Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фузикокцина, эмистима и синтетических регуляторов роста на генетический аппарат сельскохозяйственных растений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние фузикокцина, эмистима и синтетических регуляторов роста на генетический аппарат сельскохозяйственных растений"

РГб од

о ~ V- -;

На правах рукописи

АРТЕМЬЕВА Галина Михайловна

ВЛИЯНИЕ ФУЗИКОКЦИНА, ЭМИСТИМА И СИНТЕТИЧЕСКИХ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА

НА ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

(Специальность 03.00.23 - Биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии .

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ПОЛЯКОВ В.Ю.,

кандидат биологических наук КЛИЦОВ С.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ПРУСАКОВА Л Д.,

кандидат биологических наук КИРЕЕВ И.И.

Ведущая организация - Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится ".............."...............................1997 г.

в.........часов на заседании диссертационного совета Д 020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан «...........»......................1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ¡¿А ' МЕЛИКОВАСА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современных технологиях возделывания культурных растений широкое применение находит перспективный класс средст химизации сельского хозяйства: регуляторы роста и развития растений. Регуляторы роста используются для предотвращения полегания различных культур, защиты растений от стрессовых ситуаций, а также для повышения урожая и улучшения его качества (Мельников.Новожилов и др., 1995).

Однако для некоторых регуляторов роста помимо желательного физиологического эффекта выявлен мутагенный эффект (Хрусталева,1994). Известно,что накопление мутаций у культурных растений способствует ухудшению хозяйственно-ценных признаков и утере сортовых свойств (Шевелуха,Хрусталева и др.,1990). Поэтому особый интерес представляет псиск и изучение новых, экологически чистых регуляторов роста с более высокой физиологической активность, минимальной гектарнсй нагрузкой, низкой токсичностью и генотоксичностью (Кефели, Прусакова, 1935).

К таким перспективным веществам относятся биосинтетические регуляторы роста растений - метаболиты микроскопическая грибов, проявляющие сесй физиологический эффект в мик-рсдозах. Однако встречаемость в природе таких веществ не является гарантией их генетической безопасности: они также подлежат испытанию, хотя база данных, требуемая для их оценки, может быть несколько уже (Гигиенические критерии состояния окружающей среды 104, 1992).

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования было изучение действия перспективных к применению в сельском хозяйстве регуляторов роста растений микробного происхождения и синтетических антистрессовых препаратов на генетический аппарат важнейших сельскохозяйственных растений.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить цитсгенетическое действие регуляторов роста в соматических клетках мягкой пшеницы, ржи, ячменя, гороха и сои.

2. Изучить влияние фузикокцина А на частоту образования сестринских хроматидных обменов в корневой меристеме ячменя.

3. Выявить действие исследуемых регуляторов роста в генеративных клетках мягкой пшеницы.

4. Изучить влияние регуляторов роста на пролиферативную активность клеток первичной корневой меристемы мягкой пшеницы.

5. Выяснить способность регуляторов роста воздействовать на рост первичных проростков пшеницы.

6. Изучить влияние регуляторов роста на динамику транскрипционной активности кластеров рибосомных генов.

7. Оценить влияние фузикокцина А на процессы каллусо- и органогенеза в культуре ткани сои.

Научная новизна работы. Впервые проведена проверка на мутагенную активность применяемых в растениеводстве концентраций фузикокцина А, эмистима, гексафлор&га.и хлофлорама в соматических клетках мягкой пшеницы, ржи, ячменя, гороха и сои.

Впервые проведена сравнительная оценка цитогенетическо-го действия фузикокцина А стандартным анафазно-телофазным методом и методом учета частоты образования сестринских хроматидных обменов.

Впервые установлено повышение фертильности пыльцы у растений мягкой пшеницы, обработанных фузикокцином А и эмис-тимом, при неблагоприятных условиях произрастания: недостатке почвенной влаги.

Впервые показана способность фузикокцина к, гексафлора-та и эмистима повышать интенсивность синтеза рибосомной РНК в интерфазных ядрах клеток корневой меристемы мягкой пшеницы.

Впервые зарегистрирован положительный эффект фузикокцина А в процессах регенерации растений сои in vitro.

Практическая значимость работы. В результате проведенного в работе комплексного анализа действия регуляторов роста на наследственные структуры важнейших сельскохозяйственных растений показана генетическая безопасность фузикокцина А, эмистима, гексафлората и хлофлорама в концентрациях, рекомендованных для практического использования в растение-

водстве, что позволяет рекомендовать их к широкому применению в современных технологиях возделывания культурных растений.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на: 1.Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ленинские горы-95", Москва. 1595; 2. Третьей международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", МоскЕа, 1995; 3. Научной конференция "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии",Москва, 1995; 4. Научном семинаре отдела трансгенных растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, 1997.

Объем к структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорз литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, еыводов и описка литературы. Материалы диссертации изложены на //£ страницах машинописного текста, содержат ЗО таблиц и рисунков, список литературы включает 2/? наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа проводилась на следующих экспериментальных моделях: мужской гаметофит растений яровой пшеницы сорта Мос-ковская-35-, клетки апикальной корневой меристемы первичных корешков оемян озимой пшеницы сорта МиронозскаЛ-808, яровой пшеницы сорта Люба, озимой ржи сортов Чудпан и Татарская-1, ячмене сортов Нутанс-778 и Зазерский-85, горохе сорта Труженик и сое сорта Магева; культура тканей сои сорта Магева.

Регуляторы роста были изучены в концентрациях, рекомендованных для практического использования в растениеводстве, а также на порядок выше рекомендованных: фузикокцин А - 5-1СГ-4М, 1СГ-4М, 5-10"-5М, 1СГ-6М, 1СГ-7М; эмистим, гексафло-рат и хлофлорам - 0,1 мл/л и 0,01 мл/л.

Влияние регуляторов роста на генетический аппарат растений исследовали следующими методами:

1. Метод учета частоты аберраций хромосом в анафазе-те-лофазе митоза клеток первичной корневой меристемы (Туркав и др.,1988).

2. Дифференциальное окрашивание сестринских хроматпд

после инкубации материала б растворе ВгёС (10 мг/л) методом "флюоресценция плюс краситель Гимза" (Регг1,1973).

3. Ацетокарминовый метод учета фертитльности пыльцы (Паушева,1974).

4. Определение митотического индекса клеток первичной корневой меристемы (Паушева,1974).

5. Измерение интенсивности роста первичных корешков на протяжении первых суток роста.

6. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом растений нитратом серебра для выявления активных ядрышкоор-ганивущих районов хромосом (Н1гите е1.а1.,1980).

7. Морфометрический подсчет количества и размера ядрышек на интерфазное ядро (Архипчук и др.,1992) с использованием специально созданной компьютерной программы "Ь-уИ" (Ра1з,К1гееу е1;.а1. ,1996).

8. Морфометрический подсчет некротических и морфогекных зон в культуре тканей растений.

9. Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами. Достоверность отличий между опытными и контрольными вариантами оценивали по критерию Стьюдента (Плохинский,1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние регуляторов роста на генетический аппарат сельскохозяйственных растений.

1.1. Скрининг регуляторов роста на мутагенную активность анафазно-телофазным методом.

В системе проведенного нами первичного скрининга регуляторов роста при выборе концентраций исходили из дозы, рекомендованной для практического использования в растениеводстве, а также на порядок вше рекомендованной. Тест-объекты отбирались на основе реокмендаций кафедры физиологии растений Казанского гос. университета, как наиболее отзывчивые к действию исследуемых регуляторов роста.

Табл.1. Цитогенетический эффект регуляторов роста в клетках первичной корневой меристемы проростков сельскохозяйственных растений.

Препарат Концент- Количество ана^телофаз * ± ГП td

рзция всего с аберрациями

озимая пшеница сорта Мироновская - 808

ФУЗИКОК- 1Q--4M 1101 3 0,272+0,157 0,554

ЦИН А 10"-5М 984 г> >. 0,203+0,144 0,211

10Л-6М 1051 4 0,381+0,189 1,553

1СГ-7М 978 2 0,204±0,144 0,228

КОНТРОЛЬ ---- 1216 2 0,162+0,116 —

озимая рожь сорта Чулпан

ФУЗККОК- 10~-4М 1150 с с 0,174+0,123 0,484

ЦШ А 10"-5М 1113 1 0,089+0,088 0,769

10Л-6М 1037 1 0,097+0,066 0,017

ю-*-™ 941 0 0 1,002

КОНТРОЛЬ ---- 1107 1 0,099+0,099 ----

яровая пшеница сорта Люба

ГМ /т<р ТТЛ / OLVO'lU i*UYL 0,1 мл/л 770 ■1 1 0,13010,129 0,893

0,01 мл/л 381 4- 0,454+0,227 0,559

КОНТРОЛЬ ---- 773 3 0,388+0,224 —-

горох сорта Труженик

эмистш 0,3 мл/л 500 Л 1 0,200+0,199 1,002

0,01 мл/л 522 1 0,192+0,191 1,001

КОНТРОЛЬ ---- 503 0 0 ---

яровая пшеница сорта Люба

ХЛОФЛО- 0,1 мл/л 1292 5 0,3S7±0,163 0,088

?м 0,01 мл/л 1114 1 0,090±0,089 0,712

КОНТРОЛЬ ---- 941 П а. 0,213+0,148 —

озимая рожь сорта Татарская-1

ХЛОФЛО- 0,1 мл/л 1174 2 0,170+0,120 0,184

РАМ 0,01 мл/л ■1197 1 0,084+0,083 0,692

КОНТРОЛЬ ---- 1019 2 0,196+0,139 - —

соя сорта Магева

хлсшга- 0,1 мл/л 600 0 0 0

РАМ 0,01 мл/л 545 0 0 0

КОНТРОЛЬ ---- 510 0 0 0

озимая пшеница сорта Мироновская-808

ГЕКСА- 0,1 мл/л 1016 1 0,094+0,093 0,339

ФЛОРАТ 0,01 мл/л 1-384 0 0 1,439

КОНТРОЛЬ ---- 941 2 0,213±0,148 —

озимая рожь сорта Татарская-1

ГЕКСА- 0,1 мл/л -1230 3 0,244±0,141 0,642

ФЛОРАТ 0,01 мл/л 1315 2 0,152+0,107 0,119

КОНТРОЛЬ ---- 1480 2 0,13510,097 —

ячмень сорта Нутанс- -778

ГЕКСА- 0,1 мл/л 930 1 0,10810,109 0,989

ФЛОРАТ 0,01 мл/л 1128 2 0,177+0,125 0,796

КОНТРОЛЬ ---- 1356 0 0 ---

Фузикокцин , эмистим, хлофлорам и гексафлорат не вызывают повышения уровня аберраций хромосом во всех проанализированных концентрациях в соматических клетках растений, взятых . в качестве тест-объектов. Отсутствие цитогенетического эффекта установлено как для регуляторов роста микробного происхождения - фуаикокцина и эмистима, так и для синтетических регуляторов роста антистрессового типа действия -хлофлорама и гексафлората.

1.2. Изучение мутагенной активности фуаикокцина А методом учета частоты образования сестринских хроматидных обменов.

Более чувствительным тестом на мутагенную активность химических веществ является метод учета частоты образования сестринских хроматидных обменов, позволяющий работать с концентрациями на три порядка ниже тех, на которых установлен кластогенный эффект химических веществ (Карлов,Хрусталева, 1995).

Опыт проводили на семенах ячменя сорта Зазерский-85, проращенных в водных растворач фуаикокцина следующих концентраций: 5<10~-4М, 10"-4М, 5-1СГ-5М, 1СГ-5М. Результаты исследований представлены в таблице:

Табл.2. Влияние фузикокцина А на частоту образования

сестринских хроматидных обменов (СХО) в клетках проростков ячменя сорта Зазерский-65.

* - статистически достоверная разница (Ьд >, 1,96) Фузикокцин в физиологически активных концентрация;: 5* 10Л-5М и 10Л-5М не вызывал повышения частоты СХО пй сравнению с контрольным уровнем. При обработке фузикокцином з концентрации 10"-4М наблюдается увеличение частоты СХО. Фузи-кокцин в максимальной концентрации 5.10Л-4М вызывал значительное и достоверно отличное от контроля увеличение частоты СХО. В вариантах опыта и в контроле не были обнаружены стандартные хромосомные и хроматидные аберрации хромосом, которые обычно имеют место при воздействии мутагенных факторов. В варианте"с обработкой фузикокцином в максимальной концентрации наблюдалось угнетение роста и.утолщение проростков ячменя. Вероятно, фузикокцин в данной концентрации, _ которая является сильно завышенной по сравнению с физиологически активными концентрациями, проявляет некоторый питостатический эффект. Известно, что при одинаковых условиях е культуре животных клеток с более медленным ростом выявляется больше СХО, чем в культуре клеток с более сильной стимуляцией роста (Лекявичус,1983). Таким образом, уровень СХО обусловлен не только мутагенностью изучаемого вещества, но также продолжительностью клеточного цикла и скоростью деления клеток тест-объекта. Вероятно, на фоне увеличения фузикокцином в концентрации 5 • 10Л-4М продолжительности меточного цикла в клетках проростков ячменя возрастает вероятность протекания событий разрыва и воссоединения хроматид, приводящих к образованию СХО.

Концентрация Частота СХО

Контроль 5 •'10"-4М 10--4М 5 •10Л-5М 1СГ-5М

1,157±0,061 9,021*

0,612+0,046 1,900

0,339+0,042 1,577

0,406+0,029 1,497

0,484±0,043

1.3. Влияние регуляторов роста на фертильность пыльцы у растений яровой пшеницы сорта Московская-35.

Растения яровой пшеницы сорта Московская-35 подвергались одноразовому опрыскиванию регуляторами роста в физиологически активных концентрациях на стадии кущекня.

Табл.3.Стерильность пыльцы у растений пшеница сорта

Московская-35, обработанных регуляторами роста.

Препарат Концентрация Стерильность пыльцы,% Ъй

Контроль — 1?,284±1,328

Фузикокцин 1СГ-4М 14,053+1,109 1,868

10"-5М 7,435+0,861 6,223*

10--6М 14.984±1,163 1,304

Змистим 0,01 мл/л 11,б49±0,882 3,535*

Гексафлорат 0,01 мл/л 15,118±1,261 1,182

Хлофлорал 0,01 мл/л 16,107±1,155 0,669

* - статист^вски достоверная разница (¿^ >/ 1,96)

УРОВНЯ стерильности пыльны в варинтах опыта по /-¿ношению к контролю обнаружено не было. Наблюдалась обратная картина - повышения уровня фертильностя пыльцы е ва-рштах опыта. В кпнгрояьном варианте достаточно высокий уровень стери»яости пыльцы: 17,3%. Неооходимо отметить, что вегетационный период 1995 года, когда было проведено данное исследование, характеризовался двумя засушливыми периодами. В частности, почвенная засуха тлела место на стадии закладки колоса яровой пшеницы, что отрицательно сказалось на количественных характеристиках урожая. Известно, что частичное обезвоживание вегетирующего растения привадит к нарушению хода мейоза в генеративных клетках, что в конечном итоге приводит к формированию большого количества стерильных пыльцевых зерен (Сказкин,1957, Балина,1977, Гэлстон.1983).

Фузикокцин в концентрации 10"-5М и эмистим в концентрации 0,01 мл/л достоверно повышают фертильность пыльцы у обработанных ими растений. По литературным данным, фузикокцин и эмистим предотвращают вызываемое засухой падение продук-

тизности сельскохозяйственных культур (Хохлова,Хамидудлина и др.,1995, Драбкин.Клычников и др.,1996). Мы предполагаем, что повышение фузикокцином и эмистимом уровня фертильности пыльцы является одним из возможных механизмов их антистрессового действия.

1.4. Влияние регуляторов роста на интенсивность транскрипции кластеров рибосомных генов.

В клетках первичной корневой меристемы проростков семян озимой пшеницы Мироновская-808 была изучена динамика транскрипционной активности кластеров рибосомных генов с целью оценить влияние исследуемых регуляторов роста на функциональную активность генома растительной клетки на примере изменения функциональной активности рибосомных генов. Известно, что рибосомная РНК является основным продуктом транскрипции эукариотной клетки (Льюин.1937).

Активность генов pFKK в интерфззном ядре можно косвенно оценить по изменению числа и размера ядрышек, которые являются комплексом рибосомных генов и их продуктов (Архипчук и др.,1995).

На протяжении перЕых суток роста проростков озимой пшеницы измеряли количество и суммарный объем ядрышек в интерфазных ядрах. Были обнаружены ядра с четырьмя ядрышками, что соответствует количеству активных ядрьппкоеых организаторов в гоенсме мягкой пшеницы (Flavell, О Dell,1976), таких ядер было около 6%. а также ядра с тремя ядрышками (35%), с двумя ядрышками (около 50%) и с одним ядрышком (£0%). Слияние ядрышек вероятно обусловлено ассоциацией ядрышкоорганизующих районов хромосом (Mukai.,1991). Проращивание семян озимой пшеницы сорта Мироновская-808 в водных растзорах фувикокцина в концентрациях 10'-4М, 10"-5М, 10Л-6М, эмистима и гексафло-рата в концентрации 0,01 мл/л приводит к изменению соотношения интерфазных ядер с разным числом ядрышек в клетках корневой меристемы проростков. Во всех вариантах с обработкой регуляторами роста происходит увеличение доли ядер с одним или двумя ядрышками за счет снижения доли ядер с тремя и четырьмя ядрышками. Особенно ярко данный эффект выражен в варианте с обработкой фузикокцином в концентрации 1СГ-5М: за

период времени от начала прорастания семян до окончания первых суток роста проростков количетство ядер с одним ядрышком возросло на 83%, а количество ядер с тремя и четырьмя ядрышками упало соответственно на 100% и 83%. Вероятно, вызванная регуляторами роста тенденция к слиянию ядрышек обусловлена активацией ими ассоциации ядрышковых организаторов.

Влияние регуляторов роста также сказывается на изменении суммарного объема ядрышек на ядро. Математическая модель процесса в виде усредненной теоретической линии прямолинейной регрессии, полученной методом наименьших квадратов (Пло-хинский,1978) представлена на рисунках 1 и 2.

В процессе роста первичного корешка происходит изменение суммарного объема ядрышек на ядро: в контрольном варианте, а также в варизнте с обработкой фувикокцином в концентрациях 1СГ-4М и 1СГ-5М наблюдается уменьшение суммарного объема по мере роста проростков. В вариантах с обработкой фузикокцином в концентрацга! 1СГ-6М как и в вариантах с обработкой гекоашлоратом и эмистимом суммарный объем ядрышек на ядро возрастает по мере роста проростков н через 44 часа от начала замачивания семян становится выше контрольного уровня (см.рис.1 и 2).

Исходя из существования корреляции между размерами ядрышка и метаболической активностью клетки (Саламатоза,1983) мы предполагаем, что исследуемые регуляторы роста способны повышать интенсивность синтеза рибосомной РНК в меристемных клетках проростков озимой пшеницы сорта Мироновская-808.

Увеличение размеров ядрышек в ядрах клеток обработанных растений может быть обусловлено несколькими причинами. Возникает вопрос: не происходит ли под действием регуляторов роста активации дополнительных, копий рибосомных генов или латентных ядрышкоеых организаторов в геноме пшеницы. Используя метод серебрения активных ядрышкоорганизующих районов метафазных хромосом озимой пшеницы сорта Мироновская-808, определили:под действием регуляторов роста не активируются латентные ядрышкоорганизующие районы в геноме озимой пшеницы. Во всех варинтах опыта и в контроле наблюдали только два активных ядрышкоорганизующих района: хромосом 1В и 6Б.

Раэмерьп. • активно работающих ядрышковых организаторов

Рис Л. Динамина суммарного объема ядрнвек в интер^азных ядрах клеток корневоП меристемы семян озииоП пшеницы сорто 1!ироновская-803, обработанных }узикокцинои.

90

84

>78

3 72

о

о

! 66

5б0

54

о

о о А

- -

■_ о _ □ ___ О ———А |г " л:______ ^__о- - ----Я .".Г

. - -о" о о 0

А о

22 26 30 34 38

Время (ч)

42

46

"-о^ КОНТРОЛЬ

С ок ю ¿и

■ОК Ю"°И

Рис.2. Динаиина супмарного объема ядрипек в интер5азных ядрах клеток корневол черкстены сеиян озимо"! пизннцы сорта Еиронозсная-308, обработанных зиисг.шоя и Г8кса*яорсток.

90 85 80

1 75

2

= 70 г

й 65

0

1 60

22 26 30 34 38 Время (ч)

42

46

КОНТРОЛЬ ^ ГЕКСАХЛОРАТ

^ эмистим

остаются практически неизменными как в контроле, так и в вариантах опыта:

Табл.4. Измерение ядрышкоорганизующих районов (ЯОР) хромосом пшеницы сорта Мироновская-808 в клетках корневой меристемы семян,обработанных регуляторами роста.

Препарат Концентрация Отношение ЯОР к td

длине хромосомы

Хромосома 1Е

Контроль — 0,17 —

Фузикокцин 10Л-5М 0,19 0,013

Эмистим 0,01 мл/л 0,16 0,006

Гексафлорат 0,01 мл/л 0,19 0,012

Хромосома 5Е

Контроль — 0,26 —

Фузикокцин 10"-5М 0,23 0,0iS

Эмистим 0,01 мл/л 0,25 0,005

Гексафлорат 0,01 мл/л 0,28 0,012

Показано, что фузикокцин стимулирует синтез РНК в системах in vitro, действуя непосредственно на фермент РНК-по-лимеразу и не затрагивает матричную активность хроматина (Муромцева,1990). Наши результаты,полученные на проростках семян, не противоречат установленным данным о механизме действия фузикокцина.

2. Влияние регуляторов роста на ростовые процессы у растений озимой пшеницы сорта Кироновская-808.

Учитывая тот факт, что в настоящей работе предметом оценки цитогенетического действия являлась специфическая группа веществ, обладающих ростстимулирушщими свойствами, параллельные наблюдения предусматривали определения их влияния на ростовые процессы у озимой пшеницы.

Кзк известно, рост растений происходит главным образом за счет двух процессов: пролиферации клеток и роста клеток в

результате растяжения (Иванов.1987). В растениях в течении всего периода жизни сохраняются гоны с растущими эмбриональными тканями. В этих зонах, называемых зонами роста или апикальными меристемами, протекают интенсивные процессы обмена веществ (Калинин,1984).

Б качестве интегральных показателей, отражающих эффект изучаемых регуляторов роста, определяли динамику и уровень митотической активности клеток корневой меристемы озимой пшеницы и динамику роста первичного корешка.

Для определения данных параметров семена пшеницы проращивали в водных растворах фузикокцина, эмистима и гексафло-рата в тех же концентрациях, что и в предыдущем опыте. Длину первичного корешка и уровень митотической активности определяли через каждые четыре часа от момента прорастания семян и на протяжении первых суток роста проростков.

Фузикокцин в концентрациях 1СГ-4М и 1СГ-5М значительно стимулирует начальный рост проростка (см.рис.За). Через 4-8 часов от начала прорастания эффект фузикокцина несколько ослабевает, но сохраняется на протяжении первых суток роста проростков: длина проростков в вариантах опыта достоверно превышает контрольный уровень. Однако обработка фузикокцином в концентрации 10"-6М не вызывает стимуляции прорастания первичного корешка. Ростстимулирущий эффект фузикокцина в данной концентрации проявляется только к 40 часам от начала замачивания семян.

Способность фузикокцина стимулировать прорастание семян показана для широкого круга объектов (Обручева,Антипо-ва,1988, Муромцев,Горбатюк,1994, Фролова,1995, Lado et.al.,1974, Ballio et.al.,1981). Его действие включает в себя активацию Н -АТФазу плазмалеммы, гиперполяризацию мембраны и экскрецию протонов в среду клеточной стенки, что приводит к ее разрыхлению и растяжению (цит.по Кунаевой, 1995). Отмечается, что фузикокцин не оказывает влияния на митотическую активность клеток (Yamagato et.al., 1975).

По результатам нзших исследований, фузикокцин во всех проанализированных концентрациях вызывает достоверное повышение числа делящихся клеток корневой меристемы озимой пшеницы сорта Мироновская-808 через 32 часа от начала замачива-

кия семян (концентрация фузикокцина 1СГ-4М) и через 32 и 36 часов от начала замачивания семян (концентрация фузикокцина 1СГ-5М, 1СГ-6М) (см.рис.36). Показано, что фузикокцин способен имитировать некоторые физиологические эффекты как ауксинов, так и цитокининов (Муромцев и др., 1980). В наших исследованиях фувикокцин сочетает эффект ауксина - вызывает усиление растяжения клеток к цктокинина - стимулирует деление клеток, обнаруживая сходство с гибйереликом. По аналогии с механизмом действия экзогенного кинетина, который вызывает возрастание скорости роста корней гороха и увеличивает на несколько процентов митотическую активность меристемы за счет сокращения на 30% фазы клеточного цикла (Гудков, 1685) мы предполагаем: фузикокцин, ускоряя процесс растяжения меристемных клеток, сокращает интерфазу и таким образом повышает число клеток, вступающих в митоз. Это влияние наиболее ярко выражено через 8-12 часов от начала прорастания семян.

Гексафлорат в концентрации 0,01 мл/л подобно фузикокци-ку достоверно повышает митотическую активность меристемных клеток проростков озимой пшеницы сорта Мироновская-808 через 8-12 часов от начала прорастания семян, однако это повышение митотической активности не сопровождается интенсификацией роста проростков (см.рис.4а,б).

Повышение фузикокцином и гексафлоратом митотической активности меристемных клеток ке сопровождается изменениями б распределении клеток по фазам митоза.

Змистим е концентрации 0,01 мл/л вызывает слабую активацию прорастания семян озимой пшеницы и ке влияет на проли-феративную активность меристемных клеток, а также на интенсивность роста проростков (см.рис. 4а,б).

3. Эффект фузикокцина А в культуре тканей сои.

В последние годы активно ведутся исследования по доказательству гормональной природы фузикокцина. Совокупность полученных на сегодня данных позволяет заключить, что фузикокцин претендует на роль фитогормона (Муромцев и др.,1986, Муромцев и др.,1987, Муромцев,1996). К настоящему времени не выявлено его действие и возможное применение при культивиро-

%

200-1 180

РисЗ. Влияние фузикок-цина на ростовые процессы у гшеницн:

а) динамика прорастания семян в % по отношению к контролю (контроль взят за 100%),

б) динамика митотическоЯ активности клеток корневой меристемы проростков.

* - статистически достоверная разница между контролем и опытом, К - контроль, обработка $узикокциног," в концентрации:

1 - юЛ\

2 - Ю"5!,!,

3 - 10

-6„

44 ^,часы

Рис.4. Влияние эмистима и гекса^лората на ростовые процессы у пшеницы:

а) динамика прорастания семян в % по отношению к контролю (контроль взят на 1002),

б) динамика митотическоЯ активности клеток корневой меристемы проростков.

*- статистически достоверная разница между контролем и опытом, К - контроль,

1 - обработка эмистимом в концентрации 0,01 мл/л,

2 - обработка гекса*лора-том в концентрации

0,01 мл/л.

44 1,часн

вании.

Нами была предпринята попытка сравнить действие фузи-кокцина и некоторых стандартных фитогормонов в культуре тканей сои. На сегодняшний день известно очень мало работ, описывающих каллусогенез и регенерацию у сои , одной из важнейших зернобобовых и масличных культур (Гамаденец и др.,1989).

Создание подходящего уровня экзогенных гормонов - необходимое условие,как правило разрабатываемое эмпирически, для получения каллуса и регенерации растения (Дмитриева,1981), В опыте использовали стандартные среды Мурзсиге-Скуга с разным гормональным составом: фузикокцин использовался в концентрациях 10"~5М и 1СГ-6М, контролем служила среда, содержащая нэфтилуксусную кислоту (НУК) е концентрации £ мг/л.

Фузикокцин не вызывал индукции каялусообрааования у сок. Первоначально каллусы индуцировали на среде, содержащей 2 мг/л НУК и 0,5 мг/л кинетина, затем, культивировали на средах с фузикокцкком.

Фузикокцин в концентрации 10"-6М поддерживал достаточно интенсивный рост каллуоной ткани сои, однако его активность была несколько ниже по сравнению с НУК.

Существенное влияние фузикокцин оказал на последующие морфосбравовательные процессы в казлусной ткани сои. Каллусы, растущие на среде с фузикокцином б концентрации 10Л-6М, формировали в 4 раза больше морфогенных участков, чем контрольные. При длительном пассировании на среде с фузикокцином снизился уровень некротизации и гибели каллуоной ткани, что также положительно повлияло на морфогенез. Скорость нарастания сырой массы ткани была несколько ниже, чем в контрольном варианте, благодаря усиленным процессам гисто-дифференцировки.

Способность каллусных клеток к морфогенезу определяется балансом фитогормонов, создаваемым в каллусных клетках и зависит как от уровня эндогенных фитогормонов, так и от обеспечения каллусных тканей экзогенными фитогормонами и .наконец. от способности культивируемых клеток к рецепции и реакции на гормональные факторы (Бутенко,Катаева,1983). По результатам наших исследований, клетки каллуса сои оказались восприимчивы к фузикокцику в большей степени, чем к НУК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что регуляторы роста нового поколения: фузикокцин А, эмистим, гексафлорат и хлофлорам не обладают кластогенным действием в соматических клетках мягкой пшеницы, ржи, ячменя, гороха и сои в концентрациях, рекомендованных для практического использования в растениеводстве и в концентрациях на порядок Еыше рекомендованных.

2. Фузикокцин А в концентации 1СГ-5М и эмистим в концентрации 0,01 мл/л повышают фертильность пыльцы у обработанных ими растений яровой пшеницы сорта Московская-35 в неблагоприятных условиях произрастания: недостатке почвенной влаги', что подтверждает известные данные об антистрессовом эффекте этих веществ.

3. Использование морфометрического подхода (компьютерный анализ светооптического изображения) для изучения активности синтеза рибосомной РНК в интерфазных ядрах клеток первичной корневой меристемы озимой пшенищл сорта Мироновс-кая-808 свидетельствует об интенсификации синтеза рибосомной РНК при обработке семян фузикокцином А в концентрации 10Л-6М, эмистимом и гексафлоратом в концентрации 0,01 мл/л.

4. Используя в качестве критерия относительные размеры активно функционирующих ядрышкоорганизующих районов метафаз-ных хромосом озимой пшеницы сорта Мироновская-808 показано, что обработка фузикокцином А, эмистшом и гексафлоратом не приводит к активации дополнительных кластеров рибосомных цистронов.

5. Фузикокцин А в концентрации 1СГ-6М вызывает 4 кратное увеличение количества морфогенных зон в культуре каллуснои ткани сои, что указывает на положительное влияние данного регулятора роста в морфообразовательных процессах при культивировании in vitro.

6. Фузикокцин А и гексафлорат оказывают стимулирующее воздействие на ростовые процессы у озимой пшеницы сорта Ми-роновская-808: - фузикокцин А в концентрациях 10Л-4М, 10"-5М

1 я

и 1СГ-6М повышают интенсивность начального роста проростков семян, - фузикокцин А в концентрациях 1СГ-4М, 10"-5М и 10"-6М и гексафлорат в концентрации 0,01мл/л увеличивают пролиферативный пул клеток корневой меристемы, не оказывая влияния на распределение клеток по фазам митоза.

7. фузикокцин А в концентрации 5-1СГ-4М вызывает повышение частоты сестринских хроматидных обменов в клетках первичной корневой меристемы ячменя сорта Зазерский-85.

Полученные в работе результаты показывают, что фузикокцин А, змистим, гексафлорат и хлофдорам не вызывают аномалий хромосом, тестируемых стандартными цитогенетйческими методами у ряда сельскохозяйственных растений, что позволяет считать данные регуляторы роста экологически безопасными.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Хохлова Л.П., Артемьева Г.М., ЯвшевБ.Г., Гараева Р.Г., Ермолаев А.К. Цитогенетический анализ действия и последействия синтетических антистрессовых регуляторов роста картолика-2 и оксикарбама на сельскохозяйственные культуры // Агрохимия. 1392. N 10. С.104-109.

2. Гараева Р.Г., Хохлова Л. П., ЯвшевБ.Г., Артемьева Г.М. Влияние бактериальной рибонукдеазы на продуктивность ярового ячменя, озимой пшеницы, гречихи и цитогенетическая активность ферментного препарата // Биологические науки. 1932. N 2. С.121-125.

3. Семенов В.В., Иванов А.Б., Имамов А.Х.. Артемьева Г.М. "Методические рекомендации по биошщикации мутагенного фана внешней среды на бысших растениях". Казань, 1393, 17с.

4. Клицов C.B., Артемьева Г.М., Хохлова Л.П., Явишев Б.Г. Влияние регуляторов роста нового поколения на генетический аппарат сельскохозяйственных растений // 3 Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Тезисы докл. М.,1995, С.1S0-191.

5. Артемьева Г.М., Клицов C.B., Хенаро Рейес. Генетический эффект фузикогацша и эпибрассинолида у злаков // Конф. "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Тезисы докл. М.,1996.С.6.