Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация рецепторов фузикокцина и их реакция на абиотический стресс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация рецепторов фузикокцина и их реакция на абиотический стресс"

од

на правах рукописи

КЛЫЧНИКОВ Олег Игоревич

ОРГАНИЗАЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ ФУЗИКОКЦИНА И ИХ РЕАКЦИЯ НА АБИОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1998

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева совместно с ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

доктор биологических наук Новиков H.H.

кандидат физико-математических наук Бабаков A.B.

доктор химических наук Демушкин В.П.

кандидат биологических наук Ладыженская Э.П.

Институт физико-химической биологи им. А.Н. Белозерского, МГУ

Защита диссертации состоится "_"_ 1998 г. в_часов

заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной б] технологии РАСХН по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной б] технологии РАСХН

Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С. А. Меликова

Все опыт, опыт! Опыт - это вздор.

Значенья духа опыт не покроет...

Гете "Фауст".

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Клетки всех организмов воспринимают многочисленные сиг-палы, передают эту информацию на соответствующие внутриклеточные компоненты и отвечают путем изменения метаболизма и роста. Одним из видов химических сигналов, воспринимаемых растеними, являются регуляторы роста. Их воздействие приводит к изменению скорости прорастания семян, модуляции роста и старения растения, определяет пол цветков, (ин)активирует ферменты, изменяет экспрессию генов. Изучение молекулярных событий, определяющих эффекты регуляторов роста растений, требует выяснения многих звеньев, вовлеченных в цепь передачи сигнала. Несмотря на последние достижения в решении этой задачи (например, обнаружения сходства этиленового рецептора с двукомпо-нентпой системой бактерий (Bleeker and Schaller 1996, Chang et al. 1996) и участия в передаче сигнала этилена каскада митоген активируемых протеин киназ (Mizoguchi et al. 1997) большинство этапов молекулярного уровня, вовлеченных в полный путь прохождения гормонального сигнала, до сих пор не известно.

Одним из регуляторов роста растений является фузикокцин (ФК). ФК был открыт как продукт фитопатогенного гриба Fusicoccum amygdali Del, а позже затем был обнаружен в растениях (Муромцев и др. 1980, 1986; Babakov et al. 1994). Он стимулирует рост изолированных частей растений, усиливает транспирацию за счет раскрытия устьиц, способствует выходу семян из состояния покоя и ускорению их прорастания (Marré 1979), индуцирует корнеобразование (Султанов и Муромцев 1985), повышает всхожесть семян в условиях, неблагоприятных для прорастания (Гупавардана и др. 1990, Волыюва и др. 1992, Леонова и др. 1994). На молекулярном уровне ФК активирует Н+-ЛТФазу (De Michelis et al. 1991, Johanson et al. 1993; Lanfermeijer and Prins 1994), блокирует проводимость калиевых каналов плазмалеммы (Blatt and Clint 1989) и активирует гапрат-редуктазу (Moorhead et al. 1996).

В плазматической мембране всех высших растений локализованы специфические рецепторы ФК (Meyer et al. 1993), в формировании которых участвуют белки суперсемейства 14-3-3 (Marra et al. 1994, Koríhout and De Boer 1994, Oecking et al. 1994). Плазмалемма многих видов растений содержит рецепторы двух типов - с низким (Ко ~ 100 нМ) и высоким

(Kq ~1 нМ) сродством к ФК (Aducci et al. 1995). Благодаря быстрой активации Н+-АТФазь: плазмалеммы в присутствии ФК обычно предполагают более короткий и, вероятно, боле« простой путь транедукции сигнала по сравнению с другими фитогормонами (например, с ауксином) (Aducci et al. 1995). Было показано, что в сигнальном пути "ФК рецептор —; Н^-АТФаза" нет системы усиления сигнала (de Michelis ct al. 1996; Trofimova et al. 1997) i: что 14-3-3 напрямую взаимодействуют с С-термипалышм доменом Н+-А'ГФазы (Jahn et al 1997; Oecking et al. 1997). Т.к. in vitro ни Н^-АТФаза, ни 14-3-3 белки по отдельности ш связывает ФК, то возникает вопрос какие молекулы являются определкяцими для образования ФК рецептора. Также оставались малоизученными рецепторы разной аффинноста их сходства и различия, а также роль в клетке растений.

Цели и задачи работы. Все сказанное выше определило цели данной работы: выяснение организации ФК рецепторов разной аффинности в мембране растений и изученш изменения аффинности ФК рецептора под воздействием разных факторов. Для достиже ния первой цели была применена методика определения молекулярной массы ФК рецепторного комплекса в мембране in situ - радиационная инактивация. Вторая часть ра боты выполнялась на протопластах, выделенных из суспензионной культуры сахарно! свеклы, - объекте максимально приближепном к клеткам по физиологической чувстви тельпоста к ФК и позволяющем исследовать свойства ФК рецептора в плазматическое мембране. Были поставлены следующие основные задачи исследования:

♦ определить молекулярные массы ФК рецепторов разной аффинпоста in situ;

♦ выяснить роль белков 14-3-3 в формировании ФК-рецепторного комплекса;

♦ исследовать физико-химические параметры рецептора ФК при воздействии внеш них стрессовых факторов на клетку;

♦ на основании полученных данных построить модель организации ФК рецептора(ов в мембране.

Научная новизна и практическая значимость работы. В проведенных исследова ний обнаружен новый класс ФК рецепторов, активируемых при воздействии стрессовые факторов на клетки растений, - "молчащие" ФК рецепторы. Методом радиационной пнах тивации определены молекулярные массы высоко-, низкоаффинного и "молчащего" ре цепторов. Показано, что аффинность существующих в плазматической мембране рецепта ров ФК не постоянна, а меняется при различных стрессовых воздействиях на раститель ную клетку. Показано, что ФК может изменять молекулярную массу рецепторного ком

плекса, увеличивая степень взаимодействия между 14-3-3 белками и Н+-АТФазой плазма-леммы. Предложена модель рецептора ФК, в которой аффинность зависит от взаимодействия белков 14-3-3 и их белков-мишеней в рецепторном комплексе.

Практический интерес представляет экспериментальная разработка использования ФК как инструмента для исследования роли 14-3-3 белков и их межмолекулярных взаимодействий с белками-мишенями.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА и отчетах лаборатории гормональной регуляции онтогенеза с.х. растений ВНИИСБ, на международной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", на ежегодной конференции молодых учепых ТСХА (Москва, 1997), на симпозиуме общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано четыре печатные работы, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертация. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Результаты", "Обсуждение" и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц и 38 рисунков.

Объекты п методы исследований. Основным объектом исследований были мнкро-сомальные мембраны и протопласты, изолированные из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) штамма 2 п, которая выращивалась в лаборатории физиологии культивируемых клеток Института физиологии растений РАН.

Протопласты получали инкубированием клеток суспензионной культуры в растворе с гидролитическими ферментами (Трофимова и др. 1996), затем суспендировали в среде, содержащей 400 мМ сорбита, 1 мМ CaS04,2.5 мМ K2S04, 20 мМ Mes-BTP, рН 6.3. Протопласты сохраняли жизнеспособность в этой среде при комнатной температуре не менее 5 часов. Жизнеспособность протопластов оцештали по пе окрашиванию красителем "голубой Эванса". По данному критерию не менее 90% протопластов в суспензии оставалось ип-такгаыми во время эксперимента.

Микросомальные мембраны выделяли из 15-20-дпевной суспензионной культуры сахарной свеклы методом дифференциального центрифугирования (Abramycheva et al. 1991), и суспендировали в буфере: 20 мМ Mes-Tris, 10% сахарозы, 20 мМ дитиотрейтола, 5 мМ EDTA, рН 7.2 при концентрации белка 2-3 мг/мл. Белок микросом в количестве 2003

250 мкг замораживали в жидком азоте, лиофилыю высушивали и хранили при -70 °С в атмосфере аргона в эксикаторе над Р2О5.

Образцы фракций микросомальных мембран облучали на линейном ускорителе электронов 5 МэВ (Институт физической химии РАН) при мощности дозы 1.2 Мрад/мин, охлаждая их потоком газообразного азота (-90°С). Молекулярную массу мишени вычисляли по эмпирической формуле: log 5.89 - logD37 - 0.0028Т, где D37 - доза облучения, при которой сохраняется 37% связывающей активности, а Т - температура образца во время облучения в °С (Beliveau et al. 1988). D37 находили графически по линейному участку дозо-вой кривой радиационной инактивации (Alper 1979).

Инактивацию ФК рецептора определяли, измеряя его связывание с [3Н]дигидроФК при двух концентрациях - 0.3 нМ и 100 нМ. При измерении концентрационных зависимостей связывания [3Н]дигидроФК диапазон концентраций меченого дигидроФК был равен 0.6-100 нМ. От несвязавшейся метки освобождались вакуумной фильтрацией через смоченных в 1% полиэтиленимине фильтрах GF-C (Whatman) в соответствии с методом de Boer et al. (1989). Неспецифическое связывание [3Н]дигидроФК измеряли в присутствии 10 мкМ немеченого ФК. Измерение связывания [3Н]дигидроФК с протопластами проводили так же, как и с микросомальными мембранами. На одно измерение как правило брали 105 протопластов.

Гель-фильтрацию солюбилизировашюго ФК рецептора проводили в системе FPLC® на колонке Superose-6 (Pharmacia). Для проведения одной хроматографии на колонку наносили 2 мг солюбилизировашюго белка. Собранные после хроматографии фракции, ипкуби-ровали с 10 нМ меченого лиганда 30 мин при комнатной температуре и определяли [3Н]дигидроФК связывающую активность на фильтрах GF-C. Для проведения гель-электрофореза и иммуноблотганга образцы концентрировали в 10 раз, используя систему ультрафильтрации Millipore-LGC с пределом исключения 10 кДа.

Электрофорез белков проводили в 10% полиакриламидном геле в соответствии с методом Laemmli (1970), используя мини камеру Bio-Rad. На один трек наносили 5 мкг белка. Электрофоретически разделенные полипептиды переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super™ электроблотингом 2 часа при комнатной температуре, используя буферную систему: 25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 20% этанол (Towbin et al. 1979). Для подавления неспецифической сорбции антител мембраны выдерживали в течение ночи при 4 °С в TBS-T буфере: 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl и 0.05% Tween-20. После этого нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с кроличьими антителами ВМН1

(1:7000) к белку 14-3-3 Saccharomyces cerevisiae, или с мышиными антителами AIIA3 (1:5000) к Hf-АТФазе плазмалеммы растений. Инкубацию проводили в течение одного часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивапии. Антитела ВМН1 были любезно предоставлены Dr. van Heusden (Leiden University, The Netherlands), антитела AHA3 - Prof. Serrano (Universidad Poltécnika de Valencia, España). После трехкратной отмывки в TBS-T буфере мембрану инкубировали 1 ч при компатпой температуре со вторыми антителами (1:10000). Вторые ("коза-антикролик", "кролик-антимышь") антитела, копьюгированные с пероксидазой хрена, были любезно предоставлены с.н.с. Юровым Г.К (ВНИИСБ, Москва). Далее нитроцелшолозную мембрану промывали три раза по 10 мин буфером TBS-T. Полосы визуализировали, используя хемолюминесцентную систему ECL™ (Amerscham), короткой (10-60 сек) экспозицией полученного блота на чувствительную к синему свету пленку (Hyperfilm ECL™, Amerscham). Молекулярные массы разделенных на SDS-гель электрофорезе полипептидов определяли, используя биотинилированные маркеры, которые затем проявляли конъюгироваппой со стрептавидином пероксидазой хрена (1:1500).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура ФК рецепторного комплекса

Гель-филыпрация. Для оценки молекулярной массы ФК-рецепторного комплекса был использован метод гель-фильтрации в системе FPLC® на колонке Superose-6. После хроматографии в получепных фракциях методом Вестерп-блогганга определяли белки 14-3-3 и П^-АТФазу плазмалеммы - компоненты, входящие в ФК-рецепторный комплекс. В предварительных экспериментах были подобраны условия, позволяющие получать максимальное количество активной формы ФК-связывающего белка в солюбилизированном виде. Были протестированы различные ионные и неионные детергенты по их способности к со-любилизации и диссоциации ФК:ФК-рецепторного комплекса. Ионпые детергенты (соли холиевых кислот, CHAPS) вызывали диссоциацию более половины солюбилизированного комплекса; неионные: Triton Х-100 - не более трети, октилглюкозид - практически не вызывал диссоциации. При этом октилглюкозид солюбилизировал 87% ФК рецепторов, остальные протестированные детергенты в значительной степени уступали ему.

На рис. 1 приведены результаты гель-хроматографии и Вестерн-блотгинга белков контрольных микросом и микросом, предобработанных ФК перед солюбилизацией. Видно,

что в варианте без обработки ФК (рис. 1а), ФК-связывающие белки выходят из колонки широким пиком - 700-70 кДа. Следует обратить внимание на то, что максимальное количество белков 14-3-3 в этом варианте обнаруживалось в 17 фракции (60-70 кДа) и не совпадало с максимумом связывания ФК в 11 фракции (500 кДа). Малая величина свя-

20000

е

о_

О 15000 *

о. «

£ 10000-^

£ д

X

5000

0

♦

97 кДз-» 2ЭкДа»

200 «Да

150 «Да

67 кДа

I

10 15

фракции, мл

14000

20

«-ЯШ»'

г

о. о

а Е

669 кДа 6

- - 200 кДа

- 150 «Да

- _ ^ 67 кДа

-

-

Н*-АТФаза

14-3-3 белки

10 15

фракции, мл

Рис. 1. Гель-хроматография белков (5ирсгозе-б, система БРЬС®) после солюбилизации микросо мальных мембран и Вестерн-блоттинг полученных фракций. Вверху. Распределение ФК-связывающей активности, а. - В контрольном варианте проводили солюбилизацию и хроматографию микросомальных мембран, а затем измеряли специфическое связывание с [3Н]дигидроФК; б. - Микросомальные мембраны до солюбилизации инкубировали сначала 40 мин с 30 нМ [3Н]дигидроФК, затем 15 мин с 10 мкМ ФК. Внизу. Иммунодетекция Н+-АТФазы плазмалеммы и 14-3-3 белков в полученных фракциях после гель-хроматографии.

зывания ФК во фракциях 16-18, которые содержат практически 90% белков 14-3-3, говорит о чрезвычайно низкой аффинности связывания ФК белками 14-3-3 после гель-фильтрации (к сожалению, ограниченное количество материала во фракции не позволило измерить параметры связывания). Если учесть, что в наших условиях гелъ-фильтрацш происходит лишь незначительная инактивация ФК рецепторов (15-20%), то можно сделал заключение о том, что в мембране присутствует значительное количество 14-3-3 белков, н< принимающих участия в рецепции ФК.

Из данных, представленных на рис. 16 следует, тго обработка микросомальных мем бран ФК перед солюбилизацией приводит к увеличению доли 14-3-3 белков, выходящи: из колонки в высокомолекулярных фракциях (начиная с 900 кДа). При этом также меняет

ся и распределение Н+-АТФазы: она элюируется более узким пиком в области бблыних молекулярных масс (фракции 8-13 - 900-200 кДа), увеличивается доля высокомолекулярной фракции ФК рецептора (фракции 8-10 - 900-700 кДа). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что обработка мембран ФК приводит к стабилизации ФК-рецепторного комплекса, в состав которого входят белки 14-3-3 и Н+-АТФаза плазмалеммы.

Следует также обратить внимание на то, что не все 14-3-3 белки в ответ на обработку ФК изменили профиль элюции при гель-хроматографии. Таким образом, можно предполагать наличие в мембранах растений как минимум двух типов белков 14-3-3: связывающих ФК и изменяющих после этого свое распределение при гель-хроматографии; и 14-3-3, которые, видимо, не связывают ФК и поэтому не изменяют своего распределения в ответ на обработку ФК.

Радиационная инактивация. Для определения молекулярной массы ФК рецептора в нативном окружепии в мембране использовали метод радиационной инактивации. Этот метод основывается на измерении падения функциональной активности молекул ферментов или рецепторов под воздействием ионизирующего облучения. После облучения измеряли специфическую активность облученных образцов (Во), строили график зависимости 1п (Вг/По) от экспозициошюй дозы облучения (О) и на основании теории мишеней рассчитывали молекулярную массу (эффективный размер) исходной активной молекулы.

Дозовые зависимости инактивации ФК рецепторов разной аффинпости, представленные на рис. 2, имеют две особенности: кривые расходятся при увеличении дозы облучения и нелинейны. Первое свойство связано с тем, что ФК рецепторы разной аффинности имеют разный размер мишени и, следовательно, разную молекулярную массу. Второе обусловлено появлением в образце дополнительного количества центров связывания ФК при малых дозах облучения.

Подтверждение этому было получено при измерении концентрационных зависимостей связывания меченого дигидроФК с мембранами, подвергнутыми разным дозам облучения (рис. 3). В контроле и при дозах 5, 10 и 15 Мрад (рис. За) в мембранах преобладал один тип ФК-связывающих сайтов с К а = 2.7±0.4 нМ. При увеличении дозы облучения (20-25 Мрад) отклонение от линейности графика в координатах Скэтчарда (см. рис. 36) указывало на появление в образце заметного количества пизкоаффшшых сайтов с Ко 68±26 нМ. Из постоянства аффинности ФК рецептора при малых дозах облучения следовало, что нелинейность кривой радиационной инактивации связывания ФК в этой области обусловлено появлением в образце новых высокоаффинных центров связывания. Экстраполяция на

рис. 2а линейного участка кривой радиационной инактивации (пунктирная линия) в область нулевой дозы облучения давала сумму активных и активируемых ("молчащих") облучением ФК рецепторов. Видно, что количество "молчащих" ФК рецепторов в 1.4 раза больше количества изначально активных.

Рис. 2. Радиационная инактивация ФК рецепторов а. - Дозовые зависимости инактивации высокоаффинных (•) и низкоаффинных (О) ФК рецепторов. Зависимость инакшвации высокоаффинных ФК рецепгоров.получена измерением связывания [3Н]дигидроФК с микросомальными мембранами при концентрации 0.3 нМ. Зависимость инактивации швкоаффинных ФК рецепторов, вычислена из величины связывания [3Н]дигидроФК, измеренной при 100 нМ с учетом вклада в связывание высокоаффинных рецепторов. Пересечение пунктирной линии с осью ординат дает сумму активных и активируемых облучением ФК рецепторов, б. - Компьютерная аппроксимация (г2 = 0.97) данных радиационной инактивации высокоаффинных ФК-связывакяцих мест в соответствии с уравнением (1).

Зпачение молекулярной массы высокоаффинного ФК рецептора, рассчитанное нами из до-зовой кривой радиационной инактивации (рис. 2а), было равпо 130±15 кДа. Эта величина превышала почта в два раза молекулярную массу ФК рецептора, определенную другими авторами методом гель-фильтрации (Pesci et al. 1979b; Aducci et al. 1982; Meyer et al. 1989; Korfhout 1996). Молекулярная масса щелочной фосфатазы (фермента, который мы облучали в тех же условиях, что и ФК рецептор, и использовали в качестве внешнего стандарта) была определена как 121±8 кДа, что близко к реальной массе ее гомодимера, состоящего из субъедшшц по 70 кДа. Из-за значительного превышения полученной нами

0.12

0.08

LL ffl

0.04

0.00

В, нМ

0.00

Рис 3. Концентрационные зависимости связывание [ П]дигидроФК микросомальными мембранами в координатах Скэтчарда. а. - А Контрольные мембраны; Ш, Т микросомальные мембраны, облученные на электронном ускорителе при дозах 5, 10, 15 Мрад, соответственно; б. - О 20 Мрад, □ 25 Мрад. Параметры связывавания Ко и Втгх рассчитывали при помощи компьютерной программы Enzfitter 1.05 (R.J. Leatherbairow, Elsevier-Biosoft, Cambridge, England) по одно- или двуместной модели связывания.

величины молекулярной массы ФК рецептора, мы предположили, что кроме димера белков 14-3-3, в структуру ФК рецептора должна входить, по крайней мере, еще одна молекула.

Наиболее вероятпой второй молекулой для ФК рецептора является Н'-АТФаза плазматической мембраны. Недавно, методом двугибридной системы (two-hybrid system) было показано взаимодействие С-терминалыюго домепа Н+-АТФазы и одной из изоформ растительного белка 14-3-3 - GF-14-ф (Jahn et al. 1997). Также было показано увеличение взаимодействие С-терминального домена изоформы белка 14-3-3 - GF-14-6 с Н4-АТФазой в присутствии ФК (Fullone et al. 1998). Группе De Boer (персональное сообщение) in vivo удалось выявить сайт связывания ФК с Ко ~ 3 нМ, в результате совместной экспрессии генов белка 14-3-3 и растительной ЬГ"-АТФазы в клетках дрожжей.

Одпако по данным радиационной инактивации молекулярная масса Н+-АТФазы в мембране равна 200 кДа (Briskin et al. 1985). Из сопоставления этих цифр (200 кДа Н+-АТФаза, 130 кДа высокоаффинный сайт) следует, что в формировании центра связывания ФК в мембране помимо димера белков 14-3-3 (63-67 кДа) должна участвовать не только Н'-АТФаза, но и белок с молекулярной массой около 60-70 кДа. Действительно, в очищенных препаратах ФК рецептора нередко обнаруживают полипептиды с молекулярной массой 67 кДа (Korthout, and de Boer 1994; Feyerabend, and Weiler 1989) и 52 кДа (Oecking

et al. 1997). Можно полагать, что тесное взаимодействие с одним из этих полипептидов оказывается необходимым условием для формирования высокоаффипного центра связывания.

Молекулярная масса низкоаффинного ФК рецептора, также вычисленная но данным радиационной инактивации (рис. 2а), была равна 63±7 кДа. Эта величина близка к молекулярной массе димера белков 14-3-3. Однако сами по себе димеры белка 14-3-3 не связывают ФК (Korthout and de Boer 1994; Oecking et al. 1997; Jahn ct al. 1997; см. также рис. la). Белковый комплекс при радиационной инактивации ведет себя как единая структура в том случае, если субъединицы комплекса очень тесно связаны между собой. Поэтому полученная нами меньшая величина для молекулярной массы низкоаффшшого ФК рецептора по сравнению с высокоаффинпым указывает на то, что в ней ослаблено взаимодействие димера 14-3-3 белков со своим окружением. В пользу этого говорят и обнаруженные нами переходы рецептора ФК из одного состояния аффинпости в другое (см. ниже) при стрессовых воздействиях на протопласты.

Дополнительные данные об организации ФК рецепторов разной аффинности, дали эксперименты по инактивации связывания ФК-рецепторного комплекса в протопластах под действием гидролаз, проведенные в нашей лаборатории А.В. Драбкиным. Было показано, что в формировании как высоко-, так и низкоаффинных сайтов участвуют белки, имеющие гликозилированные домены на наружной поверхности плазматической мембраны. Белки 14-3-3 гидрофильны, не имеют трансмембранных гидрофобных доменов, не гликозилированы и расположены вероятнее всего с цитонлазматической стороны плазматической мембраны (Aitken 1995; 1996; Ferl 1996; Oecking et al. 1997). Н+-АТФаза плазма-леммы также не имеет сайтов гликозилирования со стороны апопласта (Serrano 1989). Поэтому возможно, что именно белок 60-70 кДа, входящих в состав ФК рецептора, является мишеныо для протеаз и а-маннозидазы, т.е. имеет апопластические пептидные домены и гликозилирован.

Чтобы оценить молекулярную массу мишени, в которой входят "молчащие" рецепторы ФК, мы предположили, что такой рецептор находится в комплексе с молекулой-ингибитором. При попадании электрона в ингибитор комплекс диссоциирует, и рецептор активируется. Если это предположение верно, то количество ФК-связывающих сайтов будет меняться при облучении в соответствии со следующим выражением:

В = Noe4M)0 + NS(1 - e-D/Di)e-°®0 , (1)

где Ns - количество "молчащих" рецепторов в образце микросомальных мембран, No - ко-

личество активных, Do - D37 для высокоаффинного рецептора, a Dj - то же самое для ингибитора. Первый член этого уравнения (Noe-0®0) отражает инактивацию активных ФК рецепторов. Второй - активацию "молчащих" рецепторов, вызванную инактивацией ингибитора (1 - e"D/Dl), при не инактивации рецептора (e"D/Do). Компьютерная аппроксимация данных радиационной инактивации в соответствии с уравнении 1 приведена на рис. 26. В четырех независимых экспериментах вычисляемое значение молекулярной массы ингибитора варьировало от 220 до 450 кДа, что в среднем дало 290±80 кДа. Таким образом, общая молекулярная масса мишени с "молчащим" рецептором равна 420±90 кДа.

Анализ концентрационных зависимостей связывания ФК с микросомальными мембранами, подвергнутых малым дозам облучения, показал, что "молчащий" рецептор под действием радиации переходит в высокоаффшшый сайт связывания. Такое воздействие должно приводить или к диссоциации, или, по крайней мере, к ослаблению связей внутри комплекса 420 кДа, и в результате к уменьшению молекулярной массы. Таким образом, "молчащий" рецептор представляется нам, как динамическая система, изменяющая свою аффинность и молекулярную массу под воздействием различных внешних факторов (радиация, осмотический стресс см. ниже). Оказалось, что на изолированных мембранах количество потенциальных мест связывапия для ФК не меньше, а гораздо больше, чем активных. Наши данные (см. рис. 1а), а также данные других исследователей (Oecking et al. 1994), указывали на наличие в мембране 14-3-3 белков "свободных" от связывания ФК. Именно этот пул белков 14-3-3 может являться основой для формирования новых мест связывания ФК.

14-3-3

I

.67 кДа 63 кДа I

I I if If

JB^b

I

низкоаффинный высокоаффшшый сайт сайт

290 кДа

молчащим рецептор"

Рис. 4. Гипотетическая схема организации ФК рецептора в мембране.

На основании собственных результатов и литературных данных, нами предложена модель организации ФК рецепторов разпой аффинности (рис. 4). Эта схема учитывает разную степень сродства лиганда к рецепторам, их молекулярную массу, степень взаимодействия в ФК-рецепторном комплексе и доступность полипептидов для гидролаз, а также функцию 14-3-3 белков как белков-адаптеров. Мы предполагаем, что рецептор ФК - это надмолекулярная структура с молекулярной массой 700-900 кДа. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания ФК входят в эту надмолекулярную структуру как составные компоненты. При этом, основываясь на том, что центр связывания ФК возникает в димерс белка 14-3-3 только при его взаимодействии с белком-мишенью, мы предположили, что аффинность к ФК отражает степень взаимодействия между этими белками: ослабление связи приводит к уменьшению аффинности, усиление - к ее увеличению.

Какие из белков плазматической мембраны кроме Н+-АТФазы плазмалеммы могут претендовать на роль мишеней для 14-3-3 белков и образовывать сайты связывания ФК? По всей видимости, это К+-выводящие каналы, изменяющие свою проводимость под действием ФК (Blatt and Clint 1989) и имеющие консервативную аминокислотную последовательность для взаимодействия с белками 14-3-3 (Czempinski et al. 1997). Не исключено, что G-белки, протеин киназы, протеин фосфатазы также могут входить в структуру ФК-рецепторного комплекса.

Изменения аффинности ФК рецептора при стрессовых воздействиях

Впервые переходы низкоаффинного сайта в высокоаффинный при закислении цитоплазмы протопластов изобутиратом были обнаружены в нашей лаборатории (Drabkin et al. 1997). Из литературных данных было известно, что холодовой, кислотный и солевой стресс, как правило сопровождаются закислением цитоплазмы (Yoshida 1994; Xia and Roberts 1996; Vene Kamp 1989 Niu et al. 1995). Нами было показано, что агенты, вызывающие закисление цитоплазмы (изобутират, EGTA, дибукаин), приводят к увеличению на порядок аффинности низкоаффинного ФК рецептора (Drabkin et al. 1997). Таким образом, применение протопластов для исследования рецепции меченого дигидроФК привело к неожиданному результату: аффинность ФК рецепторов не постоянна и может обратимо меняться при стрессовых воздействиях. Предстояло исследовать действие других стрессов на связывание ФК с протопластами, в частности раневого и осмотического.

Раневой стресс. Раневой стресс моделировали нарушением целостности протопластов. Нарушение целостности протопласта осуществляли тремя способами: пшоосмотиче-

ским лизисом (полное разрушение), замораживанием-оттаиванием (протопласт частично сохранял свою форму и размер) и инкубированием протопластов с 1 мМ поли-Ь-лнзином (изменения затрагивали в основном плазматическую мембрану). Все эти воздействия приводили к переходу низкоаффинпых сайтов в высокоаффшшые, напоминающие изменения в связывании ФК при закислепии клеток изобутиратом (см. табл. 1). Однако были обнаружены два основных отличия: этот переход необратим и изменения в количестве ФК-связывающих мест были более значительными, чем при закислении изобутиратом (происходило увеличение 5тах на 40-60% по сравнению с контрольными (пативными) протопластами).

Причина, по которой происходит увеличение Ко и Втах при разрушении клеток пока непонятна. Возможно, этот явление связано с измепением состава цитоплазмы при разрушении (например, увеличении Са2+ из среды инкубации), возможно - с изменением структуры плазматической мембраны. Следует отметить, что при нарушении целостности

Таблица 1. Параметры связывания меченого [3Н]дигидроФК с протопластами

Протопласты KD, Вшах»

нМ фмоль/103 протоплатов

контрольные высокоаффинный сайт 1.0±0.8 7±3

низкоаффшшый сайт 74±22 56±11

подвергнутые

осмотическому лизису 7.6±0.6 80±10

замораживанию-оттаиванию 6.3±0.5 71±7

действию поли-L-лизина 14±2 83±9

клетки существует удивительное совпадение между потерей лабильности (взаимопереходов) ФК рецепторов и изменением активности "стрессовых" ферментов, регулируемых 14-3-3 белками: аскорбат оксидазы (Zhang et al. 1997) и митоген активируемых протеинкиназ (Radziwill et al. 1996; Coffer et al. 1998). Имеет ли этот эффект биологическое значение (например, как ответ растения на атаку патогена), или эти события происходят независимо друг от друга - вопрос дальнейших исследований.

Осмотический стресс. Осмотическое давление среды, в которой инкубировали протопласты, обусловливалось концентрацией сорбита. Осмотический стресс моделировали

двумя способами: уменьшением концентрации собрита или увеличением его концентрации с последующим возвращением в изотонические условия.

На рис. 5 показано, что связывание [3Н]дигидроФК с протопластами достигает стационарного равновесного значения за 15-20 мип инкубации. Уменьшение осмолярности внеклеточной среды на 150 мосМ, создаваемое уменьшением концентрации сорбита в среде инкубации протопластов, приводит к дополнительному связыванию, которое превышает предыдущее примерно в три раза. Такая обработка приводит также к увеличению размеров протопластов, которое происходит примерно с той же скоростью, что и увеличение связывания (см. вставку рис. 5). Когда концентрацию сорбита уменьшали до 0.25 М, поверхность протопласта увеличивалась примерно на 50%, при этом количество ФК рецепторов (Вшах) возрастало в несколько раз (см. табл. 2).

£шах также возрастал в несколько раз при обработке протопластов по схеме "гипертония —> изотония" (см. рис. 66), когда их конечный объем и площадь поверхности оставались без изменений. Анализ концентрационных зависимостей связывания [3Н]дигидроФК с протопластами в средах с разной концентрацией сорбита (см. рис. 6а; табл. 2) показал, что при уменьшении концентрации сорбита в среде от 0.4 М до 0.25 М аффинность ФК-связывающих мест не мепяется, но наблюдается рост количества, главным образом, низкоаффинных ФК рецепторов.

Вновь открывшиеся при набухании протопластов фК-связывающие центры через 1015 мин исчезали (см. рис. 7), а связавшийся с ними ФК не давал им вернуться в прежнее "молчащее" состояние (рис. 5). Необратимость в связывании [3Н]дигидроФК была использована нами для установления локализации появляющихся осмоактивируемых ФК-связывающих центров, хотя и было хорошо известно, что ФК рецепторы располагаются в плазматических мембранах (Aducci et al. 1995). Для этого из протопластов, выдержанных с [3Н]дигидроФК в изо- и гипотонических средах, были получепы фракции микросомаль-ных мембран, которые были разделены центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Было установлено, что связанный ФК расположен в основном в той же части градиента (35-40% сахарозы), где и плазматические мембраны, очищенные распределением i двуфазовой системе ПЭГ-Декстран. Также были сопоставлены между собой распределен и* по градиенту радиоактивно меченого комлекса ФК:ФК рецептор с ванадат-чувствительно* АТФазной активностью, взятой в качестве маркера плазматических мембран. АТФазна« активность и пик радиоактивности комплекса ФК:ФК рецептор совпадали между собой

* и 250 в о

|g 200

Рис. 5. Кинетика изменений связывания [ Н]дигидроФК с протопластами при ггатоос-мотическом шоке (0.25 М сорбита). Протопласты

(5x10е) инкубировали в 5 мл стандартной среде в присутствии 37 нМ [3Н]дигидроФК, отбирали по 100 мкл через разные промежутки времени и измеряли связывание. Через 30 мин суспензию разбавляли стандартной средой без сорбита, но с той же концентрацией меченого дигидроФК (указано стрелкой). Следующие 30 мин продолжали измерять связывание, отбирая пробы с тем же количеством протопластов. На вставке. Кинетика изменения площади поверхности протопласта при гипоосмотическом шоке.

5 2 £ 1150 100

100

о

О 20 40 60 Время, мин

Это свидетельствовало в пользу того, что новые центры связывания открываются на плазматической мембране.

В качестве инструмента для подтверждения мембранной локализации стресс активируемых ФК рецепторов был выбран поли-Ь-лизин (78кДа). Поли-Ь-лизин - поликатион, пепроникающий внутрь клетки, связывающийся с плазматической мембраной и изменяющий ее поверхностные свойства. В малых концентрациях (до 0.1 мМ по мономеру) он не приводил к повреждению протопластов, что контролировали по пе окрапгавапию их красителем "голубой Эванса", но вызывал те же изменения в связывании дигидроФК, что и осмотический шок (рис. 6в; табл. 2). Эта данные можно рассматривать как дополнительное подтверждение тому, что появление новых сайтов связывания дигидроФК происходит на плазматической мембране.

Приведенные выше результаты свидетельствуют в пользу того, что наблюдаемое возрастания связывания ФК, по всей видимости, является результатом увеличение плотпости рецепторов ФК па плазматической мембране протопластов. Есть несколько принципиально разных путей возрастания плотности рецепторов. Один - адсорбция из цитоплазмы белков 14-3-3 н образование новых рецепторов на мембране при осмотическом стрессе de novo, другой - встраивание в мембрану новых, сформированный в аппарате Гольджи ФК рецепторный комплексов путем экзоцитоза, третий - активация уже существующих в плазматической мембране или как мы их называем, - "молчащих". Не отрицая первые две возможности, мы, тем не менее, активацию "молчащих" рецепторов считаем более вероят ной: в изолированных плазматических мембранах имеются пул белков 14-3-3 для создания дополнительного количества ФК-связывающих сайтов. "Молчащие" рецепторы в

1 10 100 1 10 100 1 10 100 [3Н]диждроФК, нМ

Рис. 6. Концентрационные зависимости связывания [3Н]дигидроФК с протопластами, а.-Протопласты из изотонической среды (• - 0.4 М сорбита) переводили в гипотоническую (■ - 0.3 М; ▼ - 0.25 М; ▲ - 0.2 М). б. - Протопласты из гипертонической среды (▲ - 0.8 М) переводили обратно в изотоническую (■ - 0.8—>0.4 М). в. - Протопласты 1 мин инкубировали с 0.1 мМ поли-Ь-лизина (Ж). После обработки к протопластам добавляли разные концентрации [3Н]дигидроФК. На одно измерение брали 105 протопластов, связывание лиганда измеряли в течение 15 мин.

Таблица 2. Действие осмотического стресса и поли-Ь-лизина на связывание меченого дигидроФК с протопластами

«■а > л-0 , п!о* шах >

нМ фмоль/105 протопласт

контроль 0.4 М 3±1 68+9 7+4 40±5

0.4 0.3 М 1.6±1 70±6 9±3 117+18

0.4 -» 0.25 М 2.0+0.5 65±8 12+5 200±30

0.4 0.8 М 1.0±0.5 60+7 5+3 42+5

0.4 —> 0.8 —> 0.4 М 1.2+0.5 73±7 11±4 260+20

0.1 мМ поли-Ь-лизин 3±1 80+10 10+4 165+30

мембранах обнаруживаются методом радиационной инактивации. И, наконец, обратимость появления дополнительных центров связывания в протопластах также, на наш взгляд, свидетельствует против первого пути.

Приведенные нами результаты показывают, что в плазматической мембране протопластов существует динамическое равновесие между состояниями разной аффинности ФК рецепторов - "молчащего", низко- и высокоаффинного (см. рис. 8). Это равновесие меняется под воздействием различных внешних факторов (закисление, осмотический стресс,

О

О 40 80 120 Время, мин

Рис. 7. Кинетика изменений количества связывающих мест протопластов при гипо- (•) и гипертоническом (Л) стрессах. В первом случае протопласты переводили в среду 0.25 М сорбита, во втором - в среду 0.8 М, а затем 0.4 М сорбита. Через указанные на оси абсцисс промежутки времени измеряли концентрационные зависимости связывания и по ним рассчитывали параметры связывания меченого дигвдроФК с протопластами. Пунктирная линия - контрольных протопластов.

поранение). Чувствительность аффинности ФК рецептора к внешним факторам является следствием особой организации ФК рецептора, при которой центр связывания ФК образуется только тогда, когда димер белков 14-3-3 находится в комплексе со своими белками-мишенями. Изменение взаимодействия внутри комплекса могут приводить к изменению аффинности ФК рецептора.

Рис. 8. Схема наблюдаемых изменений аффинности ФК рецепторов протопластов, подвергнутых разным стрессовым воздействиям (переход "молчащий" —> высокоаффинный рецептор наблюдался при радиационном облучении микросом).

Какую функцию в клетке выполняет динамический белковый комплекс, включающий в себя белки 14-3-3 и каково значение изменений аффинности к ФК в ответ на внешние

поли-Ьлизин $0.1 мМ гипотоническая среда гипертоник изотоник

радиационная инактивация

разрушение протопластов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

воздействия? Объяснение может быть дано, исходя из двух равноправных предположений: ФК - это фитогормон или ФК - фитотоксин.

Первая точка зрения основывается на факте, что целый ряд растений содержит эндогенный ФК, соединения схожей структуры и вещества, конкурирующие с ФК за места связывания на плазматической мембране (Muromtsev et al. 1994; Muromtsev 1996). В этом случае ФК-связывающие сайты могут быть "настоящими" рецепторами для ФК-подобных ли-гандов, и могут формировать специфическую регуляторную систему гормонального типа в растениях. Эта система динамично отвечает на стресс и ее отличительной особенностью является то, что регуляция с ее участием происходит путем изменения сродства рецептора к лиганду. Возрастание аффинности (закисление, поранение) или увеличение количества связывающих мест (осмотический стресс) находится в соответствии с гипотезой Trewavas (1981) о механизме гормональной регуляции в растениях. Trewavas постулировал, что в растениях при быстром ответе на изменения внешней среды меняется не концентрация фитогормона, а количество гормон рецепторных комплексов. Возможность такой регуляции подтверждается не только наличием эндогенного ФК и целой группы ФК-подобных соединений в различных растениях, но и тем, что ФК рецептор обнаружен во всех высших растениях, исследованных до сего дня (Meyer et al. 1993).

Альтернативная точка зрения заключается в том, что ФК является экзогенным фито-токсином. В этом случае ФК служит прежде всего прекрасным инструментом в обнаружении надмолекулярных комплексов, в состав которых входят белки 14-3-3 и их белки-мишени. Набор же мишеней для белка 14-3-3 весьма велик, поэтому возможен целый ряд систем регуляции, в которых задействованы ФК "рецепторы" (см. рис. 9). Межмолекулярные взаимодействия внутри этих комплексов изменяются в стрессовых условиях, что косвенным образом обнаруживается в изменении аффинности рецептора к ФК. При этом могут (ин)активироваться различные ключевые ферменты клеточного метаболизма, что, в конечном счете, может приводить к глобальным изменениям биохимии клетки в ответ на стрессовые воздействия, т.е. эти комплексы могут являться первичными акцепторами стрессовых сигналов. Связывание ФК "замораживает" рассматриваемые комплексы в стабильном состоянии. Эта модель не принимает в расчет участия эндогенных ФК подобных лигандов или их рецепторов.

В нашей лаборатории была предложена гипотеза о роли ФК-связывающих белков в высших растениях как модуляторов рН-чувствительности КГ-АТФазы плазмалеммы (Drabkin et al. 1997). Было предположено, что такой механизм может являться частью "рН-

стата" растительной клетки: стрессовое воздействие —» закисление цитоплазмы —> кон-формационные изменения ФК рецептора активация Н+-насоса и закрывание К+-каналов —» восстановление цитоплазматической рН (Трофимова и др. 1997). Осмотический стресс, вызывающий изменение аффинности ФК рецептора - активацию "молчащих" рецепторов, также приводит к активации Н+-ЛТФазы плазмалеммы (Cram 1980; Rubinstein 1982; Wyse et al. 1986; Perry et al. 1987; Curti et al. 1993; Michelet and Bontry 1995). Возможно, что ФК рецептор входит в систему осморегуляции Н^-АТФазы, изменяя ее активность в ответ на осмотический стресс.

G-белок

Нитрат рсдуктаза

/

К -выводящий канал (КС01)

14-3-3

I

Н -АТФаза плазмалеммы

ч

„ 2*

Са зависимая протеин киназа

Рис. 9. Гипотетическая схема образования ФК рецепторов как белок белковых комплексов с 14-3-3 белком.

Не зависимо от того, какая из точек зрения является истинной, способность ФК модулировать энзиматическую активность позволяет с успехом использовать его для определения партнеров по комплексу для белков 14-3-3 (De Boer 1997) и для дальнейшего изучения роли этого/этих комплексов.

ВЫВОДЫ

1. Рецептор фузикокцина (ФК) представляет собой белковый комплекс с молекулярной массой 700-900 кДа. Методом радиационной инактивации белков выяспеш, что низко-

и высокоаффшшыс сайты связывания ФК в этом комплексе различаются по молекулярной массе - 63 и 130 кДа, соответственно. Предполагается, что аффинность к ФК отражает степень взаимодействия между димером белков 14-3-3 и его белками-мишенями в ФК-рецепторном комплексе.

2. Высокоаффинный ФК рецептор в мембране организован как динамичный комплекс бежов 14-3-3 с КГ-АТФазой плазмалеммы и неизвестным белком 60-70 кДа. Связывание рецептором ФК приводит к стабилизации рецепторного комплекса, что выражается в увеличении его молекулярной массы и изменении распределения белков 14-3-3 и ЬГ-АТФазыпри гель-хроматографии.

3. В плазматических мембранах обнаружен новый тип ФК-связывающих мест -"молчащие" рецепторы - в обычных условиях не связывающие ФК, но активируемые стрессовыми воздействиями (осмотический стресс, радиационное облучение). Показано, что такая активация "молчащего" рецептора связана с диссоциацией комплекса 420 кДа.

4. Аффинность ФК рецепторов протопластов сахарной свеклы не постоянна и обратимо меняется при воздействии внешних факторов. Закисление цитоплазмы и раневой стресс приводит к увеличению аффинности низкоаффинного рецептора ФК, а осмотический стресс вызывает появление дополнительного количества низкоаффинных ФК-связывающих мест.

5. Предполагается, что ФК-рецепторный комплекс является частью механизма адаптации растений к осмотическому, кислотному и раневому стрессам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.'A.V. Drabkin, M.S. Trofimova, I.N. Smolenskaya, O.I. Klychnikov, V.V. Chelysheva, A.V. Babakov. 1997. Plant cell pH-static circuit mediated by fusicoccin-binding proteins. FEBS Lett. 405,145-147.

2. M.C. Трофимова, A.B. Драбкип, О.И. Клыяников, С.А. Зориняпц, А. Андолфи, А. Эвидеите, А.В.Бабаков. 1997. Предполагаемая роль фузикокцин-связывающих белков в адаптации растений к стрессовым воздействиям. Физиология растений. Т. 44. Вып. 5, С. 652-657.

3. М.С. Трофимова, О.И. Клычников, А.В.Бабаков. Июнь 1997. 14-3-3 рецепторы ФК как сенсоры внешних сигналов в растениях. //Тезисы 3й ежегодного симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений". Москва, 1997.

4. A.B. Драбкип, О.И. Клычников, М.С. Трофимова, A.B. Бабаков. Окт. 1996. Фузикок-цин-связывающие белки как рН-сенсоры при стрессе. //Тезизы конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветерена-рии". Москва 1996.