Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов нарушения морфо-функционального состояния культивированных клеток-зерен мозжечка при нейроцитотоксическом действии глутамата

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов нарушения морфо-функционального состояния культивированных клеток-зерен мозжечка при нейроцитотоксическом действии глутамата"

2 1 М1Р «97

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.31 : 612.827.014.46 + 616.831.71

СТЕЛЬМАШУК Елена Викторовна

«ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ НАРУШЕНИЯ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО состояния КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК-ЗЕРЕН МОЗЖЕЧКА ПРИ НЕЙРОЦИТОТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ

ГЛУТАМАТА»

Специальность 03.00.11 — эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Л1 о с к в а — 1997

Работа выполнена в НИИ мозга РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук И. В. ВИКТОРОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. В. Г. СКРЕБИЦКИЙ кандидат биологических наук И. А. ГРИВЕННИКОВ

Ведущая организация — НИИ морфологии человека РАМН

Защита диссертации состоится « » ^Ссо.^ 1997 г

в 4 ^ часов на заседании специализированного ученого советг Д.053.05.68 при Московском государственном университете имеш М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологиче ского факультета Московского государственного университет* им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан 1997 г.

Ученым секретарь Специализированного совета

_ Е. Н. КАЛ ИСТРАТОВА

кандидат биологических наук . ^

' /

Заказ 213 Поди, к печ. 12.03.97 г. Печ. л. 1 Тираж 10'

Типография ВИА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

За последнее десятилетие накопились данные как клинического, так и экспериментального характера, указывающие на то, что появление в мозге избытка эндогенных возбуждающих аминокислот является одним из патогенетических факторов повреждения нейронов при различных острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы. В связи с этим особую актуальность приобрели исследования механизмов деструктивных процессов, происходящих в нейронах под действием токсических доз глутамата (ГЛУ) и его аналогов. Для объяснения механизмов, опосредующих нейродеструктивное действие глутамата, еще в начале 70-х годов Олни (Olney, 1978) предложил одну из первых гипотез токсичности возбуждающих аминокислот. Согласно этой гипотезе постоянная деполяризация нейронов, происходящая при продолжительном воздействии токсических доз глутамата, приводит к увеличению проницаемости цитоилазматической мембраны для различных ионов, что в свою очередь активирует энергозависимые механизмы, направленные на восстановление внутриклеточного ионного гомеостаза. Однако, энергетические ресурсы клеток быстро истощаются, и недостаточное функционирование ион-транспортных систем приводит к такому нарушению ионного баланса, при котором клетки оказываются необратимо поврежденными. Полученные в настоящее время данные во многом подтверждают гипотезу Олни. Показано, что активированные глутаматом рецепторы открывают связанные с ними ионные каналы, проницаемые для ионов Na+ и Са2+. Деполяризация мембраны, обусловленная в основном входом в нейроны ионов Na+, приводит к тому, что Са2+ начинает поступать в клетки и через потенциалзависимые Са2+-каналы. Избыточный вход Са2+ в клетки рассматривается многими исследователями как одна из основных причин повреждения нейронов в результате действия возбуждающих аминокислот in vitro (Choi, 1985), а также при гипоксии/ишемии, гипогликемии и эпилепсии. Вместе с тем, наряду с кальциевой перегрузкой при токсическом воздействии ГЛУ отмечается значительное увеличение в цитоплазме нейронов ионов натрия. В ряде работ отмечено, что удаление натрия из

инкубационного раствора может снижать токсичность ГЛУ. В последние годы экспериментально показано снижение уровня АТФ в клеточных культурах, подвергнутых цитотоксической обработке ГЛУ (Богачев с соавт., 1992), однако причины этого снижения остаются не до конца изученными, поскольку оно может происходить как в результете активации энергозависимых процессов, так и вследствие нарушения функционирования митохондрий - основного источника АТФ в клетках. Таким образом, вопрос о нарушении клеточной энергетики при токсических воздействиях ГЛУ, являющийся, фактически,ключевым в гипотезе Олни, на момент начала данного исследования оставался не ясен. Другие важные факторы повреждения нейронов - это стойкое повышение в них концентрации свободного цитозольного Са2+ ([Са2+]0 после кратковременого (в течение нескольких минут) воздействия глутамата и причины, препятствующие нормализации [Са2+^ после прекращения действия ГЛУ. Естественно поэтому было поставить вопрос о функционалных изменениях митохондрий, а также роли Ыа+/Н+, Ка+/Са2+- обменников, Са2+- АТФазы и №+/К+-АТФазы в нейродеструктивных процессах, индуцированных кратковременным воздействием глутамата.

Цель настоящего исследования состояла в изучении морфо-функционального состояния митохондрий культивируемых клеток-зерен после цитотоксического действия ГЛУ, а также роли мембранных систем переноса ионов в нейродеструктивных процессах, индуцируемых ГЛУ.

Задачи исследования исследование функционального состояния митохондрий культивированных клеток-зерен после кратковременного воздействия ГЛУ;

- исследование ультраструктуры клеток-зерен после глутаматного воздействия;

- изучение влияния уабаина, блокатора №а+/К+-АТФазы, на цитотоксичность ГЛУ;

- исследование внутриклеточного рН при действии ГЛУ;

исследование влияния блокатора \та+/Н+-обмена этилизопропиламилорида (Е1РА), в постглутаматньш период на отсроченную гибель нейронов, вызванную глутаматом;

- исследование влияния блокады Кта+/Са2+-обмена с помощью 3,4-дихлоробензамина (БСВ) и удаления внеклеточного Ма+ на нейротоксический эффект глутамата.

Научная новизна исследования определяется рядом впервые полученных данных. Было показано, что:

а) нейроцитотоксическая обработка ГЛУ культивированных клеток-зерен мозжечка ведет к падению мембранного потенциала и изменению ультраструктуры митохондрий этих нейронов;

б) ионы кобальта и МК-801 - блокатор активированных каналов, ассоциированных с ЫМОА-рецепторами, предотвращают падение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен, вызванное ГЛУ;

в) блокада транспорта кальция в митохондрии рутениевым красным предотвращает падение митохондриального потенциала клеток-зерен при действии глутамата;

г) предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка блокатором №+/К+-АТФазы - уабаином снижает токсический эффект ГЛУ;

д) блокада \та+/К+-АТФазы уабаином и Са2+-АТФазы эозином в постглутаматном периоде увеличивает токсичность глутамата;

е) блокада Ка+/Н+-обмена в течение постглутаматного периода приводит к уменьшению, а блокада Ка+/Са2+ обмена - к увеличению нейроцитотоксического эффекта глутамата.

Научно-практическое значение работы. Данные, полученные в настоящем исследовании, могут служить экспериментальным обоснованием для разработки

фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать иейродегенеративные изменения при острых и хронических патологических состояниях ЦНС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Кратковременная обработка ГЛУ культивированных клеток-зерен мозжечка ведет к падению мембранного потенциала и изменению ультраструктуры митохондрий этих нейронов.

2. Одной из главных причин деэнергизации митохондрий является вызванный ГЛУ вход в клетку ионов кальция, так как ионы кобальта - конкурентного антагониста Са2+ , и МК-801 -блокатор каналов глутаматных рецепторов, предотвращают падение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен, вызванное ГЛУ.

3. Кальций, поступивший в клетку при действии ГЛУ, транспортируется в митохондрии и вызывает их деэнергизацию, поскольку ингибирование этого транспорта с помощью рутениевого красного предотвращает снижение мембранного потенциала митохондрий и оказывает выраженный защитный эффект.

4. В нормализации внутриклеточного ионного баланса, нарушенного глутаматом, принимают активное участие АТФ-зависимые системы транспорта ионов кальция и натрия, поскольку блокада АТФаз в постглутаматном периоде ведет к увеличению нейроцитотоксичности глутамата.

5. Воздействие токсических концентраций ГЛУ вызывает стойкое снижение цитоплазматического рН культивированных клеток-зерен, что может активировать работу Ыа+/Н+ -обменника и приводить к дополнительному увеличению [Ыа+]р

6. Ыа+/Н+ обмен участвует в реализации нейроцитотоксического эффекта возбуждающих аминокислот в течение постглутаматного периода, поскольку его блокада с помощью этилизопропиламилорида после обработки клеток глутаматом снижает степень повреждения культур. Это защитное действие, возможно, объясняется интенсификацией №+-зависимого вывода Са2+ в результате относительного снижения концентрации внутриклеточного Ка+ при блокаде №+/Н+ обмена.

7. Кта+/Са2+ -обменник осуществляет выведение избыточного Са2+, накапливающегося в культивируемых клетках-зернах мозжечка, поскольку его блокирование с помощью Б СБ или путем удаления из солевого раствора в постглутаматном периоде усиливает нейроцитотоксическое действие ГЛУ.

8. Предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка блокатором Ма+/К+ - АТФазы - уабаином снижает токсический эффект ГЛУ, возможно, вследствие экспрессии нейротрофических факторов, вызванной сдвигом ионного баланса нейронов.

Апробация диссертационного материала Материалы настоящего исследования были представлены на Учредительном Конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991); на международном симпозиуме Нейронаук (Киото, 1995); на третьих научных чтениях имени академика С.А.Саркисова и симпозиуме "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга (Москва, 1995); на первом Конгрессе нейронаук (Берлин, 1996); 4-м Российско-Шведском симпозиуме "Новые исследования в лейробиологии" (Москва, 1996), на 2-й международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996), на научной конференции и Ученом Совете НИИ мозга РАМН (Москва, 1997).

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 156 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературных данных, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, состоящий из 22 отечественных и 172 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 7-о-дневных мсцсслойныу культурах. полученных с помощью ферментио-механичсской диссоциации ткани мозжечка 7-9-дневных крыс (Викторов с соавт., 1990). Клеточные культуры выращивали на покровных стеклах, покрытых поли-Ь-лизином или полиэтиленимином и помещенных в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм, в С02- инкубаторе при температуре 35,5 °С и относительной влажности 98% в среде следующего состава: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 90% минимальной среды Игла, 2мМ глутамина 2 сд/мл инсулина, 0,8% глюкозы, ЮмМ буфера НЕРЕБ рН 7,2-7,4. В качестве добавок использовали плацентарную сыворотку человека в концентрации 5% или повышенную концентрацию хлорида калия (25 мМ), оказывающую трофическое действие па культивируемые клетки-зерна мозжечка. Прижизненные наблюдения за развитием культур проводили в

инвертированном микроскопе "Биостар" (Райхерт). Все воздействия биологически активных веществ на клетки-зерна были выполнены при инкубации культур в сбалансированном солевом растворе (СРС) следующего состава: 137 mM NaCl, 5 тМ KCl, 0,35 тМ Na2HP04, 12 тМ NaHC03, 2,3 тМ СаС12, И тМ глюкозы.

После окончания экспериментов культуры фиксировали смесью абсолютного спирта формалина и ледяной уксусной кислоты в отношении 7:2:1, соответственно, и окрашивали ванадиевым гематоксилином (Викторов, 1990). На полученных гистологических препаратах проводили подсчет количества интактных и поврежденных клеток-зерен (пикнотических ядер) мозжечка в 20 нолях зрения общей площадью 2,8 мм2. Отношение числа пикнотических ядер к суммарному количеству просчитанных клеток, выраженное в процентах, являлось надежным показателем степени повреждения культур. Достоверность отличий определяли по критерию Стыодента (t-тест).

Для анализа функционального состояния митохондрий клетки после экспериментальных воздействий окрашивали родамином 123 (Р123), растворенном в СРС (5 мкг/мл, 10 минут), отмывали 2 мин. в СРС и помещали в камеру, склеенную из предметных стекол. Флюоресценцию клеток наблюдали с помощью микроскопа "МБИ-15", при облучении синим светом (длина волны 450-490 нм). Данная методика позволяет визуально определить наличие потенциала на митохондриальной мембране (Johnson et al., 1981). В экспериментах по определению мембранного потенциала митохондрий использовали кальциевые блокаторы: хлорид кобальта (2 мМ), МК-801 (30 мкМ). Был использован также блокатор транспорта кальция в митохондрии, рутениевый красный (100 мкМ), которым обрабатывали культуры в течение одного часа до воздействия ГЛУ.

Для электронномикроскопического изучения клеточные культуры фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7,2) с последующей дофиксацией 1% раствором осмиевой кислоты на фосфатном буфере. Культуры заливали в эпон-812 по стандартной методике (Боголепов, 1976; Скибо, 1988). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме "LKB-3" и помещали на бленды, покрытые формваровой пленкой.

Полученные препараты в течение 5 минут контрастировали уранилацетатом и окрашивали цитратом свинца по методу Рейнольдса в течение 10 минут. Срезы просматривали и фотографировали на электронном микроскопе "HU-11" при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Для определения внутриклеточного рН (pH¡) культивированные клетки-зерна мозжечка отмывали от среды в СРС (с добавкой 10 мМ HEPES, рН раствора 7,4) и окрашивали флуоресцеиндиацетатом (ФДА; Serva; 10 мкМ) в течение 15 минут при комнатной температуре. После окрашивания культуры промывали СРС, помещали в камеру и наблюдали в люминисцентном фотометрическом микроскопе Люмам 13 (Россия) с галогеновой лампой KGV9-70 и светофильтрами (ФС 1-4, СЗС 212). Отношение флуоресценции при 520 нм к флуоресценции при 570 нм использовалось для определения значения р 11 ¡ по калибровочной кривой, полученной при измерении флуоресценции флуоресцеина в буферах со стандартными значениями рН.

Чтобы изучить влияние торможения активного энергозависимого вывода внутриклеточного Na+ на индуцированную ГЛУ гибель клеток-зерен, 1\та+/К+-АТФазу блокировали уабаином (10 мкМ, 90-120 мин) в предглутаматном или постглутаматном периодах. Кальциевую АТФазу цитоплазматической мембраны блокировали эозином (50 мкМ; (jatto and Milctüick, 12D3) i: постглутаматном периоде. Для изучения роли Na+/H+ обмена в развитии нейроцитотоксичности ГЛУ культуры обрабатывали специфическим блокатором этого обмена - этилизопропил-амилоридом (10 мкМ). Для изучения влияния блокады Na+/Ca2+-обмена на гибель культивированных клеток-зерен мозжечка, вызванную ГЛУ, в постглутаматном периоде был применен 3,4-дихлоробензамил (30 мкМ), или безнатриевый солевой раствор, в котором NaCl был заменен холин хлоридом. Состав раствора (в мМ): холинС1 120; КС1 5,4; СаС12 2,3; глюкоза 15; Трис.С1 25; рН раствора 7,4-7,6. Культуры инкубировали в этом растворе 3 часа в СО2- инкубаторе.

Количественный анализ гистологических препаратов проводили по указанной выше стандартной методике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологическая характеристика диссоциированных культур зернистых клеток мозжечка.

После диссоциации ткани мозжечка изолированные нервные и глиальные клетки лишены отростков и приобретают округлую форму. Окраска клеток суспензии трипановым синим показала, что 80-85% клеток являются живыми. При нанесении клеточной суспензии на стекла, покрытые поли-Ь-лизином или полиэтиленимином, большинство клеток прикрепляется к субстрату в течение первого часа культивирования. Через 4-6 часов после прикрепления клеток начинается рост отростков. Обычно у клеток-зерен в течение первых суток in vitro формируется 1-2 тонких отростка, оканчивающихся конусами роста. В дальнейшем, в процессе дифференцировки этих клеток, может образовываться еще несколько отростков. На 3-4 сутки в культурах мозжечка начинается активная пролиферация глиальных клеток, образующих глиальный подслой, на котором находятся клетки-зерна. Для уменьшения содержания глиальных клеток в части экспериментов культуры на вторые сутки in vitro обрабатывали антимитотиком арабинозин моноцитозидом (10 мкМ).

Клетки-зерна легко идентифицировать прижизненно как небольшие, округлые или овальные клетки, 7-10 мкм в диаметре, с 1-4 отростками. При окраске культур клеток-зерен мозжечка ванадиевым гематоксилином хорошо видно ядро клетки, которое содержит диспергированный хроматин и занимет большую часть клеточного тела. Вокруг ядра виден тонкий ободок цитоплазмы, наибольшее количество которой находится в местах огхождения отростков.

Результаты наблюдения живых культур и исследования гистологических препаратов показали, что нейронная популяция культур, полученных из мозжечков 7-8 дневных крыс, была представлена практически только одним типом нейронов - клетками-зернами. Другие типы нейронов мозжечка в полученных диссоциированных культурах отсутствовали. Спонтанная

дегенерация нейронов в 7-8 дневных культурах составляет 10±1 %. Следует отметить, что основная часть погибших нейронов находилась в агрегатах; изолированные клетки подвергались дегенерации в меньшей степени. Количество поврежденных клеток в контрольных культурах, инкубированных в солевых растворах (до 24 часов), не отличалось от числа погибших клеток-зерен в культурах, находившихся в питательной среде.

2. Цитотоксическое действие глутамата.

После обработки ГЛУ в токсических концентрациях (25 мкМ и выше) 7-8-дневные диссоциированные культуры мозжечка отмывали и затем инкубировали в конденционированной питательной среде или в СРС. В результате этого клетки-зерна увеличивались в размерах и в их цитоплазме появлялись темные гранулы. В дальнейшем происходило нарастание отека цитоплазмы и сжатие ядер. В конечном итоге от клетки оставалось лишь сжатое пикнотическое ядро, что свидетельствовало о ее гибели. Таким образом, поврежденные глутаматом нейроны резко отличались от нормальных как при наблюдении живых культур, так и на гистологических препаратах, окрашенных ванадиевым гематоксилином, что дало возможность визуально оценивать жизнеспособность клеток-зерен и проводить количественную обработку таких культур.

3. Морфология митохондрий клеток-зерен и глии при окраске

родамином 123.

После окраски культур клеток-зерен мозжечка Р123 в течение 10 минут митохондрии нейронов и глиальных клеток интенсивно светились при облучении синим светом (длина волны 450-490 нм). В клетках-зернах, размер которых, как было указано выше, составляет всего 7-10 мкм, основную часть клетки занимает ядро, а цитоплазма образует лишь узкий ободок вокруг него. Эти клетки слабо распластаны по субстрату и часто имеют почти сферическую форму тела. В связи с этими морфологическими особенностями клеток-зерен при наблюдении культур на светооптическом уровне мофология отдельных митохондрий различима недостаточно четко и

на микрофотографиях митохондрии видны как мелкие светящиеся палочки или точки.

Глиальные клетки, распластанные по субстрату, обладают большим объемом цитоплазмы, благодаря этому их митохондрии хорошо видны при окраске Р123. Митохондрии этих клеток выглядели как длинные светящиеся тяжи, образующие скопление в околоядерной области.

4. Влияние глутамата на накопление родамина 123 клетками-зернами и глией.

После 15-минутной инкубации культур клеток-зерен мозжечка в сбалансированном солевом растворе митохондрии нейронов и глиальных клеток активно накапливали Р123. Обработка ГЛУ (100 мкМ, 15 минут) вызывала отек цитоплазмы клеток-зерен, при этом митохондрии нейронов не накапливали Р123, в то время как митохондрии глиальных клеток активно поглощали этот краситель. Описанное выше деэнергизующее влияние ГЛУ на нейроны, зависело от концентрации этого нейромедиатора. Так, если обработка 100 мкМ ГЛУ вызывала падение мембранного потенциала митохондрий почти во всех обработанных клетках-зернах, то после инкубации культур с 10 мкМ ГЛУ митохондрии клеток-зерен не теряли способности накапливать Р123.

Таким образом, при воздействии токсических доз глутамата на нейро-глиальные культуры клеток-зерен мозжечка происходит быстрая деэнергизация митохондрий клеток-зерен, причем она строго специфична для нейронов, т.к. обработка глутаматом не влияет на накопление родамина митохондриями клеток глии.

5. Влияние хлорида кобальта и МК-801 на деэнергизующий эффект глутамата.

В настоящее время показано, что кальциевая перегрузка нейронов, возникающая при нейроциготоксическом воздействии ГЛУ, является ключевым моментом запуска многих - патобиохимических процессов в клетке, приводящих к ее гибели (Choi, 1988; Siesjio, 1988). Логично было предположить, что обнаруженное нами снижение мембранного потенциала митохондрий

в клетках-зернах, обработанных ГЛУ, также связано с кальциевой перегрузкой нейронов. Это предположение было проверено и подтверждено с помощью различных блокаторов кальциевого транспорта в клетки во время действия ГЛУ. Неконкурентный, селективный антагонист К1УГОА-рецепторов, МК-801, блокирующий активированные ГЛУ К1УГОА-каналы, полностью предупреждал деэнергизацию митохондрий и цитонлазматический отек клеток-зерен. Применение блокатора всех трансмембрапных кальциевых каналов, хлорида кобальта в концентрации 2 мМ, также полностью предотвращало деэнергизующее действие высоких концентраций ГЛУ. Таким образом, проведенные эксперименты демонстрируют, что снижение мембранного потенциала митохондрий в клетках-зернах, обработанных ГЛУ, обусловлено кальциевой перегрузкой нейронов.

6. Влияние специфической блокады транспорта Са2+ в

митохондрии на деэнергизующий и нейроцитотоксический эффекты глутамата.

Известно, что при действии ГЛУ избыток ионов цитозольного кальция начинает захватываться митохондриями. Процесс электрогенного транспорта ионов кальция внутрь митохондрий можно сст?.?*гтить. используя его специфический блокатор -рутениевый красный.

Для исследования влияния митохондриалыюго транспорта кальция на мембранный потенциал митохондрий и жизнеспособность клеток-зерен, подвергнутых действию 100 мкМ ГЛУ, культуры инкубировали 1 час с рутениевым красным (100 мкМ) перед токсическим воздействием глутамата. Результаты этих экспериментов показали, что в клетках-зернах, предварительно инкубированных с рутениевым красным, а затем подвергнутых действию ГЛУ, митохондрии сохраняют способность активно накапливать Р123. При исследовании таких культур во флуоресцентном микроскопе обнаружено, что интенсивность свечения родамина 123 в митохондриях клеток-зерен, сравнима с интенсивностью его свечения в контрольных (необработанных ГЛУ) культурах.

Для оценки влияния предобработки рутениевым красным на жизнеспособность клеток при токсическом воздействии ГЛУ культуры клеток-зерен через 2 часа после окончания эксперимента фиксировали и на полученных гистологических препаратах подсчитывали соотношение живых и погибших клеток. Результаты количественного анализа показали, что предобработка культур рутениевым красным значительно снижает токсическое действие ГЛУ. Если в культурах, предварительно инкубированных с рутениевым красным, гибель клеток от ГЛУ составляла 20±2%, то в культурах, инкубированных такое же время в СРС, она достигала 65±5%.

Таким образом, данные эксперименты демонстрируют, что кальций-зависимые процессы повреждения и деэнергизации митохондрий являются одной из основных причин клеточной гибели при действии токсических доз ГЛУ.

7. Изменение ультраструктуры клеток-зерен под действием токсических доз глутамата.

Данные, полученные при исследовании изменения мембранного потенциала митохондрий при токсическом действии глутамата, навели нас на мысль о возможных ультраструктурных изменениях этих органелл. К моменту начала исследований в литературе этот вопрос не был освещен. В этой связи было проведено электронно-микроскопическое исследование культивированных клеток-зерен мозжечка при нейроцитотоксическом действии ГЛУ.

При исследовании с помощью электронной микроскопии диссоциированных культур мозжечка крыс выявляются небольшие нейроны, основную часть объема которых занимает ядро, окруженное тонким ободком цитоплазмы. Несколько больший обьем цитоплазмы может наблюдаеться с одной стороны от ядра. Ядро заполнено диффузным хроматином с мелкими глыбками конденсированного хроматина вблизи ядерной мембраны. В ядре, обычно округлой формы, можно наблюдать 1-2 электронноплотных ядрышка. Основное количество клеточных органелл находится в местах отхождения дендритов от клетки, где четко выявляются цистерны аппарата Гольджи, гладкого и гранулярного

эндоплазматического ретикулума (ЗПР), лизосомы, а в самом отростке - параллельно ориентированные микротрубочки, вдоль которых расположены митохондрии. При большем увеличении в цитоплазме и дендритах заметны многочисленные рибосомы, в большинстве собранные по 4-6 штук в "розетки" - полисомы. Гранулярный ЭПР клеток-зерен мозжечка развит относительно слабо и не образует телец Ниссля. Он представлен всего лишь несколькими мембранными трубочками, на которых лежат группы рибосом. Митохондрии клеток-зерен некрупные, округлые или палочковидные, их кристы четко выделяются и равномерны по толщине. Изредка наблюдаются и разветвленные митохондрии с хорошо заметными продольно ориентированными кристами. Митохондриальный матрикс имеет сходную или несколько большую электронную плотность, чем окружающая органеллу цитоплазма.

В культурах, обработанных ГЛУ в токсической концентрации (100 мкМ, 15 минут), наблюдаются значительные по сравнению с контролем ультраструктурные изменения, которые затрагивают как ядро, так и органеллы цитоплазмы. Во-первых, происходит просветление ядерного матрикса с образованием мелких глыбок конденсированного хроматина, часто наблюдается расширение перинуклеарного пространства. Во-вторых, электронная плотность цитоплазмы заметно снижается, видимо, вследствие отека, вызванного начальным входом в клетку йснсг; натри? через активированные глутаматные и потенциалзависимые каналы и последующим пассивным поступлением воды. В-третьих, происходит нарушение ультраструктуры митохондрий, что выражается в двух разнонаправленных процессах: конденсации и набухании, которые, возможно, представляют собой последовательные стадии деструкции этих органелл.

В развитии деструкции митохондрий можно выделить несколько форм: а) конденсированные митохондрии, которые характеризуются уменьшеной площадью сечения на ультратонком срезе, расширением внутрикристного и межмембранного пространства и уменьшением объема матрикса с увеличением его электронной плотности; б) набухшие митохондрии с пониженной электронной плотностью матрикска, но с сохранными кристами и

мембранами, ограничивающими органеллу; в) митохондрии с очаговыми набуханиями и разрушенными в этих участках кристами, однако с сохранением части крист и митохондриальных мембран в остальной части этих органелл; г) набухшие митохондрии с полностью разрушенными кристами, но еще заметной двойной мембраной. Такие ультраструктурные изменения митохондрий обычно свидетельствуют о нарушении нормального функционирования этих органелл.

В-четвертых, часто наблюдается расширение цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, на которых сохраняются рибосомы. Свободные рибосомальные розетки-полисомы, состоящие из 4-6 рибосом, не разрушаются. Цистерны гладкого ЭПР и аппарата Гольджи несколько набухшие. Центриоли и микротрубочки четко различимы и имеют нормальную структуру.

Следует отметить, что степень поврежденности нейронов различна, причем даже в патологически измененных клетках-зернах втречаются нормальные цистерны гранулярного ЭПР и даже отдельные митохондрии. При обработке культур более высокой концентрацией ГЛУ (500 мкМ, 15 минут) в клетках-зернах происходят те же ультраструктурные изменения, при этом в их цитоплазме заметны описанные ранее патологические формы митохондрий - мелкие, темные с конденсированным матриксом и расширенным межкристным пространством и отекшие с разрушенными кристами.

Таким образом, наблюдаемые нами ультраструктурные изменения митохондрий, ядра и ЭПР нейронов обработанных глутаматом, могут свидетельствовать о нарушении нормального функционального состояния этих органелл. Однако, несмотря на значительные изменения ядра, митохондрий и ЭПР, синтез белков, по-видимому, в таких клетках может продолжатся, т.к. рибосомы остаются на мембранах гранулярного ЭПР, и в цитоплазме не происходит разрушения полисом.

Приведенные выше данные и данные литературы (Schinder et al., 1996) позволяют представить участие митохондрий в нейродеструктивных процессах, вызванных ГЛУ, в виде схемы (рис. 1).

функция митохондрий

цепь транспорта электронов

перенос Н+ Са++ захват

Л

гомеостаз [Са++]1

клеточное выживание

глутаматный рецептор

Ц[Са++]£

МИТ

л / I

л. . ' Ц __ нарушение функции .

митохондрий

I И

перегрузка продукция [Са++]х .О-

л

клеточная гибель

Рис. 1. Схема участия мембранного потенциала митохондрий (Д*Р) во внутриклеточных процессах ь норме и при развитии глутаматной токсичности. Слева показано нормальное функционирование митохондрий, при котором одновременно с переносом электронов происходит выброс протонов (Н+) из матрикса митохондрий в межмембратгное пространство и создается электрический мембранный потенциал, который обспечивает захват Са2+ этой органеллой и тем самым регулирует концентрацию кальция в цитоплазме ([Са2+];), необходимую для поддержания жизнеспособности клеток. Гиперстимуляция глутаматных рецепторов (правая часть схемы) индуцирует вход Са2+ в клетку и его захват митохондриями. Кальциевая прегрузка митохондрии ведет к открытию Са2+-зависимой поры, падению мембранного потенциала, нарушению функционирования митохондрий, прекращению синтеза АТФ, усилению продукции свободных радикалов, перегрузке нейрона кальцием и, в конечном итоге, к гибели клетки.

8. Влияние блокады знергозависимого вывода ионов кальция из клеток на токсичность глутамата. Для исследования важности энергозависимого транспорта кальция для развития токсичности ГЛУ Са2+-АТФаза была заблокирована в постглутаматном периоде с помощью эозина (50 мкМ) (Gatto and Milanick, 1993). Количественный анализ гистологических препаратов показал, что при снижении вывода внутриклеточного кальция в результате торможения работы знергозависимого транспорта этого иона токсическое действие ГЛУ значительно возрастает: на препаратах культур, обработанных ГЛУ, процент погибших клеток в среднем был 43±3%, инкубация с эозином в постглутаматном периоде увеличивала этот показатель до 84+3%. Сам эозин заметного токсического действия на клетки-зерна в отсутствии глутаматного воздействия не оказывал. В этих культурах процент погибших клеток составлял 7+2% от общего количества клеток-зерен.

Таким образом, энергозависимый транспорт кальция из клеток является важным фактором для нормализации кальциевого баланса после его нарушения, вызванного активацией глутаматных рецепторов.

9. Влияние предобработки уабаином на жизнеспособность клеток-зерен после токсического воздействия глутамата.

В работе Метсона с соавт. (Matson ct al., 1993) было показано, что предобрабока культивированных клеток гиппокампа нейротрофическим фактором (BDNF) предотвращает падение митохондриального мембранного потенциала после глюкозной депривации. Также известно, что деполяризация нейронов способствует экспрессии в них мРНК этого фактора (Favaron et. al, 1993). Исходя из этих данных, мы предположили, что уабаин -блокатор №+/К+-АТФазы, способен как деполяризующий агент влиять на мембранный потенциал митохондрий и выживаемость клеток зерен, обработанных ГЛУ в токсической концентрации.

В экспериментах клеточные культуры предварительно инкубировали 90-120 минут в солевом растворе с добавкой уабаина в концентрации 10 и 100 мкМ. Было показано, что после обработки

ГЛУ (100 мкМ, 15 минут) во многих клетках-зернах митохондрии продолжали накапливать родамин, хотя интенсивность их свечения была ниже, чем в контрольных культурах, не обработанных ГЛУ, но инкубированных с уабаином. В связи с трудностью подсчета деэнергизованных нейронов был применен количественный анализ выживаемости клеток-зерен. На фиксированных через 2 часа после действия ГЛУ гистологических препаратах подсчитывали количество живых и погибших клеток. Результаты анализа показали, что при блокаде Ма+/К+ - АТФазы в течение 60-90 минут перед обработкой ГЛУ (100 мкМ, 15 минут) число погибших клеток-зерен статистически достоверно снижается. В культурах, подвергнутых действию ГЛУ, без преинкубации с У А число дегенерированных нейронов составляло в среднем 54±3%, а в культурах, предварительно инкубированных с У А (10 мкМ) этот показатель снижался до 31 ±2%.

10. Действие уабаина на цитотоксичность глутамата в постглутаматном периоде.

Чтобы проверить насколько важно для выживания клеток, обработанных ГЛУ, активность функционирования \га+/К+ -АТФазы, были проведены эксперименты по блокаде этого ионного насоса уабаиним б псетглут?.м?.тнпм периоде. Результаты экспериментов показали, что в культурах, предварительно обработанных ГЛУ и в дальнейшем инкубированных с УА, происходило статистически достоверное увеличение числа погибших нейронов. В таких культурах погибших клеток было па 17% больше, чем в культурах, обработанных только ГЛУ и инкубированных затем в СРС. Это усиление токсического влияния ГЛУ, является, по-видимому, результатом нарушения ионного баланса уабаином, блокирующим выведение избытка внутриклеточного Ма+, который поступает в клетку при действии глутамата. Контрольные эксперименты показали, что уабаин в той же концентрации не является токсичным для нейронов, поскольку обработка культур УА з течение 3 часов не приводила к заметному увеличению количества югибших нейронов по сравнению с контрольными культурами, шкубированными такое же время в СРС. В среднем, количество

пикнотических ядер как в таких, так и в контрольных культурах составляло 3-9%.

Таким образом, можно заключить, что энергозависимый транспорт натрия из клеток является важным фактором для нормализации кальциевого баланса после его нарушения, вызванного активацией глутаматных рецепторов.

11. Изменение внутриклеточного рН при действии глутамата.

Измерение рН в клетках-зернах было выполнено с помощью люминесцентного зонда флуоресцеиндиацетата (ФДА). Во всех экспериментах обработка культивированных клеток-зерен мозжечка 100 мкМ ГЛУ в течение 15 минут в растворе, лишенном ионов вызывала понижение внутриклеточного рН (рШ). Уже в первые 5 минут действия ГЛУ рН1 понижался на 0,1±0,045 ед. рН, к 10 минутам инкубации с ГЛУ рШ снижался на 0,3+0,035 ед. рН и к 15 минутам инкубации закисление цитозоля стабилизировалось. Значение внутриклеточного рН было ниже начального уровня на 0,27+0,03 ед. Вызванное ГЛУ закисление было стойким и сохранялось после отмывки нейромедиатора в СРС с добавлением !У^2+ на 0,37+0,04 ед. ниже рН в клетках-зернах контрольных культур, необработанных ГЛУ.

Таким образом, в этих экспериментах было показано, что применение токсических доз глутамата (100 мкМ) вызывает стойкое повышение концентрации протонов в цитозоле как во время действия глутамата, так и в постглутаматном периоде.

12. Эффект этилизопропиламилорида (Е1РА) и 2-амино-5-фосфоновалерата (АРУ) в постглутаматном париоде.

Действие Е1РА -блокатора Ка+/Н^ обмена и АРУ - блокатора КМПА-каналов, в постглутаматном периоде исследовали на параллельных сериях культур. Причины для такой постановки эксперимента были следующими: предполагалось, что из терминалей клеток-зерен при их обработке глутаматом может выделяться эндогенный глутамат, действие которого вызывало бы дальнейшее повреждение клеток в постглутаматном периоде. В этом случае умеренный защитный эффект Е1РА, наблюдаемый нами в

постглутаматиом периоде, вероятно, был бы обусловлен блокадой NMDA-рецепторов или управляемых ими каналов (Andreeva et. al., 1992). Для выяснения этого вопроса были поставлены эксперименты по сравнению влияния EIPA и APV в постглутаматиом периоде на токсический эффект глутамата. Эксперименты показали, что обработка культур APV в постглутаматиом периоде не уменьшает количества погибших клеток (среднее значение 55+4%) по сравнению с культурами, инкубированными после воздействия глутамата только в СРС (среднее значение числа поврежденных клеток 51+4%). В то же время EIPA оказывал статистически достоверный защитный эффект в параллельных культурах, снижая количество пикнотических ядер до 33+5%.

Таким образом, в этих экспериментах было показано, что защитный эффект EIPA, при применении его в постглутаматиом периоде, имеет иной механизм, чем прямая блокада NMDA-каналов, и обусловлен, по-видимому, блокадой Na+/H+ обмена, что ведет к относительному снижению концентрации ионов натрия в клетке.

13. Влияние блокады Na+/Ca2+ обмена на вызванную глутаматом

гибель нейронов.

Для исследования роли Na+/Ca2+-o6Meiia в нейродеструктивном процессе, вызванном iviyiaMdiOM, яспсльзонр.ли бтотсатор Na+/Ca2+-обменника 3,4-дихлорбензамил в концентрации 30 мкМ (Kim and Smith, 1986), который добавляли в кондиционированную питательную среду или в солевой раствор, в которые переносили культуры сразу после обработки глутаматом (25 мкМ, 15 минут). В этом случае наблюдалось резкое увеличение числа поврежденных нейронов: количество пикнотических ядер возрастало с 19±1% в культурах, инкубированных после обработки глутаматом в обычном СРС, до 71±7% под воздействием DCB.

Na+/Ca2+ обмен блокировали также с помощью удаления Na+ из постглутаматного инкубационого раствора. В этих экспериментах клетки-зерна после обработки глутаматом (25 мкМ, 15 минут) переносили в солевой раствор, где NaCl был заменен на холин хлорид. Подсчет клеток-зерен на гистологических препаратах показал, что число пикнотических ядер в культурах,

инкубированных в СРС, составляло 19+1%, а в культурах, обработанных раствором без ионов Кта+ в течение постглутаматного периода, это число повышалось до 75±5%. Следует отметить, что блокада №+/Са2+ обмена в культивируемых клетках-зернах мозжечка в течение 3-4-х часов в отсутствии глутамата не вызывала гибели клеток.

Таким образом, эти эксперименты показали, что ингибирование Ыа+/Са2+-обмена клеток-зерен мозжечка в постглутаматом периоде резко усиливает нейродеструктивные процессы, индуцируемые глутаматом в диссоциированных культурах мозжечка.

ВЫВОДЫ

Исследование морфо-функциональных изменений,

возникающих в клетках-зернах культуры мозжечка крыс при действии глутамата, позволяет сделать следующие выводы:

1. Нейроцитотоксическое воздействие глутамата (25-100 мкМ, 15 минут) на культивированные клетки-зерна вызывает снижение мембранного потенциала митохондрий этих нейронов, о чем свидетельствует отсутствие накопления Р123 в митохондриях. Этот эффект носит дозозависимый характер.

2. Ионы кобальта, блокатор активированных NN115А каналов -МК-801, и специфический блокатор транспорта кальция в митохондрии - рутениевый красный, предотвращают деэнергизующее действие глутамата. Следовательно, этот эффект обусловлен ионами Са2+.

3. Предобработка клеток-зерен рутениевым красным значительно снижает гибель клеток-зерен при токсической обработке культур глутаматом, что указывает на участие электрогенного транспорта кальция в митохондрии в процессах деэнергизации митохондрий и деструкции нейронов, вызванных ГЛУ.

4. Нейроцитотоксическое воздействие глутамата (100 мкМ, 15 минут) на культивированные клетки-зерна ведет к изменению ультраструктуры этих нейронов - конденсации, набуханию митохондрий, разрушению митохондриальных крист, клампированию хроматина в ядре, расширению перинуклеарного

пространства, набуханию эндоплазматического ретикулума, однако, не нарушает структуры полисом и микротрубочек.

5. Полученные данные показывают, что значительным фактором в развитии клеточной гибели, вызванной ГЛУ, является Са2+ -зависимое нарушение функционирования и деструкция митохондрий.

6. Блокада энергозависимого вывода из клетки ионов натрия уабаином - специфическим блокатором \та+/К+ - АТФазы, перед обработкой глутаматом снижает его токсическое действие.

7. Торможение энергозависимого вывода ионов кальция эозином и натрия уабаином после обработки культивированных клеток-зерен мозжечка глутаматом значительно увеличивает количество погибших нейронов, что свидетельствует о необходимости активной работы этих систем в постглутаматный период для выживания клеток-зерен.

8. Глутамат (100 мкМ, 15 минут) вызывает понижение цитоплазматического рН на 0,3 ед. рН. Удаление глутамата из инкубационного раствора не ведет к восстановлению нормального цитоплазматического рН, что может вести к активации Ыа+/Н+ обмена.

9. Этилизопропиламилорид (Е1РА; 10 мкМ) в постглутаматном периоде оказывает умеренный защитный эффект, что связывается с его действием как блокэтора Ма+/Н+ обмена, поскольку блокатор ЫМБА рецепторов АРУ в постглутаматном периоде аналшичкего действия не имеет.

10. Ингибирование №+/Са2+ -обмена после глутаматного воздействия с помощью 3,4-дихлорбепзамила усиливает гибель нейронов, что свидетельствует о Ма4" -зависимом выведении Са2+ и важности этого процесса для защиты нейронов в процессе отсроченной гибели. Этот вывод подтверждается тем, что удаление Г\:а+ из постглутаматного инкубационного раствора ведет в результате к аналогичному усилению нейротоксичности ГЛУ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Andreeva N., Khodorov В., Stelmashook Е.. Cragoe E.,Jr, Victorov I. Inhibition of Na+/Ca2+ exchenge enhances .delayed neuronal death elicited by glutamate in cerebellar granule cell cultures. //Brain Res.- 1991.- v.548.- P. 322-325.

2. Andreeva N., Khodorov В., Stelmashook E.. Cragoe E.Jr, Victorov I. The role of Na+/Ca2+ - exchenge systems in glutamate-induced neuronal death in cerebellar granule cell cultures.// Constituent Congress International Society for Pathophysiology: Poster.- Moscow, 1991.- P. 24

3. Андреева H.A., Ходоров Б.И., Стельмашук Е.В.. Соколова С.Н., Викторов И.В., Крагое Э., Крыжановский Г.Н. Мембранные механизмы защитного действия этилизопропиламилорида и умеренного ацидоза на культивируемые клетки-зерна мозжечка при токсическом воздействии глутамата.// Биол. мембраны,- 1992.- т. 9, N3,- С. 319-329.

4. Andreeva N., Khodorov В., Stelmashook E.. Cragoe E., Jr, Viktorov I. 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride and mild acidosis protect cultured cerebellar granule cells against glutamate-induced delayed neuronal death.// Neurosci.- 1992,- v.49, N1.- p.175-181.

5. Стельмашук E.B., Исаев H.К., Андреева H.А., Викторов И.В. Влияние уабаина на глутаматиндуцированную гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.//Материалы третьих научных чтений имени академика С.А. Саркисова и симпозиума "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга": Тезисы докл.: М., 1995.-С.111.

6. Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Стельмашук Е.В.. Зоров Д.В., Викторов И. В. Токсическое воздействие глутамата вызывает повреждение митохондрий в клетках-зернах диссоциированных культур мозжечка крыс.// Бюлл. эксперим. биол. мед.- 1995.- т. 119, N4,- С. 378-380.

7. Isaev N., Usbekov R., Stelmashook E.. Zorov D., Victorov I. Glutamate induces ultrastructural injury of mitochondria and the collapse of the mitochondrial potential in cultured cerebellar granule

cells.// Fourth IBRO World Congress of Neoroscience: Poster.-Kyoto, Japan, 1995.- P.261. ,

8.1saev N.. Stelmashook E.. Turovetsky В., Zorov D., Victorov I. Glutamate induces collapse of the mitochondrial membrane potential and acidification of the cytosol in cultured cerebellar granule cells.// 1 Kongress der Neurowissenschaften Geselschaft: Poster.- Berlin. Germany, 1996.- P.227.

9. Stelmashook E., Isaev N., Zorov D., Uzbekov R., Polyakova I., Victorov I. Ultrastructural and energy changes in the cultivated cerebellar granule cells following glutamate treatment.// The 4th Russian-Swedish symposium on "New research in neurobiology": Poster.- Moscow, Russia, 1996.- P. 107.

10. Isaev N.K., Stelmashuk E.V., Dupin A.M., Andreeva N.A., Victorov I.V. Pharmacological preconditioning with oubain reduces the degree of damage to cultured cerebellar granule cells induced by glutamate.// Hypoxia medical journal.- 1996.- v. 2- P. 36.

11. Isaev N.K., Zorov D.B., Stelmashook E.V.. Uzbekov R.E., Kozhemyakin M.B., Victorov I.V. Neurotoxic glutamat treatment of cultured cerebellar granule cells induces Ca2+-dependent collapse of mitochondrial membrane potential and ultrastructural alterations of mitochondria.// FEBS Letters.- 1996.- v. 392,- P. 143-147.

12. Стельмашук E.B., Исаев H.K., Андреева Н.А., Викторов И.В. Уабаин модулирует токсическое действии глутамата и диссоциированных культурах клеток-зерен мозжечка крыс./ / Бюлл. эксперим. биол. мед.- 1996.- т.122, N8.- С. 163-166.

- /