Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецептор фузикокцина в плазматических мембранах высших растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Бабаков, Алексей Владимирович, Москва

И'$9 '5/Н?

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

МЕМБРАНАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

(03.00.03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва -1998

• ъг- V»* у; ^ ^

ГОСУДАРСТВЕНИ"

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Ведущая организация - Институт биохимии им. Н.А.Баха РАН

Защита состоится «20« _ 199£ года в /3 часов на

заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, Москва. Тимирязевская, 42.

С материалами диссертации можно оз сельскохозяйственной биотехн

Научный доклад разослан

Официальны е оппоненты:

доктор биологических наук КЛЯЧКО Н.Л.,

доктор биологических наук ЯГУЖИНСКИЙ Л.С.,

доктор химических наук

ДЕМУШКИН В.П.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

л/ / У'> ^ , v > . * ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ f~ ' v / - , г ^ ^

Актуальность проблемы. В настоящее время в исследованиях молекулярных механизмов гормональной регуляции в растениях проблема передачи регуляторного сигнала {signal transduction) начинает занимать одно из центральных мест. Определяется это двумя обстоятельствами, во-первых, для таких фитогормонов как ауксин, этилен, а также для фузикокцина обнаружены гормон-связываюище белки и установлена их локализация в мембранах, во-вторых, в растениях обнаружены G-белки, Са2т- зависимая протеинкиназа, фосфатидилинозитолтрифос-фат - все те компоненты, которые участвуют в передаче гормонального сигнала в клетках животных. Эти данные указывают на вероятную универсальность механизмов трансмембранного прохождения гормональных сигналов у животных и растений. Такое предположение подтверждается данными о механизме действия в растениях этилена, для которого в плазматических мембранах растений обнаружен рецептор, относящийся по своей структуре к двукомпо-нентным регуляторам и связанный функционально в клетке с цепочкой протеинкияаз (МАП-каскад), по которой сигнал с поверхности клетки достигает ядра. Однако, до сих пор для большинства из известных фитогормонов остается неясным, что происходит в растениях после взаимодействия фитогормонов со своим рецептором. Типичным соединением мембранного действия можно считать фузикокцин. Фузикокцин был выделен и очищен в 1964 году из культуральной жидкости гриба Fusicoccum amigdali Del. По своему строению (см.рис.1) он относится к терпеноидам - агликоном в виде своеобразной трициклической структуры, соединенным с глюкозой с изопреновой группой. Было установлено, что он стимулирует открывание устьиц, рост растяжением, прорастание семян, индуцирует корнеобразование, а также обладает антистрессовой активностью. На физиологическом уровне действие фузикокцина выражается в усилении транспорта ионов и метаболитов в клетки высших растений, связанном вероятно с активацией ИГ-АТФазы

.....;ческих мембран [Магге, 1979]. В растениях были обнаружены белки, специфически

.7" зязщие фузикокцин с высоким сродством (Ко = 1-5 нМ), и показано, что они

и

о р ~скусловных сокращении

о .

¿2 | - фузикокцин; ФКР - рецептор фузикокцина; сМС - [3Н]дигидрофузикокцин; __- максимальное количество центров связывания

сн3

он

С№>

О^ / « СНз

НО

н1

'Т ас ч

о..

-о

V > О'" СНз

н3с—(

н,.., "ОН

" - СНз

\

о,

"СНз

Рис. 1 Структурная формула

НзС

локализованы в плазматических мембранах [Aducci, 1995]. Фузикокцин-связывающие бел присутствуют во всех растениях и составляют несколько процентов от общего белка плазма1 ческих мембран. Тем не менее, несмотря на их обилие и распространенность среди растен функции фузикокцин-связывающих белков оставались неясными. Параллельно с Ф связывающими белками в растениях были обнаружены фузикокцин А и вещества близкой к i му структуры, и возник вопрос, можно ли считать фузикокцин фитогормоном, и если да, то ч он регулирует и как это регулирование связано с онтогенезом растений [Муромцев, 1996].

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось установить структурн; организацию рецептора ФК, исследовать закономерности преобразования гормонального ci нала в растениях на примере рецепции фузикокцина и на основе полученных результат сделать выводы о роли рецепторов фузикокцина в онтогенезе растений.

Для реализации этой цели были выполнены следующие исследования:

1) проверка потенциальных эффекторов в плазматических мембранах для рецепторов фузикс цина;

2) сравнение биологической активности фузикокцина и его аналогов с параметрами их связна ния с рецепторами, локализованными на плазматических мембранах;

3) идентификация в растениях ГТФ-связывающих белков, локализация, очистка и выяснение участия в активации ТГ-АТФазы фузикокцином;

4) исследование участия протеинкиназ в механизме активации Н^АТФазы фузикокцином;

5) исследование организация рецептора фузикокцина;

6) изучение реакции рецепторов ФК на различные внешние воздействия.

Научная новизна. В плазматических мембранах высших растениях обнаружены ГТ< связывающие белки. Показано их разнообразие путем разделения солюбилизированного прег рата мембран на фракции и измерения их кинетических параметров связывания с негидрол зуемым аналогом ГТФ - Gpp(NH)p. Один из G-белков выделен и установлена его субъединичн структура. Исследовано участие G-белков, протеинкиназ и протеинфосфатаз при активации 4 зикокцином К'-АТФазы и полученные данные свидетельствуют в пользу прямого взаимодеж вия между ФКР и ЕГ-АТФазой при активации последней ФК без участия протеинкиназ, прот инфосфатаз и G-белков. Эти же данные позволили предположить, что во взаимодействии меж ФКР и ЕГ-АТФазой существенную роль играет их состояние фосфорилирования/ дефосфорил рования.

На плазматических мембранах из корней кукурузы, в протопластах из мезофилла и зам кающих клеток устьиц Vicia faba, а также из суспензионной культуры сахарной свеклы (Suf beet) обнаружено два типа ФК-связывающих сайтов, различающихся между собой по аффинв

сти к ФК. Показано, что при делом ряде воздействий на протопласты из суспензионной культуры сахарной свеклы, моделирующих раневой, кислотный и осмотический стресс, происходит взаимопереход ФК-связывающих сайтов разной аффинности. На этом же объекте обнаружен новый тип рецепторов ФК -"молчащий", активируемый осмотическим стрессом, и показано, что существует равновесие в клетке между состояниями разной аффинности рецептора к ФК. На основе взаимодействия между ФК и его рецепторами в плазматических мембранах предложен и апробирован высокочувствительный метод измерения в экстрактах из растений эндогенных ФК-подобных лигандов.

Методом радиационной инактивации белков установлено, что ФКР низкой и высокой аффинности отличаются между собой по молекулярной массе. Этим методом удалось обнаружить "молчащие" рецепторы в изолированных микросомальных мембранах и показать, что их активация связана с деградацией комплекса с молекулярной массой 420 кДа. Показано также, что низко- и высокоаффинные ФКР инактивируются под действием гидролитических ферментов с наружной поверхности протопласта. Исходя из собственных и литературных данных, предложена схема организации ФКР в виде лабильного комплекса димера белков 14-3-3 с НГ-АТФазой и с другим белком мол. массы 60 кДа, имеющим гликозшшрованный домен на наружной поверхности плазматической мембраны.

Полученные экспериментальные данные позволили сформулировать предположение о возможной роли крупных молекулярных комплексов в плазматических мембранах с участием белков 14-3-3 в адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

Практическая значимость. Разработанные методы могут быть применены в различных исследованиях, в частности при поиске новых и эффективных регуляторов роста растений, в исследовании первичных реакций растений на стрессовые воздействия и в разработке методов повышения устойчивости растений к неблагоприятным внешним условиям. Полученные в данной работе сведения о О-бешсах в высших растениях, об участии в адаптации к стрессу белков 14-3-3 делают более эффективным и целенаправленным уровень исследований по повышению устойчивости растений к неблагоприятным условиям.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных конференциях, включая Международные симпозиумы: "Регуляторы роста растений" (ГейдельбергД986), "Биохимические механизмы, вовлекаемые в регуляцию роста растений" (Милан, 1991), 6 конгресс Федерации Европейских обществ физиологов растений (Сплит, 1988), на Международном симпозиуме "Прием и передача сигналов рас-

тигельных гормонов" (Москва 1994), на симпозиумах "Физико-химические основы физиоло растений" (Пенза 1996; Москва 1997).

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа; список работ приведе конце автореферата.

Работа выполнена в отделе гормональной регуляции онтогенеза растений, руководим акад. Г.С.Муромцевым. В экспериментах принимали участие Н.Ю-Абрамычева, С.В.Билу] Е.Э.Данилина, А.В.Драбкин, О.И.Клычников, М.С.Трофимова (ИФР РАН), А.Г.Шебунин и р гие коллеги. Всем им автор выражает глубокую благодарность. Автор благодарит также за стоянную поддержку и плодотворные дискуссии акад. Г.С.Муромцева.

Сопоставление величин биологически активных концентраций ФК и i раметров его связывания с плазматическими мембранами

Впервые высокоспецифичные сайты связывания ФК в растениях были обнаружены в м росомальных фракциях из проростков кукурузы и листьев шпината в 1977 году (Dorhman et; Константа диссоциации ФК с ФК-связывакшдами сайтами была равна несколько нМоль. Дат после совершенствования методов очистки плазматических мембран растений было показа что именно на плазматических мембранах локализованы ФК-связывающие сайты (Feyerabi and Weiler, 1988; De Boer et al., 1989). Были получены производные ФК и исследована корре ция между их физиологической активностью и способностью связываться с микросомальнн мембранами (Ballio et al.,1991; Feyerabend et al., 1988; Stout, 1988). Такая корреляция была ус новлена и ФК-связывающие сайты стали называть рецепторами ФК (Aducci et al., 1992). Одна в проведенных работах биологическую активность ФК и его производных измеряли при фик рованной концентрации 10"5М и затем сопоставляли ее с константой диссоциации ФК и <J связывающих сайтов. Очевидно, что если 10~8 М есть уже насыщающая концентрация лиг да для ФК-связывающих сайтов, то в принципе можно не заметить различия в биологачем активности для производных фузикокцина А, имеющих Кв в диапазоне 1(Г7 - 10"5 М. Име! поэтому нами параллельно изучены концентрационные зависимости биологической тивности ФК А и его аналогов фузикокцинов В, С, D, Н и J на отделенных отрезках кукур) и измерены константы диссоциации их комплексов с плазматическими мембранами, вы ленными из этого же объекта.

Объектом исследования служили корни 4-х дневных этиолированных проростков кукур;, сортов "Наднепрянская-50" и "Пионер". Вначале методом дифференциального центрифугиро нвд получали микросомалыще мембраны, а затем из них распределением в двуфазовой жида полимерной системе ПЭГ/Декстран (Albertsori, 1971) выделяли фракцию, обогащенную плаз! тическими мембранами. Чистоту полученных препаратов оценивали путем измерения актив]

сти маркерных ферментов: НАДН-цитохром с редуктазы (тонопласт, наружная митохондриаль-ная мембрана, эндоплазматический ретикулум), НАДФН-цитохром с редуктазы (эндоплазматический ретжулум), сукцинат-цитохром с редуктазы (внутренняя митохондриаль-ная мембрана) и ингибиторов АТФаз различных клеточных мембран. Ориентацию изолированных мембранных везикул оценивали путем измерения АТФазной активности в присутствии и в отсутствие в среде измерения Тритона Х-100. Полученные результаты показали, что выделенная нами мембранная фракция состоит в основном из правильно ориентированных везикул плазматических мембран.

Анализ данных по связыванию dhFC с плазматическими мембранами (рис.2) с помощью компьютерной программы Enzfitter (RJ.Leathher-barrow, 1.05, Cambridge, UK) показал, что они хорошо описываются одноместной моделью связывания со следующими параметрами: константа диссоциации Ко = (1,7 ± 0,3) нМ и максимальное количество мест связывания Вшах = (6 25) пмоль/мг белка, На стационарный уровень связывание dhFC выходит за 60-^80 мин.

В качестве биологических тестов нами выбраны поглощение S6Rb отделенными корнями кукурузы и их удлинение. Активация поглощения S6Rb корнями под действием фузикокцина обусловлена, вероятно, гиперполяризацией плазматической мембраны за счет усиления оттока из клеток ионов водорода [Marre, 1979], а более быстрое удлинение - в соответствии с теорией кислого роста (Rayle and Cleland, 1977).

0,3 dpm

2000

Ö\o 1000 /

o;¿ f

¿S3 мин

sj. 0 0 40 ВО

=Q

0,1

0,0 1 1

0 1 2 3 4 5

В (моль/л 10

Рис. 2 Кинетика и концентрационная зависимость связывания с изолированными плазматическими мембранами [ЩС

% 100 - « О Связывание ФК f4« о—о—О—-о * Рост корней +

50 \\

^ Л

4,5 5,5 в,5 7,5 8,5 9,5 10,5

Концентрация ФК (-log М)

Рис.3. Сравнение связывания с плазма-леммой dhFC и влияние FC А на удлинение отделенных корней и поглощение ими 86 Rb+. За 100% приняты значения измеряемых параметров в отсутствие ФК. (Из: Бабаков и соавт. 1990, Биол. мемб. 7: 107-112; Abramycheva et al. 1991, Planta, 183: 315320).

Из рис.3 видно, что концентрационные зависимости биологической активности ФК А совг дают, тогда как насыщение связывания ШтРС с плазматическими мембранами происходит п] гораздо меньших концентрациях. В табл.1 показаны результаты подобных измерений для анал гов ФК.

Табл.1 Сравнение биологической активности фузикокцинов с их сродством к плазмат ческой мембране (Из Бабаков с соавт. 1990, Биол. мем., 7: 107-112)

Фузикокцин А(ВС) С J H

Ко, нМ 1,7 + 0,2 1,0 +0,1 2,5 + 0,2 20 + 3

Поглощение s6Rb, С50, нМ 310 + 60 140 ±20 730 + 90 3000 ±400

Удлинение корней, С50, нМ 150 ±30 120 ±20 500 ± 80 1100 + 240

Примечание: Gso - концентрация, при которой наблюдается 50% ответ.

Из полученных результатов следует, что действительно биологическая активность ФК корр лирует с величиной Ко комплекса шшмалемма-фузикокцин. Так фузикокцин A,B,C,D,J, имеющие близкие значения Kd , проявляют приблизительно одинаковую биолог) ческую активность в наших тестах. В то же время концентрационные зависимости биол( гической активности фузикокцина H в соответствии с Ко сдвинуты в область более высоки концентраций. Однако, для всех исследованных нами фузикокцинов сохраняется одна и т же закономерность, а именно: их действующая концентрация примерно на два порядка выл той, которая должна быть эффективной в биологических тестах, исходя из значений Kd Этот результат, с одной стороны, подтверждает высокую специфичность ФК-связывающи сайтов фузикокцина, а с другой - указывает на расхождение эффективности действия ФК в си( теме in vivo и in vitro.

Одно из возможных объяснений наблюдаемому противоречию заключается в том, чт плазматические мембраны по мере их выделения претерпевают изменения, в результате кс торых меняется аффинность ФК-связывающих сайтов или происходит потеря ФК связывающиих сайтов низкого сродства. Поэтому представлялось целесообразным провеет исследование связывания ФК на таком объекте, который, с одной стороны, был бы боле приближен к системе in vivo, а с другой стороны, позволял бы также проводить и биологаче ские испытания.. Поставленные задачи мы попробовали решить на протопластах. Протопла сты выделяли из мезофилла или замыкающих клеток листьев Vicia faba. Выбор источник протопластов был определен двумя обстоятельствами, во-первых, разработанностью метода ки получения протопластов из Vicia faba, во-вторых, известной уже к началу нашей работ! компетентностью протопластов из замыкающих клеток Vicia faba к ФК (стимуляция выхо да протонов и входа ионов калия) [Clint,1985; Lin et. al,1984]. Эти данные указывали на то, чп

протопласты Vicia faba , по-видимому, имеют ФКР и подходят поэтому для поставленной задачи.

Протопласты существенно отличаются от используемых ранее объектов для изучения связывания меченых лигандов, поэтому прежде всего предстояло выяснить, какими структурами протопласта обусловлено его связывание ФК. Суммарное связывание (Btot) ФК с протопластами может складываться из связывания на плазмалемме, связывания на внутренних структурах протопластов , а также из накопления ФК во внутреннем объеме протопластов, что отражает следующее выражение:

Bto,=Bp + Bv + Bln ( 1 ), где

Вр - связывание ФК с плазматической мембраной; Bv - накопление ФК во внутреннем свободном объеме; Вщ- связывание ФК с внутренними структурами протопластов. Чтобы определить, какой из членов выражения (1) вносит существенный вклад в получаемые нами результаты, мы провели ряд специальных экспериментов. Для выяснения, происходит ли накопление ФК внутри протопластов во время их инкубации с dhFC, мы подвергали протопласты осмотическому шоку