Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ультраструктурной организации симбиотического взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ультраструктурной организации симбиотического взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

РАСХН

На правах рукописи

МОРЖИНА

Елена Валентиновна

ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СИМБИОТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель — доктор биологических наук И. А. Тихонович.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук В, Ф. Машан-ский, кандидат биологических наук Л. Н. Пароменская.

Ведущее учреждение — Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева (ТСХА).

2» 1992 г. в

Защита состоится « г»

на заседании Специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАВОТ»

Актуальность нро^ломн В .условиях современного сельскохозяйственного проигеодстш широкое исиояьзованич биологического язота в ¡земледелии возможно только на основе значительного повышения интенсивности и уффективнооти симоиотической азотфиксации. Одним из перснектаишх направлений интенсификации биологической 'фиксации азота может стать создание гисокоэф1е1;тиЕннх комплементарных пар макро- и микросимбионтов. Решения этой проблемы нсвозмогао без знания тонких механизмов взаимодействия бобогах растений с клубеньковыми бактериями.

Интенсивные исследования последних лет позволили выявить .сложный характер взаимоотношений между мокро- и микросимбионтами. Эти отношения складываются в процессе Формировании симбиоза в результате взаимного обмена сигналами между ашбиотичеекмми партнерами (Могг!Р^п,Уин», 1937; Уегап а1.,1983!. Для определении последовательности обмена сигналами используются, р. частности, различные мо дольние системы, в которых какой-либо из этапов фор?лиросания екмоиопа наружен пт»тичсч:>сш дефектом мокро- или микросимбионта («Лоиа'.чпап!?, 1<вУ; Ниипап, 1 604; ПгЛ/о.СгевеШГ, 1983). Комплэкаме исследования таких симсиотических моделей, на наш взгляд, очень перспективны и позволяют »» только установить последовательность иагов (Армирования симбиоза, но и вычленить роль каждого из с-имоцонтов в формировании различиях симбиотических структур. Наша работа предусматривалась как часть (морфологический аспект) такого комплексного изучения симбиотических моделей, проводимых во ЮТ СХМ. Работа выполнялась в рамках международного проекта "Ин-терогаозот ■?( к.Ю".

Цель и задачи работы. Целью настоящая работы явился улътра-(•труктурянЯ анализ механизмов взаимодействия между бобовым расте-т:«-м и клубеньковыми бактериями в процессе становления симбиоза на призере различных симоютаческих моделей с последующей выработкой критериев их »№ктиннооти. Взаимодействия макро- и микросимбион-т'ч- изучали ну трех критических этапах формирования и функциониро-I алия симбиоза: 1) рецепции и адгезии микроорганизмов на корнях б'<\гч1х; ?,) риходв бактерий из инфекционных нитей и дифференцирован бактерий в Оактероидн; 3) фиксации азота в зрелых, сформировавшихся клубеньках.

Конкретнее задачи работа состояли в следующем:

- изучение мехтчггА'Г! взаимодействия ризобий г. растениями

гороха и люпина на этапе инфицирования корневых волосков с помощью определения злемэнтного состава корневой поверхности рентгеновким микроанализом;

- проведение сравнительного ультраструктурного анализа аффективных и неэффективных клубеньков гороха и люпина на стадии выхода бактерий из инфекционных нитей и формирования симбиосом;

- на основа комбинаций сходных по фенотипу мутаций растений

и клубеньковых бактерий выявление роли кавдого из партнеров в процессе формирования симбшгичееких структур клубеньков;

- определение внутриклеточной локализации двух мажорных ноду-линов: леггемоглобина <Л<5 > и белка N-11 в бактероидных тканях гороха и люпина, инфицированных аффективными и неэффективными штаммами оактерий;

- определение влияния ризобиального штамма на характер локализации нодулинов леггемоглобина и N-11.

Научная новизна. В работе проведен сравнительный морфологический анализ клубеньков, образуюадхся при сочетании неаффективных (Flx~) мутантов растений и неэффективных бактериальных штаммов. В результате показано наличие своеобразного контроля над формированием симбиогаческих структур: {застеше-хозяин контролирует трансформацию бактерий а бактероиды, а бактериальный штамм - формирование и стабильность перибактароидяой мембраны ({¡БШ, имеющую исходно растительное происхождение. Впервые описана ультраструктурная организация клубеньков неэффективного мутантаха гороха "Sprint -2 "Pix".

Проведен микроэлементный анализ поверхности корнэвнх волосков гороха и люпина желтого при раннем взаимодействии с клубеньковыми бактериями.

Впервые показана локализация мааорного нодулина N-11, выделенного из клубеньков желтого люпина. Белок N-11 локализован в пери-бактероиддсм пространстве (№11) бактероидных тканой люпина.

Практическая значимость. Знание морфологического проявления конкретных механизмов, определяющих различные этапы клубенькооб-разсванид, позволяет выработать критерии подбора макро- и микросимбионтов, образующих при сочетании наиболее эффективные симбио-тические системы. Характеристика перекрестного контроля над формированием симбйотических структур позволяет вести избирательный поиск факторов макро- и микросимбионтов, влияющих на процесс клубе-

нькообразования. Полученные данные позволяют конкретизировать направление селекционного процесса у микро- и макросимбионтов в зависимости от признаков, которые они контролируют,

• Апробация работа. Результат» работы были представлены: на симпозиумах "Генетика азотфиксации" (Сегед, Венгрия,1939) и "Азотфиксация-90" (Бендлево, Польша,1990), на Международном симпозиуме по молекулярной генетике взаимодействия растений с микроорганизмами (йнтерлакен,Швейцария, 1990), на XI Всесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применению в сельском хозяйстве и медицине (Самарканд,1990), на Международном конгрессе по симбиозу (Иерусалим, Израиль,1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ. Объем и структура работы, диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав: I) обзора литературы, 2) описания материалов и методов, 3) получэных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами. Список литературы включает 200 наименований.

СОДЕШШ РАБОТЫ

Материал и метода исследований Растительный материал, постановка опытов. Объектами исследований служили различные сорта и линии люпина желтого Lupinua luteua Ь. ("Факел", "Ventus") и гороха посевного Plsum sativum L. ("Виола", "Пионер", LI7I4, "Sprint-2", "Sprint~2"Fix", "Sparkle", Е135Г). Семена линии LI7I4 получены из коллекции семян гороха С.Блнкста (Швеция); семена сорта "Sparkle"» выделенной из него линии E135Í были предоставлены проф. Т.А.ЛяРю (США); семена линии "Sprint-2" получены из коллекции Института цитологии и генетики СО АН России (Новособирск). Лилия "Sprlnt-2"Fix~ получена А.Ю.Борисовым во ВШИ СХМ путем эксперементального мутагенеза. Семена гороха сортов "Виола", "Пионер" получены из коллекции ВШИ селекции и семеноводства овощных культур (Москва), люпина сорта "Факел" (К 1943) - из коллекции ВИРа, сорта "V,entus" - из коллекции Института биологии растения Сельскохозяйственного университета (Варшава).

На основании различных сочетаний сортов и линий бобовых растений с эффективными и неэффективными бактериальными штаммами по-

лучали различные варианты элективного и неаффективного симбиоза, которые затем использовали для сравнительного ультраструктурного анализа.

Работа выполнялась в условиях веготационых опытов в теплицах или вегетационных домиках на базе Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВА0ХН4Л), а также на оазе Института биохимии Сельскохозяйственного университета (г.Познань). Растения выращивали индивидуально в керамических сосудах в стерильном кварце-вом песке или перлите, а такие в гидропонных условиях на оогазотистой среде (Прянишников,1962). Инокуляцию проводили водной суспензией бактерия в расчете 10'~Ю° клеток/ растение. Исследовали 4-5-днешыо проростки лшина и гороха, а также растеши всех више названных вариантов в фазе бутонизации-цветения и на стадии старения клубеньков.

Бактериальные штаммы и их культивирование. Для инокуляции использовали ризобиальные штаммы из коллекции НИИ СХМ: 2&0а (1026, эффективный - ilx+) и 2486 (¡064, неоф£»ктившй - fix") R.leguini-nosarom (для гороха), 367а (1614, Их*) и 400 (1603, fix-) R.luptnl (для люпина).

Бактерии R.legumlnosarura выращивали люо в прооирках на скошенном Оооовом агаре в термостате при 28°С в течение 3-х суток, либо в жадной среде ТУ (Berlnger.1974) в колбах на качалке при 140 об./ мин. в течение суток. Для бактерий R.lupini использовали машштно-дроиавую среду и культивировали в термостате при 28"с в точении Ь суток.

Злектронномикроскопичеокне методц. Для проведения ультраструктурных исследований использовали методы сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии (ЭМ). Материал (клубеньки, корни растений) для сканирующей ЭМ фиксировали 2,5% глутаровны альдегидом, обезволивали и высушивали в установке для сушки при критической точке в жидком СОг (НСР-2,"Хитачи"). Высушенный материал препарировали к монтировали на продавтше столики. После напыления серебром в катодно-ионном испарителе материал исследовали в сканирующем электронном микроскопе JSM-T200 ("Дкеол") при ускоряющем напряжении 16 кВ.

Для трансшсиошой ЭМ материал фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом, 1% раствором 0s0t, IS галловой кислотой, затем обезволивали в спиртах и заключила в заливочные среда (аралдит, зпон).

Ультратонкие срезы готовили на ультратомах LKB-III (Швеция) и Reichert-Young (Австрия), контрастировали уранилацэтатом и цитратом свинца. Исследования проводили в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 ("Хитачи") при ускоряющем напряжении 70 кВ.

Рентгеновский микроанализ. Корта проростков люпина и гороха замораживали в жидком азоте (скорость замораживания 7-8 тис. град/ сек), затем высушивали в вакуумном испарителе» после затвердевания азота. Материал монтировали на берилливыэ или алюминевые держатели и производили термическое напыление углем. Исследования проводили, а сканирующем электронном микроскопе JSM-T300 (ускоряющее напряжение 16 кВ), снабженным рентгеновским микроанализэтором системы Link Mod 860-500 (время набора сигналов - 100 сек, глубина зонда - 10 мкм.

Электронная иммуноцитохимия. В работе использовали непрямой метод иммуномаркнрования с использованием коллоидного золота, ко-ньюгированного с бэлком-А. Стандартный раствор коллоидного золота готовили по методике Слота я Гензе (Slot,Gense,1985). Определение локализации белков проводили с помощью мотоспецифичэской антиснво-ротки против Лб, антител против бежа N-11 и рибосомалышх белков 17/112 E.coli, полученными из Института биохимии Сельскохозяйственного университета г.Познань.

Внутриклеточную локализацию Лб изучали на протопластах инфицированных клеток клубеньков люпина. Для выделения протопластов использовали смесь ферментов (Wool,Braugton,1979). В инкубационных средах полученные протопласты выдерживал}! в течение суток при 4°С. После проведения иммуноцитохимичесШа реакций материал обрабатывали по общепринятой схеме. По этой же методике исследовали локализацию Лб и белка N-11 на предфиксировашшх срезах клубеньков люпина и гороха.

Для определения локализации Лб и бежа N-11 на ультратонких срезах клубеньков гороха и люпина материал фиксировали смесью 4% параформальдетада и 2,5% глутарового альдегида, заключали в эпон. Ультратонкие срезы монтировали на никелевые сетки. Иммуноцитохими-ческую обработку проводили по методу фирмы Jansens с нашими моди-фикащмми.

Результаты и обсуждение

- е -

I, Морфологический и микроалементный анализ первых этапов инфицирования корней гороха и люпина.

С целью выяснения механизмов взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями на этапе прикрепления к корневой поверхности исследовали проростки 4-5 дневных проростков люпина сорта ' ''Факел" и гороха сорта "Виола", инокулированныв эффективными 250а R.ieguinlnoaarum и 367а R.luplnl штаммами.

Изучение зоны растущих корневых волосков люпина в сканирующем электронном микроскопе показало искривленные и разветвленные корневые волоски с прикрашенными к их поверхности ризобиями. Методом .рентгеновского макроанализа исследовали зону кончика корневого волоска с прикрепленными оаклериями (рпсЛ,а,в) и свободную от них (риоЛ.о.г). Согласно литературном данным (Brewin.1991; Callacham, Тоггеу.1988; Sralt et al.,1986), именно кончик коревого волоска, характеризующийся аморфной клеточной стенкой и поляризованной цигогаизматической мембраной, является сайтом прикрепления и проникновения бактерий. Рентгеновский микроанализ таких зон показал содержание 7 элементов: AI, Р. S, Ca, Ге, Zп, Си (рис.1). Из них AI, Ре, Zn, Си обусловлены фоном 'держателя объекта (рис.1,д). Особое внимание ш обратили на содержание кальция, т.к. в настоящее время высказаны предположения об участии этого элемента в процессах рецепции и адгезии клубеньковых бактерий на корнях бобовых (Bi*ev/in,1991; Morris et al.,1989; Smit et al.,1986). В ионах прикрепления к поверхности корневого волоска бактериальных клеток по сравнению с зонами, свободными от ризобий, в ряде случаев отыеча-отся повышенное содержание кальция (рис Л, a).- to полагаем, что повышенное содержание Саг* в локусах прикрепления бактерий к корневым волоскам, вероятно, отражает начало развития инфекционного процесса.

Исследование растущих корневых волосков гороха не выявило какие-либо морфологические особенности в их строении. Рентгенов-опий микроанализ показал наличие следующих элементов: AI, Si, К, Gl, Р и оа (рис:, 2). Их toix содержание а1 и Si обусловлено фоном держатели объекта (рис. 2,в). На основании данных, микроанализа wj считаем шзмомшм разделить все корневые волоски по уровню со-Дораання К, .01, Р, и Ca. В искривленных корневых' волосках (рис.1а) сш чапось тюышпшюо содержание К, и С,1 по сравнению с таковым

Рис Л. Данные рентгеновского микроанализа поверхности корневых волосков люпина желтого с прикрепленными бактериями (а,в) и без бактериальных клеток (б,г); фоновый спектр держателя объекта (д).

II !I

¡Г

1 I

да

Г "ч'^м^лЛ..,

, - - Ч».....)

атм о - и.м

& - ш

I I'

1,У '.•••■■•..• Л!

-г ' - ми» _ .........

О а""

л 1 ь> 11! и I. {11 и ¡. 111 ти 1иш< * ч . 1 >т> и 11Г111

Рис.2. Данные рентгеновского микроанализа поверхности искривленных (а) к неисривленных (0) корневых волосков гороха; фоновий спектр держателя объекта (в)

неискривленных (рис. 16). По нашему мнению это может свидетельствовать об изменениях в интенсивности синтеза олиго- и полисахаридов, входящих в состав оболочек и слизистых выделений корневых волосков. Транспорт (выведение) соединений полисахаридной природа часто бывает сопряжен с транспортом К и .соответственно, 01. Повышенное содержание Са, также отмеченное в искривленных корневых волосках, определяется, как нам кажется, обязательным присутствием и участием этого катиона в процессах рецепции и связывания между растительной и бактериальной клетками. Показанная разнокачественность корневых волосков по содержанию кальция, возможно, связана с их способностью к инфицированию клубеньковыми бактериями. Следовательно, уже на самых ранних этапах взаимодействия судьба' инфекционного процесса определяется не только воздействием бактерий на корневые волоски, но и предрасположенностью корневых волосков к бактериальному воздействию.

Полученные данные позволяют сделать вывод о наличии двух популяций корневых волосков: предрасположенных и непредрасполокен-шх к развитию инфекционного процесса. Такая разнокачественность корневых волосков может определять, вероятно, успех и чартоту инокуляции. В том числе, это может иметь значение для выяснения возможного влияния на процесс инокуляции растения-хозяина.

2. Ультраструктурная организация клубеньков при эффективном и неэффективном симбиозе.

Следующим критическим этапом развития симбиотических отношений является выход бактерий из инфекционной нити и формирование симбиосом. На этом этапе был проведен сравнительный морфологический анализ эффективных и неэффективных симбиотических моделей. Для создания симбиотических моделей использовали различные сочетания ,' макро- и микросимбионтов, в том числе- Р1х~ мутанты гороха и неэффективные ризобиальные штаммы (табл.1).

сорт/линия растеши ризобиальный штамм

желтый люпин (1ир1пиз 1Ш;еиз I.):. "Факел" "Факел"

ИЛирШ: 367а (11х+) ' 400 (Их")

горох (Р1виш ваЧтш I.):

II. 1е0лт1позагиш: 250а (Их+) 2486 ")

"Пионер" "Пионер" "БрЦги-2" "Брг1п1;-2"

250а 2480 260а 2480 250а 250а

"Бргип-гччх" "Эргш-г^х"

"ЗрагК1с" Е135Г

ТаблЛ. Варианты эффективных и перфективных симбиотических моделей.

Морфологичнеким критерием эффективности каждого • варианта мы считали строение симОйосом, т.к. симбиосома является результатом взаимодействия симбиотичоских партнеров и доетаточнот полно отражает состояние сиыоиотической системы в целом. В качестве обобщения полученных результатов ни предлагаем следующую схему строения симбиосом клубеньков гороха (рис 3).

Рис.0. Схема строения симбиосом различных симбиотических моделей.

Из данной схемы видно, что все изученные варианты

г

эфЛсктивных оимбиотических пар (рис. Э,а,с,е) имеют тшшчпую для эффективного симбиоза ультрнструктурную организацию и показывают большое сходство в строении бактероидах тканей. Такое строение выражается в наличии сформщюваишйхся оимбиотических структур: I) симбиосом, включающих перибактероидау» мембрану , 1-2 бактероида, перибактероидное пространство ; 2) дифференцированных бактероидов; 3) полного набора цитоплазматических структур растительных клеток. Аналогичную ультраструктурную организацию имеют эффективные клубеньки люпина желтого.

В рассмотренных вариантах неэффективного симбиоза можно виде лить общие признаки, выражащеся в редукции числа и размеров 'бактероидов в клубеньках (рис. 3,b,d,f,g,ti).

С учетом осооэностей строения симбиосом мы объединили все неэффективные варианты в следующие группы: а) неэффективность, обусловленная бактериальным штаммом; б) неэффективность, обусловленная растительным мутантом; в) неэффективность, обусловленная сочетанием растения-мутанта и неэффективного бактериального штамма.

а) К морфологическим признакам проявления неэффективного бактериального штамма принадлежит раннее старение бвктероидных тканей, выражающееся в раннем разрушении ПВМ и бактероидов '(рио. 3, b,d). Сходную картину деградации НЕМ и цитоплазматических структур бактероидной ткани обнаруживают,клубеньки и Р1х~-мутвнта El35f при сочетании с 250а тт. H.legumlnoaarum. Таким жэ образом проявляется неэффективность бактериального штамма в клубеньках люпина желтого варианта "Факел" t- 400 R.l. с той лишь разницей! что в бактероидах накапливается большее количество гранул поли-|3-оксимасляной кислоты (ПОМ).

Полученные результаты подтверждают литературные данные (Werner et al.,1991) об определяющем контроле со стороны микросимбионта над . формированием и поддержанием стабильности ITEM, которая исходно имеет растительное происхождение (Robertson et al.,1978).

б) Мутант "Sprint-2"Pix" отличается рядом уникальных признаков строения клубеньков (рис. 3,g): I) отсутствием дифференцированных бактероидов, выражающимся в их сходстве с бактериями в шфокционнн* нитях (Ю1) по форле, размерам и электронной плотности; 2) наличием нескольких бактериальных клеток в одной Мг-фиксирующей единице,,

не свойственное для Йактероидних тканей гороха;' 3) замодЛей-Шм или сходным о диким типом старением клубеньков.

На основании сравнения строения клубеньков варианта "Sprint-2"Fix" + 250а с литературными данными (Fischer et al.,1986; Robertson et al., 1978; Sutton,1983; Vance, Jolmson.l983;) можно сделать вывод, что аномальное строение симбиосом в этом варианте вызвано генетическим дефектом растения-хозяина. Нарушение формирования симбиоза происходит,' предположительно, на стадии выхода бактерий из инфекционной нити и-выражается в отсутствии дифференцировки бактерий в • бактероиды. Следовательно, фенотип варианта "Sprlnt-2"Fix~ + 250а следует определить как неспособность растения индуцировать трансформацию бактерий в бактероиды. Таким образом процесс дифференцировки бактероидов контролируется со стороны растения.

в) В клубеньках, образующихся при сочетании мутанта "Sprlnt-2"Fix~H 2486 шт. R.leguminosarum (fix-), проявляются признаки как Fix- мутанта (отсутствие дифференцированных бактероидов), так и неэффективного бактериального штамма (ранняя деградация ПБМ и бактероидов). Строение клубеньков этого варианта, очевидно, может свидетельствовать о независимости контроля со стороны растения-хозяина и микросимбионта над формированном некоторых симбиотических структур.

Полученные результаты сравнительного морфологического анализа показывают, что при формировании клубеньковых структур наблюдается перекрестная регуляция: стабильность структур растительного происхождения (ПБМ) определяется микросимбионтом, а дифференцировка бактерий в бактероиды требует соответсвующего сигнала со стороны растения. Использование различных мутантов (бактериальных и растительных) показало также, что признаки нарушения формирования симбиоза целесообразно группировать не по происхождению, а по тому, какой этап нарушен. Это еще раз свидетельствует о том, что симбиоз является генетически единой иситемой.*

3. Исследование иммуноцитохимической локализации леггемогло-бина и белка М-11 в бактероидных тканях гороха и люпина.

Наиболее интересной в практическом значении является стадия азотфиксации, которая сопровождается экспрессией некоторых белков - нодулинов. Показанные нами различия в ультряструктурной организации клубеньковых тканей, обусловленные неэффективными бактериальными штаммами, должны также отряжаться в различных биохимических

изменениях, происходящих и зрелых, функционирующих клубеньках. В работе било проведено иммуноцитохимическое изучение локализации двух поздних мажорных нодулинов: леггомоглобина (1Ь) и появляющегося в клубеньках одновременно с № нодулина N-11 в эф!»ктивных и неэффективных клубеньках гороха и люпина.

Первоначально определение внутриклеточной локализации ЬЬ было проведено на протопластах инфицированных клеток клубеньков липина. Нами было показано, что ЬЬ в клетках 40-дневных эффективных (при сочетании с 367а И.1ир1п1) клубеньков люпина имеет цитоплазматиче-скую локализацию. Меченные коллоидным золотом сайты локализации ЬЬ обнаруживаются в том число в непосредственной близости от'ГПЗМ или а контакте с ней (рис. 4а).

Рис. 4. Иммуноцитохимическая локализация нодулинов ЬЬ (а) и N-11 (б) в бактероидных тканях люпина.

Более детальное определение субклеточной локализации ЬЬ и белка N-11 проводили на прэдфиксированннх срезах клубеньков и на эпоновых ультратонких срезах клубеньков' лютша и гороха.

В инфицированных клетках 21-, 28-, 45-дневных эффективных клубеньков ЬЬ локализуется в цитоплазме растительной клетки, в том числе в непосредственной близости от ПБМ, в области профилей ЭПР, в ядре. Цитоплазматтическая локализация ЬЪ в неэффективных клубеньках люпина (после инокуляции 400 шт. В.1ир1п1) тех жэ возрастов была диффузной, без определенной связи с клеточными органеллами.

Нам удалось показать, что мажорный нодулин N-11, выделенный

из клубеньков' желтого люпина и сходный по относительному содержанию в клубеньках и по динамике с Lb (Madrsak et al.,1990), в 17-, 21-, 28-, 45-дневных клубеньках люпина локализован, главным образом, в ПБП бактероидных тканей (рис. 46). В неэффективных клубеньках тех же возрастов распределение бежа N-11 было таким же, но интенсивность маркировки была значительно меньше.

Внутриклеточная локализация № в клубеньках 21-, 28-, 45-дне- . вного возрастов эффективных (при сочетании с 250а шт. R.legumino-sarum) клубеньков гороха оказалась аналогичной таковой для люпина. Интенсивность (плотность) маркировки в течение развития клубеньков не изменялась. В инфицировашх клетках неэффективных клубеньков (после инокуляции 2486 шт. R.legumlnosarum) Ib был локализован также в растительной цитоплазме, но имел диффузное распределение, без связи с клеточными оргянеллами.

Полученные наш результаты по локализации Lb в•бактероидных тканях гороха и люпина хороню согласуются с литературными данными (Robertson et al.,1984; VandenBosch,NeTComb,1988). Они подтверждают функцию этого белка как переносчика 02 и позволяют сделать предположение о более широких функциях Lb в клубеньках. На основании показанной нами локализации нодулина N-11 в ПБП клубеньков люпина можно предположить, что этот белок является частью челночной системы ПБП или принимает участие в архитектонике ПБП в качестве структурного белка.

Полученные результаты показывают, что в зависимости от эффективности бактериального штамма распределение Lb, а также уровень экпре-ссии Lb и белка N-11 изменяется. Возможно, контроль со стороны ми-кросимбионга над стабильностью симбиоткческих структур, определяется, в частности, за счет локализации или уровня экспрессии ноду-линов. Эти данные также подтвервдают 'единство системы генетическо-, го контроля на более поздних этапах функционирования симбиоза. Выводы:

1. Методом рентгеновского микроанализа поверхности корневых волосков гороха и лгаина, инокулированных эффективными ризобиальными штаммами, показана разнокачественность по элементному составу корневых волосков: по содержанию Ca2" корневые волоски подразделены на две популяции.

2. Рентгеновским микроанализом показано повышенное содержание Саг* в локусах прикрепления клубеньковых бактерий к поверхности

корневых волосков, что может указывать на участие кальция в процессах адгезии и рецепции.

3. Впервые дана морфологическая характеристика растительного мутанта "Sprint2"Fix~, что позволяет оценить его фенотип как неспособность растения-хозяина индуцировать процесс трансформации бактерий в бактероиды.

4. Сравнительный ультраструктурный анализ эффективных и неэффективных клубеньков различных симбиотических моделей позволяет выявить перекрестный контроль макро- и микросимбионтов в формироватш специфических симбиотических структур: формирование и стабильность ПБМ определяется главным образом микросимбинтом, а процесс дйффе-ренцировки бактероидов контролируется растением-хозяином.

5. Иммуноцитохимическим методом показана локализация нодулина N-11 в перибактероидном пространстве клубеньков люпина.

6. На основании иммуноцитохимического изучения аффективных и неэффективных клубеньков гороха и люпина показана определяющая роль бактериального штамма в уровне экспрессии Lb и нодулина N-11.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Е.В.Моржина, В.К.Лебский. Ультраструктурный и элементный . микроанализ ранних этапов инфицирования микроорганизмами корней

люпина шлтого.// Тэзизы докладов Одиннадцатой Всесоюзной конференции по биологической роли микроэлементов и их применению в сельском хозяйстве и медицине. Самарканд, 3-5 окт., 1990. T.II, С. 289290.

2. Е.В.Моржина, А.Ю.Борисов, О.А.Куликова, В.К.Лебский. Ульт-. раструктурный анализ эффективных и неэффективных клубеньков гороха

// Цитология. 1991. Г.33. 'ji3. С. 3-7.

3. Е.В.Моржина, В.К.Лебский, Ц.Монджак, В.Голиновский, А.Ле-гоцкий, М.А.Тихонович. Иммуноцитохимическая локализация лэггемог-лобина и нодулина N-11 в бакгэроидных тканях развивающихся клубеньков гороха и люпина желтого.// Цитология. 1991. Т. 33. JJ7. C.I6-19.

4. E.V.Morzhlna, С.J.Madrzak, V.K.Lebsky, I.A.TiKhonovich. Immunocytochemlcal localization of ledhemoglobin In Infected cells of Luplnus luteus and Plsun sativum root nodules.// Proceedings of the 5 th. Scientific Symposium of Socialist Contriea on Blotechno-

logy. Balatonuzeplak. Hungary, 4-8 Sept., 19;J9. P. 300-301.

5. C.J. Madreak. V.Letoky, E.Norehina, А. В Ляг,orkl. NortuUn N—11: The peribacteroid space protein from Jellow lupin.// Proceedings of the 5 th. International Symposium on thr; Molecular One-tic of Plant-Microbe Interaetionn. Interlaof'n, Switzerland,

Sept., 1990". P.¿39.

6. I.Tlkhonovlcli, A.Filat'V, AJ'urlKov, H.Kru-,htnlna, V Arbr -ky, E.Morshiua. The pea symbiotic mutant.*! ws a mc-b-J for Ktadylng the Interaction between micro- and ma'TwiymbloiiUi 'ri the proems:; of nitrogen fixation.// Proceeding.'! of Ui<> Jntfroatlr-nal Symbiosis Congress. Jmiuulero, Israel, IT Ы N-v., 1'«». lv\

рги./'1Ш.В*Р.з«к.ГхЗ.").Тяр.10п. f. .V? .'лм'.-тл wtho.