Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт Ca2+ через перибактероидную мембрану, его аккумуляция в симбиосомах и включение в контроль нитрогеназной активности в корневых клубеньках бобов и люпина желтого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Транспорт Ca2+ через перибактероидную мембрану, его аккумуляция в симбиосомах и включение в контроль нитрогеназной активности в корневых клубеньках бобов и люпина желтого"

На правах рукописи

КРЫЛОВА Валерия Валерьевна

ТРАНСПОРТ Са2+ ЧЕРЕЗ ПЕРИБАКТЕРОИДНУЮ МЕМБРАНУ, ЕГО АККУМУЛЯЦИЯ В СИМБИОСОМАХ И ВКЛЮЧЕНИЕ В КОНТРОЛЬ НИТРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКАХ БОБОВ И ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО

(03.00.12 - физиология и биохимия растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории азотного обмена Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

Научный руководитель:

доктор биол. наук, профессор

Измайлов Станислав Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор доктор биол. наук, профессор

Балнокин Юрии Владимирович Евстегнеева Зинаида Гавриловна

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В.Цицина РАН

Защита диссертации состоится 1 июня 2004 г. в И00 часов на заседании диссертационного совета К 002.210.01. по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 9778018; электронная почта: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН. Автореферат разослан апреля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы

- глобальный процесс, от которого зависит существование всех форм жизни на Земле. Одной из важнейших составляющих этого процесса является симбиотическая азотфиксация растениями, от расшифровки механизмов которой зависит решение целого ряда таких крупных общечеловеческих задач как увеличение продуктивности и урожайности сельскохозяйственных культур, ликвидация на этой основе дефицита пищевого и кормового белка, экологическое улучшение и повышение плодородия почв за счет обогащения их биологическим азотом, снижения применения дорогостоящих и небезопасных азотных удобрений и др.

Приоритетным направлением в разработке проблемы симбиотической фиксации азота растениями является изучение механизмов взаимодействия партнеров симбиоза

- главном факторе, определяющем эффективность азотфиксации. Новым подходом на этом пути явились разработки, результаты которых позволяют совершенно по-новому трактовать взаимоотношения симбионтов на уровне пространственно разобщающих их зон - перибактероидной мембраны (ПБМ) и перибактероидного пространства (ПБП). Стимулом к изучению этих вопросов послужил тот факт, что если в азотфиксирующей системе бобовых не формируется ПБМ, то такая система по азотфиксирующему признаку оказывается неэффективной.

Несмотря на достигнутый прогресс в понимании роли ПБМ в регуляции симбиотических взаимоотношений на уровне метаболитов (Измайлов, 1996; Udvaгdi et э1., 1997), до сих пор ограничены представления о вкладе данной мембраны в контроле ионных потоков, в частности ионов кальция. Остаются неясными вопросы, связанные с механизмами транспорта Са2+ через симбиотическую мембрану, созданием Са-дискретных пулов в инфицированной клетке, участием этого катиона в регуляции ключевых процессов, направленных на реализацию азотфиксирующих свойств всей симбиотической системы, и тем самым в установлении мутуалистического типа взаимоотношений про- и эукариотических клеток.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении механизмов участия кальция во взаимоотношениях про- и эукариотических клеток клубеньков через симбиотическую — ПБМ, направленных на реализацию азотфиксирующей активности симбиотических систем люпина желтого и бобов.

В связи с этим разрабатывались следующие проблемы:

1. Компартментация кальция в неинфицированных и инфицированных клетках корневых клубеньков.

2. Роль симбиосомы в запасании кальция в инфицированных клетках клубеньков.

3. Идентификация и характеристика локализованных на ПБМ Са-транспортных систем: Са -транслоцирующей АТФазы, Са-каналов.

4. Сопряженность процессов аккумуляции Са2> симбиосомой и его включения в контроль нитрогеназной активности клубеньков.

5. Механизмы действия Са2+ на процессы, определяющие азотфиксирующую активность клубеньков.

Научная новизна. Экспериментально обосновано принципиально новое положение о том, что мутуалистические взаимоотношения про- и эукариотических

I ГОС. НАЦИОНАЛЬНА* БИБЛИОТЕКА СПтрвиг мЛ' О» /¿Ь

клеток, направленные на реализацию азотфиксирующей активности бобово-ризобиального симбиоза, достигаются за счет регулируемого транспорта через ПБМ • не только метаболитов, но и ионов, в частности кальция. При этом в инфицированной клетке наблюдается отличная от неинфицированной клетки клубенька компарментация Са, где симбиосома - азотфиксирующая единица, выполняет Са-депонирующую функцию. Впервые показано, что на ПБМ азотфиксирующих клеток люпина желтого и бобов функционирует Са2+-транслоцирующая АТФаза, обеспечивающая активный транспорт иона в симбиосому. Обнаружен верапамил-чувствительный кальциевый транспортер, через который осуществляется пассивный выход Са2+ из симбиосом в цитозоль растительной клетки. Дана характеристика указанных Са-транспортных систем ПБМ, при участии которых может достигаться создание необходимого Са-гомеостаза в цитозоле инфицированной растительной клетки, а также оптимизация уровня Са2+ в симбиосомах, прежде всего, в бактероидах. Впервые показано, что это имеет важное значение для регуляции нитрогеназной активности.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследований созданы новые представления о механизмах взаимоотношений партнеров симбиоза, что вносит существенный вклад в современное понимание роли ПБМ и локализованных на ней Са-транспортных систем в регуляции этих отношений. Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что при рациональном снабжении растений кальцием достигается оптимизация взаимоотношений между партнерами симбиоза и, соответственно, регулируется процесс симбиотической азотфиксации. Изменяя условия обеспечения бобового растения кальцием, варьируя соотношение его и калия, можно регулировать соотношение энергозатрат на рост вегетативной массы и массы клубеньков при высокой ^-фиксации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции «Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений» (Тернополь, 1991), 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), 10-ом международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), IV-ом съезде ВОФР (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа и 1 находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, объекты и методы исследования, экспериментальная часть), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой литературы включает 235 публикаций, из них 183 зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили растения люпина желтого (Lupinus luteus L) сорта Факел, Брянский-27 и бобов (Viciafaba L.) сорта Русские Черные. Растения выращивали в песчаной культуре в условиях вегетационного домика или в-кондиционированной оранжерее Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. После стерилизации семена люпина инокулировали эффективным штаммом Bractyrhizobium lupini 359а и неэффективным - 400, а бобов -

эффективными штаммами Rh izobium legum inosarum 23,501,419 и слабоэффективным - 410. После появления всходов на 7 и 21 сутки проводили две корневые подкормки растений, внося по Уг нормы модифицированной безазотной среды Кнопа и Уг нормы микроэлементов - по Ринькису (Ринькис, с 15. 1982). Нитрат (KNO3 и Ca(NO3)2) из расчета У* нормы среды Кнопа (3,6 мМ) содержала только первая подкормка. Для опытов использовали растения в фазе бутонизации - начала цветения (возраст 46-48 суток), когда азотфиксация клубеньков была максимальной (Андреева и др., 1992).

Получение фракции симбиосом, бактероидов, везикул ПБМ проводили при +4°С путем центрифугирования гомогената корневых клубеньков в ступенчатом градиенте перкола - 10, 25, 50% для эффективных клубеньков люпина желтого и 10,25 и 60% для эффективных клубеньков бобов. Суспензию симбиосом подвергали гипоосмотическому шоку и затем центрифугировали в двуступенчатом градиенте сахарозы 25/40%. Фракцию везикул ПБМ собирали на интерфейсе 25/40% сахарозы, бактероиды - в осадке. Процедуры выделения проводили по разработанной нами методике (Дуброво и др., 1992). Белок во фракции симбиосом, бактероидов, везикул определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), предварительно обрабатывая их 0,05%-ным Тритоном Х-100, и используя в качестве стандарта сывороточный альбумин.

Регистрацию на ПБМ мембранного потенциала (Ду) и трапемембранного градиента рН(ДрН) осуществляли по изменению разности поглощений при 590 и 610 нм и 492 и 540 нм потенциал- чувствительного зонда оксонола VI (Apell, Bersch , 1987) и проникающего ДрН-индикатора акридинового оранжевого (Palmgren , 1991), соответственно. Оптические измерения проводили на спектрофотометре Hitachi-557(Япония). В случае регистрации Ау по изменению флуоресценции оксонола VI измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония). Длина волны возбуждающего света составляла 680 нм, а испускаемого - 630 нм.

Регистрация поглощения Са2+ симбиосомами и везикулами ПБМ, а таже его выхода из симбиосом основывалась на изменении разностей поглощений при 720 и 650 нм (А 72эб5о) непроникающего через биологические мембраны Са2+-индикатора арсеназо Ш (Thomas, 1982). Измерения проводили на спектрофотометре Hitachi 557. Концентрация белка в препаратах составляла примерно 80-150 мкг.

Регистрацию активного транспорта Са2+ через ПБМ изолированных симбносом проводили по изменению флуоресценции при 530 нм проникающего через мембраны Са2+-индикатора хлортетрациклина (Dixon et al., 1984), возбуждая её светом при 380 нм, на спектрофлуориметре Hitachi-850. Концентрация белка в препаратах симбиосом составляла примерно 50 мкг.

Определение аккумуляции кальция в клетках клубеньков и симбиосомах осуществляли на основе его цитохимической реакции с пироантимонатом калия (ПА) (Wick et al.,1982). Срезы клубеньков (1-2 мкм) и суспензию симбиосом фиксировали в водном растворе смеси 2% OsO4 и 4%-ного ПА (1:1) 1ч при +4°С. После промывки и обезвоживания препараты полимеризовали в смеси эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали 1-2 мин на сеточках цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM 100 СХ ("JEOL", Япония).

О наличии эндогенного пула кальция внутри изолированных симбиосом и бактероидов судили также по увеличению флуоресценции проникающего через ПБМ Са-индикатора хлортетрациклина, способного детектировать кальций в области

б

концентраций 0,1-30 мкМ (Dixon et al., 1984). Измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 при 530 нм, возбуждая ее" светом при 380 нм.

Определение нитрогеиазной активности клубеньков и изолированных из них симбиосом проводили по восстановлению ацетилена в этилен на газожидкостном хроматографе Chrom 4 ("KOVO", Чехия) согласно методике (Андреева и др., 1986). Состав сред инкубации и условия опыта подробно описаны в разделе «Объекты и методы исследований» диссертации.

Определение активности НАДН-завнсимой малатдегндрогепазы в цитозольной фракции клубеньков проводили по изменению абсорбции НАДН при 340 нм на спектрофотометре Specord M40 ("Carl Zeiss", Германия) согласно методике (Appels,Haaker,1988).

Осмотические изменения объема симбиосом в результате вариации в них уровня К+ регистрировали по изменению оптической плотности их суспензии при 546 нм на спектрофотометре Hitachi-557 в двухлучевом режиме.

1. КАЛЬЦИЙ-АККУМУЛИРУЮЩАЯ ФУНКЦИЯ СИМБИОСОМ

Компонентами Са2+- сталирующей системы цитоплазмы в растениях могут быть Са2+-помпы, Са2+/Н* антипортеры, Са+- каналы; источниками Са2* служат как внешняя среда, так и внутриклеточные компартменты, в первую очередь, вакуоль. Кроме того, Са-аккумулирующей способностью обладают и другие органеллы клетки — хлоропласты, митохондрии, ГЭР и др. В инфицированной Bhtobhan растительной клетке появляется принципиально новая временная «органелла» - симбиосома. До проведения наших исследований не было ответа на вопрос, каким образом биогенез этой структуры отражается на специфике компартментации (распределении и перераспределении) кальция в симбиосоме.

1.1. Визуализация внутриклеточного распределения Са2"1" в клубеньках при эффективном и неэффективном симбиозе с помощью электронномикроскопической цитохимии

Изучение распределения кальция в клубеньках проводили у люпина жёлтого при его содержании - 2, 3 и 6, а у бобов - 2,4.5,7 и 12 ммоль на сосуд. Оказалось, что при оптимуме, гипо- и гилерпитании кальцием характер внутриклеточного его распределения у обеих культур был сходным.

При эффективном симбиозе и гипопитании кальцием продукт реакции с пироантимонатом калия (Са-ПА) в виде мелких электронноплотных гранул был выявлен в цитоплазме бактериальной клетки, на поверхности ПБМ и в меньшей степени в ПБП (рис. 1а). В растительной клетке Са выявлялся в эухроматине ядра, в матриксе митохондрий, цистернах ГЭР, диктиосомах аппарата Гольджи, на плазмапемме, в цитозоле. При оптимальной дозе кальция указанная картина распределения катиона сохранялась (рис. 16), но его было больше на ПБМ, в ПБП и особенно в бактероидах. При гиперпитании кальцием его ещё больше было на ПБМ и в ПБП (рис. 1в). Появлялись клетки в состоянии деградации, где большое количество гранул с Са было хаотично расположено на всех структурах клетки (рис. 1г). Таким образом, различное обеспечение растений кальцием в процессе их роста отражалось на характере аккумуляции этого катиона в

симбиосомах. Основным Са-накапливающим компартментом инфицированной клетки являлась симбиосома

При неэффективном симбиозе (рис 2) ультраструктура инфицированных клеток резко изменялась. Происходило обеднение симбиосом кальцием, особенно бактероидов, увеличение объема ПБП и общего объема симбиосом в клетке Наблюдались деструктивные изменения бактероидов В растительной клетке уменьшались объем цитозоля и число органелл, депонирующих кальций Вероятно, происходило нарушение кальциевого гомеостаза инфицированной клетки. Обращает на себя внимание появление в цитоплазме мелких вакуолей, не характерных для инфицированных клеток люпина, в которых был выявлен кальций.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что при неэффективном симбиозе, в отличие от эффективного, симбиосома утрачивала функцию накопления кальция

1.2. Действие Савктивных соединений и экзогенного кальция на его симбиооэмальную

компашментацию

Доказательство Са-аккумулирующей способности симбиосом может быть достигнуто от обратного: при воздействии Са-активных агентов должна происходить потеря ранее запасенного кальция В качестве таких агентов использовали Са-ионофор А23187 и ЭГТА. После 2- и 4-часовой инкубации корней растений в буферной среде, содержащей ЭГТА и ионофор А23187 наблюдались явные симптомы обеднения симбиосом кальцием. Они выражались в заметно меньшем числе, по сравнению с контролем (Рис За), электронно-плотных гранул Са-ПА в бактероидах, в ПБП и на ПБМ симбиосом (Рис. 36) Наиболее сильный эффект имел место после 4-часовой инкубации корней в среде с Са-активными агентами, в результате которой бактероиды почти полностью лишались гранул Са-ПА; только в единичном числе они наблюдалось в ПБП и в существенно меньшем числе присутствовали на ПБМ симбиосом (Рис Зг) Некоторое снижение числа гранул Са-ПА наблюдалось в цитоплазме бактероидов и ПБП симбиосом и после 4-часовой инкубации корней в забуференной воде в отсутствие в ней выбранных Са-активных соединений (Рис. Зв)

РисЗ. Электронные

микрофотографии инфицированных

клеток клубеньков люпина.

а,б - фиксированные в присутствии

ПА после 2-часовой,

в,г - 4-часовой инкубации корней

растений в забуференной воде (а,в)

или в той же среде, содержащей

2мкМ Са-ионофора А23187 и 0 2

мМЭГТА(бд-).

Аналогичные признаки обеднения симбиосом люпина и бобов кальцием мы наблюдали и после совместного действия на них ЭГТА и ионофора А23187 в условиях in vitro . В результате такой обработки заметно снижалось, по сравнению с контролем, число электронно-плотных гранул Са-ПА как на наружной поверхности ПБМ и в ПБП симбиосом, так и внутри бактероидов Добавление 5 мМ СаС!2 к

изолированным симбиосомам, преинкубированных в течение 30 мин в той же среде в отсутствие ЭГТА, но в присутствии ионофора А23187, приводило к появлению большого числа электронно-плотных гранул Са-ПА на наружной поверхности ПБМ, хотя внутри симбиосом, а именно в ПБП и бактероидах, заметного увеличения числа таких гранул не обнаруживалось.

Экспериментальное подтверждение Са-аккумулирующей способности симбиосом было получено в опытах, выполненных на препаратах изолированных симбиосом и выделенных из них бактероидов. Добавление изолированных симбиосом бобов к Са-дефицитной среде, содержащей ЭГТА и Са2* -индикатор хлортетрациклин, инициировало значительное увеличение флуоресценции этого индикатора, которое достигало почти стационарного уровня только через 30-40 мин и в существенной степени обращалось при последующем добавлении к симбиосомам Са-ионофора А23187. Подобное изменение флуоресценции хлортетрациклина, но с гораздо более быстрой кинетикой этого процесса наблюдали и в случае изолированных бактероидов.

Таким образом, из вышесказанного следует, что симбиосомы имеют способность к аккумуляции кальция и поэтому могут быть важным внутриклеточным СаЛ-источником в процессе регуляции концентрации свободного кальция в цитозоле инфицированных клеток клубеньков.

2. ТРАНСПОРТ Са2+ ЧЕРЕЗ ПБМ

Согласно современным представлениям в клетке действует несколько механизмов транспорта кальция, одни осуществляют удаление избытка этого иона из цитозоля, а другие - способствуют его притоку за счёт открывания кальциевых каналов. До наших исследований вопрос о наличии и функционировании транспортных систем на ПБМ был практически не изучен.

2.1. Электронномикроскопическая визуализация аккумуляции кальция в симбиосомах в присутствии АТФ и Ме2+

С целью решения поставленных вопросов выделенные из корневых клубеньков люпина желтого симбиосомы были энергизированы в течение 1,5 часов добавлением АТФ и Mg2+ в инкубационную среду, содержащую ионы кальция, а затем фиксированы. Результаты показали (рис. 4), что в препаратах симбиосом контрольного варианта немногочисленные гранулы Са-ПА были локализованы на наружной стороне ПБМ, но не обнаружены в ПБП. В противоположность этому, электронные микрофотографии симбиосом, инкубированных с АТФ и Mg2+ выявили наличие многочисленных крупных гранул Са — ПА на большей части поверхности ПБМ, а также в ПБП. Другое важное наблюдение - отсутствие этих гранул в присутствии ванадата, известного ингибитора АТФаз Р-типа. На основании этих данных можно предположить, что симбиосомы аккумулируют Са2+ при участии Са2+-транслоцирующей АТФазы.

люпина.

а - контрольные симбиосомы, фиксированные с ПА сразу после выделения; б -

симбиосомыдшкубированные 1.5 часа в среде, содержащей 1 мМ АТФ, 0 5 мМ

и 100 мкМ СаСЬ; в -симбиосомы, инкубированные в тех же условиях, что в (б), но в присутствии 50 мкМванадата.

2 2 Идентификация и характеристики кальциевого насоса ПБМ

В ходе экспериментов, проведенных на препаратах изолированных симбиосом и полученных из них везикулах ПБМ люпина желтого и бобов с использованием как непроникающего, так и проникающего через мембраны индикаторов кальция (арсеназо Ш и хлортетрациклина, соответственно), получены следующие характеристики кальциевого насоса

Исследование эффекта рН на (Л-аккумулирующую активность Mg-АТФ-энергизованных симбиосом показало, что она достигала максимума в области нейтральных значений рН (6 8-72), существенно снижалась при рН 8.0 и практически не обнаруживалась прирНбО, где, согласно нашим ранее полученным данным, проявлялся оптимум активности 1Т-АТФазы ПБМ (Дуброво и др, 1992). Эта результаты согласуются с имеющимися в литературе данными, согласно которым рН-оптимум большинства Са2+-аранслоцирующих АТФаз, обнаруженных в растительных мембранах, также находится в нейтральной области рН.

Зависимость скорости Mg-АТФ-энерIизированной аккумуляции Са симбиосомами характеризовалась насыщением, которое достигалось уже при концентрации АТФ в области 70-100 мкМ, причем полумаксимальная скорость процесса наблюдалась при [АТФ] * 30-50 мкМ Литературные данные показывают, что именно в этой области значений находится Ам для большинства Mg-АТФ-зависимых Сал-транслоцирующих АТФаз, обнаруженных в растительных мембранах.

Проведенный ингибиторный анализ поглощения Са2+ симбиосомами показал (рис. 5, кривые 1 и 2), что добавление АТФ к симбиосомам из корневых клубеньков люпина, суспендированным в буферной среде с Са2+-индикатором, содержащей ионы М^2+ и Са2+, инициировал относительно медленное- изменение оптического поглощения арсеназо Ш, которое свидетельствовало о постепенном удалении из нее ионов Са2+. Наблюдаемый ответ Са^-индикатора не достигал стационарного уровня даже через 20 мин после добавления АТФ и не выявлялся в отсутствие этого субстрата (кривые 1 и 2) или ионов Мм" (кривые 3 и 4) в среде. Данные рис. 5, кроме того, показывают, что М§АТФ-индуцированное поглощение Са2+ симбиосомами быстро останавливалось добавлением ортованадата - ингибитора АТФаз Р-типа (кривая 3) и практически. не обнаруживалось, если реакционная смесь исходно содержала этот ингибитор (кривая 2).

Рис 5. Кинетика М-АТФ-энаргизованного поглощения Са симбиосомами. Стрелками указано, добавлено 20 мкМСаС12, ММ^-ЛТО, ЗмМ Мё8Ю> 2 мкМ БССР, 1 мкМА23187,5мкМ эритрозинаБ, 100 мкМ ортованадата, 30 мМ КЖ>з, 5 ММ^)^.

С другой стороны, кинетика рассматриваемого процесса оставалась. неизменной после добавления к симбиосомам соединений, вызывающих диссипацию АрН на ПБМ, таких как БССР, (КИ4)2804 и ионофор А23187, а также эритрозина Б (кривая 1) и валиномицина. Поглощение Са2+ симбиосомами заметно ускорялось в присутствии анионов нитрата (кривая 4). Бактероиды, которые могли присутствовать в виде

примеси в препаратах изолированных симбиосом, не вносили вклада в наблюдаемый процесс поглощения Са2+ поскольку в их присутствии кинетика изменения оптического поглощения Са +-индикатора носила обратный характер (кривая 5).

Качественно сходные результаты были получены нами в подобных экспериментах, выполненных на препаратах везикул ПБМ люпина. Однако в этом случае наблюдаемый ответ Са2+-индикатора арсеназо Ш почти полностью обращался Са2+-ионофором А23187. Такая особенность поведения везикул ПБМ находилась в соответствии с их Са2+-аккумулирующей способностью в присутствии АТФ и ионов Mg2* в реакционной смеси.

Еще одно важное наблюдение, касающееся функционирования Mg-АТФ-зависимого Са2+-пасоса в ПБМ симбиосом люпина желтого, состояло в заметной стимуляции кинетики поглощения ими Са2* экзогенным кальмодулином. Этот эффект наблюдался также в МЛТФ-энергизованных везикулах ПБМ, когда следили за кинетикой поглощения Са2+ с помощью другого Са2+-индикатора - хлортетрациклина, способного проникать через биологические мембраны.

Таким образом, на основании выше перечисленных фактов можно сделать вывод, что на ПБМ присутствует АТФаза, обладающая характеристиками, свойственными для Са2+-АТФаз Р-типа. Эта АТФаза катализирует активный транспорт Са2+ через ПБМ из цитозоля в симбиосому. Са2+-транслоцирующая АТФаза может рассматриваться как одна из транспортных систем, обеспечивающих симбиосоме способность к статированию [Са2*]цит.

2.3. Са24"-каналы

После того, как на ПБМ была обнаружена СаЛ-транслоцирующая АТФаза, обеспечивающая транспорт ионов кальция в симбиосому, встал вопрос о путях его выхода в цитозоль растительной клетки, которые могут осуществляться при участии Са2* -каналов. Их функционирование является второй важной составляющей взаимоотношения партнеров симбиоза на основе кальция

2. 3. 1. Действие блокаторов кальциевых каналов на распределение и перераспределение кальция в симбиосомах in situ при его дефиците

Для выявления активности и природы Экспортирующей транспортной системы, гредгюложитслыю функционирующей в ПБМ симбиосом был использован методический подход, когда применение блокаюров кальциевых канатов должно было ингибирокпь выход кальция из симбиосом in situ, вызываемый, как было показано нами, продолжительной инкубацией корневых клубеньков в буферной среде, содержащей хелатор Са2* ЭТТА О локализации катьция в симбиосомах судили по наличию в них атектронноплотных комплексов этого катиона с ПА, выявляемых в виде гранул СаЛА

В контрольном варианте, когда корни с ноотделенными клубегаками инкубировали в течение 3 часов в буферной среде (рП 65), симбиосомы были в достаточной степени обогащены кальцием. Картина распределения гранул Са-ПА внутри симбиосом insitu претерпевала явные изменения после добавления ЭТТА к среде инкубации корневой системы растений. Они выражались в небольшом снижении числа таких гранул на обеих поверхностях ПБМ, замешом уменьшении численности их крупных агрегатов внутри ПБП, а также некотором снижении числа гранул СаЛА внутри

бактеровдоа Это свцц/пагьствугг о некоторой потере кальция а!мбиосомами под влиянием ЭПА Гораздо более выраженное обеднение симбиссом кальцием 1ибшсщалосьп(хяеЗдасовой инкубации корней в той же буферной среде, дополненной Салюнофором Л23187 В этом случае имело место существенное уменьшение числа гранул СаПА как на ПБИтживПШсимбиоссм,авбактерс«цах такие гранулы пракшчески не обнаруживший».

Из результатов, представленных на рис 6, следует, что индукция кальциевого дефицита симбиосом под влиянием ЭТТА практически полностью щгщдаасц если среда инкубации корневых югубеньодссвдзжащаяхелатсрСалбьт 100 мкМ рутениевого

краснота В результате действия этих соединений кархинарасхлзеяеленга гранул СаЛ\ в а!мбиосомах становилась близкой ктой, что мы наблюдали в первом контратьном варианте опьпа

Рис 6. Локализация Са2+в инфицированных клетках клубеньков кормовых бобов после инкубации корней в течение 3 ч в буферном растворе рН 6 5 (а), в той же среде, содержащей 200 мкМ ЭГТА (б), или 500 мкМ верапамила и 200 мкМ ЭГТА (в), или 100 мкМ рутениевого красного и 200 мкМ ЭГТА (г)

23 2 Действие верапамила на выхрдкальшя го симбиосом в присутствии ЭГТАи при депатяризацииПЕМв\словиях кальциевого дефицита

3-часовая инкубация изолированных симбиосом бобов в буферной среде, содержащей ЭГТА, вызывала явное обеднение их кальцием. Если при отсутствии в этой среде хелатораСа2*, гранулы СаПА более или менее равномерно покрывали наружную поверхность ПБМ истчетлиюнаблкдалисьв ПБП симбиосом, то в присутствии ЭГТА число таких гранул значительна снижалось Вместе с тем, действие хелатора Са2+ в существенной степени подавлялось, если среда инкубации симбиосом дсполнительда содержала 100 мкМ верапамила Наблюдаемое нами действие верапамила в условиях кальциевого дефицита может свидетельствовать о наличии в ПБМ Са-транспортера, ингаоируемсго данным юединением.

Это предположение получило независимое эшкриментатъноепод 1веркдешевопьЛ типа, выполненных на изолированных симбиосомах с использованием СаЛиндикатора ароавзо ЕЬ Было обнажено, что добавление К*"-иоиофора валиномицина и ионов К* к среде инкубации симбиосом, содержащей этот Оа2* индикатор, вызывало быстрый выход из них ионов Са2*, который сильно подавлялся верапамилом (рис. 7) Действие валиномицина и ионов К* в дашсм случае сводилось кдеполяризации ПБМ.

Рис 7. Изменение спектра поглощения арсеназо Ш в среде инкубации симбиосом, содержащей 60 мМ КС1, индуцированное выходом из них Са2+ после добавления к суспензии симбиосом 1 мкМ валиномицина (А), и кинетика этого процесса (Б) в отсутствие (2, 5) и в присутствии (5, б) 100 мкМ верапамила. Для сравнения показано изменение спектра поглощения арсеназо Ш, вызываемое в тех же условиях добавлением к суспензии симбиосом экзогенного кальция (50 мкМ СаСЬ) {4). Базовая линия (/) записана в условиях, когда опытная и контрольная кюветы содержали суспензию симбиосом в той же инкубационной среде в отсутствие или в присутствии 100 мкМ верапамила.

№ полученных результатов следует, что обеднение симбиосом кальцием in vivo и in \itn >, вызванное инкубацией корневых клубеньков и выделенных из них симбиосом в буферной среде, содержащей ЭТТА, в существенной степени подавляется блокагорами кальциевых канатов -верапамилом и рутениевым красным. Задержка выхода кальция из симбиосом в присутствии используемых ингибиторов может указывать на участие ионных, кальциевых, канатов, в экспорте его из симбиосом. Функционирование в ПБМ С&зкспортируквдейтранспортной системы, атакже Са2+ транслоцирующсйАТФазы соответствует говедениюсимбюст какСа-запасающихкомпартментов и предпатагает их возможное участие в гсмеостшическсй регуляции уровня свободного кальция в цитозоле.

3. ВКЛЮЧЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В КОНТРОЛЬ НИТРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

Цель данных исследований - изучение регуляции нитрогеназной активности клубеньков различных генотипов бобовых на основе изменения Са-статуса симбиосом in vivo и in vitro, а также выявление некоторых конкретных механизмов этой регуляции.

3. 1. Некоторые эпи- и генетические аспекты детерминирования кальцием активности нитрогеназы

Данные, полученные на культурах, генотипически различающихся по отзывчивости к кальцию — бобах (кальциефил) и люпине желтом (кальциефоб), показали, что у бобов максимальная величина нитрогеназной активности клубеньков наблюдалась на более высоком фоне внесенного кальция (4.5ммоль на сосуд), чем у люпина (3 ммоль на сосуд). Гипс- и гиперпитание растений кальцием приводило к подавлению нитрогеназной активности, к уменьшению веса надземной массы, а также числа и массы клубеньков. В случае слабоэффективного симбиоза у бобов была выявлена аналогичная закономерность при общем значительно более низком уровне азотфиксации. Все это позволяет говорить о наличии генотипической зависимости азотфиксации в клубеньках бобовых от уровня кальция в среде.

3.2. Действие Са-активных соединений на нитрогеназную активность симбиосом in vivo и in vitro

Дня решения указанных задач была проведена модуляция уровня кальция в субклеточных компартментах клубеньков люпина желтого путём обработки их корневых систем Са-ионофором А23187 и хелатором кальция ЭГТА Показано, что после 2- и 4-часовой инкубации корней растений в среде, содержащей 2 мкМ ионофора А23187 и 200 мкМ ЭГТА в отсутствие добавленного кальция, нитрогеназная активность уменьшалась до 30% от контроля (инкубация в забуференной воде в отсутствие Са-активных соединений). Почти такое же падение нитрогеназной активности клубеньков (до 40% от контроля) наблюдалось и при использовании значительно более низких концентраций Са-активных соединений (0, 5 мкМ ионофора А23187 и 5 мкМ ЭГТА) в среде инкубации.

Как следует из данных табл. 1, сходные изменения претерпевала и нитрогеназная активность изолированных симбиосом люпина желтого, когда они испытывали совместное действие тех же Са-активных соединений. В присутствии 200 мкМ ЭГТА и 1 мкМ ионофора А23187 она снижалась до 50 и 60% от контроля в отдельных экспериментах. Как и в случае целых корневых клубеньков, добавление к Са-дефицитной инкубационной среде экзогенного кальция (5 мМ) вызывало дальнейшее снижение нитрогеназной активности симбиосом. Важно отметить и тот факт, что заметное снижение ее наблюдалось и в присутствии одного экзогенного кальция (2 мМ) в среде, причем добавление к ней 200 мкМ ЭГТА не приводило к каким-либо изменениям азотфиксирующей активности симбиосом.

Таблица 1. Совместное влияние Са-ионофора А23187 (1мкМ) и ЭГТА (200 мкМ) на нитрогеназную активность симбиосом из корневых клубеньков люпина желтого (мкмоль С2Н4/Г сырой массы симбиосом за 1 час)

№ эксперимента Инк. смесь +ЭГТА Инк. смесь +ЭГТА +А23187 Инк. смесь +ЭГТА +А23187 +0,5мМ СаСЬ Инк. смесь +ЭГТА +А23187 +1мМ СаСЬ Инк. смесь +ЭГТА +А23187 +5мМ СаС12

1 13,30 ±0,20 12,40 ±0,40 11,80 ±0,20 11,10 ±0,20 8,20 ±1,40

2 7,58 ±0,95 4,25 ±0,65 4,10 ±0,43 2,95 ±0,30 -

3 4,10 ±0,74 2,01 ±0,18 1,34 ±0,34 2,16 ±0,32 -

Сходные эксперименты были поставлены на бобах. В результате обработки Са-активными соединениями нитрогеназная активность клубеньков и симбиосом бобов снижалась в 2 раза. Неодинаковый эффект действия ионофора и ЭГТА в случае клубеньков люпина желтого и бобов можно связывать с различной генотипической отзывчивостью азотфиксирующей системы клубеньков разных культур к уровню в них эндогенного кальция. Добавление в инкубационную среду Са2+ одновременно с ионофором не изменяло величину падения активности нитрогеназы.

Следовательно, модуляция содержания кальция в симбиосомах с помощью Са-ионофора А23187 и ЭГТА как на целых клубеньках, так и на изолированных симбиосомах, сопровождающаяся одновременным изменением нитрогеназной активности, указывает на возможность существования зависимости активности фермента от уровня эндогенного кальция.

3 3. Дейавиеблокагоровкальцисвьк канатов и ЭГТА га нигрола взную акшкюсть корневых клубеньков и симбиосом

С целью исследования зависимости нитрогеназной активности от содержания Са2+ в симбиосомах были применены ингабигоры Са-канатов (вератамил и рутениевый красный) Нитрогеназная активность корневых клубеньков бобов после их 3-часовой инкубации в буферной среде, содержащей ЭГТА, снижалась почта на 30% по сравнению с активностью фермента в отсутствие ЭГТА При совместном действии ЭГТА и верапамила или рутениевого красного нитрогеназная активность была выше,хота и недостигатакапратьногоуровня (табл. 2)

Инкубация изолированных симбиосом в среде с ЭГТА приводила к снижению нитрогеназной активности более, чем на 20 % по сравнению с кдапэатьным вариантам. При совместном действии на симбиссомыЭГТАи верапамила их нитрагеназная активность бьта выше, чем в присутствии одного ЭГГАБопеетсщс4аоказатасьвь1цкЛчелвконтраты«м варианте (табл.2)

Таким образом, в отличие от ингибирующего действия на нитрогеназную активность Са-активных соединений, блокаторы Са-каналов стабилизировали ее значение в симбиосомах.

Таблица 2. Влияние блокаторов кальциевых каналов на нитрогеназную активность корневых клубеньков бобов и изолированных из них симбиосом.

Среда инкубации Активность, мкмоль СгШг сырой массы клуб.(симбиосом)-ч

Клубеньки симбиосомы

Буферная среда 35.83 ±5.92 1.1б±0.14

Буферная среда + 200 мкМ ЭГТА 26.44 ±2.2 0.90 ±0.08

Буферная среда + 200 мкМ ЭГТА + 500 мкМ рутениевый красный 30.5 ±3.8 --

Буферная среда + 200 мкМ ЭГТА + 100 мкМ верапамил 28.16±2.3 1.36 ±0.16

3.4. Некоторые механизмы включения Са2+ в контроль нитрогеназной активности

Насколько нам известно, до сих пор не выявлено прямое участие Са2+ в регуляции нитрогеназной активности. Механизмы опосредованного регуляторного действия кальция могут быть самыми разными. В их числе - регуляция с участием Са2+ -зависимой протеинкиназы фосфорилирования нодулинов, ответственных за транспорт через ПБМ малата - главного С-интермедиата, связующего метаболизм растительной клетки и бактероидов, где он является основным источником энергии для фиксации азота. Нами была исследована кинетика поглощения малата изолированными симбиосомами люпина желтого, регистрируемая по закислению их ПБП с помощью ДрН-индикатора акридинового оранжевого. Оказалось, что она замедлялась примерно в 2 раза после обработки симбиосом в течение 20 мин экзогенной щелочной фосфатазой. Такой результат свидетельствует о том, что активность переносчика малата на ПБМ действительно чувствительна к фосфорилированию в ней белков и существенно возрастает после их ковалентной модификации, что подтверждает возможность функционирования на ПБМ Са-зависимой протеинкиназы.

Еще один из механизмов косвенного влияния Са2+ на нитрогеназную активность может быть связан с действием данного иона на работу протонного насоса ПБМ, от которого зависит энергизация мембраны, рН ПБП, а также транспорт ионов и дикарбоксилатов. Для изучения такого рода зависимости в препаратах изолированных симбиосом и везикул ПБМ, полученных из корневых клубеньков люпина желтого, исследовали АТФ-зависимую генерацию мембранного потенциала

и трансмембранного градиента рН В качестве индикаторов

использовали оксонол VI и акридиновый оранжевый соответственно. Показано, что на ПБМ локализована АТФаза, функционирующая как электрогенный протонный насос, создающий при отсутствии проникающих ионов Д\у, а в их присутствии -ДрН. Са2* подавлял АТФ-зависимую электрогенную активность ПБМ симбиосом люпина желтого, что было выявлено по интенсивности диссипативного действия, вызываемого СаСЬ. Аналогичные результаты были получены на симбиосомах бобов: Са2+ ингибировал АТФ-зависимую генерацию ДрН (рис. 8, 1) и Ду (рис. 8, 2),

создаваемых на ПБМ. В наших исследованиях эффект ингибирования кальцием протонной АТФазы, локализуемой на' ПБМ, проявлялся при микромолярных концентрациях свободного кальция, что значительно выше ее в цитозоле. Отсюда следует, что функциональное обеспечение неингибирующего действия Са<^ на протонный насос в клетке in vivo должно быть тесно взаимосвязано с работой Са-транспортных систем, обеспечивающих наномолярные концентрации его в цитозоле.

Рис 8. Ингибярование ионами кальция АТФ-зависимой генерации АрН (1) и Дц/ (2) на

перибактероидной мембране симбиосом, изолированных из корневых клубеньков бобов. Стрелками указано, добавлено 1 и 2 мМ ЭГТА (1), 1 мМ ЭГТА (2), 1 мМ АТФ, 3 мМ СаС12 и 10 мМ КЮз.

Помимо ингибирования входа в ПБП протонов, повышение уровня кальция может влиять на проницаемость ПБМ для других ионов, в частности калия. Как следует из наших данных, кальций активирует по соответствующим каналам выход из симбиосом К+ (рис. 9), который, как было показано нами, является основным осмотически активным компонентом (Андреев и др., 2004), регулятором активности значимого в энергетическом отношении фермента - НАДН-зависимой малатдегидрогеназы (МДГ) и через это - их нитрогеназной активности (табл. 3).

Рис 9. Влияние ЭГТА на кинетику пассивного закисления симбиосом бобов, суспендированных в бескалиевой инкубационной среде, содержащей ДрН-индикатор акридиновый оранжевый.

Табл. 3. Содержание калия в клубеньках бобов, НАДН-зависимая МДГ и ацетиленредуктазная активности при различных дозах калия

Содержание калия в клубеньках (мкмоль/г сухой массы) Дозы калия в среде

0,1Н 1Н 2Н

585 1018 1317

НАДН-зависимая МДГ (нмоль НАДН/мг белка-мин) 336,1 565,4

Ацетиленредуктазная активность (мкмоль С2Н4/Г сырой массычас) 2,3 3,9 5,3

(мкмоль СгН^растение-час) 1,1 2,4 3,0

Итак, по результатам исследований можно сделать вывод о том, что нитрогеназная активность симбиосом контролируется их кальциевым статусом и, скорее всего, требуется оптимизация его концентрации как в цитозоле, так и в бактероидах для достижения максимальной азотфиксирующей активности. В этой связи импорт Са2+ из цитозоля инфицированных растительных клеток внутрь симбиосом, катализируемый МлТФ-зависимым Са2+-насосом, функционирующим в ПБМ, а также низкая пассивная проницаемость ее для Са2* через Са-каналы играют ключевую роль в ряду факторов, определяющих симбиосомальную компартментацию кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований за последние 10-15 лет в области изучения биогенеза, структуры и свойств перибактероидной мембраны, являющейся продуктом взаимодействия про- и эукариота - одно из доказательств прогрессивного пути

симбиосомы 4

симбиотической эволюции, приведшей к формированию симбиосомы, обеспечившей растительной клетке новое, хотя и временное, свойство - фиксацию молекулярного азота. Несмотря на эволюционную «незавершенность» этого процесса, симбиосома как внутриклеточная структура уже располагает многими свойствами истинной органеллы. К ним можно отнести — оформившийся мембранный конверт (envelope) с разной проницаемостью внешней и внутренней мембран, присущей мембранным конвертам других органелл симбиотического происхождения (хлоропласты, митохондрии). На основе такой мембранной организации может достигаться функциональная компартментированность и интеграция метаболизма цитозоля и бактероида, приводящая к азотфиксации и ассимиляции в клубеньках связанного азота.

Поскольку в основе принципа мутуалистического симбиоза лежит взаимовыгодность отношений партнеров, то создание компартментированных пулов Са2+ в про- и эукариотических клетках клубенька с участием ПБМ является наглядной иллюстрацией такого феномена В результате создания значительного градиента концентраций кальция между окружающей средой, цитозолем и симбиосомой, с одной стороны - происходит поддержание содержания этого иона в цитозоле на физиологическом и стационарном уровне, а с другой — оптимизация его концентрации в бактероидах, что необходимо для контроля нитрогеназной активности и поддержания ее эффективности на нужном уровне. Величина пула Са2+ в симбиосоме определяет выбор альтернативы ингибирующего или активирующего действия иона на нитрогеназную активность.

В процессе эволюции оба партнера симбиоза испытывают давление отбора: с одной стороны, - у них происходит редукция (бобы) или утрата (люпин желтый) вакуолярного аппарата, как главного вместилища Са2+, а с другой, как показано нами, появляется альтернативный Са-аккумулирующий компартмент - симбиосома.

Попытки изменить указанный выше новый порядок организации азотфиксирующей системы на генетическом (неэффективный или малоэффективный симбиоз), или эпигенетическом (гипо-, гиперпитание Са2+) уровнях приводили к нарушению взаимоотношений партнеров и как следствие - падению нитрогеназной активности. Индукция кальциевого дефицита симбиосом инфицированных клеток клубеньков, достигаемая длительной инкубацией корней в Са-дефицитной среде с применением Са-активирующих агентов - ЭГТА и Са2+-ионофора А23187, также снижала азотфиксирующую активность бактероидов. В итоге во всех перечисленных случаях симбиотическая ассоциация не давала преимуществ и распадалась.

Исследования, проведенные нами, позволили впервые идентифицировать и охарактеризовать локализованные на перибактероидной мембране Са-транспортные системы. Среди них - Са2+-транслоцирующая АТФаза и Са-канал, которые могут участвовать в поддержании оптимального уровня кальция в цитозоле растительной клетки. Согласно полученным данным Са2+-транслоцирующая АТФаза характеризуется многими свойствами АТФаз Р-типа. Другая, обнаруженная нами Са-транспортирующая система обеспечивает пассивный выход ионов кальция из симбиосомы. Некоторые экспериментально полученные нами характеристики позволяют отнести се к Са-каналам.

В работе выявлены некоторые механизмы регулирующего действия кальция на активность нитрогеназы. Экспериментально показанное замедление кинетики

поглощения малата изолированными симбиосомами люпина желтого после их обработки экзогенной щелочной фосфатазой, свидетельствует о зависимости активности переносчика малата ПБМ от фосфорилирования в ней белков, катализируемого Са-зависимой протеинкиназой. Не менее значимым может быть обнаруженный в наших исследованиях факт ингибирования кальцием протонной АТФазы, локализуемой на ПБМ. Поскольку от работы протонного насоса на ПБМ зависит энергизация мембраны, транспорт через нее ионов и метаболитов, а также рН ПБП, способных контролировать активность нитрогеназы в бактероидах, отмеченное действие Са2+ может представлять собой эффективный механизм эндогенной регуляции. Действие кальция распространяется на саму перибактероидную мембрану. Связываясь с ней, он способен влиять на ее проницаемость для калия, активируя функционирование К+-каналов, что важно для осморегуляции симбиосом.

Исследования, проведенные в данной работе, позволяют заключить, что специфика структурно-функциональной организации ПБМ способна обеспечить слаженность кооперативного взаимодействия цитозоля и симбиосомы не только на метаболическом, но и на ионном уровне, что определяет главное свойство бобово-ризобиального симбиоза - его азотфиксирующую активность. Мы ограничились экспериментальной демонстрацией такой возможности на примере кальция. Выяснение вопросов участия других ионов в регуляции симбиотических взаимоотношениях макро- и микросимбионта еще ждет своих разработок.

ВЫВОДЫ

1. С использованием электронномикроскопических методов цитохимии по визуализации содержания кальция выявлены закономерности внутриклеточной его компартмеитации в инфицированных и неинфицированных клетках клубенька люпина желтого и бобов:

а) В обоих случаях в аккумуляции кальция участвует широкий спектр структур - эухроматин ядра, матрикс митохондрий, цистерны ГЭР, диктиосомы аппарата Гольджи, плазмалемма, апопласт и др.;

б) В неинфицированных клетках главным Са-аккумулирующим компартментом являются вакуоли. В связи с редукцией (бобы) или исчезновением (люпин желтый) в инфицированных клетках вакуолярного аппарата его мажорную Са-аккумулирующую функцию принимают на себя симбиосомы.

2. На симбиосомальном уровне основной зоной сосредоточения кальция являются бактероиды. С увеличением дозы экзогенного Са2+ от гипо- до гипертрофических концентраций, адекватно повышается Са-аккумулирующая способность симбиосом за счет участия в этом процессе не только бактероидов, но перибактероидного пространства и перибактероидной мембраны. Благодаря этому симбиосомы выполняют функцию главного Са-аккумулирующего компартмента в инфицированных клетках клубеньков.

3. В переносе кальция через перибактероидную мембрану принимают участие различные транспортные системы:

а) идентифицирована и охарактеризована MgЛ-зависимая Са2+-транслоцирующая АТФаза (Са2+-насос), в результате функционирования которой происходит активный транспорт Са из цитозоля в симбиосому против

градиента концентрации. АТФаза имеет К„АТФ« 50 МкМ, оптимум рН 6 8 — 7.2, ингибируется ванадатом, обнаруживает высокое сродство к Са2+, активируется кальмодулином, что позволяет ей отнести к Са2+ -АТФазам Р-типа.

б) показано наличие верапамил-чувствительного Са-транспортера (Са-канала) перибактероидной мембраны, через который осуществляется пассивный выход кальция из симбиосом в цитозоль. Выход кальция активируется только при деполяризации мембраны и, скорее всего, находится под контролем мембранного потенциала.

4. Функционирование на перибактероидной мембране Са2+-транслоцирующей АТФазы и Са-экспортирующей транспортной системы соответствует поведению симбиосом как Са-запасающих компартментов, что может свидетельствовать в пользу участия их как в транедукции сигналов в инфицированных клетках корневых клубеньков, так и в гомеостатической регуляции в их цитозоле уровня свободного кальция.

5. Нитрогеназная активность симбиосом in vivo и in vitro контролируется их кальциевым статусом. Выявлены механизмы возможного контроля опосредованного регулирования нитрогеназной активности кальцием через функционирование Са-зависимой протеинкиназы, протонного насоса, Кл-каналов, НАДН-зависимой малатдегидрогеназы клубеньков.

6. На основании полученных результатов обосновывается положение, согласно которому мутуалистические взаимоотношения про- и эукариотических клеток, направленные на реализацию азотфиксирующей активности бобово-ризобиального симбиоза, могут достигаться за счет регулируемого транспорта через перибактероидную мембрану не только метаболитов, но и ионов, в частности, кальция.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Ливанова Г. II., Дуброво IL Н., Крылова В. В. Свойства Н*-АТФаз перибактероидной мембраны корневых клубеньков люпина желтого // Тез. докладов II съезда ВОФР. Минск, 24 - 29 сентября, 1990. С. 53.

2. Livanova Q. I., Dubrovo P. N., Krylova V. V., Izmailov S. F. Some properties of K^-ATFases of the peribacteroid membrane of lupin root nodules // Abstr. 7th Congress of FESPP (Umea, Sweden, 1990) Physiologia plantarum. V. 79. F. 2. P. 2. Poster sess. 21. N555.

3. Крылова В. В., Дуброво П. Н., Ливанова Г. II.. Измайлов С. Ф. Свойства АТФаз перибактероидной мембраны корневых клубеньков люпина желтого // Тез. докладов Республиканской конференции "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений" (Тернополь, 1991). Киев, 1991. С. 38.

4. Dubrovo P. N., Krylova V. V., Livanova G. L, Zhiznevskaya G. Y., Izmailov S. F. Properties of ATFases of the peribacteroid membrane in root nodules of Yellow Lupine // Soviet Plant Physiology. 1992. V. 39. P. 318-324.

5. Izmailov S. F., Krvlova V. V., Dubrovo P. N. ATFases ofperibacteroid membrane from root nodules of Lupmus luteus L. // Abstr. 8th Eastern Europe symposium of Biological nitrogen fixation. Saratov, 1992. P. 21.

6. Крылова В. В., Дуброво П. IL, Жизневская Г. Я., Измайлов С. Ф. Свойства АТФаз перибактероидной мембраны корневых клубеньков люпина желтого // Тез. докладов 9-го Баховского коллоквиума по азотфиксации. Москва, 24-26 января, 1995. С. 25.

7. Kudryavtseva N.N.,Tsydendambaev V. D., Dubrovo P.N., Krylova V.V. Borodenko L.L, Zhiznevskaya G.Ya., Izmailov S. F. Role of the peribacteroid membrane in the interactions of the symbiotic partners in the nitrogen fixing root nodules of Lupinus luteus L. // Abstr.lOth International Congress on Nitrogen fixation. Saint-Petersburg. Russia, May 28 - June 3,1995. P. 551-556.

8. Андреев IL M, Дуброво IL IL, Кореньков В. Д., Крылова В. В., Сорокин Е. М., Измайлов С. Ф. АТФ-зависимый электрогенный перенос протонов и транспорт метаболитов через ПБМ клубеньков люпина желтого // Физиология растений. 1996. Т. 43. № 6. С. 874- 882.

9. Andreev L, Dubrovo P., Krylova V., Andreeva L N., Koren'kov V., Sorokin E. and Izmailov S. Characterization of ATP-Hydrolyzing and ATP-Driven Proton-Translocating Activities Associated with the Peribacteroid Membrane from Root Nodules of Lupinus luteus L //J. Plant Physiol. 1997. V. 151. N2. P. 563-569.

10. Andreev L M., Dubrovo P. N., Krylova V. V. and Izmailov S. F. Calcium Uptake by Symbiosomes and the Peribacteroid Membrane Vesicles Isolated from Yellow Lupin Root Nodules//J. ofPlant Physiology. 1998. V. 153. P. 203-211.

П.Андреев И.М., Дуброво ILIL, Крылова В.В. и Измайлов С.Ф. Ионы Са2+ ингибируют АТФ-зависимую транслокацию протонов через перибактероидную мембрану корневых клубеньков бобовых // Тез. докладов 4-го съезда ВОФР. Москва, 4-9 октября, 1999. Т. 1. С. 202-203.

12. Andreeva I. N., Andreev I. M., Dubrovo P. N., Kozharinova G. M., Krylova V. V. and Izmailov S. F. Calcium Stores in Symbiosomes from Yellow Lupin Root Nodules//J. ofPlant Physiology. 1999. Vol. 155. P. 357-363.

13.Andreev L M., Dubrovo P. N., Krylova V. V. and Izmailov S. F. Functional identification ofATP-driven Ca2+ pump in the peribacteroid membrane ofbroad bean root nodules // FEBS Letters. 1999.447. P. 49-52.

Н.Андреев И. М., Андреева И. Н., Кожаринова Г. М., Дуброво П. IL, Крылова В. В., Измаилов С Ф. Аккумуляция кальция и его включение в контроль нитрогеназной активности в симбиосомах корневых клубеньков кормовых бобов//Физиология растений. 2000. Т.47.№1.С. 14-20.

75. Андреев И. М., Андреева IL H., Дуброво IL H., Крылова В. В., Кожаринова Г.М., Измайлов С. Ф. Кальциевый статус симбиосом люпина желтого как потенциальный регулятор их нитрогеназной активности: роль перибактероидной мембраны // Физиология растений. 2001. Т.48. №4. С. 364374.

16. Крылова В. В., Андреев И. М., Андреева И. IL, Дуброво П. Н., Кожарннова Г. М., Измайлов С. Ф. Верапамил-чувствительный кальциевый транспортер в перибактероидной мембране симбиосом из корневых клубеньков Viciafaba L. //Физиологиярастений. 2001. Т.49. №6. С. 839-846.

17. Krylova V. V., Izmailov S. F., Dubrovo P. N., Andreev I. M. Calcium is involved in regulation of the symbiotic partnership in legume root nodules // Abstr. Xl-th

Congress International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg, July 18-27,2003. P. 294.

18-Andreev LM., Krylova V. V., Dubrovo P. N., Izmailov S. F. Functional

identification of K+-transporter in the peribacteroid membrane from broad bean root nodules // Abstr. Xl-th Congress International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions St-Petersburg, July 18-27,2003. P. 294.

19. Крылова В.В., Андреев И.М., Дуброво П.Н., Измайлов С.Ф. Выход К+ из симбиосом корневых клубеньков Viciafaba L., активируемый деполяризаций перибактероидной мембраны // Тез. докладов 5-го съезда ВОФР. Пенза, 15-21 сентября, 2003. С. 181.

20. Андреев И.М., Крылова В.В., Дуброво ILH., Измайлов С.Ф. Изменение интенсивности светорассеяния симбиосом из корневых клубеньков Vicia faba L. как индикатор транспорта ионов и метаболитов через перибактероидную мембрану//Физиология растений. 2004. Т. 51. № 1. С.80-85.

21. Крылова В.В., Андреев И.М., Дуброво П.Н., Измаилов С.Ф. Кальций в контроле нитрогеназной активности корневых клубеньков Viciafaba L.: выход кальция из симбиосом и сопутствующее ему снижение нитрогеназной активности блокируется верапамилом // Известия РАН. Серия биологическая. 2004. №2. С. 1-9.

22. Andreev I., Krylova V., Dubrovo P.', Izmailov S. Passive potassium transport by symbiosomes from yellow lupin root nodules Plant science. In press.

Издательство 00 0 "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 20.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 452. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. И 9992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

#1314 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крылова, Валерия Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Симбиотическая азотфиксирующая система бобовых растений

1.1. Биологическое значение симбиотической фиксации азота

1.2. Азотфиксирующие микроорганизмы

1.3. Этапы формирования бобово-ризобиального симбиоза

1.4. Образование клубенька

1.5. Бактероид

1.6. Нитрогеназа

1.7. Генетика азотфиксирующего симбиоза

2. Взаимоотношения партнеров симбиоза на уровне разделяющих их медиальных зон

2.1. Роль перибактероидного пространства

2.2. Роль перибактероидной мембраны

2.2.1. Транспорт метаболитов через перибактероидную мембрану

2.2.2. Дикарбоксилатный переносчик перибактероидной мембраны

2.2.3. Нодулин

2.2.4. АТФазы перибактероидной мембраны

2.2.5. Транспорт Н* и NH/ через перибактероидную мембрану

2.2.6. Интеграция метаболических взаимоотношений партнеров симбиоза через перибактероидную мембрану

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА II. Объекты и методы исследования

1. Выращивание растений

2. Получение фракции бактероидов, симбиосом и везикул перибактероидной мембраны из корневых клубеньков бобовых

3. Регистрация мембранного потенциала (Ду) и трансмембранного градиента рН (ДрН) перибактероидной мембраны

4. Регистрация выхода Са из симбиосом

5. Регистрация поглощения Са2+ симбиосомами и везикулами перибактероидной мембраны

6. Регистрация активного транспорта Са через перибактероидную мембрану

7. Электронномикроскопическая цитохимия аккумуляции кальция в клетках клубеньков и симбиосомах

8. Определение нитрогеназной активности клубеньков и изолированных из них симбиосом

9. Определение активности НАДН-зависимой малатдегидрогеназы клубеньков

10. Регистрация осмотических изменений объема симбиосом

ГЛАВА III. Кальций аккумулирующая функция симбиосом

1. Субклеточная локализация Са2+ в клетках корневых клубеньков люпина желтого и бобов при эффективном и неэффективном симбиозе

2. Действие Са2+-активных соединений и экзогенного Са2+ на симбиосомальную компартментацию этого катиона у люпина желтого и бобов

3. Обсуждение

ГЛАВА IV. Транспорт Са через перибактероидную мембрану 78 1. Са2+

-транслоцирующая АТФаза

1.1. Электронномикроскопическая визуализация аккумуляции Са в симбиосомах люпина желтого в присутствии АТФ и Mg2+

1.2. Идентификация и характеристики кальциевого насоса

1.3. Обсуждение 88 2. Са2+-каналы

2.1. Действие блокаторов Са2+-каналов на распределение и перераспределение Са в симбиосомах in situ на фоне Са2+-дефицита

2.2. Действие верапамила на выход Са из симбиосом бобов в присутствии ЭГТА и при деполяризации перибактероидной мембраны

2.3. Обсуждение

ГЛАВА V. Включение Са2+в контроль нитрогеназной активности

1. Некоторые эпи- и генетические аспекты детерминирования активности нитрогеназы кальцием

2. Действие Са - активных соединений (ЭГТА, ионофор А23187) на нитрогеназную активность симбиосом люпина желтого и бобов in vivo и in vitro

3. Действие блокаторов кальциевых каналов и ЭГТА на нитрогеназную активность корневых клубеньков и симбиосом бобов

4. Возможные механизмы действия Са на процессы, определяющие азотфиксирующую активность клеток корневых клубеньков бобовых

5. Обсуждение 120 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125 ВЫВОДЫ 129 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АО акридиновый оранжевый

АТФ аденозинтрифосфорная кислота

Б бактероид

БГТ бутилированный гидрокситолуол

БСА бычий сывороточный альбумин

ВТР бис-трис-пропан

В вакуоль

ГФ Р" глицерофосфат натрия

ГЭР гранулярный эндоплазматический ретикулум

ДТТ дитиотрейтол

ДЦКД N, N'- дициклогексилкарбодиимид

ИФ3 инозитол-1,4,5- трифосфат

КС клеточная стенка

М митохондрия

МДГ малатдегидрогеназа

МЭС 2-(N -морфолиноэтансульфоновая кислота)

НА нитрогеназная активность

ПА пироантимонат калия

ПБМ перибактероидная мембрана

ПБП перибактероидное пространство

ПВП поливинилпирролидон

Т тонопласт

FCCP карбонилцианид-л-трифторметоксифенилгидразон

Ц цитозоль

ЭГТА этиленгликоль-бис(2-аминоэтил эфир)-Ы" ,N' -тетраацетат

ЭДТА этилендиамин-тетрауксусная кислота

ЭТЦ электронтранспортная цепь

Я ядро

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транспорт Ca2+ через перибактероидную мембрану, его аккумуляция в симбиосомах и включение в контроль нитрогеназной активности в корневых клубеньках бобов и люпина желтого"

Биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы - глобальный процесс, от изучения механизмов которого зависит решение целого ряда важнейших проблем теоретического и практического значения. Среди последних: расширение круга способных к симбиотическому усвоению азота сельскохозяйственных культур, повышение продуктивности и накопления в них белка за счет интенсификации эффективности бобово-ризобиального симбиоза, обогащение почв биологическим азотом, улучшение на этой основе их экологического состояния и др.

Благодаря новым методическим подходам, базирующимся на достижениях химии, физико-химической биологии, генетики, агрономии и растениеводства, к настоящему времени значительно расширился круг фундаментальных исследований в области симбиотической азотфиксации. Это даёт основание для оптимистического взгляда на решение актуального вопроса - удовлетворения потребностей человечества в пищевом и кормовом белке, дефицит которого остается острой проблемой. Надо полагать, что в XXI веке многие современные технологии, направленные на получение и применение синтетических азотных удобрений, начнут уступать свои лидирующие позиции практическим инновациям по интенсификации биологической фиксации молекулярного азота. Начиная с 70-х годов, азотфиксация уже стала реально рассматриваться как одна из альтернативных областей, имеющая первостепенную важность для научных исследований в области сельского хозяйства. На основании современного научного прогноза ожидается, что к 2100 году урожай зерновых и бобовых за счет биологической азотфиксации достигнет более 100 ц/га (Brady, 1982).

Начало истории разработки проблемы биологической фиксации азота воздуха восходит к классическим трудам Ж. Б. Бусенго. Он не только построил научную теорию питания растений минеральным азотом (1837 г.), но и впервые показал способность бобовых «усваивать» молекулярный азот. С тех пор был пройден огромный путь в разработке проблемы. На смену агрономическому приходили более новые - физиологические, биохимические и генетические подходы. Но самым важным на этом пути было событие, связанное с пионерскими опытами Дж. Карнахана по экспериментальному выделению и идентификации нитрогеназы - реального фермента, обеспечивающего фиксацию молекулярного азота микроорганизмами (Carnahan et al., 1960).

Значительными достижениями в этой области в период с 1960-х годов следует рассматривать результаты исследований по структуре и регуляции нитрогеназы, её потребности в АТФ, ферредоксину и флаводоксину как донорам электронов, гидрогеназе, поглощающей Н2, леггемоглобину, обеспечивающему защиту нитрогеназы от кислорода, регуляции ключевых ферментов метаболизма углерода и азота, а также др. В числе последних отметим расшифровку мультигенной природы азотфиксирующего симбиоза растений.

Анализ результатов работы 13-ти Международных конгрессов по фиксации молекулярного азота (International Congress on Nitrogen Fixation), 20 Североамериканских конгрессов, посвященных этой теме (North American Conference on Symbiotic Nitrogen fixation), 5 Европейских конференций по бобовым ( European Conference on Grain Legumes) и других научных мероприятий дают основание считать, что в число приоритетных направлений по проведению исследований в этой области в настоящее время выдвигаются:

1) Химия и биохимия нитрогеназы и ее влияние на другие механизмы, функционирующие в азотфиксирующих микроорганизмах;

2) Тонкие системы обмена сигналами между партнерами симбиоза, обуславливающие формирование симбиотического аппарата;

3) Разнообразие и эволюция азотфиксирующих микроорганизмов, их систематизация и модификация на основе молекулярно-генетических методов;

4) Регуляция ключевых ферментов азотфиксирующей системы;

5) Окружающая среда и азотфиксирующая система.

Среди этих направлений большое значение придается малоизученной проблеме - изучению механизмов взаимоотношений партнеров симбиоза. Новым подходом на этом пути явились исследования, совершенно по-новому трактующие традиционные фундаментальные проблемы физико-химической биологии взаимоотношений симбионтов на уровне пространственно разобщающих их зон - перибактероидной мембраны (ПБМ) и перибактероидного пространства (ПБП). Стимулом к изучению этих вопросов послужил тот факт, что если в азотфиксирующей системе бобовых не формируется ПБМ, то такая система по азотфиксирующему признаку оказывается неэффективной. Кроме того, изучение биогенеза и функций ПБМ имеет важное общебиологическое значение с точки зрения понимания происхождения эукариотической клетки, в которой хлоропласты, митохондрии и ядро также, вероятнее всего, возникли на основе симбиогенеза.

Несмотря на достигнутый прогресс в понимании роли ПБМ в регуляции симбиотических взаимоотношений на уровне метаболитов (Измайлов, 1996; Udvardi et al., 1997), до сих пор ограничены представления о вкладе данной мембраны в регуляцию ионных потоков, в частности, ионов кальция (Измайлов, 2003). Между тем, этот ион играет большую роль в развитии растительной клетки (Hepler, Wayne, 1985) и является важнейшим регулятором внутриклеточных процессов в растении (Sanders et al., 1999; Blatt, 2000), будучи вторичным мессенджером в передаче экто- и эндосигнала, участвует в регуляции транслокации других ионов, например, калия. Остаются неясными вопросы, связанные с механизмами транспорта Са2+ через симбиотическую мембрану, созданием Са-дискретных пулов в инфицированной клетке, участием этого катиона в регуляции ключевых процессов и тем самым установлении мутуалистического типа взаимоотношений про- и эукариотических клеток, направленных на реализацию азотфиксирующих свойств всей симбиотической системы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы состояла в изучении механизмов участия кальция во взаимоотношениях через симбиотическую - ГТБМ про- и эукариотических клеток клубеньков люпина желтого и бобов, направленных на реализацию азотфиксирующей активности их симбиотических систем.

В связи с этим разрабатывались следующие проблемы:

1. Компартментация кальция в неинфицированных и инфицированных азотфиксирующих клетках корневых клубеньков.

2. Роль симбиосомы в запасании кальция в инфицированных клетках клубеньков.

3. Идентификация и характеристика локализованных в перибакгероидной мембране Са-транспортных систем: Са2+ -транслоцирующей АТФазы, Са-каналов.

Ч I

4. Сопряженность процессов аккумуляции Са симбиосомой и его включения в контроль нитрогеназной активности клубеньков.

5. Механизмы действия Са2+ на процессы, определяющие азотфиксирующую активность клубеньков.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Крылова, Валерия Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. С использованием электронномикроскопического метода цитохимии по визуализации содержания кальция выявлены закономерности внутриклеточной его компартментации в инфицированных и неинфицированных клетках клубенька люпина желтого и бобов: а) В обоих случаях в аккумуляции кальция участвует широкий спектр структур - эухроматин ядра, матрикс митохондрий, цистерны ГЭР, диктиосомы аппарата Гольджи, плазмалемма, апопласт и др.; б) В неинфицированных клетках главным Са-аккумулирующим компартментом являются вакуоли. В связи с редукцией (бобы) и исчезновением (люпин желтый) в инфицированных клетках вакуолярного аппарата его мажорную Са-аккумулирующую функцию принимают на себя симбиосомы.

2. На симбиосомальном уровне основной зоной сосредоточения кальция являются бактероиды. С увеличением дозы экзогенного Са от гипо- до гипертрофических концентраций, адекватно повышается Са-аккумулирующая способность симбиосом за счет участия в этом процессе не только бактероидов, но перибактероидного пространства и перибактероидной мембраны.

3. Симбиосомы, выполняя функцию главного Са-аккумулирующего компартмента в инфицированной клетке клубенька, могут тем самым участвовать в регуляции и поддержании в цитозоле стационарно необходимого уровня кальция - вторичного посредника инициации различных биохимических процессов.

4. В переносе кальция через перибактероидную мембрану принимают участие различные транспортные системы: л» а) идентифицирована и охарактеризована Mg -зависимая Са2+-транслоцирующая АТФаза (Са2+-насос), в результате функционирования которой происходит активный транспорт Са2+ из цитозоля в симбиосому против градиента концентрации. АТФаза имеет КМАТФ« 50 мкМ, оптимум рН 6.8 - 7.2, ингибируется ванадатом, обнаруживает высокое сродство к Са2+, л г активируется кальмодулином, что позволяет её отнести к Са -АТФазам Р-типа. б) показано наличие верапамил-чувствительного Са-транспортёра (Са-канала) перибактероидной мембраны, через который осуществляется пассивный выход кальция из симбиосом в цитозоль. Выход кальция активируется только при деполяризации мембраны и, скорее всего, находится под контролем мембранного потенциала.

Функционирование на перибактероидной мембране Са2+-транслоцирующей АТФазы и Са-экспортирующей транспортной системы, соответствует поведению симбиосом как Са-запасающих компартментов, что свидетельствует в пользу участия их как в трансдукции сигналов в инфицированных клетках корневых клубеньков, так и в гомеостатической регуляции в их цитозоле уровня свободного кальция. Нитрогеназная активность симбиосом in vivo и in vitro контролируется их кальциевым статусом. Выявлены механизмы возможного контроля опосредованного регулирования нитрогеназной активности кальцием через функционирование Са-зависимой протеинкиназы, протонного насоса, К+-каналов, НАДН-зависимой малатдегидрогеназы клубеньков. На основании полученных результатов обосновывается положение, согласно которому мутуалистические взаимоотношения про- и эукариотических клеток, направленные на реализацию азотфиксирующей активности бобово-ризобиального симбиоза, могут достигаться за счет регулируемого транспорта через перибактероидную мембрану не только метаболитов, но и ионов, в частности, кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований за последние 10-15 лет в области изучения биогенеза, структуры и свойств перибактероидной мембраны, являющейся продуктом взаимодействия про- и эукариота - одно из доказательств прогрессивного пути симбиотической эволюции, приведшей к формированию симбиосомы, обеспечившей растительной клетке новое, хотя и временное, свойство - фиксацию молекулярного азота. Несмотря на эволюционную «незавершенность» этого процесса, симбиосома как внутриклеточная структура уже располагает многими свойствами истинной органеллы. К ним можно отнести — оформившийся мембранный конверт {envelope) с разной проницаемостью внешней и внутренней мембран, присущей мембранным конвертам других органелл симбиотического происхождения (хлоропласты, митохондрии). На основе такой мембранной организации может достигаться функциональная компартментированность и интеграция метаболизма цитозоля и бактероида, приводящая к азотфиксации и ассимиляции в клубеньках связанного азота.

Поскольку в основе принципа мутуалистического симбиоза лежит взаимовыгодность отношений партнеров, то создание у. компартментированных пулов Са в про- и эукариотических клетках клубенька с участием ПБМ является наглядной иллюстрацией такого феномена. В результате создания значительного градиента концентраций кальция между окружающей средой, цитозолем и симбиосомой, с одной стороны - происходит поддержание содержания этого иона в цитозоле на физиологическом и стационарном уровне, а с другой — оптимизация его концентрации в бактероидах, что необходимо для контроля нитрогеназной активности и поддержания ее эффективности на нужном уровне. Величина пула Са2+ в симбиосоме определяет выбор альтернативы ингибирующего или активирующего действия иона на нитрогеназную активность.

В процессе формирования и функционирования симбиотических отношений оба партнера испытывают давление отбора, что приводит к их одновременным изменениям. Это обстоятельство заставляет партнеров эволюционировать совместно по пути утраты или появления новых свойств. В частности, у растений происходит редукция (бобы) или утрата (люпин желтый) вакуолярного аппарата, как главного вместилища Са2+, у бактероидов — развитие этой альтернативной способности к накоплению Са . Попытки изменить указанный выше новый порядок организации азотфиксирующей системы на генетическом (неэффективный или малоэффективный симбиоз), или эпигенетическом (гипо-, гиперпитание Са2+) уровнях приводили к нарушению взаимоотношений партнеров и как следствие - падению нитрогеназной активности. Индукция кальциевого дефицита симбиосом инфицированных клеток клубеньков, достигаемая длительной инкубацией корней в Са-дефицитной среде с применением «Сал I активирующих» агентов - ЭГТА и Са -ионофора А23187, также снижала азотфиксирующую активность бактероидов. В итоге во всех перечисленных случаях симбиотическая ассоциация не давала преимуществ и распадалась.

Исследования, проведенные нами, позволили впервые идентифицировать и охарактеризовать локализованные на перибактероидной мембране Са-транспортные системы. Среди них - Са -транслоцирующая АТФаза и Са-канал, которые могут участвовать в поддержании оптимального уровня кальция в цитозоле растительной клетки. Согласно полученным данным Са2+-транслоцирующая АТФаза характеризуется многими свойствами АТФаз Р-типа. Другая, обнаруженная нами Са-транспортирующая система обеспечивает пассивный выход ионов кальция из симбиосомы. Некоторые экспериментально полученные нами характеристики позволяют отнести ее к Са-каналам.

В работе выявлены некоторые механизмы регулирующего действия кальция на активность нитрогеназы. Экспериментально показанное замедление кинетики поглощения малата изолированными симбиосомами люпина желтого после их обработки экзогенной щелочной фосфатазой, свидетельствует о зависимости активности переносчика малата ПБМ от фосфорилирования в ней белков, катализируемого Са-зависимой протеинкиназой. Не менее значимым может быть обнаруженный в наших исследованиях факт ингибирования кальцием протонной АТФазы, локализуемой на ПБМ. Поскольку от работы протонного насоса на ПБМ зависит энергизация мембраны, транспорт через нее ионов и метаболитов, а также рН ПБП, способных контролировать активность нитрогеназы в бактероидах, отмеченное действие Са2+ может представлять собой эффективный механизм эндогенной регуляции.Действие кальция . распространяется на сами мембраны - перибактероидную и бактероидную. Связываясь с ними, он способен влиять на их проницаемость для других ионов и активировать ряд свойственных им ферментов. В частности, кальций действует на проницаемость перибактероидной мембраны для К+ и на этой основе симбиосомы подобно вакуолям могут включаться в осморегуляцию инфицированных клеток клубеньков, то есть регуляцию объема или оводненности их цитозоля.

Исследования, проведенные в данной работе, позволяют заключить, что специфика структурно-функциональной организации ПБМ способна обеспечить слаженность кооперативного взаимодействия цитозоля и симбиосомы не только на метаболическом, но и на ионном уровне, что определяет главное свойство бобово-ризобиального симбиоза — его азотфиксирующую активность. Мы ограничились экспериментальной демонстрацией такой возможности на примере кальция. Выяснение вопросов участия других ионов в регуляции симбиотических взаимоотношениях макро- и микросимбионта еще ждет своих разработок.

Автор выражает особую благодарность за научное руководство и поддержку доктору биологических наук, профессору Измайлову С. Ф., а также коллегам по работе — И.Н.Андреевой, И.М.Андрееву, П.Н.Дуброво, Г.М.Кожариновой, Т.М.Андреевой, Сацкой М. В. за участие в проведении экспериментальной работы, в полезной дискуссии и подготовке рукописи к печати.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 01-04-48554, 95-04-13228).

129

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крылова, Валерия Валерьевна, Москва

1. Агибетов К. А., Генина О. С., Дуброво П. Н., Ливанова Г. И., Жизневская Г. Я., Измайлов С. Ф. Нодулины, бактероидины и их внутриклеточная локализация в корневых клубеньках люпина желтого // Физиология растений. 1991. Т. 38. Вып. 1. С. 95-105.

2. Андреева И. Н. Сравнительное электронно-микроскопическое исследование клубеньков люпина, образованных эффективным и неэффективным штаммом Rhizobium // Докл. АН СССР. 1985. Т. 282. № 1.С. 251-253.

3. Андреева И. Н., Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф. Литическая функция перибактероидного пространства в клубеньках бобовых: электронно-микроскопическое исследование // Докл. АН СССР. 1991. Т. 320. № 1. С. 249-251.

4. Андреева И. Н., Кожаринова Г. М., Измайлов С. Ф. Структурные особенности митохондрий корневых клубеньков бобовых // Физиология растений. 1995. Т. 42. Вып. 2. С. 218-226.

5. Андреева И. Н., Козлова Г. И., Ливанова Г. И., Жизневская Г. Я., Измайлов С. Ф. Перибактероидное пространство корневых клубеньков бобовых: электронно-микроскопическое исследование // Физиология растений. 1989. Т. 36. Вып. 3. С. 551- 560.

6. Андреева И. Н., Козлова Г. И., Мандхан К., Измайлов С. Ф. Структурные особенности различающихся по эффективности азотфиксации клубеньков бобовых // Физиология растений. 1992. Т. 39. Вып. 2. С. 314325.

7. Базилинская М. В. Использование биологического азота в земледелии / Обзорная информация ВНИИ. Информация техническо-экономических исследований ВАСХНИЛ-М. 1985. 12 с.

8. Генерозова И. П. Новообразование мембраны бактериальной капсулы при биогенезе симбиотической системы клубеньков Vicia faba // Физиол. растений. 1979. Т. 26. Вып. 4. С. 788-793.

9. Доросинский Л. М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л.: Колос, 1970. 192с.

10. Дуброво П.Н., Крылова В.В., Ливанова Г.И., Жизневская Г.Я., Измайлов С.Ф. Свойства АТФаз перибактероидной мембраны корневых клубеньков люпина желтого // Физиология растений. 1992. Т. 39. С. 96-108.

11. Евстигнеева З.Г. Глютаминсинтетаза: Роль в азотном метаболизме растений, регуляция и структура. М.: Наука, 1988. 64 с.

12. Измайлов С. Ф. Взаимоотношения партнеров симбиоза на ионной основе: роль перибактероидной мемебраны // Физиология растений. 2003. Т. 50. №4. С. 1-15.

13. Измайлов С.Ф. Физиология симбиотических взаимоотношений в клубеньках бобовых: биогенез и роль перибактероидной мембраны // Физиология растений. 1996. Т. 43. С. 773-791.

14. Измайлов С.Ф., Андреева И.Н., Кожаринова Г.М. Субклеточная локализация кальция в корневых клубеньках бобовых // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 109-118.

15. Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. М.: Изд-во Моск. уни-та, 1989. 174 с.

16. Кретович JI. В. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука, 1987. 486 с.

17. Кретович JI. В. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. М.: Наука, 1994. 168 с.

18. Кретович JI. В., Чернядьева И. Ф., Мелик-Саркисян С. С. В-12 коэнзим и легоглобин в клубеньках люпина в процессе вегетации и в связи с эффективностью симбиоза//Биохимия. 1972. Вып. 3. С. 598-606.

19. Лихтенштейн Г. И., Гвоздев Р. И., Левченко Л. А., Сырцова Л. А. Строение и механизм каталитического действия активных центров нитрогеназы //Изв. АН СССР. Сер. биол. 1978. № 2. С. 165-185.

20. Мелик-Саркисян С. С., Карапетян Н. В., Кретович В. Л. Состав цитохромов эффективных и неэффективных клубеньков желтого люпина // Докл. АН СССР. 1969. Т. 188. № 4. С. 930-933.

21. Мелик-Саркисян С. С., Тихомирова А. И., Кретович В. Л. Белки перибактероидного пространства бактероидов Rhizobium lupini II Докл. АН СССР. 1981. Т. 259. №6. С. 1498-1501.

22. Мишустин Е. Н., Черепков Н. И. Биологический азот в сельском хозяйстве СССР // Технология производства и эффективность применения бактериальных удобрений — М. 1982. С. 3-12.

23. Мишустин Е. Н., Черепков Н. И. Роль биологического азота в азотном балансе земледелия СССР и в повышении плодородия почв // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. № 5. С. 649-660.

24. Мишустин Е. Н., Шильникова В. К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука, 1973. 288 с.

25. Проворов Н. А., Аронштам А. А. Генетика симбиотической азотфиксации у клубеньковых бактерий // Итоги науки и техники. Сер. микробиол. 1991. Т. 23. С. 3-97.

26. Проворов Н. А., Симаров Б. В. Внутрисортовая изменчивость люцерны по активности симбиоза с Rhizobium melilotill С.-х. Биология. 1986. № 12. С. 37-41.

27. Радюкина Н. Л. Андреева И. Н., Жизневская Г. Я., Измайлов С. Ф. Ферменты обмена углеводов в перибактероидном пространстве клубеньков люпина желтого // Физиология растений. 1991. Т. 38. № 1. С. 181-183.

28. Радюкина Н.Л., Брускова Р.К., Измайлов С.Ф. Транспорт 14С-субстратов через перибактероидную мембрану клубеньков люпина желтого // ДАН. 1992. Т. 323. С. 603-606.

29. Ринькис Г. Я., Ноллендорф В. Ф. Сбалансированное питание растений макро- и микроэлементами. Рига: Зинатне, 1982. 314 с.

30. Стеханова Т. Н., Федоровская М. Д., Тихая Н.И., Вахмистров Д. Б. Экто Са2+- или Mg2+-АТФазы корневых клеток ячменя: один или два фермента // Физиология растений. 1989. Т. 36. Вып. 5. С. 926-932.

31. Сырцова JI. А. Изучение ключевых стадий нитрогеназной реакции: сопряжение гидролиза АТФ и переноса электрона: Дис. Д-ра биол. наук. М., 1989.

32. Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Фэн, 2001. 448 с.

33. Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002. 294 с.

34. Тихонович И. А., Алисова С. М., Четкова С. А, Берестецкий О. А. Повышение эффективности азотфиксации путем отбора линий гороха по активности нитрогеназы // С.-х. Биология. 1987. № 2. С. 29.

35. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. СПб.: Наука, 1998. 194 с.а I

36. Ткачук В. А. Фосфоинозитидный обмен и осцилляция ионов Са // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 1. С. 47-56.

37. Трепачев Е. П. Биологический и минеральный азот в земледелии: пропорции и проблемы // С.-х. биология. 1980. Т. 15. № 2. С. 178-189.

38. Хайлова Г. Ф. Изучение структуры бактероидной ткани клубеньков бобовых растений в связи с отложением в ней крахмала // Физиол. Растений. 1978. Т. 25. Вып. 6. С. 1172-1179.

39. Харди Р. Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982. 735 с.

40. Харди Р. У. Ф. Химический, биологический, генетический и агрономический подход к улучшенным или альтернативным технологическим методам, обеспечивающим фиксацию азота // Химия и обеспечение человечества пищей / Ред. Шимилта JI. М.: Мир, 1986. 616 с.

41. Храмой В. К. Взаимоотношение клубеньковых бактерий и бобовых растений в процессе симбиотической азотфиксации. М.: МСХА, 2001. 30 с.

42. Черемисов Б. М. Селекция бобовых растений и клубеньковых бактерий на интенсификацию их симбиоза. М.: ВАСХНИЛ; ВНИИТЕИСХ, 1985.

43. Шапиро И. А. Азотный обмен у лишайников и его регуляция // Ботан. журн. 1986.Т. 71. № 7. С. 841-850.

44. Шилов А. Е. // Успехи химии. 1974. Т.43. Вып. 5.

45. Яковлева 3. М. Бактероиды клубеньковых бактерий. М.: Наука, 1975. 172 с.

46. Allawau D., Lodwig Е., Crompton L. A., Wood М., Parsons Т. R., Wheeler Т. et al. Identification of alanine dehydrogenase and its role in mixed secretion of ammonium and alanine by pea bacteroids // Mol. Microbiol. 2000. V. 36. P. 508-515.

47. Andreev I. M., Dubrovo P. N., Krylova V. V., Izmailov S. F. Functional Identification of ATP-driven Ca2+-pump in the Peribacteroid Membrane of Broad Bean Root Nodules // FEBS Lett. 1999. V. 447. P. 49-52.

48. Andreev I.M., Dubrovo P.N., Krylova V.V., Izmailov S.F. Calcium Uptake by Symbiosomes and the Peribacteroid Membrane Vesicles Isolated from Yellow Lupin Root Nodules // J. Plant Physiol. 1998. V. 153. P. 610-614.

49. Andreeva I. N. Ultrastructure of symbiotic systems in legume root nodules //th • Proc. 8 Eur. Congr. Electron microscopy. V. 3 Life Sciences. Budapest. 1984.1. P. 2133-2134.

50. Andreeva I.N., Andreev I.M., Dubrovo P.N., Kozharinova G.M., Krylova V.V., Izmailov S.F. Calcium Stores in Symbiosomes from Yellow Lupin Root Nodules // J. Plant Physiol. 1999. V. 155. 357-363.

51. Andreeva I.N., Izmailov S.F. Cellular Organization of Symbiotic Nitrogen Fixation and Nitrogen assimilation in Leguminous Plants // Plant Nutrition-physiology and Applications. Dordrecht etc.: Kluwer Acad. Publ., 1990. P. 133-134.

52. Apell H.-J., Bersch B. Oxonol VI as an Optical Indicator for Membrane Potentials in Lipid Vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 903. N 3. P. 480-494.

53. Appelbaum E.,Chartrain N.,Thompson D., Johansen K., O'Connell M., McLoughlin T. // Nitrogen fixation research progress. The Hague: Nijhoff, 1985. P. 101-107.

54. Appels M. A., Haaker H. Identification of cytoplasm nodule-association forms of malate dehydrogenase involved in the symbiosis between Rhizobium leguminosarum and Pisum sativum II Eur. J. Bioch. 1988. V. 171. № 3. P. 515522.

55. Appleby C. A., Bergersen F. G. Cytochromes of Rhizobium // Nature. 1958. V. 182. N. 4653. P. 1174.

56. Arwas R., Mc Kay J., Rowney F. Properties of organic acid utilization mutants of Rhizobium leguminosarum strain 300 // J. Gen. Microbiol. 1985. V.131.P. 2059-2066.

57. Bassarab S., Mellor R. В., Werner D. Evidence for two types of Mg2+-ATPase in the peribacteroid membrane from Glycine max root nodules // Endocyt. C. Res. 1986. V.3.P. 189-196.

58. Bassarab S., Werner D. A Ca2+-dependent protein kinase activity in the peribacteroid membrane from soybean root nodules // J. Plant Physiol. 1987. V. 130. P. 233-241.

59. Bassett В., Goodman R. N., Novacky A. Ultrastructure of soybean nodules: I. Release of rhizobia from the infection thread // Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. N. 6. P. 573-582.

60. Batut I., Terzaghi В., Gherardi M. Localization of symbiotic fix region on Rhizobium meliloti p Sym megaplasmid more then 200 kilobases from the nod-nif region // Mol. and Gen. Genet. 1985. V. 192. P. 232-239.

61. Bauer W. D. Role of soybean lectin in the soybean Rhizobium japonicum symbiosis // In: Nitrogen fixation. Baltimore: Univ. Park Press. 1980. V. 11. P. 205-214.

62. Bergersen F. J., Briggs M. J. Studies on the bacterial component of soybean root nodules: cytology and organization in the host tissue // J. Gen. Microbiol. 1958. V. 19. P. 482-490.

63. Bergersen F. J., Turner G. L. Comparative stadies of nitrogen fixation by soybean root nodules bacteroid suspensions and cell free extracts // J. Gen. Microbiol. 1968. V. 53. P. 205-220.

64. Bergersen F. J., Turner G. L. Properties of terminal oxidase systems of bacteroids from nodules of soybean and cowpea and of N2-fixing bacteria grown in continuous culture // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. Part I. P. 235252.

65. Birch-Machin M.A., Dawson A.P.// Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 944. N2. P. 308-334.

66. Blatt M. R. Ca2+ signaling and control of quard-cell volume in stomatal movements // Current Opinion in Plant Biology. 2000. V. 3. P. 196- 204.

67. Blevins D.G., Barnett N.M., Bottino P.J. The Effects of Calcium and Ionophore A23187 on Nodulation, Nitrogen Fixation and Growth of Soybean // Physiol. Plant. 1977. V. 41. P. 235-238.

68. Blumwald E., Fortin M. G., Rea P. A., Verma D. P. S., Poole R. J. Presence of host plasma membrane type FT^-ATPase in the membrane envelope enclosing the bacteroid in soybean root nodules // Plant Physiol. 1985. V. 78. P. 665-672.

69. Bowler C., Fluhr R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance // Trends Plant Sci. 2000. V. 5. N 6. P. 241-246.

70. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

71. Brady N. D. Chemistry and the World Food Supplies // Science. 1982. V. 218. P. 847.

72. Bredley D. J., Butcher G. W., Galfre G., Wood E. A., Brewin N. J. Physical Association between the Peribacteroid Membrane and Lipopolysaccharide from the Bacteroid Root Nodule Cells // J. Cell. Sci. 1986. V. 85. N. 9. P. 4761.

73. Brill W. // Scientific Amer. 1977. V. 236. N. 3.

74. Briskin D. P. Ca2+-translocating ATPase of the plant plasma membrane // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 397-400.

75. Bush D.S., Wang T. Diversity of Calcium transporters in wheat aleurone cells //PlantPhysiol. 1994. V. 105(Suppl.). P. 149.

76. Bush D. S. Calcium regulation in plant cells and its role in signaling // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995. V. 46. P. 95-122.

77. Caldwell В. E. Inheritance of a strain specific ineffective nodulation in soybean // Crop Sci. 1966. V. 6. P. 427-428.

78. Cardenas L., Holdaway-Clarce T. L., Sanchez F., Quinto C., Feijo J. A., Kunkel J. G., Hepler P. K. Ion Changes in Legume Root Hairs Responding to Nod Factors // Plant Physiol. 2000. V. 123. P. 443-451.

79. Carnahan J. E., Mortenson L. E., Mower H. F., Castle J. E. Biochem. Biophys. Acta. 1960. V. 44. P. 520.

80. Chen F., Ratterman D.M., Sze H. A plasma membrane-type Ca2+-ATPase of 120 kilodaltons on the endoplasmic reticulum from carrot (Daucus carota) cells // Plant Physiol. V. 102. P. 651-661.

81. Chung M. H., Chen M. K., Pan S. M. // Transgenic Res. 2000. V. 9. N 6. P. 471-476.

82. Dart P. Infection development of leguminous nodules. In: A treaties on dinitrogen fixation. Section III, biology (Eds. R. W. Hardy, W. S. Silver). New York: John Wiley, 1977. P. 367-472.

83. Dart P. J., Mercer F.V. Membrane envelopes of legume bacteroids // J. Bacteriol. 1963. V. 85. N. 4. P. 951-952.

84. Dart P., Mercer F. Fine structure of Bacterids in root nodules of Vigna sinesis, Acacia longifolia, Viminaria juncea and Lupinus angustifolius // J. Bacteriol. 1966. V. 91. № 3. P. 1314-1319.

85. Davis Т. M., Foster K. W., Phillips D. A. Nodulation mutants in chickpea // Crop Sci. 1985. V. 25. P. 345-348.

86. Davis Т. M., Foster K. W., Phillips D. A. Inheritance and expression of three genes controlling root nodule formation in chickpea // Crop Sci. 1986. V. 26. P. 719-723.

87. Day D. A., Poole P. S., Tyerman S. D., Rosendahl L. Ammonia and amino acid transport across symbiotic membranes in nitrogen- fixing legume nodules //Cell. Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 61-71.

88. Day D. A., Prise G. D., Udvardi M. K. The membrane interface of the Bradyrh. Japonicum Glicine max symbiosis: Peribacteroid units from soybeannodules. // Austr. J. Plant Physiol. 1989. V. 16. N 1. P. 69-84.

89. Day D. A., Ouyang L.-J., Udvardi M. K. / In: Nitrogen Fixation: Achievements and Objectives / Eds. Gresshoff P. M. et al., Chapman and Hall, New York. 1990. P. 219-226.

90. Dazzo F. B. Determinants of host specificity in the Rhizobium-clover symbiosis // In: Nitrogen fixation. Baltimore: Univ. Park Press. 1980. V. II. P. 165-187.

91. Dazzo F. В., Yanke W. E., Brill W. J. Trifoliin Rhizobium recognitionprotein from white clover// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 539. P. 13621373.

92. Dean R. M., Rivers R. L., Zeidel M. L., Roberts D. M. Purification and functional reconstitution of soybean nodulin 26: an aquaporin with water and glycerol transport properties // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 347-353.

93. Diaz C. L., Van Spronsen P. C., Bakhuizen R., Logman G.J.J., Lugtenberg E.J.J., Kijne J.W. Correlation between infection by Rhizobium leguminosarum and lectin of the surface oiPisum sativum L. roots // Planta. 1986. V. 168. P. 350-359.

94. Dilworth M.J. Acetylene reduction by nitrogen-fixing preparations from Clostridium pasteurianum II Biochim. et Biophys. Acta. 1966. V. 127. № 2. P. 285-294.

95. Dilworth M., Glenn A. How does a legume nodule work? // Trends in Biochem. Sci. 1984. V. 9. P. 519-523.

96. Dixon R. O. D. The structure of infection threads, bacteria and bacteroids in pea and clover root nodules // Arch. Microbiol. 1964. V. 48. P. 166-178.

97. Dixon R. A., Postgate J. E. // Nature. 1971. V. 234. P. 47-48.

98. Domigan N. M., Farnden K. J. F., Robertson , Monk B.C. Characterization of the peribacteroid membrane ATPase in lupin root nodules // Arch. Biochem. Biophys. 1988. V. 264. N. 2. P. 564-573.

99. Earl C. D., Ronson C. W., Ausubel F. M. Genetic and structural analysis of the Rhizobium meliloti fix A, fix B, fix С and fix X genes // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 1127-1136.

100. Evans D. E., Williams L. P-type calcium ATPases in higher plants biochemical, molecular and functional properties // Biochem. Biophys. Acta. 1998. V. 1376. P. 1-25.

101. Evans H. J., Zuber M., Datta D. A. // A centure of nitrogen fixation research. Philosoph. Transact. Roy. Soc. L., 1987. P. 143-159.

102. Evans D. E., Briars S.-A., Williams L. E. Active calcium transport by plant cell membranes // J. Exp. Bot. 1991. V. 42. N 236. P. 285-303.

103. Fortin M. G., Zelechowska M., Verma D. P. S. Specific Targetting of Membrane Nodulins to the Bacteroid Enclosing Compartment in Soybean Nodules // EMBO J. 1985. V. 4. N. 12. P. 3041-3046.

104. Garbers Ch., Meckbach R., Mellor R. В., Werner D. Protease (Thermolysin) Inhibition Activity in the Peribacteroid Spase of Glycine max Root Nodules // J. Plant Physiol. 1988. V.132. N. 4. P. 442-445.

105. Gilroy S., Bethke P. C., Jones R. L. // J. Cell Sci. 1993. V. 106. N 2. P. 453461.

106. Glenn A., Mc Kay J., Arwas R. Sugar metabolism and symbiotic properties of carbohydrate mutants of Rhizobium leguminosarum II J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 239-245.

107. Goodchild D. J., Bergersen F. J. Electron microscopy of the infection and subsequent development of soybean nodule cells // J.Bacteriol. 1966. V. 92. N. l.P. 204-214.

108. Haaker H., Szafran M. M., Wassink Н. J., Appels M. A. Malate, aspartate and proton exchange between Rhizobium leguminosarum symbiosomes and its symbiotic partner Pisum sativum II 1995. See ref. 82. P. 565-572.

109. Hardy Т. K., Holstein R. D., Jackson E. K. The acetylenethylene assay for N2-fixation: laboratory and field evalution // Plant Physiol. 1968. V. 43. N. 8. P. 1185-1198.

110. Hardy R., Knight E. ATP-dependent reduction of azide and HCN by N2-fixing enzymes of Azotobacter Vinelandii and Clostridium pasteurianum II Biochim. et biophys. acta. 1967. V. 139. № 1. P. 69-90.

111. Heldt H., Flugge U. I. Subcellular Transport of Metabolites in Plant Cells // The Biochemistry of Plants / Ed. Davis D. D. N. Y.: acad. Press, 1987. V. 12. P. 49-85.

112. Hepler P. K., Wayne R. O. Calcium and plant development // Ann. Rev. Plant Physiol. 1985. V.36. P. 397-439.

113. Herrada G., Puppo A., Rigaud J. Succinate Transport activity on the Peribacteroid Membranes of French-bean Nodules // Plant. Sciences Today. La Colle-sur-Loup (France), 16-18 October. 1991. INRA, Paris (Les Colluques N 59). P. 251.

114. Herrada G., Puppo A., Rigaud J. Uptake of Metabolites by Bacteroid-Containing Vesicles and by Free Bacteroids from French Bean Nodules // J.Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 3165-3171.

115. Hwang I., Sze H., Harper J. F. A calcium-dependent protein kinase can inhibit a calmodulin-stimulated Ca pump (ACA2) located in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 62246229.

116. Jourdan D. C., Grinyer I. Electron microscopy of the bacteroids and root nodules of Lupinus luteus // Can. J. Microbiol. 1965. V. 11. N. 4. P. 721-725.

117. Jourdan D. C., Grinyer I., Coulter W. H. Electron microscopy of infection threads and bacteria in young root nodule of Medicago sativa I I J. Bacteriol. 1963. V. 86. P. 125-137.

118. Kahn M.L., Krays J., Somerville J. E. A model of nutrient exchange in the Rhizobium-\e&ime symbiosis II 1985. See Ref. 61. P. 193-199.

119. Kammen A. Suggested Nomenclature for Plant Genes Involved in Nodulation and Symbiosis II Plant Mol. Biol. Rep. 1984. N. 2. P. 43-45.

120. Katinakis P., Lankhorst R. M. K., Louwerse J., van Kammen A., van den bos R. C. Bacteroid-encoded proteins are secreted into the peribacteroid space by Rhizobium leguminosarum II Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 183-190.

121. Kijne J. W. Surface interactions between rhizobia and legume root hairs // Abst. 8th international congress on nitrogen fixation. Knoxville, USA. 1990. L-14.

122. Kim Y. S., Chae H. Z. A model of nitrogen flow by malonamate in RhizobiumyapomcHm-soybean symbiosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 169. P. 692-699.

123. Kinnback A., Mellor R. V., Werner D. Alpha-mannosidase II Isoenzyme in the Peribacteroid Spase of Glycine max Root Nodules I I J. Esp. Bot. 1987. V. 38. N. 193. P. 1373-1377.

124. Kinnback A., Werner D. L-glucosidase and malatdehydrogenase activity in the peribacteroid space of soybean root nodules // Abst. 8th international congresson nitrogen fixation. Knoxville, USA. 1990. G-02.

125. Kohl D. H., Schubert K. R., Carter M. В., Hagedorn С. H., Shearer G. Proline metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2036-2040.

126. Kondorosi E., Kondorosi A. Nodule induction on plant roots by Rhizobium II Trends in Biochemical Science. 1986. V. 11. P. 296-299.

127. Lara M., Ortega J.L., Olguin b. E., Sanchez F. Nodulin Expression and Nitrogen Metabolism in Phaseolus vulgaris root Nodules // Nitrogen fixation: Hundred Years after / Eds H. Bothe et al. Stuttgart; N. Y.: Gustav Fischer, 1988. P. 617-622.

128. Lee J. W., Zhang Y., Weaver C. D., Shomer N. H., Louis C. F., RobertsD. M. Phosphorylation of nodulin 26 on serine 262 affects its voltage-sensitivechannel activity in planar lipid bilayers // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 27051-27057.

129. Legocki R. P., Verma D. P. S. A nodule-specific plant protein (Nodulin-35) from soybean // Science. 1979. V. 205. P. 190-193.

130. Libbenga K. R., Harkes A. A. Initial proliferation of cortical cells in the formation of root nodules in Pisum sativum L. // Planta. 1973. V. 114. P. 1728.

131. Lie T. A. Host genes in Pisum sativum L. conferring resistance to European Rhizobium leguminosarum strains // Plant and Soil. 1984. V. 82. P. 415-425.

132. Liss H., Siebers B.,Weiler E.W. Characterization, functional reconstitution and activation by fusicoccin of a Ca -ATPase from Corydalis sempervirens Pers. cells suspension cultures // Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 10491056.

133. Long S. R. Rhizobium-legume nodulation: life together in the underground // Cell. 1989. V. 56. P. 203-214.

134. Lowther W.L., Loneragan J.F. Calcium and Nodulation in Subterranen Clover (Trifolium subterraneum L.) // Plant Physiol. 1968. V. 43. P. 13621366.

135. Marme D. The Role of Calcium in the Regulation of Plant Metabolism // Molecular and Cellular Aspects of Calcium in Plant Development / Ed. Trewavas A.J. N.Y.; L.: Plenum Press, 1985. Ser. A. V. 104. P. 1-8.

136. Marme D. The role of calcium in the regulation of plant metabolism // Molecular and Cellular Aspects of Calcium in Plant Development / ed. Trewavas A. J. N. Y.; L.: Plenum Press, 1986. P. 1-8.

137. Marshall А. Т., Xu W. Quantitative Elemental X-Ray Imaging of Frozen-Hydrated Biological Samples //J. Microsc. 1998. V. 190. P. 305-316.

138. Mellor R. B. Bacteroids in the Rhizobium-Legume Symbiosis Inhabit a Plant Internal Lytic Compartment: Imhlications for other Microbial Endosymbioses //J. Exp. Bot. 1989. V. 40. N. 217. P. 831-839.

139. Mellor R. В., Morshel E., Werner D. Legume Root Response to Symbiotic Infection. Enzymes of the Peribacteroid Space // Z. Naturforch. (C.). 1984.V. 39. N.J4. P. 123-125.

140. Merrick M. J. Nitrogen control of the ш/regulon in Klebsiella pneumonie: involvement of the ntr A gene and analogies between ntr С and nif A IIEMBO J. 1983. V. 2.3.39-44.

141. Merrick M. J. Organization and regulation of nitrogen fixation genes in Klebsiella and Azotbacter II Nitrogen Fixation: Hundred Years After. Proc. 7th Inter. Congr. N2-fixation / Ed. Fischer G. Stuttgart, N. Y. 1988. P. 293-302/

142. Miller R.W., Sirois J.C. Calcium and Magnesium Effects on Symbiotic Nitrogen Fixation in the Alfalfa (Midicago sativa)-Rhizobium meliloti System // Physiol. Plant. 1983. V. 58. P. 464-470.

143. Mosse B. Electron-microscope studies of nodule development in some clover species // J. Gen. Microbiol. 1964. V. 36. N. 1. P. 49-66.

144. Mouritzen P., Rosendahl L. Identification of a Transport Mechanism for NHt+ in the Symbiosome Membrane of Pea Root Nodules // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 519-526.

145. Newcomb E. H., Tandon S. H., Kowal R. R. Ultrastructural specialization for ureide production in uninfected cells of soybean root nodules // Protoplasma. 1985. V. 125. P. 1-12.

146. Newcomb W. A. A correlated light and electron microscopic study of symbiotic growth and differentiation in Pisum sativum root nodules I I Can. J. Bot. 1976. V. 54. P. 2163-2186.

147. Newcomb W., Syono K., Torrey J. G. Development of an ineffective pea root nodule: morphogenesis, fine structure, and cytokinin biosynthesis // Can. J. Bot. 1977. V. 55. N. 14. P. 502-531.

148. Niemietz С. M., Tyerman S. D. Channel-mediated permeation of ammonia gas through the peribacteroid membrane of soybean nodule // FEBS Letters. 2000. V. 465. P. 110-114.

149. Ninnemann О., Jauniaux J., Frommer W. Identification of a high affinity NH4+ transporter from plants // J. EMBO. 1994. V. 13. P. 3464-3471.

150. Norris V., Grant S.,Freestone P., canvin J., Sheikh F. N., Toth I., Trinel M., Modha K. and Norman R. I. Calcium Signalling in Bacteria // J. of Bacteriol. 1996. V. 178. N. 13. P. 3677-3682.

151. Nutman P. S. Symbiotic Effectiveness in nodulated red clover. The n and d factors for ineffectiveness // Heredity. 1968. V. 23. N. 4. P. 537-551.

152. Onek L. A., Smith R. J. Calmodulin and calcium mediated regulation in prokaryotes//J. Gen. Physiol. 1992. V. 138. P. 1039-1049.

153. Ou Yang L.-J., Day D.A. Transport Properties of Symbiosomes Isolated from Siratro Nodules // Plant Physiol. Biochem. 1992. V. 30. N. 6. P. 613-623.

154. Ou Yang L.-J., Udvardi M. K., Day D. A. Specificity and regulation of the dicarboxylate carrier on the peribacteroid membrane of soybean nodules // Planta. 1990. V. 182. P. 437-444.

155. Ou Yang L.-J., Whelan J., Weaver C.D., Roberts D.M., Day D.A. Protein Phosphorylation Stimulates the Rate of Malate Uptake across the Peribacteroid Membrane of Soybean Nodules // FEBS Lett. 1991. V. 293. P. 188-190.

156. Palmgren M. G. Acridine Orange as a Probe for Measuring pH Gradients across Membrane: Mechanism and Limitations // Anal. Biochem. 1991. V.192. N. 2. P. 316-321.

157. PicKard B. G., Ding J. P. the mechanosensory calcium-selective ion channel: key component of a plasmalemmal control center? // Aust. J. Plant Physiol. 1993. V. 20. P. 439-459.

158. Pladyes D., Rigaud J. Lysis of Bacteroid in vitro and during the Senesence in Phaseolus vulgaris Nodules // Plant Physiol. Biochem. 1988. V. 26. N. 2. P. 179-186.

159. Pladyes D., Trichant J. C., Rigaud J. Proteases from French-bean Nodule Host-cells: in vitro Effects on Bacteroids // Physiol. Veget. 1986. V. 24. N. 6. P. 697-705.

160. Poovaiah В. W., Reddy A. S. N. Calcium and signal transduction in plants // CRC Crit. Rev. Plant Sci. 1993. V. 12. N 2. P. 185-211.

161. Postgate J. R. Biological Nitrogen Fixation // Nature. 1970. V. 226. P. 25-27.

162. Postgate J. R. II Nature. 1984. V. 312. P. 194.

163. Reddy A. S. N. Calcium: silver bullet in signaling // Plant Science. 2001 .V. 160. P. 381-404.

164. Rentsch D., Boorer K. J., Frommer W. B. Structure and function of plasma membrane amino acid, oligopeptide and sucrose transporters from higher plants // O. Membrane Biol. 1998. V. 162. P. 177-190.

165. Roberts D. M., Tyerman S. D. Voltage- Dependent Cation Channels Permeable to NH/, K+, and Ca2+ in the Symbiosome Membrane of the Model Legume Lotus japonicus II Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 370-378.

166. Robertson J. G., Lyttleton P., Bullivant S., Grayston G. F. Membranes in lupin root nodules I. The role of Goldgi bodies in the biogenesis of infection threads and peribacteroid membranes //J. Cell Sci. 1978. V. 30. 129-149.

167. Robertson J. G., Lyttleton P., Tapper B. A. The role of peribacteroid membrane in legume root nodules // In: Advances in nitrogen fixation research. Hague. 1983. P. 473-481.

168. Roche et al. Rhizobium meliloti extracellular Nod Signals // Abst. 8th international congress on nitrogen fixation. Knoxville, USA. 1990. L-15.

169. Rosendahl L., Dilworht M.J., Glenn A.R. Exchange of Metabolites across the Peribacteroid Membrane in Pea Root Nodules // J. Plant Physiol. 1992. V. 139. P. 635-638.

170. Rosendahl L., Glenn A. R., Dilworth M. J. Organic and inorganic inputs into legume root nodule nitrogen fixation IIIn: Biology and Biochemistry of Nitrogen Fixation/ Eds Dilworth M.J. and Glenn A.R., Elsevier, Amsterdam. 1991. P. 259-292.

171. Rubeck A., Mouritzen P., Rosendahl L. Characterisation of aspartate transport across the symbiosome membrane in pea root nodules // J. Plant Physiol. 1999. V. 155. P. 576-583.

172. Sanders D., Brownlee С., Нефег J. F. Communicating with calcium // Plant Cell. 1999. V. 11. N. 4. P. 691-706.

173. Scarpa A. Measurement of cation transport with metallochromic indicators // Methods Enzymol. 1979. V. 56. P. 301-337.

174. Schachtman D.P., Schroeder J.I. Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants // Nature. 1994. V. 370. P. 655-658.

175. Schroeder J. I., Ward J. M., Gassmann W. Perspectives on the physiology and structure of inward-rectifying K+ channels in higher plants // Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994. V. 23. P. 441-471.

176. Smith R. J., Hobson S., Ellis I. Evidence for calcium-mediated regulation of heterocyst frequency and nitrogenase activity in Nostoc 6720 // New Phytologist. 1992. V. 105. P. 531-541.

177. Stewart W.D.N. Nitrogen fixation in plants. L.: The Athlone press, 1966. 168 p.

178. Streeter J. G. Transport and Metabolism of Carbon and Nitrogen in Legume Nodules//Adv. Bot. Res. 1991. V. 18. P. 129-187.

179. Streeter J.G. Effect of Elevated Calcium Concentration in Infected Cells of Soybean {Glycine max (L.). Merr) Nodules on Nitrogenase Activity and N Input to the Plant // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 997-1003.

180. Streeter J. G., Salminen S. O. Improved analysis of metabolite uptake by Bradyrhizobium japonicum bacteroids // Can. J. Microbiol. 1990. V. 37. P. 238-243.

181. Streicher S. L., Shanmugam К. Т., Ausubel F. // J. Bacteriol. 1974. V. 120. P. 815-821.л ,

182. Sue-Hwa-Lin. Two Са dependent ATPases in Rat Liver Plasma Membrane // Biological Chemistry. 1988. V. 263. N 25. P. 12253-12258.

183. Syono K., Newcomb W., Torrey J. G. Cytokinin production in relation to the development of pea root nodules // Can. J. Bot. 1976. V. 54. N. 15. P. 21552162.

184. Szafran M. M., Haaker H. Properties of the peribacteroid membrane ATPase of pea root nodules and its effect on the nitrogenase activity // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1227-1232.

185. Thomas M. V. Techniques in Calcium Research. L. ets: Acad. Press, 1982. P. 90-138.

186. Thorneley R. N. F. //Nitrogen fixation: Achievements and objectives: Proc.

187. Of VIII Intern. Congr. On nitrogen fixation. Knoxville, 1990. P. 103.

188. Tornton H. // Ann. Bot. 1930. V. 44.

189. Torrey J.G. Kinetin as trigger for mitosis in mature endomitotic plant cells //Exp. Cell Res. 1961. V. 23. № 2. P. 291-299.

190. Torrey J., Barrios S. Cytological studies on rhizobial nodule initiation in Pisum II Caryologia. 1969. V. 22. № 1. P. 47-62.

191. Trewavas A. J. Le Calcium, C'est la Vie: Calcium Makes Waves // Plant Physiol. 1999. V. 120. N 1. P. 1-6.

192. Trewavas A. J., Malho R. Signal perception and transduction: the origin of the phenotype // Plant Cell. 1997. V. 9. N 7. P. 1181-1195.

193. Trinchant J. C., Yang Y.-S., Rigaud J. Proline accumulation inside symbiosomes of faba bean nodules under salt stress // Physiol. Plant. 1998. V. 104. P. 38-49.

194. Trinick M. J. Biology. In: Broughton W. J. (ed.): Nitrogen Fixation. V. 2. Rhizobium. Clarendon Press. Oxford, 1982. P. 76-146.

195. Tu J. C. Rhizobial root nodules of soybean as revealed by scanning and transmission electron microscopy // Phytopathology. 1975. V. 65. P. 447-454.

196. Tyerman S. D., Whitehead L. F., Day D. A. A Channel-Like Transporter for NHt+ on the Symbiotic Interface of N2-Fixing Plants // Nature. 1995. V. 378. P. 629-632.

197. Udvardi M. K., Day D. A. Metabolite Transport across the Peribacteroid Membrane from Soybean Root Nodules // Nitrogen Fixation: Hundred years after / Eds. Bothe H. Stuttgart; N. Y.: Gustav Fischer, 1988. P. 534.

198. Udvardi M. K., Lister D. L., Day D. A. ATPase Activity and anion Transport Across the Peribacteroid Membrane of Isolated Soybean Symbiosomes // Arch. Microb. 1991. V. 156. N. 5. P. 362-366.

199. Udvardi M.K., Day D.A. Metabolite Transport across Symbiotic Membranes of Legume Nodules // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 493-523.

200. Udvardi M.K., Day D.A. Metabolite Transport across the Peribacteroid Membrane from Soybean Root Nodules // Plant Physiol. 1989. V.90. P. 982987.

201. Van Brussel A. A., Planque K., Quispel A. The wall of Rhizobium leguminosarum in bacteroid and free-living forms //J. G. Microbiol. 1977. V. 101. P. 51-56.

202. Vance C. P., Heichel G. H. Carbon in N2 fixation: limitation or exquisite adaptation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 373392.

203. Verkman A. S. Optical Methods to Measure Transport Processes // J. Membrane Biol. 1995. V. 148. P. 99-110.

204. Verma D. P. S., Fortin M. G. Nodule Development and Formation of the Endosymbiotic Compartment // Cell Cult. Somat. Cell. Genet. Plants. 1989. V. 6. P. 329-353.

205. Verma D. P. S., Ни C.-A., Zhang M. Root Nodule Development: Origin. Function and Regulation of Nodulin Genes // Physiol. Plantarum. 1992. V. 85. N. 2. P. 253-265.

206. Verma D. P. S., Kazazian V., Zogbi V., Bal A. K. Izolation and Characterization of the Membrane Envelope Enclosing the Bacteroids oa Soybean Root Nodules // J. Cell. Biol. 1978. V. 78. N. 3. P. 919-936.

207. Verma D. P. S., Long S. The molecular biology of Rhizobium-legume symbiosis // Int. Rev. cytol. Suppl. 14. 1983.P. 211-245. N. Y.: Acad. Press.

208. Vest G., Caldwell В. E. Rj4 a gene conditioning ineffective nodulation in soybeans // Crop Sci. 1972. V. 12. P. 692-694.

209. Vincent J. M., Humphrey B. A. Partition of divalent cations between bacterial wall and cell content//Nature. 1962. V. 199. P. 149-151.

210. Weaver C. D., Shomer N. H., Louis C. F., Roberts D. M. Nodulin 26, a nodulespecific symbiosome membrane protein from soybean, is an ion channel //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 17858-17862.

211. Weaver C.D., Crombie В., Stacey G., Roberts D.M. Calcium-Dependent Phosphorylation of Simbiosome Membrane Proteins from Nitrogen-Fixing Soybean Nodules // Plant Physiol. 1991. V. 95. P. 222-227.

212. Weaver C.D., Roberts D.M. Determination of the Site of Phosphorylation of Noduline 26 by the Calcium-Dependent Protein Kinase from Soybean Nodules //Biochemistry. 1992. V. 31. P. 8954-8959.

213. Werner D., Morschel E. Differentiation of nodules of Glycine max. Ultrastructural studies of plant cells and bacteroids // Planta. 1978. V.141. P. 169-177.

214. White P. J. Calcium Channels in Higher Plants // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 171-189.

215. White P.J. Calcium Channels in Higher Plants // Biochim. Biophis. Acta. 2000. V. 1465. P. 171-189.

216. Whitehead L. F., Day D. A. The peribacteroid membrane // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 30-44.

217. Whitehead L. F., Tyerman S. D., Salom C. L., Day D. A. Transport of Fixed Nitrogen across Symbiotic Membranes of Legume Nodules // Symbiosis. 1995. V. 19. P. 141-154.

218. Whitehead L.F., Day D.A., Tyerman S.D. Divalent Cation Gating of an Ammonium Permeable Channel in the Symbiotic Membrane from Soybean Nodules // Plant J. 1998. V. 16. P. 313-324.

219. Wick S. M., Hepler P. K. Selective Localization of Intracellular Ca2+ with Potassium Antimonate // J. Histochem. Cytochem. 1982. V. 30. P. 1190-1204.

220. Williams L.E., Schueler S.B., Briskin D. P. Further characterization of the1. Л Lred beet plasma membrane Ca -ATPase using GTP as an alternative substrate // Plant Physiol. 1990. V. 92. P. 747-754.

221. Wilson P. W. The biochemistry of symbiotic nitrogen fixation. Madison: Univ. Wis. Press, 1940. 301 p.

222. Wipf L., Cooper D. Chromosome numbers in nodules and roots of red clover, common vetch, and garden pea // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1938. V. 24. N 1. P. 87-91.

223. Young J. P. W. Linkage of sym-2, the symbiotic specificity locus of Pisum sativum II J. Hered. 1985. V. 76. P. 207-208.