Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот

Исаев, Николай Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот"

л-ъмзз

На правах рукописи

ИСАЕВ Николай Константинович

МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ И СПОСОБЫ ЗАЩИТЫ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ДЕЙСТВИИ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ.

Специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биологи».

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва -2003

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Официальные оппоненты;

Доктор биологических наук, профессор Ю.С. Ченцов; Доктор биологических наук Е. И. Солнцева; Доктор биологических наук П.В. АВДОНИН.

Ведущая организация - Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Защита диссертации состоится 17-го апреля 2003 г. в /-3 часовна заседании диссертационного совета Д501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М-1.

Сд ч <но 03Hc.ni..,.. »ке биологического

<5 , - ИГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан _<«• ¿щ ¿¿">4 2003 года

Ученый' (ретарь Диссертационного совета к.б.н.

ЛИСТРАТОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В настоящее время многочисленными исследованиями показано, что при гипоксии и ишемии мозга ведущим патогенетическим фактором повреждения нейронов является гиперстимуляция глутаматных рецепторов возбуждающими аминокислотами. 8 связи с этим особую актуальность приобрели исследования механизмов деструктивных процессов, протекающих в нейронах под действием токсических доз глутамата (Глу) и его аналогов. Показано, что активированные Глу рецепторы открывают связанные с ними ионные каналы, через которые в нейрон начинают поступать ноны Na* и Саг* и выходить е межклеточное пространство ионы 1С. Деполяризация мембраны, обусловленная в основном входом в нейроны ионов Na\ приводит к тому, что Са2+ начинает поступать в клетки и через потен циалэави си мые Саг*-каналы, Избыточный вход Саг" в клетки рассматривается многими исследователями как одна из основных причин повреждения нейронов в результате действия возбуждающих аминокислот in vitro {Choi, 1985), а также при гипоксии/ишемии, гипогликемии и эпилепсии. Вместе с тем, при токсическом действии Глу всегда отмечается отек нейрона, причиной чего в первую очередь является значительное увеличение концентрации ионов натрия в цитоплазме и далее вход ионов хлора и пассивная диффузия воды. В ряде работ отмечено, что удаление натрия из инкубационного раствора может снижать токсичность Глу.

Таким образом, при токсическом действии Глу наблюдается стойкое повышение концентрации свободного цитозольного Саг* ([Са2"],> и Na* ([Na*],) в нейронах. Причины, препятствующие нормализации концентрации ионов после прекращения действия Глу, до конца неясны. Логичным представляется поставить вопрос о нарушении клеточной энергетики и, в частности о функциональных изменениях митохондрий, а также роли энергозависимых систем транспорта ионов в нейродеструктивных процессах, индуцированных кратковременным воздействием глутамата. Поскольку при гипоксии и ишемии мозга ведущим патогенетическим

f l.,.: >ГКл,»ьнан ^ Е i (ЧАУЧНЛЯ БМБЛИОТША

{ Моск. сгуж^лсжое акадшми

фактором повреждения нейронов является ги перст и му ля ция глутаматных рецепторов возбуждающими аминокислотами, нарушение клеточных систем генерации энергии в процессе гибели нейронов может происходить и при этих видах патологии. Однако, короткую, нелетальную для нейронов ишемию, можно использовать как индуктор нейро протекции для последующей, более жесткой летальной ишемии, что может быть использовано при клинических мозговых операционных воздействиях. Это явление было обнаружено в 1Э90 году (ККадаша е! а!., 1990) В экспериментах, проведенных на животных, было показано, что нейроны головного мозга песчанок становятся более устойчивыми к летальному ишемическому воздействию, если животное ранее было подвергнуто короткой сублетальной глобальной ишемии мозга. Однако на момент исследования это явление не было смоделировано на нейрокальных культурах с низким содержанием клеток глии, что необходимо для изучения механизмов этого процесса. Наиболее вероятно, что митохондрии, как ключевые органеллы генерации энергии клетки, имеют ведущее значение в процессе индукции ишемической толерантности. Следует отметить, что наряду с защитой нейронов от гипоксического/ишемического повреждения путем повышения устойчивости нейронов к этим патологическим воздействиям является актуальным поиск веществ, способных защищать нейроны от повреждений, связанных с гиперстимуляцией глутаматных рецепторов.

Целью настоящей работы является исследование механизмов нейрональной гибели при действии глутамата, разработка стратегии защиты нейронов головного мозга при токсическом действии возбуждающих аминокислот и кислородно-глюкозной депривации.

Задачи исследования

1) изучение морфо-функционального состояния митохондрий нейронов в связи с нарушением внутриклеточного ионного баланса при цитотоксическом действии Глу;

2) исследование роли мембранных, энергозависимых транспортных систем ионов в нейродеструктивных процессах, индуцируемых Глу;

3} изучение возможности индукции ишемической толерантности у культивированных нейронов путем временного понижения аэробной клеточной энергетики ишемическим и фармакологическим яре кондиционированием;

4) поиск новых эффективных нейропротекторов.

Научная новизна исследования определяется рядом впервые полученных данных. Было показано, что:

1) нейроцитотоксическая обработка Глу культивированных клеток-зерен мозжечка ведет к хальцийза висим ому падению мембранного потенциала и изменению упьтраструктуры митохондрий этих нейронов;

2) предотвращение входа ионов натрия в цитоплазму нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов резко повышает степень набухания нейрона льны х митохондрий;

3) причиной набухания нейронов и повышения в них уровня цитоплазм этического кальция при ингибировании NaVK'-АТФазы, является не понижение вывода ионов натрия из нейронов этой транспортной системой, а нарушение натрий зависимого захвата Глу клетками. Накопленный Глу ведет к гиперактивации N MOA-рецепторов, открытию NMDA-каналов, входу через них Na' и Саг\ и, в дальнейшем, к перегрузке нейрона этими ионами и набуханию;

4) предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка блокатором На*/К*-АТФазы - уабаином в нетоксических концентрациях, снижает последующий токсический эффект Глу или окислительного стресса;

5) показана возможность индукции ишемической толерантности культивированных нейронов кратковременной ишемией, фармакологической блокадой цели транспорта электронов митохондрий нейронов и кислородной гипероксигенацией;

6) показано, что предобработка культивированных нейронов производными им и да зола клотримазолом уши бифоназолом, значительно снижает гибель нейронов при ишемии и глута маткой токсичности посредством нормализации уровня внутриклеточного кальция и сохранения нормальной функции митохондрий;

7) показана роль эритропоэтина как возможного медиатора ишемической толерантности при гипоксическом прекондициснировании клеток мозга.

Научно-практическое значение работы.

Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о механизмах ишемического повреждения мозга, так и механизмах индуцированной ишем и ческой толерантности ЦНС. Полученный материал может служить экспериментальным обоснованием для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать нейродегенеративные изменения при острых и хронических патологических состояниях ЦНС.

Апробация диссертационного материала

Материалы настоящего исследования были представлены на международном симпозиуме нейронаук (Киото, 1995): третьих научных чтениях имени академика С.А. Саркисова и симпозиуме "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга (Москва, 1995); первом Конгрессе нейронаук (Берлин, 1996); 4-м Российско-Шведском симпозиуме "Новые исследования в нейробиологии" (Москва, 1996); 2-й международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996); на научной конференции "Организованный мозг" (Москва. 1993); Зв-м биофизическом конгрессе (Нью-Орлеан, Луизиана, 1994); конгрессе нейронаук (Сан-Диего, Калифорния, 1995); 9-ой Всероссийской научной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (Москва, 1996); Первом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); XVII)

интернациональном симпозиуме мозгового кровообращения и метаболизма (Балтимор, 1997): в материалах 3-й международной конференции "Колосовские чтения" {Санкт-Петербург, 1997); Всероссийской конференции "Гипоксия; механизмы, адаптация, коррекция" {Москва, 1997; 2002); биофизическом конгрессе (Балтимор, 1999); конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга" {Москва, 1999): II Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), совместном заседании кафедры биохимии биологического факультета и отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А,Н, Белозерского МГУ,

Структура диссертации. Диссертация изложена на 323 страницах и состоит из 5-ти глав (гл. 1 - введение; гл. 2 - обзор литературы; гл. 3 - материалы и методы исследования; гл, 4 - результаты исследования; гл. 5 - обсуждение результатов), выводов и списка цитированной литературы, состоящего из 31 отечественного и 396 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 87 микрофотографиями, 38 диаграммами, 7 схемами, и 3 графиками, которые объединены в 61 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на монослойных культурах нейронов, полученных из мозжечка 7-9-дневных крыс, коры и гиплокампа 17-18-дневных эмбрионов крыс. Диссоциацию ткани производили с помощью ферме нтно-механической диссоциации (Викторов с соавт.,1990). Клеточные культуры выращивали в 6-ти, 24-х, 96-ти луночных пластиковых камерах или на покровных стеклах, помещенных в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Поверхность для культивирования покрывали поли-|_-лизином или полиэтиленимином. Культивирование производили в СОг- инкубаторе при температуре 35,5 °С и относительной влажности 98%. Среда для культивирования клеток-зерен и астроцитов была следующего состава: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 90% минимальной среды Иглэ, 2мМ глутамина 2 од./мл. иксу лика, 0,8% глюкозы.

10 мМ НЕРЕЗ рН, 7,2-7,4. В среде культивирования клеток-зерен мозжечка уровень (С повышали до 25 мМ, что имеет трофическое действие для данного айда культур. Для культивирования коры и гиппокампа использовали бессывороточную нейробазальную среду с добавкой В27. Прижизненные наблюдения за развитием культур проведали в инвертированном микроскопе "Биостар" (Райхерт). Все воздействия биологически активных веществ на клетки были выполнены при инкубации культур в сбалансированных солевых растворах (СРС) следующего состава: 137 мМ МаС1, 5 мМ КС1, 0.35 мМ №гНР04, 12 мМ МаНСОз , 2,3 мМ Са&г, 11 мМ глюкозы или в модифицированном растворе Лома (а мМ: N3« 154, КС1 25, СаСЬ 2.3, ЫаНСО, 3.6, ^НРО, 0.35, НЕРЕЭ 5, рН 7.6). В ряде экспериментов Г\1аС1 заменяли изоосматичной концентрацией сахарозы, а уровень хлорида калия доводили до 25 мМ. В экспериментах с культурами коры и топ пока мла в те же солевые растворы добавляли 1 мМ хлорида магния.

После окончания экспериментов культуры фиксировали 5 мин смесью абсолютного спирта, формалина и ледяной уксусной кислоты {ФУС) в отношении 7:2:1. соответственно, и окрашивали ванадиевым гематоксилином (Викторов. 1990) или трипа новым синим. На полученных гистологических препаратах проводили подсчет количества интактных и поврежденных клеток-зерен (темнеокрашенных пикнотических ядер) мозжечка в 9 полях зрения, при объективе х40. Отношение числа пикнотических ядер к суммарному количеству просчитанных клеток, выраженное в процентах, являлось надежным показателем степени повреждения культур. Количественно гибель клеток оценивали также, используя общепринятые тесты, по содержанию лактатдегцдрогеназы в среде культивирования или по интенсивности превращения 3-[4,5-диметмлтиазол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолиум бромида (МТТ) в формазан. Достоверность отличий определяли по критерию Стьюдента {(-тест), Випкоксона-Манна-Уитни (и-тест) или АНОВА.

Для анализа функционального состояния митохондрий после экспериментальных воздействий (Глу, и др.) клетки окрашивали родамином 123 (Р123), растворенном в СРС (5 мкг/мл, 10 минут). Данная методика позволяет визуально определить наличие потенциала на митохокдриальной мембране

(Johnson et al., 1981). Флуоресценцию окрашенных клеток наблюдали с помощью микроскопа "Унивар" (Райхерт), В экспериментах по количественной оценке мембранного потенциала митохондрий использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Bio-Rad MRC 600 CLSM) и 0.125x10"® М TMRE (люминесцентный зонд мембранного потенциала митохондрий, этиловый эфир тетраметилродамина). Различные б локаторы кальциевых каналов и NMDA-рецепторов: хлорид кобальта (2 мМ), МК-801 (30 мкМ), 2-амино-7-фосфоногептаноат (АРН), 2-амино-5-фосфоновалерат (APV). б-циано-7-нитрокуиноксалин-2,3-(1Н.4Н)-дион (CNQX), добавляли в СРС во время действия Глу.

Для электронномикроскопического изучения клеточные культуры фиксировали 2,5% раствором гпутарового альдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7,2), с последующей дофиксацией 1% раствором четырехокисм осмия в фосфатном буфере. Культуры заливали а зпон-812 по стандартной методике (Воголепов, 1976; Скибо, 1988). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме "LKB-3" и помещали на бленды, покрытые формваровой пленкой. Полученные препараты контрастировали в течение 5 минут уранилацетатом и окрашивали цитратом свинца по методу Рейкольдса в течение 10 минут. Срезы просматривали и фотографировали на электронном микросколе "Н11-1Г при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Для определения внутриклеточного pH (pH,) культивированные клетки-зерна мозжечка окрашивали флуоресцеандиацетатом (ФДА; Serva; 10 мкМ) и наблюдали в люминесцентном фотометрическом микроскопе Люмам 13 (Россия) с галогеновой лампой KGV9-70 и светофильтрами (ФС 1-4, СЗС 21*2). Отношение флуоресценции 520/570 использовалось для определения значения рН> по калибровочной кривой, полученной при измерении флуоресценции флуоресцеина в буферах со стандартными значениями pH. Для определения изменения концентрации внутриклеточного кальция производили нагрузку нейронов люминесцентными эфирами кальциевых зондов Fluo-3-AM или Fura-2-AM и осуществляли мониторинг с помощью конфокального микроскопа или електрофлуориметра "Spex" (USA). Гилоксическое воздействие проводили в герметической пластиковой камере при температуре 36±0,5 °С, при рО? 2-4 мм Hg

(5% COi. 95% Na, или атмосфере 100% аргона). Уровень АТФ в культурах определяли, используя лгоциферин-люциферазный метод (Lust, et al, 1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Механизмы токсического действия глутамата

Обработанные токсическими концентрациями глутамата (100 мкМ, 15 минут) клетки-зерна мозжечка, нейроны коры и гиппокампа увеличивались в размерах и в их цитоплазме появлялись темные гранулы. В дальнейшем происходило нарастание отека цитоплазмы и сжатие ядер, В конечном итоге от клетки оставалось лишь сжатое пикнотическое ядро, что свидетельствовало о гибели нейрона. Таким образом, поврежденные глутаматом нейроны резко отличались от нормальных, как при наблюдении живых культур, так и на гистологических препаратах, окрашенных ванадиевым гематоксилином или трилановым синим, что дало возможность визуально идентифицировать погибшие нейроны.

Исследование морфо-функциоиального состояния митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка и глии при действии глутамата.

Во время инкубации культур клеток-зерен мозжечка в сбалансированном солевом растворе митохондрии нейронов и глиальных клеток активно накапливали Р123 и интенсивно флуоресцировали, при облучении синим светом (450-490 нм). Глиальные клетки, обладают большим объемом цитоплазмы и распластаны по субстрату, благодаря этому их митохондрии очень хорошо видны при окраске Р123. Митохондрии этих клеток выглядели как длинные светящиеся тяжи, образующие скопление в околоядерной обпасти. В клетках-зернах, размер которых составляет всего 7-10 мкм, основную часть клетки занимает ядро, а цитоплазма образует лишь узкий ободок вокруг него. Эти клетки слабо распластаны по субстрату и часто имеют почти сферическую форму тела. В связи с этими морфологическими особенностями клеток-зерен, при наблюдении культур на светооптическом уровне, морфология отдельных митохондрий различима недостаточно четко и на микрофотографиях митохондрии видны как мелкие светящиеся палочки или точки.

Обработка Глу (100 мкМ, 15 минут) вызывала отек цитоплазмы клеток-зерен, при этом митохондрии нейронов не накапливали Р123, в то время как митохондрии глиальных клеток активно поглощали этот краситель. Описанное выше деэнергизующее влияние Глу на нейроны, зависело от концентрации этого нейромедиатора. Так, если обработка 100 мкМ Глу вызывала падение мембранного потенциала митохондрий почти во всех обработанных клетках-зернах, то после инкубации культур с 10 мкМ Глу митохондрии клеток-зерен не теряли способности накапливать Р123.

Падение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен сопровождалось снижением уровня АТФ, После обработки Глу (15 мин., 100 мкМ) в культурах происходит снижение содержания АТФ до 64+3% от исходных величин (п=25, р<0.001), а после отмывания клеток контрольным раствором а течение 30 минут до 43+3.5% (п=12, р<0.001).

Применение неспецифического блокатора трансмембр энных кальциевых каналов, хлорида кобальта в концентрации 2 мМ, полностью предотвращало деэнергизующее действие высоких концентраций Глу. Неконкурентный, селективный антагонист НМОА-ре це пторо В, МК-801, блокирующий активированные Глу ШОА-кзналы или рутениевый красный -ингибитор электрогенного транспорта ионов кальция в митохондрии, также полностью предупреждали деэнергизацию митохондрий и цитоплазмагический отек клеток-зерен. Измерение относительного изменения уровня внутриклеточного кальция и мембранного потенциала митохондрий с помощью люминисцентных зондов Р1ио-3 и ТМЙЕ показало, что повышение уровня внутриклеточного кальция четко коррелируют со снижением мембранного потенциала митохондрий. Таким образом, при воздействии токсических доз глутамата на нейроглиальные культуры клеток-зерен мозжечка происходит быстрая деэнергизация митохондрий клеток-зерен, причем она строго специфична для нейронов, т.к. обработка глутаматом не влияет на накопление родамина митохондриями клеток глии. Снижение потенциала митохондрий клеток-зерен четко коррелировало с гибелью клеток, происходящей через 2-3 часа после индуцированной Глу деэнергизации нейрональных митохондрий, и составляла 70%, 8 то же время 5x10 7 М циклоспорина А — блокатора неспецифической проницаемости в митохондриях, снижало клеточную гибель.

индуцированную глутаматом, с 53+4 до 28+5% (Р<0.01, АНОВА тест, с постестом Бонферрони), что может указывать на индукцию транзитной поры во внутренней мембране митохондрий нейронов при токсическом действии Глу.

Участие кальция в деэнергизэции митохондрий подтверждается и тем. что снижение содержания АТФ в культурах в постглутаматный период было значительно менее выражено при удалении ионов кальция из инкубационного раствора. После 15 минут воздействия Глу в бескальциевом растворе в присутствии 100 мкМ ЭГТА, уровень АТФ в культурах снижался до 89±4.8%, а при последующем 30 минутном отмывании бес кальциевым раствором до 74,7+3.6%.

Исследование культур с помощью электронной микроскопии показало, что в норме митохондрии клеток-зерен некрупные, округлые или палочковидные, их кристы четко выделяются и равномерны по толщине. Изредка наблюдаются и разветвленные митохондрии с хорошо заметными продольно ориентированными кристами. Митохондриальный матрикс имеет сходную или несколько большую электронную плотность, чем окружающая органеллу цитоплазма. В культурах, обработанных Глу в токсической концентрации (100 мкМ, 15 минут), происходит нарушение ультраструктуры митохондрий, что выражается в двух разнонаправленных процессах: конденсации и набухании этих органелп.

В развитии деструктивных процессов митохондрий можно выделить несколько форм; а) конденсированные митохондрии, которые характеризуются уменьшенной площадью сечения на ультратонком срезе, расширением внутрикристного и межмембранного пространства и уменьшением объема матрикса с увеличением его электронной плотности; б) набухшие митохондрии с пониженной электронной плотностью матрикса, но с сохранными кристами и мембранами, ограничивающими органеллу; в) митохондрии с очаговыми набуханиями и разрушенными в этих участках кристами, однако с сохранением части крист и митохондриальных мембран в остальной части этих органелп; г) набухшие митохондрии с полностью разрушенными кристами. но еще заметной двойкой мембраной. Такие ультраструктуркые изменения митохондрий обычно свидетельствуют о нарушении нормального функционирования этих органелп.

Проведенные эксперименты демонстрируют, что снижение мембранного потенциала митохондрий в клетках-зернах, обработанных

Глу, обусловлено перегрузкой нейронов кальцием, который поступает в нейроны преимущественно через активированные Глу NMDA-каналы. Избыток цитоплазматического кальция электрогенно

транспортируется в митохондрии и индуцирует в них неспецифическую проницаемость, путем образования транзитной лоры во внутренней мембране митохондрий, что может быть первым шагом в деструкции митохондрий, а в дальнейшем вести к развитию нвйрональнои гибели.

Влияние удаления ионов натрия из инкубационного раствора на морфо-функциональное состояние митохондрий культивированных клеток-

зерен мозжечка.

В настоящее время наряду с кальциевой составляющей глутаматной токсичности выделяют натриевый компонент повреждения нейронов (Choi, 1987, Dessi, ef al., 1994). Чтобы определить, какое влияние оказывают ионы натрия на вызванные Глу мор фо-функци опальные изменения митохондрий, культуры инкубировали 20-25 минут в растворе, где NaCI был изоосматично заменен сахарозой - сбалансированном низконатриевом растворе (СНР). Результаты этих экспериментов показали, что инкубация культур в таком растворе даже без добавления Гпу вызывала деэнергизацию митохондрий клеток-зерен. После инкубации клеток с Р123 их цитоплазма приобретала диффузное свечение, а митохондрии не аккумулировали этот зонд. Понижение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен в СНР было кальцийзависимым и предотвращалось удалением ионов кальция из СНР или добавлением 1 мМ хлорида кобальта. Специфический неконкурентный блокатор NMDA-каналов МК-801, и специфический конкурентный антагонист NMDA подтипа Глу-рецепторов АРН также полностью предотвращали деэнергиэующее действие низконатриевого раствора, так как при действии этих блокаторов митохондрии клеток-зерен активно накапливали PI23 Полученные результаты показывают: 1) в культурах клеток-зерен при инкубации в низ ко натриевом растворе происходит накопление эндогенного Глу, что вызывает гиперактивацию Глу-рецепторов нейронов; 2) вход кальция в нейроны осуществляется преимущественно по NMDA-каналам; 3) кальциевая перегрузка клекток-зерен вызывает деэнергизацию митохондрий этих

клеток; 4) удаление ионов натрия не препятствует снижению мембранного потенциала митохондрий при действии Гпу. В настоящее время показано, что при глутаматной токсичности митохондрии нейронов активно аккумулируют ионы кальция (Weit and Reynolds, 1995, Budd 1996), и что индуцированное Глу возрастание [Na*]i активирует митохондриапьный N а 7Саг>-обмен ни к и ограничивает способность митохондрий накапливать Саг+ (Kiedrowski and Costa 1994). Замена внеклеточного натрия на сахарозу должна предупреждать как перегрузку нейрона натрием при активации глутаматных рецепторов, так и активацию митохондриального NaVCa2' обменника. В этих условиях митохондрии нейронов накапливают больше ионов кальция, что должно привести к изменениям их ультра структуры.

Электронномикроскопическое исследование показало, что инкубация культур в СНР, содержащем ионы кальция, ведет к сильному набуханию митохондрий клеток-зерен. Митохондрии зтих нейронов выглядят округлыми, но отдельные кристы хорошо различимы, ядерный хроматин клеток-зерен дампирован. В клетках-зернах, инкубированных в СНР без кальция, митохондрии мало отличались от контроля. В клетках-зернах, обработанных такое же время экзогенным Глу (100-500 мкМ) в присутствии нормальной концентрации хлорида натрия наблюдались многочисленные конденсированные митохондрии, а набухание митохондрий было выражено меньше, чем при действии эндогенного Глу s условиях изоосмотического понижения внешнего NaCI.

Результаты настоящей работы и данные, полученные другими авторами, позволяют заключить, что набухание митохондрий и падение их мембранного потенциала в нейронах при действии Глу происходит в результате кальциевой перегрузки этих органелл. Возможно, что активация митохондриального Na'/Ca2*-обменника при перерегрузке нейрона ионами натрия, входящими через NMDA-каналы, может предотвращать набухание митохондрий, и служить механизмом защиты от образования митохондриапьной транзиткой лоры.

Влияние ингибировамия активности Ыа+/Ку-АТФазы на жизнеспособность культивированных клеток-зерен.

Вероятно, процесс накопления эндогенного Глу в диссоциированных культурах клеток-зерен при понижении уровня внеклеточного натрия в инкубационном растворе связан с тем, что трансмембранный транспорт Глу является натрийзависимым и сопровождается поступлением ионов натрия в клетку {8га(ко\л(5к1 et а!.. 1990). Избыток натрия удаляется МаТК*- АТФазой и блокада этого фермента при понижении внешнего натрия или при добавлении уабаина (Уа) может вести к торможению и даже реверсу транспорта Глу в клетки и накоплению внеклеточного Глу. Для проверки этого предположения был проведен ряд экспериментов.

Инкубация нейрогпиальных культур клеток-зерен мозжечка крыс г течение 25 мин в СРС, с добавлением 1 мМ уабаина, специфического блокзтора Ма7К*-АТФазы, вызывало заметное набухание клеток-зерен. Через 3 часа после отмывания уабаина в обработанных культурах погибало большое количество клеток-зерен с образованием пикнотических ядер. Конкурентный б локатор глутаматных рецепторов - АРН, практически полностью предотвращал набухание и гибель нейронов от уабаина.

Измерение уровня внутриклеточного кальция в клетка х-зернах с помощью флуоресцентного индикатора Саг+ Р1ио-3 (Мт1а ег аI, 1989) показало, что при инкубации нейроглиальных культур клеток-зерен в СРС с Уа в концентрации 1 мМ происходит значительное увеличение флуоресценции Р1ио-3 в нейронах, что соответствует повышению уровня кальция. Через 7 мин инкубации культур с Уа в клетках-зернах 1Саг*], увеличивался от базального уровня 41 нМ до 350 нМ и через 33 мин максимальный уровень внутриклеточного кальция соответствовал 1550 нМ. АРН, специфический конкурентный антагонист ЫМРА подтипа Глу-рецепторов, ингибировал это повышение внутриклеточного кальция на 60-80%. Инкубация контрольных культур в течение такого же времени в СРС без У а не вызывала изменения [Саг^ е клетках-зернах. Для анализа функционального состояния митохондрий клетки окрашивали родамином 123. После 25-минутной инкубации культур клеток-зерен мозжечка в СРС, митохондрии нейронов активно накапливали этот краситель и интенсивно

светились, при облучении синим светом с длиной волны 450-490 нм. В клетках-зернах, инкубированных такое же время в СРС с Уа, митохондрии большинства нейронов не накапливали Р123. При совместном действии Уа со специфическим конкурентным антагонистом NMDA-рецепгоров митохондрии клеток зерен активно накапливали Р123. Полученные нами данные показывают, чгго развитие клеточной гибели в результате обработки нейроглиальных культур клеток-зерен уабаином сходно с процессами, происходящими в нейронах при токсическом действии Глу: набухание клеток, подъем (Саг*]|, деэнергизация митохондрий и гибель клеток-зерен с образованием пикнотических ядер. Весь ход развития гибели клеток-зерен при действии уабаика. можно предотвратить с помощью специфического конкурентного антагониста NMDA-рецепторов. Эти результаты позволяют сделать вывод, что при инактивации №7К*-АТФазы в культурах клеток-зерен происходит накопление эндогенного Глу. Турски с соавторами (Turski 1993) предполагают, что причиной накопления эндогенного Глу при нейродегенеративных заболеваниях является энергетический дефицит в клетках мозга. Это предположение подтверждается тем, что токсическое действие многих митихондриальных ядов: азида натрия. 3-нитропропионовой кислоты, цианида калия на глутаматцептивные нейроны также опосредовано гиперактивацией глутаматных рецепторов (Zeevalk and Nicklas 1990, Zeevalk el ai, 1995, Varmtng et a!., 1996), Полученные нами результаты в целом подтверждают эту схему. Однако в данной работе показано, что инактивация Na'/K'-АТФазы в нейроглиальных культурах клеток-зерен мозжечка даже без предварительного снижения энергетики клеток ведет к накоплению эндогенного Глу, гиперактивации Глу-рецептсрсв нейронов, повышению [Са2*], , понижению мембранного потенциала нейрона л ьных митохондрий и гибели этих клеток. Полученные результаты демонстрируют, что торможение вывода натрия из клетки ведет к накоплению внеклеточного Глу и не предупреждает деэнергизацию нейронапьных митохондрий, а тате клеточную гибель при гиперстимуляции глутаматных рецепторов.

Влияние умеренной блокады энергозависимого вывода ионов кальция и натрия из клеток на токсическое действие глутамата.

Возможными причинами стойкого повышения уровня внутриклеточного кальция в нейронах, обработанных токсическими дозами Глу, может быть увеличение проницаемости клеточной мембраны для ионоа кальция, или нарушение вывода из клеток этого иона. С целью исследования возможности снижения барьерной функции клеточной мембраны, мы производили мониторинг |Ca2+Ii в культивированных клетках-зернах, с помощью флуоресцентного индикатора Fitra-2, Результаты эксперимента показали, что в нейронах, обработанных Глу (100 мкМ), происходит устойчивое повышение [Са2<]„ на которое не влияет удаление ионов кальция из инкубационного раствора в постгутаматный период. Эти данные демонстрируют, что в нейронах, обработанных Глу, не происходит нарушения барьерной функции клеточной мембраны и наиболее вероятно, что при кальциевой перегрузке нейронов происходит понижение энерго за висим ого вывода кальция из клеток.

Для исследования важности энергозависимого транспорта кальция для развития токсичности Глу Саг<-насос был заблокирован в постглутаматном периоде эозином (50 мкМ), a Na7K* -насос уабаином (100 мкМ). Сами блокаторы в таких концентрациях не были токсичны для клеток-зерен. Количественный анализ гистологических препаратов показал, что при снижении вывода внутриклеточного кальция в результате торможения работы энергозависимого транспорта этого иона токсическое действие Гпу значительно возрастает. На препаратах культур, обработанных Глу, процент погибших клеток в среднем был 43+3%. Инкубация с эозином в постглутаматном периоде увеличивала этот показатель до 84+3%, то есть гибель клеток увеличивается на 41+3%, тогда как Уа. увеличивал этот показатель лишь на 17+3%.

Таким образом, ионы капьция при Глу токсичности поступают в нейрон по активированным каналам, и на этом этапе не происходит нарушения барьерной функции клеточной мембраны. Энергозависимый транспорт кальция и натрия из клеток осуществляется и в постглутаматном периоде и видимо является ведущим фактором

нормализации внутриклеточного ионного баланса, необходимого для выживаемости нейронов.

Механизмы, ведущие к нарушению энергетического и ионного гомеостаэа в нейронах при токсическом действии глутамата.

Полученные нами данные относительно морфо-функционапьного состояния митохондрий и систем ионного транспорта в нейронах при действии глутамата. а также данные других авторов демонстрируют, что ионные и энергетические механизмы, участвующие в развитии токсического действия Глу, тесно связаны, и их можно обобщить в следующей схеме (рис. 1). Известно, что имеется два источника Са2+ при активации глутаматных рецепторов: наружная среда, где его концентрация в норме на 4 порядка выше, чем в цитозоле (10 3 М [Са!']<> по сравнению с 10"7 М (Са2^), и внутриклеточные депо Саг*; эндоплазматический ретикулум, митохондрии и, возможно, так называемые "кальциосомы* (0!Ро1о апс! Веацде, 1988) {рис. 1), Выход Саг+ из эндоплазматического ретикулума вызывает инозитол-трифосфат (ИТ) (ОегтМде е(. а1.,1984, ЭМесгек е1. а!., 1985), который образуется в результате активации фосфои нозктидного обмена под влиянием взаимодействия глутамата с метаботролным рецептором. Из наружной среды Саг* может поступать по Глу каналам и потенциал зависимым (ПЗ) Са-каналам (рис. 1). Нами и рядом других авторов было показано, что кальциевая перегрузка нейронов при глутаматной обработке ведет к значительному закислению цитоплазмы этих клеток (Пинелис с соает., 1992; 1г\мл е1 э)., 1994). Источник протонов в этом процессе полностью еще не идентифицирован. Закисление цитоэоля нейронов при действии Глу может происходить по многим причинам: во-первых, вследствие усиленного гидролиза АТФ; во-вторых, повышения интенсивности гликолиза; и, в-третьих, снижения скорости №*/Н* - обмена, вследствие перегрузки нейронов ионами Ыа, Однако, при закислении цитоплазмы, вызванном действием Глу, Ыа*/Н+-обменник является одним из путей поступления в клетку ионов натрия, перегрузка которыми может тормозить вывод излишнего кальция путем Иа7Саг+ обмена, и тем самым способствовать увеличению кальций зависимой клеточной гибели. Данные, полученные другими авторами, по измерению внутриклеточной концентрации Саг*

подтверждают предположение о важной роли NaVH* обмена в нейродеструктивном действии глутамата (Ходоров с соавт., 1992).

Ионы Na+, как показано на рисунке 1, поступают в клетку из наружной среды через рецепторные каналы, потенциал зависимые Na-кэнэлы, Na4/H* - и NaVCa2* -обменпики, а выводятся NaVIC -насосом. Поскольку эффективность На' -зависимого вывода Са2+ определяется трансмембранным градиентом по Na' (DiPolo and Beauge, 1988), то любой процесс, приводящий к увеличению концентрации цитозольного Na*, в том числе и Na+/H+ -обмен, тормозит вывод Са1"* с помощью NaVCa2* -обменника. Активация глутаматных рецепторов вызывает постоянное поступление ионов Na' и Са5' через NMDA и потенциалзависимые каналы. Эта ионная перегрузка вызывает интенсивный расход АТФ 8 результате активации АТФ-зависимых систем вывода внутриклеточных ионов. Натриевая перегрузка нейронов ведет к нарушению транспорта Глу в клетку, и возможно, способствует дополнительному выбросу этого нейромедиатора из терминапей. Излишний цитоэольный кальций, поступивший в клетку при действии Глу. в значительной степени аккумулируется митохондриями (White, Reynolds, 1995), что показано на схеме (рис. 1).

Кальциевая перегрузка митохондрий может приводить к повышенной продукции свободных радикалов е митохондриях (Dugan et al., 1995), которые способствуют нарушению нормального состояния внутренней мембраны с образованием в ней крупных пор. падению мембранного потенциала, прекращению генерации АТФ аэробным путем (рис. 1) и возможно реверсу митохондриапьной АТФазы (Budd, Nicholls, 1996), выходу из митохондрий цитохрома С и ионов кальция. Бад и Николе также предполагают, что развитие глутаматной токсичности непосредственно связано с функцией митохондрий -депонировать ионы кальция. Не исключено, что натриевая перегрузка цитоплазмы нейронов может в некоторой степени тормозить развитие неспецифической проницаемости митохондриальных мембран, усиливая выход кальция из митохондрий через NaVCa1*- обмен ни к, но это в свою очередь не только не предупреждает деэнергизацию митохондрий, но даже увеличивает расход клеточного АТФ реверсированной АТФазой митохондрий, тем самым приводит клетку к быстрой гибели по некротическому механизму.

Кальциевая перегрузка митохондрий индуцирует открытие поры во внутренней мембране этих органелл, их деэнергизацию и выход из них запасов кальция в цитозоль нейрона. Этот выход кальция из митохондрий и может быть причиной стойкой кальциевой перегрузки нейрона при токсическом действии Глу, так как удаление внешнего кальция в постглутаматном периоде не ведет к значительному снижению кальциевой перегрузки цитоплазмы нейрона, а ингибирование цепи транспорта электронов в митохондриях ротеноном и олигомицином во время дествия Глу позволяет клетке нормализовать кальциевый баланс в лостглутаматный период (ВисМ, МсЬоНв, 1996).

Рис. 1. Основные механизмы изменения внутриклеточных концентраций ионов Саг* и Ма+ при действии глутамата (Глу), ведущие к нарушению структуры и функции митохондрий нейронов. Обозначения на рисунке: ФП - фосфолипаза С; ФД - фосфоинозитнд-ди фосфат; ИТ - инозитол-трифосфат; ДАГ -диацилглицерол; ПК - протемнкиназз С; ПЗ - потенциалзависимые каналы; ЭПР -эндоплазм этический ретикупум, М - митохондрия; Мп - митохондрия с открытой порой, (Пояснения к схеме даны в тексте).

Вследствие снижения уровня АТФ из-за кальцийзависимой деструкции митохондрий в клетке резко повышается роль АТ<0-независимого вывода Саг' путем активации Ма"'Саг' -обменника (01Ро1о, Веаизе, 1986). Однако, нейроны, лишенные основного источника АТФ, даже после прекращения действия Глу не могут нормализовать ионный баланс, что ведет к активации л и политических и протеолитических ферментов, а в дальнейшем к гибели клеток.

Используя результаты настоящей работы и ранее полученные данные можно заключить, что набухание митохондрий и падение их мембранного потенциала е клетках-зернах при действии Глу происходит е результате кальциевой перегрузки этих органелл и возникновения неспецифической проницаемости в мембранах митохондрий. Возможно, что активация митохондриального Л1а7Сзг+- обменника при перегрузке нейрона ионами натрия, входящими через КМОД-кэналы, может предотвращать набухание митохондрий, и служить механизмом защиты от образования митохондриальной транзитной лоры

Суммируя вышеизложенные экспериментальные данные, можно сделать вывод, что участие ионов натрия в развитии глутаматного поражения нейронов неоднозначно. Хотя ионы натрия при кальциевой перегрузке нейрона снижают степень набухания митохондрий, но они не препятствуют деэнергизации митохондрий. В то же время, повышение концентрации внутриклеточного Nа* на фоне снижения активности Ыа*;1С-АТФазы может привести к торможению вывода внутриклеточного кальция Ыа*/Са2*-обменником, а также к накоплению внеклеточного Глу, который в свою очередь активирует Гпу-рецепторы. Нарушение аэробного синтеза АТФ при увеличении расхода этого энергетического субстрата будет вести к понижению его концентрации в цитозоле нейрона, и в дальнейшем к торможению энвргозависимоео вывода ионов Ыа* и Са'*, что будет способствовать поддержке перегрузки клетки этими ионами.

Предотвращение гибели нейронов при глутаматной токсичности и кислородно-глюкозкой депривации с помощью нейро протекторов.

Глутамат является ведущей составляющей патологических процессов при развитии ишемического поражения мозга. 5 связи с этим в настоящее время одним из важнейших направлений исследований нейробиологии является поиск новых эффективных не йропроте кторов, способных предотвращать как токсичность глутамата, так и ишемические поражения мозга, и исследование механизмов действия этих веществ.

Клотримазоп снижает уровень гибели культивированных клеток-зерен мозжечка и нейронов гиплокампа при кислородно-глюкозной депривации и глутаматной токсичности.

В использованной нами ишемической модели 50-минутная кислородно-глюкоэной депривация (КГД) культур клеток-зерен мозжечка крыс вызывает гибель 73+9% нейронов через 4 часа после прекращения ишемии. Однако если КГД производили в присутствии 10 мкМ клотримазола - антигрибкового препарата, производное имидазола то количество погибших нейронов снижалось до 25+8% (р<0.05); эффект 1 мкМ клотримазола был значительно слабее, а 100 мкМ токсично. В этой модели ишемии дегенерация нейронов происходит в результате гиперстимуляции ггтутаматных рецепторов клеток эндогенным глутаматом, поскольку конкурентный специфический антагонист глутаматкых НМОА-рецепторов - АРУ (250 мкМ) полностью предотвращает гибель нейронов от КГД. Это позволило предположить, что кпотримазол может уменьшать число поврежденных нейронов при обработке культур токсическими дозами Глу. В используемой клеточкой модели токсичности Глу через 3 часа после обработки культур Глу (100 мкМ, 15 минут) происходила гибель 50+11% культивированных нейронов. Добавление 10 мкМ клотримазола к инкубационному раствору за 3 минуты до Глу приводила к понижению клеточной гибели до 14+6% (р<0.05), эффект 1 мкМ клотримазола был менее выражен. Подобный защитный эффект Клт был выражен и при токсической обработке Глу культивированных нейронов гиплокампа. Было показано, что кпотримазол в концентрации 10 мкМ повышает выживаемость нейронов гиплокампа при токсическом действии Глу с 85+3,2% до 69+2,2% (р<0.05)

В ходе работы было исследовано другое производное имидазола -бифонаэол, которое, как было обнаружено нами, также оказалось способно защищать нервные клетки от Гпу и КГД. Таким образом, эти эксперименты продемонстрировали, что обработка клотримаэолом культур е глутаматном периоде предотвращает нейрональную гибель, индуцированную Глу,

При гиперстимуляции Глу-рецепторов многие механизмы развития повреждений нейронов являются кальцийзависимыми. Часто кальций как своеобразный "месеенжер" влияет на кальций зависимые процессы не непосредственно, а, в основном, через активацию внутриклеточных белков, в частности - кальмодулина. Так как бифонаэол и клотримазол являются антагонистами кальмодулина, логично было поставить вопрос о связи способности этих веществ блокировать кальмодулин и модуляции ими токсического эффекта Глу. Поэтому были выполнены эксперименты с другим веществом способным блокировать кальмодулин - тиоридозином. В наших экспериментах при совместном действии на клетки этого вещества с Глу, токсический эффект достоверно увеличивался на 16+6% (Р<0.05, п=9). Из того. ЧТО тиоридозин • блокатор кальмодулина, отличный по химическому строению от клотримаэола и бифоназола, не только не снижает токсического действия Глу на клетки-зерна мозжечка, а даже наоборот, усиливает его, следует, что защитное действие клотримазол а и бифоназола при Глу токсичности не связано со способностью этого вещества блокировать кальмодулин.

Используя зонд на ионы внутриклеточного кальция Яио-З и конфокальную микроскопию, было определено, что клотримазол достоверно уменьшает индуцированное Гпу повышение [Саг*]; в нейронах (рис. 2). Эти данные демонстрируют, что Клт может снижать вход Саг* в нейроны, или интенсифицировать его вывод. Для исследования влияния клотримазол а на вывод кальция из клеток, изменение уровня этого иона было определено в клетках через 10 минут после отмывания Глу. Полученные результаты показали, что в обработанных Глу нейронах уровень кальция не понизился, тогда как в клетках, обработанных Глу, на фоне 10 мкМ клотримаэола отмечалось значительное снижение уровня [Саг*]| (рис. 2). Из этого эксперимента следует, что нейроны, обработанные клотримазолом, способны после кальциевой перегрузки нормализоать внутриклеточный уровень этого иона.

Ранее мы показали, что при Глу-индуцированиой кальциевой Перегрузке нейронов происходит снижение мембранного потенциала митохондрий этих клеток. Используя флуоресцентный зонд для мониторинга мембранного потенциала митохондрий ТМРЕ, было показано, что предобработка культур мозжечка 10 мкМ клотримазола значительно предотвращает индуцированное Глу снижение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен (рис. 2А1-Б1, В). Сохранение функций митохондрий может происходить в связи с меньшей кальциевой перегрузкой нейронов првдобработанных клотримазолом, Однако, другими авторами было показано, что предобработка клотримазолом предотвращает снижение уровня АТФ в фибробластах Ы1Н-ЗТЗ при кальциевой перегрузке этих клеток, вызванной кальциевым ионофором (Аэ)1кепагу-ЗЬаЬаг М, ВеНпег Я., 1999), _

А , .... у

г . V , <

'■г . *

л/ '

-Г

1 2 3

1 2 3 4 5

Рис. 2, Клотримазол предотвращает индуцированные глутаматом патофизиологические изменения культивированных клеток-зерен. А - в митохондриях клеток-зерен интенсивно флуоресцирует ТМРЕ. А1 - эти же клетки после 15 минут экспозиции с глутаматом в концентрации 100 мкМ. Заметно сильное снижение интенсивности свечения ТМВЕ в митохондриях клеток-зерен после обработки глутаматом. Б - в митохондриях клеток-зерен интенсивно флуоресцирует ТМРЕ в присутствии 10 мкМ клотримазола. Б1 - эти же клетки после 15 минут экспозиции с глутаматом в концентрации 100 мкМ и 10 мкМ клотримазола. Кпотримазол предотвращает выход ТМРЕ из клеток под действием глутамата. В - интенсивность свечения ТМИЕ в клетках-зернах,

выраженная в относительных единицах, где - базапьный уровень свечения родамина в митохондриях, Р - свечение родамина в митохондриях а эксперименте. 1 - базальный уровень свечения ТМНЕ в митохондриях клеток-зерен без воздействия; 2 - после действия глутамата (100 мкМ, 15 мин.); 3 - после действия глутамата {100 мкМ, 15 мин.) на фоне клотримазола. *Р<0,01, п=187, где п — количество клеток. Г - Клотримазал понижает вход кальция в клетки-зерна при действии Глу и стимулирует выход этого иона из клеток после отмывания Глу Интенсивность свечения кальциевого зонда Р1ио-3 в клетках-зернах, выраженная в относительных единицах, где Ро - базальный уровень свечения зонда в клетках, Р - свечение зонда в клетках в эксперименте. 1 - базальный уровень свечения Ркю-З в кпетках-зерах без воздействия; 2 - после действия глутамата (100 мкМ. 15 мин.); 3 - после действия глутамата (100 мкМ, 15 мин.) на фоне клотримазола; 1144 - 10 мин. после отмывания глутамата; 5 - 10 мин. после отмывания глутамата и клотримазола, *Р<0.01 (сравнение 2 и 3), п=114, "Р<0.01 (сравнение 4 и 5), п=114

Полученные нами результаты, и данные других авторов позволяют предположить, что клотримазол способен предотвращать снижение мембранного потенциала митохондрий и развитие неспецифической проницаемости мембран митохондрий при избыточной перегрузке »слетки ионами кальция. Защитное действие клотримазола при КГД и токсичности Глу обусловлено его способностью с одной стороны частично ингибировать ЫМОА*канал, и с другой предотвращать нарушения митохондриальных функций, что позволяет нейронам в постглутаматный период нормализовать уровень ионов цитоплазматичвского кальция.

Эффекты ноотропного дилептида ГВС-111 при кислородно-глюкоз ной депривации и глутаматмой токсичности in vitro. Ранее было показано, что новый дипептидный аналог лирацетама, ноотропное соединение ГВС-111 (этиловый эфир М-фенил-ацетил-L-npo лина, Патент № 564396930 USA) оказывает защитное действие при фокальной ишемии, уменьшая вызванный фототромбозом очаг поражения в коре головного мозга крыс, и восстанавливая когнитивные способности этих животных (Ostrovskaya, el al.p 1999). Однако механизмы защитного действия этого вещества были неясны. Мы исследовали защитные эффекты ГВС-111 на модели ишемии in vitro. Результаты экспериментов показали, что инкубация культур е течение 1.5 часа в

условиях, моделирующих ишемическое повреждение, приводила к гибели 43,2+2,5% клеток-зерен. Добавление к культурам ГВС-111 (1 мкМ, за 30 минут до КГД) снижало количество поврежденных нейронов на 12,3%. Таким образом, ГВС-111 дает достоверный защитный эффект при ишемическом повреждении клеток-зерен мозжечка.

В наших экспериментах конкурентный блокатор ЫМОА-рецепторов аминофосфоновалерат полностью блокировал гибель клеток-зерен при кисло родно-глюкозной депривации. Это демонстрирует, что основной составляющей повреждения нейронов в нашей модели ишемии является Глу. высвобождающийся из клеток-зерен и активирующий ММОА-рецепторЫ- Эти данные позволили предположить, что защитное действие ГВС-111 при ишемическом повреждении нейронов опосредовано снижением глутаматной нейроцитотоксичности. В ходе проверки этого предположения на модели нейроцититоксического повреждения культивированных клеток-зерен было показано, что добавление ГВС-111 к культурам во время действия Глу к в постглутаматном периоде снижало индуцированную гибель нейронов на 36%. Добавление классического ноотропа пирацетама, в такой же и более высоких концентрациях, по аналогичной схеме, не оказывало статистически достоверного защитного действия на нейроны при их повреждении Глу.

Таким образом, защита коотропным ди пептидом ГВС-111 от ишемического повреждения клеток-зерен мозжечка, основывается на способности этого не йро про гектора понижать токсическое действие возбуждающих аминокислот.

Данные, приведенные в этом разделе, подтверждают, что глутамат является ведущим патогенетическим фактором при ишемии мозга, так как исследованные нами нейропротекторы, которые защищают нейроны от глутаматной токсичности, также предупреждают развитие дегенерации нейронов при кислородно-глюкозной депривации.

Индукция в культивированных нейронах ишемической голера нтности.

Одним из методов снижения степени повреждения и гибели нейронов ЦНС от ишемии и гипоксии является повышение устойчивости нейронов к этим видам патологического воздействия путем отсроченного предварительного фармакологического или физиологического воздействия.

Индукция ишемической толерантности в культивированных нейронах путем гипоксического прекондиционирования.

В последние годы было показано, что короткая ишемия мозга может значительно защищать нейроны от повреждения, вызванного последующей летальной ишемией (Kilagawa et аА, 1991). Однако, возможность моделирования этого явления на культивированных, дифференцированных нейронах не была показана. Отсутствие такой модельной системы в значительной мере осложняло исследование механизмов гнпоксического прекондиционирования.

Целью наших экспериментов было показать возможность индукции ишемической толерантности в клеточных нейрональных культурах.

В выполненных экспериментах было показано, что 90 минут КГД не вызывали морфологических изменений культивированных нейронов коры крыс и не повышали достоверно их гибель. Через 24 часа после более длительной КГД (180 мин.) содержание лактатдегидрогеназы в среде культивирования увеличивалось на 70+8%, по сравнению с базальным уровнем. Исследование этих культур с помощью фазоао-контрастной микроскопии показало в них дегенерацию 70-90% нейронов. Значительная нейропротекция наблюдалась, если нейроны были лрекондиционированны 90 минутной КГД за 72 часа до 180 минутной КГД. В последующих экспериментах интервал между прекондиционирующей КГД и летальной КГД (ЛКГД) варьировал от 24-х до 72-х часов. Интервал короче 24 часов не индуцировал толерантность. В культурах подвергнутых ЛКГД уровень ЛДГ, снижался за 24 часа на: 34+7% (24 часовой интервал), 40+16%, (48 часовой интервал), 62+14%(72 часовой интервал) (рис. 3).

Интервал 24 часа Интервал 48 часов Интервал 72 часа

110 60 10 -40

..Ой

S3.

12 3 4

Рис. 3, Индукция ишемической толерантности культивированных нейронов юры ишемическим прекокдиционированием. Тест на высвобождение лактатдегидрогеназы из погибших клеток через 24 после КГД. Данные приведены в процентах от летальной КГД (3). 1 - контроль, 2 - ишемическое прекондиционирование (90 минут КГД), 3 - летальная ишемия (180 минут КГД), 4 — клетки подвергнуты ишемическому прекондиционироаанию (90 минут КГД) и последующей летальной ишемии (130 минут КГД). *Р<0.05 (сравнение 3 и 4). л=16-20, где п - количество культур. В верхней части рисунка указаны интервалы между прекондиционированием и летальной ишемией.

Индукция ишемической толерантности у культивированных нейронов фармакологическим п ре кондиционированием.

3-нитролропионовая кислота способна индуцировать ишемическую толерантность нейронов.

Таким образом, мы продемонстрировали, что в культурах нейронов можно короткой нелетальной ишемией защищать нейроны от повреждения последующей летальной ишемией. Однако первый вопрос, который возникает при начале исследования внутриклеточных механизмов этого феномена ■ насколько важно понижение уровня кислорода для индукции ишемической толерантности нейронов. Для изучения этой проблемы мы исследовали вопрос, может ли химическая гипоксия (ингибирование дыхательной цепи митохондрий) при нормальном содержании кислорода и глюкозы в питательной среде культур индуцировать ишемическую толерантность нейронов.

% 100

КГД -6 -7 -8 -9 -10 3-нитропропионовая кислота в 1д М

Рис. 4. Индукция ишемической толерантности культивированных нейронов коры фармакологическим пре кондиционированием. Тест на высвобождение лактатдегидрогеназы из погибших клеток через 24 после КГД, данные приведены в процентах от КГД. Интервал от прекондиционирования до КГД 24 часа (А). Интервал от прекондиционирования до КГД 4В часов (Б). *Р<0.05, л=8-24, где п - количество культур.

Для ингибирования дыхательной цепи митохондрий мы использовали 3-нитропропионовую кислоту (3-НПК), которая мнгибирует сукцинатдегидрогеназу. Инкубация нейрональных культур с 3-НПК я концентрации 10 мкМ вызывало через 4-6 часов набухание нейронов и через 24 часа их гибель и высвобождение ЛДГ в среду культивирования. Прекондиционирование нейрональных культур в течение 2-х часов с 3-НПК в интервале концентраций 1-0,01 мкМ не вызывала морфологических изменений клеток и значительно снижало гибель нейронов после ПКГД, если ишемию производили через 24 и 48 часов после инкубации культур С 3-НПК (рис. 4).

Таким образом, ишемическую толерантность можно индуцировать в присутствии кислорода и глюкозы, понижая аэробную энергетику мереных клеток, путем нарушения нормального функционирования цепи переноса электронов митохондрий.

Формирование ишемической толерантности в культурах клеток-зерен мозжечка с помощью гипероксигемации.

Разработана модель индукции ишемической толерантности культивированных кпеткок-зерен мозжечка крыс с помощью карбогена (95% 02, 5% С02. 1 час) при нормальном атмосферном давлении. В лредобработанных таким образом культурах, гибель нейронов от следующей через 24 ч КГД была в ряде экспериментов меньше по сравнению с необработанными культурами. Однако, эффект носил нестабильный характер. Последовательное двукратное часовое прекондиционирование с 24 ч интервалом дает достоверное уменьшение количества погибших нейронов при последующей 45 минутной КГД с 64,4+3,2% до 47.5+3,6%.

Эритропоэтин как возможный медиатор ишемической толерантности в мозге.

Ранее было обнаружено, что астроциты способны продуцировать эритропоэтин (ЭПО), а нейроны обладают рецепторам« к этому гормону (Masuda et а/., 1993, 1994; Digicayltoglu ei al., 1995; Marti ef al., 1996; Liu ei al.. 1997; Bernaudin ef al.. 2000). Возможно, что ЭПО может быть вовлечен в развитие ишемической толерантности, поскольку обладает нейролротвкторными свойствами (Morishfta ef al.. 1997; Sadamoto ef a/., 1998; Sakanaka ef aJ., 1998; Bernaudin ef ai, 1999; Brines et ai„ 2000; Sinor and Green berg, 2000; Siren et al., 2001). Это предположение мы проверили, используя как модель клеточные культуры нейронов и астроцитов.

В ходе исследования было показано, что предобработка ЭПО первичных культур нейронов коры крыс повышает их устойчивость к последующей кислородно-глюкозной депривации. Степень защиты нейронов зависела от концентрации ЭПО (рис. 5А), а иммуноцигтохимическая окраска нейрональных культур коры показала, что эти нейроны экспрессируют рецепторы к ЭПО. Первичные культуры нейронов коры были обработаны ЭПО в концентрациях 1 б.е,/мл, 10 б,е./мл,, 100 б.е,/мл, в течение 48 часов. Только высокие концентрации ЭПО статистически достоверно повышали выживаемость нейронов после 120 минут КГД, при оценке этого параметра через 24 часа после повреждающего воздействия (рис. 5А). Защита нейронов была выражена уже

после 5 минут преинкубации с ЭПО и достигала максимума после 48 часов аппликации эритропоэтина (рис. 5Б). Добавление ЭПО в питательную среду культур после ишемии не давало достоверного снижения гибели нейронов (рис. 5В). Защитные свойства эритропоэтина не наблюдались, если культуры обрабатывали одновременно с эритропоэтином анителами против рецепторов к этому гормону или водорастворимыми рецепторами. Комбинированная окраска культур флуоресцентными красителями этидиумом бромидом и акридиновым оранжевым наглядно демонстрировала эти данные. В дальнейшем, используя TUNEL-метсд выявления фрагментации ядерной ДНК при аполгозе, было показано, что преинкубация нейрона л ьных культур с ЭПО, предотвращает фрагментацию ДНК нейронов, индуцированную КГД. Если в этом эксперименте, стимуляция культур ЭПО в концентрации 100 б.е./мп. течение 48 часов перед 120 мин. КГД была блокирована антителами против ЭПО-рецепторов в концентрации 2 мкг/мл, то ЭПО не предотвращал фрагментацию ядерной ДНК после КГД,

Было обнаружено, что среда культивирования астроцитов, подвергнутых киспородно-глкжоэной депривации, индуцирует защиту нейронов от кислородно-глюкозной депривации, которая не развивалась, если рецепторы к эритролоэтину у нейронов были заблокированы антителами. В аналогичных экспериментах с нейронами было показано, что среда культивирования нейронов после 90 минут КГД также содержит факторы, способные индуцировать ишемическую толерантность нейронов.

Преинкубация нейрона л ьных культур в такой среде культивирования защищала нейроны от длительной (120 мин.) КГД. Однако ЭПО в этом случае не вовлечен в каскад процессов развития устойчивости нейронов к повреждению, так как антитела к ЭПО и водорастворимые рецепторы ЭПО не блокировали в таких экспериментах защитное действие среды культивирования нейронов, подвергнутых нелетальной КГД.

Рис. 5. Развитие толерантности к КГД в культурах коры мозга крыс эритропоэтином (ЭПО).

(A) дозозависимость эффекта ЭПО (48 часов перед КГД). Предобработка 100 б.е./мл ЭПО достоверно повышает выживаемость нейронов.

(Б) зависимость выраженности защитного эффекта от времени инкубации культур С ЭПО. Максимальный защитный эффект наблюдался после 24-48 часов инкубации культур с ЭПО.

(B) зависимость действия ЭПО (100 б.е./мп.) от момента воздействия: предобработка в течение 48 часов достоверно повышает выживаемость нейронов, тогда как обработка культур ЭПО после КГД менее эффективна. Клеточная гибель в экспериментах Л, Б, 8 оценивалась по уровню ПДГ в среде культивирования через 24 часа после КГД. *Р<0,05.

Индукция ишемической толерантности культивированных нейронов дефероксамином.

Ранее было обнаружено, что фактор индуцируемый гипоксией (HIF-1) регулирует экспрессию эритролоэтина (Semenza, 2000), На моделях ¡n vivo и ¡n vitro было продемонстрировано, что сам фактор HIF-1 можно активировать дефероксамином и, тем самым, стимулировать синтез матричной РНК для эритропоэтина в астроцитах (Zaman et af„ 1999; Bergeron et al., 2000; Bernaudin et al., 2000). Эти данные наводят на мысль, что дефероксамин может являться потенциальным индуктором ишемической толерантности клеток мозга, что было подтверждено в дальнейших наших исследованиях.

Дефероксамин добавляли в культура льну ю среду в различных концентрациях (15, 50, 100, 150, 300 и 600 мкМ) перед кислород но-глюкоэной депривацией. Было обнаружено, что только 150 мкМ дефероксамина статистически достоверно уменьшает гибель нейронов, индуцированную кислородно-глюкозной депривацией (рис. 6А). Если 150 мкМ дефероксамина добавляли в среду культивирования на различное время, от 1 до 46 часов, то только 48-часовая преинкубация была эффективна. Добавление в среду культивирования циклогексимида полностью блокировало индукцию дефероксамином ишемической толерантности культивированных нейронов (рис. 6S). Таким образом, полученные данные демонстрируют возможность индукции ишемической толерантности культивированных нейронов дефероксамином. Данные также указывают на то, что этот процесс сопряжен с синтезом новых белков и косвенно свидетельствуют о возможности участия эритропоэтина в этом процессе.

40 30 20 10

К 0 15 60 100 150 300 600 Дефероксамин е мкМ

■ 1.11

кгд кгд кгд кгд

+ДФ +ДФ +ЦГ

Рис. в. Индукция ишемической толерантности у культивированных нейронов фармакологическим прекондиционированием дефероксамином (ДФ). Тест на высвобождение лактатдегидрогеназы из погибших клеток через 24 после КГД, данные приведены в процентах от ПДГ, высвобождающейся в культуре при гибели 100% нейронов.

ДФ дозозависимо индуцирует устойчивость нейронов против КГД, примененный после 46 часов инкубации с ДФ.

Циклогексимид (ЦГ, 10 мкМ) предупреждает индукцию ДФ (150 мкМ) ишемической толерантноси у культивированных нейронов (Б). Интервал от прекондиционирования до КГД 48 часов. К - контрольные культуры, не подвергавшиеся КГД. *Р<0.05, п=16. где п - количество культур.

Влияние предобработки уабаином на жизнеспособность клеток-зерен после токсической обработки гпутаматом.

Известно, что при гипоксии и ишемии в клетках происходит снижение активности Ма*/К*-АТФазы. что может быть одним из механизмов адаптации клеток к условиям кислородного голодания. В настоящее время общепризнано, что Глу токсичность является ведущим фактором при развитии гилоксического и ишемического повреждения мозга. Исходя из этих данных, мы предположили, что временным понижением активности ЫаЧК'-АТФаэы можно уменьшить последующее токсическое действие Глу на культивированные клетки-зерена.

В экспериментах клеточные культуры предварительно инкубировали 90120 минут в солевом растворе с добавлением уабаина (Уа) в концентрации 10 -100 мкМ и после его отмывания подвергали токсической обработке Глу. На фиксированных через 2 часа после действия Глу. гистологических препаратах, окрашенных ванадиевым гематоксилином, подсчитывали количество живых и погибших клеток, Результаты анализа показали, что при блокаде NaVK* - АТФазы перед обработкой Глу (100 мкМ, 15 минут) число погибших клеток-зерен статистически достоверно снижается. В культурах, подвергнутых действию Глу, без преинкубации с Уа число дегенерироэанных нейронов составляло в среднем 54+3%, а в культурах, предварительно инкубированных с Уа (10 мкМ), этот показатель снижался до 31 ¿2%. Еще более эффективной была более длительная обработка культур уабаином (0,1 мМ, 24 часа). Подобное защитное действие уабаина наблюдается и при предобработке этим веществом купьтивированных нейронов коры при инициации клеточной гибели кислородно-глюкозной депривацией. Если повреждающее воздействие производили через 24 часа после обработки Уа <10 мкМ), клеточная гибель уменьшалась на 25%,

Возможный механизм защиты нейронов при снижении активности №*/К*-АТФазы в диссоциированных культурах мозжечка.

В клеточных культурах при кислородно-глюкозной депривации и при токсическом действии возбуждающих аминокислот нейроны гибнут по некротическому и апоптотическому типу. В этом разделе мы исследовали влияние снижения активности NaVK'-АТФазы на развитие алолтоза нейронов.

Замена среды культивирования с высоким содержанием хлорида калия (ВКС) в клеточных культурах мозжечка на среду с низким содержанием хлорида калия (НКС) вызывала заметное снижение количества живых клеток-зерен в этих культурах. Результаты подсчета клеток показали, что уже через 24 часа после снижения в среде культивирования уровня KCl, количество клеток-зерен в культурах снижается на 54%, по сравнению с сестринскими культурами, в которых уровень KCl не понижали. Гибель клеток-зерен сопровождалась фрагментацией ДНК. характерной для апоптоза. Чтобы исследовать влияние снижения активности Ма7К+-АТФаэы на развитие апоптоза, в ряде культур ВКС заменили

НКС, которая содержала 0,1 мМ уабаина • специфического ингибитора Na'/Ю-АТФазы. Ранее мы показали, что уабаин в такой концентрации нетоксичен для данного типа культур. Добавление Уа в НКС полностью предотвратило гибель клеток-зерен, индуцированную НКС и деградацию ДНК. Более низкие концентрации уабаина были менее эффективны.

Известно, что индуцированная низким калием гибель этого типа нейронов, развивается по апоптотическому типу {D'Mello et ai, 1993), но если клетки-зерна культивировать в НКС с добавлением Глу, это значительно увеличивает их выживаемость, а блокаторы ионотрогшых каналов Глу - МК-801 или CNQX, предотвращают антиапоптотическое действие Глу (Guang-Mei Yan ef. at., 1994). Ранее нами было показано, что присутствие Уа в питательной среде нейроглиальных культур мозжечка может вести к накоплению в ней эндогенного Глу и активации им NMDA-рецептороа клеток-зерен. Чтобы проверить, не опосредовано ли защитное действие Уа активацией ионотропных Ппу-рецелторов, этот блокатор Ыа7К*-АТФаэы добавляли в НКС одновременно с МК-801 и CNQX. Результаты эксперимента показали, что МК-801 вместе с CNQX незначительно снижали защитное действие уабаина. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что защитное действие уабаина от индуцированной НКС гибели клеток-зерен не опосредовано активацией NMDA или каинатных рецепторов.

Ранее нами было показано, что предобработка культивированных нейронов блокатором Na'/K'-АТФазы значительно снижает гибель клеток при ишемии и глутаматной токсичности. Известно, что нейрона л ьная гибель, вызванная этими воздействиями, равно как и в целом, развитие алоптоза сопровождаются гиперпродукцией свободных радикалов, (Bondy and Lee 1993, Schreiber et ai, 1995, Atabay et a)., 1996). Исходя из вышеприведенных данных, можно предположить, что предобработка культивированных нейронов уабаиком повышает их устойчивость к воздействию окислительного стресса. Для проверки этого предположения в среду культивирования клеток-зерен на 24 часа добавляли уабаин в концентрации 0.1 мМ. Окислительный стресс клеток-зерен инициировали обработкой культур в течение 25 минут FeJVacK0p6aT0M в сбалансированном солевом растворе. Через 3-4 часа после обработки клеток Рег+/аскорбатом в культурах, предобработанных Уа, погибло 49+3% клеток-зерен, тогда как в необработанных уабаином культурах количество погибших нейронов

было значительно выше и составляло 78+2%, Подобные эксперименты были проведены нами и на других моделях окислительного стресса, где в качестве индукторов окислительного стресса использовали паракват или перекись водорода. В этих экспериментах было показана, что предобработка Уа достоверно повышает выживаемость культивированных клеток-зерен мозжечка при обработке паракватом. индуцирующем повышение в клетках активных форм кислорода. Если в необработанных культурах выживало 50+2,7% этих клеток, то в преинкубированных с Уа 68+2,5% (р<0.05), При действии перекиси водорода была выявлена хорошо выраженная тенденция повышения выживаемости клеток-зерен, лредобработанкых Уа. 78+6,4% по сравнению с 61+8,4% в необработанных культурах.

Выполненные эксперименты указывают на то, что вызванное Уа снижение активности Na'/Ю-АТФэзы в клеточных культурах мозжечка крыс может предупреждать развитие аполтической гибели нейронов. Это защитное действие уабаина не опосредовано активацией NMDA или АМРА/каинатных рецепторов. Повышение устойчивости клеток-зерен, обработанных уабаином, к индукторам апоптоза, может происходить вследствие активации внутриклеточных систем защиты от окислительного повреждения, что подтверждается значительной толерантностью к окислительному стрессу клеток-зерен лредобработанкых уабаином. Подобное защитное действие уабаина было показано в немозговых клетках (VSMC-EA1), в которых понижение активности Ма+/К*-АТФэзы предупреждало развитие апоптоза, индуцированного стауроспорином, удалением сыворотки из среды культивирования клеток, или окаданоиевой кислотой (Orlov ef al„ 1999). Не исключено, что обнаруженный ранее в мозге и плазме эндогенный ингибитор Ма7К*-АТФазы (Tymtak et al., 1993, Zhao el at., 1995) может участвовать в регуляции апоптотической гибели клеток, происходящей при развитии организма.

Индукция ишемической толерантности культивированных нейронов коры с помощью анестетика изофлурана.

При ишемии мозга, вследствие дефицита энергетических субстратов и кислорода происходит снижение метаболизма в его ткане Подобное понижение метаболической активности в мозге можно имитировать фармакологически анестетиком изофлураном (Не\*Ьегд 1_.А. е1 а)., 1983). Кроме выше сказанного следует отметить, что как при индукции ишемической толерантности, так и при применении ряда анестетиков активируется ряд генов быстрота ответа (Уопес1а У, е1 а1., 1997; Натауа У. е1 а!., 2000). Мы предположили, что, обрабатывая культивированные нейроны анестетиком изофлураном, можно индуцировать в них повышение устойчивости к ишемии. Выполненные эксперименты подтвердили это предположение. Культуры коры мозга крыс инкубировали а течение трех часов в пластиковой камере, содержащей газовую смесь воздуха, 5% СОг и 1.4% изофлурана. После прекондиционирования старую среду удаляли и заменяли новой средой, С контрольными культурами производили такие же процедуры, но в отсутствии анестетика. Через 24 часа после прекондиционирования контрольные и прекондиционированные культуры подвергли кислородно-глюкозной депривации и через 48 часов после этого оценили клеточную выживаемость с помощью опредепения уровня лактатдегидрогеназы в среде культивирования. Результаты экспериментов показали, что в среде культивирования прекондиабонированных культур содержалось на 49% меньше лактатдегидрогеназы. Таким образом, выполненные эксперименты демонстрируют, что прекондиционирование культур анестетиком изофлураном достоверно уменьшает гибель нейронов от последующей летальной кислородно-глюкозной депривации, В литературе имеются многочисленные обьяснения нейропротекторного действия анестетиков. Этот эффект обьясняют блокадой высвобождения Глу при ишемии (Ра£е1 е! а1., 1995), индукцией А-типа рецепторов у-аминомаспяной кислоты, ассоциированных с входом К4 (Ошп1ап е( а!., 1995; ЗИиа1Ь е( а1., 1996), или ингибированием ИМРА-каналое (Уапд е( а!., 1991). Однако все исследования были сфокусированы на непосредственном эффекте анестезии и отсроченный на несколько часов эффект анестезии на ишемию мозга не изучался.

Из выше изложенного можно сделать заключение, что ишемическую толерантность нейронов можно индуцировать, имитируя полностью или частично внутриклеточные и межклеточные процессы, происходящие в нейронах и тканях мозга при летальной ишемии, но не повреждая при этом клетку. Наиболее вероятно, что в генерации первичного сигнала, ведущего к индукции ишемической толерантности, принимают непосредственное участие митохондрии. Обобщив полученные нами данные и данные других авторов, можно заключить, что процесс индукции ишемической толерантности является каскадом сложных внутриклеточных процессов, происходящих в нейронах и клетках алии после действия индуктора.

Кратко и весьма приблизительно каскад процессов индукции ишемической толерантности на ми представлен на следующей схеме (рис. 7). Ишемический стимул вызывает в нейронах продукцию свободных радикалов и выброс из терминалей этих клеток глутамата. На следующем этапе происходит активация NMDA и аденозиновых рецепторов, и возможно усиление генерации активных форм кислорода (АФК), далее эти процессы ведут к повышению уровня антиоксидантое в нейроне, экспрессии белков теплового шока и белков, участвующих в репарации ДНК, открытию А ТФ-чуествительных калиевых каналов. Параллельно ишемияескии стимул вызывает в клетках глин увеличение фактора индуцируемого гипоксией (HIF1), который ведет к повышению продукции эритропоэтина этими клетками Эритролоэтин в свою очередь связывается со специфическими рецепторами на нейронах, вызывая каскад процессов, также повышающих устойчивость нейронов к последующей летальной ишемии.

Й Р

3" К ■

Й 5

повышение продукции АФК, выброс Глу

активация ЫМОА и аденозиновых рецепторов

повышение уровня антиоксцдантов, увеличение экспрессии белков теплового шока и репарации ДНК, открытие АТФ -чувствительных калиевых каналов

■о

я Ф х

к £

Е Д>

£ п

£ -4 О

№

г>

-1

клетки

г л и

повышение экспрессии н1Г-1

усиление продукции эритропоэтина

Рис, 7. Схема индукции ишемической толерантности в нейронах.

ВЫВОДЫ

1. При действии токсических концентраций глутамата на культивированные клетки-зерна мозжечка происходит снижение мембранного потенциала митохондрий этих нейронов, что вызвано избыточным входом ионов кальция в цитоплазму через активированные глутаматом МБА-каналы.

2. Деэнергазация нейроиальных митохондрий при токсическом действии глутамата в присутствии натрия и кальция в инкубационной среде сопровождается разнонаправленными процессам» изменения ультра структуры митохондрий -сжатием или набуханием.

3. Изоосмотическое удаление внеклеточного натрия или торможение вывода этого иона из клеток может нарушать захват нейронами и астроглией эндогенного Глу, что ведет к его накоплению и гилераюгивации глутаматных рецепторов нейронов.

4. Кальциевая, но не натриевая перегрузка нейрона вызывает набухание митохондрий, так как активация глутаматных каналов клеток-зерен на фоне изоосмотического снижения концентрации ионов натрия в инкубационной среде ведет к деэнергизации нейрокаяьных митохондрий, которая сопровождается сильным набуханием этих органелл. Конденсированных митохондрий в этих условиях не наблюдается.

5. Торможение энергозависимого вывода ионов кальция эозином и ионов натрия уабаином после обработки культивированных клеток-зерен мозжечка глутаматом увеличивает количество погибших нейронов, что свидетельствует о необходимости активной работы этих систем в постглутаматный период для выживания клеток-зерен.

в. Обнаруженный защитный эффект клотримазола при токсическом действии глутамата и ишемии, обусловлен его способностью частично ингибировать вход кальция в нейроны, и предотвращать нарушения

митохондриальных функций, что позволяет нейронам в постглутаматный период нормализовать уровень цитоплазматического кальция.

7. Ишемическую толерантность культивированных нейронов возможно индуцировать умеренной ишемией, транзитной блокадой цепи транспорта электоронов а митохондриях или кислородной гипероксигенацией, что говорит с непосредственном участии митохондрий в развитии этого явления.

д. Эритропозтин может являться одним из медиаторов развития ишемической толерантности в мозге. Обработка культивированных клеток коры эритропоэтином, или дефероксамином - веществом, стимулирующим продукцию эритропозтина астроцитами, повышает устойчивость нейронов к ишемии.

9, Умеренная блокада Na+/tC - АТФазы в культурах клеток-зерен мозжечка может предотвращать их гибель, индуцированную понижением в среде культивирования содержания ионов калия, а предварительное, транзитное снижение активности этой транспортной системы может уменьшать токсическое действие глутамата или окислительного стресса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Викторов И.В., Андреева H.A., Исаев Н.К. Использование полизтилениминового субстрата для культивирования диссоциированных клеток центральной нервной системы. Цитология. 1990, 32(7), с, 81-84.

2. Викторов И.В., Хаспеков Л.Г., Андреева НА. Барсков И.В, Исаев, Н.К. Лыжин A.A., Ерин А.Н-, Дупин A.M. Роль свободно-радикальных реакций в деструкции нейронов in vitro и in vivo при действии возбуждающих аминокислот и при гипоксии/ишемии. Научная конференция "Организованный мозг", М. 1993, с. 42.

3. Исаев Н.К., Зоров Д.Б.. Лыжин АА, Ходоров Б.И., Викторов И,В. Глутамат вызывает понижение мембранного потенциала митохондрий в культивированных клетках-зернах мозжечка. Бюпл. зксперим. биол. мед. 1994, 117(2). с. 226.

4. tsaev N„ Zorov D„ Lijin A„ Khodorov В., Victorov i. Neurotoxic glutamate treatment of cultured cerebellar granule cells induced the collapse of mitochondrial potential. Biophysical Journal. 1994, 66(2), part 2 of 2, p.A111.

5. Khodorov В., Pinelis V„ Fayuk D.p Vinskaya N„ Storoghevikh T„ Bykova L,, Arsenieva E„ Isaev N„ Andreeva N„ Khaspekov L, Victorov I. Mechanism of deterioration of the ionic homeostasis in cultured nerve cells after a toxic glutamate treatment. In 3d Internat. Symp. on Hypoxia, Berlin, 1994, p, 221a-21b.

6. Khodorov В., Pinelis V„ Segal M„ Fajuk D., Vinskaya N,, Khaspekov L., Andreeva N., Isaev N., Victorov I. Na*/Ca+* exchange, Na'-K* pump and a delayed glutamate neurotoxicity. Pathophysiology, Special Tissue, 1994 (2nd Internal Congr, Pathophysiol., Kyoto), p.106,

7. Sorokina E„ Pinelis V., Segal M., Reutov V„ Vinskaya N., Chodorov В., Isaev N.. Victorov l. The influence of glutamate neurotoxicity and nitrite hypoxia on cyclic nucleotide levels in cerebellar granule cells. In 3d Internat. Symp. on Hypoxia, Berlin, t994, p. 37.

8. Стельмашук E.B., Исаев,. Андреева H.A., Викторов И В. Влияние уабаина на глутамат-ин ду цированную гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. В материалах третьих научных чтений им, С.А. Саркисоеа и симпозиума современные представления о структурно-функциональной организации мозга. М.1995, с.111.

9. Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б., Викторов И.В. Токсическое воздействие глутамата вызывает повреждение митохондрий в клетках-зернах диссоциированных культур мозжечка крыс, Б юля, эксперим. биол. мед. 1995,119(4), с, 378-380.

10. Khodorov В., Pinelis V., Fayuk D., Storoghevych Т.. Vinskaya N„ Koshelev S., Vergun 0,, Khaspekov L., Lyzhin A., Isaev N„ Victorov I. Use of manganese (o monitor changes in calcium permeability of neuronal membrane caused by a toxic glutamate treatment of cultured nerve cells. Biophysical Journal, 1995,68(2), part, p. A112.

11. Freyer D., Weikert S., Weih M„ Isaev N,, Victorov I., Meisel A., Weber J„ Oimagl U, Ozone chemiluminescence (03-CL) measurement of nitric oxide (NO) production in cultur9s of rat cerebral endothelial cells, astrocytes, and neurons. In: Society for

neuroscience Abstracts V.21, part 1. 25th Annua! meeting San Diego, California, 1995, p. 435.

12. Khodorov В., Pineiis V., Vergun 0., Storozhevykh Т., Fajuk D„ Vinskaya N., Arsenjeva E„ Khaspekov L., Lyzin A., Isaev N.. Andreeva N.. Victorov I. Dramatic effects of external alkalinity on neuronal calcium recovery following a short-duration glutamate challenge: the role of the plasma membrane Ca27H* pump. FEBS Letters. 1995, 371, p. 249-252.

13. Isaev N.. Usbekov R., Stelmashook E.p Zorov D., Victorov I. Glutamate induces uftrastructural injury of mitochondria and the collapse of the mitochondrial potential in cultured cerebellar granule cells. ln:Fourth IBRO Wortd Congress of Neoroscience. 1995, p. 261.

14. Pineiis V„ Bykova L., Isaev N., Vinskaya N.. Victorov I., Khodorov B. Changes cytoplasmic pH and ATP content associated with glutamate neurotoxicity. ln:Fourth IBRO World Congress of Neoroscience. 1995, p. 255,

15. Isaev N„ Stelmashook E.p Turovetsky В., Zorov D„ Victorov I, Glutamate induces collapse of the mitochondrial membrane potential and acidification of the cytosol in cultured cerebellar granule cells. 1 Kongress der Neurowissenschaften Geselschaft. Berlin. Germany, 1996, p,227.

16. Stelmashook E„ Isaev N„ Zorov D„ Uzbekov R„ Polyakova 1„ Victorov t. Ultrastructural and energy changes in the cultivated cerebellar granule cells following glutamate treatment. Moscow. Russia. 1996. The 4th Russian-Swedish symposium "New research in neurobiology", p. 107.

17. Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Реутов В.П., Винская Н.П., Исаев Н.К., Викторов И. В. Роль окиси азота в механизме повреждения клеток мозжечка глутаматом.Тезисы в материалах 9-ой Всероссийской научной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии". М„ 1996, с. 43-44.

18. Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г, Реутов В,П., Винская Н.П., Исаев Н.К., Викторов И.В. Оценка роли окиси азота в механизме повреждения клеток мозжечка глутаматом. Первый Российской конгрес по патофизиолога и. М.. 1996, с. 187.

19. Isaev N.K., Stelmashuk E.V., Dupin A.M., Andreeva N.A., Victorov l.V. Pharmacological preconditioning with oubain reduces the degree of damage to cultured cerebellar granule cells induced by glutamate. Hypoxia medical journal. 1996, 2, p. 36.

20. Isaev N.K., 2orov D.B., Stelmashook E.V., Uzbekov R.E., Kozhemyakin M.B., Victorov I.V. Neurotoxic glutamat treatment of cultured cerebellar granule cells induces Ca^-dependent collapse of mitochondrial membrane potential and ultrastructural alterations of mitochondria. FEBS Letters. 1996, 392, p. 143-147.

21. Стельмашук E.B., Исаев, Андреева H.A., Викторов И.В. Уабаин модулирует токсическое действие глутамата в диссоциированных культурах клеток-зерен мозжечка крыс. Бюлл. эксперим. биол. мед. 1996,122(8), с. 163-166.

22. Khodorov В.1., Fayuk D.A,, Koshelev S.G., Vergun O.V., Pinelis V.G., Vtnsbaya N.P., Storozhevykh T.P., Arsenyeva E.N., Khaspekov L.G., Lyrhin A.P., Isaev N„ Victorov I.V., Dubinsky J.M. Effect of a prolonged glutamate challenge on plasmalemma) calcium permeability In mammalian central neurones. as a tool to study calcium influx pathways. Int. J, Neurosci. 1996, 88(3-4), p. 215-241,

23. Пинелис В.Г., Быкова Л.П., Богачев А,П., Исаев Н.К., Викторов И,В., Ходоров Б.И. Токсическое воздействие глутамата на культивируемые зернистые клетки мозжечка снижает внутриклеточное содержание АТФ. Роль ионов CaSt. Бюлл. эксперим. биол. мед. 1997, 123(2), с. 162-164.

24. Weikert S., Freyer D., Weih M., Isaev N., Bush СЛ., Megom D., Ditnagl U. Rapid Ca2+-de pendent NO-production from central nervous system cells In culture measured by NO-nitiite/ozone chemoluminiscertce. Brain Res. 1997,748, p. 1-11.

25. Brauer U., Isaev N„ Weih M., Wiegand F„ Manz R„ Meisel A., Dimagl U. Tolerance to hypoxia/hypoglycemia Induced by hypoxia or pharmacologically in cultured neurons. XV111th International Symposium on Cerebral Blood How and Metabolism (BRAIN 97), J. Cereb. Blood Row Metab, 1997,17, p. S216.

26. Стельмашук E.B., Исаев H.K., Зоров Д Б., Викторов И.В. Кальций вызывает снижение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен мозжечка крыс при токсическом воздействии гпутамата, Бюлл. эксперим, биол, мед, 1997(4), с. 378-380.

27. Bruer U„ Weih М.К., Isaev N.K., Ruscher К., Bergk A., Trendelenburg G„ Meisel A., Wiegand F., Victorov l,V., Dirnagl U. Induction of Tolerance in Rat Cortical Neurons: Hypoxic Preconditioning. FEBS Letters. 1997, 414, p. 117-121.

28. Пинелис В.Г., Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Исаев Н.К., Викторов И.В, Влияние токсического воздействия глутамата и нитрита на содержание циклического ГМФ в нейронах и их выживаемость. Доклады РАН. 1997, 352, с, 259-261.

29. Викторов И.В., Андреева НА, Дупин A.M., Исаев Н.К., Лыжин А.А., Стельмашук Е.В., Хаспеков Л.Г. Исследование механизмов гипоксических/ишемических повреждений нейронов и ишемической толерантности в культуре клеток головного мозга. В материалах 3-й международной конференции " Колосовские чтения 97" Санкт-Петербург, 1997, с. 23.

30. Ruscher К„ Isaev N,, Trendelenburg G„ Berg A., Bruer U,, Weih V., Meisel A., Dirnagl U. Effect of hypoxia and aglycemia on hypoxia inducible factor in vitro model of cerebral ischemia. Society for neuroscience. 1997,23, p. 2181.

31. M. Weih M., Grabb M„ Isaev N, Meisel A., Dirnagl U.. Choi D.W. Induction of tolerance against oxygen-glucose deprivation by 3-nitropropionic acid in cortical neurons. Society for neuroscience. 1997, 23, p. 2182.

32. Исаев H.K., Бруер У., Вейх М., Рейшер К,, Бергк А., Майзель А., Транделенбург Г., Дирнагль У., Викторов И.В. Формирование ишемической толерантности в культуре нейронов коры головного мозга крыс. Всероссийская конференциия "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция", 1997, с. 47-48.

33. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Полякова И.А., Викторов И,В., Зоров Д.Б. Ультраструктурные изменения митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка после воздействия токсических доз глутамата. Всероссийская конференциия "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". 1997, с, 116-117,

34. Исаев Н.К., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г., Викторов И.В. Глутамат вызывает увеличение продукции лакгата в культивированных клетках-зернах мозжечка". Всероссийская конференциия "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". 1997, с, 48.

35. Isaev N.K., Slelmashook E.V., Alexandria О.Р., Andreeva N.A., Polyakova l.A., Victorov I.V., Zorov D.B. The Jack of extracellular Na* exacerbates CaJt-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. FEBS Letters, 1998,434(1-2), p,188-192.

36. Ruscher K., Isaev N,, Trendelenburg G., Weih M„ luraio L., Meisel A., Dirnagl U. Induction of hypoxia inducible factor 1 by oxygen glucose deprivation is attenuated by hypoxic preconditioning in rat cultured neurons. Neuroscience Letters. 1998, 254, p.1-4,

37. Stelrnashook E.V, Weih M., Zorov D., Victorov l„ Dirnagl U., Isaev N. Short-term block of Na'/K'-ATPase in neuro-glial cell cultures of cerebellum induces glutamate dependent damage of granule cells. FEBS Letters. 1999,456, p. 41 -44.

38. Weih M., Bergk A., Isaev N.K., Ruscher K., Megow D., Riepe M., Meisel A„ Viktorov I.V., Dimagl U. Induction of ischemic tolerance in rat cortical neurons by 3-nitropropionlc acid: chemical preconditioning. Neurosci. Letters. 1999,272, p.207-210.

39. Александрова О.П., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Викторов И.В. Исследование морфологических изменений культивированных клеток-зерен мозжечка при действии глутамата. Hypoxia Med. J. 1998, 6(2), р.26.

40. Isaev N.K., Stelmashook E.V.. Krasnikov B.F., Viktorov I.V., Zorov D.B. Short-term block of Na4/K* ATPase induces glutamate-dependent damage of cultured cerebellar granule cells. Biophysical Journal. 1999. 76 (2), part 2, A376.

41. Исаев H.K., Стельмашук E.B., Викторов И.В. Влияние снижения активности Ыа*/К*-АТФазы на жизнеспособность клеток-зерен в дисоциироеанных нейроглиальных культурах мозжечка крыс. Материалы конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга. М., 19Э9, с, 41.

42. Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Александрова О,П., Андреева Н.А, Зоров Д.Б., Викторов И.В. Влияние изоосмотического раствора с пониженным содержанием натрия на состояние митохонодрий культивированных клеток-зерен мозжечка. Бюл. экспер. биол. мед. 2000,129(1), с. 41-44,

43. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Halle A., Harms С., Lauienschlager М., Weih М., Dimagl U., Victorov I.V., Zorov D.B. Inhibition of NaM^-ATPase activity in cultured rat cerebellar granule celts prevents the onset of apoptosis induced by low potassium. Neurosc. Letters. 2000; 283(1), p. 41-44.

44. Андреева H.A., Стельмашук E.B., Исаев H.K., Островская Р.У., Гудашева ТА, Викторов И.В. Нейропротекторные эффекты ноотропного дипептида ГВС -111 при кислородно-глюкозной делривации, глутаматной токсичности и оксидативном стрессе in vitro. Бюл. экспер. биол. Мед. 2000,130, с. 969-972.

45. Стельмашук E.Bi Андреева НА, Исаев Н.К., Викторов И.В., Ходоров Б.И. Влияние блокады Са2+ насосов плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума на нейротоксичность глутамата в культуре клеток-зерен мозжечка крысы. 2000,11 Российский Конгресс по патофизиологии. С. 179.

46. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А, Манухова J1., Зоров Д.Б., Исаев Н.К. Антигрибковые препараты кпотримазол и бифоназол предотвращают гибель

культавированных клеток-зерен мозжечка крыс при глутаматной токсичности и кислородно-шюкозной депривации. В материалах конференции ■функциональная нейроморфология фундаментальные и прикладные исследования", Минск 2001 г., с.173-175.

47. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А, Манухова Л., Зоров Д,Б,, Исаев Н.К. Бифоназол модулирует гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс, индуцированную глутаматом и киспородно-глюкозной делривацией, Бюл. экспер. биол. Мед. 2001.132, с.542-544.

48. Prass К., Ruscher К., Karsch М„ Isaev N., MegowD., PriHer J., Scliarff A,, Dirnagl U., Meisel A. Desferoxamine induces delayed tolerance against cerebral ischemia in vivo and in vitro. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002; 22(5), p. 520-525.

49. Isaev N.K., Stelmashook E.V., Dimagl U., Andreeva N.A., Manuhova L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Skrebitsky V.G., Victorov I.V.. Katchanov J., Weih M., Zorov

D.B, Neuroprotective effects of the antifungal drug clotrimazole, Neuroscience, 2002, v, 113(1), p. 47-53,

50. Kapinya K.J., Low) D„ Futter C., Maurer M„ Waschke K.F., Isaev N.K., Dirnagl U. Tolerance against ischemic neuronal injury can be induced by volatile anesthetics and is iNOS-dependent. Stroke. 2002, v. 33(7), p.1889-98.

51. Ruscher K,p Freyer D., Karsch M., Isaev N., MegowD, Sawitzki В., PriHer J., Dimagl U„ Meisel A. Erythropoietin: a paracrine mediator of ischemic tolerance in the brain .Cellular/Molecular Neuroscience. 2002, v. 2(23), p. 10291-301.

52.Стельмашук E.B.; Андреева H.A.; Белоусов В,В.; Исаев Н.К. Фармакологическое п ре кондиционирование уабаином при моделировании гипоксии In vitro. Материалы 3 Всероссийской конференции: «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция», 2002, с. 116.

53. Стельмашук Е.В., Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Манухова Л.А., Захарова

E.И., Белоусов В.В., Зоров Д.Б., Викторов И В,, Исаев Н.К Повышение устойчивости к гипоксии клеток-зерен мозжечка с помощью кислорода. Материалы 3 Всероссийской конференции: «Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция» 2002, с. 117.

Описок сокращений

Глу - глутамат Р123-родамин 123 УА -уабаин

ФДА - флуоресцеин диацетат

ФУС • фиксирующая смесь (формалин, уксусная кислота, спирт)

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

АМРА - амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпролионат

АРН - 2-амино-7-фосфоногептаноат

APV • 2-амино-5-фосфоновалерат

АФК - активные формы кислорода

H£PES - (М-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этанолсульфоновая кислота IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат

МК-801 - (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(а.с1)цикло-гептен-5,10-имин малеат

MIT - 3-j4,5-Ди метштги а зол-2-и п]-2,5-дифен и л тетразолиум бромида

TMRE - этиловый эфир тетраэтилродамина

КГД - киспородно-гпюкозная деприеация

СНР - сбалансированный низко натриевый раствор

СРС - сбалансированный солевой раствор, содержащий Саг*

CNQX - 6-циаио-7-китрокуиноксалин-2,Э-(1 Н,4Н)-дион

ПКГД - летальная кислородно-глкжозная депривация

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

З'НПК - тринитролролионовая кислота

ВКС - среда с высоким содержанием калия

НКС - среда с низким содержанием калия

NMOA - N-метил-О-аспартат

ЭПО - эритро поэтик

Зак.126 Подп. к печати 6.03.2003 г. Печ.л.2 Тираж 100 экз. Бумага офсетн. Формат 60x84 1/16 Типография ВИУ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Исаев, Николай Константинович

Список сокращений.

Глава 2. Обзор литературных данных.

2.1. Морфологическая характеристика культивированных клеток коры полушарий головного мозга, гиппокампа и клеток-зерен мозжечка.

2.2. Глутамат как возбуждающий нейромедиатор.

2.3. Нейроцитотоксический эффект глутамата.

2.3.1. Роль ионов кальция, натрия и калия в развитии механизмов нейроцитотоксичности глутамата.

2.3.2. Структура и функции митохондрий в норме и патологии.

2.3.3. Повреждение митохондрий нейронов при глутаматной цитотоксичности.

2.3.4. Роль свободных радикалов в повреждениях нейронов, индуцированных глутаматом.

2.3.5. Роль молекулы N0 в механизмах глутаматной токсичности.

2.4. Значение глутамата в развитии патологий ЦНС.

2.4.1. Развитие ишемического поражения головного мозга и участие глутамата в этом патологическом процессе.

2.5. Фармакологическая защита нейронов от Деструктивного действия глутамата.

2.6. Защита нейронов головного мозга от ишемического повреждения путем индукции ишемической толерантности

Глава 3. Материал и методы исследования.

3.1.1 .Объект исследования.

3.1.2. Получение диссоциированных монослойных культур мозжечка, коры и гиппокампа крыс.

3.1.3. Приготовление субстратов для культивирования.

3.2. Приготовление препаратов для световой микроскопии.

3.3. Методы количественного анализа культур и оценки выживаемости.

3.4. Определения функционального состояния митохондрий с помощью родамина 123.

3.5. Оценка фрагментации ДНК в культурах нейронов.

3.6. Электронная микроскопия.

3.7. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия.

3.8. Определение внутриклеточного рН.

3.9. Иммуноцитохимия и иммунологическая идентификация белка Ьах в культурах.

3.10. Определение уровня АТФ и уровня активности Na/K-АТФазы в культурах клеток.

3.11. Моделирование окислительного стресса.

3.12. Кислородное прекондиционирование и кислородно-глюкозная депривация культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.

3.13. Кислородно-глюкозная депривация культивированных нейронов коры головного мозга.

3.14. Схемы проведения экспериментальных воздействий.

3.14.1. Обработка культур глутаматом и уабаином.

3.14.2. Обработка клеток-зерен эозином в постглутаматном периоде.

3.14.3. Блокада транспорта Са2+ в митохондрии.

3.14.4. Исследование нейропротекторных свойств клотримазола и бифоназола.

3.14.5. Инкубация культур в растворе с пониженным содержанием ионов натрия.

3.14.6. Схема экспериментов с ГВС-111.

Глава 4. Результаты исследования.

4.1. Диссоциированные культуры зернистых клеток мозжечка, нейронов коры и гиппокампа.

4.2. Цитотоксическое действие глутамата на культивированные клетки-зерна мозжечка крыс.

4.3. Морфология митохондрий клеток-зерен и глии при окраске родамином 123.

4.4. Влияние глутамата на мембранный потенциал митохондрий и уровень внутриклеточного кальция в культивированных клетках-зернах мозжечка крысы.

4.5. Изменение уровня АТФ в культурах клеток-зерен при токсическом действии глутамата.

4.6. Влияние ингибирования входа внешнего кальция в клетки-зерна на деэнергизующий эффект глутамата.

4.7. Действие специфической блокады транспорта Са в митохондрии клеток-зерен на деэнергизующий и токсический эффекты глутамата.

4.8. Влияние циклоспорина А на токсическое действие глутамата.

4.9. Влияние умеренной блокады энергозависимого вывода ионов кальция и натрия из клеток на токсическое действие глутамата.

4.10. Ультраструктура клеток-зерен.

4.11. Изменение ультраструктуры клеток-зерен под действием токсических доз глутамата.

4.12. Изменение внутриклеточного рН при действии глутамата.

4.13. Влияние удаления ионов натрия из инкубационного раствора на морфо-функциональное состояние митохондрий культивированных клеток-зерен мозжечка.

4.14. Влияние понижения активности Ыа+/К+-АТФазы на жизнеспособность культивированных клеток-зерен.

4.2. Защита нейронов головного мозга от повреждений вызванных глутаматом и ишемией.

4.2.1. Предотвращение гибели нейронов при глутаматной токсичности и кислородно-глюкозной депривации с помощью нейропротекторов.

4.2.1.1. Клотримазол снижает уровень гибели культивированных клеток-зерен мозжечка и нейронов гиппокампа при кислородно-глюкозной депривации и глутаматной токсичности.

4.2.1.2. Бифоназол модулирует гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс, индуцированную глутаматом.

4.2.1.3. Эффекты ноотропного дипептида ГВС-111 при кислородно-глюкозной депривации и глутаматной токсичности in vitro.

4.2.2. Индукция в культивированных нейронах ишемической толерантности.

4.2.2.1. Индукция в культивированных нейронах ишемической толерантности путем гипоксического прекондиционирования.

4.2.2.2. 3-нитропропионовая кислота способна индуцировать ишемическую толерантность нейронов в присутствии кислорода.

4.2.2.3. Формирование ишемической толерантности в культурах клеток-зерен мозжечка с помощью гипероксигенации.

4.2.2.4. Индукция ишемической толерантности культивированных нейронов коры с помощью анестетика изофлурана.

4.2.2.5. Влияние предобработки уабаином на жизнеспособность клеток-зерен при токсической обработке глутаматом.

4.2.2.6. Механизм защиты нейронов при снижении активности №+/К+-АТФазы в диссоциированных культурах мозжечка.

4.2.3. Эритропоэтин как возможный медиатор ишемической толерантности в мозге.

Глава 5. Обсуждение результатов.

5.1. Диссоциированные культуры клеток головного мозга как объект для исследования глутаматной токсичности и гипоксии.

5.2. Морфофункциональное состояние органелл культивированных клеток-зерен после кратковременного воздействия глутамата.

5.3. Внутриклеточные процессы, происходящие при деэнергизации митохондрий нейронов, вызванной глутаматной токсичностью.

5.4. Влияние снижения интенсивности работы АТФ-зависимого транспорта ионов кальция и натрия на цитотоксичность глутамата в постглутаматном периоде.

5.5. Механизмы, ведущие к нарушению энергетического и ионного гомеостаза в нейронах при токсическом действии глутамата.

Глава 1. Введение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот"

Л | поступать ионы Na и Са и выходить в межклеточное пространство ионы К+. Деполяризация мембраны, обусловленная в основном входом

I 2+ в нейроны ионов Na , приводит к тому, что Са начинает поступать в клетки и через потенциалзависимые Са2+-каналы. Избыточный вход Са2+ в клетки рассматривается многими исследователями как одна из основных причин повреждения нейронов в результате действия возбуждающих аминокислот in vitro (Choi, 1985), а также при гипоксии/ишемии, гипогликемии и эпилепсии. Вместе с тем, при токсическом действии Глу всегда отмечается отек нейрона, причиной чего в первую очередь является значительное увеличение концентрации ионов натрия в цитоплазме и далее вход ионов хлора и пассивная диффузия воды. В ряде работ отмечено, что удаление натрия из инкубационного раствора может снижать токсичность Глу.

Таким образом, при токсическом действии Глу наблюдается стойкое повышение концентрации свободного цитозольного Са2+ ([Ca2+]i) и Na+ ([Na+]i) в нейронах. Причины, препятствующие 9 нормализации концентрации ионов после прекращения действия Глу, до конца неясны. Логичным представляется поставить вопрос о нарушении клеточной энергетики и, в частности о функциональных изменениях митохондрий, а также роли энергозависимых систем транспорта ионов в нейродеструктивных процессах, индуцированных кратковременным воздействием глутамата. Поскольку при гипоксии и ишемии мозга ведущим патогенетическим фактором повреждения нейронов является гиперстимуляция глугаматных рецепторов возбуждающими аминокислотами, нарушение клеточных систем генерации энергии в процессе гибели нейронов может происходить и при этих видах патологии. Однако, короткую, нелетальную для нейронов ишемию, можно использовать как индуктор нейропротекции для последующей, более жесткой летальной ишемии, что может быть использовано при клинических мозговых операционных воздействиях. Это явление было обнаружено в 1990 году (Kitagawa et al., 1990). В экспериментах, проведенных на животных, было показано, что нейроны головного мозга песчанок становятся более устойчивыми к летальному ишемическому воздействию, если животное ранее было подвергнуто короткой сублетальной глобальной ишемии мозга. Однако на момент исследования это явление не было смоделировано на нейрональных культурах с низким содержанием клеток глии, что необходимо для изучения механизмов этого процесса. Наиболее вероятно, что митохондрии, как ключевые органеллы генерации энергии клетки, имеют ведущее значение в процессе индукции ишемической толерантности. Следует отметить, что наряду с защитой нейронов от гипоксического/ишемического повреждения путем повышения устойчивости нейронов к этим патологическим

10 воздействиям является актуальным поиск веществ, способных защищать нейроны от повреждений, связанных с гиперстимуляцией глутаматных рецепторов.

Задачи исследования

3) изучение возможности индукции ишемической толерантности у культивированных нейронов путем временного понижения аэробной клеточной энергетики ишемическим и фармакологическим прекондиционированием;

4) поиск новых эффективных нейропротекторов.

Научная новизна исследования определяется рядом впервые полученных данных. Было показано, что:

1) нейроцитотоксическая обработка Глу культивированных клеток-зерен мозжечка ведет к кальцийзависимому падению мембранного потенциала и изменению ультраструктуры митохондрий этих нейронов;

3) причиной набухания нейронов и повышения в них уровня цитоплазматического кальция при ингибировании Ыа+/К+-АТФазы, является не понижение вывода ионов натрия из нейронов этой транспортной системой, а нарушение натрийзависимого захвата Глу клетками. Накопленный Глу ведет к гиперактивации NMDA-рецепторов, открытию NMDA-каналов, входу через них Na+ и Са2+, и, в дальнейшем, к перегрузке нейрона этими ионами и набуханию;

4) предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка блокатором Ыа+/К+-АТФазы - уабаином в нетоксических концентрациях, снижает последующий токсический эффект Глу или окислительного стресса;

5) показана возможность индукции ишемической толерантности у культивированных нейронов кратковременной ишемией, фармакологической блокадой цепи транспорта электронов митохондрий нейронов и кислородной гипероксигенацией;

6) показано, что предобработка культивированных нейронов производными имидазола клотримазолом или бифоназолом, значительно снижает гибель нейронов при ишемии и глутаматной токсичности посредством снижения кальциевой перегрузки клеток, нормализации уровня внутриклеточного кальция и сохранения нормальной функции митохондрий;

7) показана роль эритропоэтина как возможного медиатора ишемической толерантности при гипоксическом прекондиционировании клеток мозга.

Научно-практическое значение работы.

Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представления фундаментальной нейробиологии как о механизмах ишемического повреждения мозга, так и механизмах индуцированной ишемической толерантности ЦНС. Полученный материал может служить экспериментальным обоснованием для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать нейродегенеративные изменения при острых и хронических патологических состояниях ЦНС.

Апробация диссертационного материала

Материалы настоящего исследования были представлены на международном симпозиуме нейронаук (Киото, 1995); третьих научных чтениях имени академика С.А. Саркисова и симпозиуме "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга (Москва, 1995); первом Конгрессе нейронаук (Берлин, 1996); 4-м Российско-Шведском симпозиуме "Новые исследования в нейробиологии" (Москва, 1996); 2-й международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996); на научной конференции "Организованный мозг" (Москва, 1993); 38-м биофизическом конгрессе (Нью-Орлеан, Лоузиана, 1994); конгрессе нейронаук (Сан-Диего, Калифорния, 1995); 9-ой Всероссийской научной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (Москва, 1996); Первом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); XVIII интернациональном симпозиуме мозгового кровообращения и метаболизма (Балтимор, 1997); в материалах 3-й международной конференции "Колосовские чтения" (Санкт-Петербург, 1997);

Всероссийской конференциии "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1997; 2002); биофизическом конгрессе (Балтимор, 1999); конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга" (Москва, 1999); II Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), совместном заседании кафедры биохимии биологического факультета и отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Список сокращений.

Глу - глутамат

ДМСО - диметилсульфоксид

КПС - кондиционированная питательная среда

ПЭИ - полиэтиленимин

Р123 - родамин 123

СРС - сбалансированный солевой раствор, содержащий Са2+ УА - уабаин

ФДА - флуоресцеин диацетат

ФУС - фиксирующая смесь (формалин, уксусная кислота, спирт)

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

АМРА - амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат

АРН - 2-амино-7-фосфоногептаноат

APV - 2-амино-5-фосфоновалерат

CMF - солевой раствор, лишенный ионов Са2+ и Mg2"1"

DIV - дни in vitro

HEPES - К-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этанолсульфоновая кислота

IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат

МК-801 - (+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо(а,ё)цикло гептен-5,10-имин малеат NOS - NO-синтетаза NMDA - N-метил-В-аспартат PBS - изотонический фосфатный буфер N0- окись азота SOD - супероксиддисмутаза ТМРЭ - этиловый эфир тетраэтилродамина АФК - активные формы кислорода АНТ - транслокатор адениновых нуклеотидов АИФ - фактор, индуцирующий апоптоз КП - кислородное прекондиционирование КГД - кислородно-глюкозная депривация СНР - сбалансированный низконатриевый раствор ПКГД - прекондиционирующая кислородно-глюкозная депривация

ЛКГД - летальная кислородно-глюкозная депривация

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

3-НПК - тринитропропионовая кислота

ВКС - среда с высоким содержанием калия

НКС - среда с низким содержанием калия

Клт - клотримазол

Биф - бифоназол

ЭПО - эритропоэтин

глава 2. Обзор литературных данных.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Исаев, Николай Константинович

ВЫВОДЫ

2. Деэнергизация нейрональных митохондрий при токсическом действии глутамата в присутствии натрия и кальция в инкубационной среде сопровождается разнонаправленными процессами изменения ультраструктуры митохондрий - сжатием или набуханием.

3. Изоосмотическое удаление внеклеточного натрия или торможение вывода этого иона из клеток может нарушать захват нейронами и астроглией эндогенного Глу, что ведет к его накоплению и гиперактивации глутаматных рецепторов нейронов.

4. Кальциевая, но не натриевая перегрузка нейрона вызывает набухание митохондрий, так как активация глутаматных каналов клеток-зерен на фоне изоосмотического снижения концентрации ионов натрия в инкубационной среде ведет к деэнергизации нейрональных митохондрий, которая сопровождается сильным набуханием этих органелл. Конденсированных митохондрий в этих условиях не наблюдается.

5. Торможение энергозависимого вывода ионов кальция эозином и ионов натрия - уабаином после обработки культивированных клеток-зерен мозжечка глутаматом увеличивает количество погибших

264 нейронов, что свидетельствует о необходимости активной работы этих систем в постглутаматный период для выживания клеток-зерен.

6. Обнаруженный защитный эффект клотримазола при токсическом действии глутамата и ишемии, обусловлен его способностью уменьшать вход ионов кальция в нейроны, и предотвращать нарушения митохондриальных функций, что позволяет нейронам в постглутаматный период нормализовать уровень цитоплазматического кальция.

7. Ишемическаую толерантность культивированных нейронов возможно индуцировать умеренной ишемией, транзитной блокадой цепи транспорта электоронов в митохондриях или кислородной гипероксигенацией, что говорит о непосредственном участии митохондрий в развитии этого явления.

8. Эритропоэтин может являться одним из медиаторов развития ишемической толерантности в мозге. Обработка культивированных клеток коры эритропоэтином, или дефероксамином -веществом, стимулирующим продукцию эритропоэтина астроцитами, повышает устойчивость нейронов к ишемии.

9. Умеренная блокада Na+/K+ - АТФазы в культурах клеток-зерен мозжечка может предотвращать их гибель, индуцированную понижением в среде культивирования содержания ионов калия, а предварительное, транзитное снижение активности этой транспортной системы может уменьшать токсическое действие глутамата или окислительного стресса.

265

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Исаев, Николай Константинович, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К.,Уотсон Дж/ Молекулярная биология клетки. /М: Мир. 1987.

2. Алиева И.Б., Воробьев И.А. Реакция клеточного центра на воздействие кальциевого ионофора А23187./ Цитология. 1989, т.31, N3, с. 259-265.

3. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д., Ашапкин В.В., Осадчая Л.М., Вольский Г.Г., Туманова С.Ю., Каменская М.А., Дамбинова С.А., Каразеева Е.П., Титов А.А. Биохимия мозга./Издательство С.-Петербургского университета, 1999.

4. Боголепов Н.Н. Ультраструктура мозга при гипоксии./ М: Медицина, 1979.

5. Боголепов Н.Н. Методы электронно-микроскопического исследования мозга./ 1976, 71с.

6. Викторов И. В. Развитие и пластичность нейронов в тканевых и клеточных культурах./ Док. дисс., Москва, 1987.

7. Викторов И.В., Шунгская В.Е. Методы культивирования. Руководство по культивированию нервной ткани./ М.: Наука, 1988.

8. Викторов И.В. Методика тотальной окраски монослойных культур ванадиевым гематоксилином./ Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. 1990, т.109, N6, с. 612-613.266

9. Гребенщикова В.И. Ультраструктурные изменения в клетках культуры СПЭВ при действии фактора, влияющего на проницаемость мембран клеток./ Материалы IX Всесоюз. конф. по электронной микроскопии. М: Наука. 1973, с. 391-392.

10. Захарова И.О., Стельмашук Е.В., Викторов И.В., Тюрин В.А., Аврова Н.Ф. Защитный и модуляторный эффект разных концентраций ганглиозидов в клетках-зернах мозжечка и в синаптосомах мозга крыс./Нейрохимия. 1998, т.15, вып. 2, с. 117-125.

11. Литинская JI.JI., Векслер A.M., Иконникова Н.И., Туровецкий В.Б., Козлов Д.А. Хруст Ю.Р. Микроскопический вариант прижизненной рН-метрии индивидуальных клеток с использованием флуоресцеин диацитата/. М: ВИНИТИ. 1984.

12. Литинская Л.Л., Векслер A.M., Иванова H.JI., Лейкина М.И., Измерение внутриклеточного рН в процессе культивирования клеток./ Вестник МГУ, Биология 1986.

13. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Мор Ю.Е. Трансмембранный потенциал регулирует неспецифическую проницаемость внутренней митохондриальной мембраны./Биол.мембр. 1989, т. 6, с.1053-1062.267

14. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Зоров Д. Б., Кушнарева Ю.Е., Кудряшов, Ю. Б. Действие циклоспорина А и олигомицина на неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий./Биохимия, 1991, т. 56, с. 529-535

15. Овчинников Ю.А. Бооорганическая химия. /- М.: Просвящение. -1987.

16. Питере А., Палей С., Уэбстер Г./ Ультраструктура нервной системы."Мир". М. 1972.

17. Полякова И.А. Структурные и функциональные изменения клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма./Канд. дис. М. 1991.

18. Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты./ "Медицина"М. 1986.

19. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения окиси азота в организме млекопитающих./ "Наука"М. 1998.

20. Серов В.В., Пауков B.C. Ультраструктурная патология./ "Медицина", М. 1975.268

21. Скибо Г.Г. Приготовление препаратов культивируемой нервной ткани для исследования в электронном микроскопе./ Руководство по культивированию нервной ткани./ М., Наука. 1988.

22. Струве М.Е., Ченцов Ю.С. Действие циклогексимида на ультраструктуру и некоторые метаболические процессы клеток культуры СПЭВ./ Цитология и генетика. 1977, т. 11, N 5, с. 409-418.

23. Струве М.Е., Ченцов Ю.С. Изучение репарации повреждений клеток культуры СПЭВ после действия митомицина С./ Цитология. 1978, т.20, N 2, с. 198-203.

24. Ходоров Б.И., Пинелис В.Г., ГоловинаВ.А., Фаюк Д.А., Уварова Т.М., Андреева Н.А., Хаспеков Л.Г., Викторов И.В. О природе "кальциевой перегрузки" нейрона после токсического воздействия глутамата./Биологические мембраны. 1992, т. 9, N10-11. с. 1045-1048.

25. Хаспеков Л.Г., Викторов И.В. Морфологические характеристики нейронов гиппокампа, развивающихся в условиях клеточных культур./ Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. 1987, т. 103, N6, с. 738-741.

26. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы./ М. 1990.

27. Ченцов Ю.С. Общая цитология./ М.: Изд -во Моск. Ун-та. 1984.269

28. Ченцов Ю.С. Практикум по цитологии./ М.: Изд-во Моск. Ун-та. 1988.

29. Al-Baldawi N.F., Abercrombie R.F. Calcimn diffusion coefficient in Myxicola axoplasm./ Cell Calcium. 1995, v. 17, N6, p. 422-430.

30. Albers G.W. Potential therapeutic uses of N-methyl D-aspartate antagonists in cerebral ischemia. / Clinical neuropharmacology. 1990, v. 13, N3, p. 177-197.

31. Adachi S., Cross, A. R., Babior, В. M., Gottlieb, R. A. Bcl-2 and the outer mitochondrial membrane in the inactivation of cytochrome с during Fas-mediated apoptosis./J.Biol.Chem. 1997, v. 272, p. 21878-21882

32. Allerand D.C. Pattern of neuronal differentiation in developing cultures of neonatal mouse cerabellum./ J.Comp. Neurol. 1971, v. 142, p. 167-204.

33. Almeida A., Bolanos J.P., Medina J.M. Nitric oxide mediates glutamate-induced mitochondrial depolarization in rat cortical neurons./ Brain. Res. 1999, v. 816, N2, p. 580-586.

34. Alvarez J., Montero M., Garcia-Sancho J. High affinity inhibition of Ca2+-dependent K+ channels by cytochrome P-450 inhibitors./ J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 11789-11793.

35. Al Nasser I., Crompton M. The reversible Ca2+-induced permeabilization of rat liver mitochondria./ Biochem.J. 1986, v. 239, p. 1929.

36. Andreeva N., Khodorov В., Stelmashook E., Cragoe E. Jr, Victorov I. Inhibition of Na+/Ca2+ exchenge enhances delayed neuronal death elicited by270glutamate in cerebellar granule cell cultures. Brain Res., 1991, v. 548, p. 322-325.

37. Andreeva N., Khodorov В., Stelmashook E., Cragoe E., Jr, Viktorov I. 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride and mild acidosis protect cultured cerebellar granule cells against glutamate-induced delayed neuronal death./ Neurosci., 1992, v.49, N1, p.175-181.

38. Andreeva L., CromptonM. An ADP-sensitive cyclosporin-A-binding protein in rat liver mitochondria./ Eur.J.Biochem. 1994, v. 221, p. 261-268.

39. Ankarcrona M., Dypbukt J.M., Orrenius S., Nicotera P. Calcineurin and mitochondrial function in glutamate-induced neuronal cell death./ FEBS Lett. 1996, v. 394, N3, p. 321-324.

40. Asher P., Nowak L. Electrophysiological studies on NMDA receptors./ Trends in Neurosci. 1987, v. 10, p. 284-288.

41. Ashkenazy-Shahar M., Beitner, R. Effects of Ca2+-ionophore A23187 and calmodulin antagonists on regulatory mechanisms of glycolysis and cell viability ofNIH-ЗТЗ fibroblasts./Mol. Genet. Metab. 1999, v. 67, p. 334342.

42. Auer R.N., Siesjo B.K. Biological difference between ischemia, hypoglycemia, and epilepsy./ Ann. Neurol. 1988, v.24, N6, p. 699-707.

43. Beal M.F., Kowall N.W., Ellison P.W., Mazurek M.F., Swartz К .J., Martin J.B. Replication of the neurochemical characteristic of Huntington's disease by quinolinic acid./ Nature. 1986, v. 321, p. 168-171.

44. Beatrice M. C., Palmer J. W., Pfeiffer D. R. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria./ J.Biol.Chem.1980, v. 255, p. 8663-8671.

45. Beatrice M. C., Stiers D. L., Pfeiffer D. R. Increased permeability of mitochondria during Ca2+ release induced by t- butyl hydroperoxide or oxalacetate. The effect of ruthenium red./ J.Biol.Chem. 1982, v. 257, p. 7161-7171.

46. Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., Marhall P.A., and Freeman, B.A. Apparent hydroxy! radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990, v. 87, p. 1620-1624.

47. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly./ Am. J. Physiol. 1996, v. 271, N5, p. C1424-C1437.

48. Bergeron M., Gidday J.M., Yu A.Y., Semenza G.L., Ferriero D.M., Sharp F.R. Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain./ Ann. Neurol. 2000, v. 48, p. 285-296.

49. Bernaudin M., Bellail A., Marti H.H., Yvon A., Vivien D., Duchatelle I., Mackenzie E.T., Petit E. Neurons and astrocytes express EPO mRNA: oxygen-sensing mechanisms that involve the redox-state of the brain./ Glia. 2000, v. 30, p. 271-278.

50. Bernardi P., Vassanelli S., Veronese P., Colonna R., Szabo I., Zoratti M. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore. Effect of protons and divalent cations./ J.Biol.Chem.1992, v. 267, p. 2934-2939.

51. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol triphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction./Nature. 1984, v. 312, p. 315-320.273

52. Bindokas V.P., Miller R.J. Excitotoxic degeneration is initiated at non-random sites in cultured rat cerebellar neurons./ J. Neurosci. 1995, v. 15, N11, p. 6999-7011.

53. Blake J.F., Brown M.W., Collingridge G.L. CNQX blocks acidic amino acid induced depolarization and synaptic components mediated by non-NMDA receptors in rat hippocampal slices./ Neurosci. Lett. 1988, v. 89, p. 182-186.

54. Borel J. F. Cyclosporine forever?/ Transplant.Proc. 1986, v. 18, p. 271272.

55. Bond A., Lodge D., Hicks C.A., Ward M.A., O'Neill M.J. NMDA receptor antagonism, but not AMPA receptor antagonism attenuates induced ischaemic tolerance in the gerbil hippocampus./ Eur. J. Pharmacol. 1999, v. 380, N2-3, p. 91-99.

56. Boveris A., Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen./ Biochem.J. 1973, v. 134, p. 707-716.

57. Braughler J.M. and Hall E.D. Central nervous system trauma and stroke. I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. / J. Free Radic. Biol. Med. 1989, v. 8, p. 3-11.

58. Brewer G.J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus./ J Neurosci Res 1995, v. 42, p. 67483.

59. Broekemeier K.M., Dempsey M. E., Pfeiffer D. R. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria./J.Biol.Chem. 1989, v. 264, p. 7826-7830.

60. Brorson J.R., Schumacker P.T., Zhang H. Nitric oxide acutely inhibits neuronal energy production. The Committees on Neurobiology and Cell Physiology./ J. Neurosci. 1999, v. 19, N1, p. 147-158.

61. Brustovetsky N., Brustovetsky Т., Jemmerson R., Dubinsky J.M. Calcium-induced cytochrome с release from CNS mitochondria is associated with the permeability transition and rupture of the outer membrane./ J. Neurochem. 2002, v. 80, N2, p. 207-218.

62. Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. /J. Neurochem. 1996, v. 67, N6, p. 2282-2291.275

63. Buttke Т. M., Sandstrom P. A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis see comments./ Immunol.Today. 1994, v. 15, p. 7-10.

64. Carbonera D., Azzone G. F. Permeability of inner mitochondrial membrane and oxidative stress./ Biochim.Biophys.Acta. 1988, v. 943, p. 245-255.

65. Carpenter R.L., Eger E.I., Johnson B.H., Unadkat J.D., Sheiner L.B The extent of metabolism of inhaled anesthetics in humans./ Anesthesiology. 1986, v. 65, p. 201-205.

66. Castillo L., Andreeva N., Victorov I. Dissociated nervous cell cultures from rat cerebellum. Morphological characterization./ Int. J. Neurosci. 1989, v. 48, p. 293.

67. Chan P.H., Fishman R.A., Longar S., Chen S., Yu, A. Cellular and molecular effects of polyunsaturated fatty acid in brain ischemia and injury./ Prog. Brain Res. 1985, v. 63. p. 227-235.

68. Chan P.H., Fishman R.A. Transient formation of superoxide radicals in polyunsaturated fatty acid induced brain swelling./ J. Neurochem. 1978, v. 35, p. 1004-1007.

69. Chan P.H., Chu L., Chen S.F., Carlson E.J., Epstein C.J. Attenuateon of glutamate-induced neuronal swelling and toxicity in transgenic mice overexpressing human CuZn-superoxide dismutase./ Acta Neurochir. Suppl (Wien). 1990, v. 51, p. 245-247.276

70. Chen Z.L., Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalyzed degradation of laminin./ Cell. 1997, v. 91, N7, p. 917-925.

71. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent./Neurosci. Lett. 1985, v. 58, p. 293-297.

72. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neuro toxicity./ J. Neurosci. 1987, v. , N2, p. 369-379.

73. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system./Neuron. 1988a, v. 1, p. 623-634.

74. Choi D.W. Calcium-mediated neurotoxicity: relationship to specific channel types and role in ischemic damag/Treds Neurosci. 1988b, v.l 1, N10, p.465-469.

75. Choi D.W. Excitotoxic cell death./ J. Neurobiol. 1992, v. 23, N 9, p. 1261-1276.

76. Choi D.W., Rothman S.M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death./Ann. Rev. Neurosci. 1990, v. 13, p. 171182.

77. Clark G.D. Role of excitatory amino acids in brain injury caused by hypoxia-ischemia, status epilepticus and hypoglycemia./ Neonatal Neurology. 1989, v. 16, p. 459-474.

78. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death./ Biochem.J. 1999, v. 341, p. 233-249.277

79. Crompton M., Andreeva L. On the interactions of Ca2+ and cyclosporin A with a mitochondrial inner membrane pore: a study using cobaltammine complex inhibitors of the Ca2+ uniporter./ Biochem.J.1994, v. 302, p. 181185.

80. Crompton M., Costi A., Hayat L. Evidence for the presence of a reversible Ca2+"dependent pore activated by oxidative stress in heart mitochondria/ published erratum appears in Biochem. J. v.246, N3: following 806. Biochem.J. 1987, v. 245, p. 915-918.

81. Crommpton M., McGuinnes O., Nazareth W. The involvement of cyclosporin A binding protein in regulating uncoupling mitochondrial energy transduction./Biochim. Biophys. Acta. 1992, v. 1101, p. 214-217.

82. Crompton M., Ellinger H., Costi A. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress./Biochem J. 1988, v. 255, N1, p. 357-360.

83. Culcasi M., Lafon-Cazal M., Pietri S., Bockaert J. Glutamate receptors induced a burst of superoxide via activation of nitric oxide synthase in arginine-depleted neurons./J. of Biol. Chem., 1994, N17, p. 12589-12593.

84. Currie R.W., Ellison J.A., White R.F., Feuerstein G.Z., Wang X., Barone F.C. Benign focal ischemic preconditioning induces neuronal Hsp70278and prolonged astrogliosis with expression of Hsp27./ Brain Res. 2000, v. 863, N1-2, p. 169-181.

85. Curtis D.R., Johnston G.A.R. Amino acid transmitters in the mammalian central nervous system./ Ergebn. Physiol. 1974, v. 69, p. 98188.

86. Daugas E., Nochy D., Ravagnan L., Loeffler M., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. Apoptosis-inducing factor (AIF): a ubiquitous mitochondrial oxidoreductase involved in apoptosis./ FEBS Lett. 2000, v. 476, N3, p. 118123.

87. Dawson V.L., Dawson T.M., London E.D., Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures./Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, v.88, p. 6368-6371.

88. Dawson V.L., Brahmmbhatt H.P., Mong J.A. and Dawson T.M. Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary mixed neuronal-glial cortical cultures./ Neuropharmacology. 1994, v. 33, p. 1425-1430.

89. DeCoster M.A., Koenig M.L., Hunter T.C., Tortella F.C. Calcium dynamics in neurons treated with toxic and non-toxic concentration of glutamate./Neuroreport. 1992, v. 3, p. 773-776.

90. Demopoulos H.B., Flamm E.S., Pietronigro D.D., Seligman M.L. The free radical pathology and the microcir culation in the major central nervous system disorders./Acta Physiol. Scand. Suppl. 1980, v.492, p. 91-119.279

91. Desmond N., Levi W.B. Synaptic correlates of as sociative potentiation/depression: An ultrastructural study in the hippocampus. /Brain Res. 1983, v.265,p.21-31.

92. Dessi F., Charriaut-Marlangue C., Ben-Ari Y. Glutamate-induced neuronal death in cerebellae culture is mediated by two components: a sodium-cloride component and a calcium component./ Brain Res. 1994, v. 650, p. 49-55.

93. Dessi F., Ben-Ari Y., Charriaut-Marlangue C. Ruthenium red protects against glutamate-induced neuronal death in cerebellar culture./Neuroscience Letters. 1995, v. 201, p. 53-56.

94. Dichter M.A. Rat cortical neurons in cell culture; culture methods, cell morphology, electrophysiology and synapse formation./ Brain Res. 1978, v. 149, p. 279-293.

95. Digicaylioglu M., Bichet S., Marti H.H., WengerR.H., Rivas L.A., Bauer C., Gassmann M. Localization of specific erythropoietin binding sites in defined areas of the mouse brain./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, v. 92, p. 3717-3720.

96. DiPolo R, Beauge L. Ca2+ transport in nerve fibers. /Biochimica et Biophysica Acta. 1988, v. 947, p. 549-569.

97. Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view./ Trends Neurosci. 1999, v. 22, N9, p. 391-397.

98. Dong H., Xiong L., Zhu Z., Chen S., Hou L., Sakabe T. Preconditioning with hyperbaric oxygen and hyperoxia induces tolerance against spinal cord ischemia in rabbits./ Anesthesiology. 2002, v. 96, N4, p. 907-912.

99. Drejer J., Benveniste H., Diemer N.H., Schousboe A. Cellular origin of ischemia-induced glutamate release from brain tissue in vivo and in vitro./J. Neurochem. 1985, v. 45, p. 145-151.

100. Drejer J., Frandsen A., Honore Т., Schousboe A. Adenosine inhibits glutamate stimulated 3H.D-aspartate release from cerebellar granule cells./Neurochem. Int. 1987, v. 11, N1, p. 77-81.

101. Dumuis A., Sebben M., Haynes L., Pin J. P., and Bockaert J. NMDA receptors activate the arachidonic acid cascade system in striatal neurons./Nature. 1988, v.336, p. 68-70.281

102. Dugan L.L., Choi D.W. Excitotoxicity, free radicals and cell membrane changes. Annals of neurology. 1994, v. 35, p. S17-S21.

103. Dykens J.A., Stern A., Trenker E. Mechanism of kainate toxicity to cerebellar neurons in vitro is analogous to reperfusion tissue injury./ J. Neurochem. 1987, v. 49, N4, p. 1222-1227.

104. Dykens J.A. Isolated cerebral and cerebellar mitochondria produce free radicals when exposed to elevated Ca2+ and Na+: Implication for neurodegeneration./J. of Neurochemistry. 1994, v. 63, N2, p. 584-591.

105. Eimerl S., Schramm M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death./J. Neurochem. 1994, v. 62, N3, p. 1223-1226.

106. Faden A.I., Demedink P., Panter S.S., Vink R. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury./Science. 1989, v. 244, p. 798-800.

107. Facci L., Leon A., Skaper S.D. Hypoglycemic neurotoxicity in vitro: involvement of excitatory amino acid receptors and attenuation by monosialoganglioside GM1./Neurosci. 1990, v. 37, N3, p. 709-716.

108. Favaron M., Manev M., Rimland J. M., Candeo P., Beccaro M. and Manev H. NMDA-stimulated expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule neurones./NeuroRepot. 1993, v. 4, p. 1171-1174.282

109. Fearon I.M., Ball S.G., Peers C. Clotrimazole inhibits the recombinant human cardiac L-type Ca2+ channel alpha 1С subunit./ Br. J. Pharmacol., 2000, v. 129, p. 547-554.

110. Flamm E.S., Demopoulos H.B., Seligman M.L., Poser G.R., Ransohoff J. Free radicals in cerebral ischemia./ Stroke, 1978, v. 9, p.445-451.

111. Fournier N., Duce, G., Crevat A. Action of cyclosporine on mitochondrial calcium fluxes./ J.Bioenerg.Biomembr.1987, v. 19, p. 297303.

112. Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain./ J. Neurochem. 1984, v. 42, p. 1-11.

113. Foster A.C., Gill R., Iversen L.L., Woodruff G.N. Systemic administration of MK-801 protects against ischemia induced hippocampal neurodegeneration in the gerbils./ Br. J. Pharmacol. 1987, v. 90, p. 9.

114. Frandsen A., Schousboe A. Development of excitatory amino acid induced cytotoxicity in cultured neurons./ Int. J. Dev. Neurosci. 1990, v. 8, p. 209-216.

115. Frelin C., Barbry P., Chassande O., Vigne P., Lazdunski M. Amiloride-sensitive Na+ transport systems./In: Molecular Basis of Biomembrane Transport. Eds. Palmiery F., Quagliariello E. Elsevier, 1988, p. 81-90.

116. Gallo V., Ciotti M.T., Aloisi F., Levi G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differen tiating in culture./ Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982, v. 79, p. 7919-7923.

117. Gallo V., Giovannini C., Levi G. Modulation of non N-methyl-D-aspartate receptors in cultured cerebellar granule cells./ J. Neurochem. 1990, v. 54, N5, p. 1619-1625.

118. Garthwaite J., Charles S.L., Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain./ Nature. 1988, v. 336, p. 385-388.

119. Gatto C. and Milanick M.A. Inhibition of the red blood cell calcium pump by eosin and other fluorescein analogues./ Am. J. Physiol. 1993, v. 264, p. C1577-C1586.

120. Giraud M. F., Velours J. The absence of the mitochondrial ATP synthase delta subunit promotes a slow growth phenotype of rho- yeast cells by a lack of assembly of the catalytic sector F1./ Eur.J.Biochem. 1997, v. 245, p. 813-818.284

121. Glass-Marmor L., Morgenstern H. and Beitner, R. Calmodulin antagonists decrease glucose 1,6-bisphosphate, fructose 1,6-bisphosphate, ATP and viability of melanoma cells./ Eur. J. Pharmacol., 1996, v. 313, p. 265-271.

122. Grabb M.C., Choi D. W. Ischemic tolerance in murine cortical cell culture: critical role for NMDA receptors./ J. Neurosci. 1999, v. 19, N5, p. 1657-1662.

123. Griffiths E. J., Halestrap A. P. Protection by Cyclosporin A of ischemia/reperfusion-induced damage in isolated rat hearts./ J.Mol.Cell Cardiol. 1993, v. 25, p. 1461-1469.

124. Gross A., Jockel J., Wei M.C., Korsmeyer S.J. Enforced dimerization of В AX results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis./ EMBO J. 1998, v. 17, N14, p. 3878-3885.

125. Gunter Т. E., Pfeiffer D. R. Mechanisms by which mitochondria transport calcium./Am.J.Physiol. 1990, v. 258, p. C755-C786.285

126. Hamaya Y., Takeda Т., Dohi S., Nakashima S., Nozawa Y. The effects of pentobarbital, isofluarane and propofol on immediate-early gene expression in the vital organs of the rat./ Anesth Analg. 2000; v. 90, p. 1177-1183.

127. Hamon В., Heinemann U. Developmental changes in neuronal sensitivity to excitatory amino acids in area of the rat hippocampuc./ Dev. Brain. Res. 1988, v. 38, p. 286-290.

128. Hartley D.M., Choi D.W. Delayed resque of N-methyl D-aspartate receptor-mediated neuronal injury in cortical culture./ J. Pharmacol, and Exp. Therapeutics. 1989, v. 250, N2, p. 752-758.

129. Hartley D.M., Monyer H., Colamarino S.A., Choi D.W. 7-chloro-kynurenate blocks NMDA receptor-mediated neurotoxicity in cortical cell cultures./ Soc. Neurosci. Abstr. 1989, v. 15, p. 762.

130. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture286correlates with subsequent neuronal degeneration./ J. Neurosci. 1993, v. 13, N5, p. 1993-2000.

131. Haworth R. A., Hunter D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site./ Arch. Biochem. Biophys. 1979, v. 195, p. 460-467.

132. Hawrot E. Cultured sympathetic neurons: effects of cell-derived and synthetic substrata on survival and development./ Developm. Biol. 1980, v. 77, p. 136-151.

133. Hegemann L., Toso S.M., Lahijani K.I., Webster G.F., Uitto J. Direct interaction of antifungal azole-derivaties with calmodulin: a possible mechanism for their therapeutic activity./ J. Invest. Dermatol. 1993, v. 100, p. 343-346.

134. Hiraide Т., Katsura K., Muramatsu H., Asano G., Katayama Y. Adenosine receptor antagonists cancelled the ischemic tolerance phenomenon in gerbil./ Brain. Res. 2001, v. 910, N1-2, p. 94-98.

135. Hood W.F., Sun E.T., Compton R.P., Monahan J.B. 1-Aminocyclobutane-l-carboxylate (ACBC): a specific antagonist of the N-methyl-D-aspartate receptor coupled glycine receptor./ Eur. J. Pharmacol. 1989, v. 161, p. 281-282.

136. Huettner J.E. Indole-2-carboxylic acid: a competi tive antagonist of potentiation by glycine at the NMDA receptor./ Science. 1989, v. 243, p. 611-1613.287

137. Hunter F. L. Inactivation of oxidative and phosphorilative systems in mitochondria by preincubation with phosphate and other ions./ J.Biol.Chem. 1955, v. 216, p. 357-369.

138. Hunter D. R., Haworth R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms./ Arch.Biochem.Biophys. 1979, v. 195, p. 453-459.

139. Hunter D. R., Haworth R. A., Southard J. H. Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria./ J.Biol.Chem. 1976, v. 251, p. 5069-5077.

140. Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury./ Trends Neurosci. 1997, v. 20(3), p. 132-139.

141. Igbavboa U., Zwizinski C. W., Pfeiffer D. R. Release of mitochondrial matrix proteins through a Ca2+-requiring, cyclosporin-sensitive pathway./ Biochem.Biophys.Res.Commun. 1989, v. 161, p. 619-625.

142. Ikeda J., Terakawa S., Murota S., Morita I., Hirakawa K. Nuclear disintegration as a leding step of glutamate excitotoxicity in brain neurons./ J. of Neorosci. Res. 1996, v. 43, p. 613-622.

143. Irwin R.P., Lin S.-Z., Long R.T., Paul S.M. N-methyl-D-aspartate induces a rapid, reversible, and calcium-dependent intracellular acidosis in cultured fetal rat hippocampal neurons./ The J. of Neuroscience.1994, v. 14, p.1352-1357.

144. Iversen L.L., Woodruff G.N., Kemp J.A. et al. Noncompetitive NMDA antagonists as drugs./ In: The NMDA Recep tor. Eds. Watkins J.C., Collingridge G.L./ Oxford: Oxford University Press. 1989, p. 117-226.

145. Jacobson M. D., Burne J. F., King M. P., Miyashita Т., Reed J. C., Raff, M. C. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA./ Nature. 1993, v. 361, 365-369.

146. Johnson L.V., Walsh M.L., Bockus B.J., Chen L.B. Monitoring of relative mitochondrial membrane potential in living cell by fluorescence microscopy/ J. Cell Biol. 1981, v. 88, p. 526-535.

147. Katsura K., Kristian Т., Siesjo B.K. Energy metabolism, ion homeostasis, and cell damage in the brain./ Biochem. Soc. Trans. 1994, v. 22, N4, p. 991-996.

148. Kato H., Kogure K., Araki Т., Itoyama Y. Induction of Jun-like immunoreactivity in astrocytes in gerbil hippocampus with ischemic tolerance./Neurosci. Lett. 1995, v. 189, N1, p. 13-16.

149. Khaspekov L., Shambo M., Victorov I., Wieloch I. Sublethal in vitro glucose-oxygen deprivation protects cultured hippocampal neurons against a subsequent severe insult./NeuroReport. 1998, v. 9, p. 1273-1276.

150. Keilhoff G., Erdo S.L. Parallel development of excitotoxic vulnerability to N-metyl-D-aspartate and kainite in dispersed cultures of the rat cerebral cortex./ Neuroscie. 1991, v. 43, N1, p. 35-40.290

151. Kemp J.A., Foster A.C., Wong E.H.F. Non-competitive antagonists of excitatory amino acid receptors./ Trends in Neurosci. 1987, v. 10, p. 294298.

152. Kessler M., Baudry M., Lynch G. Quinoxaline deriva tives are high-affinity antagonists of the NMDA receptor associated glycine sites./ Brain Res. 1989, v.489, N2, p.377-382.

153. Kim S.U. Observations on cerebellar granule cells in tissue culture./Z. Zellforsch. 1970, v. 107, p. 454-456.

154. Ют J.S. Cerebral glutamate, neuroleptic drugs and schizophrenia: Increase of cerebrospinal fluid glutamate levels and decrease of striatal levels following sulpiride treatment in rats./ Eur. Neurol. 1983, v.22, p.367.

155. Krigstein A.R., Dichter M.A. Morphological classification of rat cortical neurons in cell culture. J. Neurosci. 1984, v. 3. p. 1634-1647.

156. Kitagawa K., Matsumoto M., Tagaya M., Hata R., Ueda H., Niinobe M., Handa N., Fukunaga R., Kimura K., Mikoshiba K., et al. 'Ischemic tolerance' phenomenon found in the brain. / Brain. Res. 1990, v. 528, N1, p. 21-24.

157. Kitagawa K., Matsumoto M., Kuwabara K., Tagaya M., Ohtsuki Т., Hata R., Ueda H., Handa N., Kimura K., Kamada T. 'Ischemic tolerance' phenomenon detected in various brain regions./ Brain Res. 1991, v. 561, N2, p. 203-211.291

158. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis./ Science. 1997, v. 275, N5303, p. 1132-1136.

159. Kobayashi T. The roles of mitochondrial permeability transition in brain ischemia./Hokkaido Igaku Zasshi. 2000, v. 75, N4, p. 243-252

160. Koch R.A., Barish M.E. Perturbation of intracellular calcium and hydrogen ion regulation in cultured mouse hippocampal neurons by reduction of the sodium ion concentration gradient./ J. Neurosci. 1994, v. 14, p. 2585-93.

161. Krell H., Tafler M., Blaich G., PfaffE. On the state of calcium ions in isolated rat liver mitochondria. I. Ion fluxes and volume changes upon Ca2+ uptake under various ionic conditions./ Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem. 1984, v. 365, p. 59-71

162. Krippner A., Matsuno-Yagi A., Gottlieb R. A., Babior В. M. Loss of function of cytochrome с in Jurkat cells undergoing fas- mediated apoptosis/. J.Biol.Chem. 1996, v. 271, p. 21629-21636.

163. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. Mitochondrial control of apoptosis./Immunol.Today. 1997, v. 18, p. 44-51.292

164. Kudo Y., Ogura A. Glutamate-induced increase in intracellular Ca2+ concentration in isolated hippocampal neurons./ Br. J. Pharmacol. 1986, v. 89, p. 191-198.

165. Kurth M.C., Weiss J. H. and Choi D. W. Relationship between glutamate-induced 45Ca influx and resultant neuronal injury in cultured cortical neurons./Neurology. 1989, v. 39, p. 217.

166. Labruyere J., Fuller T.A., Olney J.W., Price M.T., Zorumski C., Clifford D. Phencyclidine and ketamine protect against kainic acid-induced seizures and seizure-related brain damage./ Neurosci. Abstr. 1986, v. 12, p. 344.

167. Lafon-Casal M., Pietri S., Culcasi M. and Bockaert J. NMDA-dependent superoxide production and neurotoxicity./ Letters to Nature. 1993, v. 364, p. 535-536.

168. Lapidus R. G., Sokolove P. M. Spermine inhibition of the permeability transition of isolated rat liver mitochondria: an investigation of mechanism./ Arch.Biochem.Biophys 1993, v. 306, p. 246-253.

169. Lehninger A. Water uptake and extrusion by mitochondria in relation to oxidative phosphorilation./ Physiol.Rev.1962, v. 42, p. 467-517.293

170. Lees G.J., Leong W. Interactions between excitotoxins and the Na+/K+-ATPase inhibitor ouabain in causing neuronal lesions in the rat hippocampus./Brain Res. 1996, v. 714, N1-2, p. 145-155.

171. Letourneau P.C. Possible roles for cell-to-substratum adhesion in neuronal morphogenesis./ Develop. Biol., 1975, v. 44, p. 77-91.

172. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons./ Physiol Rev. 1999, v. 79, N4, p. 1431-1568.

173. Liu C., Shen K., Liu Z., Noguchi C.T. Regulated human erythropoietin receptor expression in mouse brain. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 3239532400.

174. Liu X., Kim C. N., Yang J., Jemmerson R., Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome с./ Cell, 1996, v. 86, p. 147-157.

175. Liu C., Shen K., Liu Z., Noguchi C.T. Regulated human erythropoietin receptor expression in mouse brain./ J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 3239532400.

176. Lu G.W., Liu H.Y. Downregulation of nitric oxide in the brain of mice during their hypoxic preconditioning./ J. App.l Physiol. 2001,v, 91, N3, p. 1193-1198.294

177. Lucas D.R., Newhouse J.P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina./Arch. Ophtalmol. 1957, v. 58, p. 193-201.

178. Lynch G. Synapses, Circuits and the Begginings of Memory./ MIT Press, Cambridge, MA, 1986.

179. Lysenko А.У., Uskova N.I., Ostrovskaia R.U., Gudasheva T.A., Voronina ТА. Dipeptide nootropic agent GVS-111 prevents accumulation of the lipid peroxidation products during immobilization. / Eksp. Klin. Farmakol. 1997, v. 60, N5, p. 15-28.

180. Lytton J., Nigarn S.K. Intracellular calcium: molecules and pools./ Curr Opin. Cell Biol., 1992, v. 4, N2, p. 220-226.

181. MacDermott A.B., Mayer М.1., Westbrook G.L., Smith S.J. and Barker J.L./Nature. 1986, v. 321, p. 519-522.

182. Mahadik S.B., Karpiak S.E. Gangliosides in treatment of neuronal injury and disease./ Drug Dev. Res. 1988, v. 15, p.337-360.

183. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca2+ influx elicited by glutamate: role in neuronal death./ Mol. Pharmacol. 1989, v. 36, N1, p. 106-112.

184. Manev H., Costa E., Wroblewski J.T., Guidotti A. Abusive stimulation of excitatory amino acid receptors: a strategy to limit neurotoxicity./FASEB J. 1990, v.4, p. 2789-2797.

185. Marti H.H., Wenger R.H., Rivas L.A., Straumann U., Digicaylioglu M., Henn V., Yonekawa Y., Bauer C., Gassmann M. Erythropoietin gene expression in human, monkey and murine brain./ Eur. J. Neurosci. 1996, v. 8, p. 666-676.

186. Masuda S., Okano M., Yamagishi K., Nagao M., Ueda M., Sasaki R. A novel site of erythropoietin production. Oxygen-dependent production in cultured rat astrocytes./ J. Biol. Chem. 1994, v. 269, p. 19488-19493.

187. Masada Т., Xi G., Hua Y., Keep R.F. The effects of thrombin preconditioning on focal cerebral ischemia in rats./ Brain Res. 2000, v. 867, N1-2, p. 173-179.

188. Marota J.J., Crosby G., Uhl G.R: Selective effects of pentobarbital and halothane on c-fos and jun-B gene expression in rat brain./ Anesthesiology, 1992; v. 77, p. 365-371.

189. Martin R.L., Lloyd H.G., Cowan A.I. The early events of oxygen and glucose deprivation: setting the scene for neuronal death?/ Trends Neurosci. 1994, v. 17(6), p. 251-257.

190. Mattson M.P. Antigenic changes similar to those seen in neurofibrillary tangles are elicited by glutamate and Ca2+ influx in cultured hippocampal neurons./Neuron. 1990, v. 4, N1, p. 105-117.

191. Mattson M.P., Zhang Y., Bose S. Growth factors prevent mitochondrial dysfunction, loss of calcium homeostasis, and cell injury, but not ATP depletion in hippocampal neurons deprived of glucose./ Experimental neurology. 1993, v. 121, p. 1-13.

192. Maulucci-Gedde M. and Choi D.W. Cortical neurons exposed to glutamate rapidly leak preloaded 51chromium./ Exp. Neurol. 1987, v. 96, p. 420-429.

193. McCaslin P.P., Morgan W.W. Cultured cerebellar cells as an in vitro model of excitatory amino acid receptor function./ Brain Res. 1987, v. 417, p. 380-384.297

194. McPherson P.S, Kim Y.K, Valdivia H., Knudson C.M., Takekura H., Franzini-Armstrong C., Coronado R., Campbell K.P. The brain ryanodine receptor: a caffeine-sensitive calcium release channel./ Neuron, 1991, v. 7, N1, p. 17-25.

195. Meldrum B. Excitatory amino acids and anoxic/is chaemic brain damage./ Trends Neurosci. 1985, v. 8, N2, p. 47-48.

196. Messer A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture./ Brain Res. 1977, v 130, p. 1-12.

197. Messer A., Smith D.M. In vitro behavior of granule cell from staggeres and weaver mutant of mice./ Brain Res., 1977, v. 130, p. 13-23.

198. Michaels R.L., Rothman S.M. Glutamate neuro toxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations./J. Neurosci. 1990, v. 10, N11, p. 283-292.

199. Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ homeostasis. / Prog. Neurobiol. 1991, v. 37, N3, p. 255-285.298

200. Miller В., Sarantis т., Traynelis F.S. and Attwell D. Potentiation of NMDA receptor currents by arachidonic acid./ Nature. 1992, v. 355, p. 722725.

201. Moore C.L. Specific inhibition of mitochondrial calcium transport by ruthenium red./ Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971, v. 42, p. 298-305.

202. Mori Т., Muramatsu H., Matsui Т., McKee A., Asano T.Possible role of the superoxide anion in the development of neuronal tolerance following ischaemic preconditioning in rats./Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2000, v. 26, N1, p. 31-40.

203. Morris R.G., Anderson E., Lynch G.S., Baudry M.Selective impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist AP5./Nature. 1986, v. 319, p. 774776.

204. Murphy S.N., Thayer S. A. and Miller R.J. The effects of excitatory amino acids on intracellular calcium in single mouse striatal neorons in vitro./J. Neurosci. 1987, v. 7, p. 4145-4158.

205. Murphy Т.Н., Malouf A.T., Sastre A., Schnaar R. L. and Coyle J.T. Calcium-dependent glutamate cytotoxicity in a neuronal cell line./ Brain Res. 1988, v. 444, p. 325-332.299

206. Murphy Т.Н., Mixamoto M., Sastre A., Schnaar R.L., Coyle J. Glutamate toxicity in neuronal cell line involves inhibition of cystine transport leading to oxidative stress./Neuron. 1989, v. 2, p. 1547-1558.

207. Murphy M.P. Nitric oxide and cell death./ Biochimica et Biophysica Acta. 1999, v. 1411, p. 401-414.

208. Nagafuji Т., Koide Т., Takato M. Neurochemical correlates of selective neuronal loss following cereberal ischemia: role of decreased Na+,K+- ATPase activity ./Brain Res. 1992, v. 571, p. 265-267.

209. Nakagawa I., Nakase H., Aketa S., Kamada Y., Yamashita M., Sakaki T. ATP-dependent potassium channel mediates neuroprotection by chemical preconditioning with 3-nitropropionic acid in gerbil hippocampus./ Neurosci. Lett. 2002; v. 320, N1-2, p. 33-36.

210. Nakase H., Heimann A., Uranishi R., Riepe M.W., Kempski O.Early-onset tolerance in rat global cerebral ischemia induced by a mitochondrial inhibitor./Neurosc. Lett. 2000, v. 290, N2, p. 105-108.

211. Nandagopal K., Dawson T.M., Dawson V.L.Critical role for nitric oxide signaling in cardiac and neuronal ischemic preconditioning and tolerance./ J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, v. 297, N2, p. 474-478.300

212. Newberg L.A., Milde J.H., Michenfelder J.D: The cerebral metabolic effects of isoflurane at and above concentrations that suppress cortical electrical activity./ Anesthesiology, 1983, v. 59, p. 23-28.

213. Newcomb R., Sun X.,Taylor L., Curthoys N., Giffard R.G. Increased production of extracellular glutamate by the mitochondrial glutaminase following neuronal death./ J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 11276-11282.

214. Nicholls D., Akerman K. Mitochondrial calcium transport./ Biochim. Biophys. Acta. 1982, v. 683, N1, p. 57-88.

215. Nicholls D.G., Scott I.D. The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport. The role of ATP in the discrimination between kinetic and membrane-potential-dependent calcium-ion efflux mechanisms./ Biochem. J. 1980, v. 186, N3, p. 833-839.

216. Novgorodov S. A., Gudz' Т. I., Zorov D. B. Kushnareva I., Kudriashov I. The effect of cyclosporin A and oligomycin on the nonspecific permeability of the mitochondria inner membrane./ Biokhimiia. 1991., v. 56, p. 529-535.301

217. Novgorodov S. A., Gudz Т. I., Kushnareva Y. E., Zorov D. В., Kudrjasliov Y. B. Effect of cyclosporine A and oligomycin on non-specific permeability of the inner mitochondrial membrane./ FEBS Lett., 1993, v. 270, p. 108-110.

218. Ogura A., Miyamoto M., Kudo Y. Neuronal death in vitro: parallelism between survivability of hippocampal neurons and sustained elevation of cytosolic Ca2+ after ex posure to glutamate receptor agonists./ Exp. Brain Res. 1988, v. 73, p. 447-458.

219. Ohtsuki Т., Matsumoto M., Kuwabara K., Kitagawa K., Suzuki K., Taniguchi N., Kamada T. Influence of oxidative stress on induced tolerance to ischemia in gerbil hippocampal neurons./ Brain Res. 1992, v. 599, N2, p. 246-252.

220. Oka M., Itoh Y., Ukai Y. Involvement of Na+ and Ca2+ channel activation and resultant nitric oxide synthesis in glutamate-mediated hypoxic injury in rat cerebro./ Life Sci. 2000, v. 67, p. 2331-2343.

221. Olney J.W. Brain lesions, obesity and other dis turbances in mice treated with monosodium glutamate./ Science. 1969, v. 164, p. 719-721.

222. Olney J.W. Neurotoxicity of excitatory amino acids./In: Kainic Acid as a Tool in Neurobiology. Eds. McGeer et al., N.-Y., Raven Press. 1978, p. 95-121.302

223. Olney J.W. Excitotoxic amino acids and Huntington's disease./ In: Advances of Neurology, Huntington's Disease, v. 23. Eds. Chase T.A., Wexler A., Bar bean A. N.-Y., Raven Press. 1979, p. 609-624.

224. Olney J.W. Excitatory transmitters and neurop sychiatric disorders.An: Neurobiolody of Amino Acids, Pep tides and Trophic Factors. Eds. Frendelli J.A., Collins R.C., Johnson E.M. Kluwer Acad. Publishers. 1988, p. 51-61.

225. Olney J.W., de Gubareff Т., Labruyere J. -aminoadipate blocks the neurotoxic action of N-methylaspartate./Life Sci. 1979, v.25, p. 537-540.

226. Olney J.W., de Gubareff Т., Sloviter R.S. "Epileptic" brain damage in rats induced by sustained electrical stimulation of the perphorant path. II Ultrastructural analysis of acute hippocampal pathology./ Brain Res. Bull. 1983, v. 10, p. 699-712.

227. Olney J.W., Ho Oi Lan, Rliee V. Cytotoxic effects of acidic and sulphur containing amino acids on the infant mouse central nervous system./ Exp. Brain Res. 1971, v.14, p. 61-76.

228. Olney J.W., Labruyere J., Price M.L. Pathological changes induced in cerebrocortical neurons by phencyclidine and related drugs./Science. 1989, v. 244, p. 1360-1362.

229. Olej В., dos Santos N.F., Leal L., Rumjanek V.M. Ouabain induces apoptosis on PHA-activated lymphocytes./ Biosci Rep. 1998, v. 18, N1, p. 1-7.303

230. Orlov S.N., Thorin-Trescases N., Kotelevtsev S. V., Tremblay J., Hamet P. Inversion of the intracellular Na+/K> ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3./ J. Biol. Chem.1999, v. 274, N23, p. 16545-10552.

231. Orlov S.N., Taurin S., Thorin-Trescases N., DulinN.O., Tremblay J., Hamet P.Inversion of the intracellular Na(+)/K(+) ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle cells by induction of RNA synthesis./ Hypertension.2000, v. 35, N5, p. 1062-1068.

232. Quinlan J.J., Firestone S., Firestone L.L: Isoflurane's enhancement of chloride flux through rat brain y-aminobutyric acid type A receptors is stereoselective./ Anesthesiology, 1995; v. 83, p. 611-615

233. Patel J.B., Ross L.E., Duncan В., Asiz M., Salama A.I., Valerio M. Administration of glycine antagonists, HA-966 and 7-chlorokynurenic acid reduce ischemic brain damage in gerbils./Soc. Neurosci. Abstr. 1989, v. 15, p. 43.304

234. Patel P.M., Drummond J.C., Cole D.J., Goskowicz R.L: Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to fore-brain ischemia. Anesthesiology. 1995, v. 82, p. 996-1003.

235. Paul L.A., Scheibel A.B. Structural substrates of epilepsy./ Adv. Neurol. 1986, v. 44, p. 775-786.

236. Petronilli V., Cola C., Massari S., Colonna R., Bernardi P. Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A-sensitive permeability transition pore of mitochondria./ J.Biol.Chem., 1993, v. 268, p. 21939-21945.

237. Petronilli V., Nicolli A., Costantini P., Colonna R., Bernardi P. Regulation of the permeability transition pore a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. / Biochim.Biophys.Acta. 1994, v. 1187, p. 255-259.

238. Pfeiffer D. R., Kauffman R. F., Lardy H. A. Effects of N-ethylmaleimide on the limited uptake of Ca2+, Mn2+, and Sr2+ by rat liver mitochondria./J.Biol.Chem. 1978, v. 253, p. 4165-4171.

239. Pfeiffer D. R., Schmid P. C., Beatrice M. C., Schmid H. H. Intramitochondrial phospholipase activity and the effects of Ca2+ plus N305ethylmaleimide on mitochondrial function./ J.Biol.Chem.,1979, v., 254, p. 11485-11494.

240. Pinelis V.G., Segal M., Greeberger В., Khodorov B.I. Changes in cytosolic sodium by a toxic glutamate treatment of cultured hippocampal neurons./ Biochemistry and molecular biology international. 1994, v. 32, p. 475-481.

241. Plaitakis A., Caroscio J.T. Abnormal glutamate metabolism in amiotrophic lateral sclerosis./Ann. Neurol. 1987, v.22, p. 575-579.

242. Pomerat C.M., Costero I. Tissue culture of cat cerebellum./ Amer. J. Anat. 1956, v. 99, p. 211-247.

243. Privat A., Drian M. J., Mandon P. The outgrowth of rat cerebellum in organized culture./ Z. Zellforsch.1973, v. 153, p. 291-307.

244. Privat A. In vitro models of neural growth and differentiation. Development and Cemical Specificity of Neurons. Progress in Brain Research. Ed. by M.Cuenod, G.W.Kretzberg, F.E.Bloom./ Amsterdam: Elsevier, 1979, v. 51, p. 335-356.

245. Pylova S.I., Majkowska J., Hilgier W., Kapuscinski A., Aldrecht J. Rapid decrease of high affinity ouabain binding sites in hippocampal CA1306region following short-term global cerebral ischemia in rat./Brain Res. 1989, v. 490, p.170-173.

246. Rajdev S. and Reynolds I.J. Glutamate-induced intracellular calcium changes and neurotoxicity in cortical neurons in vitro: Effect of chemical ischemia./ Neuroscience. 1994, v. 62, N 3, p. 667-679.

247. Reshef A., Capua N.D., Sperling O., Zoref-Shani E. Ischemic tolerance conferred to cultured rat neurons by heat shock is not mediated by opening of adenosine triphosphate-sensitive potassium channels./ Neurosci. Lett. 2000 a, v. 287, N3, p. 223-226.

248. Reshef A., Sperling O., Zoref-Shani E. Opening of K(ATP) channels is mandatory for acquisition of ischemic tolerance by adenosine./ Neuroreport. 2000 b, v. 11, N3, p. 463-465.

249. Reshef A., Sperling O., Zoref-Shani E. The adenosine-induced mechanism for the acquisition of ischemic tolerance in primary rat neuronal cultures./ Pharmaco.l Ther. 2000 c, v. 87, N2-3, p. 151-159.

250. Reshef A., Sperling O., Zoref-Shani E. Opening of ATP-sensitive potassium channels by cromakalim confers tolerance against chemical ischemia in rat neuronal cultures./ Neurosci. Lett. 1998, v. 250, N2, p. 111114.

251. Reynolds I.J. and Hastings T.G. Glutamate induces the production of oxygen species in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation./ The Journal of Neuroscience. 1995, v. 15, p. 3318-3327.307

252. Richelmi P., Mirabelli F., Salis A.,Finardi G., Berte F., Bellomo G. Onл Ithe role of mitochondria in cell injury caused by vanadate-induced Ca overload./Toxicology. 1989, v. 57, p. 29-44.

253. Rigobello M. P., Toninello A., Siliprandi D., Bindoli A. Effect of spermine on mitochondrial glutathione release./ Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, v. 194, p. 1276-1281.

254. Riepe M.W., Nakase H., Esclaire F., Kasischke K., Schreiber S., Ludolph A.C., Dirnagl U. Chemical preconditioning a novel neuroprotective strategy. In: 1 Kongress der Neurowissenschaftlichen Gesellschaft in Berlin. 1996, p. 182.

255. Riley W. W. Jr., Pfeiffer D. R. Relationships between Ca2+ release, Ca2+ cycling, and Ca2+~mediated permeability changes in mitochondria./ J.Biol.Chem. 1985, v. 260, p. 12416-12425.

256. Rolfe D. F., Brand M. D. The physiological significance of mitochondrial proton leak in animal cells and tissues./ Biosci.Rep. 1997, v. 17, p. 9-16.

257. Rose K., Bruno V. M. G., Oliker R., and Choi D.W. Nordiliydroguaiaretic acid (NDGA) attenuates slow exitatory amino acid308induced neuronal degeneration in cortical cultures./ Soc. Neurosci. Abstr. 1990, v. 16, p. 288.

258. Rose K., Liu D. and Choi D.W. Nitric oxide synthase activation or cystine depletion may not be critical to NMDA receptor-mediated injury in murine cortical cultures./ Soc. Neurosci. Abstr. 1992, v. 18, p. 645.

259. Rothman S.M. Synaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death./J. Neurosci. 1984, v. 4, p. 1884-1891.

260. Rothman S.M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx./J. Neurosci. 1985, v. 5, p. 1483-1489.

261. Rothman S., Olney J.W. Glutamate and the pathophysiology of hypoxic ischemic brain damage./Ann. Rev. Neurol. 1986, v. 19, p. 105-111.

262. Rothman S.M., Olney J.W. Excitotoxicity and the NMDA receptor./Trends in Neurosci. 1987, v. 10, N7, p. 299- 302.

263. Rothwell N.J., Hopkins S.J. Cytokines and the nervous system II: Actions and mechanisms of action./ Trends Neurosci. 1995, v. 18,N3, p. 130-136.

264. Ryffel В., Donatsch P., Gotz U., Tschopp M. Cyclosporin receptor on mouse lymphocytes./ Immunology. 1980, v. 41, p. 913-919.

265. Sakanaka M., Wen T.C., Matsuda S., Masuda S., Morishita E., Nagao M., Sasaki R. In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, v. 98, N8, 4635-4640.309

266. Sakaki Т., Yamada К., Otsuki H., Yuguchi Т., Kohmura E., Hayakawa T. Brief exposure to hypoxia induces bFGF mRNA and protein and protects rat cortical neurons from prolonged hypoxic stress/ Neurosci Res. 1995, v. 23, N3, p. 289-296.

267. Samali A., Cai J., Zhivotovsky В., Jones D. P., Orrenius S. Presence of a pre-apoptotic complex of pro-caspase-3, Hsp60 and HsplO in the mitochondrial fraction of jurkat cells./ EMBO J. 1999, v. 18, p. 2040-2048.

268. Satoh Т., Enokido Y., Kubo Т., Yamada M., Hatanaka H. Oxygen toxicity induces apoptosis in neuronal cells/ Cell. Mol. Neurobiol. 1998, v. 18, p. 649-666.

269. Sandberg M., Butcher S.P., Hagberg H. Extracellular overflow of neuroactive amino acids during severe insulin-induced hypoglycemia: in vivo dyalisis of the rat hippocampus./J. Neurochem. 1986, v. 47, p. 178184.

270. Schulze-Osthoff K., Krammer P. H., Droge W. Divergent signalling via APO-l/Fas and the TNF receptor, two homologous molecules involved in physiological cell death./ EMBO J. 1994, v. 13, p. 4587-4596.

271. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.C., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity./The J. of Neuroscience. 1996, v. 16, p. 6125-6133.

272. Schurr A., Payne R.S., Tseng M.T., Gozal E., Gozal D. Excitotoxic preconditioning elicited by both glutamate and hypoxia and abolished by lactate transport inhibition in rat hippocampal slices./ Neurosci. Lett. 2001, v. 307, N3, p. 151-154.310

273. Sciamanna M.A., Zinkel J., Fabi A.Y., Lee C.P. Ischemic injury to rat forebrain mitochondria and cellular calcium homeostasis./ Biochim. Biophys. Acta. 1992, p. 1134(3), p. 223-232.

274. Seil F.J., Herndon R.M. Cerebellar granule cells in vitro a light and elektron microscope study./ J. Cell Biol., 1970, v. 45, p. 212- 220.

275. Semenza G.L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia./ J. Appl. Physiol. 2000, v. 88, p. 1474-1480.

276. Sengpiel В., Preis E., Kriglstein J., Prelm J.H. NMDA induced superoxide production and neurotoxicity in cultured rat hippocampal neurons: role of mitochondria./Eur. J. Neurosci., 1998, v. 10, p. 1903-1910.

277. Seredenin S.V., Voronina T.A., Gudasheva T.A., et al. / Biologically active N-acylprolyl-dipeptide having antiamnestic, antihypoxic and anorexigenic effects./ United States Patent No. 5,439,930.

278. Sheardown M.J., Nielsen E., Hansen A. J., Jacobsen P., Honore T. 2,3-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo-(F) quinoxaline: a neuroprotectant for cerebral ischemia./Science. 1990, v. 247, p. 571-574.

279. Shepherd G.M. The Synaptic Organization of the Brain./New York, Oxford, Oxford Univ. Press, 1979.

280. Siesjo B.K. Calcium, ischemia and death of braincells./In: Calcium Antagonists. Eds. Vanhoutte P.M., Paoletti R., Govoni S. Ann. New-York Acad. Sci. USA. 1988, v. 522, p. 638-661.

281. Siesjo B.K., Bengtsson F. Calcium fluxes, calcium antagonists and calcium-related pathology in brain ischemia, hypoglycemia and spreading depression: a unifying hypothesis./J. Cerebr. Blood Flow Metab. 1989, v. 9, p. 127- 140.

282. Silverstein F.S., Buchanan K., Johnston M.V. Perinatal hypoxia-ischemia disrupts high-affinity 3H.-glutamate uptake into synaptosomes./J. Neurochem. 1986, v. 47, p. 1614-1619.

283. Simchowitz L., Cragoe E.J. Inhibition of chemotactic factor-activated Na+/H+ exchange in human neutrophils by analogues of amiloride: structure activity relationships in the amiloride series./Mol. Pharmacol. 1986, v. 30, p. 112-120.

284. Simon R.P., Swan J.H., Griffiths Т., Meldrum B.S. Blockade of N-methyl-D-aspartate receptors may protect agains ischemic damage in the brain./Science. 1984, v. 226, p. 850-852.

285. Simpson P.B., Challiss R.A., Nahorski S.R. Neuronal Ca2+ stores: activation and function./ Trends Neurosci. 1995, v. 18, N7, p. 299-306.312

286. Sinor A.D., Greenberg D.A. Erythropoietin protects cultured cortical neurons, but not astroglia, from hypoxia and AMPA toxicity./ Neurosci. Lett .2000, v. 290, p. 213-215.

287. Skaper S.D., Facci L., Milani D., Leon A. Monosialo-ganglioside GM1 protects against anoxia-induced neuronal death in vitro./Exp. Neurol. 1989, v.106, p.297- 305

288. Skulachev V. P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants./ Q.Rev.Biophys. 1996, v. 29, p. 169-202.

289. Skulachev V. P. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide- producing mitochondria and cell./ FEBS Lett. 1996, v. 397, p. 7-10.

290. Skulachev V. P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics./Biochim.Biophys.Acta. 1998, v. 1363, p. 100-124.

291. Sladeczek F., Pin J.P., Recasens M., Bockaert J., Weiss S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurons./ Nature. 1985, v. 317, p. 717-719.

292. Snajdrova L., Xu A., Narayanan, N. Clotrimazole, an antimycotic drug, inhibits the sarcoplasmic reticulum calcium pump and contractile function in heart muscle./ J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 28032-28039.313

293. Sokolove P. M., Haley L. M. Butylated hydroxytoluene and inorganic phosphate plus Ca2+ increase mitochondrial permeability via mutually exclusive mechanisms./ J. Bioenerg. Biomembr. 1996, v. 28, p. 199-206.

294. Sokolove P. M., Kinnally K. W. A mitochondrial signal peptide from Neurospora crassa increases the permeability of isolated rat liver mitochondria./ Arch.Biochem.Biophys. 1996, v. 336, p. 69-76.

295. Stone T.W. Glutamate as the neurotransmitter of cerebellar granule cells in the rat: electrophysiological evidence./Br. J. Pharmacol. 1979, v. 66, p. 291-296.

296. Shuaib A., Murabit M., Kanthan R., Howlett W., Wishart T: The neuroprotective effects of gamma-vinyl GABA in transient global ischemia: A morphological study with early and delayed evaluations. Neurosci Lett., 1996; v. 204, p. 1-4.

297. Susin S.A., Zamzami N., Castedo M., Hirsch Т., Marchetti P., Macho A., Daugas E., Geuskens M., Kroemer G. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease./ J. Exp. Med. 1996, v. 184, N4, p. 1331-1341.

298. Sugawara Т., Noshita N., Lewen A., Kim G. W., Chan P.H. Neuronal expression of the DNA repair protein Ku 70 after ischemic preconditioning corresponds to tolerance to global cerebral ischemia./ Stroke. 2001, v. 32, N 10, p. 2388-2393.

299. Sugino Т., Nozaki K., Takagi Y., Hashimoto N. 3-Nitropropionic acid induces ischemic tolerance in gerbil hippocampus in vivo. Neurosci. Lett. 1999, v. 259, N1, p. 9-12.

300. Szabo I., Zorati M. The mitochondrial megachannel is the perability transition pore./ J. of bioenergetics and biomembranes, 1992, v. 24, N1, p. 111-117.

301. Szabo I., Bernardi P., Zoratti M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons./ J.Biol.Chem. 1992a, v. 267, p. 2940-2946.

302. Szabo I., Zoratti M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore./ J.Bioenerg.Biomembr. 1992b, v. 24, p.l 11117.

303. Szatkowski M., Barbour В., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. / Nature. 1990, v. 348, N6300, p. 443-446.315

304. Taga К., Patel P.M., Drummond J.C., Cole D.J., Kelly P.J. Transient neuronal depolarization induces tolerance to subsequent forebrain ischemia in rats./ Anesthesiology. 1997, v. 87, N4, p. 918-925.

305. Takahashi N., Hayano Т., Suzuki M. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase is the cyclosporin A-binding protein cyclophilin./ Nature. 1989, v. 337, p. 473-475.

306. Takayama K., Suzuki Т., Miura M: The comparison of effects of various anesthetics on expression of Fos protein in the rat brain./ Neurosci Lett. 1994, v. 173, p. 59-62

307. Tassani V., Biban C., Toninello A., Siliprandi D. Inhibition of mitochondrial penneability transition by polyamines and magnesium: importance of the number and distribution of electric charges./ Biochem.Biophys.Res.Commun. 1995, v. 207, p. 661-667.

308. Tauskela J.S., Comas Т., Hewitt K., Monette R., Paris J., Hogan M., Morley P. Cross-tolerance to otherwise lethal N-metliyl-D-aspartate and oxygen-glucose deprivation in preconditioned cortical cultures./ Neuroscience. 2001, v. 107, N4, p. 571-584.

309. Tsacopoulos M., Magistretti P.J. Metabolic coupling between glia and neurons./ J. Neurosci. 1996, v. 16, N3, p. 877-885.316

310. Toninello A., Siliprandi D., Siliprandi N. On the mechanism by which and adenine nucleotides restore membrane potential in rat livermitochondria deenergized by Ca2+ and phosphate./ Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, v. Ill, p. 792-797.

311. Turski L., Turski W.A. Towards an understanding of the role of glutamate in neurodegenerative disorders: energy metabolism and neuropathology./Experientia. 1993, v. 49, N12, p. 1064-1072.

312. Valkina O.N., Vergun O.V., Turovetsky V.B., Khodorov B.I. Effects of repetitive stimulation, veratridine and ouabain on cytoplasmic pH in frog nerve fibre: role of internal Na+./FEBS, 1993, v. 334. N 1, p. 83-85.

313. Varming Т., Drejer J., Frandsen A., Schousboe A. Characterization of a chemical anoxia model in cerebellar granule neurons using sodium azide: protection by nifedipine and MK-801./ J. Neurosci. Res. 1996, v. 44, N1, p. 40-46.

314. Vanden Bossche H., Marichal P., Gorrens J., Coene M.C., Willemsens G., Bellens D., Roels I., Moereels H. ,Janssen, P.A. Biochemical approaches to selective antifungal activity. Focus on azole antifungals./Mycoses. 1989, v. 32, p. 35-52.

315. Vercesi A. E., Ferraz V. L., Macedo D. V., Fiskum G. Ca2+-dependent NAD(P)+-induced alterations of rat liver and hepatoma mitochondrial membrane permeability./ Biochem.Biophys.Res.Commun. 1998, v. 154, p. 934-941.

316. Vigne P., Frelin C., Cragoe E., Lazdunski M. Ethyl-isopropyl-amiloride: a new and highly potent derivative of amiloride for the inhibition317of the Na+/H+ exchange system in various cell types./ Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1983, v. 116, p. 86-90.

317. Volterra A.V., Trotti D., Tromba C., Floridi S. and Racagni G. Glutamate uptake inhibition by oxygen free radicals in rat cortical astrocytes./The J. of Neuroscience. 1994, v. 14, p. 2924-2932.

318. Wachtel H., Turski L. Glutamate: a new target in schizophrenia?/ Trends Pharmacol. Sci. 1990, v. 11, N6, p. 219-220.

319. Wada K., Miyazawa Т., Nomura N., Yano A., Tsuzuki N., Nawashiro H., Shima K. Mn-SOD and Bcl-2 expression after repeated hyperbaric oxygenation./ Acta Neurochir. Suppl. 2000, v. 76, p. 285-290.

320. Wada K., Ito M., Miyazawa Т., Katoh H., Nawashiro H., Shima K., Chigasaki H. Repeated hyperbaric oxygen induces ischemic tolerance in gerbil hippocampus./Brain. Res. 1996, v. 740, N1-2, p. 15-20 .

321. Walev I., Reske K., Palmer M., Yaleva A., Bhakdi S. Potassium-inhibited processing of IL-1 beta in human monocytes./ EMBO J. 1995, v. 14, N8, p. 1607-1614.

322. Wang G.L., Semenza G.L. Desferrioxamine induces erythropoietin gene expression and hypoxia-inducible factor 1 DNA-binding activity: implications for models of hypoxia signal transduction./ Blood. 1993, v. 82, N12, p. 3610-3615.

323. Wang G.I., Randall R.D., Thayer S.A. Glutamate-induced intracellular acidification of cultured hippocampal neurons demonstrates altered energy318metaboism resulting from Ca2+ loads. / J. Neurophysioll. 1994, v. 72, N 6, p. 2563-2569.

324. Watkins J.C. Excitatory amino acids./In: Kainic Acid as a Tool in Neurobiology. Eds. McGeer E., Olney J.W., McGeer P. New-York, Raven Press. 1978, p. 37-69.

325. Watkins J.C., Olverman H.J. Agonists and an tagonists for excitatory amino acid receptors./Trends in Neurosci. 1987, v. 10, p. 265-272.

326. Watkins J.C., Krogsgaard-Larsen P. and Honore T. Structure-activity relationships in the development of excitatory amino acid receptor agonists and competitive antagonists. /Treds Pharmacol. Sci. 1990, v. 11, p. 25-33.

327. Weih M., Prass K., Ruscher K., Trendelenburg G., Dirnagl U., Riepe M.W., Meisel A. Ischemia tolerance; model for research, hope for clinical practice?./Nervenarzt. 2001, v. 72, N.4, p. 255-260.

328. Weiss J., Goldberg M.P., Choi D.W. Ketamine protects cultured neocortical neurons from hypoxic injury./ Brain Res. 1986, v. 380, p. 186190.319

329. White R.J.and Reynolds I.J. Mitochondria and Na+/Ca2+ exchange buffer glutamate-induced calcium loads in cultured cortical neurons./ The Journal of Neuroscience. 1995, v. 15, p. 1318-1328.

330. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondrial depolarization in glutamate-stimulated neurons: an early signal specific to excitotoxin exposure./ J. Neurosci. 1996, v. 16, N18, p. 5688-5697.

331. Wolf M.K. Differentiation of neuronal types and synapses in myelinating cultures of mouse cerebellum./ J. Cell Biol., 1964, v. 22, p. 259279.

332. Wolf M.K., Dubois-Dalcq M. Anatomynof cultured mouse cerebellum. 1. Goldi and electron microscopic demonstration of granule cells, their afferent and efferent synapses./ J. сотр. Neurol., 1970, v. 140, p. 261-280.

333. Wolf G., Keilhoff G. Moderne Aspekte der Epilepsieforschung und ihre Anwendung./Psychiat. Neurol, med. Psychol., Leipzig. 1987, v. 39, p. 662-667.

334. Wolter K. G., Hsu Y. Т., Smith C. L., Nechushtan A., Xi X. G., Youle R. J. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis./ J.Cell Biol. 1997, v. 139, p. 1281-1292.320

335. Wong E.H.F., Kemp J.A., Priestly Т., Knight A.R., Woodruff G., Iversen L.L. The anticonvulsant MK-801 is a potent N-methyl-D-aspartate antagonist./Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986, v. 86, p. 7104-7108.

336. Xie Z., Kometiani P., Liu J., Li J., Shapiro J.I., Askari A. Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes./ J. Biol. Chem. 1999, v. 274, N27, p.19323-19328.

337. Yagita Y., Kitagawa K., Ohtsuki Т., Tanaka S., Hori M., Matsumoto M.Induction of the HSP110/105 family in the rat hippocampus in cerebral ischemia and ischemic tolerance. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001, v. 21, N7, p. 811-819.

338. Yavin L., Yavin E. Synaptogenesis and myelinogenesis in dissociated cerebral cells from rat embryo on poly lysine coated surfaces. Exp. Brain. Res. 1977, v. 29, p. 137-147.

339. Yoon K.-W., Rothman S.M. Adenosine inhibits excitatory but not inhibitory synaptic transmission in the hippocampus./J. Neurosci. 1991, v.l 1, p.1375-1380.

340. Young A.B., Fagg G.E. Excitatory amino acid receptors in the brain: membrane binding and receptor autoradiographic apporaches./TiPS. 1990, v. 11, p.126-133

341. Young A.B., Greenmayer J.T., Penney J.B. Glutamate receptors in Alzheimer's disease ./In: Excitatory Amino Acid Transmission, Eds. Hicks T.P., Lodge D., McLennan H., Alan R. Liss, N.-Y.1991, p.233-240.

342. Yu S.P., Yeh C.H., Sensi S.L., Gwag B.J., Canzoniero L.M., Farhangrazi Z.S., Ying H.S., Tian M., Dugan L.L., Choi D.W. Mediation of neuronal apoptosis by enhancement of outward potassium current. / Science. 1997, v. 278, N5335, p. 114-117.

343. Yu S.P., Yeh C.-H., Strasser U., Tian M., Choi D.W. NMDA receptor-mediated K+ efflux and neuronal apoptosis./ Science. 1999, v. 284, p. 336-339.

344. Yu S.P., Choi D.W., 2000 Yu S.P., Choi D.W.Ions, cell volume, and apoptosis./ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, v. 97, N 17, p. 9360-9362.

345. Zaidan E., Sims N.R. The calcium content of mitochondria from brain subregions following short-term forebrain ischemia and recirculation in the rat./ J. Neurochem. 1994, v. 63, N5, p. 1812-1819.

346. Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Hirsch Т., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. / J. Exp. Med. 1996, v.183, N4, p. 1533-1544.

347. Zhou X., Jiang G., Zhao A., Bondeva Т., Hirszel P., Balla T. Inhibition of Na,K-ATPase activates PI3 kinase and inhibits apoptosis in LLC-PK1 cells./ Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001a, v. 285, N1, p. 46-51.

348. Zhou A.M., Li Q.J., Ghen X.L., Li W.B. Increase in amount and affinity of adenosine receptor in rat hippocampal cellular membranes induced by cerebral ischemic preconditioning and its protective effects on the neurons 2001b, v. 53, N4, p.265-926.

349. Zeevalk G.D., Derr-Yellin E., Nicklas W.J. NMDA receptor involvement in toxicity to dopamine neurons in vitro caused by the succinate dehydrogenase inhibitor 3-nitropropionic acid./ J. Neurochem. 1995, v. 64, N1, p. 455-458.

350. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition./ Biochim.Biophys.Acta. 1995, v. 1241, p. 139-176.

351. Zorov D. B. Mitochondrial damage as a source of diseases and aging: a strategy of how to fight these./ Biochim.Biophys.Acta. 1996, v. 1275, p. 10-15.323

352. Zorov D. В., Krasnikov В. F., Kuzminova A. E., Vysokikh M. Y., Zorova L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria./Biosci.Rep. 1997. v. 17, p. 507-520.

353. Zorov D.B., Kinnally K.W., Tedeschi H. Voltage activation of heart inner mitochondrial membrane channels./J. of Bioenergetics and Biomembranes. 1992, v. 24, N1, p. 119-124.

354. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. An APAF-1 .cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9./

355. J.Biol.Chem. 1999, v. 274, p. 11549-11556.

Информация о работе

Исаев, Николай Константинович
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.25

Диссертация

Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Механизмы повреждения и способы защиты культивированных нейронов головного мозга при действии возбуждающих аминокислот - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы