Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономия и симбиотические свойства клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника, копеечника, солодки, вязеля и стальника

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и симбиотические свойства клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника, копеечника, солодки, вязеля и стальника"

РГ6 од

» 7 [¡ДО \ { и,¡.у-.'О

всероссийский научно-исследовательскии институт

сельскохозяйственной микробиологии

РАСХН

На правах рукописи

ПАВЛОВА Елена Авгусговна

ТАКСОНОМИЯ И СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ АСТРАГАЛА, ОСТРОЛОДОЧНИКА, КОПЕЕЧНИКА, СОЛОДКИ, ВЯЗЕЛЯ И СТАЛЬНИКА

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург

1993

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биологического азота Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник А. П. Кожемяков.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор В. К. Шильннкова; кандидат биологических наук С. А. Четкова.

Ведущее учреждение — Институт физиологии растений РАН.

Защита состоится « Ч » 1993 г. в 10 час. на

заседании Специализированного совета К.020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологичесих паук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активный интерес к клубеньковым бакте-эиям вызван их участием в трансформации атмосферного азота в лег-(0 усваиваемые растениями соединения, а также широким практическим ^пользованием их иакросимбионтов - бобовых растений, являющихся 1енныи источником белка и ряда других биологически активных -ве-»еств. На-основе этих микроорганизмов производят препарат ризотор-[)ин, который используют для обработки семян перед посевом, что гаособствует увеличению урожая бобовых культур, улучшению их ка-[ества, повышению плодородия поЧвы (Доросинский, 1970; Мишустин, 1илышкова, 1973).

В последние годы внимание к себе привлекают перспективные'для ^пользования новые кормовые и лекарственные бобовые растения, та-[ие как астрагал, солодка, копеечник, стальник и многие другие, [екоторые из них вводятся в культуру в настоящее время. В связи с ии'и встает необходимость детального изучения их биологии, в том шсле способности фиксировать молекулярный азот атмосферы в симби-(зе с клубеньковыми бактериями. В отличие от ризобий, специфичных 1ля традиционных бобовых культур, в почвах, как правило, отсутст-|увт эффективные штаммы для интродуцируемих бобовых, поэтому требуется селекция клубеньковых бактерий, которые могут служить для [роизводства инокулянтов под эти растения.

С другой стороны^ изучение "новых" ризобий должно значительно 1асширить наши представления о таксономии и филогении клубеньковых 'актерий, приблизить нас к построению естественной классификации нутри семейства НМгоМасеае.

цель а задачл работы. Целью настоящей работы явилось изучение' лубеяьковых бактерий, являющихся микросимбионтами астрагала (Аз-;га§а1иа) ^ остролодочника (Оху^орхэ) , солодки (й1усуггЫга), опеечника (НеЛузагиш) ( вязеля (Согошна) и стальника (Опо-

, а также селекция высокоактивных штаммов для этих п^рспектив-ых бобовых культур. В нашу задачу входило: создать коллекцию клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника, солодки, копеечника, вязеля и стальника, имеющих различное географическое происхождение;

изучить морфологические и физиолого-биохимические особенности этих бактерий;

определить таксономический статус клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника, копеечника, солодки, вязеля и стальника в

- г -

пределах семейства Rhizobiaceae с помощью метода "нумерической таксономии";

- изучить хозяйскую специфичность штаммов Rhizobium sp. (Astragalus), Rhizobium sp.(Oxytropis), Rhizobium sp.(¡ledysarum), Rhizobium sp.(Glycyrrhiza),Rhizobium o'p. (Coronilla) f Rhizobium sp. (Ononis) |

- провести селекцию высокоактивных штаммов для перспективных бобовых культур.

Научная новизна. В работе впервые показано, что:

- клубеньковые бактерии астрагала, остролодочника, копеечника,.солодки, вязеля и стальника являются родственными и таксономически

близки штаммам вида Rhizobium loti¡

- исследованные бактериальные изоляты. и клубеньковые бактерии ляд-венца (Rhizobium loti ) могут быть выделены в отдельный род, занимающий промежуточное положение между родами Rhizobium и Bradyrhizobium в семействе Rhizobiaceae}

- изученные штаммы Rhizobium loti, Rhizobium sp.(Astragalus), Rhizobium sp. (Coronilla) , Rhizobium sp.,(Hedysarum), Rhizobium sp. (Glycyrrhiza), Rhizobium sp, (Oxytropis), Rhizobium sp. (Ononis) представляют не менее двух новых родственных видов в пределах нового рода;

- клубеньковые бактерии астрагала, копеечника, остролодочника образуют группу перекрестной'инокуляции, которая, в свою очередь, входит в обширную группу смешанной инокуляции,включающей также ризобии солодки, вязеля, стальника и лндвенца;

- бактероиды, обнаруженные в клетках эффективных корневых клубеньков растений Ononis arvensis . имеют уникальную морфологическую структуру.

Практическая значимость. Проведена селекция эффективных штаммов клубеньковых бактерий, которые могут быть использованы для производства ризоторфина под астрагал, копеечник, стальник и вязель. На штаммы клубеньковых бактерий CIAM 3401 Rhizobium sp. (Coronilla; и CIAM 3502 líhizobium sp. ('Ononis) получены положительные решения на выдачу авторских свидетельств. Совместно с Н.И.Воробьевым создана компьютерная программа для обработки данных "нумерической таксономии" и проведения кластерного анализа, отражающего уровень сходства 'между исследуемыми микроорганизмами в многомерном пространстве признаков. Результаты изучения хозяйской специфичности клубоньковых бактерий могут быть использованы .в сельскохозяйственной практике при применении ризоторфина и интродукции новых бобовых культур.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на: Всесо-озной конференции "Состояние и перспективы научных исследований ю интродукции лекарственных растений" (Москва, 1990), Всесоюзной конференции "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата. 1990); I Республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйстве" [Кишинев, 1991); 1У Зсесоюзной конференции "Микроорганизмы в сель-:ком хозяйстве" (Пущино-яа-Оке, 1992); УШ Симпозиуместран Восточ-юй Европы "Нитрогенфикс-92и (Саратов, 1992); IX Международном <онгрессе по азотфиксация (Мексика, 1992); годичном собрании Рос-зельхозакадемия, секция земледелия (Москва, 1993); заседании Всероссийского Ботанического общества (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано II работ и полу-шны два положительных решения на выдачу авторских свидетельств на дтаммы клубеньковых бактерий.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 207 страницах машинописного' текста и состоит из введения; обзора штературы; описания материалов и методов; .трех глав, в которых [зложены полученные результаты и их обсуждение; заключения; выво-шв и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и !5 таблицами. Список литературы включает 280 наименований, из [их 35 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований

Объектом наших исследований служили штаммы клубеньковых бак-ерий с неизвестным таксономическим положением, являющихся микро-имбионтами астрагала и родственных ему бобовых растений: остроло-очника, солодки, копеечника, стальника и вязеля. Часть этих мик-оорганизмов была получена из Национальной коллекции клубеньковых актерий (ВНИИ с.-х. микробиологии), а остальные штаммы были ви-елены нами из природных корневых клубеньков соответствующих бобо-ых растений.

Штаммы бактерий семейства ныгоМасеае с известным система-ическим положением были использованы в качестве контрольных.

Всего исследовано 84 штамма- бактерий.

В стерильных микровегетационных опытах, а также в вегетацион-ых опытах были использованы мелкосемянные растения, имеющие раз-ичное таксономическое положение внутри семейства Ьебшп1позае.

Бактериальные штаммы выращивали при 28°С на маннитно-дрожже-вом агаре (Vincent \ 1970). Изучение физиолого-биохимических признаков проводили традиционный» методами (Методические указания по идентификации неспоровых бактерий, доминируюидах в ризосфере, 1985; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1982).

Метод "нумерической таксономии" был применен согласно известным рекомендациям (Классификация и кластер, 1980). Кластерный анализ проводили по программам, составленным Н.И.Воробьевым.

Сиибиотические свойства изучали в условиях стерильного микровегетационного, а также вегетационного опытов (Методические указания, 1982; Методические рекомендации, 1984; Починок, 1976).

Исследование ультраструктуры клубеньков было выполнено в Институте физиологии растений РАН под руководством И.Н.Андреевой методами трансмиссионной электронной микроскопии (Андреева и др., 1986).'

Статистическую обработку всех экспериментальных данных проводили, используя общепринятые методы (Лакин, 1980). Обработку результатов микровегетационных и вегетационных опытов проводили с помощью дисперсионного анализа (Доспехов, 1972).

Результаты и обсуждение

I. Определение таксономического положения клубеньковых бактерий астрагала и бактериальных изолятов hS родственных астрагалу бобовых растений методом "нумерической таксономии"

В результате применения метода "нумерической таксономии" и проведения кластерного анализа была п<Жтроена дендрограмма (рис.1) отражающая таксономическую близость клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника, копеечника, солодки, вязеля и стальника и представителей сем. Rhizobiaceae , идентифицированных до вида.

Все проверенные штаммы были сгруппированы в 13.кластеров. Уровень сходства между быстро- и медленнорастущими клубеньковыми бактериями (роды Rhizobium и Bradyrhizobium) составил 0,24.

Клубеньковые бактерии астрагала, солодки, остролодочника, копеечника, вязеля и стальника формировали 2 таксономически близкие группы, В одну ИЗ которых ВОШЛИ штаммы вида Rhizobium loti (группа I:''КЛ£отеры 7-9). Этот факт свидетельствует о-родстве микроорганизмов группы I клубеньковым бактериям лядвенца и находится в соответствии о данными фаготипирования, полученными ранее (Новико-

Уровень сходства .

Рис.1. Дендрограмма, отражающая родство между различными штаммами бактерий семейства шигоЫасеае.'

штаммы,' являющиеся центральными в группе. Могут быть рекомендованы в качестве типовых для таксономической группы

ва, Лимещенко, 1992). Внутри группы I наибольший уровень сходства (О,63) с ризобиями лядвенца показали штампы клубеньковых бактерий более южного географического происхождения (кластер 7): CIAM 3101 Rhizobium sp. (Glycyrrhiza) (Туркменистан), CI Am 3502 R.sp.(Ononis) . (Украина) и CIAM 3403 н-sp.(Coronilla) (США). Бактериальные изоляты из гомологичных'растений-хозяев, попавшие в другие кластеры этой группы, имели иное географическое происхождение.

Клубеньковые бактерии астрагала и остролодочника алтайского происхождения, за исключением штамма CIÁM 0211 K.sp. (Astragalus), образовали отдельную группу (группа П: кластеры 10-13), причем .уровень сходства между группами I и П был довольно низким (0,44),'что позволяет говорить об их различии,по крайней мере,на уровне вида. С другой стороны, уровень сходства между штампами выявленных таксономических групп и другими быстрорастущими ризобиями не превышал 0,36, что свидетельствует о значительной удаленности этих групп микроорганизмов от бактерий родов Rhizobium И Bradyrhizobium.

В результате применения компьютерного анализа была также построена таблица дифференцирующих характеристик для штаммов из групп I И П И видов Rhizobium И Bradyrhizobium (табл.1). '

Таблица I

Дифференцирующие признаки ДЛЯ ВИДОВ Rhizobium и рода Bradyrhizobium

П ризйак • R. loti R.legu-minosa- R.raeli-loti R.ga-legae род Bradyrhizobium

груп ría I - группа П rum

I 2 3 5 6 7

Ско-ро-сть роста:

2-3 сутки - - + + + - •

4-7 сутки + + - -

8 и более суток - - - - - +

Рост при 37°С d - d + d +

Рост на МПА - - - + - -

Рост на 1,5$ N801 d d + + + -

Рост на лакмусовоы молоке :

.РЗдкисление - - - d - -

коагуляция + d - + + -

Рост па ксилозе d + d d + ■ .. + ■

Рост на арабинозе ♦ d + • + + +

Продолжение таблицы I

Подкисление среды при утилизации:

ксилозы с1 + а • а <1

лактозы + + .+ + + -

арабинозы, рамнозы, ыаннозы + <1 + + +•

раффинозы + + - + +

Подкислеяие среды при росте на минеральных источниках азота +++++-

Устойчивость к антибиотикам:

въг (25 мг/л) л а +

■ нис (20 иг/л) -._--- +

Кш (25 мг/л) а - - а + +

' Ра (ю мг/л) а - а + + -

Ар (10 мг/л) а - + + + -

Рост на среде, содержащей в качестве единственного источника "С" и "Л":

валин а. а а + + +

серин а а + + ■ + +

Подщелачивание пра росте на среде, содержащей:

пролин + + а - - +

серин а а а - - а

Обозначения:

"+" - более 95/0 изученных штаммов давали положительный ответ; и_ более -95/&изученных штаммов давали отрицательный ответ; "а" - менее 95% штаммов давали положительный ответ.

Данные физиолого-биохикических исследований показали, что мик-оорганизмы из групп I и П были не просто удалены от бактериальных одов Hhi2obium и Braayrhizobium , а занимали промежуточное оложение между ними.

Штаммы Rhizobium sp. (Astragalus) неалтайского происхождения, . sp.(Gljcyrrhiza),H.sp. (Heaysarum), H.sp. (Ononis), R.sp.(Coro-illa) по физиолого-биохимическим свойртвам существенно не отли- ' ались между собой, а также от штаммов R.loti . Клубеньковые бак- ■ зрии астрагала и остролодочника алтайского происхождения по боль-листву исследованных характеристик были сходны < .штаммами груп-

пи I, за исключением таких свойств, как термочувствитольность, способность к коагуляции при росте на лакмусовом молоке, способность утилизировать некоторые углеводы, устойчивость к некоторым антибиотикам.

Все исследованные нами штаммы клубеньковых бактерий астрагала, солодки, остролодочиика, копеечника, стальника и вязеля -граыотрицательные подвижные палочки. Эти микроорганизмы, также как и ризобии лядвенца, формировали на маннитно-дрожжевом агаре слабоокрашенные, круглые, с ровным краен, выпуклые, слизистые колонии. Измерение кислотности культуралыюй жидкости 2-суточных культур данных ризобий показало варьирование рИ от 4,4 (для штаммов CIAM 1414 Rhizobium sp. (Hedysarum) И CIAM 3120 Rhizobium зр. (Glycyrrhiza)) до pH 6,6 (ДЛЯ штаммов CIAM 1412 Rhizobium sp.(Hedysarum) и CIAM 0201 Rhizobium sp. (Astragalus))при ИСХОДНОМ значении рН среды 6,9. Проверенные штаммы не разжижали желатину. При утилизации углеводов газообразования не наблюдалось.

Проанализированные в качестве контрольных штаммы клубеньковых бактерий лядвенца и язвенника имели сходные характеристики с бактериальными изолятами из растений Lotus spp. , описанными ранее в качестве типовых штаммов вида K.loti (Jarvis et al. .1982).

2. Изучение хозяйской специфичности клубеньковых бактерий астрагала и бактериальных изолятов из родЬтвенных астрагалу'бобовых растений

Изучение хозяйской специфичности штаммов Rhizobium-sp. (Astragalus) и родственных им ризобий проводили в условиях стерильного микровегетационного опыта. Ни один из проверенных изолятов не нодулировал растения Medicago sativa, Trifolium pratenseil Galega orientaiis. Суммарные результаты опытов приведены в таблицах 2 и 3.

Штаммы Я.sp.(Astragalus), R.sp.(Oxytropis) , R.sp.(Hedysaruo) (табл.2) не обладали строгой хозяйской специфичностью по отношению к проверенным бобовым растениям и имели сходный характер взаимодействия с данными макросимбионтами, за исключением ризобий копеечника, которые не модулировали растения лядвенца. Клубеньковые бактерии остролодочника и некоторые штаммы н.вр.(Astragalus) алтайского происхождения вступали в эффективный симбиоз с растениями Ltotua cornicuiatus и образовывали неактивные -клубеньки ни корнях L.pedunculatus.

Таблица 2

Хозяйская специфичность клубеньковых бактерий ' астрагала, остролодочника и копеечника

Симбиоз с растениями

Штамм

я)

ьо

Л (4 М О)

о

м *н

р

и оьн ■и м

О 01

и а) р д. л а и й

О О

м я

■с) А 0) <-4 М 05

о) N •и Я §

•гЧ «1 и •с)

Я -Н И о ф

^ ю й а и ■н 01 о 3 РЛ1

>л <а •гЧ Д ■з ■р С0-Р

ОгЧ я О) Зев

РЧД) ' о > •р ■р-н

3 ^ я и о оз

о о 1-ДО

■СТАМ 0201 АК .АК АК АК АК . 0 0

i А.Гг1е1<1из:

СШ 0202 К 0 АК ■ АК АК 0 0

) А.о1сеп

С1АМ 0203 АК • АК АК АК 0 0 0

СШ 0204 АК АК К АК 0 0 0

СШ 0208 АК 0 0 АК 0 = 0 0

СШ 0209 АК АК К' АК 0 0 0

СШ 0210 АК АК К АК К 0 0

АН • АК АК АК лК к 0 и

А23 . АК АК К К АК 0 0

А.и1^1позиз:

ЛАМ 0205 АК АК АК АК К 0 0

ЛАМ 0206 . К 0 АК К К 0 0

ЛАМ 0211 ■ АК АК АК К АК . 0 0

А.Г а1са<;из!

НАМ .0207 АК 0 0 К К 0 0

■1АМ 0212 АК АК АК К АК 0 к

А.Зап1оиз1

163 К АК К ' К ' АК 0 к

1АМ 0213 АК АК АК АК К - АК к

А. аца^Ь81Ыг1сиз!

ГАМ 0214 К АК АК АК К • АК к

р.СОхуЬгор!^)«

55 АК АК АК АК к АК к

¡6 АК АК АК . АК 0 - АК 0

:АМ 2209 АК АК АК АК АК АК ' к

Продолжение таблицы '¿

I 2 3 4 5 6 7 8

:.эр.(Нейузагит)1

•СИМ 1406 ■ К АК АК АК АК 0 0

С1АМ 1410 К АК . АК К АК 0 0

С1АМ 1412 АК АК К АК К 0 0

С1АМ 1413 К 0 АК АК АК 0 0

С1АМ 1414. АК АК АК АК АК 0 0

С1АМ 1415.С1АМ 1416 К АК АК АК АК 0 • 0

Обозначения: К - неактивные клубеньки;

• АК - азотфиксирующие клубеньки; ' -■ 0- нет клубеньков.

Таблица 3

Хозяйская специфичность клубеньковых бактерий лядвенца, солодки, вязеля и стальника

Штамм

Симбиоз с растениями

V 03

П -Р в п! ■Р гН О 3 н! Ц

I

3

т) а) Р<

м а

и й й ■Р гН о з ^ о

и ■н м ш •и р а р

я « ,

•И и Я -н й п й а (и

о М

п5 ЬО

га й ц <и о м -н

Я* 3

т) а,

0) гЦ

I 2 3 . 4 5 6 7

И.1о1;1|

С1АМ 1801 АК К АК 0 АК 0

С1АМ 1802 АК К АК : к АК 0 '

• С1АМ 1803 АК К ■ АК к ' К 0

С1АМ 1604 АК К АК к АК 0

С1АМ 1805 АК К АК •о АК • 0

С1АМ 1806 АК К АК к К 0

С1АМ 3001 АК К . АК к 0 0

С1АМ 3002 АК К АК к • 0 ■ 0

"" С1АМ 3003 АК К 0 к АК • 0

С1АМ 3004 АК К АК к 0 0

Продолжение таблицы 3 I 2.34567

R.sp.(Glycyrrhiza):

CIAM 3101 AK AK 0 AK 0 АК

СI Alil 3118 AK К D AK 0 АК

CIAM 3119 AK К 0 AK 0 АК

CIAM 3120 AK К 0 AK 0 АК

R.sp.(Coronilla)i

CIAM 3401 0 0 0 AK К ' 0

CIAM 3402 0 0 0 К к 0

CIAM 3403 AK AK К AK AK К

R.sp.(Ononis)i

CIAM 3501 AK AK ' AK К К 0

CIAM 3502 ' AK AK AK 0 К 0

GiAa 3503 , AK К - AK 0 К 0

CIAM 3504 ' AK К AK 0 К 0

CIAM 3505 К К AK 0 К 0

Обозначения: К - неактивные клубеньки;

АК - азотфиксирующие клубеньки; О - нет клубеньков.

Нами было показано, что штаммы вида R.loti помимо гомологичных растений-хозяев рода Lotus вступали в симбиоз с астрагалом, СОЛОДКОЙ И стальником, Причем растения L.oornioulatus, L.peduncu-latus и Glycyrrhiza uralensis ЯВЛЯЛИСЬ общими МЗКроСИМбИОНТа-ми И для штаммов R.sp.(Glycyrrhiza), R.sp.(Coronilla) и R.sp. (Ononis) (табл.3). Однако, ризобии солодки, вязеля и стальника не обладали способностью перекрестно инокулировать гомологичных хозяев.

Интересно отметить, что штаммы CIAM 3101 R.sp.(Glycyrrhiza), CIAM 3502 R.sp.(Ononis) и CIAM 3403 R.sp.(Coronilla) , имеющие наибольший уровень сходства со штаммами вида R.loti , вступали в эффективный симбиоз с растениями лядвенца двух видов.

Итак, можно заключить, что клубеньковые бактерии лядвенца, солодки, вязеля и стальника входят в состав обширной группы смешанной инокуляции, к которой также относится группа перекрестной инокуляции клубеньковых бактерий астрагала, копеечнг.ка и остролодочника.

Зффектииность симбиоза изученных штаммов R.sp. (Astragalus) и родственных им риэобий с бобовыми растениями, являющимися перспективными кормовыми и лекарственными культурами, оценивали в условиях вегетационного опыта. В результате селекции бактериальных изолятов были отобраны эффективные инокуляпты для производства ризоторфина под астрагал, копеечник, вязель и стальник (табл.4).

Таблица 4

Взаимодействие клубеньковых бактерий с бобовыми растениями в условиях вегетационного опыта

Ряптпнмр-упчтт " Вариант Масса сухих Накопление, растение xojmm инокуляции растений, г азота, мг

Astragalus с leer Контроль б/и 2,5 2,5

СХАМ 0203* 3,í 7,2

СХАЕД 0210 3,7 74,0

НСР0,05 0,46 ' • 4,67

Astragalus uliglnosus Контроль б/и 1,8 21,6

CIAM 0206* 2,2 41,8

• CIAM 0212 3.6 93,6

CIAM 0213 3.0 ■ 90,0

[[СР0,05 . и,35 1,13

Hedysarum alpinum Контроль б/и 1,0 21,0

CIAM 1406* 4,1 98.4

i ' CIAM 1415 3.6 111,6

НСР0,05 1,6?' 42.0

Coronilla varia Контроль б/и М 16,8

CIAM 3401 2,7 ■ 64,8

HCP0t05 0,56 2,17

Ononis arvensis . . Контроль б/и 22,0

CIAM 3502 7,2 144,0

НСР0,05 1,29 . 3-51

Обозначения: * - эталонные штаммы для соответствующей культуры.

3. Ультраструктурная организация корневых клубеньков, образованных ризобиями астрагала, остролодочника, стальника, копеечника и солодки в симбиозе с растениями рода Astragaius и родственными им бобовыми '

В данной работе впервые проведены электронномикроскопические исследования корневых клубеньков, образованных при взаимодействии растений Astragaius cicer, А.uliginosas, A.dasyanthus, Hedysarum( alpinum, Glycyrrhiza uralensis и Ononis arvensis со штамка-

ми гомологичных и гетерологичных ризобий, являющихся природными изолятами. Для сравнительного ультраструктурного анализа использовали эффективные и слабоэффективные клубеньки, собранные с корне и растений, выращенных в условиях стерильного микровегетационного опыта.

Рис.2. Профиль инфицированной

клетки эффективного клубенька стальника

Обозначения:

В - бактероид;

ь - "лагуна"

Масштабная линейка соответствует I мкм.

На примерах взаимодействия растений A.cicer, н.alpinum,

G.uraiensis и 0.arvensis с клубеньковыми бактериями различного происхождения было'показано, что максимальная эффективность процесса азотфиксации и наиболее полная совместимость партнеров наблюдались при сочетании гомологичных симбионтов: А23 Rhizobium sp. (Astragalus) + A.cicer ; CIAM 1406 li.sp.(Hedysarum) +H.ul pinumi ; CIAM 3101 R.sp.<Glycyrrhiza) + G.uraiensis и

CIAM 3501 R.sp. (Ononis) + 0.arvensi3.

Гетерологичное взаимодействие (CIAM 0212 R.sp. (Astragalus) +

H.alpinum ; 256 R.sp. (Oxytropis) + H.alplnumi CIAM 2209 R.sp. (Oxytropis) + g.uraiensis) , снижавшее эффективность cuu-биотической азотфиксации, на ультраструктурном уровне выражалось ъ накоплении в матриксе бактероидов гранул пош-fi -оксимасляноЯ кислоты (ПШ), что, как известно, связано с функциональной неполноценностью бактероидов (Андреева и др., 1978).

В вариантах слабоэффективного симбиоза (А23 R.sp. (Astragalus) + A.dasyanthus И CIAM 0214 H.sp. (Astragalus) + G.uralensis)

были отмечены следующие признаки неэффективности: редукция количества бактероидов, агрегация бактероидов, нарушение формирования или агрегация перибактероидных.мембран, накопление в бактероидах ПОИ.

Таким образом, результаты ультраструктурного анализа корневых клубеньков показали, что изученные эффективные симбиотические пары имели типичную для. эффективного симбиоза ультраструктурную организацию и обнаруживали большое сходство тонкого строения бактероид-ных тканей клубеньков, выражавшееся в наличии сформированных симби-отических структур - симбиосом и дифференцированных бактероидов. Электронномикроскопические исследования малоактивных клубеньков подтвердили существующее мнение о том, что основные морфологические признаки неэффективности симбиотических систем универсальны для всех изученных видов бобовых (Newcomb , I98I; wemer et a]j[988).

Эти закономерности были присущи и симбиотической модели взаи-модбйствия растений Ononis arvensis с ризобиями различного происхождения, однако этот вариант заслуживает особого внимания. Инфицированные клетки клубеньков, образованных у стальника при эффективном симбиозе, содержали бактероиды необычной формы (рис.2). Мы наблюдали впячивания стенок бактероидов, в результате чего образовывались многочисленные "лагуны", величина которых варьировала в зависимости от штамма-микросимбионта, при этом целостность перибак-тероидной мембраны не нарушалась.

До настоящего времени подобная форма бактероидов не была описана ни для одной из'изученных симбиотических моделей. Можно предположить, что такое строение бактероидов позволяет увеличитьобъем перибактероидного пространства; непосредственно соприкасающегося с бактероидом, для активизации процессов'нетаболитного транспорта с наименьшими энергетическими потерями.

ВЫВОДЫ

1. Изучены культуральные и сиыбиотические свойства 55 штаммов клубеньковых бактерий с неясным таксономическим положением, среди которых 29 штаммов Rhizobiun sp. (Astragalus), 7 штаммов R.sp.(üxy-tropis), 7 штаммов H.sp.(Hedysarum), t 5 штаммов R.sp.(Ononis),

4 штамма R.sp.(Glycyrrhiza) ( 3 штамма H.sp. (Coronilla).

2. Изучена хозяйская специфичность клубеньковых бактерий вида Hhizobium loti , Показано, что растении Astragalus cicer, Gly-

cyrrhiza uralensis, Ononis arvensis И Desmodium oanadense СПОО собны вступать в симбиоз с ризобинми этого вида. клубеньковые бак-тер.ш лядвенца не нодулировали следующие бобовые: Coroniila varia, Hedysarum alpinum, Onobrychis vioiifolia, Oxytropis campestris, Trifolium pratense, Meiicago sativa и Galega orientalis.,

3. Анализ симбиотических свойств клубеньковых бактерий астрагала, остролодочника и копеечника показал, что они образуют группу перекрестной инокуляции, которая, в свою очередь, входит в обширную группу смешанной инокуляции, включающей также штаммы Е.-зр. (Glycyrrhiza), Н.зр. (Coroniila),R.sp. (Ononis) и штаммы Вида R.loti.

4. Проведена селекция эффективных штаммов для перспективных кормовых и лекарственных бобовых культур зоны умеренного климата: Astragalus cioer (штамы CIAM 0210), Astragalus uliginosus (штаьшы CIAM 0212 И CIAM 0213),Hedysarum alpinum (штамм CIAM 1415),Coroniila varia (штамм CIAM 3401) И Ononis arvensis (штамм CIAM 3502).

5. Впервые проведён сравнительный ультраструктурный анализ корневых клубеньков, образованных у растений Astragalus cioer, A.uliginosus, A.dasyanthus, Hedysarum alpinum, Glycyrrhiza uralensis, Oxytropis campeatris и Ononis arvensis штаммами ГОМОЛОГИЧНЫХ и гетерологичных ризобий. Показано, что максимальная эффективность симбиоза достигается при взаимодействии гомологичных симбиотических партнеров. Впервые дана морфологическая характеристика нового мпа бактероидов, обнаруженных в клетках эффективных корневых клубеньков растений Ononisarvensis.

6. В результате применения метода "нумерической таксономии" (анализ 55 культуральных свойств) и проведения кластерного анализа была построена дендрограмма,отражающая родство между микросимбионтами астрагала, остролодочника, солодки; копеечника, стальника и вязеля и клубеньковыми бактериями вида Rhizobium loti (всего изучено 73 штамма). Перечисленные микроорганизмы формировали 2 таксо-номически близкие группы,-различающиеся на уровне вида. Можно они-дать, что на основе выявленных групп могут быть описаны, по меньшей мере, два новых вида, родственные ныне существующему таксону Rhizobium loti . Анализ фенотипического сходства R.loti с другими представителями семейства Rhizobiaceae свидетельствует о его значительной удаленности от остальных быстрорастущих клубеньковых бактерий рода Rhizobium и предполагает выделение нового рода в данной бактериальном семействе.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Новикова НД1.„ Лимещенко Е.В., Павлова Е.А. Таксономическое значение.фаготипирования клубеньковых бактерий // Всесоюзная конференция "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". Секция П. Вирусы растений, животных и микроорганизмов - Тезисы докл.. Алма-Ата, 1990, с.81.

2. Новикова Н.И., Романов Ю.С., Павлова Е.А., Кожемяков А.П. Препараты клубеньковых бактерий при интродукции лекарственных растений семейства бобовых // Всесоюзная конференция "Состояние и перспективы научных исследований по интродукции лекарственных-растений". -Тезисы докл., Москва, 1990, с.43.

3. Новикова Н;И. .„Павлова Е.А.. Сафронова В.И., Кожемяков А.П. Селе-кция штаммов клубеньковых бактерий для инокуляции новых кормовых и лекарственных бобовых растений // Республиканская конференция "Микробиология в сельском хозяйство" - Тезисы докл., Кишинев, 19§1, с.31. -

4. Новикова Н.И., Павлова Е.А., Лимещенко Е.В. Культуральные свойства и хозяйская специфичность клубеньковых бактерий астрагала (Astragalus) и.копеечника (Hedysarum) // Республиканская конференция "Биологическая фиксация молекулярного азбта и азотный метаболизм у растений" (Тернополь, 1991). - Тезисы докл., Киев, 1991, с.53. . .

5. Новикова Н.И., Сафронова В.И., Павлова Е.А. Взаимодействие клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium gaiegae с бобовыми растениями. - Бюллетень ВНИИ СХМ, 1991, №54, с.12-17.

6. Павлова Е.А., Камардин Н.Н., Новикова Н.И. Симбиоз растений Lotus pedunculatus ц Lotus corniculatus с быстрорастущими и медленнорастущими клубеньковыми бактериями // Научная конференция "Изучение и рациональное использование природных ресурсов". -Тезисы докл.. Уфа, 1991, с.100.

7. Новикова ii.il., Сафронова В.И., Павлова Е.А. Систематика новых видов клубеньковых бактерий // 1У Всесоюзная конференция "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" - Тезисы докл., Пущино, 1992, с.152.

■8. Новикова Н.И., Сафронова В.П., Павлова Е.А. О характере взаимодействия клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium gaiegae с бобовыми растениями. - Сельхоз. биология (серия биология растений), 1992', К; 5. с.105-110.

о

9. Novikova N., Pavlova E., Limeshchenko E., Vorobjev N. The taxonomy of Rhizobium strains from root nodulea of Astragalus, Hedysarum, Glycyrrhiza and Ononis. - Ini Abstracts of VIII-th Eastern Europe Symposium on Biol; Nitr. Fixat. NITROGENFIX-92, Saratov, 1992, p.20. .

10. Novikova N.I., Pavlova E.A., Limeshchenko E.V. The taxonomy of Hhizobium strains from temperate legumes// 9-th Intern. Congress on Nitr. Fixat. (Cancun/Mexico, December b-II, 1992). -i Program and Abstracts, abstract N 822.

11. Novikova N.I., Pavlova E.A., Limeshchenko E.V. Phage sensitivity and host range of Rhizobium strains isolated from'root nodules of temperate legumes. - Plant and Soil., I993i in press (accepted for publication in January 22, 1993).

Авторские свидетельства

1. Новикова Н.И., Павлова Е.А., Лимещенко Е.В., Витол М.В., Кожемяков А.П. Штамм ,Rhizobium sp. (Ononis) 3502 (ВНИИ CXÍi) -активный азотфиксирующий симбионт стальника. - Заявка на авт.. свид. № 5027312 / 13(081295); положит, решение от ,09.06.1992.

2. Новикова H.Ü., Павлова Е.А., Лимещенко Е.В., Витол М.В., Кожемяков А.П. Штамм Rhizobium sp. (Coronilla)3401 (ВНИИ СИ,i) -активный азотфиксирующий симбионт вязеля. - Заявка на авт. свид. №5018425/13; положит, решение от 05.08.1992.