Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное изучение паротитного и коревого вакцинальных процессов и совершенствование контроля нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное изучение паротитного и коревого вакцинальных процессов и совершенствование контроля нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори"

3- 3

<ХУДК й^.371:578.831.21].076.9 На правах рукописи

МАКСИМОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПАРОТИТНОГО И КОРЕВОГО ВАКЦИНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КОНТРОЛЯ НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ ПАРОТИТА 11 КОРИ.

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Мскт - 1995

Работа выполнена в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. ЛАТарасееича при Государственном комитете РФ санитарно-эпидемиологического надзора.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки России, академик Международной Академии Информатизации ООН В.<£.Попов

кандидат медицинских наук, старшии научный сотрудник Л.В.Григорьева .

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В.Погодина

доктор медицинских наук, ведущии научный сотрудник А.М.Харитонова

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится О/Л■ 1996 г.

в час. на заседании диссертационного совета Д.001.27.01 Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт Полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан 19965г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

О.А. Медеедкина

Актуальность проблемы.

Несмотря на длительный период успешного проведения профилактических мероприятий по предупреждению таких опасных детских инфекций как паротит и корь, остаются актуальными многие вопросы, касающиеся особенностей патогенеза экспериментальных паротитного и коревого вакцинального процессов, а также совершенствования контроля безопасности живых паротитной и коревой вакцин.

Известно, что ведущим методом контроля безопасности этих препаратов является оценка степени их остаточной нейровирулентности в тесте на обезьянах. Однако, ни в требованиях ВОЗ, ни в действующей отечественной научно-технической доментации и национальных требованиях других стран, не содержится патоморфологических критериев и методических принципов оценки нейровирулентности как паротитной, так и коревой вакцин [WHO Techl. Rep. Ser.,1987, No.760, Annex 7; 1988, No.771, Annex 5; US Code of Federal Regulations. Title 21, Part 630, Subpart F, D,1994].

Дискутабельной остаётся трактовка морфологических изменений, развивающихся в ЦНС обезьян после интрацеребральной инокуляции этими вакцинами. Обсуждается вопрос о возможности проникновения вакцинных вирусов паротита и кори в нейроны и способности их вызывать те или иные формы поражения нервных клеток. Нуждаются в уточнении особенности локализации изменений в ЦНС, распространения вакцинных вирусов в экстраневральных органах и возможность поражения последних.

До настоящего момента исследователи, ведя дискуссии о характере паротитного и коревого патологического процесса в ЦНС обезьян, ограничивались лишь качественными характеристиками и оценками "больше" или "меньше" и не предпринимали попыток количественной оценки нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори. В связи с этим при производственном контроле нейровирулентности всегда стояла проблема установления "допустимых пределов"

изменений в ЦНС обезьян, а оценка безопасности этих препаратов была в значительной мере субъективной.

До сих пор, исследователи при изучении патологического процесса в ЦНС, вызванного интрацеребральным введением различных шта: мов вирусов паротита и кори, совсем не уделяли внимания изучению роли тяжести и топографии травматического повреждения головного мозга.

Невыясненным остается изучавшийся некоторыми авторами вопрос о возможности использования в качестве модели для изучения не1 ровирулентных свойств вируса паротита различных животных, в частности мини-свиней, и замены ими ныне существующей и очень дорогостоящей модели на обезьянах.

Все вышесказанное явилось основанием для проведения настоящих исследований по изучению особенностей экспериментальных пар| титного и коревого вакцинального процессов и разработки объективно! и достоверного метода количественной оценки степени остаточной нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори.

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящих исследований явилось экспериментальное изучение паротитного и коревого вакцинальных процессов и использование полученных данных для совершенствования метода оценки нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Изучить морфологические изменения в ЦНС и экстраневраль-ных органах обезьян и установить корреляцию этих изменений с локализацией и активностью накопления вирусного антигена (ВАГ) при инт-рацеребральном и внутримышечном введении вакцинных штаммов вирусов паротита и кори.

2. Установить значение топографии и тяжести инокуляционной травмы головного мозга в патогенезе патологического процесса, разви-

вающегося в ЦНС обезьян при инокуляции вакцинными штаммами вирусов паротита и кори.

3. Разработать на основе количественного подхода объективный метод оценки степени остаточной нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори с целью установления пределов допустимых изменений в ЦНС обезьян при контроле безопасности живых паротитной и коревой вакцин.

4. На основе объективного количественного подхода провести сравнительную оценку нейровирулентных свойств различных вакцинных штаммов вируса паротита.

5. Изучить возможность использования мини-свиней а качестве биологической модели, альтернативной обезьянам, для оценки нейровирулентности вакцинных штаммов вируса паротита.

Научная новизна исследований.

1. В результате проведенных исследований получены дополнительные данные по характеристике биологических свойств вакцинных штаммов вирусов паротита и кори.

2. Выявлены особенности патогенеза экспериментального инфекционного процесса в ЦНС и экстраневральных органах обезьян, вызванного вакцинными штаммами вирусов паротита и кори.

3. С помощью метода количественной оценки морфологических параметров паротитного патологического процесса в ЦНС обезьян впервые проведено дифференцирование различных штаммов вируса паротита по степени их нейровирулентности.

4. Впервые показано влияние инокуляционного травматического повреждения целостности желудочковой системы (ЖС) мозга обезьяй на развитие паротитного и коревого вакцинального процессов в ЦНС.

Полученные данные послужили основанием для усовершенствования контроля нейровирулентности живых паротитной и коревой вакцин.

Практическая значимость работы.

1. На основе проведенных исследований усовершенствованы морфологические критерии оценки нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов кори и паротита в интрацеребральном тесте на обезьянах.

2. Впервые разработан и применен количественный метод оценки * морфологических параметров паротитного и коревого вакцинального

процессов в ЦНС обезьян для объективной сравнительной характеристики нейровирулентных свойств различных штаммов и установления пределов допустимых изменений при контроле остаточной нейровиру-8> лентности живых паротиной и коревой вакцин.

3. Усовершенствована методика интрацеребральной инокуляции обезьян в тесте нейровирулентности живых паротитной и коревой вакцин с целью уменьшения вероятности травматизации стенок желудочков мозга и снижения интенсивности травматического повреждения..

4. Разработаны и утверждены методические рекомендации "Оценка нейровирулентности живых паротитной и коревой вакцин" использование которых в процессе производства будет способствовать совершенствованию контроля безопасности этих препаратов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Нейровирулентные свойства вакцинных штаммов вируса паротита при интрацеребральной инокуляции обезьянам обусловлены их высокой тропностью к элементам ЖС мозга и проявляются в развитии характерной патоморфологической триады: хориоплексита, эпендимита и перивентрикулярного энцефалита.

2. Нарушение целостности стенок желудочков при инокуляцион-ной травме мозга, является неблагоприятным фактором, способствующим распространению вирусов паротита и кори по ЖС и усугубляющим развитие специфического патологического процесса в ЦНС.

3. Впервые разработанный метод количественной оценки параметров патологического процесса, развивающегося в ЦНС обезьян после

введения вакцинных штаммов вирусов паротита и кори, позволил получить объективные показатели остаточной нейровирулентности, установить пределы допустимых морфологических изменений в ЦНС обезьян и стандартизировать оценку безопасности живых паротитной и коревой вакцин при производственном контроле.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции "Актуальные проблемы диагностики и профилактики . кори, эпидемического паротита и краснухи" (Москва, 1992); конференции молодых ученых ЦНИИЭ "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней"'(Москва, 1992); юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Пастера "Актуальные проблемы инфекционной патологии" (Санкт-Петербург, 1993); межлабораторной конференции ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва, 1992); заседании Ученого совета ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва, 1994). В завзршенном виде диссертационная работа обсуждалась на заседании Ученого совета ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва, 1995).

Публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация объемом 211 страниц машинописного текста (без списка литературы) состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и приложений. Работа иллюстрирована 60 таблицами и 80 рисунками. Библиография включает 113 работ отечественных и 192 работ зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Исследования проводились на обезьянах вида Rhesus (Macaca mulatta), Cynomolgus (Macaca fascicuiaris), зеленых мартышках (Сегсо-pithecus aethiops) и мини-свиньях (породы "Светлогорская"), серонега-тивных к вирусу паротита или кори.

Животных инокулировали сочетанно интрацеребральным и внутримышечным методами. Контрольным животным интрацеребрально вводили жидкость, собранную с неинфицированной вирусом культуры клеток куриных эмбрионов или эмбрионов японских перепелов.

В течение опыта за животными велось клиническое наблюдение. Эфтанаэию производили на 17- 31 сутки путем декапитации под глубоким наркозом.

Всего в опытах было использовано 356 обезьян и 8 мини-свиней. Характеристика экспериментального материала представлена в табл.1.

Гистологическое исследование.

Головной и спинной мозг фиксировали в 10% растворе формалина. Вырезку кусочков головного мозга, подлежащих исследованию, производили с помощью усовершенствованных нами методик, различающихся в зависимости от изучаемого вакцинального процесса - паротит-ного или коревого. Материал обрабатывался по обычной гистологической методике с заливкой в парафин и окрашивался гематоксилин-эозином и по методу Ниссля. Для выявления миелиновых волокон применяли окраску замороженных срезов по Шпильмейеру.

Количественный метод оценки патоморфологических изменений.

Для оценки интенсивности патоморфологических изменений в желудочковой системе (ЖС) при экспериментальном паротитном процессе нами разработана 4-х бальная шкала. Оценка дается каждому из 7-ми отделов ЖС: 1) передним частям боковых желудочков; 2) центральным частям боковых желудочков; 3) третьему желудочку; 4) нижним рогам боковых желудочков; 5) задним рогам боковых желудочков; 6) сильвие-ву водопроводу; 7) четвертому желудочку. При этом парным образованиям (боковым желудочкам) количественная оценка дается отдельно правой и левой сторонам, а затем вычисляется средняя.

Для оценки нейровирулентных свойств вакцинного штамма вируса кори применялась 3-х бальная шкала интенсивности патоморфологических изменений.

Таблица ^Характеристика экспериментального материала.

Вид животных Исследованный вирус, инокуляционный титр Количество животных

Обезьяны Rhesus (Macaca mulatta) П London (16А) 6,1 lg ТЦД50/мл 5

Обезьяны Cynomolgus (Macaca fascicularis) А Р Albrecht (7399) 6,1 lg ТЦД50/мл 10

Macaca mulatta, Macaca fascicularis О Т Jeryl Lynn (7 серий вакцины) 5,3 - 6,5 lg ТЦД50/мл 120

Зеленые мартышки (Cercopithecus aethiops) И т Urabe Am9 (серия вакцины) 4,7 lg ТЦД50/мл 10

Cercopithecus aethiops, Macaca mulatta Ленинград-3 (6 посевных вирусов, серия вакцины N.020) 5,3 - 5,4 lg ТИД50/м.'1 77

Контроль 28

Мини- свиньи (породы Urabe Am9 (серия вакцины) 4,7 lg ТЦД50/мл 3

"Светлогорская") Ленинград-3 (посевной вирус№50) 4,7 lg ТЦД50/мл 3

Контроль 2

Cercopithecus aethiops к о р Ленинград-16 (производственный штамм, 9 посевных вирусов) 2,4 - 6,25 lg ТЦД60/мл 96

ь Контроль 10

Всего: обезьян - 356

мини-свиней - 8

Арифметическое среднее всех оценок патоморфологических изменений у отдельного животного представляет собой индивидуальную гистологическую оценку специфических изменений (ГОСИ). Оценка теста или групповая ГОСИ представляет собой арифметическое среднее всех индивидуальных оценок животных.

Для оценки инокуляционной травмы головного мозга животных нами были разработаны и применены две шкалы, отражающие спектр травматических изменений в зависимости от срока после инокуляции -на 7-12 и 17-31 сутки.

Арифметическое среднее оценгд( травматических изменений у отдельного животного, представляет собой индивидуальную гистологическую оценку травматических изменений (ГОТИ). Групповая ГОТИ представляет собой арифметическое среднее индивидуальных оценок.

Иммунофлюоресцентное исследование (МФА).

Использовали отпечатки и криокатные срезы головного мозга и экстраневральных органов животных. Выявление паротитного и коревого антигенов проводили с помощью постановки прямого МФА по методу Coons и Kaplan (1950). Гипериммунный лошадиный противопаротитный и противокоревой иммуноглобулины метили флюоресцеин-5-изотиоци-натом по общепринятой методике [Шаханина К.Л., 1977]. Интенсивность свечения определяли визуально по общепринятой четырехбальной шкале [Гольдин Р.Б., 1977; Кетиладзе Е.С., 1979].

Электронная микроскопия.

Кусочки головного мозга фиксировали в 1% растворе глутарового альдегида на 1 М фосфатном буфере, обезвоживали в спиртах, заключали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали нитратом свинца и уранилацетатом и просматривали в электронном микроскопе JEM-100B.

Серологические методы.

Пробы сывороток обезьян исследовали в реакции торможения ге-магглютинации (РТГА) с 4 АЕ паротитного или коревого гемагглютини-

рующего антигена. РТГА ставили микрометодом на фоне национального стандарта антител. Любой титр антигемагглютининов, выявляемый у серонегативных до инокуляции обезьян, расценивался как положительная сероконверсия.

Статистические методы. Оценка теста или групповая ГОСИ вычислялась по формуле: М* = £ м где: М - индивидуальные оценки животных;

Статистическую значимость разницы между средними арифметическими вычисляли по методу Стьюдента (Student's t-test). Разницу считали статистически достоверной при р<0,05.

Результаты и обсуждение.

Проведенное изучение экспериментальной паротитной инфекции выявило ряд закономерностей и особенностей развивающегося в ЦНС и экстраневральных органах патологического процесса, с«

Результаты исследований подтвердили высокую тропность вируса паротита к элементам желудочковой системы (ЖС) мозга при интраце-ребральной инокуляции обезьянам. Сравнительное изучение нейрови-рулентных свойств "диких" и вакцинных штаммов вируса паротита показало, что патоморфологическая триада - хориоплексит, эпендимит и перивентрикулярный энцефалит является основным проявлением паро-титного процесса в ЦНС обезьян. Степень выраженности и распространенности этих изменений являются основными морфометрическими параметрами, отражающими нейровирулентные свойства различных штаммов вируса паротита.

п

п - количество животных.

Среднее квадратичное (стандартное) отклонение:

где: М - индивидуальные оценки животных; М*- групповая ГОСИ; п - количество животных.

Выявленные нами дистрофические изменения со стороны нейронов в леритравматической зоне в виде набухания, умеренной вакуолизации и частичного тигролиза при отсутствии признаков накопления вирусного антигена в цитоплазме нервных клеток, являются вторичными, развивающимися вследствие циркуляторных нарушений.

На основании всего спектра выявленных форм поражения желу-

ч

дочковой системы обезьян при введении "диких" и вакцинных штаммов вируса паротита нами разработан метод количественной оценки степени нейровирулентности различных штаммов вируса паротита.

С помощью количественного метода проведена сравнительная оценка нейровирулентности отечественного вакцинного штамма Ленин-град-3 (Л-3) с двумя зарубежными штаммами, применяемыми для производства живых паротитных вакцин - Jeryl Lynn и Urabe Am9. Установлено, что штамм Л-3 обладает более низкой степенью остаточной нейровирулентности, при одинаковых экспериментальных условиях, по сравнению как со штаммом Jeryl Lynn, так и со штаммом Urabe Am9 (Рис.1). Разница между отмеченными показателями статистически достоверна (р<0,05).

А

Б

госи

госи

1.

1.0 (

Jeryl Lynn

Л-3

Urabe Am9

Л-3

Рис.1. Сравнительная оценка нейровирулентности вакцинного штамма Ленинград-3 с зарубежными штаммами - Jeryl Lynn (А) и Urabe Am9 (Б).

Распространение патологического процесса в ЦНС различалось у обезьян, инокулированных дикими и вакцинными штаммами вируса паротита. При инфицировании дикими штаммами патоморфологические изменения распространялись равномерно по всем отделам ЖС мозга обезьян по мере удаления от места инокуляции. Вакцинальный же процесс характеризовался наиболее частым поражением отделов ЖС, соседствующих с местом введения вируссодержащего материала: передних, центральных частей боковых желудочков и III желудочка.

При оценке распространения патологического процесса по отделам ЖС обезьян, после инокуляции различными вакцинными штаммами вируса паротита наблюлись небольшие колебания, по-видимому, являющиеся результатом штаммовых различий.

Количественный метод также использован нами для выявления колебаний в степени остаточной нейровирулентности различных посевных оирусоз штамма Л-2, прошедших е течении последних 5-ти лет производственный контроль. Проведено вычисление средней величины показателя степени остаточной нейровирулентности для тех посевных вирусов, низкая степень остаточной нейровирулентности которых не вызывала сомнений. Среднее значение ГОСИ в наших расчетах составило - 0,532 ± 0,394. Эта величина может служить показателем предела

CS

допустимых изменений в ЦНС обезьян при контроле безопасности живой паротитной вакцины из штамма Л-3.

В процессе производственного контроля нейровирулентности живой паротитной вакцины на основании данных, полученных после проведения ряда тестов, может быть определена средняя величина показателя приемлемой степени остаточной нейровирулентности и выбран на её основе референс-препарат, сравнение с которым позволит достоверно решать вопрос о пригодности испытуемых препаратов.

Количественный метод оценки нейровирулентности позволил ус-

тановить почти двухкратное уменьшение интенсивности патоморфоло-гических изменений в желудочковой системе обезьян, инокулированных вакциной из штамма Л-3, по мере увеличения срока наблюдения от 17 до 31 суток (ГОСИ - 0,642±0,319 и 0,323±0,216, соответственно). Наличие выявленного регресса в динамике развития поражений желудочковой системы обезьян, вызванных вакцинным штаммом Л-3, свидетельствует о высоком уровне его аттенуации. Полученные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным для оценки степени остаточной нейровирулентности вакцинных штаммов вируса паротита является срок наблюдения за животными, равный 30-35 суткам после инокуляции, что позволит выявить наличие или отсутствие регресса в развитии патоморфологических изменений в ЖС обезьян и может служить важным дополнительным показателем для характеристики нейровирулентности испытуемого вакцинного штамма.

В проведенных исследованиях установлено значение инокуляци-онных травматических повреждений головного мозга в генезе патологического процесса в ЦНС обезьян после интрацеребрального введения вакцинных штаммов вируса паротита.

Для изучения влияния инокуляционной травмы мозга на развитие экспериментального паротитного процесса в желудочковой системе, нами разработана шкала оценки травматизации и проведена количественная оценка степени травматических повреждений на большом количестве животных. При сопоставлении количественных оценок специфических и травматических изменений в желудочковой системе обезьян была установлена прямая корреляция между степенью травматизации стенок желудочков и выраженностью патоморфологических изменений в структурных элементах ЖС.

Результаты проведенных нами исследований позволили придти к заключению о том, что механическое повреждение стенок желудочков при инокуляции способствует распространению вакцинного вируса па-

ротита по ЖС и значительно затрудняет оценку истинной нейровиру-лентности испытуемого вируса.

Нежелательные последствия травматического повреждения ЖС побудили нас усовершенствовать методику интрацеребральной инокуляции обезьян. Для фиксирования кожного покрова и точного определения мест инокуляции на поверхности черепа обезьяны используется специальная инокуляционная пластина с двумя отверстиями, расположенными строго на расстоянии 1,5 см латеральнее от сагиттального шва с каждой стороны и 0,5 см от коронарного шва по направлению кзади. Отверстия в инокуляционной пластине выполнены таким образом,

э

что позволяют вводить инъекционную иглу в требуемом вентрально-медиальном направлении.

Данный метод отличается от применяемых в настоящее время в нашей стране и за рубежом. С его помощью становится возможным уменьшить частоту травматизации стенок желудочков почти в два раза и значительно снизить тяжесть травматического повреждения.

Проведенное изучение патоморфологической картины в ЦНС обезьян при инокуляции различными штаммами вируса паротита позволило уточнить ряд важных звеньев патогенеза экспериментальной па-ротитной инфекции ЦНС. Установлено, что вирус паротита диссемини-рует в ЦНС по желудочковой системе тремя путями - гематогенным, контактным и стоком спинномозговой жидкости. Такой механизм распространения вируса паротита подтверждается результатами проведенного иммунофлюоресцентного исследования, показавшего наличие вирусного антигена (ВАГ) в цитоплазме эпителия сосудистых сплетений, эпендимных клеток и клеток периваскулярных инфильтратов в лери-вентрикулярной зоне.

С помощью иммунофлюоресцентного исследования отмечена способность вакцинного штамма Л-3 вируса паротита к репродукции в экстраневральных органах обезьян. Вирусный антиген определялся в

эпителии слизистой оболочки слюнных и поджелудочной желез, в элементах ретикулоэндотелиальной системы и эпителии респираторного тракта. Репродукция вакцинного штамма Л-3 в экстраневральных органах не сопровождалась развитием воспалительных и дегенеративных изменений, что также может свидетельствовать в пользу высокого уровня аттенуации штамма.

При изучении вопроса о возможности использования мини-свиней как экспериментальной модели для оценки нейровирулентных свойств вируса паротита обнаружены особенности гистологического строения >£С, отличающие этих животных от обезьян. Это касается наличия мощного реактивного слоя эмбрионального матрикса, расположенного вдоль вентрикулярных стенок, состоящего из недифференцированных клеток и дающего выраженные неспецифические пролиферативные реакции в ответ на инокуляционную травму и введение контрольного материала. Отменено отсутствие воспалительных реакций в желудочковой системе мини-свиней после инокуляции вакцинными штаммами вируса паротита и получены отрицательные результаты иммунофлюо-ресцентного исследования ЦНС и экстраневральных органов на наличие ВАГ. Всё вышеотмеченное позволило нам заключить, что мини-свиньи, в качестве биологической модели для оценки нейровирулентных свойств вакцинных штаммов вируса паротита являются малочувствительными.

Проведенное нами изучение экспериментального коревого вакцинального процесса показало, что в отличие от патологического процесса, вызываемого вирусом паротита, основные патоморфологические изменения возникают в месте инокуляции и сопровождаются развитием воспалительной реакции, очаговой демиелинизации, пролиферации глии и дистрофии нервных клеток. При наличии инокуляционного повреждения ЖС вакцинный вирус кори вызывает развитие преимущественно перивентрикулярного очагового энцефалита.

При интрацеребральном введении обезьянам вакцинного штамма Л-16 не было обнаружено морфологических изменений нервных клеток, характерных для вирусного поражения. При иммунофлюоресцентном исследовании наличия ВАГ в нейронах не выявлено. Выявленные умеренной выраженности дистрофические изменения нервных клеток в виде набухания, вакуолизации и частичного тигролиза обусловлены цир-куляторными нарушениями и являются вторичными.

Изученный нами вакцинный штамм Л-16 вируса кори не вызывал дегенеративных изменения миелиновых оболочек нервных волокон. Отмеченные данные свидетельствуют о высоком уровне аттенуации отечественного вакцинного штамма вируса кори.

Установление предела допустимых изменений в ЦНС обезьян при производственном контроле безопасности живой коревой вакцины так же, как и при контроле паротитной вакцины является актуальным. С этой целью нами был разработан метод количественной оценки остаточной нейровирулентности вакцинного штамма вируса кори с учетом особенностей морфологической картины в ЦНС обезьян при коревом вакцинальном процессе.

С помощью метода количественной оценки выявлена вариабельность в интенсивности морфологических изменений, развивающихся в ЦНС обезьян после введения различных вариантов вакцинного штамма Л-16 вируса кори.

При использовании материалов производственного контроля нейровирулентности посевных вирусов штамма Л-16 за последние 5 лет, нами вычислено среднее значение степени остаточной нейровирулентности (0,428+0,253). Эта величина может служить показателем предела допустимых изменений в ЦНС обезьян при контроле безопасности живой коревой вакцины из штамма Л-16.

При изучении экспериментального коревого вакцинального процесса также было установлено значение инокуляционных травматических

повреждений головного мозга обезьян в генезе патоморфологических изменений в ЦНС. Распространение патологического процесса в ЦНС в значительной мере определялось наличием и степенью травматизации стенок боковых желудочков. Повреждение целостности ЖС способствовало развитию более выраженных инфильтративно-пролиферативных реакций в строме сосудистых сплетений и в перивентрикулярной зоне, равно как и распространению патологического процесса за пределы зоны введения. В связи с этим, применение усовершенствованного метода интрацеребральной инокуляции, позволяющего уменьшить частоту травматизации стенок желудочков обезьян, оправдано и для контроля степени остаточной нейровирулентности вакцинных штаммов вируса кори.

Проведенное изучение морфологической картины в ЦНС обезьян, инокулированных вакцинным штаммом Л-16 вируса кори, позволило тз'оке уточнить ряд важных ззеньев патогенеза экспериментального вакцинального процесса в ЦНС.

Сопоставление данных гистологического и иммунофлюоресцент-ного исследований позволило установить ограниченную зоной инокуляции репродукцию вакцинного штамма вируса кори с накоплением ВАГ в глиальных, гистиоцитарных клетках, в арахноидэндотелии, в эпителии сосудистого сплетения и эпендимных клетках. Отмечено, что при иноку-ляционном повреждении стенок желудочков в результате нарушения барьерных функций мозга, возникают благоприятные предпосылки для диссеминации вируса по желудочковой системе гематогенным путём и с током спинномозговой жидкости, с дальнейшим развитием перивентри-кулярного энцефалита.

С помощью иммунофлюоресцентного исследования установлена способность вакцинного штамма Л-16 к репродукции в элементах рети-кулоэндотелиальной системы и эпителии дыхательного тракта обезьян без признаков повреждения клеток, воспалительных изменений и гиган-

токлеточного метаморфоза, характерного для инфекции "дикими" и ела-боаттенуированными штаммами вируса кори, что также может свидетельствовать в пользу высокого уровня аттенуации штамма.

В результате проведенных исследований получены уточненные морфологические критерии для оценки степени остаточной нейровиру-лентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори. Применение разработанного количественного метода позволило провести сравнительную оценку нейровирулентных свойств различных штаммов вируса паротита и сделало возможным установить предел допустимых морфологических изменений в ЦНС обезьян при производственном контроле безопасности живых паротитной и коревой вакцин. Методические принципы количественной оценки остаточной нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори, а также усовершенствованная нами методика интрацеребральной инокуляции и обязательный учет травматического повреждения головного мозга включены в методические рекомендации "Оценка нейровирулентности живых паротитной и коревой вакцин". Использование этого документа в процессе производственного контроля будет способствовать совершенствованию оценки безопасности живых паротитной и коревой вакцин.

18

Выводы

1. Изучение нейровирулентных свойств "диких" и вакцинных штаммов вируса паротита в тесте интрацеребральной инокуляции обезьян показало их высокую тропность к элементам желудочковой системы мозга, первичность поражения этих структур с развитием характерной патоморфологической триады: хориоплексита, эпендимита и перивент-рикулярного энцефалита.

2. Изучение экспериментального коревого вакцинального процесса в ЦНС установило локализацию поражений преимущественно в зоне интрацеребральной инокуляции с развитием ограниченной^оспали-тельной реакции и очаговой демиелинизации.

3. С помощью иммунофлюоресцентного исследования установлена прямая корреляция между наличием вирусного антигена и локализацией выявленных патоморфологических изменений в ЦНС при экспериментальны/. паротитнсм и коревом вакцинальных процессах, а также показана способность отечественных вакцинных штаммов вирусов паротита и кори к репродукции в экстраневральных органах без развития в них патологических реакций.

4. На основе полученной качественной характеристики паротитно-го и коревого патологических процессов в ЦНС нами разработан метод количественной оценки выявленных морфологических изменений.

5. С помощью количественного метода впервые проведена сравнительная оценка нейровирулентных свойств различных вакцинных штаммов вируса паротита, которая показала, что отечественный штамм Ленинград-3 обладает более низкой степенью остаточной нейровируле-нтности, по сравнению с вакцинными штаммами Jeryl Lynn и Urabe Am9.

6. Применение разработанного нами метода количественной оценки остаточной нейровирулентности показало высокий уровень аттенуа-ции отечественных вакцинных штаммов вирусов паротита и кори, а также позволило установить пределы допустимых морфологических изме-

нений в ЦНС обезьян и стандартизировать оценку безопасности живых паротитной и коревой вакцин при производственном контроле.

7. Установлено, что нарушение целостности стенок желудочков при инокуляционной травме мозга, является неблагоприятным фактором, способствующим распространению вирусов паротита и кори по желудочковой системе и усугубляющим развитие специфического патологического процесса в ЦНС.

8. Усовершенствованный нами метод интрацеребральной инокуляции обезьян позволяет уменьшить частоту повреждения стенок желудочков мозга, предупреждает развитие неспецифических посттравматических реакций и способствует стандартизации результатов оценки нейровирулентности вакцинных штаммов вирусов паротита и кори.

9. По материалам наших исследований, мини-свиньи не являются достаточно чувствительной моделью для оценки нейровирулентных свойств вакцинных штаммов вируса паротита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Характеристика некоторых биологических свойств вакцинных штаммов вируса паротита./ Шевченко O.A.// Поствакцинальные осложнения: патогенез, профилактика, лечение. - М.,1991. - С. 135.

2. Исследование ЦНС и внутренних органов обезьян, зараженных инт-рацеребрально вакцинным штаммом Л-16 вируса кори. / Максимова O.A., Попов В.Ф., Юнасова Т.Н. и др. //Актуальные проблемы диагностики и профилактики кори, эпидемического паротита и краснухи. - М., 1992. - С. 38-39.

3. Иммунофлюоресцентное исследование как дополнительный метод оценки остаточной нейровирулентности вакцинного штамма вируса кори. / Максимова О А II Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. - М„ 1992. - С. 54-56.

4. Изучение экспериментального коревого вакцинального процесса.

/ Максимова O.A., Попов В.Ф., Григорьева Л.В. и др. // Актуальные проблемы инфекционной патологии.Часть I. Кишечные и респираторные инфекции. - Санкт-Петербург, 1993. - С. 144.

5. Использование метода флюоресцирующих антител (МФА) для изучения вакцинального паротитного процесса у обезьян. I Максимова O.A., Попов В.Ф., Григорьева Л.В. и др. II Актуальныё проблемы инфекционной патологии. Часть I. Кишечные и респираторные инфекции. - СС'нкт-Петербург, 1993.-С. 145.

6. Использование диагностических препаратов при оценке специфической безопасности живых вирусных вакцин. / Максимова O.A., Терешкина Н.В., Шарова O.K. и др. //Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики. - Пермь, 1993. - С. 77.

7. Морфологическое и иммунофлюоресцентное исследование коревого вакцинального процесса в эксперименте на обезьянах. / Максимова O.A., Попов В.Ф., Григорьева Л.В. и др. // Вопр. вирусологии. - 1994. -N.2 - С.71-74.

8. Усовершенствованный тест нейровирулентности живых паротитных вакцин./ Максимова O.A., Levenbook I., Albrecht Р. и др.// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Санкт-Петербург, 1995. - С. 17.

9. Сравнительная характеристика нейровирулентных свойств различных штаммов вируса паротита в эксперименте на обезьянах./ Максимова O.A., Levenbook I., Попов В.Ф. и др. II Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Санкт-Петербург, 1995. - С. 34.