Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита

Неверов, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита"

На правах рукописи

Неверов Александр Александрович

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ КОРИ И ПАРОТИТА

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2006

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дерябин Петр Григорьевич

кандидат химических наук Синяков Александр Николаевич

Ведущая организация:

ФГУН Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора (Москва)

Защита состоится « 8 » сентября 2006 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « 4 » июля 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Вирусы эпидемического паротита и кори вызывают заболевания, характеризующиеся высокой контагиозностью, восприимчивостью разных возрастных групп и развитием продолжительной иммуносупрессии переболевших. Эффективного специфического лечения для кори и эпидемического паротита не разработано. Вследствие этого единственной действенной мерой борьбы с данными заболеваниями является активная иммунизация.

Для профилактики эпидемического паротита применяют вакцины на основе штаммов Ленинград-3 (Россия), Leningrad-Zagreb (Египет, Хорватия, Индия), Jeryl Lynn (США, Бельгия), Urabe Am9 (Франция, Бельгия, Италия), RIT4385 (Бельгия) (www.whQ.int/vaccines/en/mumps.shtm1>. Одним из осложнений, возникающих при использовании паротитных вакцин на основе атгенуированных штаммов, является асептический менингит (Sugiura A. and A. Yarnada, 1991; Forsey Т. et al., 1992; Miller E.M. et al., 1993). Наибольшее число случаев асептического менингита отмечалось при использовании вакцин на основе штаммов Urabe и Leningrad-Zagreb (250 и 100 случаев на сто тыс. привитых соответственно). Вакцина на основе штамма Ленинград-3 характеризуется высокой безопасностью (0,018 случаев асептического менингита на сто тысяч привитых). Неоднократное отождествление штаммов Leningrad-Zagreb и Ленинград-3 при отсутствии молекулярно-генетических исследований вызывало спекуляции о низком качестве российской вакцины (Galazka А.М. et al., 1999). Таким образом, детальное изучение генетических свойств штамма Ленинград-3 необходимо для дифференциации данных штаммов. Всемирный Комитет по Безопасности Вакцин ВОЗ (Global Advisoiy Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) признал такие исследования необходимыми, а также рекомендовал характеризовать генетическую стабильность используемых штаммов на всех этапах производства паротитных вакцин. Изучение генетических свойств штаммов вируса паротита «дикого» типа было также рекомендовано ВОЗ, прежде всего для определения маркеров их вирулентности и механизмов аттенуации.

Для профилактики кори более сорока лет применяются эффективные и безопасные вакцины. Сложились условия, позволившие ВОЗ объявить программу элиминации кори в Европейском регионе (включая Россию) к 2010 году. В число основных задач программы входит установление полного эпидемиологического контроля над инфекцией, что, в свою очередь, требует исследования разнообразия генотипов вируса кори, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками. Для решения поставленных задач необходимо лабораторное подтверждение каждого случая клинического диагноза «корь» серологическими методами и с помощью генодиагностики, а также подробная характеризация генетических свойств циркулирующих штаммов вируса кори. На сегодняшний день для генодиагностики кори применяется метод детекции геномной РНК вируса с помощью ОТ-ПЦР. Для изучения циркулирующих штаммов проводят изоляцию вируса на пермиссивных культурах

клеток, определение последовательности нуклеотидных остатков значимых участков генома и их филогенетический анализ. В настоящее время, наиболее востребованными являются методы, позволяющие одновременно выявлять вирус кори и проводить его генотипирование непосредственно из клинических образцов, полученных неинвазивным способом (мочи, смывов с полости рта и слюны). В то же время, актуальность быстро проводить исследования такого рода в лабораториях регионального уровня без определения последовательности нуклеотидных остатков, не вызывает сомнения.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение генетических свойств вирусов кори и паротита. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучение генетических свойств Российского вакцинного штамма Ленинград-3 вируса эпидемического паротита: определение полной последовательности генома штамма Ленинград-3 (Л-3); сравнение последовательностей генома штамма Л-3 и штаммов вируса паротита с определенными полноразмерными последовательностями (как вакцинных, так и штаммов "дикого" типа); изучение состава вирусной популяции вакцинного штамма Л-3; изучение генетической стабильности штамма Л-3 в готовых вакцинных препаратах и при пассировании на культуре клеток, используемой при производстве вакцины.

2. Сравнительный анализ последовательностей геномов штаммов вируса эпидемического паротита "дикого" типа, выделенных на территории г. Новосибирска: определение полной последовательности геномов штаммов "Драгун" (генотип С, выделен в 1994 году) и "ПетроНов" (генотип Н, выделен в 2003 году); сравнение полученных последовательностей с ранее определенными последовательностями геномов штаммов вируса паротита, доступных в базе данных вепВапк.

3. Изучение разнообразия генотипов вируса корн, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками: анализ клинических образцов методом ОТ-ПЦР для определения геномной РНК вируса кори; определение генотипов изолятов вируса кори, циркулирующих на данной территории.

4. Разработка ДНК-микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса корн: разработка метода и его оптимизация, используя установленные ВОЗ эталонные штаммы генотипов вируса кори и изоляты "дикого" типа, выделенные на территории различных стран; валидация метода используя панели клинических образцов, собранных от больных корью и лиц, инфицированных другими вирусами, вызывающими экзантемные заболевания; определение чувствительности и специфичности разработанного метода.

Научная новизна работы. Впервые определены полноразмерные последовательности геномов сибирских изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Получена полноразмерная последовательность генома штамма Л-3, применяющегося при производстве паротитной вакцины в России. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма Л-3. Для обработки данных

ДНК-микрочипов при генотипировании изолятов вируса кори впервые применен метод иерархического кластерного анализа.

Практическая значимость работы. Выделен и депонирован в коллекцию культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер V-330) штамм вируса паротита ПетроНов (генотип Н). Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков генома штаммов вируса паротита. В соответствии с рекомендациями ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) охарактеризован штамм Л-3, применяющийся для производства паротитной вакцины в России. Разработан метод генотипирования изолятов вируса кори без использования определения последовательности нуклеотидных остатков участков генома вируса. Положения, выносимые на защиту.

1. Показана стабильность и генетическая гомогенность штамма Л-3 вируса паротита, применяемого для производства паротитной вакцины в России.

2. Установлены генетические различия между вакцинными штаммами вируса паротита Л-3 (Росиия) и L-Zagreb (Хорватия, Индия, Египет).

3. Разработан и апробирован ДНК-микрочип, способный детектировать и эффективно дискриминировать все 23 описанных генотипа вируса кори в клинических образцах.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, а также 5 сообщений в трудах научных конференций.

Результаты работы были представлены автором на следующих международных конференциях: "Генодиагностика Инфекционных Болезней" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), "IUMS 2004 - Microbes in the changing world. XIII International Congress of Virology" (San Francisco, CA, July 23-28, 2005), "A Century of FDA Science: Pioneering the Future of Public Health. FDA Science Forum" (Washington, DC, April 18-20,2006).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела 'Тезультаты и обсуждение", заключения, выводов и указателя литературы (13 источников на русском языке и 198 на английском). Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 21 рисунок.

Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением клинических исследований, получены непосредственно автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы: в работе исследованы штаммы Драгун и ПетроНов, полученные из коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор". Штамм JI-3 со следующими пассажными характеристиками: 15 пассажей в культуре клеток ПМС (почки морской свинки) и 4 пассажа в культуре КЭЯП (клеток эмбрионов японского перепела) — производственный штамм Российской паротитной вакцины, 15 пассажей ПМС и б пассажей КЭЯП - посевной вирус, 15 пассажей ПМС и 10 пассажей КЭЯП - предельный пассаж, применяемый для производства вакцины - получены из ГИСК им Л.А. Тарасевича.

Вакцины: паротитная вакцина, приготовленная из штамма JI-3 производства НПО "Микроген" серий 035, 0927, 0972, 029, 012; паротитная вакцина на основе штамма L-Zagreb производства Serum Institute of India серии EU-740. Все вакцинные препараты получены из ГИСК им Л.А. Тарасевича.

Выделение суммарной РНК из образцов проводили набором QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, США). Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием d(N)¿ праймера и обратной транскриптазы SuperScript II (Invitrogen, США). Амплификацию фрагментов генома вируса паротита проводили при помощи ПЦР с использованием высокоточной термофильной ДНК-полимеразы ThermalAce (содержит смесь Taq и Pfu ДНК-полимераз) (Invitrogen, США). Определение 5' и 3' концевых фрагментов генома вируса паротита проводили при помощи метода быстрой амплификации концов кДНК (RACE), используя набор реактивов 573'RACE Kit, second generation (Roche,CILLA). Диагностическую ОТ-ПЦР для обнаружения вируса кори проводили двухраундовой ОТ-ПЦР как описано в работе (Atrasheuskaya A.V. et al., 2005). Амплификацию кДНК для проведения анализа ДНК-микрочипом проводили двухраундовой ПЦР с использованием ДНК-полимеразы HotStarTaq (Qiagen, США) и специфических праймеров (MV60 и MV63 для первого раунда; Measles_F и Measles_R_T7 для второго раунда), Праймер Measles_R_T7 содержал в свобм составе последовательность промотора РНК-полимеразы фага Т7. Очистку продуктов амплификации после проведения ПЦР проводили фракционированием электрофорезом в 2% агарозном геле и элюцией ДНК из фрагмента геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Клонирование продуктов ПЦР в плазмиднын вектор pGEM-5Zf(+) Е. Coli проводили используя набор pGEM-T Vector System II (Promega, США). Для трансформации использовали ультракомпетентные клетки JM 109 (Promega, США). Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК проводили по методу Сэнгера на автоматическом анализаторе ДНК ABI 3100 (Applied Biosystems, США), используя набор реактивов BigDye v. 3.1 Kit (Applied Byosystems, США). Множественное выравнивание последовательностей нуклеотидных остатков проводили, используя программное обеспечение ClustalW v.l.8. Расчет вариабельности сайтов после проведения множественного выравнивания ("энтропии"

множественного выравнивания) проводили программным обеспечением Bioedit v.1.0. Филогенетический анализ и расчет расстояний в парных сравнениях последовательностей проводили, используя программное обеспечение Mega v. 3.1 (Kumar S. et al., 2004). Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа для генотипирования изолятов вируса кори и анализ гибридизационных паттернов образцов, полученных с помощью ДНК-микрочипов проводили, используя программное обеспечение Oligoscan (автор Чумаков K.M., FDA, США). При приготовлении ДНК-микрочипов для генотипирования образцов вируса кори каждый из 145 олигонуклеотидных зондов наносили в трёх повторах контактным методом на поверхность стеклянных слайдов CodeLink Activated Slides (Amersham Biosciences, США), при помощи роботизрованной системы PIXSYS 5500 (Cartesian Technologies, США). Подготовка молекул одноцепочечной РНК для гибридизации на ДНК-микрочипах осуществляли транскрипцией ампликонов второго раунда ПЦР in vitro, используя набор реагентов MEGAscript Т7 High Yield Transcription Kit (Ambion, США). Полученную РНК метили присоединением остатков красителя СуЗ, используя набор реактивов MICROMAX ASAP RNA Labeling Kit (Perkin Elmer, США) с последующей очисткой от избытка свободного красителя при помощи гель-фильтрации на микроколонках Centrisep Spin Columns (Princeton Separations, США). Раствор очищенной меченой РНК высушивали на вакуумном испарителе и растворяли в гибридизационном буфере MICROMAX Hybridization Buffer III (Perkin Elmer, США) до конечной концентрации 2,0 цМ. Гибридизацию флуоресцентномеченых одноцепочечных молекул РНК с олигонуклеотидными зондами ДНК-микрочипа проводили при температуре 50°С в течение одного часа. Далее слайды отмывали в течение 10 минут в нагретом до 50°С растворе 4xSSC с добавлением 0.1 % SDS по весу при интенсивном перемешивании, затем 2 минуты в растворе 2xSSC комнатной температуры и 1 минуту в растворе lxSSC. Сканирование ДНК-микрочипов и анализ данных проводили используя сканер ScanArray 5000 (Perkin-Elmer, США). Полученные изображения обрабатывали программным обеспечением ScanArray Express (Perkin Elmer, США). Статистический анализ данных проводили используя программное обеспечение STATA V. 7.0 (StataCorp, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение генетических свойств вируса паротита.

1.1. Рассчет праймеров для амплификации и определения полноразмерной последовательности генома штаммов вируса паротита. Для рассчета олигонуклеотидных праймеров, позволяющих амплифицировать в ПЦР кДНК любого вируса паротита в виде перекрывающихся фрагментов ДНК, суммарно содержащих полноразмерную последовательность вирусного генома, использовали консервативные регионы, не содержащие замен ни в одном из штаммов. Идентификацию данных регионов проводили множественным выравниванием 13 доступных на момент начала исследований полноразмерных последовательностей генома

Таблица 1. Праймеры для амплификации кДНК штаммов вируса паротита.

Название Последовательность (5' -3') Положение в геноме

П/С 1С GTAAGAAACAOTAAGCCCGGAAG 21 —44

С 1Ас CATTATTTATGGTTGGAGGGAGGTC 550 — 575

С 1С GAAATTGCTGCCTATGCTTTGC 499 — 521

П/С 1 Ас TAGGAAAGGTCGTGCATAAGTG 1194—1216

П/С2С AGAACAAGCCAGATACCTTGC 1045—1066

С 2Ас TGTTGCTGACTTGAGGATATAATGG 1594—1619

С 2С GCCATTATATCCTCAAGTCAGCAAC 1569—1594

П/С 2Ас CTGAATGTTCTTTTGCTCTGG 2131—2152

П/СЗС GGTGATTTAATTGAGACAGGAATG 1985 — 2009

СЗАс TTGCACCACTCAAAGACCCG 2527 — 2547

СЗС ATCCAAGAGGAGGGCATAGAC 2451—2472

П/С ЗАо ATCTCCTGGTCCACTAACAATTG 2868 — 2891

П/С4С TTGATGAGCTTAGAAGAAGTTTTAGTG 2806 — 2833

С 4Ас TTGTGATGATTCAGAGATGAACTC 3476 — 3500

С 4С AGTTCATCTCTGAATCATCACAAC 3454 — 3478

П/С 4Ас TGCATGGACTAGAATGGTTGG 4092 — 4112

П/С 5С TTAAATGACCCTGATGGAGAAGG 3910 — 3933

С 5Ас GGGTTGGATATTCGGTAAAAGC 4700 — 4722

С 5С AAGCTTTTACCGAATATCCAACC 4676 — 4699

П/С 5Ас TGTTAATTCTGTTAGGTATAATCCTAG 5130 — 5157

П/С6С CGCTGTCTCATTAGTTCAAGC 4893 — 4914

С 6Ас GTTTGCAACAATTGTTCCATCCAG 5658 — 5682

С 6С ATCAAAACTATGCCTTGCAGGC 5555 — 5577

П/СбАс GGCAGGGTCACGAGACG 6226 — 6243

П/С7С GTCTCGTGACCCTGCCG 6227 — 6244

С7Ас TGAAGACAACTGATTGCTCAAG 6801 —6823

С7С AATGCCACCTTTGCACCTGG 6627 — 6647

П/С 7Ас GGACTGTTGCAATTGAGCAGC 7340 — 7361

П/С8С ATGTAATTAATGCCAACTGCAAGG 7176 — 7200

С 8Ас GGAGTTCATACGGCCACCAG 7887 — 7907

С8С CGAGCTAGTTGTCCCCTCA 7770 — 7789

П/С 8Ас GAAAAGCTTATATCTAACGATGGG 8485 — 8509

П/С 9С GGCGGGCCTAAATGAGATAC 8420 — 8440

С 9Ас GGTACGTTAATOCTTTGTGCTC 9118 — 9140

С9С TGGCTTATGATTAAATATAGAATGAGG 8954 — 8981

П/С 9Ас GGAGGCCAGATTCCATTATGG 9681 —9702

П/С 10С TTGACAATCTATCCCCTGATTTAAC 9461—9486

С 10 Ас GGTCCCTAAGATATTCTCCACTG 10044—10067

С ЮС TGCTTTGATGCATCACCTGATG 9802 — 9824

П/С ЮАс TATCAAGGTCAAGTTGGGTAGG 10603 — 10625

П/С 11С ATCCCCTTTGCGCGTACATTG 10463 — 10484

С 11 Ас AACACAAATCTTTCTCGACCCC 11098 — 11120

С 11С AACCATGGAATTGGACACCAC 10865 —10886

П/С 11 Ас CTAATAGATACTGTGCGAGTTC 11584—11606

П/С 12С GAGTGTTAATCCCATGCTCCG 11506— 11527

С 12 Ас CTGAGTGCTGATTTAAGTGATAC 12163 — 12186

С 12С GAATGCAATCAATGTTGATACTTGTAG 11812—11839

П/С 12Ас CTTATACAGCAAGATGAGCCTG 12560—12582

П/С 13С AAGCTCCTATGCATTCTCTAGC 12351 —12373

С 13 Ас CCTCAAGGTCATATACACATAGTC 13000 — 13024

С 13С CTAGCAATTGGATTAGTGAATGC 12847— 12870

П/С 13 Ас TAAAACAAATTACTAGGGTAGGCAG 13472 — 13497

П/С I4C CAAAGGTTAAAGGTATGTCACCTG 13314 — 13338

С 14 Ас ACACTTTCAATAAACTGGGTGGG 13996— 14019

С 14С AAGATATCTGACGGTGCCCATC 13825 — 13847

П/С 14 Ас CGTAAGGTGAGACGAGTTTG 14905—14925

П/С 15С AATCTTGAAAGCTTCATGGGAACC 14263—14287

П/С 15 Ас TGTGGTTATGATTGTTCGAGGTCGT 15300— 15324

3'R2C CATCTTGCCCACCCAAACTCG 14884—14907

3'R 1С ACAATGTAGGTCCCCTCGGG 14802— 14822

5'R 2Ас GAGAATAATGTTATCAATGCACCTAC 352 — 378

5'R 1 Ас AATTTCATTGGCAGTAAGATTGGCG 501 —526

штаммов вируса паротита. Всего было рассчитано 30 олигонуклеотидов ( П/С 1С - П/С 15С; П/С 1Ас - П/С 15Ас), при использовании которых в качестве праймеров для ПЦР (в соответствующих парах) возможно амплифицировать большую часть генома вируса (21-15324 позиции из 15384) в виде 15 фрагментов ДНК. Для увеличения точности считываемой последовательности были рассчитаны 28 дополнительных праймеров для определения последовательности нуклеотидных остатков по Сэнгеру, разбивающие каждую цепь ДНК ПЦР продуктов 1-14 приблизительно на половину (С 1С - С 14С; С 1Ас - С 15 Ас). Характеристика рассчитанных олигонуклеотидных праймеров приведена в таблице 1.

1.2 Определение полной последовательности геномов изолнтов вируса паротита, выделенных на территории Новосибирской области. На момент начала исследований в базе данных GenBank было доступно всего 13 полноразмерных последовательностей генома штаммов вируса паротита. Шесть из них представляли собой уникальные штаммы (генотипы А, В, Н, I, G) остальные - варианты штамма Urabe (генотип В). Учитывая количество описанных генотипов вируса паротита — 13 - число доступных уникальных полноразмерных последовательностей геномов штаммов данного вируса явно недостаточно для проведения значимого сравнительного анализа.

В 1994 г. при изучении вспышки эпидемического паротита в поселке Кольцове Новосибирской области был выделен изолят вируса паротита "Драгун" (Агафонов А.П. и др., 1997). Данный штамм по результатам генотипирования был отнесен к генотипу С (Heider A. et а!., 1997). В 2003 г. в городе Новосибирске выделили штамм от больного "ПетроНов" (депонирован в коллекцию микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (Кольцове, Новосибирской обл., Россия) за номером V-330. Полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов "Драгун" и "ПетроНов" были расшифрованы в ходе выполнения работы, используя описанные в разделе 1.1 праймеры. Полученные последовательности депонированы для свободного доступа в базе данных GenBank под номерами AY669145 и AY681495. Последовательность штамма "Драгун" представляет собой первую полноразмерную последовательность генома штамма вируса эпидемического паротита генотипа С, доступную в базе данных GenBank. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов генотипа Н "ПетроНов" и 88-1961 (изолирован в 1988 году в США) (Amexis G. et al., 2003), выявило их незначительную дивергенцию (1,67 %). Определенные последовательности, в дополнение к 3 известным ранее полноразмерным последовательностям генома штаммов 88-1961 (генотип Н), Dgl062 (генотип I) и Gloucl (генотип G) были в дальнейшем использованы при проведении сравнительного анализа и генотипирования штамма Л-3.

1.3. Определение и сравнительный анализ полноразмерной последовательности генома вакцинного штамма Л-3 вируса паротита. Полноразмерная последовательность генома штамма Л-3, используемого для производства паротитной вакцины в России, была определена, используя

праймеры, описанные в разделе 1.1. Штамм прошел 15 пассажей в культуре клеток ПМС и 4 пассажа в культуре КЭЯП. Определенная последовательность 18.12.2003 депонирована и 01.07.2004 открыта для публичного доступа в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером AY508995. Результаты сравнения кодирующих участков генома штамма JI-3 и других штаммов вируса паротита приведены в таблице 2. Сравнение разных генов выявило, что помимо гена SH вариабельными являются гены N, I и F. Наиболее консервативными во всем геноме являются гены М и особенно L. Сравнение некодирующих областей генома штамма Л-3 и других штаммов приведено в таблице 3. Вариабельность последовательностей нетранслируемых участков была в большинстве случаев выше вариабельности кодирующей части последовательностей соответствующих генов. Следует отметить, что в отличие от других генов, 5'-нетранслируемая последовательность мРНК белка SH является консервативной у всех штаммов, включая Л-3. Лидерные последовательности штаммов Л-3 и Драгун (генотип С) совпадают. Последовательности инициации синтеза мРНК и сигналы их полиаденилирования у всех исследованных штаммов консервативны. Штамм Л-3 несет замену в последовательности полиаденилирования мРНК гена Р. Данная замена, по аналогии с ранее описанной в 5'-нетранслируемой области гена F штамма Enders (Takeuchi К, et al., 1996), может влиять на уровень синтеза белкового продукта следующего по порядку в геноме гена М, ключевого для архитектоники вириона. Трэйлерная последовательность из 24 нуклеотидов на 3'-конце генома консервативна у всех штаммов. Сравнение аминокислотных последовательностей эпитопов белков HN показало их высокую вариабельность. Критичные для гемагглютинации и нейраминидазной активности участки данного белка NRKSCS (а.о. 240-245) и GAEGRV (а.о. 405-410) (Lim C.S. et al., 2003) идентичны у всех сравниваемых штаммов. Аминокислотные остатки 35-53 (ILVLSVQAVILILVIVTLG) составляющие "мембранный якорь" белка HN (Waxham M.N. et al., 1988) консервативны у всех штаммов вируса паротита, за исключением штаммов Л-3 и L-Zagreb. Штаммы Л-3 и L-Zagreb, в отличие от других, содержат в позиции 51 вместо остатка треонина аминокислоту аспарагин. Первые 19 аминокислот N-концевой части белка слияния, составляющие его сигнальную последовательность, важную для функциональной активности белка (Elango N. et al., 1989; Tecle Т. et al., 2000) высоко вариабельны у всех штаммов. Пептид RRHKR (аминокислотные остатки 98-102), распознаваемый клеточной протеазой, активирующей белок слияния (Waxham M.N. et al., 1987), напротив, идентичен у всех штаммов. Аминокислотный остаток в позиции 195 белка слияния влияет на его активность при слиянии мембран зараженных клеток. Штаммы Л-3 и L-Zagreb содержат в указанном сайте остаток фенилаланина. Этот же аминокислотный остаток содержат штаммы семейства Urabe и корейский штамм "дикого" типа Dgl062. Вакцинные штаммы Jeryl Lynn (США), Rubini (Швейцария), Miyahara и Hoshino (Япония), а также дикие штаммы Gloucl, 88-1961, ПетроНов и Драгун содержат в данной позиции остаток серина. Содержащие данную аминокислоту штаммы предположительно обладают более сильными

Таблица 2. Сравнение кодирующих участков генома штамма Л-3 с гомологичными регионами всех штаммов вируса паротита с известной полной последовательностью нуклеотидных остатков.

№ Название штамма Г* N Р V I м F SH HN L

нк ак НК ак нк ак НК ак нк ак НК ак нк ак ик ак НК ак

1 L-Zagreb_AY685921 ? 0.06 0.18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.06 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

2 JL minor AF345290 A 4.48 1.82 6.64 6.27 6.96 7.14 8.59 8.24 4.52 1.33 5J2 3.16 12.64 15.79 5.60 3.78 4.89 1.46

3 JL major AF338106 A 4.73 1.82 5.71 6.27 6.37 6.70 8.01 7.65 4.34 1.60 5.75 4.09 10.92 12.28 6.29 4.64 5.08 1.33

4 JL Clarke AF201473 A 4.73 1.82 5.71 6.27 6.37 6.70 8.01 7.65 4.34 1.60 5.75 4.09 10.92 12.28 6.29 4.64 5.07 1.33

5 Miyahara NC_002200 В 3.33 1.09 1.96 2.28 2.67 3.12 3.32 2.94 2.57 1.07 3.53 2.42 5.75 8.77 2.80 1.89 2.59 0.71

6 SKB AF314559 В 3.94 1.82 2.30 2.28 2.81 3.12 3.32 2.35 2.39 1.33 3.40 2.42 6.90 10.53 2.92 2.07 2.76 0.66

7 Biken AF314561 в 3.94 1.82 2.30 2.28 2.81 3.12 3.32 2.35 2.39 1.33 3.40 2.42 6.90 10.53 2.80 1.89 2.73 0.62

8 Chiron AF314558 в 3.94 1.82 2.30 2.28 2.81 3.12 3.32 2.35 2.39 1.33 3.40 2.42 6.90 10.53 2.86 1.89 2.74 0.66

9 87 1004 AF314560 в 3.94 1.82 2.30 2.28 2.81 3.12 3.32 2.35 2.39 1.33 3.40 2.42 6.90 10.53 2.80 1.89 2.74 0.66

10 87 1005 AF314562 в 3.94 1.82 2.30 2.28 2.81 3.12 3.32 2.35 2.39 1.33 3.40 2.42 7.47 12.28 2.92 2.06 2.77 0.71

11 ПетроНов_АУ681495 н 4.06 0.73 3.24 4.27 S.04 S.36 5.86 5.88 3.55 1.33 4.64 2.42 6.32 10.53 4.12 2.92 3.40 0.66

12 Драгун AY669145 с 4.24 1.10 2.98 2.28 3.70 3.57 4.69 3.53 3.46 1.33 3.S3 1.86 6.90 12.28 3.72 2.41 3.29 0.88

13 Dgl062 AY309060 I 3.52 0.73 2.98 3.99 4.00 4.46 4.88 4.71 3.81 1.07 4.21 2.97 5.17 7.02 3.09 1.20 3.42 1.81

14 88-1961 AF467767 н 3.64 0.73 2.81 3.70 4.59 4.02 5.08 4.12 3.46 1.33 4.70 2.61 6.32 8.77 3.66 2.24 3.20 0.62

15 Gloucl AF280799 G 3.64 0.18 2.98 2.85 3.85 3.12 4.69 2.94 3.28 0.80 3.53 2.79 4.02 3.51 3.66 2.06 3.27 0.71

Длина последовательности 1650 549 1176 391 675 224 516 165 1128 375 1617 538 174 57 1749 582 6786 2261

Таблица 3. Сравнение некодирующих участков последовательности генома штамма Л-3 с гомологичными регионами всех штаммов вируса паротита с известной полной последовательностью нуклеотидных остатков.

№ Название штамма Г * Лид ер N Т!\П Р V I м F SH HN L Трэйл ер

5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3"

1 L-Zagreb AY685921 7 3.64 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 о.оо 0.00 0.00 0.00 0.00 0.73 0.00

2 JL minor AF345290 A 3.64 3.33 9.01 17.14 16.22 7.50 6.25 11.11 15.56 9.52 16.67 2.00 16.30 16.67 15.15 0.00 10.2 4.17

3 JL major AF338106 A 3.64 4.44 4.50 15.71 16.22 6.28 5.16 8.33 14.44 6.35 18.75 4.00 16.30 19.23 16.67 0.00 10.9 0.00

4 JL Clarke AF201473 A 3.64 4.44 4.50 15.71 16.22 6.28 5.16 8.33 14.44 6.35 18.75 4.00 16.30 19.23 16.67 0.00 10.9 0.00

5 Miyahara NC_002200 В 1.82 1.11 1.80 5.71 10.81 2.27 1.90 2.78 8.89 6.35 6.25 2.00 9.78 8.97 4.55 0.00 5.11 0.00

6 SKB AF314559 В 3.64 1.11 1.80 5.71 12.16 2.97 2.58 2.78 7.78 4.76 6.25 0.00 4.35 10.26 6.06 0.00 3.65 0.00

7 Biken AF314561 В 3.64 1.11 1.80 5.71 12.16 2.97 2.58 2.78 7.78 4.76 6.25 0.00 4.35 10.26 6.06 0.00 3.65 0.00

8 Chiron AF314558 в 3.64 1.11 1.80 5.71 12.16 2.97 2.58 2.78 7.78 4.76 6.25 0.00 4.35 10.26 6.06 о.оо 3.65 0.00

9 87 1004 AF314560 в 3.64 1.11 1.80 5.71 12.16 2.97 2.58 2.78 7.78 4.76 6.25 0.00 4.35 10.26 6.06 0.00 4.38 0.00

10 87 1005 AF314562 в 3.64 1.11 2.70 5.71 12.16 2.97 2.58 2.78 7.78 4.76 6.25 0.00 4.35 10.26 6.06 о.оо 3.65 0.00

11 ПетроНов AY681495 н 5.45 4.44 6.31 11.43 9.46 1.92 2.04 2.78 7.78 11.11 6.25 0.00 13.04 7.69 7.58 0.00 8.03 0.00

12 Драгун AY669145 с 0.00 2.22 8.11 5.71 13.51 3.49 2.85 2.78 6.67 14.29 4.17 2.00 11.96 11.54 9.09 0.00 10.2 0.00

13 Dgl062_AY309060 I 1.82 2.22 3.60 5.71 14.86 3.32 2.85 8.33 10.00 9.52 8.33 4.00 15.22 10.26 3.03 0.00 3.65 0.00

14 88-1961 AF467767 н 5.45 5.56 5.41 10.00 12.16 1.92 2.17 2.78 10.00 11.11 8.33 0.00 11.96 10.26 6.06 о.оо 5.11 0.00

15 Gloucl AF280799 G 0.00 3.33 7.21 7.14 14.86 3.49 2.99 5.56 7.78 7.94 2.08 2.00 11.96 11.54 6.06 0.00 2.19 0.00

Длинна последовательности 55 90 111 70 74 573 736 36 90 64 48 50 92 78 66 8 137 24

Примечание: цифры показывают долю различающихся нуклеотидных/аминокислотных остатков в процентах для пары сравниваемых последовательностей. Образцы 1-8 представляют собой вакцинные штаммы; 9,10 - вирусы, изолированные от лиц с поствакцинальными осложнениями после применения вакцины, приготовленной из штамма игаЬе, 11-15 - штаммы "дикого" типа. Колонка Г показывает генотип штамма, определенный филогенетическим анализом последовательности гена БН.

свойствами к слиянию мембран чем штаммы, содержащие тирозин или близкий к нему по биохимическим свойтвам фенилаланин (Tanabayashi К. et al., 1993). Аминокислотные остатки 483512 белка слияния образуют его "мембранный" якорь (Elango N. et al., 1989). Пептиды, соответствующие данному участку у различных штаммов близки. В то же время, штамм Л-3 содержит остаток треонина вместо аланина в позиции 489. Аминокислотные последовательности С-терминальной части белка N, в которой картированы антигенные детерминанты (а.о. 412-475; 475-549) (Tanabayashi К. et al., 1990) высоко вариабельны у всех штаммов. Данный участок вакцинного штамма Л-3 имеет высокую степень гомологии с соответствующими районами диких штаммов "ПетроНов", "Драгун", Gloucl и 88-1961. Сравнение нуклеотидных и выведенных аминокислотных последовательностей гена L сравниваемых штаммов показало, что он является самым консервативным среди всех белков, кодируемых вирусным геномом. Наиболее важные аминокислотные участки — полимеразный каталитический сайт (а.о. 778-780), район контакта с РНК матрицей (а.о. 555-643) и АТФ связывающий сайт (а.о. 1814-1818) (Okazaki К. et al., 1992) идентичны у всех исследованных штаммов.

Генотипирование штамма Л-3 проводили сравнительным анализом гипервариабельного локуса — гена SH. Филогенетическое древо, построенное методом объединения ближайших соседей при анализе последовательностей гена SH эталонных штаммов различных генотипов, описанных в литературе (Jin L. et al., 2005), и соответствующей последовательности штамма Л-3, полученной в данной работе, представлено на рисунке 1. Индексы поддержки кладистических групп показывают, что данную последовательность достоверно нельзя отнести ни к одному известному генотипу. Схожие результаты получены при анализе методом максимальной экономии, минимальной эволюции и максимального топологического подобия. Полученный результат можно объяснить либо отсутствием всего спектра последовательностей, адекватно описывающих изменчивость вируса паротита на данный момент, либо тем, что она образует новую группу в рамках существующей классификации. Последовательности гена SH штаммов Л-3 и L-Zagreb идентичны. Наименьшая вариация гена SH вакцинного штамма вируса паротита Л-3 выявлена со штаммом ZgB 69 (выделен в 1969 г. в Хорватии) - 4,1 %. Очень близок (5,1% различий) с российским вакцинным штаммом изолят Taylor, выделенный в 1950-х гг. в Великобритании (точное место и время выделения неизвестны, штамм прошел множество пассажей на культуре клеток Vero). Среди остальных генотипов, наиболее близкими к штамму Л-3 являются изоляты, принадлежащие генотипам D и G. Факт удаленности штамма Л-3 от штаммов, выделяемых сегодня, и близость его к "древним" изолятам, скорее всего, отражает его положение исторического реликта, искусственно сохраненного в лаборатории и родство со штаммами, циркулирующими в Европе в конце 60-х гг. прошлого века. Учитывая данные, впервые полученные в ходе выполнения текущей работы, штамм Л-3 может быть отнесен к новому генотипу вируса паротита. Ввиду того, что он прошел большое количество

в!| АА97-12-3

-1198-53/Когеа

|-1598-48/Когеа

' 1598-50/Когеа

£N0

— явы

С1г1 /иК96

МапсМ/1Ж9! - Ое*1/иК98

— МАТ

- М1У

»».Е<12/иК88 ~1Е<1б/иК/88

I-С1ои1/иК9б

|_ |-Рок1-4тер

-КеШ4/иК97

«51—Кеп I— Ьоп

I-1

1-Е<14/ик88 СО« 1/1ш1|а98

-Вга£/Ни151а94

ЬН957 ЬИ959 ЫН023

651-КепН-ЗД1К97

1/иК96 11|1р1/иК97

-РоЗз/Рог^аДОб

|-О К/97/04

У-О К/79/02

„10К/80,'01 5»! Р К/97/03

431 О К/82/06

Л]-В К/83/06

'О К/88/02

БЕУП 5ЕУ1 5Е26068 — Б Е50647 БЕУЗ ва ¡Ь3/Вия1я "^Ь-газгеЬ -Тау/иК50а

Генотвп С

Групп« За

Гаютап Р

а' I—

0.02

Рисунок 1. Результаты филогенетического анализа последовательностей гена БН штаммов вируса паротита, полученных с использованием метода объединения ближайших соседей. Генотип использованных для сравнения изолятов показан жирным шрифтом справа. Цифры показывают индексы поддержки кладистических групп (число репликаций 1 ООО).

пассажей на различных культурах клеток в процессе аттенуации и отсутствия похожих на него современных циркулирующих вирусов, целесообразнее считать его необычным представителем старых изолятов, выходящим за рамки стандартной классификации. Последовательность этого штамма следует использовать при сравнительном анализе новых изолятов вируса паротита.

1.4. Исследование состава вирусной популяции в препарате производственного штамма JI-3. Фрагмент ДНК, содержащий последовательность гена SH, полученный ПНР с использованием высокоточной ДНК полимеразы и кДНК производственного штамма Л-3, клонировали в составе плазмидного вектора Е. coli. Всего было получено 163 колонии клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды. Для дальнейшей работы случайным образом выбирали 64 колонии, у которых определяли последовательность нуклеотидных остатков обеих цепей ДНК встройки гена SH. Проведенное множественное выравнивание полученных последовательностей не выявило наличия замен нуклеотидных остатков. Таким образом, препарат производственного штамма Л-3 гомогенен по наиболее вариабельному локусу генома. Скорее всего, этот факт показывает отсутствие доминирующих квазивидов внутри препарата вакцины.

1.5. Исследования генетической стабильности живой паротитной вакцины на основе штамма Л-3. Используя описанный в разделе 1.1. метод определяли нуклеотидные последовательности вирусов, прошедших 4, 6 и 10 пассажей на культуре КЭЯП. Данные пассажные варианты представляли производственный штамм, посевной вирус и предельный пассаж вируса, применяемый для производства вакцины. При сравнении полученных последовательностей не обнаружено замен нуклеотидов ни в одном из исследованных образцов. Также не определено наличия сайтов со смешанными основаниями. Использованная методика определения последовательности нуклеотидных остатков, по утверждениям фирмы-производителя (http://www.appliedbiosystems.com/), позволяет определить наличие гетерогенных сайтов, если минорный компонент составляет не менее 10% матриц, используемых для определения первичной последовательности. Таким образом, полученные данные, в совокупности с результатами определения нуклеотидных последовательностей репрезентативного числа рекомбинантных плазмид, содержащих встройку гена SH штамма Л-3, еще раз доказывают его генетическую гомогенность. Для проверки генетической стабильности вируса в готовой вакцине нами были определены последовательности н.о. генов SH и HN разных серий паротитной вакцины. Исследованные серии (035, 0927, 0972, 029, 012) были произведены из разных серий посевного вируса в 1992 и 2002 гг. Сравнение полученных последовательностей не выявило наличия мутаций в генах HN и SH ни в одной из исследованных серий вакцины.

1.6. Сравнение полных последовательностей геномов штаммов Л-3 и L-Zagreb. Проведено сравнение полноразмерных последовательностей генома штаммов Л-3, L-Zagreb (номер в базе данных GenBank AY685920) (Ivancic J. et al., 2005), а также штамма L-Zagreb, применяемого для производства паротитной вакцины в Индии, полученной в ходе данной работы. В результате

сравнения установлено, что штамм Leningrad-Zagreb имеет замены нуклеотидов в гене F (G —• А, позиция в геноме 5037) и N (А —► A/G, позиция 1059). Индийский штамм содержит оба варианта нуклеотидных остатков (A/G) в соответствующей позиции гена N. Замена в гене белка слияния не приводит к смене аминокислоты, в то время как замена в гене нуклеопротеина штамма L-Zagreb является значащей и приводит к существованию 2 различных вариантов белка в препарате вакцины, производимой на основе штамма в Ицдии, и полностью меняет кодируемую аминокислоту в штамме, используемом в Хорватии. Российский штамм содержит остаток аспарагиновой кислоты — полярной гидрофильной, отрицательно заряженной аминокислоты; Хорватский - глицин, полярную и незаряженную аминокислоту. Таким образом, происходит смена класса кодируемой аминокислоты, что, потенциально, может привести к изменению биологических свойств нуклеокапсидного белка. Данный белок участвует в упаковке геномной РНК в составе нуклеокапсида, кроме того, без него геномная РНК не может транскрибироваться и реплицироваться (Howley P.M. et al., 1999). В работе (Rubin S.A. et al., 2003) показано, что мутация в гене N возникает при адаптации вируса паротита к репликации в культуре клеток нервной ткани. Таким образом, данные генетические изменения могут привести к изменению биологических свойств вируса, например, его тропности к определенному виду ткани. При сравнении лидерной последовательности штаммов JI-3 и L-Zagreb обнаружено, что оба варианта штамма L-Zagreb содержат замену двух нуклеотидов в данном регионе генома (позиции 14 и 30), участвующем в регуляции транскрипции гена N, инициации синтеза антигеномной РНК и упаковки геномной РНК в составе нуклеокапсидов. Таким образом, вакцинные штаммы JI-3 и L-Zagreb, генетически очень близки, но не идентичны, и поэтому нельзя говорить о полном соответствии российского штамма JI-3 хорватскому (и индийскому) штамму L-Zagreb. 2. Изучение генетических свойств вируса кори.

2.1. Лабораторное подтверждение клинического диагноза "корь" у вакцинированных пациентов.

С 2001 по 2003 год в процессе выполнения работы проводили лабораторное подтверждение случаев клинического диагноза - "корь". Материалы для исследования были получены из городской инфекционной больницы города Минска. Всего были получены образцы от 14 больных корью. Согласно рекомендациям ВОЗ для подтверждения диагноза применяли серологические методы. У обследованных больных диагноз "корь" подтверждался серологически только у шести пациентов из 14 (42.9 %). У троих из них (21.45 %) определялись как специфические антитела класса М, так и значительное повышение титра специфических иммуноглобулинов класса G. При проведении диагностической ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к С-терминальному сегменту гена N вируса кори, клинический диагноз подтверждался у всех исследованных больных. Одинадцать изолятов, выделенных на протяжении всего исследования (2001-2003 гг) при генотипировании были отнесены к генотипу А вируса кори. Образцы, полученные от больных в

2003 г., содержали вирус кори генотипов D6 (2 случая) и D7 (1 случай). Нуклеотидные последовательности выделенных изолятов вируса кори были депонированы в базу данных GenBank под номерами AY523577-AY523581. Последовательности одиннадцати изолятов генотипа А, выделенных в г. Минск были идентичны. Сравнение консенсусной последовательности белорусских изолятов генотипа А с последовательностями ранее описанных штаммов, показало их близость как к вакцинным штаммам (Л-16, AIK-C, L-Zagreb, Rubeovax, Moraten, Shwartz), так и к "диким" штаммам данного генотипа. Схожие данные получены при изучении изолятов вируса кори, выделенных в центральной России и г. Новосибирске (Atrasheuskaya A.V. et al., 2004; Santibanez S. et al., 1999; Журавлева Ю.Н. и др., 2003). При анализе белорусского изолята вируса кори генотипа D7 выявлена высокая гомология (99,3%) последовательности его С-терминального сегмента гена N с последовательностями европейских изолятов вируса кори данного генотипа. Сравнительный анализ минских изолятов вируса кори генотипа D6 показал их близость к штаммам Berlin. DEU/47.00 (Santibanez S. et al., 2002) (Германия, 2000 г.), Nov/97 (Santibanez S. et al., 1999) (Новосибирск, 1997 г.) и к недавним изолятам из г. Москвы (Moscow.RUS/13.03) и республики Дагестан, выделенными в 2003 году.

Таким образом, клинический диагноз "корь" у пациентов, проживающих на территории с высоким показателем применения профилактических прививок (привиты 11 пациентов из 14 (охват прививками против кори в Белоруссии — 99%)) лабораторно подтверждался в основном методами молекулярной диагностики (ОТ-ПЦР и генотипированием), а не серологическими методами. От момента взятия образцов у больных в г. Минске до подтверждения клинического диагноза традиционными методами прошел один месяц. Из-за длительности срока полученния результаты лабораторных тестов не могли помочь клиницистам при ведении больных, а также не были использованы для планирования и проведения должных и своевременных противоэпидемических мер. Результаты, описанные в данном разделе работы, иллюстрируют необходимость метода, позволяющего проводить генодиагностику кори в лабораториях регионального уровня в течение 1-2 дней, Традиционно применяемые процедуры, основанные на ОТ-ПЦР и определении последовательностей нуклеотидных остатков участков генома вируса кори, для данных целей не подходят. Следующий раздел работы посвящен разработке удовлетворяющего поставленным условиям метода.

2.2. Разработка ДНК-микрочипа для генотипнрования образцов вируса кори

Для генотипнрования изолятов вируса кори без применения определения последовательности нуклеотидных остатков в работе применяли технологию ДНК-микрочипов. Процедура анализа основывалась на принципе обратной гибридизации нуклеиновых кислот: на поверхности стеклянного слайда-подложки иммобилизовали олигонуклеотидные зонды, способные гибридизоваться только с определенными видами молекул РНК-мишеней. На предварительном этапе работы проводили идентификацию генотипо-специфических

В2

ВЗ/1 ВЗ/2 С1

С2/1

С2/2

D5/1 D5/2 D6

D7/1

D7/2

D10

HI Н2

GCAATGCATACTAC GCAATGCATACTAC 3AGGACAGGATCAGTAG 3AGGACAGGATCAG TAG

. .А...........С. .

37Sуникальных последовательностей

GCAATGCATACTAofcAGGACAGGATCAGTAG - С2 "специфический* GCAATGCATACTAC|13AGGACAGGATCAGTAG - С2 "контрольный"

Рисунок 2. Рассчет зондов ДНК-микрочипа

нуклеотидных замен, общих для всех изолятов каждого генотипа вируса кори (всего описанно 23 генотипа). Для этого использовалось программное обеспечение Oligoscan (автор д.б.н. К. М. Чумаков, FDA, США). Характерных замен для всех генотипов вируса найти не удалось, поэтому использовали замены, специфичные для различных составных групп, содержащих изоляты вируса кори нескольких генотипов. Генотип образца, в таком случае, можно однозначно определить при помощи анализа структуры замен, характерных для нескольких перекрывающихся составных групп.

Найденные замены использовали для расчета последовательностей зондов ДНК-микрочипа. "Специфические" для определенных групп или генотипов вируса кори зонды рассчитывали по следующим критериям: температура плавления в составе ДНК-дуплекса 45°С, центральное положение детектируемой замены в последовательности зонда, максимально возможное количество различий с другими генотипами вируса кори. Большинство зондов содержало всего одну характерную замену. Для увеличения надежности и точности детекции однонуклеотидных замен в состав ДНК-микрочипа включили дополнительные "контрольные" зонды, которые рассчитывались как антиподы соответствующих "специфических" зондов: оба олигонуклеотида имели идентичные последовательности, однако в ключевой позиции "контрольного" зонда содержался нуклеотидный остаток, встречающийся наиболее часто в не целевых для "специфического" зонда генотипах. Рисунок 2 иллюстрирует процесс расчета зондов для идентификации нуклеотидных замен, характерных для групп и генотипов вируса кори. В состав ДНК-микрочипа были включено два зонда, специфичных к высоко консервативной области С-терминального сегмента гена N изолятов вируса кори. Молекулы РНК-мишени готовили амплификацией вирусной кДНК образца в 2-раундовой ПЦР. Последовательность антисмыслового праймера второго раунда содержала промотор РНК-полимеразы фага Т7. С полученного ампликона in vitro трансрибировали РНК, используя РНК полимеразу данного фага. Далее молекулы РНК химически метили введением остатков флуоресцентного красителя СуЗ. Зонд ДНК-микрочипа, содержащий последовательность смыслового праймера 2 раунда ПЦР использовали для контроля длины синтезируемой РНК мишени, а также для нормировки флуоресцентных сигналов широко специфичных зондов для

вируса кори. После гибридизации и отмывки для каждого зонда ДНК-микрочипа считывали интенсивность флуоресцентного сигнала и значения фонового сигнала. Затем для каждой пары рассчитывали отношение флуоресцентных сигналов "специфического" и "контрольного" зондов. Если флуоресцентные сигналы обоих зондов пары одновременно имели значения ниже четырех величин локального фона, значение отношения их сигналов полагали равным нулю. Нормализованные сигналы двух зондов, связывающихся с любыми штаммами вируса кори, использовали для подтверждения принадлежности исследуемого образца к данному вирусу. Таким образом, паттерн гибридизационных сигналов анализируемого образца состоял из 71 значения отношения сигналов пар зондов для детекции генотипоспецифических или группоспецифических замен, сигналов 2 зондов, показывающих принадлежность образца к вирусу кори и сигнала контрольного зонда. Для анализа данных ДНК микрочипа применен метод иерархического кластерного анализа, позволяющий группировать схожие паттерны гибридизационных сигналов исследуемых образцов. Генотипирование анализируемого образца проводили сравнением его гибридизационного паттерна с полученными ранее и хранящимися в памяти программы анализа паттернами установленных ВОЗ эталонных штаммов генотипов вируса кори (А, В1-ВЗ, С1-С2, D1-D9, Е, F, G1-G3, Н1-Н2). На рисунке 3 показаны результаты кластерного анализа гибридизационных паттернов исследованных в работе образцов. Контрастность элементов матрицы значений (центральная часть рисунка) показывает отношение сигналов флуоресценции пар диагностических зондов ("специфического" и соответствующего "контрольного"), распределенных в обоих измерениях в соответствии с результатами иерархического кластерного анализа. Два последних ряда матрицы показывают интенсивность гибридизационных сигналы от широкоспецифичных для изолятов вируса кори зондов. Индивидуальные гибридизационные профили образцов содержатся в колонках матрицы (название образца вверху колонок). Отношения флуоресцентных сигналов каждой пары олигонуклеотидных зондов содержатся в рядах матрицы (название олигонуклеотидных зондов в правой части рисунка). Шкала значений отношений сигналов пар зондов показана в верхней части рисунка. В нижней части рисунка показана шкала нормализованных сигналов зондов, специфичных для всех изолятов вируса кори. Древовидная схема вверху рисунка показывает группы, определенные сравнением гибридизационных паттернов различных образцов вируса кори. Названия генотипов, соответствующих выделенным группам вируса кори, показаны жирным шрифтом.

Для оценки чувствительности и специфичности разработанного метода использованы 4 панели образцов, суммарная характеристика и результаты исследования которых приведены в таблице 4. Первая панель (образцы № 1-20), содержала ампликоны первого раунда ПЦР, установленных ВОЗ эталонных штаммов генотипов вируса кори. Вторая панель (образцы №2161) содержала кодированные образцы ампликонов первого раунда ПЦР, полученных из образцов больных корью и изолятов вируса кори. В состав панели входил образец генотипа DIO, неизвестного на момент разработки микрочипа, а также 2 гетерологичных образца: вирусы Nipah

Рисунок 3 Иерархический кластерный анализ паттернов гибридизации образцов, полученных используя разработанный ДНК-микрочип

Таблица 4. Образцы вируса кори и других вирусов, вызывающих экзантемные заболевания,

использованные для оптимизации и валидации разработанного ДНК-микрочипа.

№ Шифр в работе Название штамма Номер в GenBank Генотип образца Результат ДНК микрочип

1 AREF MVi/Edmonston-wt.USA/54 U01987 A А

2 B1 REF MVi/Yaounde.CAE/12.83 "Y-14" U01998 B1 В1

3 B2REF MVi/LibreviIle.GAB/84 "R-96" U01994 B2 В2

4 В3.1 REF MVi/New York.USA/94 L46753 B3.1 ВЗ

5 В3.2 REF MVMbadan.NIE/97/1 AJ232203 B3.2 ВЭ

6 CI REF MVi/Tokyo.JPN/84/K AY043459 CI С1

7 С2 REF MVi/Maryland.USA/77 "JM" M89921 C2 С2

8 D3REF MVi/IlHnois.USA/89/1 "Chicago-1" U01977 D3 D3

9 D4REF MVi/Montreal.CAN/89 U01976 D4 D4

10 D5.1 REF MVi/Palau.BLA/93 L46758 D5.1 D5

11 D5.2 REF MV ¡/Bangkok. THA/93/1 AF079555 D5.2 D5

12 D6REF MVi/New Jersey.USA/94/1 L46750 D6 D6

13 D7.1 REF MVi/Victoria.AUS/16.85 AF243450 D7.1 D7

14 D7.2 REF MVi/Illinois.USA/50.99 AY037020 D7.2 D7

15 D9 REF MVi/Victoria.AUS/12.99 AF481485 D9 D9

16 G1 REF MVi/Berkeley.USA/83 U01974 G1 G1

17 G2 REF MVi/Amsterdam.NET/49.97 AF171232 G2 G2

18 G3REF MVi/Gresik.INO/17.02 AY184218 G3 G3

19 HI REF MVi/Hunan.CHN/93/7 AF045201 HI HI

20 Н2 REF MVi/Beijing.CHN/94/I AF045217 H2 Н2

21 CDC 1 Shanghai-191 (штамм ЖКВ) DQ390225 A А

22 CDC г MVi/Noith Carolina. USA/20.05 DQ390255 A А

23 CDC 3 MVi/Niamey.NIG/26,03-1 DQ390243 B3.2 ВЗ

24 CDC 4 MVi/Niamey.NIG/26.03-2 DQ390240 B3.2 ВЗ

25 CDC 5 MVi/Niamey.NIG/26.03-3 DQ390241 B3.2 ВЗ

26 CDC 6 Вирус Nipah HO. _ Отр

27 CDC 7 Вирус Паротита H. O. - Отр

28 CDC 8 MVi/IllinoisUSA/01.03 DQ390227 D3 D3

29 CDC 9 MVi/California.USA/20.04 DQ390226 D3 D3

30 CDC 10 MVi/Pennsylvannia.USA/14.03 DQ390238 D4 D4

31 CDC 11 MVi/Iliino is. USA/22.05 DQ390253 D4 D4

32 CDC 12 MVi/lndiana.USA/22.05 DQ390254 D4 D4

33 CDC 13 MVi/Tokyo.JPN/00.97 DQ390230 D5.1 D5

34 CDC 14 MViAnkaia.TUR/10.98-4 AY899319 D6 D6

35 CDC 15 MVi/Washington.USA/17.98 AY037038 D6 D6

36 CDC 16 MVs/Arizona.USA/04.05 DQ390256 D6 D6

37 CDC 17 MVi/New York.USA/32.03 DQ390229 D7.2 D7

38 CDC 18 MVi/California.USA/41.02 DQ390235 D7.2 D7

39 CDC 19 MVi/lowa.USA/13.04 DQ390252 D8 D8

40 CDC 20 M Vi/Iowa.USA/11.04 DQ390251 D8 D8

41 CDC 21 MVi/Iowa.USA/14.04 DQ390250 D8 D8

42 CDC 22 MVi/Brooklyn.USA/10.04 DQ390245 D8 D8

43 CDC 23 MVs/New York.USA/04.05 DQ390257 D8 D8

44 CDC 24 MVi/Santander.COL/31.02 DQ390237 D9 D9

45 CDC 25 MVs/New York.USA/1.05 DQ390258 D9 D9

46 CDC 26 MVi/Montreal.CAN/11.87 AF410989 E Е

47 CDC 27 SMa79 X84865 F F

48 CDC 28 MVi/Loei.THA/23.01-1 DQ390231 G2 G2

49 CDC 29 MVi/Bangkok.THA/41.00-3 DQ390232 G2 G2

50 CDC 30 MVi/Gresik.INO/17.02 AY184217 G3 G3

51 CDC 31 MVs/Majuro.RMI/35.03 DQ390228 HI HI

52 CDC 32 MVi/California.USA/20.04 DQ390249 HI HI

53 CDC 33 MVi/Mexico City.MEX/14.04-1 DQ390248 HI HI

54 CDC 34 MVi/Mexico City.MEX/14.04-2 DQ390247 HI HI

55 CDC 35 MVi/Mexico City.MEX/14.04-3 DQ390244 HI HI

56 CDC 36 MVi/Mexico City.MEX/14.04-4 DQ390246 HI HI

57 CDC 37 MVi/Majuro.RMI/44.03 DQ390239 HI HI

58 CDC 38 MVi/Utanbataar.MOG/50.02 DQ390234 HI HI

59 CDC 39 MVi/Mexico City.Mex/23.03 DQ390242 HI HI

60 CDC 40 MVi/MinnesotaUSA/36.01 DQ390236 H2 H2

61 CDC 41 MVi/Kampala.UGA/51.00 AY 923185 D10 D10

62 SA 1 MVs/Cape Town.SOA/45.02 AY994533 B2 ВЗ

63 SA 2 MVs/Cape Town.SOA/47.02/7 AY994533 B2 ВЗ

64 SA 3 MV s/Luanda. AN G/13.03/1 AY994534 В2 ВЗ

65 SA 4 MVs/Maputo.MOZ/21.03 AY994533 D2 D2

66 SA 5 MVs/Bushbuckridge.SOA/29.03 AY994533 D4 D4

67 SA 6 MVs/Paarl.SOA/37.03 AY994534 D2 D2

68 SA 7 MVb'Beira.MOZ/38.03 DQ400386 D4 D4

69 SA 8 MVs/Benoni.SOA/43.03 DQ400387 D2 D2

70 SA 9 MVs/JohannesbuiE.SOA/45.03 DQ400388 D2 D2

71 SA 10 MVs/Johannesburß.SOA/37.04/2 DQ400389 D2 D2

72 SA 11 MVs/Johannesburß.SOA/37.04 DQ400390 D2 D2

73 SA 12 MVs/Johannesburfi.SOA/3.04 DQ400391 D2 D2

74 SA 13 MVs/Maseru.LES/44.04 DQ400392 D2 D2

75 SA 14 MVs/Boksburß.SOA/36.03 DQ400393 D2 D2

76 SA 15 MVi/Kinshasa.COD/ 19.05 DQ400394 В2 ВЗ

77 VIDRL 1 MVs/PNG/24.02 DQ400395 D3 D3

78 VIDRL 2 MVs/Victoria.AU/20.03 DQ400396 D8 D8

79 VIDRL 3 M Vs/Oueensland. AU/18.03 DQ400397 HI Hl

80 VIDRL 4 MVi/Sarawak.MAS/2.05 DQ398063 D9 D9

81 VIDRL 5 Парвовирус человека B19 И.О. _ Огр

82 VIDRL 6 MVs/NS W.AUS/29.01 AF481481 D5 ПЦРОгр

83 VIDRL 7 MVs/Victoria.AUS/26.00 AF481494 G2 G2

84 VIDRL 8 MVi/Victoria. AUS/4.90 AF243459 С2 С2

85 VIDRL 9 MVi/Victoria. AUS/13.98 AF243468 D4 D4

86 VIDRL 10 MVs/Queetisland. AUS/52.01 Vaccine А ПЦРОтр

87 VIDRL 11 MVs/Victoria. AUS/1.02 DQ398061 D8 D8

88 VIDRL 12 MVs/Victoria. AUS/30.02 DQ398072 HI HI

89 VIDRL 13 MVs/Queensland. AUS/38.03 DQ398057 D5 D5

90 VIDRL 14 MVi/Victoria. AUS/43.01 AF481484 D5 ПЦРОгр

91 VIDRL 15 MVi/Queensland. AUS/37.03 DQ398058 D5 D5

92 VIDRL 16 Респираторно-синцитиальный вирус H. О. - Огр

93 VIDRL 17 Вирус парагриппа типа 2 Н. О. - Огр

94 VIDRL 18 MVi/Victoria. AUS/39.81 AF243449 Dl D1

95 VIDRL 19 М Vi/Victoria.AUS/51.86 AF243454 D7 D7

96 VIDRL 20 Нетипнрованный риновирус Н. О. _ Огр

97 VIDRL 21 i'epneceupyc человека типа 6 н. о. - Отр

98 VIDRL 22 MV s/Victoria. AUS/10.03 DQ398073 Hl 111

99 VIDRL 23 MVs/Queensland. AUS/9.03 DQ398056 D3 D3

100 VIDRL 24 MVs/Victoria. AUS/10.03 DQ398074 Hl Hl

101 VIDRL 25 Герпесвирус человека типа 6 И.О. - Отр

102 VIDRL 26 MVi/Victoria. AUS/5.01 AF481491 D8 D8

103 VIDRL 27 MVs/Queensland. AUS/8.00 DQ398065 D7 ПЦРОгр

104 VIDRL 28 MVs/Victoria.AUS/29.04 DQ398078 G2 G2

105 VIDRL 29 MVs/Victoria. AUS/6.05 DQ398066 D4 D4

106 VIDRL 30 Вирус Эпштейна-Барр И.О. - Отр

107 VIDRL 31 Парвовирус человека В19 И.О. _ Огр

108 VIDRL 32 MV s/Victoria. AUS/28.04 DQ398079 G3 G3

109 VIDRL 33 MVs/South Australia.AUS/39.04 DQ398062 D8 D8

110 VIDRL 34 MVs/Victoria. AUS/21.02 DQ398077 H2 Н2

111 VIDRL 35 Varicella Zoster Virus И.О. _ Огр

112 VIDRL 36 Нетипированный риновирус И.О. - Отр

113 VIDRL 37 MVi/MGL/26.02 DQ398076 Hl HI

114 VIDRL 38 MVs/Victoria. AUS/16.03 DQ398075 HI HI

115 VIDRL 39 MVs/Oueensland.AUS/44.01 Vaccine A А

116 VIDRL 40 MVs/Queensland. AUS/52.01 DQ398059 D5 D5

117 VIDRL 41 MVs/ PNG/48.01 DQ398055 D3 D3

118 VIDRL 42 Цитомегаловирус человека Н. О. - Огр

119 VIDRL 43 Вирус ветряной оспы - опоясываюи^го лиишя НО. - Огр

120 VIDRL 44 MVs/Queensland.AUS/47.03 DQ398081 D9 D9

121 VIDRL 45 MVs/Victoria. AUS/14.04 DQ398064 D9 D9

122 VIDRL 46 Цитомегаловирус человека Н.О. - Огр

123 VIDRL 47 MVs/ South Australia.AUS/37.03 DQ398071 Hl HI

124 VIDRL 48 MVs/New South Wales.AUS/4.04 DQ398067 D4 D4

125 VIDRL 49 MVs/Queensland. AUS/12.04 DQ398068 D4 D4

126 VIDRL 50 Вирус парагриппа типа 2 Н.О. - Отр

127 VIDRL 51 MVs/Victoria. AUS/48.04 DQ398082 D5 D5

128 VIDRL 52 Вирус Эпттейна-Барр Н.О. - Огр

129 VIDRL 53 Респираторно-синчитиальный вирус Н. О. - Отр

130 VIDRL 54 MVs/Victoria. AUS/2.04 DQ398080 G3 G3

131 VIDRL 55 MVs/South Australia.AUS/20.03 DQ398069 D2 D2

и паротита. Данные панели использованы для оптимизации и первичной характеризации разработанного метода. Результаты определения генотипов в образцах вируса кори из панели 2 ДНК-микрочипом полностью совпадали с результатами генотипирования классическим методом. Образец нового генотипа DIO был определен как принадлежащий вирусу кори. Образцы вирусов Nipah и паротита определялись как отрицательные. Для валидации метода использованы кодированные панели образцов из Австралии (№ 177-131) и ЮАР (№ 62-76). Панель из Австралии содержала образцы кДНК, полученной из клинических образцов больных корью и гетерологичные образцы от больных инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом, различными герпесвирусами, вирусом парагриппа второго типа и риновирусом. Панель из ЮАР содержала кодированные образцы кДНК, приготовленные из клинического материала больных корью. При исследовании панели образцов из Австралии вирус кори обнаруживали в 35 из 39 образцов. Чувствительность метода, таким образом, составляла 89,7%. Ложно-положительных результатов не зафиксировано (т.е. специфичность 100%). Генотипы образцов полученных анализом ДНК-микрочипом и классическим методом совпадали у всех положительных образцов. При исследовании панели образцов из ЮАР вирус кори обнаруживали в 14 образцах из 15. Чувствительность анализа составляла 93,3%. Специфичность не определялась, т.к. панель содержала только образцы вируса кори. Совпадение результатов генотипирования с результатами классического метода составляло 71,4%. Анализ ДНК-микрочипом неверно идентифицировал генотип 4 образцов генотипа В2, ошибочно определив их принадлежащими к генотипу ВЗ. Это было вызвано малым размером выборки последовательностей (всего 2), использованной для расчета зондов для детекции генотипа В2. После включения дополнительных зондов, специфичных для данного генотипа вируса кори, ДНК-микрочип был способен дифференцировать все ранее описанные, равно как и неизвестный на момент расчета генотип D10 вируса кори. Итоговая чувствительность анализа составила 90,7%. Ложноположительных результатов получено не было, поэтому специфичность метода приближалась к 100%. Совпадение генотипов, определенных с помощью ДНК-микрочипов и классическим методом, составило 85,7%. Исходя из полученных результатов, разработанный метод может быть использован для быстрого генотипирования изолятов вируса кори.

Благодарности. Автор благодарит коллег по лаборатории и сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор", в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа: Г.М. Игнатьева, Е.В. Отрашевскую, Е.К. Букина, А.П.Агафонова, H.A. Нетесову, A.B. Шустова; Е.А. Нечаеву; сотрудников ГИСК им Л.А. Тарасевича Т.Н. Юнасову, Т.А. Бектимирова и В.Ф.Попова; сотрудников FDA K.M. Чумакова и В.Е. Чижикова. Автор благодарит Р. A. Rota, D. Е. Griffin, G. Tipples, за предоставленные образцы кори для проведения исследований.

Выводы:

1. Впервые определена полноразмерная последовательность генома вакцинного штамма JI-3 вируса паротита. Полученная последовательность депонирована в базе данных GenBank.

2. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма Л-3 вируса паротита, используемого для производства вакцины в России.

3. Впервые в России определены полноразмерные последовательности геномов изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Последовательность штамма "Драгун" представляет первую полноразмерную последовательность генома вируса паротита генотипа С в мире. Сравнение полноразмерных последовательностей штамма "ПетроНов" генотипа Н, выделенного в г. Новосибирске в 2003 г. с последовательностью штамма 88-1961 (1988 г., США) выявило их незначительую вариацию (1,67%).

4. Впервые определены генотипы вируса кори, циркулирующие на территории г. Минск, республика Беларусь. В 2001-2003 гг. выделены изоляты генотипа А вируса кори, в 2003 году выделены изоляты генотипов D6 и D7.

5. Разработан ДНК-микрочип для генотипирования изолятов вируса кори. Метод апробирован, используя образцы вируса кори всех описанных генотипов, включая новый генотип D10. Анализом клинических материалов, полученных от больных другими экзантемными заболеваниями, показана строгая специфичность метода для вируса кори. Чувствительность и специфичность разработанного метода при исследовании панелей кодированных образцов составила (90,7%) и (100%), соответственно.

Список публикаций по итогам работы:

1. Atrasheuskaya A.V., Kameneva S.N., Neverov A.A.. Ignatyev G.M. Acute infectious mononucleosis and coincidental measles virus infection. J Clin Virol. 2004 Oct;31(2): 160-4.

2. Агафонов А.П., Каменева C.H., Агафонова O.A., Неверов A.A.. Игнатьев Г.М. Вирусологические и иммунологические показатели у больных рассеянным склерозом. Вестник Российской Академии медицинских наук. 2004. №8: 3-6.

3. Atrasheuskaya A.V., Blatun Е.М., Neverov A.A. Kameneva S.N., Maksimov N.L., Karpov I.A., Ignatyev G.M. Measles in Minsk, Belarus, 2001-2003: clinical, virological and serological parameters. J Clin Virol. 2005 Nov;34(3): 179-85.

4. Неверов A.A.. Игнатьев Г.М., Юнасова Т.Н., Попов В.Ф., Бектемиров Т.А., Чумаков K.M. Изучение генетической стабильности и гомогенности вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита. Биопрепараты. 2005 №4: 21-27.

5. Atrasheuskaya A.V., Neverov A.A.. Rubin S., Ignatyev G.M. Horizontal transmission of the Leningrad-3 live attenuated mumps vaccine virus. Vaccine. 2006 Mar;24(10):1530-6.

Доклады и тезисы конференций

1. A.V. Atrasheuskaya, A.A.Neverov, S.N. Kameneva, G.M. Ignatyev. Horizontal Transmission of Live Attenuated L-3 Mumps Vacine Virus. / Тезисы конференции "11th International Congress on Infection Diseases" Cancun, Mexico, March 4-7 2004.

2. Неверов А.А.. Юнасова Т.Н., Попов В.Ф., Бектимиров T.A., Игнатьев Г. М., Chumakov К.М. Изучение генетической стабильности штамма JI-3 вируса паротита при производстве живой вакцины. / Тезисы конференции 'Тенодиагностика Инфекционных Болезней" Москва, 1921 октября 2004.

3. Неверов А.А.. Игнатьев Г.М., W. Moss, V. Chizhikov. Использование методологии ДНК микрочипов для генотипирования изолятов вируса кори. / Тезисы конференции 'Тенодиагностика Инфекционных Болезней" Москва, 19-21 октября 2004.

4. Neverov A.A.. Atrasheuskaya A.V., Unasova Т. N., Bectimirov Т. A., Chumakov К. М. and G.M. Ignatyev. Genetic stability of L3 live mumps vaccine strain during vaccine production in Russia. / Тезисы конференции "IUMS 2005. Microbes in a Changing world" San Francisco, CA, July 2328,2005.

5. A. Neverov. M. A. Riddell, W. J. Moss, D. V. Volokhov, P. A. Rota, L. E. Lowe, D. Chibo, S. B. Smit, D. E. Griffin, К. M. Chumakov, V. E. Chizhikov. Genotyping of measles virus in clinical specimens based on oligonucleotide microarray hybridization patterns. /Тезисы конференции "A Century of FDA Science: Pioneering the Future of Public Health. FDA Science Forum" Washington, DC, April 18-20, 2006.

Подписано к печати 27 июня 2006 г. Тираж 100 экз. Заказ № 1787. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Неверов, Александр Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ. ф ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Семейство Paramyxoviridae. Генетические и биологические свойства. Классификация. Общие сведения.

1.2. Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства Paramyxoviridae.

1.2.1. Вакцины против эпидемического паротита.

1.2.2. Вакцины против кори.

1.3. Диагностика заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae.

1.3.1. Диагностика эпидемического паротита. Генодиагностика эпидемического паротита.26 ^ 1.3.2. Диагностика кори.

1.3.2.1. Методы лабораторной диагностики кори.

1.3.2.2. Молекулярная эпидемиология и генодиагностика вируса кори.

1.3.2.3. Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори. Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори. 1.4. Лечение заболеваний, вызываемых вирусами кори и паротита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы. ф 2.2.1. Выделение суммарной РНК.

2.2.2. Проведение реакции обратной транскрипции.

2.2.3. Проведение ПЦР.

2.2.3.1. Амплификация фрагментов генома вируса паротита.

2.2.3.2. Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения вируса кори.

2.2.3.3. Амплификация кДНК вируса кори из клинических образцов для проведения анализа ДНК-микрочипом.

2.2.4. Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР.

2.2.5. Клонирование продуктов ПЦР в плазмидный вектор pGEM-5Zf(+) Е. Coli.

2.2.6. Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК.

2.2.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.8. Подготовка молекул одноцепочечной РНК для гибридизации на ДНК-микрочипе. 2.2.9. Приготовление ДНК-микрочипов для генотипирования вируса кори.

2.2.10. Гибридизация молекул одноцепочечной РНК на ДНК-микрочипе.

2.2.11. Сканирование ДНК-микрочипов и анализ данных.

2.2.12. Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полноразмерных последовательностей генома вируса паротита.

3.2. Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г. Новосибирска.

3.3. Изучение генетических свойств вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита.

3.3.1. Определение полноразмерной последовательности генома штамма Л-3 вируса паротита.

3.3.2. Исследование состава вирусной популяции в препарате производственного штамма ф Ленинград-3, применяемого при производстве паротитной вакцины.

3.3.3. Исследования генетической стабильности живой паротитной вакцины на основе штамма JI3.

3.3.4. Сравнительный анализ последовательности генома вакцинного штамма JI-3 с описанными ранее штаммами вируса паротита. 3.4. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Ленинград-3 и • L-Zagreb.

3.5. Генотипирование изолятов вируса кори.

3.6. Разработка олигонуклеотидного микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори.

3.6.1. Определение генотип- и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе гена N вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа.

3.6.2. Оценка различных платформ для иммобилизации олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа и оптимизация условий метода.

3.6.3. Первичная характеризация разработанного ДНК-микрочипа для генотипирования изолятов вируса кори.

4 3.6.4. Валидация метода генотипирования вируса кори с помощью ДНК-микрочипов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита"

Высокая контагиозность, восприимчивость разных возрастных групп, возможные тяжелые осложнения и продолжительная иммуносупрессия у переболевших характерны для заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae - паротита и кори (Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина, 2000). Успехи вирусологии в разработке эффективных вакцин способствовали широкому использованию иммунизации против данных заболеваний во многих странах мира. Обе инфекции относят к категории заболеваний, контролируемых с помощью вакцинации (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. В.И. Покровского, 1993; Galazka A.M. et al., 1999).

Средством профилактики эпидемического паротита являются вакцины на основе аттенуированных штаммов. Наибольшее применение имеют вакцины, приготовленные на основе штаммов Ленинград-3 (Россия), Leningrad-Zagreb (Египет, Хорватия, Индия), Jeryl Lynn (США, Бельгия), Urabe (Франция, Бельгия, Италия) (Galazka A.M. et al., 1999; www.who.int/vaccines/en/mumps.shtml). Одним из факторов, заставляющих настороженно относится к использованию вакцин против вируса паротита на основе аттенуированных штаммов, является их возможная нейровирулентность (Sugiura A. and A. Yamada, 1991; Forsey Т. et al„ 1992; Miller E.M. et al., 1993). ВОЗ предлагает не только выяснить причины нейровирулентности вакцинных штаммов, применяемых при производстве вакцин для профилактики эпидемического паротита, но и осуществлять контроль их генетической стабильности на этапах производства. Такая работа проведена для штамма Jeryl Lynn (Amexis G.S. et al., 2002). Изучение штамма Jeryl Lynn показало, что он генетически гетерогенен и содержит 2 различных субштамма (Afzal М.А. et al., 1993; Amexis G.S. et al., 2002). Вакцина на основе этого штамма достаточно иммуногенна и не вызывает неврологических осложнений у привитых. Известна полноразмерная последовательность генома штамма Urabe (Amexis G. et al., 2001a), однако, работы по изучению генетической стабильности этого штамма в условиях производства не проводятся. В России (ранее в СССР) для производства вакцины против эпидемического паротита используется штамм Ленинград-3 (JI-3). В Хорватии, Индии и Египте используется штамм Leningrad-Zagreb. История появления штамма с таким названием указывает на его связь со штаммом Ленинград-3 (Beck М. et al., 1989). Анализ данных о поствакцинальных осложнениях после иммунизации вакциной на основе штамма Л-3 в России обнаружил чрезвычайно низкую частоту неврологических осложнений (0,018 на 100000 привитых) (Максимова О.А. и др., 2001). В то же время при применении вакцины производства Хорватии и Индии (штамм L-Zagreb) осложнения в виде асептического менингита неоднократно регистрировались (Cizman М. et al., 1989; Kraigher A. and Tesovic G. et al., 1993; da Cunha S.S et al., 2002; da Silveira C.M et al., 2002). Многие авторы обсуждают штаммы L-Zagreb и Ленинград-3 как один и тот же штамм. Подобные факты вызывали спекуляции о низком качестве российской вакцины, однако, никто из зарубежных (равно и отечественных) исследователей не сообщали данных о генетических свойствах штамма Ленинград-3. Отсутствие таких данных не позволяет говорить об идентичности штаммов Leningrad-Zagreb и Ленинград-3. Средством, позволяющим положить конец подобным инсинуациям, является изучение структуры штамма Ленинград-3 и его генетической стабильности.

Несмотря на широкое применение профилактических прививок, заболеваемость эпидемическим паротитом в различных странах, включая Россию, остается значительной (4,2 на 100000 человек в 2004 году) (http://www.mzsrrf.ru/stat/41.html). Данные о генетических свойствах циркулирующих штаммов вируса паротита очень ограничены. На территории России подобные исследования проводятся спорадически и в очень ограниченных масштабах (Heider A. et al., 1997b; Нестеров А.Е. и др., 2004). Общеизвестно, что под давлением иммунной системы вирус способен изменять свои антигенные и другие биологические свойства. Поэтому анализ циркулирующих на отдельной территории изолятов, выделенных в разное время, может предоставить информацию об изменениях в геноме вируса и возможных путях его эволюции. Иммунизация вакцинным штаммом вируса паротита потенциально может не приводить к формированию полноценного протективного иммунного ответа вакцинированных против различающихся по антигенным свойствам (Orvell, С.A. et al., 1997а; Yates, P.J. et al., 1996) штаммов «дикого» типа. Об этом свидетельствуют случаи заболевания вакцинированных лиц (Hersh, B.S. et al., 1991) и случаи повторного заболевания ранее переболевших при инфицировании вирусами гомологичных генотипов (Nojd, J. et al., 2001). Поэтому сравнение последовательностей эпитопов и других иммунологически и функционально значимых районов белков циркулирующих штаммов «дикого» типа и штаммов, используемых для приготовления вакцин, представляет определенный интерес для выяснения причин названных выше явлений.

В рамках программы по элиминации кори, проводящейся под эгидой ВОЗ и ЮНЕСКО (WHO-UNICEF, 2002) генотипирование изолятов этого вируса является важным компонентом слежения за заболеваемостью (Bellini W.J. and Helfand R.F. 2003; Bellini W.J. and Rota P.A. 1998; Mulders M.N. et al., 2001; Rota J.S. et al., 1996). Исследование генотипов вируса кори, циркулирующих на определенной территории, позволяет отслеживать пути передачи вируса (Rota, J.S. et al., 1996) и помогает отличать поствакцинальные осложнения от случаев заболевания, вызванных инфицированием штаммами "дикого" типа (Bellini W.J. and P.A. Rota, 1998). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований, в совокупности с анализом данных классической эпидемиологии, позволяют корректировать календарь профилактических прививок для повышения эффективности контроля над инфекцией (Mulders M.N. et al., 2001).

Молекулярная характеризация изолятов вируса кори проводится, в основном, крупными лабораториями, расположенными в развитых странах (Featherstone, D.D. et al., 2003). Сложности, связанные с необходимостью транспортировки инфекционных образцов, высокой термолабильностью вируса кори, а также длительным сроком проведения анализа подчас не позволяют эффективно осуществлять генодиагностику заболевания для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий. Из-за изменений в клинической картине и атипичности серологических показателей у вакцинированных против кори (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005), диагностика заболевания рекомендованными ВОЗ методами (WHO Department of vaccines and Biologicals, 1999) затруднена. В случае инфицирования вакцинированных штаммами вируса кори "дикого" типа, принадлежащими генотипу А (идентичному с генотипом вакцины), молекулярные методы (ОТ-ПЦР и генотипирование) являются единственным способом лабораторного подтверждения клинического диагноза (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2004; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005).

Определение последовательности нуклеотидных остатков продуктов ПЦР в настоящее время является самым точным и эффективным способом идентифицировать генотипы вируса кори (Kremer J.R. et al., 2004). Однако, существует необходимость использовать альтернативные методы, позволяющие быстро проводить генотипирование большого количества образцов. Так же может быть необходимо анализировать несколько областей генома вируса одновременно, например, для повышения точности или чувствительности анализа. Поэтому необходима разработка методов, позволяющих проводить генетический анализ изолятов вируса кори за наиболее короткое время и как можно ближе от мест их выделения. Метод ДНК-микрочипов с применением олигонуклеотидных зондов (Pease А.С. et al., 1994; Schena М. et al., 1995; Hoheisel J.D. 2006) представляет одну из возможных альтернатив, т.к. он применим для исследования большого количества образцов и может быть легко модифицирован для одновременного анализа нескольких генов вируса или всего генома.

Целью настоящего исследования являлось изучение генетических свойств вирусов кори и паротита.

Задачами настоящего исследования являлись:

3. Изучение разнообразия генотипов вируса кори, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками: анализ клинических образцов методом ОТ-ПЦР для определения геномной РНК вируса кори; определение генотипов изолятов вируса кори, циркулирующих на данной территории.

4. Разработка ДНК-микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори: разработка метода и его оптимизация, используя установленные ВОЗ эталонные штаммы генотипов вируса кори и изоляты "дикого" типа, выделенные на территории различных стран; валидация метода используя панели клинических образцов, собранных от больных корью и лиц, инфицированных другими вирусами, вызывающими экзантемные заболевания; определение чувствительности и специфичности разработанного метода.

Научная новизна работы. Впервые определены полноразмерные последовательности геномов сибирских изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Получена полноразмерная последовательность генома штамма JI-3, применяющегося при производстве паротитной вакцины в России. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма JI-3. Для обработки данных ДНК-микрочипов при генотипировании изолятов вируса кори впервые применен метод иерархического кластерного анализа.

Практическая значимость работы. Выделен и депонирован в коллекцию культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер V-330) штамм вируса паротита ПетроНов (генотип Н). Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков генома штаммов вируса паротита. В соответствии с рекомендациями ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) охарактеризован штамм JI-3, применяющийся для производства паротитной вакцины в России. Разработан метод генотипирования изолятов вируса кори без использования определения последовательности нуклеотидных остатков участков генома вируса.

Положения, выносимые на защиту.

1. Показана стабильность и генетическая гомогенность штамма JI-3 вируса паротита, применяемого для производства паротитной вакцины в России.

2. Установлены генетические различия между вакцинными штаммами вируса паротита JI-3 (Росиия) и L-Zagreb (Хорватия, Индия, Египет).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Генодиагностика Инфекционных Болезней" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), "IUMS 2004 - Microbes in the changing world. XIII International Congress of Virology" (San

Francisco, CA, July 23-28, 2005), "A Century of FDA Science: Pioneering the Future of Public Health. FDA Science Forum" (Washington, DC, April 18-20,2006) Публикации. По материалам диссертации опубликование 10 печатных работ. Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением клинических исследований, получены непосредственно автором.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Неверов, Александр Александрович

выводы

1. Впервые определена полноразмерная последовательность генома вакцинного штамма Л-3 вируса паротита. Полученная последовательность депонирована в базе данных GenBank.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день определены полноразмерные последовательности геномов 13 штаммов вируса паротита. Шесть из них представляют собой последовательности вариантов штамма Urabe, 7 - последовательности уникальных штаммов. Проведению сравнительных исследований на уровне полноразмерных последовательностей геномов мешает их существенная дивергенция (достигает 8% между наиболее удаленными представителями), не позволяющая использовать специфичные для определенного штамма праймеры при амплификации кДНК других штаммов. В данной работе впервые применен подход к дизайну олигонуклеотидов-праймеров, обеспечивающий их применимость для амплификации любых штаммов вируса паротита, как вакцинных, так и штаммов «дикого типа». Использованный подход позволяет комплексно изучать изменчивость различных генов в ходе эволюции при исследовании штаммов "дикого" типа и является единственно доступным на сегодняшний день для выяснения молекулярных механизмов аттенуации вируса. Определение полной последовательности генома вируса паротита, используемого в качестве посевного вируса при производстве вакцины может также быть использовано в качестве дополнительного контрольного теста при определении ее качества.

С помощью предложенного метода определена полноразмерная последовательность генома вакцинного штамма Ленинград-3, а также штаммов "дикого" типа ПетроНов и Драгун, выделенных в г. Новосибирске в 1994 и 2003 годах. Штамм Драгун представляет собой первый в мире штамм вируса паротита генотипа С с определенной полнополноразмерной последовательностью генома. Штамм ПетроНов относится к генотипу Н - широко распространенному в настоящее время на территории Европейских стран и США. В базе данных GenBank доступна последовательность штамма 88-1961, этого же генотипа, выделенного в 1988 году в США. Проведенные исследования позволили получить данные о генетических различиях между циркулирующими в Сибири штаммами вируса паротита генотипов С и Н (штаммы "ПетроНов" и "Драгун"), вакцинными штаммами

Ленинград-3, Leningrad-Zagreb, Urabe, Jeryl Lynn major, Jeryl Lynn minor и другими ранее описанными штаммами "дикого" типа (Dgl062, 88-1961, Gloucl) на уровне полноразмерных последовательностей геномов. Сравнение различных генов данных штаммов вируса паротита выявило, что помимо гена SH вариабельными также являются гены N, I и F. Наиболее консервативными во всем геноме являются гены М и особенно L. Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена показал, что между дикими и вакцинными штаммами явных отличий нет. С незначительными перестановками внутри подгрупп, топология деревьев, построенных по последовательностям всех генов были схожи и практически повторяли топологию дерева, построенного при анализе последовательностей полного генома. Помимо кодирующих участков, геном вируса содержит достаточно большое количество (около 7% всего генома) не кодирующих, регуляторных участков. Сохранение их в ходе эволюции указывает на функциональную значимость. Регуляторные последовательности найдены во многих вирусных геномах, они необходимы для правильной реализации генетической информации на различных этапах жизненного цикла вируса. Точные функциональные значения замен нуклеотидов в данных участках генома вируса паротита эксперементально не определены, однако мутация в 5'-некодирующей части гена F приводит к отсутствию нормальной экспрессии следующего за ним в геноме гена SH (Takeuchi К. et al., 1996). При анализе последовательности генома штамма Л-3 обнаружена аналогичная замена в последовательности сигнала полиаденилирования матричной РНК гена Р, который также кодирует дополнительные белковые продукты V и I.

Определение и сравнение полноразмерных последовательностей генома вариантов штамма Ленинград-3 с различной пассажной историей показало, что штамм не претерпевает каких-либо генетических изменений после 6 последовательных пассажей на первичной культуре клеток эмбрионов японского перепела, используемой в качестве клеточного субстрата при производстве вакцины в Росиии. Исследование гипервариабельного локуса генома - гена SH, показало генетическую гомогенность препарата производственного штамма Российской вакцины на основе штамма Ленинград-3.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в отличие от штамма Jeryl Lynn (США), вакцина на основе отечественного штамма Л-3 генетически гомогенна - т.е. она не содержит нескольких субштамов вируса. Более того, генетически гомогенным является не только исходныйпроизводственный вакцинный штамм, но и пассажи, применяемые для получения серий посевного вируса и готовой паротитной вакцины. В отношении других используемых вакцинных штаммов вируса паротита - Urabe, Rubini, Miyahara, L-Zagreb подобная информация отсутствует. Таким образом, живые вакцины, производимые только из штаммов Jeryl Lynn и Ленинград-3 охарактеризованы по составу вирусной популяции в их препаратах.

В работе определена полноразмерная последюовательность генома штамма L-Zagreb, применяемого для производства паротитной вакцины фирмой Serum Institute of India (Индия). Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Л-3 и L-Zagreb (номер в базе данных GenBank AY685920) (Ivancic J. et al., 2005), а также индийского варианта этого штамма показало, что штамм L-Zagreb имеет замены нуклеотидов в гене F (G-* А, позиция в геноме 5037) и N (А-* A/G, позиция 1059). Индийский штамм содержит оба варианта (A/G) в соответствующей позиции гена N. Мутация в гене белка слияния (F) не приводит к смене аминокислоты, в то время как замена в гене нуклеопротеина штамма L-Zagreb является значащей, т.е. приводит к существованию 2 различных вариантов данного белка в препарате вакцины, производимой на основе штамма в Индии и полностью меняет кодируемую аминокислоту в штамме, используемом в Хорватии. Российский штамм содержит остаток аспарагиновой кислоты - полярной, гидрофильной, отрицательно заряженной аминокислоты; другой - глицин - полярной, не заряженной. Таким образом, происходит смена класса кодируемой аминокислоты, что, потенциально, может привести к изменению биологических свойств нуклеокапсидного белка. При сравнении лидерной последовательности штаммов Л-3 и L-Zagreb обнаружено, что оба варианта штамма L-Zagreb (Хорватский и Индийский) содержат замену двух нуклеотидов в данном регионе генома (позиции 14 и 30) по сравнению с Российским штаммом Ленинград-3. Таким образом, показано, что вакцинные штаммы Л-3 и L-Zagreb, генетически очень близки, но не идентичны, и поэтому нельзя говорить о полном соответствии российского штамма Л-3 хорватскому (и индийскому) штамму L-Zagreb.

При лабораторном подтверждении случаев с клиническим диагнозом "корь" на территории республики Беларусь диагноз подтверждался по серологическим показателям только у 6 пациентов из 14. В то же время генодиагностика кори подтверждала клинический диагноз у всех пациентов (14 из 14). Установлено, что с 2001 по 2003 гг. регистрировали циркуляцию штаммов вируса кори генотипа А, генотипы D6 и D7 вируса кори среди исследованных случаев на территории г. Минск определены в 2003 году. Вирусы генотипа А продолжали циркулировать на данной территории несмотря на высокий охват вакцинацией населения. Данные молекулярной эпидемиологии, полученные в ходе программы надзора за корью во множестве других стран мира, показывают низкое количество случаев заболеваний корью, вызванных генотипом А вируса в настоящее время. Клинический диагноз "корь" у пациентов, проживающих на территории с высоким показателем применения профилактических прививок (привиты И пациентов из 14 (охват прививками против кори в Белоруссии - 99%)) лабораторно подтверждался в основном методами молекулярной диагностики (ОТ-ПЦР и генотипированием), а не серологическими методами. Таким образом, большинство случаев кори на территории с высоким показателем применения профилактических прививок представляют собой случаи нетипично протекающей "вакцинно модифицированной" кори, для правильной диагностики которых необходимо применение как серологических, так и молекулярно-вирусологических методов анализа клинических образцов в комплексе. Очевидно, что для современных условий необходим метод, позволяющий быстро (в течении 1-2 дней) проводить генодиагностику кори в лабораториях регионального уровня. Существующие общепринятые методы анализа, основанные на ОТ-ПЦР и определении последовательности нуклеотидных остатков участков вирусного генома для данных целей не подходят. Таким образом, разработка альтернативных методов генотипирования вирусов кори, необходима и оправдана.

ДНК-микрочипы для генотипирования микроорганизмов основаны на использовании относительно коротких (15-40 звеньев) олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизоваться с определенными участками некоторых последовательностей из анализируемой совокупности. Таким образом эти последовательности могут быть дискриминированы относительно других. В настоящее время существует несколько компьютерных программ для автоматизированного расчета уникальных олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипов. Однако расчет олигонуклеотидных зондов для близко родственных последовательностей, различающихся одной или несколькими рассеянными точковыми мутациями, представляет собой непростую задачу. Возможность перекрестная гибридизация с неспецифическими для анализируемого образца зондами также ограничивает возможности метода. Процедуры, применяемые в исследованиях, связанных с ДНК-микрочипами, пока не оптимизированы для стандартного использования в полевых условиях, они все еще относительно дороги. Несмотря на указанные недостатки, последние достижения в области жидкостных систем малого размера, кремниевой технологии, электроники и нанотехнологии обещают создание небольших по размерам, недорогих, и удобных в использовании устройств, комбинирующих различные лабораторные приборы в виде одного инструмента разового использования.

Использование стандартных подходов для расчета олигонуклеотидных зондов для дискриминации последовательностей гена N вируса кори не привело к нахождению достаточного количества уникальных для каждого генотипа олигонуклеотидных зондов. Чтобы преодолеть данное затруднение, использовались зонды, специфичные для сложных групп, состоящих из образцов, принадлежащих нескольким генотипам, которые использовались в дополнение к зондам, специфичным для одного генотипа вируса кори. Таким образом, генотипирование изолятов вируса кори в работе базировалось на комплексном анализе паттернов гибридизации, содержащих сигналы от нескольких зондов, специфичных для перекрывающихся групп вируса кори. Пары олигонуклеотидных зондов ("специфические" и "контрольные") использовались для детекции единичных замен нуклеотидных остатков в анализируемых образцах - мишенях.

Чтобы идентифицировать генотип анализируемого образца вируса кори, сравнивали его гибридизационный паттерн с паттернами, полученными при анализе эталонных штаммов генотипов. Коэффициент корреляции Пирсона использовался в качестве меры расстояния между сравниваемыми гибридизационными паттернами образцов. Вычислением расстояния во всевозможных вариантах парных сравнений результатов анализа ДНК-микрочипом клинических образцов и эталонных штаммов получали матрицу расстояний, которая использовалась для построения древовидной схемы, отражающей меру родства образцов между собой. Данная методика, обычно используемая при анализе дифференцильной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов, впервые использована для целей классификации последовательностей вируса кори. Разработанный метод прошел валидацию с использованием панелей клинических образцов, полученных от больных корью и другими экзантемными заболеваниями (54 клинических образца от больных корью, 16 образцов от больных другими вирусными заболеваниями). В результате исследования, метод показал высокую чувствительность (90,7%) и специфичность (100%). Совпадение результатов генотипирования изоляов вируса кори, полученных методами ДНК-микрочипов и определением первичной последовательности участков вирусного генома с последующим филогенетическим анализом составило 85,7%. Данные различия были обусловлены малым размером выборки последовательностей, использованной для дизайна олигонуклеотидных зондов для детекции генотипа В2. После включения дополнительных зондов для детекции данного генотипа вируса кори, ДНК-микрочип был способен дифферинцировать все ранее описанные, ровно как и неизвестный на момент расчета генотип D10 вируса кори. Исходя из полученных результатов, разработанный метод может быть использован в качестве альтернативного для быстрого генотипирования большого количества изолятов вируса кори, относящихся как к ранее описанным, так и к новым генотипам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Неверов, Александр Александрович, Кольцово

1. Агафонов А.П., Нечеухина С.Н., Патрушев Н.А., Денисов С.И., Орловская С.П., Рябчикова Е.И., Блинов В.М., Игнатьев Г.М. (1997). Выделение сибирского изолята вируса паротита. Вопросы вирусологии 42(5): 222.

2. Агафонов А.П., Каменева С.Н., Агафонова О.А., Неверов А.А., Игнатьев Г.М. (2004). Изучение вирусологических и иммунологических показателей у больных рассеянным склерозом. Вестник Российской Аадемии Медицинских Наук 8: 3.

3. Журавлева Ю.Н., Луговтцев В.Ю., Воронина О.Л., Шилов И.А., Ванюшева О.В., Лунин В.Г., Наумова М.А., Мамаева Т.А., Тихонова Н.Т. (2003). Вопросы вирусологии 4:29.

4. Максимова О.А., Попов В.Ф., Бектимиров Т.А., Григорьева Л.В., Юнасова Т.Н., Каплунова О.П., Шарова O.K. (2001). Сравнительная оценка нейровирулентности отечественной и зарубежных живых паротитных вакцин. Вопросы вирусологии 5:31.

5. Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Бурчик М.А., Рота П. Генотипический анализ диких штаммов вируса кори, циркулирующих в России в 2000-2001гг. Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. Т.3:299.

6. Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Рота П., Бурчик М.А., Седак Е.Ф. (2004). Генетическая характеристика диких штаммов вируса кори, циркулирующих на европейской территории России в период 1998-2002 гг. Вопросы вирусологии 4:12.

7. Нестеров А.Е., Каменева С.Н., Максимов Н.Л., Игнатьев Г.М. (2004). Лимфаденопатия при эпидемическом паротите у ранее вакцинированного ребенка. Инфекционные болезни 2(4): 92.

8. Попов В.Ф. Корь и коревая вакцина JI-16. М. Триада-Х, 2002:192

9. Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина. С-Петербург. Фолиант, 2000: 480.

10. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.2. Под ред. В.И. Покровского. М. Медицина, 1993:374

11. Чумаков К.М. и Юшманов С.В. (1988). Принцип максимального топологического подобия в молекулярной систематике. Молекулярная генетика микробиология и вирусология 3:3.

12. Юшманов С.В и Чумаков К.М. (1988). Алгоритмы построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия. Молекулярная генетика микробиология и вирусология 3:9.

13. Afzal, M. A., J. Buchanan, A. B. Heath and P. D. Minor (1997b). Clustering of mumps virus isolates by SH gene sequence only partially reflects geographical origin. Archives of Virology 142(2): 227.

14. Afzal, M. A., A. R. Pickford, T. Forsey, A. B. Heath and P. D. Minor (1993). The Jeryl Lynn vaccine strain of mumps virus is a mixture of two distinct isolates. J Gen Virol 74 (Pt 5): 917.

15. Albrecht, P., K. Herrmann and G. R. Burns (1981). Role of virus strain in conventional and enhanced measles plaque neutralization test. Journal of Virological Methods 3(5): 251.

16. Amexis, G., N. Fineschi and K. Chumakov (2001a). Correlation of genetic variability with safety of mumps vaccine Urabe AM9 strain. Virology 287(1): 234.

17. Amexis, G., S. Rubin, N. Chatteijee, K. Carbone and K. Chumakov (2003). Identification of a new genotype H wild-type mumps virus strain and its molecular relatedness to other virulent and attenuated strains. J Med Virol 70(2): 284.

18. Amexis, G., S. Rubin, V. Chizhikov, F. Pelloquin, K. Carbone and K. Chumakov (2002). Sequence diversity of Jeryl Lynn strain of mumps virus: quantitative mutant analysis for vaccine quality control. Virology 300(2): 171.

19. Arista, S., D. Ferraro, A. Cascio, E. Vizzi and R. Di Stefano (1995). Detection of IgM antibodies specific for measles virus by capture and indirect enzyme immunoassays. Research in Virology 146(3): 225.

20. Arens M. (1999). Methods for subtyping and molecular comparison of human viral genomes Clin Microbiol Rev 12(4):612.

21. Atrasheuskaya, A. V., S. N. Kameneva, A. A. Neverov and G. M. Ignatyev (2004). Acute infectious mononucleosis and coincidental measles virus infection. J Clin Virol 31(2): 160.

22. Atrasheuskaya, A. V., E. M. Blatun, A. A. Neverov, S. N. Kameneva, N. L. Maksimov, I. A. Karpov, G. M. Ignatyev (2005). Measles in Minsk, Belarus, 2001-2003: clinical, virological and serological parameters. J Clin Virol. 34(3): 179.

23. Bech, V. (1959). Studies on the development of complement fixing antibodies in measles patients. J Immunol 83:267.

24. Bellini, W. J., G. Englund, S. Rozenblatt, H. Arnheiter and C. D. Richardson (1985). Measles virus P gene codes for two proteins. J Virol 53(3): 908.

25. Bellini, W. J. and R. F. Helfand (2003). The challenges and strategies for laboratory diagnosis of measles in an international setting. J Infect Dis 187 Suppl 1: S283.

26. Bellini, W. J. and P. A. Rota (1998). Genetic diversity of wild-type measles viruses: Implications for global measles elimination programs. Emerging Infectious Diseases 4(1): 29.

27. Biellik, R., S. Madema, A. Taole, A. Kutsulukuta, E. Allies, R. Eggers, N. Ngcobo, M. Nxumalo, A. Shearley, E. Mabuzane, E. Kufa and J. M. Okwo-Bele (2002). First 5 years of measles elimination in southern Africa: 1996-2000. Lancet 359(9317): 1564.

28. Black, F. L. (1989). Measles active and passive immunity in a worldwide perspective. Progress in medical virology. Fortschritte der medizinischen Virusforschung. Progres en virologie medicale 36:1.

29. Schaffner (1994). Sustained transmission of mumps in a highly vaccinated population: Assessment of primary vaccine failure and waning vaccine-induced immunity. Journal of ® Infectious Diseases 169(1): 77.

30. Broliden, К., E. R. Abreu, M. Arneborn and M. Bo?ttiger (1998). Immunity to mumps p before and after MMR vaccination at 12 years of age in the first generation offered the twodose immunization programme. Vaccine 16(2-3): 323.

31. Brown, E. G., K. Dimock and К. E. Wright (1996). The Urabe AM9 mumps vaccine is a mixture of viruses differing at amino acid 335 of the hemagglutinin-neuraminidase gene with one form associated with disease. Journal of Infectious Diseases 174(3): 619.

32. Cattaneo, R., К. Kaelin, К. Baczko and M. A. Billeter (1989). Measles virus editing provides an additional cysteine-rich protein. Cell 56(5): 759.

33. Cattaneo, R., G. Rebmann, A. Schmid, K. Baczko, V. ter Meulen and M. A. Billeter (1987). Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain. Embo J 6(3): 681.

34. Chamot, E., L. Toscani, P. Egger, D. Germann and C. Bourquin (1998). Estimation of the efficacy of three strains of mumps vaccine during an outbreak in Geneva state (Switzerland). Rev Epidemiol Sante Publique 46(2): 100.

35. Chen, R. Т., L. E. Markowitz, P. Albrecht, J. A. Stewart, L. M. Mofenson, S. R. Preblud and W. A. Orenstein (1990). Measles antibody: Reevaluation of protective titers. Journal of Infectious Diseases 162(5): 1036.

36. Chibo, D., C. J. Birch, P. A. Rota and M. G. Catton (2000). Molecular characterization of measles viruses isolated in Victoria, Australia, between 1973 and 1998. J Gen Virol 81(Pt 10): 2511.

37. Chibo, D., M. Riddell, M. Catton and C. Birch (2002). Novel measles virus genotype, East Timor and Australia. Emerg Infect Dis 8(7): 735.

38. Chibo, D., M. Riddell, M. Catton, M. Lyon, G. Lum and C. Birch (2003). Studies of measles viruses circulating in Australia between 1999 and 2001 reveals a new genotype. Virus Res 91(2): 213.

39. Chizhikov, V., A. Rasooly, K. Chumakov and D. D. Levy (2001). Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl Environ Microbiol 67(7): 3258.

40. Cizman, M., M, Mozetic, R. Radescek-Rakar, D. Pleterski-Rigler and M. Susec-Michieli (1989). Aseptic meningitis after vaccination against measles and mumps. Pediatric Infectious Disease Journal 8(5): 302.

41. Cochi, S. L., M. Wharton and S. A. Plotkin (1994). Mumps vaccine. In: Vaccines. Plotkin S.A., Mortimer E.A.Philadelphia, WB Saunders: 277.

42. The risk of aseptic meningitis associated with the Leningrad-Zagreb mumps vaccine strain il following mass vaccination with measles-mumps-rubella vaccine, Rio Grande do Sul,

43. Brazil, 1997. Int J Epidemiol 31:978.

44. Medicina Tropical de Sao Paulo 33(1): 32.57. de Swart, R.L., S. Yuksel and A. D. Osterhaus (2005). Relative contributions of measles virus hemagglutinin- and fusion protein-specific serum antibodies to virus neutralization. J Virol. Sep;79(17): 11547

45. Drake, J.W. and J.J. Holland (1999). Mutation rates among RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 96 (24): 13910.

46. Eisen, M. В., Р. Т. Spellman, P. 0. Brown and D. Botstein (1998). Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 95(25): 14863.

47. Elango, N., Т. M. Varsanyi, J. Kovamees and E. Norrby (1988). Molecular cloning and characterization of six genes, determination of gene order and intergenic sequences and leader sequence of mumps virus. J Gen Virol 69 (Pt 11): 2893.

48. Elango, N., Т. M. Varsanyi, J. Kovamees and E. Norrby (1989). The mumps virus fusion protein mRNA sequence and homology among the paramyxoviridae proteins. Journal of General Virology 70(4): 801.

49. Elliott, G. D., M. A. Afzal, S. J. Martin and В. K. Rima (1989). Nucleotide sequence of the matrix, fusion and putative SH protein genes of mumps virus and their deduced amino acid sequences. Virus Research 12(1): 61.

50. Featherstone, D., D. Brown and R. Sanders (2003). Development of the Global Measles Laboratory Network. J Infect Dis 187 Suppl 1: S264.

51. Fescharek, R., U. Quast, G. Maass, W. Merkle and S. Schwarz (1990). Measles-mumps vaccination in the FRG: An empirical analysis after 14 years of use. II. Tolerability and analysis of spontaneously reported side effects. Vaccine 8(5): 446.

52. Forleo-Neto, E., E. S. Carvalho, I. C. P. Fuentes, M. S. Precivale, L. H. A. Forleo and С. K. Farhat (1997). Seroconversion of a trivalent measles, mumps, and rubella vaccine in children aged 9 and 15 months. Vaccine 15(17-18): 1898.

53. Forsey, Т., M. L. Bentley, P. D. Minor and N. Begg (1992). Mumps vaccines and meningitis 25. Lancet 340(8825): 980. W 69. Furesz, J. and G. Contreras (1990). Vaccine-related mumps meningitis-Canada. Canadadiseases weekly report 16(50): 253.

54. Galazka, A. M., S. E. Robertson and A. Kraigher (1999). Mumps and mumps vaccine: A global review. Bulletin of the World Health Organization 77(1): 3.

55. Giraudon, P., M. F. Jacquier and T. F. Wild (1988). Antigenic analysis of African measles virus field isolates: Identification and localisation of one conserved and two variable epitope$sites on the NP protein. Virus Research 10(2-3): 137.

56. Gluck, R., J. M. Hoskins and A. Wegmann (1986). Rubini, a new live attenuated mumps vaccine virus strain for human diploid cells. Developments in Biological Standardization• Vol. 65: 29.

57. Gotoh, В., Т. Komatsu, К. Takeuchi and J. Yokoo (2001). Paramyxovirus accessory ^ proteins as interferon antagonists. Microbiology and Immunology 45(12): 787.

58. Hamaguchi, M., T. Yoshida, K. Nishikawa, H. Naruse and Y. Nagai (1983). Transcriptive complex of Newcastle disease virus. I. Both L and P proteins are required to constitute an active complex. Virology 128(1): 105.

59. Hersh, В. S., P. E. M. Fine, W. K. Kent, S. L. Cochi, L. H. Kahn, E. R. Zell, P. L. Hays and C. L. Wood (1991). Mumps outbreak in a highly vaccinated population. Journal of Pediatrics 119(2): 187.

60. Hersh, B. S., G. Tambini, A. C. Nogueira, P. Carrasco and C. A. De Quadras (2000). Review of regional measles surveillance data in the Americas, 1996-99. Lancet 355(9219): 1943.

61. Hilleman, M. R., E. B. Buynak, R. E. Weibel and J. Stokes, Jr. (1968). Live, attenuated mumps-virus vaccine. N Engl J Med 278(5): 227.

62. Howley, P. M., B. Lafont, D. Spehner, K. Kaelin, M. A. Billeter and R. Drillien (1999). A functional measles virus replication and transcription machinery encoded by the vaccinia virus genome. J Virol Methods 79(1): 65.

63. Hummel, К. В., D. D. Erdman, J. Heath and W. J. Bellini (1992). Baculovirus expression of the nucleoprotein gene of measles virus and utility of the recombinant protein in diagnostic enzyme immunoassays. Journal of Clinical Microbiology 30(11): 2874.

64. Ihara, Т., H. Ochiai, K. Kitamura, M. Ito, M. Sakurai and H. Kamiya (1995). Markedly elevated levels of a2-microglobulin in urine with measles viruria in patients with measles. Clinical and Diagnostic Virology 4(4): 285.

65. Isa, M. В., L. Marti?nez, M. Giordano, M. Zapata, С. Passeggi, M. С. De Wolff and S. Nates (2001). Measles virus-specific immunoglobulin G isotype immune response in early and late infections. Journal of Clinical Microbiology 39(1): 170.

66. Ivancic, J., Т. K. Gulija, D. Forcic, M. Baricevic, R. Jug, M. Mesko-Prejac and R. Mazuran (2005). Genetic characterization of L-Zagreb mumps vaccine strain. Virus Res 109(1): 95.

67. Jefferson, Т., D. Price, V. Demicheli and E. Bianco (2003). Unintended events following immunization with MMR: a systematic review. Vaccine 21(25-26): 3954.

68. Jenkerson, S. A., M. Beller, J. P. Middaugh and D. D. Erdman (1995). False positive ® rubeola IgM tests 4. New England Journal of Medicine 332(16): 1103.

69. Jin, L., S. Beaid and D. W. Brown (1999). Genetic heterogeneity of mumps virus in the United Kingdom: identification of two new genotypes. J Infect Dis 180(3): 829.

70. Jin, L., D. W. G. Brown, P. A. Litton and J. M. White (2004). Genetic diversity of mumps p virus in oral fluid specimens: Application to mumps epidemiological study. Journal ofф Infectious Diseases 189(6): 1001.

71. Jin, L., D. W. G. Brown, M. E. B. Ramsay, P. A. Rota and W. J. Bellini (1997). The diversity of measles virus in the United Kingdom, 1992-1995. Journal of General Virology 78(6): 1287.

72. Jin, L., B. Rima, D. Brown, C. Orvell, T. Tecle, M. Afzal, K. Uchida, T. Nakayama, J. W.t

73. Song, C. Kang, P. A. Rota, W. Xu and D. Featherstone (2005). Proposal for geneticcharacterisation of wild-type mumps strains: preliminary standardisation of the nomenclature. Arch Virol 150(9): 1903.

74. Johansson, В., Т. Tecle and C. Orvell (2002). Proposed criteria for classification of new genotypes of mumps virus. Scand J Infect Dis 34(5): 355.

75. Kashiwagi, Y., T. Takami, T. Mori and T. Nakayama (1999). Sequence analysis of F, SH, and HN genes among mumps virus strains in Japan. Archives of Virology 144(3): 593.

76. Kobune, F., H. Sakata and A. Sugiura (1990). Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus. Journal of Virology 64(2): 700.

77. Kolakofsky, D. and A. Bruschi (1975). Antigenomes in Sendai virions and Sendai virus-infected cells. Virology 66(1): 185.

78. Kolakofsky, D., T. Pelet, D. Garcin, S. Hausmann, J. Curran and L. Roux (1998). Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. J Virol 72(2): 891.

79. Kouomou, D. W., E. Nerrienet, J. Mfoupouendoun, G. Тепе, H. Whittle and T. F. Wild (2002). Measles virus strains circulating in Central and West Africa: Geographical distribution of two B3 genotypes. J Med Virol 68(3): 433.

80. Kovamees, J., R. Rydbeck, C. Orvell and E. Norrby (1990). Hemagglutinin-neuraminidase (HN) amino acid alterations in neutralization escape mutants of Kilham mumps virus. Virus Research 17(2): 119.

81. Kraigher, A. Monitoring Side-Effects and Adverse Events Following Immunization Against Measles and Mumps in a National Vaccination Programme in Slovenia from 1982 to 1986.

82. Kreis, S. and T. Whistler (1997). Rapid identification of measles virus strains by the heteroduplex mobility assay. Virus Res 47(2): 197.

83. Kremer, J. R., F. Fack, С. M. Olinger, M. N. Mulders and C. P. Muller (2004). Measles virus genotyping by nucleotide-specific multiplex PCR. J Clin Microbiol 42(7): 3017.

84. Kumar, S., K. Tamura, I. B. Jakobsen and M. Nei MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software.

85. Kumar, S., K. Tamura and M. Nei (2004). MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 5(2): 150.

86. Kunkel, U., G. Driesel, U. Henning, E. Gerike, H. Willers and E. Schreier (1995). Differentiation of vaccine and wild mumps viruses by polymerase chain reaction and nucleotide sequencing of the SH gene: brief report. J Med Virol 45(2): 121.

87. Laassri, M., V. Chizhikov, M. Mikheev, S. Shchelkunov and K. Chumakov (2003). Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J Virol Methods 112(1-2): 67.

88. Lamb R.A. and Kolakofsky D. (2001). Paramyxoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields Virology. Knipe D.M. and Howley P.M. Philadelphia, Lippincott Williams and Wilkins. 2: 1305.

89. Lee, J. Y., Y. Y. Kim, G. C. Shin, В. K. Na, J. S. Lee, H. D. Lee, J. H. Kim, W. J. Kim, J. Kim, C. Kang and H. W. Cho (2003). Molecular characterization of two genotypes of mumps virus circulated in Korea during 1998-2001. Virus Research 97(2): 111.

90. Levitt, L.P., D.H. Mahoney, H.L. Casey, J.O. Bond (1970). Mumps in a general population: A sero-epidemiologic study. Am J Dis Child 120:134.

91. Lim, С. S., К. P. Chan, К. Т. Goh and V. Т. К. Chow (2003). Hemagglutinin-neuraminidase sequence and phylogenetic analyses of mumps virus isolates from a vaccinated population in Singapore. Journal of Medical Virology 70(2): 287.

92. Lund, G. A., D. L. Tyrrell, R. D. Bradley and D. G. Scraba (1984). The molecular length of measles virus RNA and the structural organization of measles nucleocapsids. J Gen Virol 65 (Pt 9): 1535.

93. Margraf, R.L., M. Erali, M. Liew, C.T. Wittwer (2004). Genotyping hepatitis С virus by heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis. J Clin Microbiol. 42(10): 4545.

94. Matsumoto, T. (1982). Assembly of paramyxoviruses. Microbiol Immunol 26(4): 285.

95. McCarthy, M. and R. A. Lazzarini (1982). Intracellular nucleocapsid RNA of mumps virus. J Gen Virol 58 Pt 1:205.

96. Miller, E., M. Goldacre, S. Pugh, A. Colville, P. Farrington, A. Flower, J. Nash, L. MacFarlane and R. Tettmar (1993). Risk of aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine in UK children. Lancet 341(8851): 979.

97. Miller, E., A. Hill, P. Morgan-Capner, T. Forsey and M. Rush (1995). Antibodies to measles, mumps and rubella in UK children 4 years after vaccination with different MMR vaccines. Vaccine 13(9): 799.

98. Minnich, L. L., F. Goodenough and C. G. Ray (1991). Use of immunofluorescence to identify measles virus infections. Journal of Clinical Microbiology 29(6): 1148.

99. Mori, T. (1994). A simple method for genetic differentiation of the AIK-C vaccine strain from wild strains of measles virus. Biologicals 22(2): 179.

100. Muhlemann, K. (2004). The molecular epidemiology of mumps virus. Infect Genet Evol 4(3): 215.

101. Mulders, M. N., A. T. Truong and C. P. Muller (2001). Monitoring of measles elimination using molecular epidemiology. Vaccine 19(17-19): 2245.

102. Muwonge, A., M. Nanyunja, P. A. Rota, J. Bwogi, L. Lowe, S. L. Liffick, W. J. Bellini and S. Sylvester (2005). New measles genotype, Uganda. Emerg Infect Dis 11(10): 1522.

103. Nates, S. V., G. Y. Rey, M. 0. Giordano, M. T. Zapata, A. Depetris and J. Boshell (1994). Modified seroneutralization assay for measles virus antibody detection. Research in Virology 145(1): 45.

104. Nojd, J., T. Tecle, A. Samuelsson and C. 0?rvell (2001). Mumps virus neutralizing antibodies do not protect against reinfection with a heterologous mumps virus genotype. Vaccine 19(13-14): 1727.

105. Ohara, O., R. L. Dorit and W. Gilbert (1989). Direct genomic sequencing of bacterial DNA: the pyruvate kinase I gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 86(18): 6883.

106. Okazaki, К., K. Tanabayashi, K. Takeuchi, M. Hishiyama, K. Okazaki and A. Yamada (1992). Molecular cloning and sequence analysis of the mumps virus gene encoding the L protein and the trailer sequence. Virology 188(2): 926.

107. Orvell, C. (1978). Structural polypeptides of mumps virus. J Gen Virol 41(3): 527.

108. Orvell, C., A. R. Alsheikhly, M, Kalantari and B. Johansson (1997a). Characterization of genotype-specific epitopes of the HN protein of mumps virus. Journal of General Virology 78(12): 3187.

109. Orvell, С., M. Kalantari and В. Johansson (1997b). Characterization of five conserved genotypes of the mumps virus small hydrophobic (SH) protein gene. Journal of General Virology 78(1): 91.

110. Paccaud, M. F., P. Hazeghi, M. Bourquin, A. M. Maurer, C. A. Steiner, A. J. Seiler, P. Helbling and H. Zimmermann (1995). Two mumps outbreaks in retrospect RUCKBLICK AUF ZWEIMUMPSAUSBRUCHE. Sozial- und Praventivmedizin 40(2): 72.

111. Paterson, R. G. and R. A. Lamb (1990). RNA editing by G-nucleotide insertion in mumps virus P-gene mRNA transcripts. Journal of Virology 64(9): 4137.

112. Pease, A.C., D. Solas, E. J. Sullivan, M. T. Cronin, C. P. Holmes, S. P. Fodor (1994). Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 91:5022.

113. Preblud, S.R. and S.L. Katz (1994). Measles vaccine. In: Vaccines. Plotkin S.A., Mortimer E.A. Philadelphia, WB Saunders: 182

114. Ratnam, S., G. Tipples, C. Head, M. Fauvel, M. Fearon and B. J. Ward (2000). Performance of indirect immunoglobulin M (IgM) serology tests and IgM capture assays for laboratory diagnosis of measles. Journal of Clinical Microbiology 38(1): 99.

115. Riddell, M. A., J. S. Rota and P. A. Rota (2005). Review of the temporal and geographical distribution of measles virus genotypes in the prevaccine and postvaccine eras. Virol J 2: 87.

116. Rota, J. S., P. A. Rota, S. B. Redd, S. C. Redd, S. Pattamadilok and W. J. Bellini (1998). Genetic analysis of measles viruses isolated in the United States, 1995-1996. J Infect Dis177(1): 204.

117. Rota, P. A. and W. J. Bellini (2003). Update on the global distribution of genotypes of wild type measles viruses. J Infect Dis 187 Suppl 1: S270.

118. Rota, P. A., S. L. Liffick, J. S. Rota, R. S. Katz, S. Redd, M. Papania and W. J. Bellini (2002). Molecular epidemiology of measles viruses in the United States, 1997-2001. Emerg Infect Dis 8(9): 902.Ш

119. Rubin, S. A., G. Amexis, M. Pletnikov, Z. Li, J. Vanderzanden, J. Mauldin, C. Sauder, T. Malik, K. Chumakov and К. M. Carbone (2003). Changes in mumps virus gene sequence associated with variability in neurovirulent phenotype. J Virol 77(21): 11616.

120. Sallie, R. (2005). Replicative Homeostasis: A fundamental mechanism mediating selective viral replication and escape mutation. Virol J 2(1): 10.

121. Santibanez, S., A. Heider, E. Gerike, A. Agafonov and E. Schreier (1999). Genotyping of measles virus isolates from Central Europe and Russia. Journal of Medical Virology 58(3): 313.Ъ

122. Santibanez, S., A. Tischer, A. Heider, A. Siedler and H. Hengel (2002). Rapid replacement of endemic measles virus genotypes. Journal of General Virology 83(11): 2699.

123. Sauder, С. J., К. M. Vandenburgh, R. С. Iskow, Т. Malik, К. M. Carbone and S. A. Rubin (2006). Changes in mumps virus neurovirulence phenotype associated with quasispecies heterogeneity. Virology.

124. Schena, M., D. Shalon, R, W. Davis, P. 0. Brown (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270:467.

125. Schrag, S. J., P. A. Rota and W. J. Bellini (1999). Spontaneous mutation rate of measles virus: Direct estimation based on mutations conferring monoclonal antibody resistance. Journal of Virology 73(1): 51.

126. Sergeev, N., M. Distler, S. Courtney, S. F. Al-Khaldi, D. Volokhov, V. Chizhikov and A. Rasooly (2004). Multipathogen oligonucleotide microarray for environmental and biodefense applications. Biosens Bioelectron 20(4): 684.

127. Server, A. C., D. C. Merz, M. N. Waxham and J. S. Wolinsky (1982). Differentiation of mumps virus strains with monoclonal antibody to the HN glycoprotein. Infection and Immunity 35(1): 179.

128. Singh, R., T. J. John, T. Cherian and P. Raghupathy (1994). Immune response to measles, mumps and rubella vaccine at 9, 12 and 15 months of age. Indian Journal of Medical Research ЮО(ОСТ.): 155.

129. Smaron, M. F„ E. Saxon, L. Wood, C. McCarthy and J. A. Morello (1991). Diagnosis of measles by fluorescent antibody and culture of nasopharyngeal secretions. Journal of Virological Methods 33(1-2): 223.

130. Smit, S. В., D. Hardie and С. T. Tiemessen (2005). Measles virus genotype B2 is not inactive: evidence of continued circulation in Africa. J Med Virol 77(4): 550.

131. Smorodintsev, A. A., M. N. Nasibov and N. V. Jakovleva (1970). Experience with live rubella virus vaccine combined with live vaccines against measles and mumps. Bull World Health Organ 42(2): 283.

132. Stallcup, К. C., S. L. Wechsler and B. N. Fields (1979). Purification of measles virus and characterization of subviral components. J Virol 30(1): 166.

133. Strohle, A., C. Bernasconi and D. Germann (1996). A new mumps virus lineage found in the 1995 mumps outbreak in western Switzerland identified by nucleotide sequence analysis of the SH gene. Archives of Virology 141(3-4): 733.

134. Sugiura, A. and A. Yamada (1991). Aseptic meningitis as a complication of mumpsvaccination. Pediatric Infectious Disease Journal 10(3): 209.

135. Takahashi, M., T. Nakayama, Y. Kashiwagi, T. Takami, S. Sonoda, T. Yamanaka, H.

136. Takeuchi, К., K. Tanabayashi, M. Hishiyama and A. Yamada (1996). The mumps virus SH protein is a membrane protein and not essential for virus growth. Virology 225(1): 156.

137. Tamin, A., P. A. Rota, Z. D. Wang, J. L. Heath, L. J. Anderson and W. J. Bellini (1994).ф Antigenic analysis of current wild type and vaccine strains of measles virus. Journal of1.fectious Diseases 170(4): 795.

138. Tanabayashi, К., К. Takeuchi, К. Okazaki, М. Hishiyama and A. Yamada (1992). Expression of mumps virus glycoproteins in mammalian cells from cloned cDNAs: both Fj** and HN proteins are required for cell fusion. Virology 187(2): 801.

139. Tanabayashi, К., K. Takeuchi, K. Okazaki, M. Hishiyama and A. Yamada (1993). Identification of an amino acid that defines the fusogenicity of mumps virus. Journal of Virology 67(5): 2928.

140. Tecle, Т., В. Bottiger, С. Orvell and B. Johansson (2001). Characterization of two decades of temporal co-circulation of four mumps virus genotypes in Denmark: Identification of anew genotype. Journal of General Virology 82(11): 2675.

141. Tecle, Т., В. Johansson, A. Jejcic, M. Forsgren and C. Orvell (1998). Characterization of three co-circulating genotypes of the small hydrophobic protein gene of mumps virus. J Gen1. Ф Virol 79 (Pt 12): 2929.

142. Tecle, Т., В. Johansson, Z. Yun and C. 0?rvell (2000). Antigenic and genetic t characterization of the fusion (F) protein of mumps virus strains. Archives of Virology145(6): 1199.

143. Tesovic, G., J. Begovac and A. Bace (1993). Aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine. Lancet 341(8859): 1541.

144. Thomas, H. I. J., E. Barrett, L. M. Hesketh, A. Wynne and P. Morgan-Capner (1999). ^ Simultaneous IgM reactivity by EIA against more than one virus in measles, parvovirus В19ф and rubella infection. Journal of Clinical Virology 14(2): 107.

145. Tidona, С. A., H. W. Kurz, H. R. Gelderblom and G. Darai (1999). Isolation and molecular characterization of a novel cytopathogenic paramyxovirus from tree shrews. Virology 258(2): 425.

146. Tikhonova, N., T. Mamaeva, M. Naumova, E. Leschinskaja, M. Volkov, I. MartynenkoЬ1992). Wild measles virus strain: Isolation and Identification. Acta Virol. 36: 557.

147. Tipples, G. A., M. Gray, M. Garbutt and P. A. Rota Genotyping of measles virus in Canada: 1979-2000. J Infect Dis 189 Suppl 1: S171

148. Tuokko, H. (1995). Detection of acute measles infections by indirect and capture enzyme immunoassays for immunoglobulin M antibodies and measles immunoglobulin G antibody avidity enzyme immunoassay. Journal of Medical Virology 45(3): 306.

149. Uchida, К., M. Shinohara, S. I. Shimada, Y. Segawa and Y. Hoshino (2001). Characterization of mumps virus isolated in Saitama Prefecture, Japan, by sequence analysis of the SH gene. Microbiology and Immunology 45(12): 851.

150. Ueda, К., C. Miyazaki, Y. Hidaka, K. Okada, K. Kusuhara and R. Kadoya (1995). Asepticmeningitis caused by measles-mumps-rubella vaccine in Japan. Lancet 346(8976): 701.

151. Utz, S., J. L. Richard, S. Capaul, H. C. Matter, M. G. Hrisoho and K. Muhlemann (2004). ^ Phylogenetic Analysis of Clinical Mumps Virus Isolates from Vaccinated and Non

152. Vaccinated Patients with Mumps during An Outbreak, Switzerland 1998-2000. Journal of % Medical Virology 73(1): 91.

153. Vesikari, Т., F. E. Andre and E. Simoen (1983). Evaluation in young children of the Urabe Am 9 strain of live attenuated mumps vaccine in comparison with the Jeryl Lynn strain. Acta Paediatrica Scandinavica 72(1): 37.

154. Waxham, M. N., J. Aronowski, A. C. Server, J. S. Wolinsky, J. A. Smith and H. M. Goodman (1988). Sequence determination of the mumps virus HN gene. Virology 164(2): 318.

155. Waxham, M. N., A. C. Server, H. M. Goodman and J. S. Wolinsky (1987). Cloning and sequencing of the mumps virus fusion protein gene. Virology 159(2): 381.

156. WHO-UNICEF (2002). Joint statement on strategies to reduce measles mortality worldwide. Wkly Epidemiol Rec 77(27): 224.

157. WHO (2001a). Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update). Wkly Epidemiol Rec 76(33): 249.

158. WHO (2001b). Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update). Part I. Weekly epidemiological record. Releve epidemiologique hebdomadaire. World Health Organization 76(32): 242.

159. WHO (2001c). Progress toward interrupting indigenous measles transmission Region of the Americas, January-November 2001. Morbidity and Mortality Weekly Report 50(50): 1133.

160. WHO (2003). Update of the nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses: new genotypes and reference strains. Wkly Epidemiol Rec 78(27): 229.

161. WHO (2005a). Global measles and rubella laboratory network-update. Wkly Epidemiol Rec 80(44): 384.

162. WHO (2005b). Global Measles and Rubella Laboratory Network, January 2004-June 2005. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 54(43): 1100.

163. WHO (2005c). Measles. Fact sheet no. 286. Geneva, Switzerland, World Health Organization.

164. WHO (2005d). New genotype of measles virus and update on global distribution of measles genotypes. Wkly Epidemiol Rec 80(40): 347.

165. WHO Expert Committee on Biological Standardization Forty-fourth report. WHO Expert Technical Report Series 848.

166. WHO Mortality Reduction and Regional Elimination (2001). Strategic Plan 2001-2005; Global Measles'. 1.

167. WHO Vaccines Immunization and Biologicals. Belarus Reported Cases.

168. Wild, T. F., E. Malvoisin and R. Buckland (1991). Measles virus: both the haemagglutinin ^ and fusion glycoproteins are required for fusion. J Gen Virol 72 (Pt 2): 439.

169. Wolinsky, J. S., M. N. Waxham and A. C. Server (1985). Protective effects of glycoprotein-I specific monoclonal antibodies on the course of experimental mumps virusmeningoencephalitis. Journal of Virology 53(3): 727.

170. Wu, L., Z. Bai, Y. Li, В. K. Rima and M. A. Afzal (1998). Wild type mumps viruses circulating in China establish a new genotype. Vaccine 16(2-3): 281.

171. Xu, W. В., A. Tamin, J. S. Rota, L. Zhang, W. J. Bellini and P. A. Rota (1998). New genetic ^ group of measles virus isolated in the People's Republic of China. Virus Research 54(2):147.

172. Yates, P. J., M. A. Afzal and P. D. Minor (1996). Antigenic and genetic variation of the HN protein of mumps virus strains. Journal of General Virology 77(10): 2491.

173. Yeo, R. P., M. A. Afzal, T. Forsey and В. K. Rima (1993). Identification of a new mumps virus lineage by nucleotide sequence analysis of the SH gene of ten different strains. Archives of Virology 128(3-4): 371.1. ОТ АВТОРА

174. Работа выполнялась при финансовой поддержке ВТЕР (грант ВТЕР-16 (МНТЦ-2168)) в Лаборатории Иммунологической Безопасности ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва) и US FDA (Rockville, США).

Информация о работе

Неверов, Александр Александрович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы