Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ некоторых этапов формирования симбиоза между Pisum stativum L. и Rhizobium leguminosarum bv. viciae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ некоторых этапов формирования симбиоза между Pisum stativum L. и Rhizobium leguminosarum bv. viciae"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ ФОРМИРОВАНИЯ СИМБИОЗА МЕЖДУ PISUM SATIVUM L. И R . LEGUMINOSARUM BV. VICIAE

Специальности: 03.00.07 — микробиология 03.00.15 — генетика

А ВТОР ЕФ ЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

КУЛИКОВА Ольга Алексеевна

УДК 635.656:576.8.095.38

/

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии ВАСХНИЛ.

Научный руководитель — кандидат биологических наук И. А, Тихонович.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук М. М. Ле/и-тин; кандидат биологических наук Н. А. Проворов.

Ведущее учреждение — Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Защита состоится » ,1990'г. в $ час. на заседании

Специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Ленинград—Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3, ВНИИСХМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В обеспечении культурных растений азотом большое значение имеет симбиотическая азотфиксация,которая определяется скоординированным взаимодействием генотипов бобо'вкх растений и клубеньковых бактерий семейства Rhizo-b.iaceae. Несмотря на большие потенциальные возможности сим-биотической азотфиксация, заменить большую часть минеральных удобрений удастся лишь в том случае, если отот процесс будет существенно интенсифицирован. Практически единственнпм используемым в настоящее время способом шгтенскфикации процесса сим-биотической азотфиксация является внесение в почву препаратов, содержащих отселектированше штаммы клубеньковых бактерий.Известно, однако, что отзывчивость некоторых культур на инокуляцию быЕает очень низкой, в частности, у такой; широко возделываемой в нашей стране зернобобовой культуры, как горох (Ко-аемяков, Доросинский, 1981). Основными причинами такой ситуации являются наличие в почве высококонкурентноспособных, но малоэффективных рас клубеньковых бактерий и отсутствие селекции бобовых растений по симбиотическим признакам. Поэтому одним из перспективных направлений интенсификации процесса ст-биотической азотфиксации должно стать создание высокоэффективных комплементарных пар макро- и микросимбионта.

Важнейшая роль растения-хозяина в цроцессе формирования и функционирования симбиотического аппарата на сегодняшний • день не вызывает сомнений. Методами классического генетического анализа у бобовых растений обнаружено несколько десятков генов, контролирующих все зталн формирования симбиоза. У гороха известно более 20 таких генов (Kneen et al.,I987; Vance at al., 1988), контролирующих, в основном, ранние стадии фор-мированпя симбиоза. На более поздних стадиях развития симбиоза труднее вычленить роль растения-хозяина, настолько велико здесь взаимодействие двух симбионтов, поэтому и возможности классического гибридологического анализа при таких условиях , существенно ограничиваются. Эти трудности преодолеваются о использованием молекулярно-биохимических методов. Известно, что процесс форшрования и функционирования симбяотического аппа-эата сопровождается изменением экспрессии некоторых растительных и бактериальных генов ( Veraa et al.,I984; Govers et al.,

I

1985). Необходимым начальным этапом изучения отях генов является идентификация продуктов их трансляции. Кроме чисто практического интереса - использование генов бобовых в селекционных программах - анализ молекулярно-генетических механизмов формирования симбиоза представляет несомненный теоретический ' интерес, связанянй с взаимоотношением про- и эукаритических организмов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явился молекулярно-гекетический анализ механизмов взаимодействия между горохом ( P.sativum L. ) и Я .leeuminosarum bv.vlciae на двух основных этапах формирования симбиоза: стадии инфицирова-. ния и стадии сформировавшегося клубенька.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

- изучение признака устойчивости к заражению европейскими штаммами клубеньковых бактерий у трех линий афганского проио-хоадеяия и характера наследования атого признака в потомстве гибридов от скречивашч линий гороха афганского и европейского происхождения; получение константных линий гороха, устойчивых к заражению европейскими штаммами бактерий и с фенотя-пическими признака!;ш окультуренных Горохов;

- - идентификации белков - продуктов растительных и бактериальных генов, участвующих, в формировании и функционировании симбиотического аппарата, и определение функциональной значимости этих белков с использованием двух модельных систем: I -линии гороха афганского и европейского происхождения и комплементарные игл штаммы (A-I и 250а); 2 - линии гороха европейского происхождения и два европейских ризобиальных штамма, (эффективный штамм 250а и неэффективный 2486);

- определение гомологии некоторых-из этих белков у нескольких видов семейства бобовых с помощью иммукохишческих методов,-

Научная новизна. В работе впервые сделан генетический анализ признака "устойчивость в клубенькообразованию" линий .гороха афганского происходдения при взаимодействии с ризоби- . альяым штаммом 250а. Показано, что изученные афганские линии гороха не обладают полной устойчивостью к заражению этим штаммом. Идентифицирован растительный белок, синтезируемый de novo в корнях гороха при заражении комплементарным штаммом клубеньковых бактерий, который может служить специфическим белковым 2

маркером успешного взаимодействия мекро- и шюросимбионта на ранних стадиях формирования симбиоза,

- В работе дан сравнительный анализ спектров водорастворимых цитоплазматическях белков из корней я клубеньков гороха, образованных эффективным штатом 250а и неэффективным штаммом 2486, идентифицированы яодулины - белки растительного происхождения, синтезируемые de novo при взаимодействии с бактериями, и белки, синтез которых уменьшается или прекращается . в клубеньках (рутины). Показана универсальность одного из них для семейства бобовых. Показало имиунохшдическое родсаво трех нодулинов, связанных с симбиотяческой азот^иксацией, у люшша и гороха.

Практическая ценность. В результате индивидуального анализа гибридных растений от скрещивания линий гороха афганского и европейского происхождения получены 5 константных линий, устойчивых к заражению штаммом 250а. Эти линия гороха -удобная модель для дальнейшего изучения ранних стадий формирования бобово-рязобиального симбиоза. Полученные линии могут быть использованы в качестве доноров генов устойчивости к заражению европейскими штаммами клубеньковых бактерий в селекционных программах.

. Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", 1986 г. г.Цущино; на 7 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров, Москва, 1987 г.; яа 7111 Всесоюзном Баховском коллоквиуме по азотфиксация, Кобулеттй, 1988 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и.объем диссертации.-Диссертационная работа сос^ тоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения в 5 главах полученных результатов ж их обсутвте, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 9 .таблицами. Список литературы, включает ¿29 наименований, из них 7 - яа русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Растительный материал и постановка вегетационных опытов. Две линии гороха (Pisum sativum L. )афганского происхоадения -31/6 и 28Д5 - получены во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в лаборатории биотехнологии из образцов гороха Всесоюзного института растениеводства (ВИР) с коллекционными номерам К 6559 и К 6106 соответственно. Линия 2150 афганского происхоадения получена из коллекции семян С.Бликста (Швеция) в качестве носителя гена аут 2, контролирующего устойчивость к заражению европейскими штаммами клубеньковых бактерий ( н0ц, 1975; Lie, 1976). Линия гороха европейского происхождения 32/ 12 выделена в нашем институте из сорта "Местный" (К 6335) путем отбора на повышенную эффективность симбиотической аэотфик-сации (Макашова и др., 1985). Две другие линии европейского происхоадения - 1714 и 1238 - получены из коллекции семян гороха С.Бликста. .

В работе были также использованы и некоторые другие виды семейства бобовых. Семена этих растений получены из коллекции ИФа: бобы ( Vicia faba L. ), К 1617; ЛЮПИН ( bupinus lutenu L. ), К 1943; нут ( Cicer arientinum L. ), К II8I; сераделла ( Ornithopus sativus Brot. ), К 38616; соя ( Olycine шах Ь„ ), К 7208; фасоль ( Phaseolus vulgaris i- ), К 14279.

Для размножения растительного материала и для проведения скрещивания проросшие семена гороха высаживали в почву в сосуда объемом 5 л; .для оценки гибридного материала по признаку клубеяькообразоваяия и для получения клубеньков проростки высаживали в стерильный песок по одному в каждый сосуд объемом 0,5 л с добавлением питательных элементов (ПряншлниковД962), дез азота. Инокуляцию проводили водной суспензией бактерией в расчете 10^-10® клеток/растение. Для цитологического и биохимического изучения начальных стадий формирования симбиоза проростки высаживали в кюветы со стерильным вермикулитом с добавлением питательных.элементов, без азота. Опыты проводили' в1 условиях теплицы или вегетационного домика (в течете летнего периода).

, Скреишвания между отдельными линиями гороха проводили на стадии бутонизации-цветения.

Нитрогеназную активность измеряли ацетиленовым методом •

[Алисова, 1979). .

Дтаммы бактерий и их культивирование. Для инокуляции гороха использовали три итамма и .1еЕшп1поаагит bv.vi.ciae из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии: 250а - производственный штамм; 2486 - неэффективный штамм, образует на . корнях растений много мелких, белых клубеньков, не Фиксирующая азот; А-1 - штамм, способный преодолевать устойчивость к эбразованию клубеньков у линий гороха афганского происхождения, обладает высокой конкурентноспособностью по отношению к ятащу 250а (Четкова, Тихонович, 1986). .

Для инокуляции люпина использовали штамм и .iupi.nl 367а аз коллекции ВНИИ сельхозминробиологии.

Бактерии к .1ееит1поаагит в зависимости от задачи исследования выращивали либо в пробирках на скошенном бобовом агаре в темноте при 28°С в течение 3-х суток, либо в жидкой сре-це тг (Бег1пдег,1974) в колбах на качалке при 140 об/мин. в течение суток. Для бактерий й .1ир1п± использовали маняитно-црожжецпо среду (Федоров и др., 1983). Бактерии культивировали в темноте при 28°С в течение 5 суток. 1рйготовление белковых проб для электрофореза. Клубеньки и ... юрки гомогенизировали растиранием в фарфоровой ступке с жидким азотом до состояния пудры. Гомогенат центрифугировали при [5000 в в течение 20 мин. В полученный супернатант, содержа- ■ ций водорастворимые цитоплазматическив белки, добавляли буфер, равный по объему супернатанту, следующего состава: 0,125 М Грис НС1 рН 6,8, 2% ДСН (додецилсульфат натрия), 5% £ -мерка-1тоэтанол (буфер для белковых проб). Кипятили 1-2 глин, на во-цяной бане.

Бактероид-содержащие клетки из клубеньков выделяли с помощью ферментативной обработки клубеньков с последующим центрифугированием изолированных клеток в градиенте плотности -з'ерколла (ипейа, Зуопо, 1987). Гомогенизировали клетки и центрифугировали при 15000 g 20 мин. Супернатант отбирали и добавляли буфер для проб. .!..'.

Выделение бактероидов проводили методом центрифугирования з градиенте плотности перколла (ИеАЪаоЬ, 1981). Бактероиды -разрушали кипячением на водяной бане в течение 5 мин. в буфере следующего состава: 50 ЫА Трис НС1, рН 6,8, -меркапто-зтанол, 2% ДСН, а затем центрифугировали при 15000 в 20 кия.

Злектройорез и иммуноблотинг белков.Электрофорез в денатури-

5

рующих условиях проводили в присутствии ДОН в блоках 12-15$ полнакриламядного геля (ШАГ) по методу Лэмшш ( Laemmli, 1970) "Нативный" электрофорез проводили в блоке 7,5$ ПААГ без ДСН. При двумерном электрофорезе в качестве первого направления служил "нативный" электрофорез. Дорожку геля первого направления в течение 30 мин. "уравновешивали" следующим буфером: 50 мМ Трис HGI, рН G,':>•,2,5% fi-меркаптоэтанол; 2% ДСН - и укладывали на старт концентрирующего геля. Гели окрашивали 0,25$ ку-масси. Молекулярные массы белков после ДСН-электрофореза определяли с использованием стандартной смеси белков ("Фармация", ЛКБ) о молекулярными массами: 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа. Белки с.геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (ШСБ, 0,45 мкм) электрофоретически (аппарат "Трансфер",ЖБ) в 0,25 М иа-фосфатном буфере, рН 6,5. Нитроцеллюлозу блокировали 3% обез.шренным сухим молоком, приготовленным на IES -буфере (20 Ш Трис, 500 Ш Насх , -рН 7,5). Обработку первыми антителами проводили в течение ночи. Б качестве вторых антител использовали антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с перохсидазой, либо белок А, меченый Комплексы антиген-антитело визуализировали либо ферментативным "окрашиванием о-дианизидином (25 мкг/мл) в присутствии .. 0,02% HjOg, либо авторадиографлей. В качестве первых антител использовали: антитела против клубеньковоспецифичных белков, леггемох'лобина, R 18 люпина желтого (Lupinus luteua L. ),предо ставленные д-ром Ц.Мондааком и д-ром А.Легоцким (Сельскохозяйственный университет, Познань, ПНР); антитела против тотальные водорастворимых цитоплазматнческих белков, выделенных наш из элективных клубеньков гороха; сыворотка против этих, белков получела в кооперативе "Шшроанализ" (Москва). Для получения клубеньковомющйичных антител высаживали из зтой сыворотки ишуноглсбулиновую фракцию 35/2 ( WH^j^O^, píí 8,0 ( Harboe, ingiid,I972) и очищали ее методом ш!мугюай]иной хро-матограмш на СНВг-активированной сефарозе 4В ("Фармация"), ш,¡мобилизованной корневыми белками.

Цитологические методы. Изучение начальных стадий инфицирова- ' лия проводили с помощью светового микроскопа с предварительным окрашиванием корней в растворе 0,01$ метшгенового синего в течение 15 мин. ( Vassa.Truchet, IS84).

Изучение структуры клубеньков гороха, образованна оффек-

тивным и неэффективным штаммами клубеньковых бактерий проводили с помощью электронного микроскопа. Клубеньки фиксировали в 2,5$ глютаровом альдегиде, 1% 0В0^, 1% галовой кислоте. Срезы готовили на Ультратоме 3 (ЖБ), контрастировали уранялацета-том и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 ("Хитачи").

Статистическую обработку данных по гибридологическому анализу проводили методомX ^ (Глотов и др., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Генетический анализ признака устойчивости к клубенькообразованшо • I.I. Симбиотические признаки линий гороха

афганского и европейского происхождения

Начальным этапом работы было тестирование трех линий афганского происхождения (2150, 31/6 и 2150) на устойчивость к заражению двумя штаммами бактерий: 250а и 2486. Все три линии не формировали клубеньки при заражении штаммом 2486. А при заражении штаммом 250а на отдельных растениях этих линий гороха формировалось от I до 10 клубеньков (так называемые, "случайные" клубеньки). Попытка получить линии гороха без клубеньков путем двухкратного отбора растений не увенчалась успехом: с. определенной частотой, вновь появлялись растения со "случайными" клубеньками (табл.1). Бактерии, выделенные из этих клубеньков, при повторном заражении афганских Горохов также формировали только редкие клубеньки на отдельных растениях. Таким образом, растения не отбирали бактерии с измененными симбиоти-ческими характеристиками, а пооявляли скорее фенотипическую нестабильность.

Таблица .1

' Характеристика линий гороха афганского происхождения по устойчивости к заражению штаммом 250а .,

Линия Количество проанализированных растении Частота встречаемости растений с > клубеньками Количество клубеньков •

2150 77 0,22 0-10

31/6 41 0,07 0-5

28/15 39 0,49 0-10

Клубеньки, формируются при заражении афганских линий гороха штаммом 250а, - мелкие, бледно-розовые. Расположены клубеньки Или на боковых корнях, или в самом низу главного корня. Их нитрогеназная активность незначительна, но с увеличением количества клубеньков она достоверно увеличивается.

Количество клубеньков на линиях гороха европейского про-' исховдеяия при заражении штаммом 250а не бывает меньше определенного числа для каждой линии, ¡штрогеназная активность -высокая (табл.2).

Таблица 2

Сямбкотические признаки линий гороха европейского происхождения при инокуляции штаммом 250а

Линия Количество проанализированных растеши Количество клубеньков на растение Нитрогеназная активность, «моль СоНд/ час на растение 4

1714 62 не менее 100 5260 ± 480

1238 • 36 не менее 40 1540. ± 100

32/12 45 не менее 70 3200 ± 400

„ При заражении линий гороха европейского'происхождения штаммом 2480 образуется много белых мелких клубеньков, отсутствует нитрогеназная активность. . .

Таким образом, штамм 250а способен частично преодолевать устойчивость афганских Горохов, вызывая образование "случайных" клубеньков, обладающих незначительной ацетиленредуктаз- • ной активностью. Единственное отличие'между изученными.линиями афганского происхождения заключается в частоте образования растений с клубеньками. В атом отношении 'наиболее стабильной является линия 31/6. ,

1.3. Анализ аллельности генов устойчивости к клубенько-образованюо у разных линий афганского происхождения.

При скрещивании линий гороха афганского-происхождения 'растения первого поколения дали один и тот же ответ, характерт ный для кавдой отдельной линии при заражении штаммом 250а: клубеньки формировались только на некоторых растениях, и их количество не превышало 8. Во втором поколении также не обнаружили ни одного растения с большим количеством клубеньков (табл.3). Из полученных результатов можно- сделать вывод о том 8

что гены, вызывающие блок инфекционного процесса на ранней стадии, у всех трех афганских линий аллельны.

В дальнейшем изучении генетического контроля .признака устойчивости к заражепию штаммом 250а у линий гороха афганского происхождения за Но<1~ фенотип мы принимали те расте!шя, которые при заражении штаммом 250а формировали не более 10 клубеньков.

Таблица 3

Анализ гибридов Р1 и Р2 поколения от скрещивания афганских линяй гороха по устойчивости к заражению штаммом 250а

Гибриды Р1 Гибриды Fg

Скрещивание Коли- Частота Количе- Коли- Частота Количе-

чество встреча- ство чество встреча- ство

расте- емости клубе- расте- емости кдубе-

ний растений ньков/ ний растений ньков/

с клу- расте- с клу- расте-

беньками кие беньками пие

2150 х 28/15 16 0,25 0-6 74 0,28 0-10

28/15 х 2150 16 0,38 0-8 133 0,16 0-10

31/6 х 28/15 22 0,27 0-5 32 0,22 0-8

28/15 х 31/6 14 0,30 0-6 41 0,24 0-10

2150 х 31/6 8 0,30 0-7 38 0,21 0-10

3I/& х 2150 II • 0,28 0-6 59 0,23 0-10

1.3. Анализ гибридов и ?2 поколения от скрещивания

линий гороха афганского и европейского происхождения по признаку устойчивости к заражению штаммом 250а

При скрещивании линий гороха афганского и европейского происхождения в поколений были подучены гибриды, которые вне зависимости от направления скрещивания формировали не менее 40 клубеньков. Данные распределения Hod+ и н0а" фенотипов в г2 представлены в таблице 4.

На основании всех подученных результатов мы сделали вывод, что у изученных наш трех линий афганского происхождения устойчивость к заражению штатом 250а контролируется одним геном, который адлелен ранее описанному и обозначается вут 2 (Lie, . 1971). Для дальнейшего анализа гибридов с целью получения линий, константных по признаку "устойчивость к клубеяькообразо-ваншо" при .заражении штаммом 250а мы использовали гибрида от

9

скрещивания линяй 2Г50 и 1238.

' Таблица 4

Характеристика гибридов ig поколения от скрещивания линий гороха афганского и европейского происхождения по признаку устойчивости к клубенькообразованию при инокулящш штаммом 250а

Скрещивание Количество растений Т?*

iíod+ фенотипа Nod" фенотипа 3 : I

1238 х 2150 150 52 0,06

2150 х 1238 2В 12 0,53

1714 X 28/15 81 24 0,25

28/15 х 1714 63 19 0,15

1714 х 2150 80 31 0,50

2150 х 1714 112 34 0,23

2150 х 32/12 ' 72 30 1,ЗГ

**0,05 = З-84

1.4. Получение константных линий'гороха по признаку "устойчивость к клубенькообразованию" при заражении штаммом 250а

Потомство 17 растений Hod" фенотипа второго поколения было индивидуально проанализировано в следующем'поколении.Обнаружено, что 21 растете (что составило 24^ от общего числа. полученных растений) ишли Mod* фенотип (эти растения форми- ' ровали от 15 до 80 клубеньков), Из F-j были отобраны только карликовые растения с некоторыми друтими фенотипическими признаками родительской линии европейского происхождения ( 1238), но с полным отсутствием клубеньков. Индивидуальный анализ этих растений в и поколениях показал стабильность наследования признака "устойчивость к клубеяьксобразовашто" при заражении штаммом 250а. Но эта устойчивость преодолевалась при заражении штаммом A-I, как и у родительской линии гороха _ афганского происхождения 2150.

.Таким образом, признак "устойчивость к клубенькообразованию " у трех изученных линий гороха афганского происхождения контролируется одним основным геном в рецессивном состоянии, но обладает широкой нормой реакции, которая может изменяться в зависимости от генетического фона и ризобиального штамма^ 10

Полученные линии гороха, устойчивые к клубенькообразованию при заражении штаммом 250а - материал для дальнейшего изучения молекулярно-генетических механизмов взаимодействия между , растением-хозяином и микросимбионтом на стадии инфекционного процесса.

2. Цитологический и молекулярно-биохимический анализ инфекционного процесса

Линии, гороха 2150 и 1238 инокулировали двумя штаммами: 250а и A-I; через трое суток после инокуляции просматривали зону коркешх волосков под световым микросколом. 'Наблюдали характерное изменение корневых волосков под воздействием клубеньковых бактерий: на L 2150 при заражении штаммом 250а корневые волоски деформировались, некоторые из них приобретали форму "крючка", в котором находилась неразвившаяся инфекционная нить, а при заражении шташом A-I наблюдали и развившиеся инфекционные нити. Таким образом, блокировка инфекционного процесса у линий гороха афганского ироисховдекия идет на стадии формирования инфекционной нити. У линии гороха европейского происхоадения 1238 наблвдали корневые волоски со сформировавшейся инфекционной нитью при заражении штаммами 250а и A-I. '

Изолировали зону корня, соответствующую зоне корневых волосков (но без корневых волосков) и выделили из этого материала водорастворимые белки, которые,фракциоиироглли методом двумерного электрофореза (рис.1).'

Два белка с молекулярными массами.53 и 55 кДа были обнаружены в белковых препаратах из корней L 2150, инокулированной штаммом A-I, и из корней L 1238, инокулированной штаммами 250а и A-I. В белковых препаратах из корней L 2150, инфицированной лтаммом 250а и из неинфицированных корней Ь 2150 и Ь 1238 обнаружен только один из этих белков с большей электрофоретаче-ской подвижностью и в гораздо меньшем количестве.

Таким образом, белок с молекулярной массой 53 кДа является растительным белком, синтез которого усиливается в результате внедрения бактериального партнера в корень. Белок с молекулярной массой 55 кДа синтезируется de novo в корнях растений при заражении, комплементарном шташом.

При заражении трех изученных линий афганского происхождения штаммом 250а, не происходит формирования олуходеподобных,

II

Рас.1. Фрагменты 2Д-электрофорезов водорастворимый вдтоплазма-тагаескшс белков из корней, , гороха 1.2150 (А) и 11238 (В); а - яеинокулироваяных, б -црокулированных штаммом 250а, . в - ияокулированяых штаммом А-1

ЮТ-— —

ИИ - —

I I

Рис.2. Иммунохимическое тестирование

водорастворимых цитоплаз матйче скшс белков из: а -клубеньков, образованных на Ь 32/12 при инокуляции штаммом 250а: б - неинокулированных корней Ь32Д2; в - бактерий штамма 250а, - райделентах методом ДСВ-электрофореза, клубеньковоспецифичными антителами.

■ кдубеяьков. То есть, кроме того, что не развивается инфекционная нить, у афганских линий не происходит и образования клубеньковой меристемы. Возможно, что идентифицированный наш белок 55 кДа связан с функционированием одного из этих процессов.

3. Сравнительный анализ спектров белков из корней и эффективных клубеньков гороха

Водорастворимые цитошгазматическяе белки выделяли из корней 7-дневяых проростков L 32/12 и клубеньков, образованных на этой линии штаммом 250а. При сравнительном анализе результатов одномерного я двумерного электрофорезов водорастворимых белков выделили три основные группы белков:

- конститутивно синтезируемые белки, которые присутствуют и в корнях и клубеньках гороха; составляют большую часть всех тестируемых белков;

- белки, специфичные только дай клубеньковой ткани;

- корневые белая, синтез которых частично или полностью репрессируется в клубеньках.

Первая группа белков далее не анализировалась. Вторая группу представлена 16 клубеяьковоспецифичныш белками с молекулярными массами от 15 до 90 кДа. В эту группу белков входят: а) нодулинн - белки растительного пропахоздения, которые синтезируются de novo при взаимодействии с бактериями (Van Колнаеп, 1984); б) белки растительного происхождения, синтез которых, усиливается в клубеньковой ткани по сравнению с корневой и в) белки, кодируемые бактериальным геномом и секретируемые в пе-рибактероидное пространство и цитоплазму инфицированных клеток. Белки, синтез которых уменьшается в клубеньках, - белки растительного происхождения. Эта группа включает до 8 ¡торных и минорных фракций. Представляют интерес в плане изучения регуляции экспрессии растительных генов при формирования симбиоза. Клубеньковоспецифичные белки. Метод разделения белков с пошщы) двумерного электрофореза обладает довольно высокой разрешающей способностью, но не дает возможности различить бактериальные и растительные белки. Используя поликлонвлыше антитела на клуб е етько во специфичные белки, мн тлели возможность использовать в качестве контроля белки, выделенные из бактерий, и определить собственно нодулияы. Среди белков, синтезируемых в цитоплазме клубеньков, отчетливую реакцию антиген-антитело дрояв-

. . • ' • и

ляют 12. Среди них 6 белков совпадают по электрофоретической подвижности с белками, синтезируемы:.® бактериями ( ии-белки). Происхождение этих белков можно объяснить несколькими причинами: I) бактериальные белки могут экскретироваться в цитоплазму инфицированных клеток или в перибактероидное пространство, 2) загрязнением препарата белками бактерий (как известно, в зрелых клубеньках находятся инфекционные нити с бактериями) или бактероидов, -разрушенных в процессе приготовления белковых проб.

Мы сравнили спектры водорастворимых белков из свободножи-вущих бактерий и бактероидов, разделенных одномерным ДСИ<-злё~ ктрофорезом и обработанных клубеньковоспецифпчпши антителами. Идентичными оказались два белка: с молекулярными массами приблизительно равными 69 кДа и 37 кДа. Кроме того, при обработке белковой фракции бактероидов из клубеньков гороха клуб енько во специфичными антителами люпина, мы также обнаружили реакцию антиген-антитело с аналогичными белками. По-видимому! эти два белка являются универсальными бактериальными белками, которые конститутивно синтезируются как свободноживущими бактериями, так и бактероидами. Часть бактероидных белков,'-специфически реагирующих с клубеяьковоспецифичяой антисывороткой, отсутствует в белковых препаратах из свободшживущих ризобий. Возможно, это бактериальные белки, которые синтезируются только в симбиозе с растением-хозяином, и тогда их можно отнести к группе бактероидинов (Уап Кщцшеп, 1984).

Самый мажорный в количественном отношении нодулин - лег-гемоглобин (ьъ ), который выполняет функцию вгутрлклеточного переносчика кислорода. С помощью антител, полученных против ьь люпина желтого (ь.1и-Ьеиа ь. ) показали, что на одномерном ДСН-электрофорезе этот яодулин имеет 1-2 фракции с молекулярной массой, приблизительно равной 15 кДа, а на двумерном электрофорезе - 5. Существование субфракционного состава 1,15 характерно для большинства бобовых.

Растительные белки, синтез которых репрессируется при Фдрми-ровании клубенька. При сравнительном анализе белковых спектров из корней и клубеньков гороха идентифицировали 4 мажорных белка, синтез которых уменьшается лля вообще прекращается в функционирующем клубеньке. Предполагается, что репрессия синтеза этих бёлков происходит вследствии воздействия неизвест-

них факторов бактериального происхождения ( Verma,Ual3ier, 1984). Не исключено, что ин.цукция и репрессия синтеза бежа в формирующемся клубеньке осуществляется взаимосвязанными механизмами ( Sikoraki et al.,1988). Более по,дробно мы изучили белок с молекулярной массой, приолизителыю равной 18 кДа, по величине молекулярной массы и оргшгоспещкйичиости подобный белку Л18, обнаруженное польскими исследователями у люпина желтого (Sikorsici et al.,1985). Наши совместные исследования с польскими коллегами показали, что эти два белка являются тдглуно-логически родственник. В клубеньках гороха и люцина белок к 18 также присутствует, но в количественном отношении в клубеньках его значительно меньше, чем в "корнях. Иммунологическое тестирование HIS только в инфицированных (бактероид-содер-жацих) клетках клубеньковой ткани показало, что белок RE8 в этих клетках отсутствует. Вероятно, этот белок является у!ш-версальнш для различных видов семейства бобовых. Он обнаружен наш не только в корнях гороха и люпина, но и бобов, сои, яута, маша, сераделлы. .

4. Сравнительный анализ ультраструктуры клубеньковой ткани и состава белков эффективных и неэффективных клубеньков

Сравнительный ультраструкгургаш анализ клубеньковой ткани клубеньков, образованных на Ь 32/12 штампами 250а и 2486, показал четкие различия между ниш. У неэффективных клубеньков ткань более рыхлая н в клетках находится большое количество вакуолей, бактероидов мало и среди них отсутствуют бактероиды характерной У-образной формы. В,эффективных клубень?-ках бактероиды окружены нерибактеровдной мембраной л четко выражено перибактероидное пространство. В неэффективных клубеньках существуют нарушения в образовании этих структур. Возможно, ото связано с тем, что неэффективные клубеньки начинают быстро стареть и деградировать. В неэффективных клубеньках содержится большое количество зерен крахмала. По-видимому, дефект в функционировании симбиотического аппарата, образованного' штаммом 2486, сдадзан с развитием бактероидов.

Одна из характерных особенностей для ьсох типов неэффективных клубеньков, не исключая и дашшй, - это сладошо количества леггемогкобпна. Мы идеити^ицирошли всего G полос

. '15

преципитации при обработке белков из неэффективных клубеньков клубеньковоспецифичныш антителами: очень слабая полоса Преципитации в области расположения ьъ, остальные пять соответствовали Rh 31, Rh 37; N43, и H 67. И еще один полипептид с молекулярной массой, приблизительно равной 60 кДа, который отсутствует в эффективных клубеньках. Этот белок - корнеспе-цифичный, синтез которого не изменяется при взаимодействии ■ растения с неэффективным штаммом (в результате нарушения в развитии симбиоза).

5. Гомология растительных белков гороха и люпина, ' участвующих в формировании бобово-ризобиального симбиоза (общие белки)

При обработав клубеньковых белков гороха, разделенных одномерным ДСН-электрофорезом, антителами против клубёньково-специфичннх белков люпина, мы выявили иммунохимическое родство нескольких белков: трех нодулинов ( Н42, Н67, N90) и двух бактериальных белков (Rh37,Rh69). Такие же результаты были получены при обработке белков из клубеньков люпина клубеньковоспецифичныш. антителами гороха.

Эти данные (и предыдущие данные о иммунологическом родстве белка RI8 у разных видов семейства бобовых) свидетельствуют о том, что бобовые растения располагают универсальными симбиотическими генами, которые представляют большой интерес для дальнейшего изучения бобово-ризобиального симбиоза.

ВЫВОДИ

1. Установлено, что устойчивость к заражению штаммом R . leguminosarum bv. viciae 250а у трех изученных линий афганского происхождения (2150, 28/Ï5 и 31/6) не является абсолютной, так как с определенной частотой появляются растения с так называемыми "случайными" клубеньками (от I до 10 мелких клубеньков с незначительной нитрогеназной активностью).

2. В результате анализа гибридов îl1 и от скрещивания линий гороха афганского и европейского происхождения установлено, что признак "устойчивость к клубенькообразованию" наследуется моногенно и рецессивно.

3. Путем индивидуального анализа гибридов ï2 поколения от скрещивания линии европейского происхождения 1238 и линии 16

афганского происхождения 2150 в последующих трех поколениях получены 5 константных линий, устойчивых к .заражению штаммом 250а и с некоторыми фенотипкческиш признаками линии 1238.

4. Идентифицирован белок с молекулярной массой приблизительно равной 55 кДа, синтезируемый de novo в корнях гороха (ранний нодулин) при заражении линии 1238 бактериальными штаммами 250а и A-I и линии 2150 штаммом A-I. В неинокулиро-ванных корнях обеих линий и при заражении линии 2150 штаммом 250а этот белок отсутствует. Таким образом, этот белок сйнте-'зируется растением только при взаимодействии с комплементарным штаммом.

5. При сравнительном анализе спектров водорастворимых ци-топлазматических белков из неинокулированнцх корней гороха и эффективных клебеньков, разделенных методом двумерного электрофореза идентифицировано 12 клубеньковоспецифичных белков

и 8 белков, синтез которых уменьшается (ил прекращается), в клубеньковой ткани по сравнению с корневой (рутины). С помощью иммунохимических методов группа клубеньковоспецифячннх белков разделена на 6 нодулинов и 6 бактериальных белков.

• 6. С помощью иммунохимического тестирования белковых спектров из эффективных и неэффективных клубеньков, образованию: на линия гороха 32Д2 штаммами 250а и 2486 соответст-'венно, идентифицировано только 5 клубеньковоспецифичннх белков (2 бактериальных и 3 нодуляна) в неэффективных клубеньках и один белок с молекулярной массой приблизительно равной 60 кДа, являющийся корнеспецифичным белком, синтез которого не уменьшается в неэффективных клубеньках, в отличие от эффективных- клубеньков.

7. Показано иммунохимическое родство двух бактериальных белков и. Трех нодулинов, ввделеяных из клубеньков гороха и ' люпина. Один из рутинов (R 18) - ¡монологически родственен белкам приблизительно такой же молекулярной массы (18 кДа) в корнях семи других видов семейства бобовнх.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

■I. О.А.Куликова, А.О.Заленский, А.А.Филатов. Идентификация белков гороха, связанных с симбиотической азотфиксацией. В сб.: Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной микробиологии. Материалы Всесоюзной конференция. Москва, 1986, с.217-218. ■ ' я ' ' 17.

2. М.Ю.Муравьева, О.А.Куликова. Репрессия синтеза корневого белка бобовых растений при формировании клубеньков. -Бшл. ВШШ с.-х. микробиологии, 1988, с.23-26.

3. М.А.Матвиенко, О.А.Куликова, А.О.Заленский, А.А.Филатов, И.А.Тихонович. Леггемоглобия гороха: множественные форш белков и идентификация гена. В сб.: Новые направления биотехнологии. Пущино, 1986, с.134. . .

4. О.А.Куликова, М;А.Матвиенко, А.А.Филатов, А.О.Заленский , И.А.Тихонович. Идентификация некоторых белков и генов гороха, связанных с симбиотической азотфиксацией. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва, 1987, с.122.

5. О.А.Куликова,- М.А.Матвиенко, А.0.Заленский, А.А.Филатов. Генетический и биохимический анализ признака клубевь-кообразования у гороха. В сб.: Материалы УШ съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров. Москва, 1987,т.1У, 4.1, с.226.

6. I.Iikhonovich, O.Kulikova, ti.matvienko, S.Chetkova, A.Zalensky and A.Filatov. She genetic control of symbiotic nitrogen fixation in pea (Pisum sativum L.). In: Hitrogen fixations Hundred iears After. Proceedingss of the 7th International Congress on Nitrogen Fixation. K0ln (Cologne), P.R.G., 1968. Ede. H.Bothe, F.J.Bruijin ¿nd W.iS.Newton. Stutgari. New York. 1988, p.645.