hirschi K. D. Distinct N-terminal regulatory domains of Ca 7HT antiporters // Plant Physiol., 2002b, Vol. 130, P. 1054-1062.

130. Plieth С. Plant calcium signaling and monitoring proc and cons and recent experimental approaches // Protoplasma, 2001, Vol. 218, P. 1-23.

131. Plieth C. Calcium: just another regulator in the machinery of life? // Ann. Bot., 2005, Vol. 96, P. 1-8.

132. Qi Z, Kishigami A., Nakagawa Y., Iida H, Sokabe M. A mechanosensitive anion channel in Arabidopsis thaliana mesophyll cells // Plant and Cell Physiol., 2004, Vol. 45, P. 1704-1708.

133. Ramahaleo Т., Alexandre J., Lassalles J-P. Stretch activated channels in plant cells. A new model for osmoelastic coupling // Plant Physiol. Biochem., 1996, Vol. 34, P. 327-334.

134. Rao A., Luo C., Hogan P. G. Transcription factors of the NFAT family: regulation and function // Annu. Rev. Immunol., 1997, Vol. 15, P. 707-747.

135. Rathbun W. В., Betlach M. V. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate // Anal. Biochem., 1969, Vol. 28, P. 436-445.

136. ReddyA S N Calcium: silver bullet in signaling // Plant Science, 2001, Vol. 160, P. 381-404.

137. Reifarth F. W, Weiser Т., Bentrup F. W. Voltage- and Ca2r-dependence of the Ю channel in the vacuolar membrane of Chenopodium rubrum L. suspension cells // Biochim. Biophys. Acta, 1994, Vol. 1192, P. 79-87.

138. Reisen D., Marty F., Leborgne-Castel N. New insights into the tonoplast architecture of plant vacuoles and vacuolar dymamics during osmotic stress // BMC Plant Biology, 2005, Vol. 5, P. 1-13.

139. Rhoads A. R., Friedberg F. Sequence motifs for calmodulin recognition // FASEB J., 1997, Vol. 11, P. 331-340.

140. Rivers R. L, Dean R M., Chandy G., Hall J. E., Roberts D. M., Zeidel M. L Functional analysis of nodulin 26, an aquaporin in soybean root nodule symbioso-mes // J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, P. 16256-16261.

141. Roberts S K. Plasma membrane anion channels in higher plants and their putative functions in roots // New Phytol., 2006, Vol. 169, P. 647-666.

142. Roberts D. M., Tyerman S. D Voltage-dependent cation channels permeable to NH4+, K+, and Ca2+ in the symbiosome membrane of the model legume Lotus japo-nicus // Plant Physiol., 2002, Vol. 128, P. 370-378.

143. Saalbach G., Erik P., Wienkoop S Characterization by proteomics of peribacteroid space and peribacteroid membrane preparations from pea (Pisum sativum) symbio-somes // Proteomics, 2002, Vol. 2, P. 325-337.

144. Sanders D., Brownlee C., Harper J. F. Communicating with calcium // Plant Cell, 1999, Vol. 11, P. 691-706

145. Scarpa A. Measurement of cation transport with metallochromic indicators // Methods Enzymol., 1979, Vol. 56, P. 301-337.

146. Schulz-Lessdorf В, Lohse G, Hedrich R GCAC1 recognizes the pH gradient across the plasma membrane: a pH-sensitive and ATP-dependent anion channel linksguard cell membrane potential to acid and energy metabolism // Plant J., 1996, Vol. 10, P. 993-1004.

147. Schuurink R. C., Chan P. V., Jones R. L. Modulation of calmodulin mRNA and protein levels in barley aleurone // Plant Physiol., 1996, Vol. 111, P. 371-380.

148. Schuurink R C., Shartzer S F., Fath A., Jones R. L Characterization of a calmo-dulin-binding transporter from the plasma membrane of barley aleurone // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1998, Vol. 95, P. 1944-1949.

149. Shi H Z, Ishitani M, Kim C. S., Zhu J. K. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter // Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, Vol. 97, P. 6896-6901.

150. Sinai A. P., Joiner K. A. Safe haven: the cell biology of nonfusogenic pathogen vacuoles//Annu. Rev. Microbiol., 1997, Vol. 51, P. 415-462.

151. Snedden W A., H Fromm Calmodulin as a versatile calcium signal transducer in plants//New Phytologist, 2001, Vol. 151, P. 35-66.

152. Spalding E P., Goldsmith M. Activation of 1С channels in the plasma membrane of Arabidopsis by ATP produced photosynthetically // The Plant Cell, 1993, Vol. 5, P. 477-484.

153. Streeter J G. Integration of Plant and Bacterial Metabolism in Nitrogen Fixing Systems // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications, Tichonovich et al. (ed.), Dordrecht etc.: Kluwer Acad. Publ., 1995, pp. 67-76.

154. Sutton J. M., Lea E. A., Downie J A. The nodulation-signaling protein NodO from Rhizobium leguminosarum biovar viciae forms ion channels in membranes // Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, Vol. 91, P. 9990-9994.

155. Szafran M. M, Haaker H Properties of the peribacteroid membrane ATPase of pea root nodules and its effect on the nitrogenase activity // Plant Physiol., 1995, Vol. 108, P. 1227-1232.

156. Sze H, Liang F., Hwang /., Curran А. С, Harper J. F. Diversity and regulation of plant Са2т pumps: insights from expression in yeast // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 2000, Vol. 51, P. 433-462.

157. Szewczyk A., Pikuta S. Adenosine 5'-trisphosphate: an intracellular metabolic messenger//Biochem. Biophys. Acta, 1998, Vol. 1365, P. 333-353.

158. Tikhonova L I, Pottosin I. I., Dietz K. J., Schonknecht G Fast-activating cation channels in barley mesophyll vacuoles. Inhibition by calcium. // Plant J., 1997, Vol. 11, P. 1059-1070.

159. Thomas M. V Metallochromic indicators, In: Techniques in Calcium Research, London: Academic Press, 1982, pp. 90-138.

160. Thomine S, ZimmermannS, Guem J., Barbier-Brygoo H. ATP-dependent regulation of an anion channel at the plasma membrane of protoplasts from epidermal cells of Arabidopsis hypocotyls//Plant Cell, 1995, Vol. 7, P. 2091-2100.

161. Thomine S, Guern J., Barbier-Brygoo H Voltage-dependent anion channel of Arabidopsis hypocotyls: nucleotide regulation and pharmacological properties // J. Membrane Biol., 1997, Vol. 159, P. 71-82.

162. Trinchant J.-C., Yang Y.-S, RigaudJ. Proline accumulation inside symbiosomes of faba bean nodules under salt stress // Physiol. Plant., 1998, Vol. 104, P. 38-49.

163. Trinchant J-C, Boscari A., Spennato G., Van de Sype G., Le Rudulier D. Proline betaine accumulation and metabolism in alfalfa plants under sodium chloride stress. Exploring its compartmentalization in nodules // Plant Physiol., 2004, Vol. 135, P. 1-12.

164. Trinick M. J Biology. In: Broughton W. J. (ed.): Nitrogen Fixation, Vol. 2, Rhi-zobium Clarendon Press, Oxford, 1982, pp. 76-146.

165. Trofimova M. S., Andreev I. M., Kuznetsov VI. V. Calcium is involved in regulation of the synthesis of HSPs in suspension-cultured sugar beet cells under hyperthermia//Physiol. Plant., 1999, Vol. 105, P. 67-73.

166. Tyerman S D., Whitehead L F., Day D. A. A channel-like transporter for NH/ on the symbiotic interface of N2-fixing plants // Nature, 1995, Vol. 378, P. 629-632.

167. Udvardi M. K., Day D A. Electrogenic ATPase activity on the peribacteroid membrane of soybean (Glycine max L.) root nodules // Plant Physiol., 1989, Vol. 90, P. 982-987.

168. Udvardi M K., Lister D L , Day D. A. ATPase activity and anion transport across the peribacteroid membrane of isolated soybean symbiosomes // Arch. Microbiol., 1991, Vol. 156, P. 362-366.

169. Van Eldik L J, Watterson D M Calmodulin and Signal Transduction, New York, USA: Academic Press, 1998.

170. Vantard M., Lambert A. M., De Mey J., Picquot P., Van Eldik L. J. Characterization and immunocytochemical distribution of calmodulin in higher plant endosperm: localization in the mitotic apparatus // J. Cell Biol., 1985, Vol. 101, P. 488499.

171. Venema K., Quintero F. J., Pardo J. M., Donaire J. P. The Arabidopsis Na+/H+ exchanger AtNHXl catalyses low affinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes // J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, P. 2413-2418.

172. Very A -A , Sentenac H Molecular mechanisms and regulation of K+ transport in higher plants // Annu. Rev. Plant Biol., 2003, Vol. 54, P. 575-603.

173. Verhaert J., Vanderleyden J., Michiels J. Bacterial Endocytic Systems in Plants and Animals: Ca2+ as a Common Theme? 11 Crit. Rev. Plant Sci., 2005, Vol. 24, P. 283-308.

174. Verma D P. S, Cheon С -I, Hong Z Small GTP-binding proteins and membrane biogenesis in plants // Plant Physiol., 1994, Vol. 106, P. 1-6.

175. Verma D P. S, Hong Z Biogenesis of the peribacteroid membrane in root nodules //Trends Microbiol., 1996, Vol. 4, P. 364-368.

176. Vincent J. M., Humphrey В A. Partition of divalent cations between bacterial wall and cell content//Nature, 1963, Vol. 199, P. 149-151.

177. Wada Y, Ohsumi Y., Anraku Y Chloride transport of yeast vacuolar vesicles: a study of in vitro \acuolar acidification // Biochem. Biophys. Acta, 1992, Vol. 1101, P. 296-302.

178. Waggoner A. S. Dye indicators of membrane potential // Annu. Rev. Biophys. Bi-oeng., 1974, Vol. 8, P. 47-68.

179. Walker S. A., Viprey V., DownieJ. A. Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers // Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, Vol. 97, P. 13413-13418.

180. Ward J M, Schroeder J. I. Calcium-activated K+ channels and calcium-induced calcium release by slow vacuolar ion channels in guard cell vacuoles implicated in the control of stomatal closure // Plant Cell, 1994, Vol. 6, P. 669-683.

181. Weaver C. D., Shomer N. H., Louis C. F., Roberts D M. Nodulin 26, a nodule-specific symbiosome membrane protein from soybean, is an ion channel // J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, P. 17858-17862.

182. Werner D., Kuhlmann K. P., Gloystein F, Richter F. W Calcium, iron and cobalt accumulation in root hairs of soybean // Z. Naturforsh., 1985, Vol. 40c, P. 912913.

183. WickS M., Hepler P. К Selective localization of intracellular Ca2+ with potassium antimonite//J. Histochem. Cytochem., 1982, Vol. 30, P. 1190-1204.

184. Wienkoop S., Saalbach G. Proteome analysis: novel proteins identified at the peribacteroid membrane from Lotus japonicus root nodules // Plant Physiology, 2003, Vol. 131, P. 1080-1090.

185. Wink M The plant vacuole. A multifunctional compartment // J. Exp. Bot., 1993, Vol.44(suppl.), P. 231-246.

186. Whitehead L F., Day D. A The peribacteroid membrane // Physiol. Plant., 1997, Vol. 100, P. 30-44.

187. Yamaguchi T, Aharon G. S., Sottosanto J. В., Blumwald E Vacuolar Na+/H+ antiporter is regulated by calmodulin from within the vacuole in a Ca2+- and pH-dependent manner // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 2005, Vol. 102, P. 1610716112.

188. Yuasa К, Maeshima M. Purification, properties and molecular cloning of a novel Ca2'-binding protein in radish vacuoles // Plant Physiol., 2000, Vol. 124, P. 10691078.

189. Zhang H-X., Blumwald E. Transgenic salt tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit // Nat. Biotechnol., 2001, Vol. 19, P. 765-768.

190. Zhang Y, Roberts D. M. Expression of soybean nodulin 26 in transgenic tobacco. Targeting to the vacuolar membrane and effects on floral and seed development // Mol. Biol. Cell, 1995, Vol. 6, P. 109-117.

191. ZuhlkeR D., Pitt G S., Deisseroth K., TsienR. W, Reuter H Calmodulin supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels // Nature, 1999, Vol. 399, P. 159-162.

192. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

193. Андреев И М., Кореньков В. Д., Молотковский Ю. Г. Выделение и АТФазная активность интактных вакуолей и вакуолярных мембран из листьев города // Физиология растений, 1985, том 32, N 1, С. 5-14.

194. Андреев И. М., Андреева И. Н., Дуброво П. Н., Крылова В. В., Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф. Кальциевый статус симбиосом люпина желтого как потенциальный регулятор их нитрогеназной активности // Физиология растений, 2001, том 48, N 3, С. 364-374.

195. Aderem A., Underbill D. М. Mechanisms of phagocytosis in macrophages // Annu. Rev. Immun., 1999, Vol. 17, P. 593-623.

196. Andreev I. M., Dubrovo P. N., Krylova V. V., Izmailov S. F. Functional identification of ATP-driven Ca pump in the peribacteroid membrane of broad bean root nodules // FEBS Lett., 1999, Vol. 447, P. 49-52.

197. Bassham D. C., Raikhel N V. Unique features of the plant vacuolar machinery // Curr. Opin. Cell Biol., 2000, Vol. 12, P. 491-495.

198. Fortin M. G., Morrison N. A., Verma D. P. S. Nodulin 26. a peribacteroid membrane nodulin, is expressed independently of the development of the peribacteroid membrane //Nucleic Acids Res., 1987, Vol. 15, P. 813-824.

199. Johannes E., Croft A., Sanders D. Control of СГ efflux in Chara corallint by1cytosolic pH, free Ca and phosphorylation indicates a role of plasma membrane anion channels in cytosolic pH regulation // Plant Physiol., 1998, Vol. 118, P. 173181.

200. Schroeder J. I. Anion channels as central mechanisms for signal transduction in guard cells and putative functions in roots for plant-soil interactions // Plant Mol. Biol., 1995, Vol. 28, P. 353-361.

201. Shepherd V. A., Beilby M. J., Shimmen T. Mechanosensory ion channels in charo-phyte cells: the response to touch and salinity stress // Eur. Biophys. J., 2002, Vol. 31, P. 341-355.

202. Vitale A., Raikhel N. V. What do proteins need to reach different vacuoles? // Trends Plant Sci., 1999, Vol. 4, P. 149-155.

203. Weaver C. D., Crombie В., Stacey G., Roberts D. M. Calcium-dependent phosphorylation of symbiosome membrane proteins from nitrogen-fixing soybean nodules // Plant Physiol., 1991, Vol. 95, P. 22-227.

204. White P. J. Calcium channels in higher plants // Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1465, P. 171-189.

205. White P. J., Broadley M. R. Calcium in plants // Ann. Bot., 2003, Vol. 92, P. 487511.

206. Zhou X.-L., Batiza A. F., Loukin S. H., Palmer C. P., Kung C., Saimi Y. The transient receptor potential channel on the yeast vacuole is mechanosensitive // Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, Vol. 100, P. 7105-7110.

207. Zimmermann S., Thomine S., Guem J., Barbier-Brygoo H. An anion current at the plasma-membrane of tobacco protoplasts shows ATP-dependent voltage regulation and is modulated by auxin // Plant J., 1994, Vol. 6, P. 707-716.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Андреев, Игорь Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Механизмы и регуляция транспорта ионов через вакуолярную и перибактероидную мембраны растительных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы