Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности прохождения гормонального сигнала через плазматические мембраны высших растений на примере рецепции фузикокцина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности прохождения гормонального сигнала через плазматические мембраны высших растений на примере рецепции фузикокцина"

гЧ 6 О А

_ П £ £ Л М »уй^йАг

ДРАБКИН Артем Владимирович

закономерности прохождения гормонального сигнала через плазматические мембраны высших растений на примере рецепции фузикощина.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА -1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельском

зяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, ведущий научный сoí рудник БАБАКОВ A.B.

Офиииальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Соболев A.C.; как дидат биологических наук Андреев И.М.

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии МГУ.

Защита состоится 1997г. в час на заседани]

диссертационного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологи

по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Афтореферат разослан 1997г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной бис

технологии.

Ученый секретарь диссертационного совета -

к. б. н. Меликова С. А.

ДБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Д ктуальность проблемы. Основный компонентом мембранных систем рас-тителыюй клетки является плазматическая мембрана, которая формирует барьер лежду цитоплазмой и апопластом, тем самым регулируя потоки веществ и служа реце-гтором для сигналов окружающей среды. К числу таких сигналов относятся изменения гриродных условий и поражение фитопатогенными грибами, вырабатывающими вто-»ичные метаболиты, воздействующие на клетки хозяина. Одним из таких метаболитов [вляется фузикокцин (ФК) - токсин фитопатогенного гриба Fusicoccum amygdali Del. Ballio et al. 1964), вызывающий рак косточковых - миндаля, персика, абрикоса.

На целом ряде высших растений установлено, что ФК стимулирует рост изолиро-;анных частей растений, усиливает транспирацию за счет раскрытия устьиц, способст-ует выведению семян из состояния покоя и усилению их прорастания (Marré 1979), шдуцирует корнеобразование (Султонов и Муромцев 1985) и т.д. Эффекты ФК связа-[Ы с активацией выброса протонов из клеток во внеклеточное пространство с после-ующим увеличением ион-транспортирующей способности плазмалеммы и входом нутрь клеток осмотически активных веществ. Согласно последним данным ФК влияет ак на активность Н+-АТФазы (De Michelis et al. 1991, Johanson et al. 1993; Lanfermeijer nd Prins 1994), так и на проводимость калиевых каналов плазмалеммы (Blatt and Clint 989). Одно из наиболее ярких свойств ФК - его антистрессовое действие. ФК повыша-г всхожесть семян в условиях, неблагоприятных для прорастания: при высокой и по-иженной температурах, избыточном увлажнении, при засолении (Гунавардана и др. 990, Вольнова и др. 1992, Леонова и др. 1994). Столь широкий спектр физиологичес-их реакций, а также потенциальная возможность применения ФК в сельскохозяйст-енной практике, вызывает интерес к молекулярным основам действия этого фитоток-ина. Однако механизм транедукции ФК-сигнала, приводящего к столь драматичным оследствиям, до сих пор не раскрыт. На сегодняшний день известны многие мембран-ые компоненты как возможные участники сигнальной цепи: Н+-АТФаза, 14-3-3 белки, ротеинкиназы, фосфолипаза Аг, фосфатазы, G-белки, но пока ни кому еще не удалось эбрать их в единую схему. Еще один вопрос, остающийся нерешенным,- это роль ре-епторов ФК (ФКР) в растительной клетке. Известно, что гриб поражает только кос-эчковые, тогда как рецепторы к его токсину встречаются во всех тканях высших рас-гний и относятся к мажорным белкам.

I |ели И Задачи работы. Выяснение значения ФКР в растительной клетке, ^"■"также установление молекулярного пути ФК-сигнала, собственно и являлись ц< лью данной работы. Для достижения этих целей необходимо было получить объект максимально сохраняющий параметры живой клетки, физиологически чувствительны к действию ФК и позволяющий измерять некоторые биохимические характеристики, частности параметры связывания ФК с плазматическими мембранами. Этим условия: отвечали протопласты, получаемые нами из суспензионной культуры сахарной свекл! (СК), на которых и проводились данные исследования. Основными задачами было:

• Установить корреляцию между активацией Н+-АТФазы и связыванием ФК плазмалеммой.

• Определить сходство и различие в химической природе высокоаффинных и ш зкоаффинных сайтов связывания ФК и их роль в активации Н*-АТФазы.

• Выяснить, участвуют ли протеинкиназы в передаче ФК-сигнала, и если да, т определить их положение в сигнальной цепи.

• Проанализировать полученные результаты с целью установления возможно роли рецепторов ФК в высших растениях.

|1аучная новизна работы и практическая значимость работы.

настоящей работе разработан метод выделения протопластов из суспензионно культуры сахарной свеклы, которые сохраняют физиологическую чувствительность фузикокцину, измеряемую по защелачиванию цитоплазматического рН. Показано, ч^ эти изменения связаны с активацией Н+-АТФазы плазматической мембраны, в которс принимают участие ФКР разной аффинности. Получены данные свидетельствующие пользу прямого конформационного взаимодействия между рецептором фузикокцина Н+-АТФазой.

Впервые показано, что аффинность ФКР не постоянна и на плазматической ме! бране протопластов существует динамическое равновесие между сайтами связываш фузикокцина с разной аффинностью.

Обнаружено, что существующее равновесие смещается в сторону высокоаффи ных сайтов связывания при закислении цитоплазмы. На основе полученных даннь предложена гипотетическая схема функционирования ФК-связывающих белке (ФКСБ) в высших растениях как рН-зависимых регуляторов активности эффекторо таких как Н+-АТФаза и калий выводящие каналы, а также концепция о роли ФКР адаптации растений к абиотическим воздействиям.

Л пробсшия работы. Материалы диссертации были представлены на Между' »народном симпозиуме "Прием и передача сигналов растительных гормо-юв"(Москва 1994г.), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в расте-шеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва 1996г.) и на ежегодном симпози-'ме "Physical-chemical basis of plant physiology" (Пенза 1996).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано десять печатных работ, список которых приводится в конце автореферата.

f-^Tpyioypa И объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Результаты", "Обсуждение", "Заключение", 1ыводов, благодарностей и списка использованной литературы. Работа изложена на 16 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 22 рисунка.

)БЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным объектом исследований были протопласты из суспензионной культуры клеток корнеплода сахарной свеклы (Beta vulgaris L., штамм 2 п), которая выращивалась в лаборатории физиологии культивируемых клеток Института физио-югии растений РАН.

Цитоплазматический рН регистрировали путем измерения интенсивности флуоре-ценции рН-индикатора флуоресцеина, предварительно загруженного в протопласты, [а 530 нм при возбуждении 490 нм или определяли отношение интенсивностей его флу-ресценции на 530 нм при возбуждении 490 и 440 нм (F490/F440). При измерении дейст-ия различных соединений на цитоплазматический рН протопласты вначале выдержи-али 15 мин в инкубационной среде с 2 цМ флуоресцеиндиацетата, затем отмывали их т красителя центрифугированием и добавляли к ним испытуемые вещества. Через 5 [ин половину протопластов брали для измерения флуоресценции F490o6m и F44006111, а ставшуюся половину центрифугировали, получали супернатант и измеряли его флуо-есценцию Fwicyrep и F+iocynep. Далее рассчитывали отношение F4900&U - F490cynep / 1м40общ -'440супер и по калибровочной кривой определяли рН цитоплазмы. Точность определения Н составляла 0.05 единицы.

Связывание протопластов с рЩцигидроФК проводили при комнатной тел пературе в 100 мкл среды, содержащей 400 мМ сорбита, 1 мМ CaS04, 2,5 мМ K2SO, 20 мМ MES-BTP, рН 6,3. На одно измерение брали обычно 105 протопластов. От hi связавшейся метки протопласты освобождали вакуумной фильтрацией на фильтра GF-C (Whatman, Англия), смоченных в растворе 1% полиэтиленимина Р в соответс вие с методом (De Boer et al. 1989). После фильтрации образца ячейку с фильтро промывали два раза 5-ю мл буфера глицин-NaOH, рН 9,5 с добавлением 5х10"71 фузикокцина. Добавление ФК в промывочный раствор более чем в 2 раза уменыш ло неспецифическое связывание меченого дигидроФК. Неспецифическое связываш ФК с протопластами оценивали путем измерения связывания меченого дигидроФ в присутствие 10 мкМ свободного ФК.

Электрофорез белков проводили в 12,5% полиакриламидном геле в соответствии методом Laemmli (1970). SDS-PAGE и иммуноблотинг проводили на установке Bii Rad Modular Mini Electrophoresis. Условия электрофореза были 100 V , 10 мин а зате 200 V, 1 ч. Электрофоретически разделенные полипептиды переносили на нитроцелш. лозные мембраны (100 V, 1 час при комнатной температуре) электроблотингом, и пользуя буферную систему: 25 мМ Tris, 192 мМ глицин (Towbin et al. 1979). Мембран инкубировали в течение ночи при 4 °С в растворе: 4% (м/о) БСА в TBS-T: 20 мМ Tri НС1 рН 7.5,150 mM NaCl и 0.05% Tween 20. После этого мембраны промывали три р за TBS-T и обрабатывали антителами. Для проявки белков использовали следующ! антитела: (а) Моноклональные анти-CDPK антитела; (б) анти-14-3-3 антитела, пол ченные против ВМН1 трансляцинного продукта, кодирующего 14-3-3 гомолог Saccaharomyces cerevisiae. Вторые антитела были меченные пероксидазой хрена крол чьи (Sigma А 8786) или козьи против JgG мыши. Инкубацию с первыми антитела» вели в течение 1 часа. Затем промывали три раза по 10 мин буфером TBS-T и наноси вторые антитела. Выдерживали 45 мин и повторяли промывку. Хемолюминисценци визуализировалали короткой (10-60 сек) экспозицией мембраны на чувствительную синему свету пленку (Hyperfilm, ECL, Amerscham). Биотинилированные маркеры виз ализировали конъюгированной со стрептавидином пероксидазой хрена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

'Рецепция фузикокциин - первый шаг к физиологическому действию

Возможность использования протопластов для измерения связывания меченого ФК с плазматическими мембранами была продемонстрирована в работе Бабакова и Данилиной 1991. Этими авторами также показано, что протопласты могут быть [спользованы и для изучения физиологической активности ФК. Поэтому этот объект 1ыл выбран нами для одновременного исследования связывания ФК с плазматической ¡ембраной и его способности активировать Н+-АТФазу. Перед нами стоял вопрос, акой растительный материал использовать в качестве источника протопластов. Мы становились на суспензионной культуре клеток сахарной свеклы, которая уже более О лет культивируется в лаборатории физиологии культивируемых клеток Института этиологии растений РАН.

Прежде всего нами была проверена чувствительность клеток суспензионной куль-уры к ФК в зависимости от ее возраста. Чувствительность к ФК оценивали по его пособности индуцировать транспорт ионов Н+ из клеток.

Таблица 1. Чувствительность клеток суспензионной культуры сахарной свеклы к ФК зависимости от возраста культуры*

Показатели Возраст культуры после нереса-живашш на свежую среду, сут

7 М

акисление наружной среды за ЮОмин (-ФК), ДрН 0.012 0.086 0.16

акисление наружной среды за ЮОмин (+ФК), ДрН 0.2 0.41 0.33

рН(+ФК)/ДрН(-ФК) 16.6 4.8 2.1

Ценные, приведенные в таблице, усреднены по 2 биологическим и 3 аналитическим пов-юрностям. Среднеквадратичная ошибка не превышает 12%.

Из представленных данных (Таблица 1) видно, что ФК воздействовал на клетки сусго нзионной культуры сахарной свеклы так же, как и на большинство других объекта индуцируя направленный в наружную среду транспорт протонов. Однако по мере до( тижения культурой стационарной стадии роста (10-12 дней) и дальнейшего ее старена относительное воздействие ФК на протонный транспорт уменьшалось. Поэтому дл дальнейшей работы нами были использованы клетки, находящиеся в наиболее чувс-вителыюй к ФК логарифмической фазе роста (7-9 дней).

Модельным параметром действия фузикокцина на клетки растений нами был выбрано защелачивание внутриклеточного рН (рНс). Для измерений рН цитоплазм мы использовали флуоресцеин с рК = 6.4 и высоким квантовым выходом флуоресци ции. Это вещество отличается легкостью проникновения в цитозоль как диацетата специфическим накоплением в цитоплазме. В большей части экспериментов, особенн при проверке действия различных веществ на рНс, мы измеряли флуоресцентное othi шение F490/F440, так как измерение рН в этом случае не зависит от концентрации флу< реецеина него утечки из протопластов в течение эксперимента. На рисунке 1 предста лены концентрационные зависимости действия фузикокцина на цитоплазматическр рН и концентрационная зависимость связывания [3Н]дигидроФК с протопластами. Параметры связывания, расчитанные с использованием программы "Enzfitter 1.05"(R. Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft, Cambridge, England), были К"** = 1.45+ 0.42 нМ, В™

(4.2 ± 0.2)х105 сайт/протопласт; = 150 ± 80 nM, B'Z~ (2.7 ± 1.1)х11 сайт/протопласт, в то время как CI50 эффекта ФК составлял 6х 10-8. Видно, что действ]

Рисунок 1. Концентрационные зависимости связывания рЩцигидроФК (А) и влияния ФК на рН, (Б). Эффект 1 цМ ФК на Р49<>/Р440 принят за 100%.

0 9 8 7 6 «K.-K1ÍM1

ФК на протонный транспорт в протопластах начинается при концентрации ФК 10 8 М. Легко подсчитать, что при этой концентрациии ФК занято 90 % высокоаффинных сайтов и 9% низкоаффинных. Наиболее выраженное действие ФК на транспорт Н+ в протопластах проявляется при концентрациях ФК, близких к 10-7 М, более соответствующих константе диссоциации для низкоаффинных ФК-связывающих сайтов. Очевидно, тго совпадения действующей концентрации ФК с величиной константы диссоциации хля низкоаффиных сайтов еще недостаточно для того, чтобы делать какие-либо выводы о роли низкоаффинных или высокоаффинных сайтов в механизме действия ФК. Эднако, наши исследования говорят в пользу участия обоих типов сайтов связывания 1)К в этом процессе.

В присутствии специфического ингибитора Н+-АТФазы - эритрозина В (Яа51-НаМо^ло е1 а1. 1989) - внутриклеточный рН обработанных фузикокцином протопластов не смещался под действием фузикокцина. В отсутсвие фузикокцина эритрозин В не жазывал влияния на стационарное значение рН цитоплазмы контрольных протопластов, тогда как добавленный после ФК вызывал возвращение рНс к исходному уровню рисунок 2). Таким образом наблюдаемые изменения рНс под действием ФК могут Зыть объяснены активацией протонной АТФазы плазматической мембраны.

ЕгВ(ЮцМ)

Рисунок 2. Эффект эритрозина В (Ег В) на рНс контрольных (•) и ФК-предобработанных (О) протопластов.

£ 7.15

о

7.3

7.0

фк

\

ЕгВ(ЮцМ)

0 4 8 12

Время (мин)

/ —1-112 20 30

Таблица 2. Концентрации ФК, его производных и аналогов, вызывающие полумак симальный эффект на защелачивание цитоплазмы, и конкуренция между ними \ рН]дигидроФК за связывание с высокоаффинными и низкоаффинными сайтами про топластов

Соединение ЮедМ высокоаффиниый сайт' 1Си> ^М пизкоаффшшый сайт ECso цМ защелачивание цитоплазмы

ФК 0.003 0.25 (Юм) 0.06 ± 0.02

ДидеацетилФК 0.1 1 0.16 ±0.05

За-Гидрокси-19-деоксидидеацетилФК 1 1.5 0.6 ±0.1

ФК-агликон но нет конкуренции нет эффекта

16-0-Деметил-19- Деоксидидеацетил-З-эпи- ФК нет конкуренции нет конкуренции нет эффекта

Изучение действия аналогов и производных фузикокцина на рНс и их способное ти конкурировать с рЩдигидроФК за связывание с протопластами показало, что дейс твие ФК строго специфично и коррелирует со связывающей активностью (Таблица 2

а

Так, диадецетилФК и За-окси-19-деоксидидеацетилФК вытесняют [ ЩдигидроФК ФК-агликон вытесняет меченый дигидроФК только с высокоаффинного сайта. Нрои: водное ФК, 16-0-диметил-19-деоксидидеацетил-3-эпи-ФК, не конкурирует

3

[ ЩдигидроФК за связывание ни с одним из типов сайтов на протопластах. Следуе отметить, прямую зависимость сродства аналогов и производных ФК к рецептору и и концентраций, вызывающих полумаксимальное защелачивание цитоплазмы протоплг стов. По-видимому, активация Н+-АТФазы фузикокцином прямо пропорциональн количеству занятых лигандом рецепторов.

Нами проведено сравнительное исследование действия а-маннозидазы и разли1 ных протеаз (глутаминовая протеаза из Bacillus licheniformis, расщепляющая полипы тидную цепь по С-концевой части глутаминовой кислоты, а-химотрипсин, субтилизи (Фен, Тир, Три) и металлопротеаза из Bacillus megaterium (Фен, Лей, Вал, Ил1 (Морозова и др. 1993)) на связывание ФК с низко- и высокоаффинными Ф1 связывающими сайтами протопластов. Показано, что низкоаффинные сайты меш подвержены разрушительному действию протеаз, чем высокоаффинные. Оба сайта св зывания оказались чувствительны к действию а-маннозидазы. Это, а также совпадет

адов аффинности производных ФК для низко- и высокоаффинных ФК-связывающих 1йтов свидетельствуют в пользу того, что они имеют близкородственную химическую руктуру и входят в единую регуляторную систему.

Показано, что после разрушения протопластов осмотическим шоком наблюдает-[ деградация во времени обоих типов мест связывания, причем высокоаффинные ФК-1язывающие сайты инактивируется существенно медленнее низкоаффинных. Вполне :роятно, что быстрая деградация низкоаффинных ФК-связывающих сайтов является ¡новной причиной потери способности Н+-АТФазы плазматических мембран активи-)ваться ФК в системе in vil го. Введение в среду осмотичесого шокирования протопла-ов ингибиторов протеаз, фосфатаз или протеинкиназ не влияет на скорость наблюда-юй инактивации. В тоже время РЩцигидроФК, стабилизирующий структуру ФК-¡цептора, а также такие вещества как этиленгликоль и глицерин, приводят к полной щите высокоаффинных ФК-связывающих сайтов от деградации и существенному гижению скорости инактивации низкоаффинных.

'частис протеинкиназ и протеинфосфатаз б чрансдукции ФК сигнала

ели предположить, что передача ФК-сигнала на Н+-АТФазу происходит с участи-—^ем протеинкиназ и протеинфосфатаз, то добавление их ингибиторов перед внесе-(ем ФК привело бы к подавлению активации Н+-транспорта. В случае, когда ингиби->ры фосфорилирования/дефосфорилирования добавлялись после ФК, их эффект не >лжен был бы обнаруживаться. Для выяснения этого вопроса мы использовали стау-»спорин, кальфостин С и хелеретрин - как ингибиторы протеинкиназ и окадаевую гслоту - ингибитор протеинфосфатаз I и 2А. Влияние этих веществ на активность Н+-ГФазы исследовали, измеряя цитоплазматический рН протопастов из суспензионной 'льтуры клеток в отсутствии и в присутствии фузикокцина. Как следует из рисунка 3 ауроспорин и окадаевая кислота сами индуцируют защелачивание цитоплазмы, сра-[имое с вызываемым ФК. Эффект фузикокцина подавляется в присутствии стаурос->рина и не изменяется на фоне окадаевой кислоты. Стауроспорин и фузикокцин обсуживают взаимный антагонизм. Эритрозин В блокирует все наблюдаемые эффекты, штывая, что ингибиторы фосфорилирования/дефосфорилирования смещают равно-сие между этими процессами в растительной клетке (Grosskopf at al. 1990, Raz and uhr 1993), это говорит о том, что Н+-АТФаза может быть активирована как путем )сфорилирования ( Suzuki et al. 1992, в нашем случае окадаевая кислота), так и дефо-юрилирования (Ver-Estrella et al. 1994, в нашем случае стауроспорин). Из однонапра-

вленного действия сгауроспорина и окадаевой кислоты на рНс следует, что Н+-АТФаз£ имеет более чем один сайт фосфорилирования, что совпадает с данными Shaller апс Sussman 1988.

Основываясь на наблюдаемом взаимном антагонизме стауроспорина и ФК (рисунок 3), мы можем сделать вывод, что наиболее вероятной следует считать версик о прямом конформационном взаимодействии между ФК-рецептором и Н+-АТФазой Проявляющиеся эффекты ФК - активация, ингибирование, отсутствие эффекта на Н+ транспорт (Felle et al. 1986, Marré et al. 1986, Ullrich andNovacky 1990, Reid et al. 1985) вероятно, есть результат состояния фосфорилированности самого эффектора.

Рисунок 3. Относительный эф фект ФК, ингибиторов фосфорита рования/дефосфорилирования и и; комбинаций на рНс. Протопласт! выдерживали с ФДА 20 мин; перво вещество вносили вместе с ФДА, второе через 10 мин в указаном по рядке. F490/F440 эффект ФК прини мали за 100%; конечные концент рации были: 1 fiM ФК, 2 цМ стау роспорина (Ст), 0.1 цМ окадаево 0 20 40 60 80 100 120 кислоты (OK).

Защелачивание цитозоля, %

Нами также получены результаты, свидетельствующие в пользу того, что 14-3-белок, образующий ФК-рецептор, может регулировать активность некоторых протеи нкиназ. Так, 43-кДа полипептид, "узнаваемый" антителами, полученными против Са2+ зависимой протеинкиназы (CDPK), присутствует в высокообогащенных фракция ФКСБ после ионобменной хроматографии. Так же этот полипептид обнаруживаете« хотя и слабозаметно, во фракциях, очищенных с использованием ФК-биотин (Korthout and De Boer 1994). Во-вторых, синтетический пептид гомолологичный тл "аннексии подобному" домену, присутствующему в 14-3-3 белках, связывается с 43-кД полипептидом в экспериментах по взаимодействию этого пептида с плаз м ал ем м арнь: ми белками после иммуноблоттинга. По-видимому CDPK могут выступать в роли са мосгоятсльных эффекторов ФК.

ФК Ст

Ст + ФК

ФК + ОК

рН цитоплазмы и аффинность фКР

Протонная АТФаза плазмалеммы является ключевым ферментом в клетках растений и одна из ее функций заключается в поддержании цйтоплазматического рН. [осколъку активация этого фермента ФК наиболее вероятно происходит путем прямо-5 конформационного взаимодействия лиганд-рецепторного комплекса и эффектора, ы предположили, что не сама Н+- АТФаза, а ее комплекс с ФКСБ является компонент рН-стата клетки, и попытались выяснить как сказываются изменения цитоплаз-атического рН на функционировании ФКСБ в качестве ФК-рецептора.

Рисунок 4. Связывание [ЗЩдигидроФК с протопластами в зависимости от рНс (1), I рНнагух (2). Наружный рН изменяли, переводя протопласты центрифугированием в «проникающий через плазматическую мембрану буфер Мея-ВТР с разным рН. рН ;итоплазмы смещали в кислую сторону, добавляя к протопластам концентрированный раствор изобутирата (1 М), оттитрованный ВТР до рН 6.3. Для смещения рН тротопластов в щелочную сторону к ним добавляли раствор КЩО. После установ-гения рН цитоплазмы (2-5 мин) к ним добавляли РЩдигидроФК в конечной кон-дентрации 10 нМ и через 15 мин измеряли связывание с ними меченого дигидроФК. )Н цитоплазмы контрольных протопластов был равен 6.95 - 7.0. 100% связывание дегидроФК с 105 протопластов составляло 0.015 пмоль. Данные усреднены по 4 независимым измерениям в 3-х кратной повторное™ каждое.

На рисунке 4 показаны зависимости связывания [ЗЩдигидроФК с протопластами г наружного и цитоплазматического рН. Из представленных данных видно, что на-ужный рН мало влияет на связывание меченого ФК с протопластами.

Для того чтобы выяснить, что меняется при закислении цитоплазмы - количество ФК-связывающих сайтов на поверхности протопласта или их аффинность мы измерили концентрационные зависимости связывания [3Н]дигидроФК с протопластами (рисунок 5).

рН =7.0 рН =6.9 рН-=6.75 рН=6.6 РНС=7.1

3 0 3 0 Воипс!, нМ

Рисунок 5. Концентрационные зависимости связывания [3Н]дигидроФК с протопластами при изменениях цитоплазматического рН (рНс) в координатах Скэтчарда; измерения проводили в стационарных условиях и при искусственном ацидозе. В опытах б, в, г через 5 мин после выдерживания протопластов с изобутиратом к ним добавляли [3Н]дигидроФК в разных концентрациях и через 15 мин измеряли связывание. В опыте (д) протопласты 5 мин инкубировали с 10 мМ изобутирата, потом осаждали центрифугированием (3 мин, 100 g) и переводили на стандартную среду иизмеряли связывание аналогично предыдущим опытам

В стандартных условиях (рНс-7.0) на плазматической мембране присутствуют высоко- и низкоаффинные сайты. При постепенном закислении цитозоля (рНс-6.9 6.75) наблюдается переход низкоаффинных сайтов в высокоаффинные, и при рНс = 6,( концентрационная зависимость соответствует одноместной модели связывания. Ве личина константы диссоциации ФК при этом приобретает промежуточное значен» между аналогичными величинами для высоко- и низкоаффинных сайтов (19 ± : нМ), а общее количество ФК-связывающих сайтов остается постоянным (Таблица 3) Меняется ли при этом сродство к ФК высокоаффинных ФК-связывающими сайтов ос тается неясным. Такое возрастание аффинности имеет обратимый характер, пос кольку после отмывки протопластов от изобутирата концентрационная зависи

ость связывания дигидроФК возвращается к первоначальному виду (рНс=7.1). В тоже эемя, защелачивание цитоплазмы протопластов под воздействием 20 мМ хлорида имония на ту же самую величину рН (0.3-0.4 единицы) не приводит к столь драмати-гским изменениям в параметрах связывания дигидроФК (Таблица 3).

Действие цитоплазматического рН на связывание ФК с протопластами имеет ряд зобенностей. 1. Оно проявляется в узком и физиологическом диапазоне рН от 7.0 до 5 и по крутизне изменений напоминает фазовый переход ФКСБ из одного состояния другое. 2. Зависимость связывания ФК с протопластами от цитоплазматического рН 1ределяется в основном изменениями в аффинности ФКСБ. 3. Изменения аффинности 'КСБ наиболее ярко проявляется для низкоаффинного сайта. 4. Наблюдаемые изме-гния в аффинности ФКСБ к ФК обратимы. Обратимость изменений аффинности 'КСБ при восстановлении цитоплазматического рН указывает на то, что в плазмати-гских мембранах протопластов, видимо, имеет место динамическое равновесие между *умя состояниями аффинности ФКСБ, которое смещается в ту или иную сторону в 1Висимости от рН цитоплазмы. Переход ФКСБ из одного состояния аффинности в эугое отражает, по-видимому, конформационный переход в этих белках. Следует от-етить, что конформационные изменения ФК-связывающих белков гораздо менее вы-1жены при одновременном смещении наружного и внутреннего рН. Поэтому вполне фоятно, что не только величина цитоплазматического рН определяет переход между )умя состояниями аффинности, но и трансмембранный градиент электрохимического этенциала. Кроме того не исключено, что крутизна и диапазон изменения аффиннос-i ФК-связывающих белков в растительной клетке регулируются другими факторами, шример, путем фосфорилирования-дефосфорилирования. сходя из того, что:

ФКСБ широко распространены в высших растениях (Meyer et al., 1993). По аминокислотной последовательности они гомологичны 14-3-3 белкам (Oecking et al. 1994, Korthout and De Boer 1994, Aducci et al. 1995), относящимся к полифункциональным регуляторным белкам в растениях и животных (Aitken 1995, Ferl 1996). Передача сигнала от ФКСБ к эффекторным белкам осуществляется по-видимому путем прямого конформационного взаимодействия (De Michelis et al. 1996). u предполагаем, что обнаруженная нами "чувствительность" ФКСБ к цитоплазмати-юкому рН может лежать в основе их функционирования в растениях в качестве свое->разных рН-зависимых регуляторов активности Н+-АТФазы

Таблица 2. Изменения параметров связывания дигидроФК с протопластами при различных воздействиях

Параметр контроль NH4CI 20тМ изобутираг ШшМ Отмывка после изобутирата

рНс 7.0-6.95 7.35-7.4 6.65-6.7 7.1

Втах мест/протопласг »105 Высокоаффинный сайт 3.4+1.6 3+0.2 23±1 5.5±0.7

Низкоаффинный сайт 30±12 21±2 15+1

Kd,HM Высокоаффинный сайт 1.9+1 2.2±0.4 19±3 1+0.3

Низкоаффинный сайт 240+60 190±40 120±50

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Т) современной литературе существуют две точки зрения о фузикокцине:

1. ФК - фитотоксин, специфически активирующий один из ключевых ферменте растений - Н*-АТФазу плазматических мембран, и поэтому он оказывает в ли ние практически на все высшие растения, а не только на те, которые F.amygdc поражает.

2. ФК или его стуктурный аналог - фитогормон.

Рассмотрим полученные нами данные в свете этих двух концепций.

Если говорить о ФК как о фитотоксине, то приведенные в этой работе литерату] ные и эксперементальные данные говорят о том, что ФК воздействует на систему per ляции Н+-АТФазы, необратимо активируя фермент. По-видимому, это связано с асо циацией ФК-(ФК-рецепторного) комплекса с эффектором. В естественных же условия в отсутствии ФК, регуляция активности фермента идет по следующей схеме: смещен! цитоплазматического рН в кислую сторону приводит к изменению конформащ ФКСБ, который в свою очередь связывается с Н+-АТФазой, переводя ее в актив» состояние, в следствии чего, рН цитоплазмы возвращается к исходному уровню, ком леке ФКСБ - Н+-АТФаза диссоциирует, с понижением активности фермента. Впол:

юзможно, что по предполагаемому механизму регулируются также и выводящие кали-вые каналы плазматических мембран клеток растений, на которые ФК оказывает вли-[ние (Blatt et al. 1989, Blatt and Armstrong 1993).

стационарное состояние клетки

* \

защелачивание цитоплазмы

*

Активация Н+-АТФазы

ч

Низкие температуры Гипоксия Засуха

Солевой стресс

поддержание концентрации внутриклеточного К+

Т

Закрытие K+out каналов

*

изменение состояния ФК-рецептора

закисление цитоплазмы

'исунок 6. Гипотетическая схема участия ФК-связывающих белков в адаптации рас-ительной клетки к стрессовым условиям.

Предложенная версия работы ФКСБ позволяет ответить на вопрос об их роли в летке. Поскольку звестно, что такие стрессовые воздействия, как низкие температуры Voshida 1994), гипоксия (Xia and Roberts 1996), засуха (Vene Кагар 1989) или засоление Niu et al. 1995) сопровождаются закислением цитозоля, мы составили гипотетическую хему (рисунок 6) функционирования ФК-связывающих белков в высших растениях, встроенную на основе обнаруженного нами эффекта и привлеченных литературных

данных. Итак, стрессовое воздействие приводит к изменению цитоплазматическог рН. Далее, закисление цитоплазмы или взаимодействие экзогенного ФК с ФК связывающими белками вызывают их конформационные изменения, которые перед; ются напрямую Н+-АТФазе и К+-каналам, что приводит к активации Н+-насоса и за! рыванию каналов. В результате восстанавливается цитоплазматический рН, сохранз ются в клетке ионы калия, и она возвращается в начальное состояние. Однако тольк активацией Н+-АТФазы невозможно объяснить весь спектр физиологических реакцш вызываемых ФК в высших растениях. По-видимому, ФКСБ, помимо регуляции Н насоса, осуществляют и передачу внешних сигналов "внутрь" клетки. Одним из звенье этой, совершенно не известной, сигнальной цепи могут являться Са2+-зависимые, I возможно, и митоген-активируемые протеинкиназы. В случае же, если ФК или его ан; лог является фитогормоном, то полученные нами данные являются прямыми докач; тельствами идеи Тревиса (Тгеууауаэ 1981) о механизме гормональной регуляции в ра тениях. В своей работе Тревис постулировал, что в растениях при быстром ответе ь изменения внешней среды меняется не концентрация гормона, а количество гормо! рецепторных комплексов. В таком случае, наблюдаемое нами увеличение аффинное! ФКР при закислении рНс отражает возрастание связывания эндогенного лиганда с р цептором и соответственно степеь активированное™ Н+-АТФазы или других эффект« рных белков.

ВЫВОДЫ

1. На плазматической мембране протопластов, полученных из суспензионной культ ры клеток сахарной свеклы, имеется два типа сайтов связывания фузикокцина (Ф1 с разным сродством к лиганду. Оба сайта быстро инактивируются при разрушеш протопластов, чувствительны к протеазам и а-маннозидазе и расположены, видим на наружной поверхности плазматической мембраны протопластов.

2. Фузикокцин активирует Н*-АТФазу плазмалеммы изученных протопластов. На шодаемая активация происходит при взаимодеиствии ФК с низко- и высокоаффи ными рецепторами. Показано, что в ФК-индуцированной активации Н+-АТФазы I участвуют протеинкиназы и предположено, что этот процесс идет путем прямо) конформационного взаимодействия рецептора и эффектора.

3. Совместная очистка фузикокцин-связывающего белка (ФКСБ) и Саг+-зависим< протеинкиназы с молекулярной массой 43 кДа при ионобменной хроматографии п казывает, что ФКСБ помимо регуляции Н+-насоса может осуществлять контро. активности пртеинкиназ.

I. Впервые обнаружено, что сродство низкоаффинного рецептора к ФК, отражающее состояние ФКСБ в мембране, не постоянно и возрастает более чем в 10 раз при понижении рН цитоплазмы протопластов в узком физиологическом интервале 7.0-6.7. Сформулирована концепция о роли ФКСБ в высших растениях как рН-зависимых регуляторов активности эффекторнах белков, таких как Н+-АТФаза и калий выводящие какналы, основанная на обнаруженной изменчивости аффинности ФК-рецептора и вероятной идентичности ФКСБ с разным сродством к ФК.

ПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

. A.V. Drabkin, М. S. Trolimova, I. N. Smolenskaya, О. I. Klychnikov, V. V. Chelysheva, А. V. Babakov. 1997. Plant cell pH-static circuit mediated by fusicoccin-binding proteins. FEBS Lett. 405, 145-147. . М.С.Трофимова, А.В.Драбкин, О.И. Клычников, С.А. Зоринянц, А. Андолфи, А. Эвиденте, А.В.Бабаков. 1997. Предполагаемая роль фузикокцин-связывающих ¿л-ков в адаптации растений к стрессовым воздействиям. Физиология растений, в печати.

. Van der Hoeven P.C.J., Siderius M., Korthout H.A.A.J., Drabkin A.V. and De Boer A.H. 1996. A calcium and free fatty acid modulated protein kinase as putative effector of the fusicoccin 14-3-3 receptor. Plant Physiol. Ill, 857-856.

М.С.Трофимова, А.В.Драбкип, И.Н.Смоленская, А.В.Бабаков. 1996. Действие фузи-кокцина на протопласты, полученные из суспензионной культуры сахарной свеклы: индукция Н+ -транспорта и связывание с рецепторами. Физиология растений. 43, 519-526.

Trofimova M.S., Smolenskaya I.N., Drabkin A.V., Galkin A.V. and Babakov A.V. 1996. Does plasma membrane H+-ATPase activation by fusicoccin involve protein kinase? Physiol. Plant. 98,215-221.

А.В.Драбкин О.И. Клычников М.С.Трофимова А.В.Бабаков. Окт. 1996. Фузикок-цин-связывающие белки как рН-сенсоры при стрессе. В тезизах конференции Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии. Москва.

Drabkin А.V., Trofimova M.S., and Babakov A.V. Sept. 1996. Fusicoccin-binding proteins as a pH-sensors in stress. Intern, symp. "On stress and inorganic nintrogen assimylation". Moscow.

8. Drabkin A.V., Trofimova M.S., and Babakov A.V. Feb. 1996. Investigation of fusicocci binding sites lability on the protoplasts from sugar beet suspension culture. Abstrac annual symposium "Physical-chemical basis of plant physiology". Penza.

9. Trofimova, M.S., Drabkin, A.V., and Babakov, A.V. Feb. 1996. Are protein kinas involved in plasma membrane H+-ATPase activation by fusicoccin. Abstracts: annt symposium "Physical-chemical basis of plant physiology". Penza

10. A.V .Drabkin, N.Yu.Abramycheva, L.M.Bartova, V.D.Voblikova, I.L. Drid: A.N.Maisuryan, G.U.Margulis, R.R.Oganyan, V.Babakov, G.S.Muromtsev. 1994, S] Properties of Fusicoccin Receptors and Interaction with Endogenous Ligand frc Transformed Horseradish Root Culture. Abstracts: International Symposium "Pla