Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита

Кулак, Михаил Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита"

□03494125

На правах рукописи !/, ■ / /

/ /

~ /

Кулак Михаил Валерьевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЛЕНИНГРАД-3 ВИРУСА ПАРОТИТА

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5МАР-2910

Кольцове - 2010

003494125

Работа выполнена в ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Фёдоровна

Ведугцая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт гриппа» (г. Санкт-Петербург).

Защита состоится «23» апреля 2010 г. в 11.30 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан » 2010 г.

Ученый секретарь

Карпенко Л.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпидемический паротит (ЭП) входит в число наиболее распространенных респираторных вирусных заболеваний человека. Возбудитель, вирус паротита, принадлежит к роду Rubulavirus семейства Paramixoviridae. Геном вируса представлен линейной не сегментированной РНК отрицательной полярности. Внутри вируса паротита выделяют 13 генотипов. Данная классификация основана на сравнении последовательности нуклеотидных остатков гипервариабельной области генома гена малого гидрофобного белка.

Профилактика ЭП осуществляется в рамках плановой вакцинации населения. Средством профилактики ЭП являются живые вакцины на основе аттенуировапных штаммов. Разные производители вакцин используют или использовали штаммы, относящиеся к различным генотипам: генотип А - Jeryl Lynn, Rubini; генотип В - Urabe; L-Zagreb - отнесен хорватскими исследователями к генотипу D (Ivancic J., et. al., 2004). Российский штамм Ленинград-3 (Л-3) является уникальным и в настоящее время не может быть отнесен ни к одному из известных генотипов (Неверов A.A. и др., 2005; Atra-sheuskaya A.V., et al., 2006).

При применении паротитных вакцин регистрируются посгвакцинальные осложнения, одним из которых является поствакцинальный асептический менингит. Так, для штамма L-Zagreb, прямого деривата Российского штамма Л-3, была показана высокая частота возникновения AM, что в свою очередь породило волну негативных спекуляций в отношении российского штамма Л-3 для которого данных по возникновению AM неописано. Для разрешения этой ситуации необходимо создать простой и доступный метода дифференциальной диагностики поствакцинальных осложнений для подтверждения или опровержения поствакцинальной этиологии AM. Помимо этого, необходимо отличать случаи AM, вызванные вирусом ЭП от других заболеваний, вызванных энтеровирусами, сопровождающихся развитием схожих менингиальиых симптомов. Учитывая эти факты, а также согласно рекомендации ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) об усилении контроля к производственным штаммам паротитных вакцин и критериев оценки их безопасности и иммуногенности необходимо осуществлять контроль генетической стабильности вакцинных штаммов на всех этапах производства.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось разработка молекулярно-генетического метода контроля стабильности вакцины на этапах производства и диагностики поствакцинальных осложнений при применении вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Анализ вакцинного штамма Л-3 на нуклеотидном уровне для выявления возможных

мутаций, возникающих при производстве вакцины.

2. Выбор области генома вируса для дифференцирования вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb, расчет олигонуклеотидных праймеров, выбор оптимальных условий для амплификации целевого фрагмента, отработка условий ресгрикционного анализа, позволяющего дискриминировать штаммы Л-3 и L-Zagreb от остальных штаммов вируса паротита.

3. Создание рекомбинантной плазмиды, как положительного контроля, для проведения дифференциальной диагностики поствакцинальных осложнений при применении вакцин на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb.

4. На животных провести апробирование подхода по выявлению РНК вируса паротита в образцах крови и глоточных смывах.

5. Оценить эффективность метода дифференциальной диагностики паротита с помощью ОТ-ПЦР в образцах слюны и крови, полученных от больных с диагнозом «эпидемический паротит» и привитых вакциной против эпидемического паротита.

Научная новтна и практическая значимость работы.

Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации целевого фрагмента вируса паротита. Сконструирована рекомбинантная плазмида, являющаяся положительным контролем в определении РНК вируса паротита штамма Л-3 и L-Zagreb. Впервые показана возможность дифференциации вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb от всех штаммов других генотипов вируса паротита с помощью ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа. По результатам проделанной работы оформлены и изданы методические рекомендации «Дифференциальная диагностика асептического менингита после применения вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом» от 28 апреля 2009 г.

Изучены молекулярно-биологические особенности иммуногенности штамма Л-3. Изучено формирование иммунного ответа на введение живой аттенуированной вакцины против ЭП на основе штамма Л-3 у мышей линии BALB/c. Положения, выносимые на защиту.

1. Геном вакцинного штамма Л-3 вируса паротита, применявшегося для производства паротитной вакцины в России в 2004 - 2008 годы, является стабильным.

2. Разработанный и апробированный метод ОТ-ПЦР, позволяет детектировать и эффективно дискриминировать вакцинные штаммы Л-3 и L-Zagreb от всех остальных штаммов вируса паротита.

Публикации и апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" Россия, Новосибирск, 2006; "Molecular diagnostics of infectious diseases", Belarus, Minsk, 2007, III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вакщшологня 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения (191 ссылка). Работа изложена на 139 страницах, содержит 20 рисунков, И таблиц.

Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением сбора клинических образцов, получены непосредственно автором.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для реализации поставленных задач были использованы следующие методы:

• Вирусологические: культивирование вируса, концентрирование и очистка вирусных антигенов.

• Молекулярно-биологические: выделение вирусной РНК, ОТ-ПЦР, методы очистки нуклеиновых кислот, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, реакция лигирования, метод плазмидной трансформации E.coli, определение нукпеотидных остатков ДНК, анализ нуклеотидных последовательностей. Для проведения реакций использовали реагенты производства НПО «СибЭнзим», Россия.

• Биологические: иммунизация мышей вакциной против вируса паротита, получение биологических образцов сывороток крови, животных, взятие глоточных смывов у животных получение биологических образцов сывороток крови людей, получение лимфоцитов от лиц, привитых вакциной против вируса паротита.

• Иммунологические: Иммуноферментный анализ: определение антител класса IgM и IgG, реакция нейтрализации, реакция бласттрансформации лимфоцитов людей, оцен-

ка продукции у-ИФН лимфоцитами людей, иммунизированных вакциной против вируса паротита в ELISpot анализе. • Статистические: общепринятые методы описательной статистики: вычисление средних значений и среднестатистических отклонений (М±т).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Молекулярно-гепетическпй контроль гомогенности и стабильности производственных серий вакцинного штамма Л-3

Следуя рекомендации ВОЗ, в данной работе был осуществлен контроль стабильности и гомогешюсти уже готовой формы препарата вахцины, выпускаемой на территории РФ. Проведенный сравнительный анализ нуклеотидных остатков вакцшшого штамма Л-3 со всеми остальными известными последовательностями нуклеотидных остатков штаммов вируса паротита позволил выбрать критические области возможного накопления мутаций в геноме вируса, которые могут являться маркерами его стабильности. Всего таких областей генома было определено четыре: гипервариабельный ген SH, ген NH, С-концевая область гена NP и N-концевая область гена F, как наиболее вариабельные кодирующие части соответствующих генов. Данные области являются «горячими» точками возможного накопления мутаций и имеют важное биологическое значение.

Первая область - С-концевая часть гена N и вторая, N-концевая часть гена F. Эти локусы были выбраны, поскольку при сравнении последовательностей геномов вакцинных штаммов Л-3 и Л-Загреб были выявлены замены нуклеотидов в гене F (G-A позиция в геноме 5037) и NP (A-A/G, позиция в геноме 1059) по сравнению со штаммом Л-3. Замена в гене белка слияния (F) не приводит к смене аминокислоты, в то время как замена в гене нуклеопротеина (NP) штамма L-Zagreb, приводит к существованию 2 разных вариантов данного белка в вирусной популяции, на основе которого производят вакцинный препарат (Неверов А.А. и др., 2005). Поскольку известно, что мутации могут накапливаться и закрепляться в вирусной популяции из-за не значительных изменений условий культивирования, в данном случае был изменен субстрат накопления: штамм Л-3 пассируется на фибробластах эмбрионов японских перепелов, а штамм L-Zagreb на фибробластах эмбрионов кур.

Помимо этого С-концевая часть гена N является гипервариабельной областью генома и содержит нейтрализующие эпитопы (Curran et al., 1993), а также принимает участие в формировании репликативного комплекса вместе с L и Р белками, то есть определяет скорость репликации вируса (Orvell С. 1978; Stallcup К.С. et al., 1979). Из-за своего сродства к матриксному белку М участвует в сборке вирионов в клетке (Coronel et al., 2001). В совокупности все эти факторы влияют на скорость репликации вирусного генома, и как следствие размножения самого вируса, что и отличает «дикие» штаммы от вакцинных, которые в силу своей аттенуации не приводят к генерализации инфекции, а индуцируют противовирусный иммунитет.

Дополнительными объектами исследования явились ген N11 и наиболее вариабельный участок генома - ген SH.

Ген HN был выбран для контроля стабильности, поскольку его центральная область кодирует эпитопы связывания нейтрализующих антител, в белке, данные аминокислотные остатки отвечают за связывание с рецептором клетки-хозяина, нейроминедазную активность, и обуславливают активность белка F (Orvell et al., 1997; Cusi et al., 2001; Kovamees et al., 1990), при этом, находясь на поверхности вириона, эти области белка HN играют основную роль в образовании гуморального иммунитета, то есть влияют на эффективность вакцины и, как следствие, протективность иммунитета (Wolinsky et al., 1985).

Помимо генов структурных белков, геномы парамиксовирусов могут содержать дополнительные единицы транскрипции, белковые продукты которых не входят в состав вириона. Для вируса паротита это ген малого гидрофобного белка SH (Elango N. ct al.,

1988), локализованный между генами F и HN (Elliott G.D. et al., 1989). Именно поэтому, а также из-за своей наибольшей изменчивости в вирусном геноме, этот ген используется для генотипирования штаммов вируса паротита (Jin Y., et. Al., 2005).

Используя данные области геномов в качестве объектов молекулярно-генетического исследования, была проведена оценка стабильности восьми различных серий паротитных вакцин на основе штамма Л-3: 0474-0607, 0473-0607, 0468-0307, 04670307, 0505-0308, 0320-0704, 0230-0704, 0312-0305, а также двух посевных серий вируса №69 и №73. Исследованные серии готовой вакцины были произведены в 2005 - 2008 годы. Посевные серии вируса использовались для производства готовых серий в те же годы. Для проверки генетической стабильности вируса в препарате готовой вакцины и посевных серий нами были определены последовательности нуклеотидных остатков выбранных участков генома. Во всех случаях кДНК, используемая для амплификации целевых фрагментов, была синтезирована методом ОТ с использованием статистического гексануклео-тида d(N6).

Ген SH с фланкирующими районами амплифицировали с использованием пары праймеров SH С и SH Ас. Длина полученного фрагмента совпала с расчетной, и составила 541 п о. Последовательность нуклеотидных остатков гена NH и фланкирующих его регионов была определена с помощью выше описанной методики с использованием пар праймеров П/С 7С, С 7Ас, С 7С, П/С 7Ас, П/С 8С, С 8Ас, С 8С, П/С 8Ас. С-концевая часть геиа N и ген F были получены с помощью следующих праймеров С 1С, П/С 1Ас, П/С 2С, С 2С (участок гена N, содержащий нуклеотидцую замену в позиции 1059) и С 5С и П/С 5Ас (участок гена F, содержащий нуклеотидную замену в позиции 5037), соответственно.

Для определения нуклеотидных остатков каждого фрагмента использовали те же олигонуклеотиды, что и для ПЦР. Консенсусную последовательность нуклеотидных остатков каждого фрагмента получали, сравнивая последовательности обеих цепей ДНК, определенных независимо не менее трех раз. Таким образом, из дальнейшего анализа исключались возможные ошибки, вызванные неточностью определения последовательности нуклеотидных остатков фрагментов ДНК. В результате были получены последовательности н о. указанных регионов всех исследованных серий вакцинного препарата. Сравнение последовательностей н о. проводили путем множественного выравнивания, которое не выявило наличия нуклеотидных замен ни в одной из всех восьми готовых и двух посевных серий по сравнению с последовательностью нуклеотидных остатков вакцинного ре-ференс-штамма Л-3 (номер в базе данных GenBank AY508995).

Использованная методика определения последовательности и.о., (URL: http://www.appliedbiosystems.com/), позволяет определить наличие гетерогенных сайтов если минорный компонент составляет не менее 10% матриц, используемых для определения первичной последовательности.

Таким образом, нами показано, что штамм Л-3, используемый в России для производства живой паротитной вакцины, является стабильным по указанным областям генома.

Известно, что в период с 2005 по 2008 годы было выпущено в России всего 220 серий ЖПВ на основе штамма Л-3. В 2005 - 101, 2006-59, 2007- 35, 2008-25 серий соответственно. Для производства всех этих серий было использовано две серии посевного вируса №69 (0320-0704, 0230-0704, 0312-0305) и №73 (0474-0607, 0473-0607, 0468-0307, 04670307, 0505-0308). Молекулярно-генетический анализ случайно выбранных серий не выявил наличия замен ни в одном из исследованных локусов по сравнению с референс-штаммом Л-3 (номер в базе данных GenBank AY508995). Таким образом, при производстве вакцины на субстрате накопления фибробластов эмбрионов японских перепелов, не выявлено замен в указанных областях вирусного генома как производственного штамма, посевных сериях, так и готовых форм вакцины. Это указывает на стабильность вакцинного штамма используемого в настоящее время в России.

2.2.2. Выбор диагностического участка для молекулярной дифференциации поствакцинальиых осложнений при применении вакцины на основе штамма Л-3 и L-Zagreb от «диких» штаммов вируса паротита

Проведенные исследования и полученные результаты позволили разработать критерии для генетической идентификации штаммов Л-3 и L-Zagreb от других генотипов. Для поиска области генома, подходящей для амплификации, из базы нуклеотидных последовательностей GenBank были взяты полные геномы всех доступных штаммов вируса паротита. На сегодняшний день известно 13 генотипов вируса паротита (различия между наиболее далекими штаммами 17,5% на нуклеотидном и 4% на аминокислотном уровне). В настоящее время в базе данных GenBank находится полная последовательность геномов штаммов, принадлежащих к генотипам А, В, С, D, G, Н, I и штамма Л-3 вируса паротита, который не отнесен ни к одному из существующих генотипов. Все они были взяты в сравнительный анализ, который проводили с использованием программного обеспечения Vector NTI v. 10.0 (InforMax, Bethesda, MD). В результате было обнаружено 147 уникальных нуклеотидных замен в последовательности штамма Л-3 относительно остальных штаммов всех выбранных штаммов вируса паротита. При анализе выявленных нуклеотидных замен было установлено, что только 63 из 147 входят в сайт, распознаваемый какой-либо из эн-донуклеаз рестрикции. При изучении оставшихся нуклеотидных остатков и областей, прилежащих к ним, наиболее подходящим участком генома для разработки предлагаемого метода, оказалась область, локализованная во внутренней части гена HN. Полностью консервативные участки гена гемагппотинина были выбраны в качестве мест гибридизации праймеров таким образом, что длина продукта амплификации составила S08 п.н. Область амплификации располагалась в геноме вируса паротита в позициях 7200-7707 н.о. и содержала два сайта узнавания эндонуклеазой Taql TCGA, так что один из сайтов являлся уникальным для штамма Л-3 и L-Zagreb, а другой сайт был общим для всех штаммов вируса паротита. Схема метода дифференциальной диагностики представлена на рисунке 1.

фрагмент 508 п.н.

рестрикция эндонуклеазой TaqI

208 п.н. 148 и 152 п.я.

152 п.н.

Рисунок 1. Схема метода дифференциальной диагностики вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb от остальных штаммов вируса паротита.

Выбранный участок генома содержит два сайта узнавания эндонуклеазы Taq\ только у штаммов JI-3 и L-Zagreb, так что данный подход может быть использован не только для дифференциации вакцинного штамма J1-3, но и вакцинного штамма L-Zagreb. Это обусловлено тем, что на территории РФ в настоящее время применяется вакцина на основе именно этих двух штаммов.

На рисунке ! изображены этапы проведения исследования для определения и дискриминации вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb от всех остальных штаммов вируса паротита. Первым этапом является получение целевого фрагмента с помощью метода ОТ-ПЦР. Для амплификации выбранною участка были рассчитаны олигонуклеотидные праймеры L-3dR (5TATGATCTCAAAGCACGCTG3') и L-3dF (5' ATGTAATTAATGCCAACTGC3'), которые впоследствии использовались для амплификации целевого фрагмента во всех последующих манипуляциях. Второй этап заключается в очистке ПЦР-продукта и его гидролизе эндонуклеазой Taq\ Третий этап - визуализация в агарозном геле. В результате электрофоретического разделения в случае штаммов Л-3 и L-Zagreb, обнаруживаются три фрагмента: 148, 152 и 208 п.н., во всех остальных случаях только два фра! мента: 356 и 152 п.н. Именно на различии гидролитической картины целевого фрагмента и основан предлагаемый в настоящей работе метод.

Для определения эффективности предлагаемого метода было необходимо провести оценку чувствительности праймеров в ОТ-ПЦР. Чувствительность была проверена с использованием шести штаммов вируса паротита: London-1, Л-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders. РНК этих штаммов выделяли из 100 мкл культуральной вируссодержащей жидкости (КВЖ). В реакции ОТ для синтеза цепи кДНК использовали d(N)6 Результаты ОТ-ПЦР представлены на рисунке 2.

М 1 2 3 4 5 6 М

Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов амплификации целевого фрагмента гена HN в 2% агарозном геле. М - маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600 , 500, 400, 300, 200, 100 п.н.). Дорожки 1-6 - штаммы London-1, Л-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders вируса паротита, соответственно (длина продукта 508 п.н.).

Следующим этапом была очистка и рестрикционный анализ ампликонов, полученных в ОТ-ПЦР. Гидролиз фрагментов проводили с помощью эндонуклеазы рестрикции Тсщ\. Результаты рестрикционного анализа представлены на рисунке 3.

300 п.н.

200 п.н.

100 п н

Рисунок 3. Электрофореграмма результата рестрикции эндонуклеазой Taql ампликонов гена HN в 2% агарозном геле. М - маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600., 500, 400, 300, 200, 100 п.н.). Дорожки 1-6 - штаммы London-1, L-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders вируса паротита соответственно.

Из рисунка 2 следует, что во всех случаях амплифицируется фрагмент расчетной длимы (508 п.н.). Последовательность нуклеотидных остатков всех полученных продуктов амплификации определяли по методу Сэнгера с использованием олигонуклеотидов L-3dR и L-3dF. Результаты проведенного секвенирования фрагментов подтвердили подлинность амплифицированных фрагментов. Таким образом, чувствительность на данном этапе составила 100% для всех шести штаммов, взятых в исследование.

Как можно видеть на рисунке 3, в результате специфического гидролиза амнлико-нов, полученных с кДНК штаммов London-1, PetroNoV, Dragoon, Urabe, Enders, образуются продукты с расчетными длинами 356 и 152 п.н. При гидролизе ампликона, полученного с кДНК штамма Л-3, получаются три фрагмента с расчетными длинами: 148, 152 и 208 пл., на рисунке они представлены двумя полосами длинами около 150 и 200 п.н., фрагменты 148, 152 п.н. видны как одна полоса. В результате картина гидролиза целевых фрагментов гена HN всех шести штаммов вируса паротита, взятых в исследование, соответствовала теоретически рассчитанной.

Таким образом, на примере шести взятых в исследование штаммов, представляющих пять генотипов и вакцинный штамм Л-3 показано, что предложенный метод позволяет дифференцировать вакцинные штаммы Л-3 L-Zagreb и от других штаммов вируса паротита, и может быть использован с этой целью.

2.2.3. Получение рекомбинаитной плазмиды, содержащей полноразмерный ген HN вируса паротита штамма Л-3

Для использования предложенного метода дифференциации вакцинных штаммов паротита Л-3 и L-Zagreb от штаммов других генотипов с помощью ОТ-ПЦР и последующей рестрикцией, необходим положительный контроль. Для этого была сконструирована рекомбинантиая плазмида, несущая в своем составе копию гена HN штамма Л-3. Целевой фрагмент, содержащий полноразмерную копию гена HN штамма Л-3 вируса паротита, был клонирован в составе вектора pGEM-T-1 (Promega, США). Карта полученной рекомбинаитной конструкции представлена на рисунке 4.

orí

Рисунок 4. Структура рекомбинаитной плазмиды рНЫ-Ь-З. Ь-ЗсЦ5 и Ь-ЗйЯ места гибридизации дифференциальных праймеров. £соИ и ВатШ - сайты рестрикции, по которым было произведено встраивание гена НИ.

Поскольку полученная конструкция несет в своем составе копию гена НЫ штамма Л-3 вируса паротита, то она может быть использована в реакции ПЦР и последующей рестрикции в методе дискриминации этого штамма (а также штамма L-Zagreb, если это необходимо) от «диких» штаммов вируса паротита (рисунок 5).

Рисунок 5. Схема использования рекомбинантной плазмиды pHN-L-З в методе дифференциальной диагностики штамма Л-3.

Как следует из рисунка 5, картина специфического гидролиза целевого фрагмента, амплифицированного с помощью праймеров L-3-NH-r и L-3-NH-f с матрицы pHN-L-3, совпадает с гидролитической картиной того же фрагмента, полученного в ОТ-ПЦР с РНК штамма Л-3 вируса паротита (рис. 11). Таким образом, рекомбинантная плазмида может быть использована в методе дифференциальной диагностики вакцинного штамма Л-3, а также вакцинного штамма L-Zagreb.

Для оценки эффективности предложенного метода по выявлению РНК вируса паротита штамма Л-3 были поставлены модельные эксперименты на животных, а также на клиническом материале полученном от заболевших людей ЭП и добровольцев, привитых паротитной вакциной российского производства.

2.2.4. Иммунизация мышей вакцинным штаммом Л-3 вируса паротита

Для апробации предложенного выше метода было проведена внутримышечная иммунизация мышей линии BALB/c вакцинным штаммом Л-3 в дозе 104 БОЕ/мышь в объеме 100 мкл. Для определения РНК вируса паротита у животных исследовали образцы глоточных смывов и цельной крови на 0, 1, 2, 3, 4, 5-е сутки после иммунизации. У животных на 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 30 и 40-е сутки были получены образцы сывороток крови, которые использовались для определения вирусоспецифических антител IgG методом иммуно-фермептного анализа (ИФА) и в реакции нейтрализации (РН). На каждый срок наблюдения для получения образцов крови использовали 3-х мышей. Все собранные сыворотки крови и образцы РНК до исследования хранились при -70 °С.

При исследовании глоточных смывов и крови иммунных животных, РНК вируса паротита штамма Л-3 обнаруживалась в слюне на 2-е и 3-й, а в крови на 3-й и 4-е сутки после иммунизации (рисунок 6). Наличие РНК вируса паротита в образцах подтверждали методом ОТ-ПЦР с использованием стандартных диагностических праймеров на ген SH вируса паротита. Амплификацию диагностического фрагмента проводили по стандартной методике (Jin L. et al., 2005).

М 1 2 345678 9 ЮМ

Рисунок 6. Электрофореграмма результатов ПЦР диагностического фрагмента гена 8Н длиной 495 п.н. при иммунизации мышей вакцинным штаммом Л-3. М-маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600., 500, 400, 300, 200, 100 п.н ), 1, 2, 3, 4

- образцы слюны, полученные на 1-е, 2-е, 3-е и 4-е сутки после иммунизации; 5, 6, 7, 8, 9,

- образцы крови, полученные на 1-е, 2-е, 3-е, 4-е и 5-е сутки после иммунизации, 10 - отрицательный контроль реакции.

Определение первичной структуры полученных ПЦР-фрагменгов и последующее сравнение с последовательностью нуклеотидных остатков гена 8Н вакцинного штамма Л-3, подтвердило подлинность ампликонов, что косвенно указывает на факт репликации штамма Л-3 вируса паротита. Сам вирус паротита из крови и слюны вакцинированных животных на культуре клеток выделить не удалось ни на один из сроков наблюдения. Таким образом, полученные данные еще раз подтверждают, что молекулярно-биологический способ детекции вируса является более чувствительным по сравнению с вирусологическими методами.

В рамках изучения чувствительности предложенного нами подхода к определению и дифференциации штамма Л-3 вируса паротита из образцов глоточных смывов и крови, полученных на те же сроки, была выделена суммарная РНК и использована в ОТ-ПЦР с разработанными в настоящей работе праймерами (Ь-ЗШ7 и Ь-3<Ж). Результаты приведены на рисунке 7.

М 1 2 3 45678 9 ЮМ

Рисунок 7. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена гемагглютини-на с кДНК, полученной от мышей, зараженных вирусом паротита штамм Л-3, с использованием дифференциальных праймеров (L-3dF и L-3dR) Длина продукта 508 п.н М-маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600., 500, 400, 300, 200, 100 п.н ). 1, 2, 3, 4 - образцы слюны, полученные на 1-е, 2-е, 3-е и 4-е сутки после иммунизации; 5, 6, 7, 8, 9, - образцы крови, полученные на 1-е, 2-е, 3-е, 4-е и 5-е сутки после иммунизации, 10 - отрицательный контроль реакции.

Из рисунка следует, что расчетный фрагмент длиной 508 п.н. амплифицируется из образцов слюны на 2-е и 3-й, а также образцов крови на 3-й и 4-е сутки соответственно, после иммунизации. Специфичность ОТ-ПЦР подтверждали определением первичной структуры всех полученных ампликонов. Сравнительный анализ нуклеотидных остатков подтвердил подлинность ампликонов.

В результате положительные результаты обнаружения вирусной РНК на различные сроки наблюдения при применении обеих пар праймеров (на ген SH и на внутреннюю область гена HN) совпадают, то есть чувствительность дифференциальной и диагностической пар праймеров в данном эксперименте была одинакова.

Сыворотки крови, полученные от иммунизированных мышей на 24-е, 30-е и 40-е сутки после иммунизации обладали вирус нейтрализующей активностью по отношению ко всем взятым в исследование штаммам вируса паротита.

2.2.5. Определение РНК в слюне и крови у добровольцев, привитых вакциной на основе штамма Л-3

Исследование было одобрено этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (П<В()0001360). С участниками исследования подписывалось информированное соглашение об участии в данных исследованиях.

Для изучения репликации вируса паротита исследовали образцы слюны и периферической крови, полученные от добровольцев на разные сроки наблюдения. С 1-х по 6-е сутки после вакцинации определяли наличие РНК вируса методом ОТ-ПЦР. Для визуализации результатов, использовали как диагностические, так и дифференциальные пары праймеров.

Полученные данные указывают на репликацию вакцинного штамма Л-3 у добровольцев, типичная картина представлена на рисунке 8.

М 1 2 3 4 5 6 7 М

Рисунок 8. Электрофореграмма результатов ПЦР диагностического фрагмента гена SH длиной 495 н о. из образцов слюны при иммунизации добровольцев парогитной вакциной на основе штамма Л-3. М-маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300,200, 100 п.н.), 1, 2, 3, 4 5, 6 - образцы слюны полученные на 1-е, 2-е, 3-е, 4-е, 5-е, 6-е сутки после иммунизации, 7 - отрицательный контроль реакции.

Для верификации разработанной пары дифференциальных праймеров, полученные образцы кДНК использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР. Данные по чувствительности полностью совпадали с диагностическими праймерами, результаты представлены на рисунке 9.

М1234 5 6 7 М

Рисунок 9. Электрофореграмма результатов ПЦР диагностического фрагмента гена HN длиной 508 п.н. из образцов слюны при иммунизации добровольцев паротитной вакциной на основе штамма Л-3. М-маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.), 1,2, 3,4, 5, 6 - образцы слюны полученные на 1-е, 2-е, 3-е, 4-е, 5-е, 6-е сутки после иммунизации, 7 - отрицательный контроль реакции.

Как следует из рисунков 8 и 9, РНК вируса паротита обнаруживалась в слюне на 2-е, 3-й, 4-е и 5-е сутки. В крови РНК вируса не обнаруживалась на всех сроках наблюдения. Из слюны и периферической крови на всех сроках наблюдения вирус паротита на клеточной культуре выделить не удалось. Для всех полученных фрагментов, как диагностиче-

ского участка гена SH, так и дифференциального фрагмента гена HN, была определена последовательность н.о. Определенная первичная структура подтвердила подлинность полученных фрагментов. Таким образом, специфичность предложенного в настоящей работе метода по идентификации штамма J1-3, а также штамма L-Zagreb по ключевому региону HN была такая же, как и для системы генотипирования штаммов вируса паротита по гену SH, описанной ранее (Jin L. et al., 2005). Помимо этого в рамках данного эксперимента было показано наличие РНК вакцинного штамма JI-3 у добровольцев в первые пять суток после иммунизации.

2.2.6. Исследование случаев заболевания вирусом эпидемического паротита у

людей

В течение 2001-2004 годов было расследовано 33 случая заболевания эпидемическим паротитом. При этом из Новосибирска было получено 18 образцов из Минска (Республика Беларусь) 15 образцов. Для подтверждения клинического диагноза было проведено лабораторное исследовшше полученных образцов (слюна, кровь).

Серологическое подтверждение включало в себя определение уровня специфических антител IgM и IgG и авидность IgG, а также PH. Молекулярно-генетическое подтверждение проводили с помощью ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса паротита (Jin L. et al., 2005) с последующим определением генотипа возбудителя. Серологически диагноз ЭП паротит был подтвержден во всех 33-х случаях.

В каждом случае был определен генотип изолята стандартным способом определ-ния первичной структуры гена SH и сравнением полученных данных с уже имеющимися в базе данных GenBank. В результате из 18 пзолятов, собранных в Новосибирске, 13 принадлежали к генотипу Н, остальные 5 к генотипу С. Все 15 образцов, полученных из Минска, принадлежали к генотипу Н. Последовательности гена SH, образцов ЭП, полученных из Минска в 2001-2003 годах, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами DQ136174 (П1/2001), DQ136175 (П4/2002) и DQ250041 (П14/2003), соответственно.

Помимо стандартного лабораторного подтверждения диагноза и исследования иммунологических показателей параллельно была определена РНК вируса паротита в слюне у всех 33-х пациентов с использованием предложенного в настоящей работе метода ОТ-ПЦР. РНК вируса паротита в крови не обнаруживалась на всех сроках наблюдения. По результатам гидролиза целевых фрагментов было установлено, что пациенты были заражены «дикими» штаммами вируса паротита, что подтвердили генотипированием штаммов по гену SH.

Проведенные исследования позволили использовать полученный материал для дальнейшего изучения чувствительности дифференциальной пары праймеров, разработанной в данной работе. Для постановки ПЦР использовали массив кДНК, полученный ранее с помощью статистического гексануклеотида d(Nó). При сравнении специфичности и чувствительности диагностической и дифференциальной пар праймеров все образцы, положительные для диагностической пары, были также положительны и для дифференциальной пары, что указывает на высокую специфичность и чувствительность предложенного в настоящей работе метода. Иллюстрацией полученных результатов является рисунок 10.

Тац\

Рисунок 10. Электрофореграмма результатов амплификации (А) и рестрикции (Б) фрагментов в агарозном 2% геле. А - результат амплификации дифференциального фрагмента гена ПК М-маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.) 1 - результат амплификации образца периферической крови заболевшего, 2 - результат амплификации образца слюны, 3 - положительный контроль на Л-3, плазмида рНМ-Ь-З. Б - результат рестрикции амлликонов эндонуклеазой Тад 1: 1 - ампли-кон полученный из образца слюны заболевшего, 2 - ампликон с рекомбинантной плазми-ды р! ¡N'-1,-3.

Как видно на рисунке 10А дорожка 1, из образца крови заболевшего на третьи сутки после начала клинических проявлений целевой фрагмент амилифицировался, тогда как из образца слюны взятого в те же сроки целевой фрагмент был получен. Результаты рестрикционного анализа целевых ампликонов, эндонуклеазой Тад], представлены на рисунке 10 Б. Фрагмент гена НЫ вируса паротита обоих генотипов (С и Н) при гидролизе образовывал два фрагмента с длинами 356 и 152 п.н,( рисунок 10 Б дорожка 1). При использовании плазмиды р! 1Ы-Ь-3, картина гидролиза закономерно отличалась (рисунок 10 Б дорожка 2).

В результате показано, что данный метод можно использовать для подтверждения паротитной этиологии заболевания, то есть определить наличие РНК вируса паротита в биологическом образце При этом, исходя из полученных результатов, целесообразно осуществлять поиск РНК вируса паротита в образцах слюны, так как ни у одного из пациентов РНК вируса паротита не была вьивлена в образцах крови ни на один из сроков наблюдения.

К сожалению, в рамках данного исследования не были предоставлены образцы СМЖ. Поскольку одним из основных поствакцинальных осложнений является асептический менингит, то было бы крайне важно изучить образцы СМЖ от пациентов с подозрением на вакцинную этиологию заболевания. В связи с чем, далее были проведены модельные эксперименты, направленные на обнаружение РНК вируса паротита в образцах СМЖ.

2.2.7. ОТ-ПЦР с образцами СМЖ, полученными от внешне здоровых людей, а также пациентов с диагнозами гнойный (не вирусный) менингит и клещевой энцефалит

Для продолжения изучения специфичности праймеров для ОТ-ПЦР в исследовании было использовано 36 образца СМЖ. Из них, 4 образца полученных от внешне здоровых людей, 14 образцов от пациентов с диагнозами «гнойный менингит» и 18 с диагнозом «клещевой энцефалит», у которых диагноз был подтвержден серологическими и вирусологическими методами. Все образцы СМЖ были проверены на наличие РНК вируса паротита с использованием ОТ-ПЦР. Для этого использовались две пары праймеров. первая

пара для амплификации гена SH, применяемая для генотипирования штаммов вируса паротита (Jin L. et al., 2005) и, вторая, для дискриминации вакцинного штамма Л-3, предложенная в данной работе. Для подтверждения адекватности прохождения всех стадий от выделения РНК до амплификации был использован набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФГУН ЦНИИЭ, Рослотребнадзора) и прилагаемая система внутреннего контроля В результате все образцы СМЖ были отрицательны на наличие РНК вируса паротита, то есть не было выявлено ни одного положительного сигнала амплификации, соответствующего РНК вируса паротита. В результате специфичность составила 100% как для метода, предлагаемого в настоящей работе, так, и для описанного ранее (Jin L. et al., 2005).

Далее была определена чувствительность метода ОТ-ПЦР при выделения вируса паротита из СМЖ Для этого ранее исследованные образцы СМЖ были контаминированы вирусной суспензией штаммов Л-3 и Dragoon в объеме 100 мкл в количестве 1000 БОЕ. Полученные пробы были раститрованы с различной кратностью до 0,05 БОЕ/мл. В дальнейшем, из пробы каждого разведения была поставлена ОТ-ПЦР. Результаты свидетельствуют, что использованный метод позволяет выявить РНК вируса паротита в концентрации 500 БОЕ/мл.

Затем, образцы СМЖ, часть из которых была контаминирована штаммом Л-3, а другая часть штаммом Dragoon в дозе 50 БОЕ в объеме 100 мкл были использованы для верификации предложенного метода. После амплификации дифференциальными прайме-ров L-3-dR и L-3-dF был получен продукт ожидаемой длины. Подлинность фрагментов была установлена секвенированием. Последующий гидролиз полученных ампликонов представлен на рисунке 11.

1 2 3 4 5 6 7 8

500 н о. 400 но. 300 но.

200 н о.

100 н о.

Рисунок 11. Электрофореграмма результатов амплификации и рестрикции ампликонов гена HN в 2% агарозном геле. На дорожках 1, 8 - маркер молекулярных весов (длины 1,500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.). На дорожке 2 - продукт амплификации штамма Dragoon, 4 - продукт амплификации штамма Л-3, 6 - результат амплификации целевого фрагмента с рекомбинантной плазмиды pHN-L-З, использованной в качестве матрицы, 3, 5 и 7 - результат рестрикции полученных фрагментов эндонуклеазой рестрикции Taq\, соответственно, Dragoon, JI-3 и рекомбинантной плазмиды.

Из рисунка видно, что картины амплификации и гидролиза целевого фрагмента, полученного с РНК штамма Л-3 вируса паротита и рекомбинантной плазмиды pHN-L-3, совпадают (дорожки 5 и 7), тогда как электрофоретически, картина гидролиза фрагмента полученного со штамма Dragoon (дорожка 3) визуально отличается от результатов рестрикции фрагментов, полученных со штаммов Л-3 и плазмиды pHN-L-3.

Для РНК-содержащих вирусов показано, что отношение (вирусная части-ца)/(инфекционная частица) обычно принимает значения между 100 и 1000 (Lee W. М., 1993). Отсюда было сделано предположение, что наш подход позволяет обнаруживать 50 -100 копий РНК вируса паротита в 100 мкл биологического образца. Этот предел чувствительности для вируса паротита является 10-кратно более чувствительным по сравнению с ранее предложенным методом (Boriskin Yu., et. al., 1993) и, в тоже время, сопоставимым с таковым для вирусов семейства Enteroviruses при обнаружении их РНК методом ОТ-ПЦР (Casas I. A., et. al., 1997; Rotbart, Н. А. 1995). Предложенные ранее методы детекции РНК вируса паротита позволяли подтвердить ее наличие (Palacios G, et. al., 2005), либо требовали дополнительных манипуляций, таких как определение первичной структуры гена SH (Cusi MG, et. al., 1996) для более точного определения генотипа вируса паротита.

Предложенный нами метод дифференциальной диагностики эпидемического паротита и поствакцинальных осложнений при применении вакцин против паротита на основе штаммов Ленинград -3 (Л-3) и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим ресгрикцион-ным анализом имеет ряд преимуществ по сравнению с предварительным выделением вируса на культуре клеток с последующей аплификацией и определение первичной структуры фрагмента. Различие в чувствительности между ОТ-ПЦР и выделением вируса на культуре клеток можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, положительный результат, полученный в ОТ-ПЦР при обнаружении геномной РНК вируса паротита не указывает на репликативные способности обнаруженных вирусных частиц. Во-вторых, например, частичная потеря жизнеспособности или присутствие небольшого количества инфекционных вирусных частиц и/или дефектных вирионов или комплексов вирус-антитело в образцах могут значительно снизить чувствительность изоляции вируса на культуре клеток. В то время как подобные факторы практически не влияют на уровень обнаружения РНК вируса паротита в ОТ-ПЦР.

Таким образом, представляется наиболее актуальным создание чувствительных систем определения и дифференциации штаммов вируса паротита, в частности дискриминации штамма Л-3 и L-Zagreb для изучения поствакцинальных осложнений, связанных с применением живой паротитной вакцины на территории РФ.

Выводы

1. Определена последовательность нуклеотидных остатков четырех наиболее вариабельных областей генома вируса паротита в двух посевных сериях штамма Ленин-град-3 и восьми готовых сериях препарата паротитной вакцины. Показана идентичность исследоватак областей с соответствующей последовательностью рефе-ренс-пггамма Л-3 (номер в базе дашшх ОепВапк АУ508995).

2. Разработан метод дифференциации вакцинных штаммов Лешшград-З и Ь-Ха$кЪ вируса паротита от остальных, описанных на сегодняшний день вирусов. Показано, что использовашгый метод позволяет выявить вирус паротита в концентрации не менее чем 500 БОЕ/мл.

3. Подготовлены и изданы методические рекомендации «Дифференциальная диагностика эпидемического паротита и поствакцинальных осложнений при применении вакцин против паротита на основе штаммов Ленинград-3 и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом» от 28 апреля 2009.

4. Сконструирована рекомбинантная плазмцда, содержащая полноразмерную копию гена НЫ вируса паротита штамма Ленинград-3, которая используется для дифференциации штаммов Ленинград-3 и Ъ-ХацгеЪ от штаммов вируса паротита других генотипов качестве положительного контроля.

5. Установлено, что РНК вируса паротита обнаруживается в слюне вакцинированных паротитной вакциной до пяти суток после иммунизации. У больных с клиническим диагнозом «эпидемический паротит» РНК вируса выявляется в слюне до пяти суток с момента клинических проявлений заболевания.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. Atrasheuskaya AV, Blatun ЕМ, Kulak MV, Atrasheuskaya A, Karpov IA, Rubin S, Ignatyev GM. Investigation of mumps vaccine failures in Minsk, Belarus, 2001-2003. // Vaccine. 2007 Jun 11;25 (24):4651-8.

2. Atrasheuskaya AV, Kulak MV, Rubin S, Ignatyev GM. Mumps vaccine failure investigation in Novosibirsk, Russia, 2002-2004. // Clin Microbiol Infect. 2007 Jul;13(7):670-6.

3. Кулак M.B., Букин E.K., Отрашевская E.B., Юнасова Т.Н., Игнатьев Г.М. Изучение некоторых параметров иммунитета при иммунизации мышей живой паротитной вакциной. //Биопрепараты. 2007 Июнь,2(26):13-19.

4. Кулак М.В., Нетесова Н.А., Белавин П.А., Серегина Е.В., Игнатьев Г.М. Получение и исследования иммунобиологических свойств рекомбииантных белков вируса кори. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2008, 1 (23): 34-37.

5. Atrasheuskaya AV, Kulak MV, Neverov AA, Rubin S, Ignatyev GM. Measles cases in highly vaccinated population of Novosibirsk, Russia, 2000-2005. // Vaccine. 2008 Apr I6;26(17):2Ill-8.

6. Кулак M.B., Белавин П.А., Нетесова Н.А., Юнасова Т.Н., Голикова JI.H., Бектемиров Т.А., Игнатьев Г.М. Дифференциация вакцинного штамма Л-3 от других штаммов вирусу паротита методом ОТ-ПЦР. // Биопрепараты. 2008 Декабрь. 4(32):7-10.

Тезисы конференций:

1. M.V. Kulak, N.A. Netesova, Р.А. Belavin, G.M. Ignatyev. Recombinant measles proteins, as the improved analogue of whole virus based antigen in ELJSA to diagnostics reproach genotypes A and D6. // 16й1 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.Nice, April l-4th, 2006.

2. A.V. Atrasheuskaya, E.M. Blatun, M.V. Kulak, E.K. Bukin, A V. Atrasheuskaya, I.A. Karpov, G.M. Ignatyev. Mumps cases in Minsk, Belarus, 2001-2003. // 16й European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, April l-4th, 2006.

3. E.B. Отрашевская, M.B. Кулак, A.E. Нестеров, Г.М. Игнатьев. Случаи паротита в Новосибирске, 2002-2004 годы: вирусологические и серологические параметры. // Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". -Сентябрь 27-29,2006. Новосибирск.

4. M.V. Kulak, А.А. Neverov, A.V. Atrasheuskaya, E.K. Bukin, G.M. Ignatyev. Investigation of genetic stability and homogeneity vaccine strain Leningrad-3 of mumps virus. Molecular diagnostics complication after vaccination. // Molecular diagnostics of infectious diseases. Belarus, Minsk, 17-18th May, 2007.

По результатам работы были подготовлены и изданы методические рекомендации: «Дифференциальная диагностика эпидемического паротита и поствакцинальных осложнений при применении вакцин против паротита на основе штаммов Ленинград -3 (Л-3) и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом», Москва, от 28 апреля 2009 г.

Благодарности.

Автор выражает благодарность сотрудникам ГНЦ ВБ «Вектор» Нетесовой H.A., Белавину H.A., Серегину C.B., Ильичевой Т.Н. за неоценимую помощь в проведении работы и обсуждении результатов; Букину Е.К., сотруднику ГУ Новосибирского областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, за предоставленные образцы СМЖ и дружескую поддержку; сотрудникам ГИСК им. Л.А.Тарасевича Юнасовой Т.Н. и Игнатьеву Г.М. за помощь в обсуждении и публикации полученных результатов; сотрудникам НПО «Микроген» Ограшевской Е В. и Сухановой Л.Л. за профессиональную консультативную помощь.

Кулак Михаил Валерьевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЛЕНИНГРАД-3 ВИРУСА ПАРОТИТА

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 18.02.2010. Заказ № 9. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулак, Михаил Валерьевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика вирусов семейства Paramixoviridae. Классификация. Геном. Морфология. Биологические характеристики. Патогенез. Эпидемиология.

1.2. Серодиагностика эпидемического паротита.

1.3. Молекулярно-генетическая диагностика эпидемического паротита.

1.4. Сравнительная характеристика штаммов вируса паротита, применяемых для производства вакцин. Сероконверсия. Эффективность. Безопасность.

1.5. Молекулярно-иммунологические основы вакцинонедостаточности при вакцинации против эпидемического паротита.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита"

Эпидемический паротит (ЭП) входит в число наиболее распространенных респираторных вирусных заболеваний человека. Вспышки данного заболевания регистрируются практически во всех странах мира. Возбудитель, вирус паротита, принадлежит к роду Rubulavirus семейства Paramixoviridae и представлен 13 генотипами от А до L в результате анализа последовательности н.о. неструктурного гена SH и прилегающих областей (Jin L. et al., 2005). Профилактика ЭП осуществляется в рамках плановой вакцинации населения. Средством профилактики ЭП являются живые вакцины на основе аттенуированных штаммов. Разные производители вакцин используют или использовали штаммы, относящиеся к различным генотипам: генотип А - Jeryl Lynn, Rubini; генотип В — Urabe; L-Zagreb - отнесен хорватскими исследователями к генотипу D (Ivancic J., et. al., 2004). Российский штамм Ленинград-3 (Л-3) является уникальным и в настоящее время не может быть отнесен ни к одному из известных генотипов. (Неверов А.А. и др., 2005; Atrasheuskaya A.V., et al., 2006).

Согласно рекомендации ВОЗ об усилении контроля над производственными штаммами паротитных вакцин и критериев оценки их безопасности и иммуногенности необходимо осуществлять контроль генетической стабильности вакцинных штаммов на всех этапах производства (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.). Для вакцинного штамма Л-3 ранее была показана стабильность и гомогенность производственного штамма на нуклеотидном уровне, а также готовой вакцины, выпускаемой до 2004 года включительно (Неверов А.А. и др., 2005). Поэтому необходимо в дальнейшем осуществлять контроль стабильности готовых серий противопаротиной вакцины на основе штамма Л-3.

На сегодняшний день, по данным ряда исследователей указанные вакцинные штаммы обеспечивают различные уровни сероконверсии и эффективности. Из-за длительного применения вакцин, антигенные свойства «диких» штаммов значительно изменились, что привело к снижению эффективности ряда вакцин (Peltola Н., et al., 2007). Это связано с тем, что сероконверсия не всегда приводит к формированию протективного иммунитета (Briss P. A., et. al, 1994; Hersh В. S., et. al., 1991; Strohle A., et. al., 1996), поэтому особенно важно проводить изучение формирования поствакцинального иммунитета в результате применения противопаротитных вакцин.

Одним из факторов, осложняющих применение вакцин на основе существующих штаммов, является их возможная нейровирулентность (Sugiura A. and A. Yamada, 1991; Forsey Т. et al., 1992; Miller E.M. et al., 1993). Под нейровирулентностью понимают случаи развития поствакцинального асептического менингита (AM), вызванного применением вакцин против ЭП. Известно, что основными причинами развития вакциноассоциированных поствакцинальных осложнений могут быть низкое качество вакцинного препарата (возможная остаточная вирулентность или реверсия штамма к дикому типу), а также особенности вакцинируемого, возможное наличие иммунных нарушений в организме, способствующих генерализации вакцинного штамма, который вызывает поражения такие же, как и «дикие» штаммы данного вируса (Goleva OV, et. al., 2004). Подобные осложнения могут приводить к энцефалиту с тяжелыми последствиями в виде паралича или даже смерти (Plotkin S.A., 2004).

Существуют довольно противоречивые данные о частоте AM как поствакцинальном осложнении, (Tesovic G., et. al., 1993; Tesovic G., et. al., 2006; Kaic В., 2007; da Cunha S.S., et. al., 2002; Kulkarni P.S., et. al., 2005), что связано с использованием различных подходов к оценке и выявлению AM. Рядом авторов ранее уже подчеркивалась необходимость создания стандарта по диагностике и исследованию случаев AM при применении вакцины против ЭП (Bonnet М.С., et. al., 2006).

Недостатками применяемых в настоящее время методов является их высокая стоимость и потребность в высокотехнологичном оборудовании. Метод ОТ-ПЦР, предложенный ранее группой авторов (Palacios G., et. al., 2005), по определению содержания РНК вируса паротита в спинномозговой жидкости (СМЖ), может использоваться для диагностики заболевания паротитом, но не позволяет определеить штамм, вызвавший заболевание. В связи с этим существует необходимость создания простого и доступного метода дифференциальной диагностики поствакцинальных осложнений для подтверждения или опровержения поствакцинальной этиологии AM, связанного с вакцинацией против вируса ЭП. Помимо этого, необходимо отличать случаи AM, вызванные вирусом паротита от других заболеваний, таких как энтеровирусные инфекции, сопровождающиеся развитием схожих менингиальных симптомов. Целью настоящего исследования являлось: разработка молекулярно-генетического метода контроля стабильности вакцины на этапах производства и диагностики поствакцинальных осложнений при применении вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов JI-3 и L-Zagreb. Задачи настоящего исследования:

1. Анализ вакцинного штамма JT-3 на нуклеотидном уровне для выявления возможных мутаций, возникающих при производстве вакцины.

2. Выбор области генома вируса для дифференцирования вакцинных штаммов J1-3 и L-Zagreb, расчет олигонуклеотидных праймеров, выбор оптимальных условий для амплификации целевого фрагмента, отработка условий рестрикционного анализа, позволяющего дискриминировать штаммы Л-3 и L-Zagreb от остальных штаммов вируса паротита.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность дифференциации вакцинного штамма Л-3 от всех штаммов других генотипов вируса паротита с помощью ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа. Изучено формирование иммунного ответа на введение живой аттенуированной вакцины против ЭП на основе штамма Л-3 у мышей линии BALB/c. Практическая значимость работы. Разработан метод ОТ-ПЦР, позволяющий выявить РНК вируса паротита и провести дифференциацию вакцинного штамма Л-3 от «диких» штаммов вируса паротита с помощью рестрикционного анализа. Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации дифференциального фрагмента. Сконструирована рекомбинантная плазмида, являющаяся положительным контролем в определении РНК вируса паротита штамма Л-3. Изучены молекулярно-биологические основы иммуногенности штамма Л-3. По результатам проделанной работы оформлены и изданы методические рекомендации «Дифференциальная диагностика асептического менингита после применения вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом». Положения, выносимые на защиту

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" Россия, Новосибирск, 2006; "Molecular diagnostics of infectious diseases", Belarus, Minsk, 2007, III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кулак, Михаил Валерьевич

выводы

1. Определена последовательность нуклеотидных остатков четырех наиболее вариабельных областей генома вируса паротита в двух посевных сериях штамма Ленинград-3 и восьми готовых сериях препарата паротитной вакцины. Показана идентичность исследованных областей с соответствующей последовательностью референс-штамма Л-3 (номер в базе данных GenBank AY508995).

2. Разработан метод дифференциации вакцинных штаммов Ленинград-3 и L-Zagreb вируса паротита от остальных, описанных на сегодняшний день вирусов. Показано, что использованный метод позволяет выявить вирус паротита в концентрации не менее чем 500 БОЕ/мл.

4. Сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая полноразмерную копию гена HN вируса паротита штамма Ленинград-3, которая используется для дифференциации штаммов Ленинград-3 и L-Zagreb от штаммов вируса паротита других генотипов качестве положительного контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время применение живой аттенуированной вакцины против эпидемического паротита на основе штамма Л-3 в России позволило резко снизить частоту данного заболевания. Но вероятные проблемы, такие как возможная нейровирулентность, низкая иммуногенность и, в особенности, поствакцинальные осложнения, в частности асептический менингит (AM) остаются в фокусе внимания научных исследований.

Согласно рекомендации ВОЗ об усилении контроля за паротитными вакцинами (WHO.INT 09/2004), направленной на изучение стабильности и безопасности в процессе их производста и применения, нами была показана молекулярно-генетическая стабильность исследованных регионов вирусного генома штамма Л-3 восьми различных серий паротитных вакцин 0474-0607, 0473-0607, 0468-0307, 0467-0307, 0505-0308, 03200704, 0230-0704, 0312-0305 и двух посевных серий вируса №69 и №73. Исследованные серии готовой вакцины были произведены на территории РФ с 2005 по 2008 годы. Для изучения молекулярно-генетической стабильности были выбраны четыре локуса вирусного генома: гипервариабельный ген SH, ген NH, С-концевая область гена NP и N-концевая область гена F, как наиболее вариабельные кодирующие части соответствующих генов. Сравнение последовательностей нуклеотидных остатков данных регионов, проводили путем множественного выравнивания, которое не выявило наличия нуклеотидных замен ни в одной из всех семи серий по сравнению с последовательностью нуклеотидных остатков вакцинного референс-штамма Л-3 (номер в базе данных GenBank AY508995).

Для решения проблем, связанных с вакцинацией, в частности проблемы AM, был разработан подход по выявлению РНК штаммов вируса паротита на основе ОТ-ПЦР, в СМЖ в слюне, а так же в крови. Рестрикционный анализ полученного таким образом

87 специфического фрагмента (508 п.о.) позволяет дифференцировать вакцинный штамм Л-3, а также вакцинный штамм L-Zagreb от всех остальных штаммов вируса паротита. Особенностью данного региона являлось наличие одного общего для всех геномов сайта рестрикции эндонуклеазой Taql, и наличие еще одного сайта рестрикции, но только для штаммов Л-3 и L-Zagreb. Данный выбор является не случайным и обусловлен тем, что на территории РФ, в настоящее время применяется вакцина на основе именно этих двух штаммов. В результате, при обработке продукта амплификации эндонуклеазой рестрикции Taql, в случае с Л-3 (и L-Zagreb) образуется три фрагмента с длинами: 148, 152, 208 п.о., в то время как в случае с любым другим штаммом вируса паротита - два фрагмента с длинами: 356, 152 п.о. Последующая визуализация результатов рестрикции в агарозном геле позволяет определить наличие РНК вируса паротита и, одновременно, дифференцировать случай поствакцинального осложнения (AM), вызванного вакцинными штаммами Л-3 или L-Zagreb, от случаев заболевания ЭП.

Показанная ранее генетическая стабильность производственного вакцинного штамма Л-3 на нуклеотидном уровне, позволила продолжить исследования и сконструировать рекомбинантную плазмиду, содержащую полноразмерную копию гена HN вируса паротита штамма Л-3. Данная рекомбинантная плазмида может выступать в качестве эталона при дифференциации штаммов Л-3 и L-Zagreb от остальных штаммов, поскольку при амплификации целевого фрагмента образуется продукт, идентичный последовательности штамма Л-3 и L-Zagreb (AY508995 и AY583323, по данному локусу они идентичны). В результате картина гидролиза фрагментов, полученных с кДНК вируса паротита штамма Л-3 и рекомбинантной плазмиды, полностью совпадает, что позволяет дискриминировать случаи поствакцинальных осложнений (AM) вызванных штаммом Л-3 и L-Zagreb от случаев заболевания ЭП.

Специфичность дифференциальных праймеров L-3dR и L-3dF была показана в ОТ-ПЦР при использовании вирусной суспензии шести штаммов вируса паротита: London-1,

L-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders (номера в базе данных Gene Bank X98874.1, AY508995, AY681495, AY669145, X93181, X93176, соответственно). Во всех случаях был получен ампликон рассчитанной длины. Подлинность ампликонов подтверждали определением нуклеотидных остатков и гидролизом эндонуклеазой Taql. Картина гидролиза полученных фрагментов полностью совпадала с ожидаемой.

В дополнение, специфичность ОТ-ПЦР была определена на биологических образцах спинномозговой жидкости (СМЖ). В исследовании было использовано 36 образцов СМЖ. Из них 4 образец получен от внешне здоровых людей, 14 образца от пациентов с диагнозами «гнойный менингит» и 18 с диагнозом «клещевой энцефалит», у которых диагноз был подтвержден серологическими и вирусологическими методами. Все образцы были отрицательны на наличие РНК вируса паротита.

Чувствительность метода была определена с использованием выше указанных образцов СМЖ. В результате было показано, что использованный метод позволяет выявить РНК вируса паротита в 35 пробах из 36 (97%) в концентрации 500 БОЕ/мл.

С помощью предложенного метода ОТ-ПЦР была показана репликация штамма Л-3 при вакцинации мышей линии BALB/c. Вирусная РНК обнаруживалась в первые четверо суток в крови и глоточных смывах у зараженных мышей линии BALB/c. Подлинность ампликонов была установлена путем определния первичной структуры. При этом была изучена иммуногенность живой паротитной вакцины. Данные показывают, что вакцинирование животных привело к формированию специфического иммунитета. Полученные результаты указывают на то, что вакцинация штаммом Л-3 приводит к формированию гуморальной составляющей иммунитета. Исследованная кросс-реактивность полученных сывороток показала что, пул нейтрализующих антител, образовавшихся на введение штамма Л-3, нейтрализует все гетерологичные штаммы, взятые в исследование.

Изучены показатели иммуногенности вакцинного штамма Л-3 на группе добровольцев, которых иммунизировали данной вакциной. В результате были оценены показатели гуморальной составляющей иммунитета, а также исследованы кровь и слюна на предмет обнаружения РНК штамма Л-3. Было выявлено, что РНК определяется только в слюне в период до 6-суток от начала иммунизации, в крови РНК не была обнаружена на всем сроке наблюдения. Подлинность амплифицированных фрагментов подтверждали определением нуклеотидных остатков. При исследовании иммунологических показателей была выявлена динамика нарастания титра специфических антител класса IgG при однократной иммунизации вакциной на основе штамма Л-3. При этом на момент окончания эксперимента (12-й месяц) общие характеристики гуморального иммунитета (титр, авидность) указывали на то, что иммунизация привела к формированию протективного уровня антител (авидность >32%) у всех взятых в исследование добровольцев. Все исследования проводились по согласованию с этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB00001360).

Во время вспышек, произошедших в Новосибирске (с 2002 по 2004 гг.) и в Минске (с 2001 по 2003 гг.), было расследовано 18 и 15 случаев заболевания вирусом паротита, соответственно. В каждом случае был определен генотип изолята стандартным способом определния первичной структуры гена SH и сравнением полученных данных с уже имеющимися в базе данных GenBank. В результате из 18 изолятов, собранных в Новосибирске, 13 принадлежали к генотипу Н, остальные 5 к генотипу С. Все 15 образцов, полученных из Минска, принадлежали к генотипу Н. Последовательности гена SH, образцов ЭП, полученных из Минска в 2001-2003 годах, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами DQ136174 (П1/2001), DQ136175 (П4/2002) и DQ250041 (П14/2003), соответственно. Помимо стандартного лабораторного подтверждения диагноза и исследования иммунологических показателей параллельно была определена РНК вируса паротита в слюне у всех 33-х пациентов с использованием предложенного в настоящей работе метода ОТ-ПЦР. РНК вируса паротита в крови не обнаруживалась на всех сроках наблюдения. По результатам гидролиза целевых фрагментов было установлено, что пациенты были заражены «дикими» штаммами вируса паротита, что подтвердили генотипированием штаммов по гену SH.

Таким образом, была показана возможность определения и дискриминации случаев заболевания эпидемическим паротитом от возможных поствакцинальных осложнений методом, предложенным в настоящей работе. Данный подход особенно информативен в случаях поствакцинальных осложнений при применении вакцины против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb, поскольку позволяет дифференцировать вакцинный штамм от «дикого». Его использование значительно проще и дешевле по сравнению с существующими на сегодняшний день подходами, основанными на определении последовательности нуклеотидных остатков гипервариабельного гена SH.

В заключении стоит отметить, что данный подход позволяет решить прикладную задачу, направленную на изучение поствакцинальных осложнений при применении вакцины на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb на территории РФ и может быть применен достаточно широко.

Возможная мутационная изменчивость штаммов Л-3 и L-Zagreb может привести к исчезновению существующих или появлению новых сайтов расщепления эндонуклеазой Taql в критической области гена HN, и привести к искажению результатов анализа. Данное обстоятельство теоретически возможно, но является крайне маловероятным, поскольку, во-первых, оба вакцинных штамма находятся в искусственных лабораторных условиях, где показана их высокая стабильность и гомогенность на нуклеотидном уровне (Неверов А.А., и др., 2005). Во-вторых, штамм Л-3 был выделен в 60-х годах прошлого века (Smorodintsev А.А. et al., 1970), а штамм L-Zagreb является его производным (Неверов А.А. и др., 2005) и согласно современной классификации они относятся к группе древних штаммов, заметно отличающихся от циркулирующих на сегодняшний день диких» штаммов вируса паротита (Peltola Н. et. al., 2007). Эволюция современных «диких» штаммов вируса паротита в сторону генетической близости к группе древних штаммов также крайне маловероятна (Teotonio Н, et. al., 2009). По мнению большинства исследователей эволюционный процесс невозможно повернуть в обратную сторону, и вернуться к исходной генетической форме, от которой произошли ныне существующие формы, поэтому данный метод дифференциальной диагностики можно считать достоверным для исследования поствакцинальных осложнений при применении вакцин на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулак, Михаил Валерьевич, Кольцово

1. Агафонов А.П., Каменева С.Н., Игнатьев Г.М. Штамм вируса кори NovO/96 для получения антигена компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори. Патент RU № 2230785 С2. Дата подачи 17 июня 2002.

2. Агафонов А.П., Ничехина С.Н., Патрушев Н.А., Денисов С.И., Орловская С.П., Рябчикова Е.И., Блинов В.М., Игнатьев Г.М. Характеристики вируса паротита, изолированного в Сибири // Вопр. Вирус. 1997. 42(5):222-6.

3. Белавин П.А., Нетесова Н.А., Решетников С.С., Ерошкин A.M., Локтев В.Б., Малыгин Э.Г. Экспрессия фрагментов гена Е вируса японского энцефалита в клетках Escherichia coli. // Биотехнология. 1997. - N 3. - С.3-9.

4. Игнатьев Г. М., Твердохлебов А. В., Калиберов С. А. Показатели иммунитета при заражении мышей различных линий вирусом Мачупо // Вопр. вирусологии. 1993. - 38, N4: 0507-4088. - С. 167-170.

5. Игнатьев Г.М., Блинов В.М., Романовски В. Изучение протективных свойств аттенуированного штамма аргентинской геморрагической лихорадки // Вопр. Вирусол. 1996. - №5. - С. 158-161.

6. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте // Вопр. Вирусол. 2003а. - №2. - С. 22-25.

7. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. Продукция некоторых цитокинов при экспериментальной инфекции клещевого энцефалита у мышей // Вопр. Вирусол. 20036. - №1. - С. 18-21.

8. Кулак М.В., Букин Е.К., Отрашевская А.В., Юнасова Т.Н., Игнатьев Г.М. Изучение некоторых параметров иммунитета при вакцинации мышей живой паротитной вакциной // Биопрепараты, 2007, Июнь, 2(26): 13-19.

9. Максимова О.А., Попов В.Ф., Бектимиров Т.А Григорьева JT. В., Юнасова Т.Н., Каплунова О.П., Шарова O.K. Сравнительная оценка нейровирулентности отечественной и зарубежных живых паротитных вакцин // Вопросы вирусологии, 2001. 5: 31.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии.-М.: Мир. 1984.

11. Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, т. 2. М.: ООО «Росинэкс», 2002. 288с.

12. Неверов А.А., Игнатьев P.M., Юнасова Т.Н., Попов В.Ф., БектимировТ.А., Чумаков К.М. Изучение генетической стабильности и гомогенности вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита // Биопрепараты, 2005, №4, с. 21-27.

13. Нетесова Н.А., Белавин П.А., Серегина Е.В., Игнатьев Г.М., Сандахчиев Л.С. Клонирование, экспрессия и очистка нуклеокапсидного белка ТОРС-коронавируса. // ДАН 2004. - т.397 - N4 - С. 4-10.

14. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.2. Под ред. В.И. Покровского. М. Медицина, 1993: 374.

15. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология 1997. - №5. - С. 7-14.

16. Afzal, M. A., A. R. Pickford, T. Forsey, A. B. Heath and P. D. Minor. The Jeryl Lynn vaccine strain of mumps virus is a mixture of two distinct isolates // J Gen Virol, 1993. 74 (Pt 5): 917.

17. Afzal, M. A., J. Buchanan, A. B. Hea h and P. D. Minor. Clustering of mumps virus isolates by SH gene sequence only partially reflects geographical origin // Archives of Virology, 1997b. 142(2): 227.

18. Alexander-Miller M.A. High-avidity CD8+ T cells: optimal soldiers in the war against viruses and tumors // Immunol Res. 2005, 1:13-24.

19. Amexis, G., N. Fineschi and K. Chumakov. Correlation of genetic variability with safety of mumps vaccine Urabe AM9 strain // Virology. 2001a. 287(1): 234.

20. Amexis, G., S. Rubin, V. Chizhikov, F. Pelloquin, K. Carbone and K. Chumakov. Sequence diversity of Jeryl Lynn strain of mumps virus: quantitative mutant analysis for vaccine quality control // Virology. 2002; 300(2): 171.

21. Anderson LJ, Seward JF. Mumps epidemiology and immunity: the anatomy of a modem epidemic // Pediatr Infect Dis J. 2008 0ct;27(10 Suppl):S75-9.

22. Atkinson W, Hamborsky J, Mclntyre L, Wolfe S. , editors. Centers for Disease Control and Prevention // Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. 9th edn. Washington DC: Public Health Foundation; 2006.

23. Atrasheuskaya AV, Blatun EM, Kulak MV, Atrasheuskaya A, Karpov IA, Rubin S, Ignatyev GM. Investigation of mumps vaccine failures in Minsk, Belarus, 2001-2003. // Vaccine. 2007(a) Jun ll;25(24):4651-8.

24. Atrasheuskaya AV, Kulak MV, Rubin S, Ignatyev GM. Mumps vaccine failure investigation in Novosibirsk, Russia, 2002-2004. // Clin Microbiol Infect. 2007(b) Jul;13(7):670-6.

25. Atrasheuskaya AV, Neverov AA, Rubin S, Ignatyev GM., Horizontal transmission of the Leningrad-3 live attenuated mumps vaccine virus // Vaccine. 2006 Mar 6;24(10): 1530-6.

26. Baron S, Lorente C. Investigation d'une Epidemie d'Oreillons dans la Commune de Millau (Aveyron), Janvier-Aout 1995 // Paris: Reseau National de Sante Publique Francais, 1995:1-22.

27. Beck M, Welsz-Malecek R, Mesko-Prejac M, et al. Mumps vaccine LZagreb, prepared in chick fibroblasts. I. Production and field trials // J Biol Stand. 1989; 17:85-90.

28. Bonnet MC, Dutta A, Weinberger C, Plotkin SA. Mumps vaccine virus strains and aseptic meningitis // Vaccine. 2006 Nov 30;24(49-50):7037-45.

29. Boriskin YuS, Booth JC, Yamada A. Rapid detection of mumps virus by the polymerase chain reaction // J Virol Methods. 1993 Apr;42(l):23-32.

30. Bouche F.B. Ertl O.T. and Muller CP. Neutralising В cell Response in Measles // Viral Immunol. 2002. 15:451-471.

31. Broliden, К., E. R. Abreu, M. Arnebom and M. Bottiger. Immunity before and after MMR vaccination at 12 years of age in the first generation offered the twodose immunization programme//Vaccine. 1998; 16(2-3): 323.

32. Brunell PA, Brickman A, Steinberg S, Allen E. Parotitis in children who had previously received mumps vaccine // Pediatrics. 1972; 50:441-4.

33. Buxton J, Craig C, Daly P, Brigham M, Bell A, Fyfe M. An outbreak of mumps among young adults in Vancouver, British Columbia, associated with "rave" parties // Can J Public Health. 1999; 90:160-3.

34. Buynak, E. B.'and M. R. Hilleman. Live attenuated mumps virus vaccine. 1. Vaccine to mumps development // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1966; 123(3): 768.

35. Camps N, Follia N, Ferrer L, Dominguez A. Brote de parotiditis en una escuela de primaria // Vacunas. 2001; 2:16-57.

36. Casas, I., A. Tenorio, J. M. Echevarria, P. E. Klapper, and G. M. Cleator. Detection of enteroviral RNA and specific DNA of herpesviruses by multiplex genome amplification //J. Virol. Methods. 1977; 66:39-50.

37. Cattaneo, R., G. Rebmann, A. Schmid, K. Baczko, V. ter Meulen and M. A. Billeter. Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain // Embo J. 1987; 6(3): 681.

38. Chamot, E., L. Toscani, P. Egger, D. Germann and C. Bourquin. Estimation of the efficacy of three strains of mumps vaccine during an outbreak in Geneva state (Switzerland) // Rev Epidemiol Sante Publique. 1998; 46(2): 100.

39. Chou CC, Huang MS, Hsieh KH, Chiang BL. Reduced IL-12 level correlates with decreased IFNgamma secreting T cells but not natural killer cell activity in asthmatic children // Ann Allergy Asthma Immunol. 1999; 82: 479-84.

40. Cizman, M., M. Mozetic, R. Radescek-Rakar, D. Pleterski-Rigler and M. Susec-Michieli. Aseptic meningitis after vaccination against measles and mumps // Pediatric Infectious Disease Journal. 1989; 8(5): 302.

41. Cochi, S. L., M. Wharton and S. A. Plotkin. Mumps vaccine. In: Vaccines. Plotkin S.A., Mortimer E.A.Philadelphia, WB Saunders. 1994; 277.

42. Conly J, Johnston B. Is mumps making a comeback? // Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(l):7-9.

43. Cusi MG, Bianchi S, Valassina M, Santini L, Arnetoli M, Valensin PE. Rapid detection and typing of circulating mumps virus by reverse transcription/polymerase chain reaction // Res Virol. 1996 Jul-Aug;147(4):227-32.

44. Cusi MG, Zurbriggen R, Valassina M, Bianchi S, Durrer P, Valensin PE, Donati M, Gliick R. Intranasal immunization with mumps virus DNA vaccine delivered by influenza virosomes elicits mucosal and systemic immunity // Virology. 2000; 277: 111-118.

45. Damien B, Huiss S, Schneider F, Muller CP. Estimated susceptibility to asymptomatic secondary immune response against measles in late convalescent and vaccinated persons //J Med Virol. 1998 Sep;56(l):85-90.

46. Davidkin I, Jokinen S, Paananen A, Leinikki P, Peltola H. Etiology of mumps-like illness in children and adolescents vaccinated for measles, mumps, and rubella // J Inf Dis 2005; 191:719-23.

47. Davidkin, I., M. Valle and I. Julkunen. Persistence of anti-mumps virus antibodies after a two-dose MMR vaccination. A nine-year follow-up//Vaccine. 1995; 13(16): 1617.

48. Derby M, Alexander-Miller M, Tse R, Berzofsky J. High-avidity CTL exploit two complementary mechanisms to provide better protection against viral infection than low-avidity CTL // J Immunol. 2001 Feb l;166(3):1690-7.

49. Elango, N., Т. M. Varsanyi, J. Kovamees and E. Norrby. Molecular cloning and characterization of six genes, determination of gene order and intergenic sequences and leader sequence of mumps virus // J Gen Virol. 1988; 69 (Pt 11): 2893.

50. Elliott, G. D., R. P. Yeo, M. A. Afzal, E. J. Simpson, J. A. Curran and В. K. Rima.

51. Strain-variable editing during transcription of the P gene of mumps virus may lead to thegeneration of non-structural proteins NS1 (V) and NS2 // J Gen Virol. 1990; 71 (Pt 7): 1555.

52. Erdman DD, Heath JL, Watson JC, Markowitz LE, Bellini WJ. Immunoglobulin M antibody response to measles virus following primary and secondary vaccination and natural virus infection // J Med Virol. 1993 Sep;41(l):44-8.

53. Falk, WA; Buchan, K; Dow, M, et al. The epidemiology of mumps in Southern Alberta, 1980-1982 // Am J Epidemiol. 1989;130:736^19.

54. Fescharek, R., U. Quast, G. Maass, W. Merkle and S. Schwarz. Measles-mumps vaccination in the FRG: An empirical analysis after 14 years of use. II. Tolerability and analysis of spontaneously reported side effects // Vaccine. 1990; 8(5): 446.

55. Forleo-Neto, E., E. S. Carvalho, I. C. P. Fuentes, M. S. Precivale, L. H. A. Forleo and C. K. Farhat. Seroconversion of a trivalent measles, mumps, and rubella vaccine in children aged 9 and 15 months // Vaccine. 1997; 15(17-18): 1898.

56. Forsey, Т., M. L. Bentley, P. D. Minor and N. Begg. Mumps vaccines and meningitis // Lancet. 1992; 340(8825): 980.

57. Furesz, J. and G. Contreras. Vaccine-related mumps meningitis-Canada // Canada diseases weekly report. 1990; 16(50): 253.

58. Galazka AM, Robertson SE, Kraigher A. Mumps and mumps vaccine: a global review // Bull World Health Organ. 1999;77(1):3-14.

59. Gluck, R., J. M. Hoskins and A. Wegmann. Rubini, a new live attenuated mumps vaccine virus strain for human diploid cells // Developments in Biological Standardization. 1986; Vol. 65: 29.

60. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation // Nature. 1992 Jun 4;357 (6377):375-9. Review.

61. Goleva OV, Kharit SM, Cherniaeva TV, Aksenov OA, Davidkin I, Kolyshkin VM. A virological description of serous meningitis in children immunized with vaccine against epidemic parotitis // Vopr Virusol. 2004 Sep-Oct;49(5):28-32. Russian.

62. Griffin MR, Daugherty J, Reed GW, Standaert SM, Hutchins SS, Hutcheson RH, Schaffher W. Immunization coverage among infants enrolled in the Tennessee Medicaid program // Arch Pediatr Adolesc Med. 1995 May;149(5):559-64.

63. Gut JP, Lablache C, Behr S, Kirn A. Symptomatic mumps virus reinfections // J Med Virol. 1995 Jan;45(l):17-23.

64. Hamaguchi, M., T. Yoshida, K. Nishikawa, H. Naruse and Y. Nagai. Transcriptive complex of Newcastle disease virus. I. Both L and P proteins are required to constitute an active complex // Virology. 1983; 128(1): 105.

65. Hersh, B. S., P. E. M. Fine, W. K. Kent, S. L. Cochi, L. H. Kahn, E. R. Zell, P. L. Hays and C. L. Wood. Mumps outbreak in a highly vaccinated population // Journal of Pediatrics. 1991; 119(2): 187.

66. Hilleman, M. R., E. B. Buynak, R. E. Weibel and J. Stokes, Jr. Live, attenuated mumps-virus vaccine //N Engl J Med. 1968; 278(5): 227.

67. Hosoya, M., K. Honzumi, M. Sato, M. Katayose, K. Kato, and H. Suzuki. Application of PCR for various neurotropic viruses on the diagnosis of viral meningitis // J. Clin. Virol. 1998; 11:117-124.

68. Huiss S, Damien B, Schneider F, Muller CP. Characteristics of asymptomatic secondary immune responses to measles virus in late convalescent donors // Clin Exp Immunol. 1997 Sep;109(3):416-20.

69. Jancikic B. Active immunization with live trivalent measles-mumpsrubella vaccine // Symp Epidem Gradacac. 1978:39-47.

70. Jancikic B. Field trials with combined trivalent measles-mumps-rubella vaccine // In: Program and abstracts of the 4th International Congress of Virology (The Hague, The Netherlands). 1978

71. Jefferson, Т., D. Price, V. Demicheli and E. Bianco. Unintended events following immunization with MMR: a systematic review // Vaccine. 2003; 21(25-26): 3954.

72. Jensik, S. C. and S. Silver. Polypeptides of mumps virus //J Virol. 1976; 17(2): 363.

73. Jin, L., D. W. G. Brown, P. A. Litton and J. M. White. Genetic diversity of mumps virus in oral fluid specimens: Application to mumps epidemiological study // Journal of Infectious Diseases. 2004; 189(6): 1001.

74. Jin, L., S. Beard and D. W. Brown. Genetic heterogeneity of mumps virus in the United Kingdom: identification of two new genotypes // J Infect Dis. 1999; 180(3): 829.

75. Johansson, В., Т. Tecle and C. Orvell. Proposed criteri a for classification of new genotypes of mumps virus // Scand J Infect Dis. 2002; 34(5): 355.

76. Kaic B. Aseptic meningitis after vaccination with L-Zagreb mumps strain-virologically confirmed cases. Faulty calculation of rates // Vaccine. 2007 Jan 26;25(7):1159-60.

77. Kashiwagi, Y., T. Takami, T. Mori and T. Nakayama. Sequence analysis of F, SH and HN genes among mumps virus strains in Japan // Archives of Virology. 1999; 144(3): 593.

78. Kolakofsky D, Roux L, Garcin D, Ruigrok RW. Paramyxovirus mRNA editing, the "rule of six" and error catastrophe: a hypothesis // J Gen Virol. 2005 Jul;86(Pt 7): 1869-77. Review.

79. Kolakofsky, D. and A. Bruschi. Antigenomes in Sendai virions infected cells // Virology. 1975; 66(1): 185.

80. Koskiniemi M, Rautonen J, Lehtokoski-Lehtiniemi E, Vaheri A. Epidemiology of encephalitis in children: a 20 year survey // Ann Neurol. 1991; 29: 492^-97.

81. Kraigher, A. Monitoring Side-Effects and Adverse Events Following Immunization Against Measles and Mumps in a National Vaccination Programme in Slovenia from 1982 to 1986.

82. Kulkarni PS, Phadke MA, Jadhav SS, Kapre SV. No definitive evidence for L-Zagreb mumps strain associated aseptic meningitis: a review with special reference to the da Cunha study // Vaccine. 2005 Nov 16;23(46-47):5286-8.

83. Kunkel, U., G. Driesel, U. Henning, E. Gerike, H. Willers and E. Schreier. Differentiation of vaccine and wild mumps viruses by polymerase chain reaction and nucleotide sequencing of the SH gene: brief report // J Med Virol. 1995; 45(2): 121.

84. Lamb RA, Paterson RG, Jardetzky TS. Paramyxovirus membrane fusion: Lessons from the F and HN atomic structures // Virology. 2006 Jan 5;344(l):30-7. Review.

85. Lee M-S, Nokes D.J., Hsu H-M, Lu C-F. Protective titers of measles neutralizing antibody // J Med Virol 2000, 62:511-517.

86. Lee, W. M. Role of maturation cleavage in infectivity of picornaviruses: activation of an infectosome // J. Virol. 1993; 67:2109-2122.

87. Lim, C. S., K. P. Chan, К. T. Goh and V. Т. K. Chow. Hemagglutinin-neuraminidase sequence and phylogenetic analyses of mumps virus isolates from a vaccinated population in Singapore // Journal of Medical Virology. 2003; 70(2): 287.

88. Lopez N.B-L, Ward B.J, Mills E, McCormick D, Martel N, Ratnam S. Development and durability of measles antigen-specific lymphoproliferative response after MMR vaccination//Vaccine, 2000; 18: 1393-1401.

89. Lund, G. A., D. L. Tyrrell, R. D. Bradley and D. G. Scraba. The molecular length of measles virus RNA and the structural organization of measles nucleocapsids // J Gen Virol. 1984; 65(Pt9): 1535.

90. Marin M, Quinlisk P, Shimabukuro T, Sawhney C, Brown C, Lebaron CW. Mumps vaccination coverage and vaccine effectiveness in a large outbreak among college students—Iowa, 2006 // Vaccine. 2008 Jul 4;26(29-30):3601-7.

91. Matsumoto, T. Assembly of paramyxoviruses // Microbiol Immunol. 1982; 26(4): 285.

92. Mauldin J, Carbone K, Hsu H, Yolken R, Rubin S. Mumps virus-specific antibody titers from pre-vaccine era sera: comparison of the plaque reduction neutralization assay and enzyme immunoassays // J Clin Microbiol. 2005 Sep;43(9):4847-51.

93. McCarthy, M. and R. A. Lazzarini. Intracellular nucleocapsid RNA of mumps virus //J Gen Virol. 1982; 58 Pt 1: 205.

94. Meyaard L, Hovenkamp E, Otto SA, Miedema F. IL-12-induced IL-10 production by human T cells as a negative feedback for IL-12-induced immune responses // J Immunol 1996:156: 2776-82.

95. Miller, E., A. Hill, P. Morgan-Capner, T. Forsey and M. Rush. Antibodies to measles, mumps and rubella in UK children 4 years after vaccination with different MMR vaccines//Vaccine. 1995; 13(9): 799.

96. Miller, E., M. Goldacre, S. Pugh, A. Colville, P. Farrington, A. Flower, J. Nash, L. MacFarlane and R. Tettmar. Risk of aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine in the United Kingdom // Am J Epidemiol. 2007 Mar 15;165(6):704-9.

97. Muhlemann, K. The molecular epidemiology of mumps virus // Infect Genet Evol. 2004; 4(3): 215.

98. Muller CP, Huiss S, Schneider F. Secondary immune responses in parents of children with recent measles//Lancet. 1996 Nov 16;348(9038):1379-80.

99. Narita M, Matsuzono Y, Takekoshi Y, Yamada S, Itakura O, Kubota M, Kikuta H,

100. Togashi T.Analysis of mumps vaccine failure by means of avidity testing for mumpsvirus-specific immunoglobulin G // Clin Diagn Lab Immunol. 1998 Nov;5(6):799-803.

101. Nojd J, Tecle T, Samuelsson A, Orvell C. Mumps virus neutralizing antibodies do not protect against reinfection with a heterologous mumps virus genotype // Vaccine. 2001 Feb 8;19(13-14):1727-31.

102. Oldstone M.B. Viruses can cause disease in the absence of morphological evidence of cell injury: implication for uncovering new diseases in the future // J Infect Dis. 1989 Mar; 159(3):3 84-9.

103. Ong G, Goh KT, Ma S, Chew SK. Comparative efficacy of Rubini, Jeryl-Lynn and Urabe mumps vaccine in an Asian population // J Infect 2005; 51:294-8.

104. Orvell C, Tecle T, Johansson B, Saito H, Samuelson A. Antigenic relationships between six genotypes of the small hydrophobic protein gene of mumps virus // J Gen Virol. 2002 Oct;83(Pt 10):2489-96.

105. Orvell C. Structural polypeptides of mumps virus // J Gen Virol. 1978; 41(3): 527.

106. Orvell, C., A. R. Alsheikhly, M. Kalantari and B. Johansson. Characterization of genotype-specific epitopes of the HN protein of mumps virus // Journal of General Virology. 1997a; 78(12): 3187.

107. Orvell, С., M. Kalantari and B. Johansson. Characterization of five conserved genotypes of the mumps virus small hydrophobic (SH) protein gene // Journal of General Virology. 1997b; 78(1): 91.

108. Ovsyannikova I.G., Dhiman N., Jacobson R.M., Poland G.A. Human leukocyte antigen polymorphisms: variable humoral immune responses to viral vaccines // Expert Rev Vaccines. 2006 Feb;5(l):33-43. Review.

109. Ovsyannikova I.G., Jacobson R.M., Poland G.A. Variation in vaccine response in normal populations // Pharmacogenomics. 2004 Jun;5(4):417-27. Review.

110. Ovsyannikova IG, Dhiman N, Jacobson RM, Vierkant RA, Poland GA. Frequency of measles-virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine // Clin Diagn Lab Immunol. 2003 May;10(3):411-6.

111. Ozanne G, Huot R, Montpetit C. Influence of Packaging and Processing Conditions on the Decontamination of Laboratory Biomedical Waste by Steam Sterilization // Appl Environ Microbiol. 1993 Dec;59(12):4335-4337.

112. Paccaud, M. F., P. Hazeghi, M. Bourquin, A. M. Maurer, C. A. Steiner, A. J. Seiler, P. Helbling and H. Zimmermann. Two mumps outbreaks in retrospect // Sozial- und Praventivmedizin. 1995; 40(2): 72.

113. Pan American Health Organization РАНО, Special Program for Vaccines and Immunization // Evaluation of Bahamas" MMR campaign, EPI Newsletter 1999;21(1):4-5.

114. Paunio M, Hedman К, Davidkin I, Pel tola H. IgG avidity to distinguish secondary from primary measles vaccination failures: prospects for a more effective global measles elimination strategy // Expert Opin Pharmacother. 2003 Aug;4(8): 1215-25.

115. Pebody RG, Gay NJ, Hesketh LM, Vyse A, Morgan-Capner P, Brown DW, Litton P, Miller E. Immunogenicity of second dose measles-mumps-rubella (MMR) vaccine and implications for serosurveillance // Vaccine. 2002 Jan 15;20(7-8):1134-40.

116. Peltola H, Kulkarni PS, Kapre SV, Paunio M, Jadhav SS, Dhere RM. Mumps outbreaks in Canada and the United States: time for new thinking on mumps vaccines // -. Clin Infect Dis. 2007 Aug 15;45(4):459-66.

117. Phadke MA, Patki PS, Kulkarni PS, Jadhav SS, Kapre SV. Pharmacovigilance on -MMR vaccine containing L-Zagreb mumps strain // Vaccine. 2004 Oct 22:22(31-32):4135-6. No abstract available.

118. Pipkin PA, Afzal MA, Heath AB, Minor PD. Assay of humoral immunity to mumps virus // J Virol Methods. 1999 May;79(2):219-25.

119. Plotkin, SA. Mumps Vaccine. In: Offit PA, Orenstein WA., editors // Vaccines. 4th edn. Philadelphia: WB Saunders Co; 2003. pp. 441-70.

120. Rammensee H.G., Falk K., Rotzschke O. Peptides naturally presented by MHC class I molecules // Annu Rev Immunol. 1993;11:213-44. Review.

121. Rima BK, Wishaupt RG, Welsh MJ, Earle JA. The evolution of morbilliviruses: a comparison of nucleocapsid gene sequences including a porpoise Morbillivirus // Vet Microbiol. 1995 May;44(2-4): 127-34.

122. Rizzo LV, DeKruyff RII, Umetsu DT. Generation of В cell memory and affinity maturation. Induction with Thl and Th2 T cell clones // J Immunol 1992, 148: 37333739.

123. Rotbart, H. A. A. Rotbart (ed.). Meningitis and encephalitis In H. Human enterovirus infections // American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1995; p. 271-289.

124. Rubin S, Mauldin J, Chumakov K, Vanderzanden J, Iskow R, Carbone K. Serological and phylogenetic evidence of monotypic immune responses to different mumps virus strains // Vaccine. 2006 Mar 24;24(14):2662-8.

125. Rubin, S. A., G. Amexis, M. Pletnikov, Z. Li, J. Vanderzanden, J. Mauldin, C. Sauder, T. Malik, K. Chumakov and К. M. Carbone. Changes in mumps virus gene sequence associated with variability in neurovirulent phenotype // J Virol. 2003; 77(21): 11616.

126. Sallie, R. Replicative Homeostasis: A fundamental mechanism mediating selective viral replication and escape mutation // Virol J. 2005; 2(1): 10.

127. Sambrook J., Russell D. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual.- Cold Spring Harbour Laboratory Press; 2001.

128. Sauder, C. J., К. M. Vandenburgh, R. C. Iskow, T. Malik, К. M. Carbone and S. A.

129. Rubin (2006). Changes in mumps virus neurovirulence phenotype associated with quasispecies heterogeneity//Virology. 2006, 7 (3): 161-4.

130. Server, A. C., D. C. Merz, M. N. Waxham and J. S. Wolinsky. Differentiation of mumps virus strains with monoclonal antibody to the HN glycoprotein // Infection and Immunity. 1982; 35(1): 179.

131. Singh, R., T. J. John, T. Cherian and P. Raghupathy. Immune response to measles, mumps and rubella vaccine at 9, 12 and 15 months of age // Indian Journal of Medical Research. 1994; ЮО(ОСТ.): 155.

132. Smorodintsev AA, Luzianina TY,Mikutskaya В A. Data on the efficiency of live mumps vaccine from chick embryo cell cultures // Acta Virol 1965; 9:240-7

133. Smorodintsev, A. A., M. N. Nasibov and N. V. Jakovleva. Experience with live rubella virus vaccine combined with live vaccines against measles and mumps // Bull World Health Organ. 1970; 42(2): 283.

134. Stallcup, К. C., S. L. Wechsler and B. N. Fields. Purification of measles virus and characterization of subviral components // J Virol. 1979; 30(1): 166.

135. Strohle A, Bernasconi C, Germann D. A new mumps virus lineage found in the 1995 mumps outbreak in western Switzerland identified by nucleotide sequence analysis of the SH gene//Arch Virol. 1996;141(3-4):733-41.

136. Strohle A, Eggenberger K, Steiner CA, Matter L, Germann D. Mumps epidemic in vaccinated children in West Switzerland // Schweiz Med Wochenschr. 1997 Jun 28;127(26):1124-33. German.

137. Sugiura A, Yamada A. Aseptic meningitis as a complication of mumps vaccination // Pediatr Infect Dis J. 1991 Mar;10(3):209-13.

138. Takahashi, M., T. Nakayama, Y. Kashiwagi, T. Takami, S. Sonoda, T. Yamanaka, H. Ochiai, T. Ihara and T. Tajima. Single genotype of measles virus is dominant whereas several genotypes of mumps virus are co-circulating // J Med Virol. 2000; 62(2): 278.

139. Takeuchi, К., M. Hishiyama, A. Yamada and A. Sugiura. Molecular cloning and sequence analysis of the mumps vims gene encoding the monocistronic // J Gen Virol. 1988; 69 (Pt 8): 2043.

140. Tecle T, Bottiger B, Orvell C, Johansson B. Characterization of two decades of temporal co-circulation of four mumps virus genotypes in Denmark: identification of a new genotype // J Gen Virol. 2001 Nov;82(Pt 11):2675-80.

141. Tecle, Т., В. Johansson, A. Jejcic, M. Forsgren and C. Orvell. Characterization of three co-circulating genotypes of the small hydrophobic protein gene of mumps virus // J Gen Virol. 1998; 79 (Pt 12): 2929.

142. Tecle, Т., В. Johansson, Z. Yun and C. Orvell. Antigenic and genetic characterization of the fusion (F) protein of mumps virus strains // Archives of Virology. 2000; 145(6): 1199.

143. Teotonio H, Chelo IM, Bradic M, Rose MR, Long AD. Experimental evolution reveals natural selection on standing genetic variation //Nat Genet. 2009 Feb;41(2):251-7.

144. Tesovic G, Begovac J, Bace A. Aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine//Lancet. 1993 Jun 12;341(8859):1541.

145. Tesovic G, Lesnikar V. Aseptic meningitis after vaccination with L-Zagreb mumps strain-virologically confirmed cases // Vaccine. 2006 Sep 29;24(40-41):6371-3.

146. Tesovic G, Poljak M, Lunar MM, Kocjan BJ, Seme K, Vukic ВТ, Sternak SL, Cajic V, Vince A. Horizontal transmission of the Leningrad-Zagreb mumps vaccine strain: A- . - report of three cases // Vaccine. 2008 Apr 7;26(16):1922-5.

147. Tesovic, G., J. Begovac and A. Bace. Aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine//Lancet. 1993; 341(8859): 1541.

148. Tidona, С. A., H. W. Kurz, H. R. Gelderblom and G. Darai. Isolation and molecular characterization of a novel cytopathogenic paramyxovirus from tree shrews // Virology. 1999; 258(2): 425.

149. Toscani L, Batou M, Bouvier P, Schlaepfer A. Comparaison de l'efficacite' de diffe'rentes souches de vaccin ourlien: une enqueue en milieu scolaire // Soz Pra'Ventivmed 1996; 41:341-7.

150. Trinchieri G. Interleukin-12: A cytokine produced by antigen-presenting cells with immunoregulatory functions in the generation of T-helper cells type 1 and cytotoxic lymphocytes // Blood 1994: 84: 4008-27.

151. Uchida, К., M. Shinohara, S. I. Shimada, Y. Segawa and Y. Hoshino. Characterization of mumps virus isolated in Saitama Prefecture, Japan, by sequence analysis of the SH gene // Microbiology and Immunology. 2001; 45(12): 851.

152. Ueda, К., C. Miyazaki, Y. Hidaka, K. Okada, K. Kusuhara and R. Kadoya. Aseptic meningitis caused by measles-mumps-rubella vaccine in Japan // Lancet. 1995; 346(8976): 701.

153. Utz, S., J. L. Richard, S. Capaul, H. C. Matter, M. G. Hrisoho and K. Muhlemann. Phylogenetic Analysis of Clinical Mumps Virus Isolates from Vaccinated and Non

154. Vardas E, Kreis S. Isolation of measles virus from a naturally-immune, asymptomatically re-infected individual // J Clin Virol. 1999 Aug;13(3):173-9.

155. Vesikari, Т., F. E. Andre and E. Simoen. Evaluation in young children of the Urabe Am 9 strain of live attenuated mumps vaccine in comparison with the Jeryl Lynn strain // Acta Paediatrica Scandinavica. 1983; 72(1): 37.

156. Weissbrich B. The use of semi-automated EBV IgG avidity determination for the diagnosis of infectious mononucleosis // J Med Virol 1998, 54:145-153.

157. Wolinsky JS, Stroop WG (1978) Virulence and persistence of three prototype strains of mumps virus in newborn hamsters // Arch Virol 57: 355-359.

158. World Health Organization. Department of Immunization Vaccines and Biologicals, Vaccine Assessment and Monitoring Team, WHO.INT 09/2004. http://www.who.int/vaccines/alobalsummarv/timeseries/tsincidencemum.htm

159. Wu, L., Z. Bai, Y. Li, В. K. Rima and M. A. Afzal. Wild type mumps viruses circulating in China establish a new genotype // Vaccine. 1998; 16(2-3): 281.

160. Yates PJ, Afzal MA, Minor PD. Antigenic and genetic variation of the HN protein of mumps virus strains // J Gen Virol. 1996 Oct,11 ( Pt 10):2491-7.

161. Yeo, R. P., M. A. Afzal, T. Forsey and В. K. Rima. Identification of a new mumps virus lineage by nucleotide sequence analysis of the SH gene of ten different strains // Archives of Virology. 1993; 128(3-4): 371.

162. York I.A., Rock K.L. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex // Annu Rev Immunol. 1996;14:369-96.

Информация о работе

Кулак, Михаил Валерьевич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы