Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях

Великанов, Геннадий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях"

На правах рукописи

ВЕЛИКАНОВ Геннадий Алексеевич

ВОДООБМЕН И СИСТЕМЫ ПЕРЕНОСА ИОНОВ У КЛЕТОК В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 1997

Работа выполнена в Казанском институте биологии КНЦ РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.Н.Жолкевич

доктор биологических наук, профессор В.А.Опритов

доктор физико-математических наук В.Н.Казаченко

Ведущая организация: Сибирский институт физиологии и

биохимии растений СО РАН, г.Иркутск

Защита состоится 1997 г. в « Я часов на

заседании диссертационного совета Д 20023.01 при Институте биофизики клетки РAI-адресу: 142292, Московская область, г. Пущано, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН.

Автореферат разослан «_» • 1997 Г-

Ученый секретарь

диссертационного совета ^

кандидат биологических наук / ^ Смолихина Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что молекулы воды способны диффундировать через искусственные бнслойные липидные мембраны. Вследствие этого БЛМ сравнительно хорошо проницаемы для воды. Нет никакого запрета на существование подобного диффузионно-растворительного механизма и для транспорта воды через естественные клеточные мембраны. Вместе с этим в мембранах клеток харовых водорослей уже давно (Collander, 1954) на основании опытов по проницаемости малых молекул неэлектролитов постулируется существование узких водных пор с размером, сравнимым с размером молекул воды, реализующих однорядный транспорт последних через мембрану. Совсем недавно методами молекулярно-генетического анализа установлено, что такие однорядные водные поры в мембранах многих растительных клеток имеют белковую природу. Идентифицированы гены, кодирующие эти белки - аквапорины (см. например, Steudle, Henzler, 1995). Определена их аминокислотная последовательность (первичная структура). Представлена топология аквапорина в мембране (Johansson et al., 1996). Однако реальный вклад каждого из двух названных «путей» в суммарный трансмембранный водообмен не оценен. Не установлено каковы возможности этих двух «путей» в регуляции проницаемости клеточных мембран для воды, каковы особенности их реакций на внешние воздействия и каковы их возможности в реализации водоудерживающей способности живых клеток. В этой связи остается нерешенным также вопрос об участии транспортных «русел» селективных ионных каналов в обеспечении водопроницаемости клеточных мембран. Остается далеким от разрешения и такой специфический вопрос физиологии водообмена растительных клеток, как вопрос о роли систем трансмембранного переноса ионов в обеспечении поступления воды и вакуолизации растительных клеток при их росте растяжением и регуляции тургора клеток. Важный аспект нерешенных проблем водообмена у клеток в растениях связан также с отсутствием убедительного объяснения (теории) для механизма передвижения воды и ионов между клетками в корнях, обеспечивающего водона-гнетающую деятельность последних (отсутствие завершенной теории так называемого корневого давления или корневой экссудации). Существующие на этот счет гипотезы основываются на симпластической теории Арица (Arisz, 1956), в соответствии с которой все клетки корня считаются соединенными между собой высокопроницаемыми для воды и ионов плазмодесменнымн связями и образуют единую систему - симпласт, практически тождественную одной клетке. Роль плазмодесм при перед вижении воды и ионов по сим пласту вдоль радиуса корня сводится, таким образом, лишь к их роли в создании такой «единой клетки».

Скмпласт считается электрически эквипотенциальным, в нем отсутствуют сколь-либо существенные градиенты для активности воды и ионов. При отсутствии надежной теории корневой экссудации изучение регуляторного влияния плазмодесм на транспорт воды и ионов между клетками в корне приобретает особую актуальность.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании механизмов транспорта воды через клеточные мембраны и механизмов регуляции водообмена у клеток в высших растениях в связи с функционированием систем трансмембранного переноса ионов и переносом ионов по плаз-модесмам. Для этой цели последовательно были поставлены и решены следующие основные задачи исследования.

1) Предложена и обоснована простая методика применения метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля для оценки изменений диффузионной водопроницаемости клеточных мембран в корнях проростков высших растений (на примере проростков пшеницы) под воздействием внешних факторов.

2) Метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля применен для обнаружения нефиковского механизма диффузии молекул воды через естественные клеточные мембраны (транспорт воды по однорядным порам).

3) Исследовано в сопоставительном плане влияние мембрано-активных веществ (из набора таковых с различным механизмом действия: специфических мембранных каналоформеров, веществ «разрыхляющих» липидную фазу мембран и т.п.) на параметры водообмена корневых клеток в «осмотических» и «диффузионных» экспериментах (т.е. сопоставлены относительные (опыт - контроль) изменения выхода воды из клеток за фиксированный отрезок времени под влиянием градиента водного потенциала на мембране с соответствующими относительными изменениями показателя диффузионной проницаемости, полученными методом ЯМР, при отсутствии градиента водного потенциала на мембране). Задача такого сопоставления (сравнения) - найти феноменологический критерий для оценки перераспределения вкладов двух «путей» транспорта воды в общий трансмембранный водообмен под воздействием «регулирующего» фактора.

4) Проанализировано влияние реагентов на БН-группы белков, некоторых мембрано-активных вешеств и ингибиторов энергетического метаболизма на проницаемость клеточных мембран для воды.

5) Исследован феномен ауксиницдуцированного набухания протопластов, изолированных из клеток высших растений. Найдены элементы специфичности такого набухания (поступления воды), связанные с функционированием систем трансмембранного переноса ионов. Исследована роль протонного насоса плаз-

малеммы в поступлении воды и в синтезе полисахаридов клеточной стенки, как составных элементов процесса роста клеток растяжением.

6) С задачей поиска новых подходов к изучению механизма вакуолизации растительных клеток и роли в этом процессе систем переноса ионов через тоно-пласт продемонстрировано наличие быстрого "захвата" вакуолью (или тонопла-стом) in situ избытка катионов цитоплазмы, возникающего при фиксации на локальном участке плазмалеммы изолированного из клетки высшего растения протопласта гиперполярнзующего скачка напряжения.

7) Получены и исследованы в сопоставительном плане данные по изменению эффективного коэффициента самодиффузии воды в корнях под влиянием физиологически-активных веществ (из набора таковых с различным механизмом действия) с соответствующими данными по измененто входного электрического сопротивления корневых клеток под влиянием веществ из того же набора. Задача такого сопоставления - проверить обоснованность симпластической теории Арица (Arisz, 1956), постулирующей отсутствие регулирующего влияния плаз-модесм на передвижение воды и ионов по симпласту.

8) Исследована возможная роль плазмодесм в электрической поляризации плазмалеммы в клетках корневого симпласта, а также экспериментально показана связь проводимости плазмодесм для воды и ионов с энергетическим метаболизмом клеток.

Основные элементы научной новизны. Данная работа - первое исследование, в котором вопросы регуляции водообмена и формирования водоудержи-вающей способности у клеток в высших растениях рассмотрены на основе представления о двух путях трансмембранного водообмена (диффузионно-растворительного механизма транспорта воды через липидную фазу мембран и механизма однорядной диффузии через белковые водные поры). В качестве реальных претендентов на роль таких белковых водных пор в клеточных мембранах (на примере корней проростков пшеницы) рассматриваются специфические аквапоркны и К'-селективные ионные каналы. На основании полученных экспериментальных данных постулируется наличие у клеток в высших растениях защитной водоудерживающей способности на уровне клеточных мембран как ответа на действие неблагоприятных факторов, основанной на уменьшении (частичном или полном закрытии) более эффективного для действия водоотни-мающей силы (градиента водного потенциала на мембране) порового пути трансмембранного водообмена.

Теоретический формализм Левитга (Levitt, 1973) о диффузии молекул воды в узкой однорядной поре с размером, сравнимым с размером молекул воды (радиус поры « 3 А) «переведен» с «языка» условной вероятности для одномер-

ного перемещения молекул по узкой длинной поре на «язык» ЯМР (получено аналитическое выражение для временной зависимости относительной амплитуды сигнала протонного эха прн равновероятной ориентации пор относительно вектора градиента магнитного поля, характерной для реальных биологических объектов), а также получено прямое экспериментальное подтверждение наличия качественного сходства механизма диффузии воды в естественных клеточных мембранах с нефиковской диффузией молекул воды, характерной для формализма Левитта.

Обнаружен феномен быстрого перехода тонопласта in situ из состояния с высоким электрическим сопротивлением в состояние повышенной проводимости для входящего в вакуоль тока («захват» избытка катионов цитоплазмы) под влиянием кратковременного (< 5 мсек) макроскопического переходного тока через локальный участок плазмалеммы изолированного из клетки высшего растения протопласта, возникающего при фиксации на этом локальном участке скачка повышенного гиперполяризующего напряжения.

Установлены элементы специфичности ауксининдуцированного набухания изолированных протопластов, связанные с предшествующей набуханию активацией протонного насоса плазмалеммы и с участием К+-селективных ионных каналов плазмалеммы в механизме такого набухания (поступления воды).

Путем совместного использования метода ЯМР и одноэлектродного метода фиксации тока (current clamp) установлено: 1) что при различных фармакологических воздействиях на клетки корня возможно как взаимосопряженное изменение проводимости плазмодесм для воды и для ионов, так и независимая от потока воды регуляция ионного транспорта по плазмодесмам; 2) что регуляция (изменение) проводимости плазмодесм для воды и ионов связана с энергетическим метаболизмом клеток корня; 3) что между клетками в симпласте корня возможна электрическая неэквипотенциальность. Эти обстоятельства, в противоположность симпластической теории Арица, позволяют принципиально по новому оценивать роль плазмодесм в транспорте воды и ионов между клетками в корне

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы дают новое представление о регуляции транспорта воды через клеточные мембраны. Это позволяет на новой основе подойти к решению не только фундаментальных проблем мембранологии, но и одной из центральных проблем практического растениеводства - механизмов формирования водоудерживающей способности растительных клеток на уровне клеточных мембран. В этой связи результаты работы могут быть использованы при совершенствовании программ оптимального орошения сельскохозяйственных культур, а также в разработках научно-

обоснованных приемов сушки и консервирования сельскохозяйственной продукции.

Результаты работы имеют фундаментальной значение для построения теории корневой экссудации, а также дают новый подход к изучению функционирования тонопласта in situ н проблем вакуолизации растительных клеток.

Материалы диссертации и методические разработки, содержащиеся в ней, могут найти применение в научных лабораториях биофизического и агрофизического профиля, а также могут использоваться при чтении лекций по теоретическим основам водного режима биологических систем, по физиологии корневого питания растений и по биофизике их клеточных мембран.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме «Водный режим в связи с различными экологическими условиями» (Казань, 1976), на Всесоюзном симпозиуме «Магнитный резонанс в биологии и медицине» (Звенигород, 1977), на XXIV Международном конгрессе AMPERE (Таллин, 1978), на Международной конференции «Вода и ионы в биологических системах» (Румыния, Бухарест, 1980), на VII Всесоюзном симпозиуме по водному режиму растений (Киев, 1981), на семинаре участников Программы сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме «Вода и ионы в биологических системах» (Москва, 1981), на Первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на Сабинннских семинарзх ИФР АН СССР (Москва, 1984, 1985, 1987), на Всесоюзных школах «Биомембраны» (Звенигород, 1986, 1988), На Всесоюзной конференции «Физиолого-генетические аспекты минерального питания растений» (Киев, 1990), на III съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993), на II съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993), на расширенных семинарах отдела клеточной биологии Казанского института биологии КНЦ РАН (1993 - 1995), на Итоговых научных конференциях Казанского научного центра РАН (КФ АН СССР, Казань, 1989 - 1997 гг.). Диссертация апробирована на объединенном семинаре Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 1997) и на заседании Ученого Совета КИБ КНЦ РАН (Казань, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме монографии на 333 страницах, содержит 63 рисунка и 5 таблиц. Состоит из введения и трех разделов, каждый из которых, в свою очередь, содержит по три главы. Диссертация завершается основными выводами и списком литературы, включающим 516 наименования, из которых 194 - на русском языке.

Объекты и основные методы исследований Объектами исследований являлись отсеченные корни проростков пшеницы (Triticum aestivum L.), а также

протопласты из клеток стеблей проростков бобов (Vicia faba), н гороха (Pisum sativum).

Для изучения диффузионной водопроницаемости клеточных мембран использован импульсный метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Выход воды из корней в гипертонические растворы осмотнков за фиксированный отрезок времени количественно оценивали рефрактометрическим методом. Для регистрации мембранного потенциала и входного электрического сопротивления корневых клеток использовали одноэлектродный метод фиксации тока (current clamp). На изолированных протопластах применена также ПЭТЧ-регистрация при неплотном контакте стеклянной микропипетки с поверхностью мембраны (loose patch clamp). Более подробная информация об объектах и методах исследований - в соответствующих разделах диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении представлены актуальные проблемы водообмена у клеток в высших растениях, исходя из которых были сформулированы цель и основные задачи исследования, и которые можно условно поделить на три части, соответствующие трем разделам диссертации.

Раздел 1. Трансмембранный водообмен у клеток в высших растениях.

Для достижения успеха в решении задач трансмембранного водообмена весьма важен выбор методов исследования. Проблема состояла в том, что необходимо было совместить исследования на уровне ткани или органа многоклеточной системы с интерпретацией результатов на уровне организации транспортных процессов в клеточных мембранах. Импульсный вариант метода ЯМР во многих случаях удовлетворяет этому требованию: при весьма малом возмущающем воздействии на исследуемый объект, он оказывается чрезвычайно чувствительным к движениям на молекулярном уровне. Поэтому первая глава посвящена описанию метода ЯМР применительно к изучению диффузии молекул воды в биологических системах, а также представлению и обоснованию подхода к проблеме водопроницаемости клеточных, мембран с позиции метода ЯМР. Кратко изложена история изучения влияния диффузии молекул на сигнал спинового эха в присутствии постоянного градиента магнитного поля, в том числе на объектах биологического происхождения. В ранних работах исследователи уделяли основное внимание проблеме состояния (структуры) воды в живых системах и стремились зарегистрировать коэффициенты самодиффузии воды при как можно меньших временах «наблюдения», чтобы исключить влияние ограничивающих диффузионное смещение молекул воды внутриклеточных структур.

Существенный прорыв в расширении экспериментальных возможностей изучения диффузии молекул воды в биологических системах обнаружился после того, как Теннер и Стейскал (Tanner, Stejskal, 1968) разработали в теоретической форме и осуществили в эксперименте методику спинового эха с импульсным градиентом магнитного поля в месте расположения образца. Они показали, что в этом случае относительную амплитуду сигнала эха (отношение амплитуды эха при включенных и выключенных импульсах градиента магнитного поля - A(g)/A(0)) можно рассчитать по формуле:

где l^'^f д) - есть условная вероятность того, что молекула, находящаяся в

момент времени t = 0 в точке пространства с координатой ?0, сместится к моменту времени t = Д в точку с координатой г . g, 5 - соответственно амплитудные и временные параметры градиента магнитного поля, а у - гиромагнитное отношение резонирующих ядер (в данной работе применен протонный резонанс).

Благодаря выражению (1.1) стал возможным математически точный учет влияния диффузионных процессов любой сложности на магнитный резонанс даже в тех случаях, когда применение постоянного градиента магнитного поля допускает лишь качественные суждения. Это в первую очередь относится к диффузии молекул в ограниченном диффузионном пространстве (ограниченная диффузия).

На основе анализа литературы по вопросам ограниченной диффузии в диссертации представлен и обоснован подход к проблеме проницаемости клеточных мембран для воды (на примере мембран у клеток в корнях проростков пшеницы) с позиции метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Суть подхода состоит в следующем. 1. Когда молекулы воды диффундируют свободно в неограниченном пространстве, то вероятность в выражении (1.1) представляет собой функцию Гаусса, а относительная амплитуда сигнала спинового эха во времени (R-фактор) в этом случае, согласно (Tanner, Stejskal, 1968), будет описываться экспонентон: R = exp[-Vg2S2(A - 8/3)D], по наклону логарифма которой (см. позицию I на рис. 1) можно определить коэффициент самодиффузии молекул воды (D). 2. Для случая, когда молекулы воды диффундируют в пространстве, разделенном непроницаемы -ми для воды перегородками, теоретически н экспериментально было показано (Tanner, Stejskal, 1968; Волков, 1976), что R-фактор описывается некоторой кривой, по форме схожей с кривой 2 иа рис. 1. После некоторого предельного времени «наблюдения» за диффузией (АД диффузионное затухание сигнала эха исчезает. Это происходит потому, что средне-

1пИ

б, д = соте!.

Рис.1. Схематический вид зависимости 1пК от Д для случаев, когда диффузия происходит: 1 - в неограниченном пространстве; 2 - в пространстве, разделенном непроницаемыми перегородками; 3 - в пространстве, разделенном перегородками, имеющими некоторую проницаемость для диффундирующих частиц (например, живая ткань с проницаемостью клеточных мембран для воды).

квадратичное смещение молекул принципиально не может превосходить среднего размера между непроницаемыми перегородками (стенками). 3. Если допустить, что стенки, разделяющие диффузионное пространство, будут иметь некоторую проницаемость для диффундирующих молекул, то при времени «наблюдения» большем Л„ вновь появится экспоненциальное затухание Я-фактора, соответствующее уже реальному среднеквадратичному смещению молекул, определяемому параметром проницаемости стенок для диффундирующих молекул. По наклону логарифма этой экспоненты (поз.З на рис.1) можно определить некоторый эффективный коэффициент самодиффузии молекул (0,фф). В диссертации продемонстрировано наличие экспериментального соответствия реальной зависимости 1п(1 от А для отсеченных корней проростков пшеницы такому формальному подходу к проблеме проницаемости клеточных мембран для воды: при Л > 300 мсек происходит спрямление зависимости 1пК от А и наблюдается строго экспоненциальный спад Я-фактора; рассчитанный по значению ¡-С средний размер клеток находится в хорошем соответствии с данными измерений под микроскопом; определенный из значения Э^ф с использованием соотношения Крика (Спек, 1970) (это соотношение получено из анализа сопротивления течению через серию равноотстоящих друг от друга плоскопараллельных мембран) коэффициент проницаемости клеточных мембран для воды (р) находится в хорошем соответствии с данными литературы о среднем значении этого показателя для мембран различных растительных клеток; нарушение барьерной функции клеточных мембран парами хлороформа увеличивает 0,фф до уровня коэффициента самодиффузии воды внутри клетки (0о). Эти обстоятельства, в сочетании с экспериментальными данными по влиянию мембра-но-активных веществ на регистрируемые значения О ^, позволяют сделать заключение, что изменение величины эффективного коэффициента самодиффузии воды при прочих равных условиях определяется изменением диффузионной во-

допроницаемости клеточных мембран. В диссертации, в связи с этим, используется сравнительный (опыт - контроль) метод анализа.

Глава 2. Экспериментально-теоретические аспекты транспорта воды и ионов через клеточные мембраны. Первые представления о клеточной мембране как о сплошном липидном бислое были поставлены под сомнение в классических исследованиях Колландера (Collander, 1937; 1949) проницаемости растительных клеток по отношению к неэлектролитам. Колландер подтвердил ранние наблюдения Овертона о том, что для многих молекул неэлектролитов проницаемость клеточных мембран находилась в соответствии с растворимостью этих молекул в оливковом масле. Тем самым была продемонстрирована возможность диффузионно-растворительиого механизма проницаемости клеточных мембран по отношению к неэлектролитам. Детальная теоретическая разработка такого механизма проницаемости неэлектролитов и воды через липидный бислой позднее была осуществлена в работе (Heckmann, 1972). Однако, вместе с этим, Колландер нашел, что определенные гидрофильные растворимые вещества (например, этиленгликоль, мочевина, ацетамид и др.) проникают в клетки гораздо быстрее, чем предсказывали данные по диффузии этих молекул в оливковом масле. Эксперимент показывал, что молекулы этих веществ проходят через клеточные мембраны со скоростью, приблизительно соответствующей скорости свободной диффузии этих молекул в воде. Была установлена существенно лучшая корреляция коэффициентов проницаемости с размерами этих молекул, нежели с их растворимостью в оливковом масле. Оказалось, что чем больше молекула, тем меньше коэффициент ее проницаемости в клетку. Если же размер молекулы превышал некоторую величину, то она почти совсем не проникала в клетки. Так по данным Левитта (Levitt, 1974) коэффициент проницаемости ди-метилмочевины (радиус 2.52 А) в 15 раз ниже, чем для мочевины (радиус 2.11 А), а молекула эритротола (радиус 2.6 А) уже имела коэффициент проницаемости на три порядка ниже, чем диметилмочевина. Результаты опытов Колландера и подобные результаты других исследователей, свидетельствующие «просеивание» маленьких гидрофильных растворенных веществ естественными клеточными мембранами, интерпретировались как доказательство существования водных (полярных) пор в этих мембранах. Причем размеры таких пор незначительно превышают размер молекул воды (радиус 1.5 А). Современные данные о белках-аквапоринах в мембранах растительных клеток (Steudle, Henzler, 1995), в смысле размерных параметров транспортных «русел» и параметров проницаемости для неэлектролитов, находятся в полном соответствии с такими «классическими» представлениями. В этой же главе анализируется современная концепция ионных каналов в клеточных мембранах. Причем основное внимание

уделено разрабатываемой в последние годы концепции их кластерной организации (Казаченко, 1990), в соответствии с которой ионные каналы представляют собой агрегаты (кластеры) идентичных элементарных протоканалов (или кана-лов-субъединиц), являющихся, в свою очередь, системами однорядного транспорта ионов и воды. Представлены основные сведения о регуляции каналов-кластеров. Обращается внимание, что концепция ионных каналов имеет общие черты с концепцией водных пор и что ионные каналы могут рассматриваться как единые транспортные системы для ионов и воды. Существенное экспериментальное звено, дающее основание для такого объединения этих двух концепций, представляют собой исследование свойств грамицидинового канала, встроенного в искусственный липидный бислой (Hladky, Haydon, 1970; 1972), а также исследования БЛМ, реконструированных полиеновыми антибиотиками, такими как нистатин или амфотерицин В (Finkelstein, Holz, 1973).

Идея однорядных водных пор в естественных клеточных мембранах стала разрабатываться в теоретическом плане. Так Левиттом (Levitt, 1973; 1974; Levitt, Subramanian, 1974) было получено точное решение для одномерного движения молекул воды в узкой поре. При условии, что столкновения молекул в поре друг с другом являются одномерными, а в результате взаимодействия со стенкой поры молекулы воды отражаются в случайном направлении (рассматривалось движение по системе диффузно-отражающих связывающих мест), вероятность того, что молекула воды, находящаяся в нулевой момент времени в нулевой координате, будет к моменту времени t находиться в координате х, была получена Левиттом в следующем виде:

где р - плотность молекул воды в одномерной поре. В соответствии с уравнением (1.1), наличие условной вероятности (1.2) диффузионного смещения молекул открывает возможность «перевода» соответствующего механизма движения на «язык» ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Мы воспользовались этим обстоятельством и получили аналитическое выражение для относительной амплитуды сигнала спинового эха (выражение для Я-фактора) при равновероятной ориентации пор относительно вектора градиента магнитного поля, характерно для реальных биологических объектов. Оно выглядит так:

(1.2)

(1.3)

гдеЕг*т= -Н»р( —/' V и представляет собой табличную функцию (интег-V* Т.

рал вероятности). На рисунках 2 и 3 представлены теоретические зависимости и соответствующие нм экспериментальные данные, полученные нами для клеток прессованных пекарских дрожжей. Теоретические кривые (по выражению (1.3)) имеют характерные особенности, отличающие эти кривые от проявлений ограниченной диффузии, и свойственны исключительно однорядному транспорту.

I 1.з Ьжп(т]

ц атпрСеек]

Рис.2. Экспериментальные зависимости 1п Я от Д для прессованных дрожжей (ГОСТ 171-69) при 5 = 600 мсек и значениях амплитуды градиентных импульсов равных:. - 87, Д - 131, о - 231, и □ -420 гс/см, соответственно. Сплошными линиями представлены теоретические зависимости по уравнению (1.3).

Рис.3. Экспериментальные зависимости 1п Я от £2 для прессованных дрожжей при 5 = 600 мсек и значениях интервала Д равных: 100, д - 200, и о - 300 мсек, соответственно. Сплошными линиями представлены аналогичные теоретические зависимости по уравнению (1.3).

Качественное совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными при больших временах наблюдения оказалось настолько хорошим, что позволяет сделать заключение о получении нами прямого экспериментального свидетельства существования нефиковского механизма диффузии воды через клеточные мембраны, характерного для однорядного транспорта воды в узких порах по формализму Левитга. На реконструированных антибиотиками (такими, как грамицидин А, нистатин, амфотерицин В) искусственных бислойных' липидных мембранах было установлено (см. КпкеЫеш, 1984), что при наличии осмотического градиента возникает фильтрация воды через поры, вследствии чего коэффициент диффузионной проницаемости, регистрируемый при отсутствии осмотического градиента на мембране (ра), всегда оказывается меньше, чем рШГП. В то время как переконструированные мембраны (диффузионно-растворительный механизм транспорта воды) характеризуются равенством отмеченных коэффициентов (р„,т = р<*).

Это обстоятельство и было положено в основу анализа и интерпретации результатов наших экспериментов, представленных в следующей главе.

Глава 3. Проницаемость мембран растительных клеток для воды. Эксперименты по ее регуляции. Весь экспериментальный материал этой главы получен на отсеченных корнях проростков пшеницы «Московская-35», а основное ее содержание в сжатой форме иллюстрируется рисунком 4. На первом этапе исследований мы использовали специфические мембранные каналоформеры -нистатин, амфотерицин В - для того, чтобы установить как скажется на изменении регистрируемых нами параметров водообмена увеличение вклада порового механизма в суммарном трансмембранном водообмене, т.е. как скажется увеличение в мембранах количества специфических водных пор. Предварительно было показано, что эти антибиотики способны проникать внутрь корневых клеток и осуществлять реконструкцию клеточной мембраны по тому же принципу как и на искусственных липидных бислоях. Под влиянием нистатина (поз.2 на рис.4) наблюдали многоразовое, по сравнению с контролем, возрастание выхода воды в раствор осмотика за фиксированный отрезок времени при сравнительно небольшом возрастании эффективного коэффициента самодиффузии воды. То есть, при количественном увеличении порового механизма водопроницаемости резко возрос показатель осмотического выхода воды.

На следующем этапе исследований в мембранах корневых клеток была осуществлена индукция аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ). Появление в гидрофобном слое мембраны гидроксилов и полярных продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот при индукции ПОЛ согласно данным литературы приводит к увеличению гидратированности мембран и может существенно увеличить диффузию воды через липидную фазу. Вместе с этим в литературе есть данные, что при активации ПОЛ резко снижается число активных БН-групп, т.е. одновременно с ПОЛ происходит окисление сульфгидрильных групп мембранных белков. В свою очередь, образование ди-сульфидных связей является эффективным механизмом блокирования водных пор белков-аквапорннов. Поэтому, исходя из данных литературы, можно было ожидать, что при активации ПОЛ уменьшится специфическая поровая водопроницаемость мембран при одновременном возрастании диффузии воды через липидную фазу. И действительно, в эксперименте наблюдается существенное возрастание эффективного коэффициента самодиффузии воды при значительно меньшем, по сравнению с эффектом нистатина, выходом воды по осмотическому градиенту (поз.З на рис.4). В этих опытах «нащупывается» феноменологический критерий для оценки регуляторного перераспределения вкладов двух «путей» в суммарный трансмембранный водообмен: при возрастании вклада порового «пути» может наблюдаться существенно больший коэффициент приращения «осмотического» показателя по сравнению с «диффузионным»; когда же доминирующим становится водообмен через липидную фазу, то коэффициенты приращения «осмотического» и «диффузионного» показателей трансмембранного водообмена выравниваются. Справедливость такого критерия подтверждается дальнейшими опытами с соединениями фенотиазиновой группы, обладающими

эфл опит эфф. контр

12 3 4

гЬ

^жрф опыт ^xjxp кмтр

8,0 5,0 <,0 3.0 2,0 '.0

J-,

Дп

i 1

а)

б)

анестезирующим действием (пипольфен, хлорпромазин). Так под влиянием пи-польфена (поз.4 на рис.4) наблюдается изменение параметров трансмембранного водообмена, сходное с таковым при ин-

Рис.4. Относительные (опыт/контроль) изменения (а) эффективного коэффициента самодиффузии воды и (б) выхода воды за 5 минут в 4% раствор сахарозы для корней проростков пшеницы после предварительной инкубации их в течение одного часа (4 - в течение 30 минут) в растворах: 1 - !ЬО (контроль); 2 - нистатин (10"4 М); 3 - индукция ПОЛ (аскорбат (10'3 М) + БКР-525А (КГ* М)); 4 - пипольфен (10"3М); 5 - ПХМБ (10"2М).

дукции ПОЛ, что в свете введенного критерия можно интерпретировать как свидетельство перераспределения вкладов двух «путей» трансмембранного водообмена в пользу доминирования диффузии воды через липидную фазу мембраны. Анализ данных литературы подтвердил правомерность такой интерпретации. Действительно, соединения типа пипольфена и хлорпромазина способны дестабилизировать липидные бислои, увеличивать гидратированность мембран и тем самым интенсифицировать диффузионно-растворительный механизм трансмембранного водообмена. Вместе с этим в последние годы убедительно продемонстрировано подавление активности ионных каналов в растительных клетках с помощью различных антагонистов кальмодулина, к числу которых в первую очередь относятся хлорпромазин и пипольфен. Анализ данных литературы свидетельствует о том, что эти соединения могут блокировать ионные каналы и кальмодулин независимым образом - путем прямого взаимодействия с Са2*-связывающими центрами канальных белков (Harper et al., 1991). Вытеснение кальция из мембран этими соединениями может способствовать распаду каналов-кластеров. В свою очередь, и это экспериментально установлено (Гелетюк, Казаченко, 1990), каналы малой проводимости, образующиеся при распаде каналов-кластеров, могут быстро инактивироваться. Таким образом под влиянием пипольфена и хлорпромазина действительно может происходить перераспределение вкладов двух «путей» для трансмембранного переноса воды в сторону до-

минирования диффузии воды через липидную фазу, что и отразилось на параметрах водообмена в «осмотических» и «диффузионных» опытах.

Интересно, что под влиянием окислителя сульфгидрильных групп белков - парахлормеркурийбензоата (ПХМБ) наблюдается «картина» изменения параметров водообмена, сходная с эффектом нистатина, когда заведомо было увеличено количество водных пор в мембранах ( сравн. поз. 2 и 5 на рис.4). Эти опыты делают достаточно убедительным вывод о том, что водопроницаемость клеточных мембран в изучаемом нами объекте может регулироваться их белковым компонентом (водными порами белковой природы). Экспериментальные данные на рис.4 свидетельствуют также о том, что поровый «путь» трансмембранного водообмена более эффективен для действия водоотнимающей силы, чем диффу-зионно-растворнтельный, поскольку при одном и том же градиенте водоотдача перового «пуги» выше. Сопоставление результатов опытов с нистатином и ПХМБ свидетельствуют также о существенном вкладе порового «пути» в регу-ляторных изменениях суммарного трансмембранного водообмена в корнях пшеницы. При этом экспериментальные данные по влиянию пипольфена и индукции перекисного окисления липидов на водопроницаемость клеточных мембран предсказывают возможность существования регуляторной связи между двумя «путями» трансмембранного водообмена (дифузионно-растворительным и поро-вым). Анализ литературы показал, что при обоих этих воздействиях возрастание транспорта воды через липидную фазу может быть сопряжено с частичным или полным блокированием транспорта воды через белковую фазу (через белковые водные поры). То есть, в этих опытах «просматривается» возникновение, в ответ на увеличение водопроницаемости литшдной фазы экзогенными факторами, защитной реакции, направленной на блокирование наиболее эффективного для действия водоотнимающей силы порового пути трансмембранного водообмена.

Возможность возникновения подобной защитной реакции на действие неблагоприятных факторов у растительных клеток зримо выявилась в опытах по влиянию ингибиторов дыхания на параметры водообмена корневых клеток (рис.5). Эффективный коэффициент самодиффузии воды под влиянием всех использованных в этих опытах ингибиторов, возможно, незначительно увеличивается (наиболее заметно в варианте с КСН хотя и в пределах недостоверных различий). В любом случае уменьшения О^ не наблюдалось, а осмотический выход воды из клеток заметно уменьшается. Явно имеет место угнетение осмотического потока воды на фоне не уменьшившейся самодиффузии воды через мембрану. Анализ полученных данных позволил выдвинуть гипотезу о наличии у клеток в высших растениях на уровне клеточных мембран защитной водоудер-

жквающей способности на действие неблагоприятных факгоров внешней среды, основанной на частичном или полном закрытии более эффективного для действия водоотнимающей силы порового пути трансмембранного водообмена.

Рис.5. Эффективный коэффициент самодиффузнн воды для корней проростков пшеницы (а) и выход воды в 5% раствор полнэтиленгликоля за 5 минут (б) после предварительной инкубации в течение одного часа в растворах: I -Н20; 2 - ротенона (МО5 М); 3 - антимицина А (1-Ю"5 М); 4 - КСЫ (2-10"4 М); 5 - мединала (5-10° М).

В этой главе проведено также обсуждение вопроса о природе водных пор в клеточных мембранах. Общий анализ полученных экспериментальных данных в совокупности с анализом данных литературы позволяет в качестве наиболее реальных претендентов на роль протеиновых водных пор в мембранах у клеток в растениях рассматривать аквапорины и калий селективные ионные каналы.

Раздел .11 (главы 4, 5. 6). Системы трансмембранного переноса ионов при росте клеток растяжением (некоторые модели и составные элементы процесса).

Механизм роста растяжением, который существует только у растительных клеток, заключается в поглощении клеткой значительного количества воды и образовании большой центральной вакуоли, занимающей до 90-95% клеточного объема. Преимущество такого способа роста многоклеточных растительных организмов (роста растяжением по сравнению с ростом за счет деления клеток) состоит в том, что этот рост осуществляется главным образом за счет поглощения клеткой воды без больших затрат азотистых веществ на синтез цитоплазмы. Участие и роль систем трансмембранного переноса ионов в регуляции поглощения воды и в механизме вакуолизации клеток при их росте растяжением до настоящего времени остаются малоизученными. Однако точно установлено, что для роста растяжением обязательно присутствие в клетках растительного гормо-

П „ х10всмг/сех

гЬ

1*1

¿1

гЬ

а)

Выход воды, % от сырого веса

б)

на ауксина (индолилуксусной кислоты - ИУК). Поэтому привлекательной моделью для изучения роли трансмембранных систем переноса ионов в поглощении воды растительными клетками может быть обнаруженный Кокингом (Cocking, 1961) процесс ауксиннндуцированного набухания изолированных протопластов растительных клеток, механизм которого до сих пор остается не ясным.

Глава 4. Ауксиннндуцированное набухание изолированных из растительных клеток протопластов как модель водообмена при росте клеток растяжением. Суть процесса заключается в том, что при действии ИУК на выделенные из растительных клеток протопласты, предварительно стабилизированные в среде ос-мотика или находящиеся даже в гипотонических условиях, наблюдается интенсивное поглощение ими воды (набухание). Использование изолированных протопластов в плане исследования механизма поступления воды в растительную клетку и участия систем трансмембранного переноса ионов в этом процессе целесообразно еще и потому, что из-за наличия клеточной стенки и тургора применение современных методов электрофизиологии непосредственно на интакт-ных клетках высших растений затруднено, и именно на изолированных протопластах и вакуолях растительных клеток в настоящее время, в связи с внедрением ПЭТЧ-регистрации на этих объектах, исследователями получена богатая информация о системах трансмембранного переноса ионов (в отдельном параграфе этой главы сделан обзор соответствующей литературы).

Полученная нами «картина» набухания протопластов под влиянием ИУК представлена на рис. 6 а. В процессе такого набухания наблюдается устойчивая ги-

Рис.6. Относительное (в % к исходному) изменение диаметров протопластов (а) и типичная картина изменения их мембранного потенциала (б) под влиянием ИУК (10"* М). п - количество протопластов, за которыми велось наблюдение. Показана ошибка средней арифметической (± ш).

перполяризация плазмалеммы (рис.б б). (Предварительно нами отработана методика отведения МП с помощью стеклянных микроэлектродов, представляющая собой нетривиальную задачу, поскольку перед началом наших исследований в литературе доминировало представление о положительном значении мембранного потенциала на плазмалемме изолированных протопластов (плюс внутри) относительно наружного раствора. Нами показано, что положительное значение МП протопласта является артефактом. Установлена его причина, найден способ устранения). При наличии в наружном растворе специфического ингибитора протонного насоса плазмалеммы (ДЦКД) гиперполяризация плазма-леммы под действием ИУК не возникает, а исходная ИУК-индуцированная гиперполяризация устраняется (см. рис.7). При этом было продемонстрировано, что введение в среду ДЦКД прекращает процесс ИУК-индуцированного набухания, а в присутствии ДЦКД ауксин вообще не вызывает поступление воды в протопласт.

Рис.7. Типичный результат изменения МП изолированных протопластов под влиянием ИУК (10"* М) и ДЦКД (Ю"4 М). Состав среды: сахароза 0.5 М, СаСЬ 1 мМ, КС1 0.1 мМ.

5-м

-20

2.-ю

ш £

о-зо

ДЦКД

I ИУК . 1

мин

10 20

(ДЦКД

ИУК г~

мин

В опытах, иллюстрируемых рисунком 6, мы одновременно наблюдали влияние ИУК на два процесса - электрическую поляризацию плазмалеммы и изменение объема протопласта. Для конкретизации механизма участия протонного насоса плазмалеммы в поступлении воды важно установить вектор взаимовлияния между этими двумя экспериментально наблюдаемыми процессами, вызываемыми ауксином. Какой из этих процессов первичен? Не может ли сам процесс набухания влиять на электрическую поляризацию плазмалеммы? С целью ответа на этот вопрос было изучено влияние изменения осмотичности наружной среды на МП протопластов. Результаты экспериментов (рис.8 а) свидетельствует о том, что при уменьшении осмотичности наружной среды и происходящего вследствие этого входа воды в протопласт по осмотическому градиенту, наблюдается гиперполя-

ризация плазмалеммы протопластов. Величина изменения МП зависит от степени разбавления наружного раствора.

Рис.8. Изменение МП изолированных протопластов при уменьшении осмотичности наружного раствора. Стрелками указаны моменты разбавления наружного раствора на 4.3% дистиллированной водой (позиция а). То же, после предварительного выдерживания протопластов в растворе ДЦКД (Ю-4 М) в течение 15 минут (позиция б). Состав наружного раствора: 1 - 0.5 М сахарозы, 1 мМ СаСЬ, 0.1 мМ КС1; 2 - 20 % раствор полиэтиленглнколя (м.в. 4000), 1 мМ СаСЬ, 0.1 мМ КС1. Показаны типичные варианты опытов.

Для выяснения механизма участия протонного насоса плазмалеммы в индуцированных осмотическим набуханием изменениях МП протопластов были проведены эксперименты с ингибитором протонного насоса - ДЦКД (рис.8 б). При осмотически вызванном набухании протопластов, предварительно находящихся в растворе с ДЦКД, наблюдалось лишь временное увеличение МП: через 3-5 минут МП возвращался на исходный уровень - устойчивой гиперполяризации не происходило. Для объяснения наблюдаемых эффектов мы привлекли результаты работ С.Н.Айрапетяна с сотр. (1979, 1981). В опытах по связыванию уабаина с мембраной нейрона ими было показано, что при изменении осмотичности наружного раствора изменяется степень связывания уабаина, т.е. изменяется число функционирующих насосных единиц. Было также установлено, что в гипотоническом растворе происходило увеличение числа функционирующих комплексов Ыа-насоса, экранированных до этого складчатостью мембраны.

Наличие складчатости плазмалеммы у изолированных протопластов растительных клеток продемонстрировано в ряде работ (см., например, Бутенко, 1981). Пров еденный нами сопоставительный анализ позволил сделать заключение, что при осмотически индуцированном набухании изолированных протопластов растительных клеток происходит увеличение числа активно функционирующих Н+-АТФазнмх комплексов плазмалеммы из-за открывания дополни-

тельных, экранированных до этого складчатостью мембраны насосных единиц. В опытах с ДЦКД (см. рис.8 б) работа этих дополнительных насосных единиц быстро подавлялась присутствующим в наружном растворе ингибитором (ДЦКД), чем и можно объяснить происхождение «горба» на кривой изменения МП. После установления природы этого «горба» возвратамся к рис.7. Видно, что под влиянием ИУК в среде с ДЦКД «горб» не возникает. Это может означать, что из двух экспериментально наблюдаемых под влиянием ИУК процессов - гиперполяризацин МП и поступления воды (набухания) - первичным является гиперполяризация плазмалеммы, связшшая с активацией протонного насоса ауксином.

Проведенный в этой главе анализ полученных экспериментальных данных показал, что активация протонного насоса плазмалеммы под влиянием ИУК является существенно необходимым специфическим элементом ауксининдуциро-ванного набухания протопластов, отличающим механизм такого набухания от осмотически индуцированного, а подключение к процессу ауксининдуцирован-ного набухания дополнительных (резервных) насосных субьединиц, экраниро-. ванных до этого складчатостью мембраны, можно рассматривать как возникновение положительной обратной связи в первичной ауксининдуцированной активации протонных насосов плазмалеммы, т.е. в качестве усилителя процесса набухания. Целесообразность такого усилителя видится в том, что он может обеспечить эффективное и быстрое подключение к первичным реакциям клетхи на ауксин потенциалзависимых изменений в ионном транспорте. И действительно, в опытах по влиянию блокаторов ионных каналов плазмалеммы на процесс аук-сининдуцированного набухания протопластов была выявлена другая специфическая особенность такого набухания (поступления в клетку воды). Задача состояла в том, чтобы выявить те ауксиииндунированные изменения в ионном обмене, которые существенно необходимы для реализации процесса набухания протопластов и которые могут быть связаны с работой селективных ионных каналов плазмалеммы. Было установлено, что специфические блокаторы кальциевых и хлорных каналов плазмалеммы - верапамил и ионы Тг\ не оказывают никакого влияния на интенсивность процесса набухания протопластов под влиянием ИУК, в то время как блокатор калиевых каналов - ТЭА* и блокатор калиевых каналов входящего выпрямления - ионы А11 (БсЬгоескг, 1988) полностью устраняли ИУК-индуцированное набухание. При этом сами блокаторы не влияли на исходную стабильность объема протопластов (контроль). Анализ этих опытов указывает на важную роль трансмембранного переноса ионов К' внутрь «клетки» при набухании протопластов, а К -селективные каналы входящего выпрямления являются, по-видимому, претендентами на основной путь ауксининдуцирован-

ною поглощения этих ионов по электрохимическому градиенту. Такое заключение соответствует представлениям о том, что гиперполяризация плазмалеммы, понижение концентрации Ca2' в цитоплазме (Н' /Са2' - обмен) и понижение ци-топлазматической концентрации ионов Н' при активации протонного насоса плазмалеммы создают необходимые условия для активации К'-каналов входящего выпрямления (Schroederet at., 1987; Schauf, Wilson, 1987).

В ходе дальнейших опытов нами было установлено, что величина ауксн-ниндуцированной гиперполяризации плазмалеммы протопластов находится в непосредственной зависимости от активности гликолиза. Это, в сочетании с отсутствием влияния блокатора хлорных каналов, позволило сделать заключение, что противоионами для входящего в клетку калия при ауксиниьдуцированном набухании протопластов могут являться анионы органических кислот (такие как пируват' или малат"), образующиеся в ходе реакций гликолиза. Анализ данных литературы позволил сделать заключение, что для ионов калия, поступающих в цитоплазму через соответствующие каналы плазмалеммы, а также для их органических противоионов имеются реальные (экспериментально обнаруженные на изолированных вакуолях) системы переноса ионов, способные обеспечить поглощение этих ионов вакуолью и, таким образом, обеспечить возможность вакуолизации (увеличения размеров вакуоли) изолированных протопластов при ауксининдуцированном набухании последних.

Способность вакуоли или тонопласта in situ к захвату избытка ионов цитоплазмы (к контролю ионной силы или тоничности цитоплазмы) была экспериментально продемонстрирована нами в опытах (6 глава) с применением ПЭТЧ-регистрации при неплотном контакте стеклянной микропипетки с поверхностью мембраны на изолированных протопластах, помещенных в среду с высокой концентрацией ионов калия (130 мМ). Было установлено, что под действием скачка высокого гиперполяризующего напряжения 400 мВ) на локальном участке плазмалеммы, площадью около 200 кв. микрон, возникает кратковременный, 5 мсек) макроскопический ток, входящего в цитоплазму направления. Одновременно с этим макроскопическим током регистрировались изменения напряжения в цитоплазме и в вакуоли относительно наружного раствора с помощью стеклянных микроэлектродов, а также макроскопический ток, текущий через вторую систему ПЭТЧ-регистрации, подключенную к протопласту так, как схематически изображено на рис.9. В результате анализа соответствующих токовых кривых и кривых изменений напряжения в цитоплазме и в вакуоли показано, что в процессе развития макроскопического тока через локальный участок плазмалеммы, тонопласт (мембрана вакуоли), исходно находящийся в состоянии высокого электрического сопротивления (RTOH» ЯПЛази), за время, равное

Рис. 9. Схематическое изображение двух систем ПЭТЧ-регистрации при неплотном контакте (ПР-1 и ПР-2), подключенных с помощью стеклянных микропипеток к различным локальным участкам плазмалеммы протопласта. На вход системы ПР-1 (вх.1) подается скачок высокого гиперполяризующего напряжения. В суммарном токе, регистрируемом системой ПР-2, вход которой (вх.2) за-

~ 1 мсек переходит в состояние повышенной проводимости для входящего в вакуоль тока. Возникновение в этой ситуации транстонопластного тока в вакуоль свидетельствует в пользу существования у вакуоли in situ способности к контролю ионного состава цитоплазмы. Полученные данные выявляют новый методический подход к познанию механизмов контроля вакуолью (или тонопластом) ионного состава цитоплазмы и создают основу для изучения ныне еще во многом загадочных механизмов участия систем переноса ионов тонопласта в процессе вакуолизации растительных клеток.

На основе полученных экспериментальных данных и данных литературы в диссертации представлена схема, иллюстрирующая системы трансмембранного переноса ионов плазмалеммы и тонопласта, которые могут быть задействованы в ауксининдцуированном набухании изолированных протопластов как модели роста клеток растяжением. Однако реальный процесс такого роста безусловно во многих аспектах отличается от процесса ауксининдуцированного набухания изолированных протопластов. Связано это прежде всего с наличием у растительных клеток полисахаридной клеточной стенки и с важной ролью элементов углеродного метаболизма в процессе роста клеток. К настоящему времени надежно установлено, что основным фактором, приводящим к лабилизации связей между компонентами клеточной стенки при росте клеток растяжением, являются ионы Н' (Taiz, 1984), т.е. подкисление клеточных стенок существенно необходимо для растяжения клеток. Другой аспект механизма роста клеток растяжением - синтез компонентов клеточных стенок de novo (т.е. прирост биомассы кле-

вакуоль

землен (на кончике микропипетки фиксируется нулевой потенциал), а чувствительность по то-

ку на два порядка выше, чем у IIP-1, содержится соответству-

ющая токовая реакция вакуоли.

точных стенок). Однако вопрос о роли систем трансмембранного переноса ионов в синтезе полисахаридов клеточной стенки и в координации такого синтеза с механизмом поступления в клетку воды (механизмом вакуолизации клеток) в литературе практически не обсуждался, хотя и существуют данные о том, что интенсивность синтеза основного полисахарида клеточной стенки растений - целлюлозы - зависит от уровня мембранного потенциала на плазмалемме. Поэтому 5 глава диссертации посвящена изучению механизма связи синтеза полисахаридов клеточной стенки с величиной электрического напряжения на плазмалемме. Синтез полисахаридов изучали путем регистрации включения экзогенной ,4С-глюкозы в различные по растворимости фракции клеточных стенок у корней пшеницы. В результате исследований было показано, что синтез целлюлозы скоррелирован не с абсолютной величиной электрического напряжения на плазмалемме (нет прямой потенциалозависимости локализованных на плазмалемме целлюлозосинтетазных комплексов), а с величиной его метаболической компоненты, определяемой активностью элекгрогенного протонного насоса плазма-леммы. Это может означать, что в единой системе процессов, составляющих рост клеток растяжением и включающий в себя поступление воды (вакуолизацию клеток), разрыхление клеточных стенок и синтез целлюлозы клеточных стенок de novo, координирующим звеном является протонный насос плазмалеммы. Это обстоятельство усиливает правомерность нашего подхода к процессу ауксининдуцированного набухания протопластов как к модели для изучения роли систем трансмембранного переноса ионов в регуляции поступления воды в клетку при ее росте растяжением, а данные о том, что протонный насос плазмалеммы может быть координирующим звеном в цепи процессов, сопряженных с ростом клеток растяжением, дополняют эту модель до ее большего соответствия реальным процесса in vivo.

Раздел HI (главы 7. 8. 9). Перенос воды и ионов между клетками в корнях растений (к механизму корневой экссудации).

7 глава посвящена рассмотрению существующих в литературе представлений, призванных описать процесс выделения пасоки у изолированного корня растения, начиная с количественного описания скорости корневой экссудации, при котором все ткани корня между наружным раствором и сосудами ксилемы (основное русло восходящего потока воды) рассматривались в качестве одной осмотически активной мембраны, и заканчивая современными выкладками, при которых исследователи отошли от принципа черного ящика при рассмотрении корня и в большей степени стали учитывать его реальную анатомическую структуру.

Для транстканевого переноса воды и растворенных веществ в корнях растений существуют три пути: апопластный (через заполненные водой полисаха-ридные клеточные стенки), симпластный (через объединенную с помощью плаз-модесм цитоплазму клеток) и трансклеточный (с пересечением клеточных мембран) (см. рис. 10). Радиальный транспорт веществ по апопласту корня в зону развитых ксилемных сосудов встречает барьер - суберинизированные, водонепроницаемые пояски Каспари в стенках клеток эндодермы. Поэтому вода и растворенные вещества на пути из внешней среды в сосуды ксилемы по меньшей мере дважды вынуждены пересекать клеточные мембраны - на входе в симопаст (в клетках эпидермиса и коры) и на вы-

Рис.10. Возможные пути радиального транспорта воды и растворенных веществ в корне (А) и двухмембранная модель корня (Б).

ходе из симпласта (в стели корня - в клетках перицикла). В этой связи радиальный транспорт через корень может быть описан на основе его двухмембранной модели (рис.10 Б). Основные приближения двухмембранной модели корня вытекают из симпластической теории Арица (АпБг, 1956), согласно которой, несмотря на наличие трех вышеназванных путей (см. рис. 10), перемещение веществ через корень в значительной мере происходит по плазмодесмам через цитоплаз-матический континуум: все клетки корня считаются соединенными между собой высокопроницаемыми для воды и ионов плазмодесменными связями и образуют единую систему - симпласт, практически тождественную одной клетке. Роль плазмодесм при передвижении воды и ионов по симпласту вдоль радиуса корня сводится, таким образом, лишь к их роли в создании такой «единой клетки». Симпласт считается электрически эквипотенциальным, а сколь-либо существенная независимая регуляция проводимости плазмодесм для воды и для ионов отсутствует (т.е. между клетками внутри симпласта отсутствуют сколь-либо существенные градиенты активности воды и растворенных веществ). Современные концепции корневой экссудации так или иначе базируются на такой модели: рассматривается либо асимметрия свойств граничных мембран по пассивной

проницаемости к воде и растворенным веществам (Newman, 1976), либо специфическая локализация активного транспорта ионов на этих мембранах (Katou, Taura, 1988; 1989), либо специфическое распределение на них гидростатического давления (Лялин, 1989).

Ограниченность всех этих концепций стала очевидной после того, как обнаружилось, что пасоку выделяют и так называемые «рукавчики» - корни проростков кукурузы, лишенные центрального цилиндра. При удалении последнего разрыв происходит по клеткам эндодермы (по зоне поясков Каспари, см. рис. 10). То есть, стало очевидным, что механизм экссудации связан не только со свойствами двух вышеназванных граничных мембран или со специфической их локализацией. В дополнение к существующим концепциям корневой экссудации была выдвинута сугубо метаболическая концепция, предполагающая, что значительная часть (компонента) движущей силы экссудации может быть основана на работе сократительных белков, осуществляющих ритмическое нагнетание воды в сосуды ксилемы живыми клетками корня (Можаева, Пильшикова, 1979; Жол-кевич и др., 1979; 1989). Автоколебания (ритмические изменения объема клеток) в процессе экссудации действительно наблюдаются экспериментально. Однако их природа не ясна. Если принять, что автоколебания отражают нагнетающую воду работу сократительных белков (что-то подобное насосу), то возникают, не говоря об энергетической стороне проблемы, по крайней мере, следующие вопросы. Что синхронизирует работу сократительных белков в разных клетках симпласта? Что выполняет роль клапанов, обеспечивающих однонаправленное движение воды при пульсации клеток? Наконец, что синхронизирует работу сократительных белков и названных клапанов?

8 глава посвящена изучению межклеточного переноса воды и ионов в корнях проростков пшеницы. Мы поставили перед собой задачу продемонстрировать наличие регуляции проводимости плазмодесм для воды и ионов, а также проверить основные постулаты вышеотмеченной симпластической теории Ари-ца путем сопоставления данных по изменению эффективного коэффициента самодиффузии воды в корнях под влиянием набора специально подобранных физиологически активных веществ с данными по изменению входного электрического сопротивления корневых клеток (сопротивления растеканию слабого электрического тока, вводимого внутрь клетки, связанной с другими клетками плаз-модесмами) под влиянием веществ из того же набора. Для этого был использован метод Я MP и одноэлектродный метод фиксации тока (current clamp). В главе достаточно подробно представлена разработанная нами методика регистрации мембранного потенциала и входного сопротивления корневых клеток одним стеклянным микроэлекгродом, вводимым в цитоплазму. Методика изучения

проводимости плазмодесм для воды заимствована у А.В.Анисимова (1987). Ее суть состоит в определении эффективного коэффициента самодиффузии воды в условиях присутствия в апопласте корня (в пространстве заполненных водой полисахаридных клеточных стенок) непроникающих через плазмалемму парамагнитных ионов марганца. В такой ситуации молекулы воды, выходящие через мембрану за пределы клетки или входящие в клетку, становятся или остаются «невидимыми», с точки зрения сигнала ÜMP, вследствие быстрого затухания намагниченности на парамагнетике. В результате «наблюдаемый» диффузионный пробег молекулы воды локализуется в пределах симпласта, а регистрируемый D^ оказывается зависимым от водопроницаемости плазмодесм.

В первой серии опытов нами были осуществлены изменения межклеточного обмена воды и ионов путем специфического воздействия на трансмембранный путь такого обмена с помощью пипольфена, хлорпромазина, а также индукции перекисного окисления липидов. При этом было представлено экспериментальное доказательство отсутствия влияния этих воздействий на транспорт по плазмодесмам (т.е. доказательство только мембранной локализации их влияния на межклеточный обмен в процессе опытов). Оказалось, что при всех этих воздействиях изменения входного электрического сопротивления отслеживаются соответствующими изменениями эффективного коэффициента самодиффузии воды, т.е. наблюдается взаимосопряженное изменение проницаемости мембран для воды и для ионов. Оказалось также, что сопротивление межклеточной связи по плазмодесмам как для воды, так и для ионов существенно меньше, чем сопротивление для межклеточного трансмембранного обмена. В этом смысле полученные данные не противоречат приближению о преимуществе симпластиче-ского пути над трансмембранным, положенному в основу симпластической теории Арипа (см. выше) и в основу двухмембранных моделей корневой экссудации. Взаимосопряженные изменения R„x и D^ только другого знака (увеличение R,, и уменьшение D«^), наблюдались также под влиянием динит-рофенола. Анализ такого влияния показал, что общий межклеточный обмен в этом случае снижается главным образом за счет снижения обмена по плазмодесмам. При этом затрагивается (изменяется) проводимость плазмодесм как для воды, так и для ионов. По-видимому, имеет место регулиторное изменение апертуры (просвета) каналов в плазмодесмах.

Тем не менее взаимосопряженная (не создающая концентрационных градиентов) регуляция межклеточного обмена воды и ионов в корнях растений, как того требует теория Арица, наблюдается не всегда. Наиболее показательными в этом смысле оказались опыты с мембранным каналоформером - нистатином. Этот антибиотик, по-видимому, тонко вторгается в регуляцию ионного гомео-

стаза клеток корня и плазмодесмы оказываются важным элементом такой регуляции. Под влиянием нистатина (см. рис. 11) наблюдается увеличение 13^ с одновременным увеличением При этом все приращение эффективного коэффициента самодиффузии воды целесообразно связывать с ростом водопроницаемости плазмалеммы, поскольку «вычленение» водообмена через шшзмалем-му с помощью парамагнитных ионов приводит на уровень контроля, т.е. весь эффект увеличения Р^ф связан с увеличением водопроницаемости плазма-леммы. Перенос воды по симпласту (через плазмодесмы) этим антибиотиком не затрагивается.

I* , МОм

аг

5 43 2 1 О

МП. мВ

-80

О ^ х 106см2/сек

эфф

О)

б)

в)

Рис.Л. Изменение параметров водообмена и обмена ионов под влиянием нистатина и 5КР-525А. Экспозиция I час. 1 - контроль; 1' - контроль с добавкой димстилсульфоксида - растворителя нистатина (0.1 мл на 25 мл раствора); 2 - нистатин (0.1 мМ); 3 -нистатин (0.1 мМ) + МпСЬ (25 мМ); 4 -БКР-525А (0.1 мМ). рН растворов 6.2 -6.3.

Входное сопротивление клетки корня складывается из параллельно включенных сопротивления плазма-леммы и входного сопротивления сим-пласта (сопротивления межклеточной связи по плазмодесмам). Поскольку при наличии увеличения проводимости плазмалеммы мембранным каналофор-мером входное сопротивление клеток все же возрастает, то это может означать, что под влиянием нистатина существенно возрастает сопротивление межклеточной электрической связи по плазмодесмам. Похожий эффект на плазмодесмы наблюдается и под влиянием специфического ингибитора элек-тронтранспортной цепи мембран эндо-

плазматического ретикулума - соединения 8КР-525А. Поскольку центральный стержень плазмодесм - десмотубула - представляет собой мембрану ЭПР, то такой результат нельзя считать неожиданным. Общий анализ полученных данных показал существование независимой регуляции потоков воды и ионов по плаз-модесмам (при отсутствии изменений проводимости плазмодесм для воды существует изменение их проводимости для ионов).

Данные литературы свидетельствуют о том, что клетки эпидермиса обладают более высокой способностью поглощать ионы, чем последующие клетки вдоль радиуса корня. Есть также данные о существовании различий в активности электрогенного насоса и АТФазной активности у эпидермальных клеток по сравнению с аналогичной активностью последующих клеток. В системе электрически связанных клеток с различной активностью электрогенных насосов уменьшение электрической связи по высокопроннцаемым контактам должно приводить к гиперполяризации плазмалеммы у клеток, обладающих более высокой электрогенной активностью (Потапова и др., 1988), поскольку электрогенные насосы таких клеток начнут работать на меньшую утечку, равную сумме утечек через плазмалемму и через межклеточные контакты. И действительно, под влиянием нистатина, увеличивающего, как мы установили, электрическое сопротивление плазмодесм, наблюдается гиперполяризация тестируемых микроэлектродом эпидермальных клеток (рис. 11 в). Анализ результатов позволил сделать заключение о существовании электрической неэквипотенциальностн между клетками в симпласте корня.

Данные рис. 12 демонстрируют, что реконструкция трансмембранного водообмена нистатином не связана с дыхательным метаболизмом, т.к. наблюдается в неизменном виде в присутствии эффективных ингибиторов третьего и четвертого сегментов дыхательной цепи митохондрий (антимипяна А и К.СЫ соответственно). В противоположность этому нистатин в присутствии указанных ингибиторов перестает работать на увеличение межклеточной электрической связи по плазмодесмам. По-видимому, рефляция проводимости плазмодесм для ионов сопряжена с энергетическим метаболизмом корневых клеток.

Совокупность полученных данных позволила сделать заключение: 1) при фармакологических воздействиях на клетки корня установлена возможность как взаимосопряженных изменений проводимости плазмодесм для воды и ионов, так и независимая регуляция этих процессов; 2) регуляция (изменение) проводимости плазмодесм связана с энергетическим метаболизмом клеток в корне; 3) между клетками в симпласте корня существует электрическая неэквипотенциаль-ность. Этими положениями демонстрируется существование регуляции проводимости плазмодесм для воды и для ионов и одновременно ставятся под сомне-

Р , МОм

гЬ

Нп

1+1

г+1

а)

О х К^см^сек

эфф

б)

ние основные постулаты симпластиче-ской теории Арица, отрицающей активную роль плазмодесм в механизме нагнетающей воду в надземные органы деятельности корневых клеток (в механизме корневой экссудации).

Рис.12. Влияние ингибиторов дыхания на индуцированное нистатином изменение входного сопротивления (а) и эффективного коэффициента самодиффузии воды в корне (б). Экспозиция в соответствующих растворах - 1 час. 1 -контроль; 2 - нистатин (104 М); 3 - ан-тимицин А (10"5 М); 4 - нистатин (КГ1 М) + антимицин А (10"5 М); 5 - КСЫ (КГ'М); 6 - нистатин (КГ4 М) + КСИ (К)'3 М).

9 глава диссертации посвящена рассмотрению экспериментально-теоретических предпосылок для построения теории корневой экссудации с учетом эффектов капиллярного осмоса и электроосмоса в плазмодесмах, как важных элементов движущих сил экссудации. В отдельном параграфе этой главы в сжатой форме проанализированы данные литературы, касающиеся теории капиллярного осмоса и электроосмоса в капиллярах. Обращается внимание на то, что изменение диаметра капилляра может кардинальным образом влиять на объемный поток раствора через капилляр, вплоть до изменения направления такого потока. Определяющее влияние в этом смысле, помимо соотношения диаметров капилляра и молекул растворенного вещества, имеет природа сил взаимодействия растворенного вещества со стенками капилляра (электрические, ван-дер-ваальсовы, дисперсионные и пр.). Применительно к структуре плазмодесм как микрокапилляров, это может означать, что изменение апертуры (просвета) плазмодесменного канала может кардинальным образом влиять на направление объемного потока через плазмодесмы.

Далее в этой главе предпринята попытка увязать существующие экспериментальные данные о регуляции корневой экссудации и полученные нами данные о регуляции проводимости плазмодесм с теоретическими представлениями о капиллярном осмосе и об электроосмосе в капиллярах. Такая увязка на данном

этапе несомненно является гипотетической и представляет собой скорее всего взгляд на перспективу исследований механизма корневой экссудации, учитывающего «активную» роль плазмодесм в этом процессе. Предполагается, что с учетом эффектов электроосмоса и капиллярного осмоса в плазмодесмах смогут найти объяснение те экспериментальные факты, которые не находят объяснения в рамках существующих моделей. Представлены некоторые соображения в пользу того, что на этом пути могут найти объясните: 1) экспериментальные данные по экссудации «рукавчиков», 2) природа «метаболической» компоненты, 3) ритмический характер экссудации.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основе разработанной Теннером и Стейскалом (Tanner, Stejskal, 1968) теории метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля предложена и обоснована простая методика применения этого метода для оценки изменений диффузионной проницаемости клеточных мембран для воды под воздействием внешних факторов (на примере мембран у клеток в корнях проростков пшеницы). Теория ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля использована также для осуществления на ее основе прямого экспериментального подтверждения наличия качественного сходства механизма диффузии молекул воды в естественных клеточных мембранах с нефиковской диффузией, характерной для однорядного транспорта воды в узких порах по формализму Левитта (Levitt, 1973).

2. Использование метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля для регистрации приращений эффективного коэффициента самодиффузии воды параллельно с регистрацией соответствующих количественных приращений выхода воды по осмотическому градиенту за фиксированный отрезок времени у клеток в корнях проростков пшеницы позволило оценить перераспределение вкладов диффузионно-растворительного и однорядно-порового пути в суммарном трансмембранном водообмене под воздействием внешних факторов. Выдвинута гипотеза о наличии у клеток в высших растениях на уровне клеточных мембран защитной водоудерживающей способности на действие неблагоприятных факторов внешней среды, основанной на частичном или полном закрытии более эффективного для действия водоотнимающей силы (градиента водного потенциала на мембране) однорядно-порового пути трансмембранного водообмена.

3. Найдены элементы специфичности ауксининдуцированного набухания протопластов, изолированных из клеток высших растений, отличающие этот процесс от процесса осмотически индуцированного поступления воды. Специфичность связана с предшествующей набуханию активацией протонных насосов плазмалеммы и с необходимостью пребывания в активированном состоянии К4-селективных каналов плазмалеммы. Проанализировано участие других систем переноса ионов через плазматическую и вакуолярную мембраны в ауксининду-цированном набухании изолированных протопластов, как модели роста клеток растяжением. С использованием двух систем регистрации макроскопических токов на локальных участках плазмалеммы изолированных протопластов получено свидетельство в пользу существования у вакуоли in situ способности к контролю ионного состава цитоплазмы, которая может составлять один из элементов механизма вакуолизации растительных клеток. Установлено, что в единой системе процессов, составляющих рост клеток растяжением, и включающей в себя поступление воды (вакуолизацию клеток), разрыхление клеточных стенок и синтез целлюлозы клеточных стенок de novo, координирующим звеном может являться протонный насос плазмалеммы.

4. При параллельном использовании метода ЯМР и одноэлеюродного метода фиксации тока установлено: а) при различных фармакологических воздействиях на клетки корня может наблюдаться как взаимосопряженное изменение проводимости плазмодесм для воды и для ионов, так и независимая от их водопроницаемости регуляция ионного транспорта по плазмодесмам; б) регуляция (изменение) проводимости плазмодесм связана с энергетическим метаболизмом клеток корня; в) между клетками в симштасте корня возможна электрическая неэквипотенциальность. Эти обстоятельства, в противоположность симпласти-ческой теории Арица, позволяют принципиально по новому оценивать роль плазмодесм в регуляции транспорта воды и ионов между клетками в корне и в механизме корневой экссудации на основе представлений о капиллярном осмосе и об элекгроосмосе в капиллярах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мифтахутдинова Ф.Г., Анисимов A.B., Великанов Г.А. Исследование самодиффузии воды в биологических объектах методом спинового эха с исполь-

зованием импульсного градиента магниного поля // Доклады АН СССР - 1975 -Т. 224 - С. 487-490.

2. Мифтахутдинова Ф.Г., Анисимов A.B., Великанов Г.А. Исследование самодиффузии воды и энергии ее активации в клетках различных растительных тканей // Физиол. биохим. культ, растений. - 1975 - Т. 7 - С. 298-301.

3. Анисимов A.B., Великанов Г.А., Федотов В.Д. Аппаратура к установке спинового эха ядерного магнитного резонанса для создания импульсного градиента магнитного поля // Приборы и техника эксперимента. - 1975 - N 4 - С. 14-17.

4. Анисимов A.B., Великанов Г.А., Мифтахутдинова Ф.Г. Исследование самодиффузии молекул воды в клетках методом спинового эха ЯМР с использованием импульсного градиента магнитного поля // Водообмен растений при неблагоприятных условиях среды. / Сборник научн. трудов. - Кишинев: Штиинца, 1975. С. 237-240.

5. Великанов Г.А., Гордон Л.Х., Волков В.Я., Барышева Т.С. Изучение проницаемости клеточных мембран для воды методом ЯМР // Физиол. биохим. культ, растений. - 1977 - Т. 9, N 2 - С. 197-201.

6. Волков В.Я., Великанов Г.А., Добреньков Д.Г., Ильин A.A. Способ измерения проницаемости пористых материалов. - A.c. N 550569 СССР // Б.И. N 10, 1977.

7. Алексеева В.Я., Великанов Г.А., Гордон Л.Х., Бичурина A.A. Проницаемость клеток корней пшеницы для воды при индуцировании перекисного окисления липидов П Физиология растений. - 1977 - Т. 24, N 3 - С. 496-499.

8. Гордон Л.X., Алексеева В.Я., Бичурина A.A., Николаев Б.А., Великанов Г.А. Влияние полиеновых антибиотиков на дыхательный обмен растительных тканей И Физиология растений. - 1977 - Т. 24, N 4 - С. 756 - 761.

9. Волков В.Я., Великанов Г.А. Изучение проницаемости биологических мембран методом ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля // Магнитный резонанс в биологии и медицине. Тезисы докл. Всес. Симп. - Москва - Черноголовка, 1977 - С. 16.

10. Бичурина A.A., Великанов Г.А., Алексеева В.Я., Гордон Л.Х. Влияние ЭДТА на проницаемость корней пшеницы для воды // Физиология растений. -1978-Т. 25, N 2 - С. 334-339.

11. Великанов Г.А., Волков В.Я. Диффузия воды через узкие поры биомембран // Биофизика. - 1978 - Т. 24, Вып. 5 - С. 813-816.

12. Volkov V.Ya., Velikanov G.A., Dautov R A., Neprimerov N.N. Study of the water selfdiffusion in the model and biological objects by NMR pulsed field gradient method // Abstracts XXIV Congress AMPERE. TALLINN, 1978. - D 1409.

13. Волков В.Я., Великанов Г.А. Изучение транспорта воды в мембранах клеток дрожжей импульсным методом ядерного магнитного резонанса // Биофизика. - 1979-Т. XXIV, вып. 1-С. 77-81.

14. Velikanov G.A., Karimova F.G. Study of the permeability of yeast cells membranes for water by pulsed NMR-method // International conference on water and ions in biological systems/ Abstracts, Bucharest, 1980. - P. 169.

15. Karimova F.G., Velikanov G.A.,Gusev N.A. Water and ion transport in plants and cyclic adenosine-3,5 monophosphate (cAMP) system // ibid. P. 184.

16. Великанов Г.А. Некоторые аспекты транспорта воды через клеточные мембраны // Вопросы водообмена и состояния воды в растениях / Сборник на-учн. трудов. - Казань: Казанский институт биологии КФАН СССР, 1981. С. 113134.

17. Ценцевицкий А.Н., Полыгалов Е.Е., Гольдман В.В., Великанов Г.А. Измерение мембранного потенциала и электрического сопротивления плазма-леммы и тонопласта при действии ауксина на изолированные протопласты и вакуоли растительных клеток II 1 Всес. биофиз. съезд. Тезисы докл. стендовых сообщений, Москва, 1982, Т. 1. С. 275.

18. Великанов Г.А. Применение импульсного ЯМР к изучению проницаемости клеточных мембран для воды Н 1 Всес. биофиз. съезд. Тезисы докл. стендовых сообщений, Москва, 1982, Т. 3. С. 219.

19. Ценцевицкий А.Н., Полыгалов Е.А., Гольдман В.В., Великанов Г.А. Изменение электрических мембранных потенциалов при действии ауксина на протопласты растительных клеток И Некоторые характеристики мембран и водообмен клеток растений / Сборник научн. трудов КИБ КФАН СССР. Под ред. Н.А.Гусева. - Казань, 1982. С. 98-105.

20. Ценцевицкий А.Н, Полыгалов Е.А, Гольдман В.В., Великанов Г.А. Изолированные протопласты и вакуоли растительных клеток как объекты для электрофизиологических исследований У/Там же, С. 106-118.

21. Ценцевицкий А.Н., Полыгалов Е.А., Великанов Г.А. Гиперполяризация плазмалеммы при осмотически вызванном набухании изолированных протопластов растительных клеток // Деп. ВИНИТИ.- N 845-85 от 29. 01. 1985. ■ 11 с.

22. Ценцевицкий А.Н., Полыгалов Е.А., Великанов Г.А. Гиперполяризация плазмалеммы растительных клеток под действием ИУК и ее связь с процессами синтеза белков // Деп. ВИНИТИ.- N 846-85 от 29.01. 1985. - 6 с.

23. Ценцевицкий А.Н., Полыгалов Е.А., Гольдман В.В., Великанов Г.А. Связь процессов белкового синтеза с гнперполяризующим плазмалемму расти-

тельных клеток эффектом ИУК // Регуляторные механизмы физиологических процессов у растений. Киев. ИФР АН УССР, 1985. - С. 59-61.

24. Нуриев И.Х., Великанов Г.А. Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида: A.c. N 1520092 СССР // Б. И. - 1989 - N 41 - С. 120.

25. Ценцевицкий А.Н., Великанов Г.А. Участие протонных насосов в аук-сининдуцированном набухании изолированных протопластов растительных клеток // Н'-АТФаза и реактивность растительной клетки / Сборник научных трудов КИБ КФАН СССР. Под ред. Л.Х.Гордона. - Казань., 1989. С. 60-69.

26. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н., Нуриев И.Х., Гордон Л.Х. Транс-целлюлярный перенос ионов и воды в корнях высших растений // Цитология. -1990-Т. 32, N9-C. 922-923.

27. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н., Нуриев И.Х., Еварестов A.C.. Гордон Л.Х. Межклеточный перенос воды и ионов в корнях проростков пшеницы // Деп. в ВИНИТИ 21.02.91. N871-В91 - 1991. -28 с.

28. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н., Нуриев И.Х., Еварестов A.C., Гордон Л.Х. Межклеточный перенос воды и ионов в корнях проростков пшеницы // Физиология растений. - 1992 - Т. 39, N 5 - С. 972-982.

29. Великанов Г.А., Парфенова Е.Л., Нуриев И.Х. Интегральные токи пассивного транспорта ионов через мембрану изолированной вакуоли // Физиол. биохим. культ, растений. - 1992 - Т. 24, N 3 - С. 275-281.

30. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н. Корневая экссудация: роль плаз-модесм //Деп. в ВИНИТИ 07.05.92, N 1523 - В92 - 24 с.

31. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н. Обмен воды и ионов в корне по плазмодесмам // Третий съезд Всероссийского общества физиологов растений. 24-29 июня 1993. Санкт-Петербург. Тезисы докладов. - 1993. - Т. I - С. 76.

32. Ценцевицкий А.Н., Великанов Г.А. Роль 1Г-помпы в ауксининдуциро-ванном набухании изолированных протопластов из клеток высших растений // Там же. - Т. 3. - С. 227.

33. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н. Можлива роль плазмодесм в эксу-дацп // И зЪд Украинского товариства ф1зюлопв рослин. Кит 4 жовтня 1993 р. -С. 83.

34. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н. Гипотетическая модель транспорта воды и ионов при корневой экссудации с учетом роли плазмодесм // Водообмен и устойчивость растений. - Казань: Изд-во Казанского университета, 1993-С. 139-149.

35. Великанов Г.А., Нуриев И.Х.. Ценцевицкий А.Н. Электрическое возбуждение вакуоли непосредственно внутри протопласта, изолированного из клеток высшего растения // Биол. мембраны. - 1996 - Т. 13, N 4 - С. 366-379.

36. Belova L.P., Velicanov G.A., Tsentsevitsky A.N. Plant cell wall polysaccharides synthesis under the different of the plasmalemma membrane potential // Annual symposium «Physical-chemical basis of plant physiology» 5-8 February, 1996, Penza,abstracts, Pushchino, 1996. - P. 19.

37. Velikanov G.A., Tsentsevitsky A.N., Nuriev I. H. Electrical excitation of vacuole in situ in the protoplasts isolated from the cell of higher plant // ibid.- P. 112.

38. Великанов Г.А., Белова Л.П., Ценцевицкий А.Н. Электрическое напряжение на плазмалемме и интенсивность синтеза полисахаридов клеточной стенки растений // Успехи современной биологии. - 1997 - Т. 117, N 1 - С.95-106.

39. A.Tsentsevitsky, G. Velikanov. Transmembrane water exchange in higher plant cells // International Symposium Drought and plant production. Belgrade, September 17-20, 1996. The book of abstracts. - Beograd: Agricultural Research Institute «SRBIJA», 1996 - P. 126.

40. A.Tsentsevitsky, G. Velikanov. Membrane potential and water entrance in isolated protoplasts // ibid.- P. 127.

41. Великанов Г.А., Белова Jl.П., Ценцевицкий А.Н., Лозовая В.В. Связь синтеза целлюлозы клетками высших растений с активностью протонного насоса плазмалеммы // Физиол. биохим. культ, растений. - 1997 - Т. 29, N 2 - С. 139-145.

42. Белова Л.П., Ценцевицкий А.Н., Ильина Т.М., Великанов Г.А. Калий-селективный канал плазмалеммы в росте клеток растяжением // Четвертая международная конференция "Регуляция роста и развития растений" (24-26 июня 1997 года). Тезисы докладов. - Москва: Миннауки РФ, МСХА, 1997 - С. 75.

43. Великанов Г.А., Ценцевицкий А.Н., Белова Л.П. Роль систем трансмембранного переноса ионов в ауксининдуцированном набухании изолированных протопластов // там же. - С. 134.

Информация о работе

Великанов, Геннадий Алексеевич
доктора биологических наук
Пущино, 1997
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика