Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация эндогенных фузикокцинов и фузикокцин-подобных веществ в цветковых растениях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация эндогенных фузикокцинов и фузикокцин-подобных веществ в цветковых растениях"

г> г С | I О

- 6 Шн {СГ7

На правах рукописи

ВОБЛИКОВА Вера Дмитриевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭНДОГЕННЫХ ФУЗИКОКЦИНОВ И ФУЗИКОКЦИН-ПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Научный руководитель — доктор биологических наук, академик РАСХН Г. С. Муромцев.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Э. П. Серебряков; кандидат химических наук П. Б. Курапов.

Ведущая организация — Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита состоится............ 1997 г.

в ...... час. на заседании диссертационного совета

Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Автореферат разослан

^иЛ^уги^^Ь. 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ ' сельскохозяйственной биотехнологии.

Ученый секретарь диссертационного совета — к. б. н.

Меликова С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЮТН Актуальность проблемы. Одним из важних направлений биотехнологии является разработка методов оинтвза регуляторов роотя растений (РРР) и их использование в практики рпотениеводствя. Из природных РРР наиболее изввотны фитогормоны.

Применения РРР в нястоящее время отало неотъемлемым элементом современных технологий возделывания сельскохозяйственных культур. На передний план выходит применение биооинтетических РРР, отличающихся низкими дозами ряохода, малой стабильностью и токоич-ноотью, что учитывает требования экологии. Поиок подобных оое-динений, иооледование их физиологической активности и механизмов дейотвия ооотавляют первоочередные этапы в создании новых РРР.

Одним из сравнительно новых биссинтетичеоких РРР является фузикокцин ( ФК ) - метаболит фитопатогенного гриба Funicaaatim amygdali Del.(Ballio et al., 1964). Исследования физиологической яктивнооти ФК выявили, что он сильно отимулирует роот изолированных частей ряотений, уоиливяет транапирацшп яя очет раскрытия устьиц, способствует выведению оемян из ооотояния покоя и уоилению их прораотания (Магге, 1979), индуцирует корнеобра-зовяние (Султонов, Муромцей, 1965) и т.д. Эффекты ФК овязаны о якт1шацией выброса протонов из клеток во внеклеточное проотрянот-во, увеличением ион-транопортирующей опоообнооти плязмалеммн, входом внутрь клеток осмотически активных веществ. Соглаоно пооледним данным ФК влияет кяк на активнооть Н+-АТФ-азн (De Michelle et al., 1991; Johanaon et al.,1993; LanfermeiJer and Prina, 1994), так-и на проводимость калиевых каналов ттлазмалеммн (Blatt and Clint,19Ö9). Одно из наиболее ярких свойств ФК - его янтиотрвооовое дейотвие. ФК повышает всхожесть оемян в уоловиях, неблагоприятных для прораотания: при выоокой и пониженной температурах, избыточном увлажнении, при заоолении ( Гунавярдвня и др., 1990; Вольнова и др., 1992; Леонова и др., 1994).

Характер биологичеокой яктивнооти ФК, типичный для фитогормонов, позволил ряооматривать его кяк их физиологический аналог ( Muromtaev, 1996 ). Велико оходство ФК о другими фитогормонвми, многие из которых как и ФК являютоя терпеноидями и тяюке синтезируются фитопатогенными грибами. Отметим, что характерное трицикличеокое отроение молекулы отнюдь ня являетоя уникальным и встречается на только ореди грибов, но и низших

раотвний (бурые водорооли), выоших раотвний (цветковый, печвноч-ники, папоротник) и даже насекомых (Muromtsfiv fit al., 1994). Это обстоятельство, наряду о широким распространением рецепторов ФК р различных видах и органах раотений (Aduoci at al., 1995) дает ооиовпния для предположения о том, что в раотен'иях должна Функционировать гормональная оиотемя на ооново фузикокцин-подобных лигандов(ФКПЛ).

Вой вышесказанное поолужило оонованием для проведения иооледо-вяиий по поиску в ряотениях эндогенных фузикокцинов и/или фузи-кокцин-подобных веществ (ФКПВ), физиологичеоких аналогов ФК. При проведении такого рода иооледований оообое значение приобретают иопользуимын методы выделения и идентификации. Привлечение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии ( ВЭЖХ ) при выделении и очиотке активных компонентов, в также таких выооко-чувотвительных аналитических методов, как радиорацвпторный, радиоиммунологичеокий и мяоо-опектрометричеокий, позволило нам продвинуть решение этой оложной поисковой задачи. Цель И задачи исследований. Целью наотоящей работы явилоя поиок эндогенных ФК и фузикокцин-подобных вещеотв в цветковых растениях,разработка методов их виделения.очиотки и идентификации.

В задачу работы входило:

1. Получить ФК А о выоокой степенью очиотки для использования в квчеотве стандартного вещйотва, а также для получения антител к ФК, меченого ФК и рядя других его производных. .

2. Разряботять методы выделения и очиотки ФК и ФКПВ из растительного мятерияля.

3. Разработать методы идентификации эндогенных ФКПВ,полученных из растительных экстрактов, на оонове ужа имеющихся методов анализа ФК А, включающих биотеотироввние, радиоиммунологичеокий (РИА) и радиорецепторный (РРА) методы, а также метод хромато-маоо-опектрометрии (Га/МС).

4. Провеоти скрининг ФК и фузикокцин-подобных лигандов (ФКПЛ) в различных раотителыгых объектах: интактные рвотенил, культуры траногенных раотений, я также раотения, находящиеся на разных отвдиях онтогенеза.

Научная новизна работы. Впервые в высших растениях "(початки и корни кукурузы,лиотья и центральная чвоть отебля кочанной капусты, незрелые плоды томптя, тряногенные корни хрена ) был обнаружен

эндогенный ФК А и некоторые его аналоги. Впертое для обнаружения и идентификации эндогенных ФКГОГ был применен комплеко аналитических методов, включающий ВЭЖХ при фракционировании растительных экстрактов; РИА и РРА гтри проведении скрининга ФКГТ.Я в полученных фракциях, и метод Га/МС в режиме селективного детектирования при идентификации ФК А в микроколичеотвях. В результате проведенного окрининга ФКШТ были обнаружены в интактных раотениях (кукуруза, капуста, томат, хрен, огурец) и культуре траногенннх раотений(хрен,алтей,люпин), а также в осевых органах семян конского каштана на разных стадиях их развития.Обнаружение эндогенных веществ фузикокциновой природы в растительных экстрактах существенно расширяет нами знания о механизмах химической регулящпг в раотениях и тем самым отавит вопрос о возможной фитогормоналъной природе фузикокцина.

Практическая значимость работы. Разработанная схема выделения и идентификации ФК и ФКПЛ в растительных объектах может быть использована в исследованиях по изучению механизма дейотпия ФК А. Установление эндогенной природы ФК А и ФКПВ позволяет разработать научно-обоснованные технологии применения фузгасокциня в растениеводстве. Предлагаемая методика может быть успешно применена при определении остаточных количеств экзогенного ФК при его применении в раотениеводотве в полевых условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации были предотавлянн на X и 11-й Воеооюзннх конференциях "Регуляторы роста и развития растений ( Мооква, Т^ЙТг. и Киев, 19Ввг.); на Меэдународном симпозиуме "Прием и передача сигналя растительным гормоном"(Москва, Г994г.); на ГО—м Конгрессе Европейского научного общества физиологов растений ( Флоренция, Т996г. ); на конферентгии "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, Т996г.).

Публикации. ГТо результатам выполненных исследований опубликовано Т5 печатных работ.

Структура И объем работы. Дисоертяционная работа соотоит из введения, обзора литературы, экспериментальной чаоти, включающей описание материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 96 страницах магахтнописного текота, содержит 27 рисунков и 3 таблицы.Список .литературы включает 123 наименования,

из них 101 работа зарубежных авторов.

0ВДК.ТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качеотве растительных объектов были попользованы корни и Початки в стадии молочно-восковой спелости кукурузы ÍZna тауг. Ь.) сорта Стерлинг; лиотья и стебель ( центральная часть ) кочанной капусты ( Вгаяяf са о 1 eraona I,. ) сортов _ Зимовка 1474 и Амагер; незрелые плоды томата ( L í cnpnrRi поп naoulRtitum Mill. ) сорта

Wiranto; корни проростков огурца (Guoumîn nativa Т,.); осевые органы проростков конокого каштана ( Авяои1ия hiррппапtanum Ь. ) ( предоставлены д.б.н. Н.В.Обручевой ); корни хрена ( Armnracia runtiaana Р.); культура трансгенного корня хрена ( предоставлена д.б.н.. А.Н.Майсуряном ); культура трансгенного корня алтея лекарственного ( Althaeea■ offíoinalin Ь. ) и люпина ( Lupir.nr, polyphyllun l'j. ) (предоотавлены к.б.н. И.Н.Кузовкиной ).

Фузикокцин А выделяли из культуральной жидкооти ( КЖ ) гриба Fusicooeum amy ad а\i Del., используя методику Баллио о ооавт. (ВаШо et al., 1464). ■ В работе использовали ("%]дигидрофузикокцин с молярной радиоактивностью 3.0 'ТВк ммоль, полученный в Институте молекулярной генетики АН РАН.

. В работе использовались различные виды хроматографии (АйЬазов, 1983;Высокоэффективная жидкоотная хроматография в биохимии ,19В8): колоночная хроматография (Ка) на силикагеле или флоризиле, тонкоолойная хроматография на оилуфоле (ТСХ), -выоокозффе.ктивная жидкоотная хроматография (ВЭЖл). ВЭЖл осуществляли на приборах фирмы "Du Pont" серии 8800 и фирмы "Gil.son", снабженных компьютерной оистемой, о УФ-детектором.

Анализ методом Га/НС в режиме селективного детектирования проводили на масс-спектрометре М-80А фирмы "Hitachi" (Садовская и Др.1986).Кроме того маос-спектры были сняты в Институте биобрга-нической.химии на приборе 1KB- 9000; Ж-спектр был записан на спектрографе UR-I0 в вазелиновом маоле; ПМР-спектр на приборе Vnrlan-XL-Í00A.

Плазматические мембраны выделялись из корней 4-дневных проростков кукурузы сорта Няднепрянская. Изолированные мембраны суспендировали в 5 МЫ Trin-HCl, рН 7-3. 1 MM EDTA, 40Ж глицерине и хранили при -20°С. Измерение связывания [%]дигидроФК о плазматическими мембранами проводили в соответствии с методикой Бабакова

о оотр.(Abramycheva et al., 1991).

Для получения антител к ФК А попользовали конъюгат ФК о БСА, полученный к.х.н. Г.Г.Кривцовым по известной методике(Feyerabend, Weiler, I987). Поликлональнне антитела к ФК бнли получены к.б.н. Бартовой Л.М. о оотр. путем иммунизации кролшсов конъюгатом ФК-БСА в полном адъюванте Фрейнда.По данным РИА титр сыворотки равен 1:2000. Связывание [*%]дигидроФК о антителами проводили в физиологическом растворе в течение 60 мин. при комнатной температуре. Пооле инкубации добавляли равное по объему количеотво 10$ ТХУ и оовобождалмоь от неовязавшейоя метки на нитроцеллюлозных фильтрах вакуумной фильтрацией.При определении неопецифичеокого овязывания [^Н]дигидроФК в среду измерения вносили свободный ФК или использовали равное количество контрольной сыворотки(Babakov et я1.,1994).

Для биотеотирования использовали 2 специфичных для ФК А теота. Тест на токсичеокое дейотвие ФК А по отношению к черенкам томатов (Botallico, 1971),для которого использовали орезанные черенки 30-дневных растений оортя Белый налив или Прогресо.и теот на удлинение апикальных отрезков корней кукурузы сорта Одесская 10 или гибрида Днепровский 505 (Муромцев и др., 1980).

Статистичеокая обработка -результатов. Каждый опыт проводили от 2 до 10 раз в трех- или пяти-кратной биологических повторноотях. На рисунках приведены данный одного характерного опыта. Все данные обрабатывали отатистически, раосчитывая требуемые па-параметры, и оценивали достоверность разницы на 5% уровне значимости.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение ФК А из культуральной жидкости гриба Fusicoccum amygdali. ФК А выделяли из культуральной жидкооти(КЖ) гриба-продуцента по схеме, более, упрощенной по сравнению оо охемой, огпюанной в литературе (Balllo et al., ¡964). С этой целью КЖ экотрагировали хлороформом, а йятем экотракт хроматографировяли о помощью КХ ня флоризиле. Элюцией экотракта смесью раотворителей хлороформ:изо-пропанол (9:1) была получена фракция, содержащая ФК А. Пооле перекристаллизации из этилацетата был выделен кристаллический ФК А и определены его физико-химичеокие параметры (температуря плавления, ПК-, ГМР- и MC-спектры). Вое полученные данные подтвердили идентичность полученных кристаллов и стандартного ФК А. Биологичеокая активнооть полученного ФКА не отличалаоь от описанной в литературе.

В дальнейшем полученный препарат ФК А очищался о помощью многократной перекристаллизации из ацетона, чистота определялась о помощью методов ВЭЖХ и ГХ/МС и соотявила

-.. Полученный таким образом ФК А служил исходным материалом длл получения [%]дигидроФК, конъюгата ФК-БСА для получения антител, а также в качестве Аутентичного соединения для воех аналитических методов (ВЭЖХ, РИА, РРА, ГХ/МС). Схема выделения ФК А из КЖ грибя-продуцентя была взятя зя основу в экспериментах по выделению эндогенного ФК А из растений.

Предварительный эксперимент по выделению ФК А из растений.

Для выявления возможностей применяемых в работе методов выделения, очиотки и идентификации ФК А из растительных экстрактов был проведен модельный эксперимент.суть которого заключалась в следующем: в хлороформный экотракт вносили стандартный ФК А в концен-тряциях от 10 до 10~ г/г экстракта; экотракт хроматографировяли по схеме 1 (рио.1), элюируемые зоны тестировали о помощью биотестов и.ГХ/МС. Методом ГХ/МС ФК А был обнаружен для воех концентраций* внесенного ФК А в зоне, соответствующей ФК А ( хлороформ:изо-пропанол), я также иногда и в сооедких с ней зонах (вымываемых о колонки хлороформом и этилацетатом). Результаты анализа фракций в биотесте на удлинение апикальных отрезков корней кукурузы показали присутствие ФК А лишь в зоне ФК А в опыте о внесением 10-^г ФК А/ г экотрвкта. В биотеоте о черенками томатов фузикокциновый аффект наблюдался в зоне ФК А независимо от концентрации внесенного в экотракт ФК А.

В аналогичном эксперименте, но без внесения экзогенного ФК А, ни одна из элюируемых о колонки зон не показала в обоих биотеотах физиологической вктивнооти, подобной ФК А, а о помощью ГХ/МС были обнаружены следовые количества ФК А в зоне.вымываемой смеоью хлороформ : изопропанол=9: I: ,

Таким образом, предварительные эксперименты показали нецелесообразность применения биотеотов для идентификации эндогенного ФКА из-за их низкой чувствительности, а также недостаточную эффективность КЗС и чрезмерную длительность процеооа очистки, что крайне нежелательно при рабате о нестабильными веществами.

Обнаружение ФК в растительных экстрактах высших растений.

Результаты, полученные в предварительном эксперименте, привели нао к поиску других хроматографичеоких методов, позволяющих кон-

центрировать выделяемый материал о одновременным увеличением степени очистки и уменьшением длительности процесоа выделения. Таким методом оказалаоь ВЭЖХ.В качестве аналитического метода в дальнейшей работе был применен метод ГХ/МС в режиме оелективного детектирования, при котором обнаружение компонентов омеои осуществляется по нескольким выбранным характеристическим ионам. Этот метод, наиболее чувствительный из всех масо-опектрометричеоких методов, имел предел детектирования ФК А ня уровня 5-20кг в пробе,что очень важно при работе с микроколичеотвями. Для детектирования ФК А были выбраны ионы масс-спектра его тетра-триметилоилильного производного (ТМС) о m/z 253, 289, 349, 385, 409, 535 и 715.

В качеотве растительных объектов были взяты корни и початки кукурузы сорта Стерлинг и лиотья кочанной капуоты сорта Зимовка

Рис. I Схема выделения и идентификации эндогенных фузикокцинов А, С и ФТСПВ.

(I, 2, 3) - разные модификации схемы выделения ФК и ФКПВ.

1474. Экотрвкцию проводили в соответствии со схемой 1 (рио.1). Фракцию, вымываемую смеоыо хлороформ:изопропанол=9:1 и содержащую ФК А по нашим предварительным данным (зона ФК А), далее хромято-графировяли о помощью ВЭЖХ ня колонке с обращенной фазой ZorhaxCR (4,6x250 и 9,4x250мм), температура п колонке 50°С, детекция при 230-240HM. Последовательное деление проводи.™ в изократичеоком режиме, используя смеси растворителей MeOll/H^O (65:35 и 60:40) и ACN/Hg0(60:40) при скорости потока 1мл /мин. или 4мл/мин.соответственно в зависимости от внутреннего диаметра колонки. Отбирали фракцию, соответствующую по времени выхода о колонки аутентичному ФК А и зятем анализировали ее о помойся ГХ/МС (схема 1, рис Л).

Ня всех отядиях работы стопились контрольные опыты ня отсутствие ФК А в используемых реактивах и аппаратуре во избежание артефакта.

В результате проведенной работы, в растительном материале, полученном из корней и початков кукурузы и листьев капусты, был обнаружен ФК А, что следует из масс-фрагментогрвммн, приведенной и!} рио.2. Как видно из рисунка, масо-фрагментогрвммн исследуемых фракций оказались идентичны мэсс-фрагментогрямме аутентичного ФКА (рио.2,А) . как по времени выходя пиков о m/z 253, 289, 349, 385, 409, 535 и 715, тяк и по их относительным интенсивностям. .Кроме того,чвстичннй маоо-опектр,снятый в диапазоне от 200 до 800а.е.м., ТНС-произгшдного содержимого ВЭЖл-фракции,полученной из экстракта лиотьев капуоты, практически совпадает с мяос-оцектром ТМС-ФК А, снятому в тех же условиях (рис. 3 ).

Таким образом, совокупность хроматографических и масс-спектро-метричеоких данных убедительно свидетельствует о присутствии ФК А в экстрактах, полученных из корней и початков кукурузы и листьев капуоты. Раочет площадей пиков масс-фрагментограмм по сравнению с образцом аутентичного ФК А показал, что ФК А был обнаружен в количествах примерно 10 г/кг сырой массы корней и початков кукурузы и Ю-® г/кг листьев капусты.

В дальнейшей работе схема выделения (1)(рио.1) была несколько модифицирована, что позволило обходиться небольшими количествами растительного материала ( 1-3 кг сырой массы ), если исключить стадию Ka и использовать метод БЗЖл непосредственно для фракционирования растительных- экстрактов, т.к. он значительно сокращает длительность очистки по сравнению с Ka и существенно уменьшает

Рис.2 ¡¿асо-фрагыентограммы.

ФК А: в аутентичном ЗК А. 4нг (А),

в листьях капусты (Б), в корнях кухутзузы (Б), в початках кукутузы (Г), в стебла капусты (Д), в незрелых плодах томатов (Е).

о -

Рй'о. а Частичный мясо-ппектр тетря-ТМС-ФК А в ВЭЖХ-фракции из

экстракта листьев капуоты(п) и аутентичный тетра-ТМС-ФК А(Ь).

¥гоТерИ ни стадии хроматогрпфировамия. Поэтому впооледствии мы ■йополъзовилй схему выделения (2), представленную нп риа.Т. В йтом случай хлороформный экстракт переряствсрлли п смели МнОН/Н^О (в соответствии о используемой алюируюшей смесью), отделяя нерастворимый освдок, и хроматогрнфировнли о помощью ЮЖХ в изократи— чео.ком режиме. По этой лхрЛир. были обработянн абстракты из корней "кукурузы сорта Стерлинг, листьев и стебля кнпуптч сорта Амагер, и "незрелых плодов томата оортя Р1 УПгяпЪо. В результате ВЭЖХ хрома-тографировяНш» этих экотрактов были исследованы зоны ФК А этих объектов, в КпторИх ФК А был идентифицирован о помощью ГХ/МС. Следует отметить, что Во фракции, выделенной из отебля капусты (рио.2,Д) приоутствует не только ФК А, Но отчетливо видно наличие прими пи другого ввщестйя фузикокщгновой природы (по времени выхода о колонок ВЭЙХ п ГХ, а также по Характеру пиков ионов его маоо-спекТря).

В некоторых экспериментах кроме фракции, соответствующей времени исходя ФК А о колонки ВЗНОС, отбирали и фракцию, соответствующую ФК С (схема 2 на рис Л), которую далее исследовали Г7/МС на присутствие ФК С По характеристическим пикам спектра его Пентв-ТМС-НроизвоДНого О т/я 5Я5, 55Т и 745. Из приведенных на

Ряс.4 Ыасс-фраплентограммы, идентифицирующие СК С: в листьях капусты (А), в початках кукурузы (Б), з аутентичном образце ФК С (В), в незрелых плодах томатов (Г).

риоунке 4 мяоо-фрягментогрямм "зоны ФК С" для листьев капусты, корней кукурузы и незрелых томатов, а также нутентичного образца ФК С (о небольшой примеаью ФК А), видно, что ФК С присутствует во всех этих объектах, особенно в листьях капусты. В то же время нельзя исключить, что ФК С мог образоваться из ФК А в процеосе выделения и хромятогряфировяния, поскольку фякт переходя ФК А в ФК С в биологичеоком материале известен (Вя111о е1 я1., 1977)-Идентификация ФКПЛ в цветковых растениях.

Одной из оообенноотей эксперимента, описанного выше, являлооь то, что выбранный нами метод идентификации ФК А (ГХ/МС) позволяет детектировать только ФК А и близкие ему метаболиты. Однако из литературы известно, что фитогормоны в растениях присутствуют не только в овободной,но и в овязанной форме(гликозиды.гликопротеины и др. ), поэтому можно предположить, что и эндогенный ФК А может находиться в ряотениях не только в свободном, но и в конъюгиро-ванном виде. В этом олучае применение ГХ/МС в режиме селективного детектирования не Приведет к желаемому результяту. Кроме того возможна ситуация, когда в растениях присутствует не сам ФКА, а его физиологический аналог. Следовательно, для детектирования такого рода вещеатв требуются другие методы анализа.

Можно предположить, что подобного рода вещеотва являются лигандами фузикокцин-овязывающего белка (ФКСБ) и для их идентификации целесообразно иопользовять радиорецепторный метод (РРА), основанный на связывании [^ШдигидроФК о плазматическими клеточными мембранами, представляющими собой препарат ФКСБ. Он был разработан итальянскими исследователями (БоЬгтапп, е1: а1., 1977),а в нашей лаборатории Бабаковым о сотр. был модифицирован метод получения препарата плазматических мембран и измерения связывания его о ФКА. Он. был взят за оонову для тестирования ряотительных фракций (Babяkov еЛ а1., 1994 ). При проведении измерений в среду вносили рязное количество исследуемого экотракта ( раотвор в этаноле ). Определяли количество экстракта, которое ингибирует связывание моченого ФК А о плазматическими мембранами на 50». Концентрацию эндогенного лиганда в исследуемом растворе рассчитывали по калибровочной кривой в пересчете на ФК А, т.е. условно принимая, что сродотво эндогенного лиганда к ФК-рецептору такое же, как и у ФК А. Неопецифичеокое связывание метки определяли при внеоении в ореду измерения большого избытка немеченого ФК А.

Другим подходящим яфтгним методом, широко применяемым я биологии и медицине, и разработанным ранее для ряда фитогормоноВ (Weller, 1979), в том числе и для ФК A (Pini et al., 1979), является радиоиммунологический (РИА)- В данном исследовании использовался препарат поликлоняльннх антител к ФК А, полученииЛ к.б.н. Бяртовой с сотр. Измерение связывания проводили о [^Н]дигидроФК и поликлональными антителами в физиологическом раотворе (рН 7,2), добавляя разное количество испытуемого образца. Для определения неспеттфического связывания в среду измерения вносили кроличью сыворотку. Как и для РРА, определяли экспериментальное количество испытуемого образца, которое на 50Я> ингибировало связывание меченого ФК А.

Первоначально методы РИА и РРА были попользованы нами для тестирования на присутствие ФКГО1 экстракта листьев капусты (сорт Славя), полученного по схейе (1)(рио.1). В этом зкотракте были обнаружены ФКПЛ в количестве 6хЮ-6 г на кг гчрой маооы в пересчете на ФК А. Содержание ФКПЛ в этом зкотракте оказалось примерно на 2 порядка выше, чем содержание ФК А, определенное методом ГХ/МС в вышеописанных экспериментах. Эти результаты находятся в соответствии с данными о сравнительной чувствительности методов РИА, РРА и ГХ/МС { предел чувствительности РИА и РРА ооотявляет соответственно 0,18 и 0,26 нг в пробе, тогда как ГХ/МС £-20 нг в пробе).

В дальнейшей работе в качестве раотительного объекта были выбраны трансформированные корни хрена. Этот объект имеет ряд преимуществ перед нативными растениями: культура стерильна от заряжения извне, выращивается круглый год в больших количеотвах, что делает работу о ней независимой от сезонности. Выращенные корни экстрагировали этанолом и центрифугировали при 4°С. Супер-натант упаривали до водного остатка и экстрагировали хлороформом. Высушенные экстракты хранили при -16°С ( охема 3 на рио.1 ). Для анализа 3-10мг экстракта экстрагировали этанолом (1:10, вео/ объем), центрифугировали и из оупернатанта отбирали по ХОмкл для РИА и ЗОмкл для РРА, добавляли к ним по 3-5 объемов оредн измерения (для каждого метода своя среда).Затем делали оерию разведений для определения конкуренции связывания [^Н]дигидроФК.

■Таким способом был протестирован ряд экстрактов из траногенных корней хрена с разной длительностью выращивания. Максимальное

и

количество ФКПЛ, обнаруженное в одном из образцов методами РИА и РРА, составило - 8x10 * г/кг сырого веса в пересчете на ФК А. По нашим данным количество ФКПЛ, определяемое в экстрактах корней хрена, не зависело от длительности выращивания культуры.

С учетом возможностей новых методов анализа была изменена дальнейшая хроматографичеокая очистка растительных экстрактов. С этой целью использовали ВЭЖл в режиме градиента: Ме0Н/Но0 от 50/ 50 до 100/0% 30 мин.,затем ЮСЙ МеОН 45 мин. Колонка о обращенной фазой гогЬах С8 (4,6x250мм ); скорость потока 1мл/минтемпература в колонке 45,5°С; УФ-детектор при 240нм. Собирали фракции по 3 мл,упаривали их и далее анализировали методами РИА и РРА. Приготовление пробы для ВЭЖХ требовало тщательной очистки от мелко-диопероных частиц. Время выхода ФК А с колонки ВГЭЖа в этих условиях было 18,5-20,5 мин.,что соответствовало 7 фракции. •

В опиоанных выше условиях экстракт корней трансгенного хрена (схема 3 на рис.1) хроматогряфировали и полученные фракции тестировали методами РИА и РРА, результаты приведены на рис.5.А. Как видно из риоунка, ингибирование связывания меченого ФК в обоих теотах наблюдалооь в нескольких фракциях, полученных из этого экотракта, что говорит о том, что не только ФК А, но и другие ФКПВ могут присутствовать в экотракте. 7 фракция была проанализирована также методом ГХ/МС.Приведенная на рис.5.Б маос-фрагменто-грамма показала наличие двух групп пиков ионов: одна из них соответствует ФК А, а другая - его изомеру ФК В. В соседних с 7-й активных фракциях фузикокцины методом ГХ/МС не были обнаружены. Расчет площадей пиков масо-фрагментограммы по сравнению о

образцом аутентичного ФК А показал, что в экстракте трансгенных

_^

корней хрена ФК А был обнаружен в количестве примерно 5x10 г/кг сырого веоя.

Применение высокочувствительных афинных методов,РИА и РРА позволило нам провести скрининг ФК и ФКПЛ в различных цветковых растениях. С этой целью были исоледованы корни нативндго хрена, трансгенные корни алтея и люпина, корни пророотков огурца и ооевые органы семян конокого каштана. В экстрактах этих растений ФКПЛ были обнаружены как РИА, так и РРА,экстракты хроматографиро-вали ( охрме 3 на рио.1 ), полученные фракции вновь тестировали обоими методами. ФКПЛ были обнаружены в различных ВЭЖХ-фракциях, причем в большинстве случаев вещеотва, обнаруживаемые РКА были

■ А п П I! 1 [ ! 1 си рт •Ш ррд (1

Рис.5 Результаты тестирования методами РИА и РРА ВЭЖХ-фракций, полученных из экстракта корней трансгенного хрена (А); масс-фрагментограмма, идентифицирующая ФК А в 7-й фракции (зоне ФК А) этого жэ экстракта (Б).

менее полярны, в то время, как ФКПЛ, детектируемые РРА, были как правило более полярнн.Бо фракции 7, совпадающей по времени выхода о ФК А, ФКПЛ обнаруживались обоими методами, причем как правило о хорошим совпадением межд,у ними.

Полученные данные предполагают существование не одного, а нескольких ФКПЛ, которые как и известные фузикокцинн,по-видимому, хорошо растворимы в хлороформе и поэтому в результате предложенной схемы экстракции переходят и хлороформный раствор. В тех случаях, когда ФКПЛ в 7-й фракции обнаруживаются как РИА, так и РРА, можно о большой долей вероятности говорить о присутствии ФК А или близких к нему веществ, даже если они не обнаруживаются о помощью Гл/МС из-за недостаточной чувствительности □того метода.

С помощью скрининга ФКПЛ на основе афинннх методов РИА и РРА » были иоследовяны ВЭЖл-фрагацга, полученные из осевых органов семян конского кяштяня. Последовали семена, находящиеся в состоянии покоя и выхода из. него с последующим проряотанием. С помощью используемых нами высокочувствительных аналитических методов удалооь выявить,что в стадии выхода из соотоянил глубокого покоя, ФКШ1 во фракции 7 отсутствовали, а у семян, которые уже способны оа"остоятельно прораотять, ФКПЛ в зоне выходя ФК А определяли обоими методами. Кроме того, в некоторых других ВЗЖл-фракциях экотрактов конокого каштана было выявлено наличие ФКПЛ обоими методами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе поиска ФК и ФКПЛ в высших растениях была разработана схема выделения ФК и ФКГО! из раотительных объектов, в которой для фракционирования полученных экотрактов попользовали различные методы хроматографии, в том числе ВЗЖл, я при идентификяцтги ФК и ФКПЛ применяли РИА, РРА и Га/'ЫС. На основе методов РИА и РРА была отработана оиотема скрининга ФКПЛ, содержвщихся в растениях в очень низких концентрациях.Это позволяет использовать небольшое количество раотительного материала, благодаря в первую очередь выоокой чувствительности выбранных афинных тестов. Известные биологичеокие теоты, специфичные для ФК А, не позволяют применять их из-за низкой чувствительности, а также из-за иокажения результатов в овязи о недостаточной очиоткой проб. С помощью раз-

работанной нами методики выделения и идентификации ФК и ФКПЛ мн обнаружили юс в целом ряде цветковых растений и определили те содержание в растениях. Содержание ФК А(по данным Га/ЫС) в корнях и початках кукурузы составило примерно ТО г/кг сырого пеоа, я в листьях капусты - Т0-йг/кг. В ВЭЖХ-фракции экстракта из трансформированного корня хрена содержание ФК А по данным Гл/МС составило примерно 5хТ0~° г/кг корней, а по данным РИА и РРА в этой фракции обнаружили ФКПЛ в количестве около 5хТ0 ' г/кг сырой масон. Эти данные подтверждают наше предположение о том, что при скрининге ФКПЛ методами РИА и РРА, мы можем обнаруживать не только ФК А, но и другие аналоги ФК А, которые проявляют сродотпо о антителами к ФК А и препаратом фузикокцин-связнвающего брлка.

Важным моментом являются полученные нами данные об обнаружении в растительных экстрактах не только ФК А, но и его близких аналогов - ФК С в нескольких'объектах и ФК В в трансгенных корнях хрена. Это свидетельствует в пользу того, что Т'К А не обязательно является основным, а тем более единственным представителем эндогенных фузикокцинов в высших растениях. Аналогичная картина наблюдается и в случае, например, эндогенных гийбереллинов, когда основной грибной метаболит ГА^ не является таковым в растениях.

Интерес представляют данные, полученные при скрининге ФКПЛ в ВЭЖл-фрякшитх, полученных из осевых органов семян конского кашта-на,находящихся в разных стадиях состояния покоя и выхода из него. Полученные данные дают основание для использования метода скрининга для изучения процессов онтогенеза, связанных о наличием в растениях ФКГШ, для выяснения физиологической роли ФК или ФКПЛ в растениях.

ВЫВОДЫ

г

1. Впервые разработан метод экстракции и очистки эндогенных ФК и ФКПЛ о применением ВЭЖХ из различных растительных объектов. Для обнаружения ФК и ФКПЛ использован комплекс аналитических методов, включающий РИА, РРА и Гл/МС, на основе которых рязрябо-танн высокочувствительные методики идентификации фузикокцин-подобнкх веществ.

2. Впервые ФК А обнаружен (методом Гл/МС) в растительных экот-рактах,полученных из корней и початков кукурузы, листьев и отебля капусты, незрелых плодов томатя, трансформированного корня хреня. В раотительных экстрактах,выделенных из початков кукурузы,листьев

капусты и незрелых плодов томата, обнаружен также ФК С, а в экстракте трансгенного корня хрена показано наличие ФК В.

3.Определено содержание ФК А в растительных экстрактах:в початках

—9 —ñ

и корнях кукурузы около ТО , в листьях капуоты 10 ив корне

трансгенного хрена 5хТ0~°г/кг сырого веса.

4. С помощью высокочувствительных аналитических методов РИА и РРА проведен скрининг ФКПЛ целого ряда цветковых растений, в результате которого ФКПЛ обнаружены в траногенных корнях алтея лекарственного и люпина,корнях интактного хрена,корнях проростков огурца, ооевых органах оемян конокого каштана. В пооледнем случае удалооь прооледить изменение содержания ФКПЛ в осевых органах оемян конокого каштана в фазах покоя и выхода из него.

5. С помощью ВЭЖХ и последующей многократной перекристаллизации фузикокцина А, продукта микробного синтеза, получен эталонный • препарат ФК А о высокой отепеныо чистоты (~98?S); охарактеризованы его физико-химичеокие параметры и биологичеокая активность.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

1. КобриняН.С..ВобликоваВ.Д.Выделение фузикокцина из культураль-ного фильтрата Funiaoocum amygdali Del.//ХПС,1980,Hñ, С.792- 796.

2. Муромцев Г.С., Коренева В.М., Краснопольская Л.М., Кобрина Н.С., Вобликова В.Д. Исследование биооинтеза и физиологической активнооти фузикокцина// Тез. 1-й Воесоюзной конференции "Регуляторы роота и развития раотений". Москва, 1981, С.204.

3. "Коренева В.М., Краснопольская Л.М., Кобрина Н.С., Вобликова В.Д. Методы определения регулятора роста растений фузикокцина// Методичеокие рекомендации ВАСлШЛ, ВНШПЫБГ. Москва,1984,С. 16-22.

4. Муромцев Г.С., Вобликова Б.Д., Кобрина Н.С., Коренева В.М., Садовокая В.Л., Столпакова В.В. Обнаружение эндогенного фузикокцина в кукурузе// Докл.ВАСлНИЛ, 1986, JÍ3, С.2-4.

5. Муромцев Г.С., Вобликова В.Д., Кобрина Н.С., Коренева В.М., Садовокая В.Л., Столпакова В.В. Эндогенный фузикокцин в высших растениях// Физиол.раот.1987, W6, С.980-987.

6. Muromtsev G.S., Vqblikova V.D., Kobrina N.S., Koreneva V.M., Sadovskaya V.L., Stolpakova V.V. On the presenoe of fusicoccin ln higher planta// Acta Agronómica Hunsarioa, 198?, v.38, P.385-393-

7. Muromtsev G.S., Voblikova V.D., Kobrina H.S., Koreneva V.M., Sadovskaya V.L., Stolpakova V.V. Fusiooocin in higher planta// Bioohem.Phyaiol.Pflanzen, 1984, v.185, P.261-268.

8. Муромцев Г.С., Вобликова В.Д., Кобрина Н.С., Коренева В.М., Садовская В.Л., Столпакова В.В. Эндогенный фузикокцин в высших

развития растений". Киев, ISR9, С.263.

9. Muromtsev G.S., Voblikova V.D., Kobrina M.S., Koreneva V.M., Krnsnopolskaya L.M., Sadovskaya V.L. Occurence of fusioocoanes in plants and fungi// J.Plant Growth Regul., 1994, v. 13, P.39-49-

10. Drabkin A.V., Abramycheva IJ.Yu. .Bartova L.M. , Voblikova V.D., Dridz.e T.L. , Maisuryan A.II., Margulis G.U., Oganyan R.R., Bahakov A.V., Muromtsev G.S. Properties of fusiooooin reoeptors and interaction with endogenous ligand from transformed horseradish root culture// Abstraotstt International Symposium "Plant hormont .signal perception and transduotion"Se Moscow, 1994, P. 18.

11. Babakov A.V.,Bartova L.M.,Margulls G.U.,Oganyan R.R., Voblikova V.D., Maisuryan A.H., Dridze I.L., Muromtsev G.S. Endogenous fusicoccin-1ike ligand revealed in higher plants by radioreceptor and radioimmuniassays// FEBS Letters, 1994. v.351, P.243-245.

12. Babakov A.V., Bartova L.M., Dridze I.L., Maisuryan A.N., Margulis G.U., Oganyan R.R., Voblikova V.D., Muromtsev G.S. Culture of transformed horseradish roots as a souroe of fusiooo-cin- like ligands// J.Plant Growth Regul,1995, v. 14, P.163- 16713. Bartova L.M., Kalashnikova T.S., Maisuryan A.N., Sadovskaya V.L., Voblikova V.D., Muromtsev G.S. Screening of higher plants for fusicocoin-like ligands// Abstraots: 10th FESPP Congress "From molecular mexanisms to the plant: an integrated approach"' Florence,Italy.Speoial assue "Plant Physiology and Bioohemistry",

1996, P.I87- 188.

14. Антипова O.B., Бартовя Л.M., Вобликовв В.Д..Калашникова Т.е.,

I

Муромцев Г.С..Обручева Н.В.Эндогенные фузикокцин-лодобные лигянды в зародышах семян конского каштана// Тез.конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводство, животноводотве и ветеринарии". Мооква, 1996, С.5.

15. Bartova L.M.,Bogdanov V.P., Kulagina N.N., Kalashnikova T.S., Reshetova O.S., Sadovskaya V.L., Voblikov* V.D., Muromtsev O.S. Fusicoooin-like ligands in higher plants// J.Plant Growth Regul.,

1997, in pre.4S.

раотениях// Тез. II Всесоюзной конференции

it

Регуляторы роста и