Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов нейроцитотоксического действия глутамата и его аналогов на культивируемые клетки-зерна мозжечка

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов нейроцитотоксического действия глутамата и его аналогов на культивируемые клетки-зерна мозжечка"

ЮСКОВСКИй ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА ____БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г Б 0 '1 пРавах рукописи

АНДРЕЕВА Надежда Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

ГЛУТАМАТА И ЕГО АНАЛОГОВ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ-ЗЕРНА МОЗЖЕЧКА

Специальность 03.00.11 — эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва —

Работа выполнена в НИИ мозга РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук И. В. ВИКТОРОВ

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, проф. К. С. РАЕВСКИЙ кандидат биологических наук А. С. ХАЛАНСКИИ

Ведущая организация — Российский Университет дружбы на родов

Защита диссертации состоится

в /£~^часов на заседании Специализированного Ученого совет; Д 053.05.68 при Московском государственном университет! им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан «/О» иЦС^СЬ^Л ШЭ^^ода.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Е. Н. КАЛ ИСТРАТОВ/

Заказ 856

Подп. к печ. 1.ХП.94 г. Печ. л. 1 Тираж 10

Типография ВИА

ВВЕДЕНИЕ

Глута»яат яля Ь-глутагшювая кислота является одата из основпнх иейромэдиаторов в шзбуядаЕцнх свдапсах центральной нервной скстекн (ЦНС) позвоночных. Однако прз некоторых патологических состояниях, таких как гипоксия/ ШВвИНЯ, гшюглек6ш1я, бпшюп 1я а ряде других острых и хрогогческнх поражений ЩС, оопровоядаидахся увеличением содержа пня глутамэта в мозге е гшерстимуляцней глутаматяых рецвпторов, sтот кэдаатор а его андргепннэ аналога (L-аспартат, шшалнЕовая ккслота, Н-аце-галаспартилглутамат н др.) шгут оказывать нейротокснчэскоа доЕстож, розультатш которого является острая п "отсроченная" гибель нейронов.

Необходимость выяснения патогенетической роли глутаката л других андргонпш: возбугдащнх ашнокяслот (ВАЧ) в развитая острых и хронических патологических состоящий ЦНС определяло актуальность детального исследования ыохаштазов дэстпуктавннз процессов, происходящих в нейронах под действием токсическжз доз ВИС. Эта исследования предстаалявтся особенно вагами для разработка ттшх фармакологических подходов к создания лекарственных препаратов, способных препятствовать дэструк-тзвнш ЕЗ?знонляа нвВроэов при упоштутах вдаэ заболеваниях. '

Успехи, дрстигвутне в областа нзучегоя механизмов цето-токсического действия ВАК, во многом обусловлены использованием з бтнх экспериментах культур нервных клеток а тканн, а таюш пврегнвакдих срезов мозга, что позволило успешно сочетать шрфолоппемсш, электрофнзпологкческиэ и бнохлиотеские метода исследования мвмбрашнх а внутриклеточных процессов, праводящкх к нэобраташа деструктивным изменениям в нейронах ЦНС.

В настоящее время установлено, что активированию глутакатоа рецептори открывает управляемые ш понныэ каналы, проннпаекие для echob Na+ н Са2+. Деполяризация кекбращг, обусловленная, в первую очередь, входом ионов Na+, приводит' к тому, что Са2+ начинает поступать в клетка тага» я через потенцзалозавзсзвяш Са2+-канаш. Избыточный вход Са2+" расскатриваотся многими исследователями как одна из основных причин "отсроченного" повревдеяия нейронов в результате дьйствия возбуядакда акзжжислот In vitro (Cbol IS85, 1387;

Manev et al. 1989), а такав ара ппюксши, шемии я гипогликемии (диег and Slesjo, 1988; Choi, 1988; Slesjo 1981; Sieajo and Bengtaaon, 1989). Однако, несмотря на достигнутые успеха, гаогив проблемы, касащався клеточных н молвкулярннх неханнзысш яеероцитотокснчвоста ВАК, пока еще аа получала удовлетворительного решения. К числу втих проблем относится вопрос о прачинаж длительного сохранения повышенной концентрации свободного цнтозольного Са2+ ([Са2+11) в нейронах, подвергавшихся кратковременному (в течение нескольких ищут) бездействия глутаиата ала его аналогов. В опытах на культурах кдетдк-гороа иозаечка бшю показано, что вто состояние на может бить устранено ни антагонистами потенцналозависнадх Са2* каналов, lis блока торами глутаматып гацепторов ахи каналов (Напет et al., 1989; Pavaron et al., 1990). Б тех se вссладованяях било показано, что устойчивое пошлю нш> [Са2"% связано с трэнслокащгай протеннкивазы С (ИКС) - фаршнта, известного своей способшстъп фосфорнлнровать в тек. самым коалировать ектгошость различных балков, в той числе, бсз&юю, белков, форыиругщшх вонные каналы а/али »энные обмвшша. К чяслу последних относятся На+/Н+ обаенник. Уснлашш HsVh* обмена, опосредованное активированной ИКС и юяивахщаа повышенна вну уршслэточной концантрацив Na+ ([Ha+Jj) uossT щашэсти к тому, что ¡внутриклеточный Ка+ будет обмакиваться ыа внеклеточный через HaVca2* обиэннвк.

Taicas образоа, последаяЯ кисет слуигть одним вз путей дал входа избыточного Св2* в клеякз в течете постглутанатсого периода. Естественно поэтому баю поставить вопрос о роли На+/Н+ ш havca2* ойейшшков в нэйродеструкппзпкг; процессах, индуцированных кратковременным воздействием глутамата в его йв&аогов.

fence ука откэчалось, что избыточное аакошюнзэ Са2* з клетках В результате длительного воздействия токсических доз ВАК отлог <3атъ причиной гаобратааа деструктивных процессов, К etm процессам, псмвидююау, оттсвтся активация Са2*-баавсвааЯ сфотеаа а лапаз (Cbol, 19®), котор«о йэгут ЕШДУц2роЕс¥ь образования свободой радвхадов к такая образок етщуларовт гэрек&саоз окнсдовет жздв шароаялышх

иембран, что приводит к нарушению целостности этих мембран и гибели нейронов. Поэтому правомврно бшю продполояитъ, что антиоксиданты, в частности а-токоферол, могут оказывать защитный аффект ори повреждении но Яро нов ВАК.

Исходя из указанных быео предполотапий была сформулирована д&^_мстоящвго_иссладовянил, "оторая состояла о изучении ролн мембранных ионнообмеяшга На+/1Г а На+/Са2+ систеа, а такхв значения шэрекасного окяслання лшидов в нэйродаструктввшк процессах, шдуцкруеии ВАК в культивируешь клатаах-зернвх тзквчка.

Задача исследования:

- получение нонослоаннх диссоциированных культур постай-тального нозгечка;

- разработка »»дали отсроченной табели нейронов, щдуцз-рованной глутакатоа я ото аналогака в культурах цлзток-зэрек иозгэчка;

- ассладрванна влития блока тора Яа,+/Т{* обьзвз - этшшзо-проши-анашорада (ВГРА) на отсрочензу® гзбвль культивируем нейронов, шзваняув глутаматоа ала его аналогами, во врэ№1 действия этих ВАК а и постглутвматай пзрссд;

- изучониз эффекта блокада На+/П+ обиекэ с помощьи етааннл р2 нарувного солового раствора во время обработка клзток-ззрвн глутааатоа алг ого аналогов - какааток, а тага» в пос.5-глутаыатнс« периоде;

- исследование влияния на неЗротсксичэский эффект глутаката блокада Ка+/Са2+ обмена с помощьв производных вмалорида -дихлоробензакила (БСВ) и хлоробанзвд-даметялбензамала (СВВКВ), в такзэ с помощьв удаления наругного На+;

- исследование действия лвпофилыагх аятсюксидантов - витамина Е (а-токофврола) н производного шнола (и 18), на отсроченную гибель пеяронов пра нх гюврзвденш аналогом глутакзта -канвовой кислотой.

В?УЗВё8__Ювнзна__иссдв^вадяд определяется рядои внаркш полученных данных. Бита показано, что:

. 51

а) блокада На /Са обмена вызывает резкое усшшнш кэйро-цэтотоксичоского эффекта глутамата;

б) заащтныЯ эф!вкт ЕШ. во время обработка влеток-зерен

козгвчка глутаиатом являемся результатов блокаду ШПА-кашиюв, управляэнгл ШЗА-рецэптореш;

в) блокада Ha+/3f otísaaa с шасяцью ЕГРА а нарутшого ацидоза в течение шстглутаыатного периода привода» к уменьшении Еэароцнтотоксического дь£стаая гдутаиата, что, вероятно, объясняется снвгениам внутряклаточной концэнтрацщ На+ и вггэнскйашцдей йа+-заииснмого вышдвяяя

г) предварительная обработка культнвируешх клэток-зераа ыозвечка лнаофш.нкыи антиоксндантаыа - а-токоферолюи и ÜI8, сникает нэйроцитотоксическнА аффект пакоокоЭ кислот.

Научвскдрактаческая значимость исследования заклхчается в том, что полученвые данные йогу слункть аксдарвнантальнам сбосновашаеи для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать ш предотвращать нэйродогенератввныо шыонення при острых л хронических заболеваниях 1ЩС, связанных о гншрсткауляцкей глутаьштшх рецепторов.

Основные налоаения, вцносшые на защиту

1. Обработка кудьтжвируэьшя клеток-зерен ыозаечка гдутакатоы зла его аналогами активирует Ка4/^ обмен, которой способствует отсроченному зейроцвтотокскческоиу эффекту ВАК, поскольку блокада втого обиаиа с пошцы» с тклазопропал- еыыдорндз, а такав ушренного наружного ацидоза в шстглутаиатшй паркид cnasae? токсическое действие глутааэта.

2. Значительное снкебшю шароцетотохснческого эффекта гдутаиата г ого аналогов при прныаненш ШРА жш наружного ацздрза во врвня обработки кдэток-зеран шззечка ВАК сбуааовлвш блонируицши таянием етах зоздэ&сгешй на ШПА-канаяа.

3. Ка*/Са2+ оЗданшт обаспвчнвао? вывод взйаточного Са24 , авюшлшшцагося в культивируема кдвтках-звраах мозжечка как so вреде действия гдутамата, так в после его удаления, ш краввей ивра при лримэнеши сдаботоцснчеасЕХ (25 шсМ) доз глутамата. Ингибнрованве NaVca3* оОиваа с помощью DCB, СВШВ а путей удаления Ка+ вз внешней среда усшавяат кайрощгю-тохсвческоо доВствав глутаиата.

4. Предварительная обработка дяссЬцшфоватшх культур мизяечка яшофиышод антаокевдантами - <*-токофпролоа а пронзводаыы

штла класса простряпствзпао затрудненных фзползэ (U18), скасквао? зяг^ятаээ дэЭствст прз сэЗроцято^оясзтаонс;!

ГОВрРЯДГ.ВСТ культшзяруонгя КЛЭТОК-ЗЗрОН ЕПЕГЭЧЕЭ ШШПОЕОЗ

гшслоюЗ, что, ло-гзщкюму, свидетельствует об участшз в в топ пспрэздапзя СЕОбОДДОрЯДЗКаЛШДХ рЭВКЦЗЭ.

Нзтарзал) пасток^ого нсишдовашя С:цз даисэпа на сон®е?жйз заседанет лабораторного сежшврз а севдет; "^юята шитая" Московского ^гзшхвоппеского осй<эс?ез, епэдстю-соютскоа сейегоекуш юеошэ ессл5дов8шя в ПЙЙрО"

бгллогаз" (Гетейорг, Швеция, I9SQ г.), 5 г&здудародасг,? Конгрессе во изйрстжснкологна (Прага, ЧСФР, 1930 г.), Учрэдатааыюч Конгресса по пвто^нзйолоти (Москго, 1991г.), Снипсзаукэ АН СССР п Нвцвснальвоа Акадоиша Наук СЯ4 по гяызкуляриюЗ нейробиояогка (Клав, 1991), II ¡¿оздупародпем семшзщгкэ го ттаюхсяя (Воретп, 1991), РэгаояалыэоЗ копфэрззцзз •'оздупародшго фазгызогнчвского обрастая (Прага, ХЭЭ1), II ¡¿зздунлродиоч csssmyis ю росторгтшпой нэврожяст (Крзутск,

По далпам нестоящего есслодовэняя опуйзткозанэ II статей (з тот числа 3 за рубегси) ш 9 тезисов докладов. ,

Структура дЕссэртатри: Диссзртас^л пзлозвна па 152 страницах а содэрзз-г его раздали: , обзор латературннх дзшвпе, ваторзад я кэтода

гссдвдрвэння, результата собствэнных Есслвдрвгяэй, обсуадвпта результатов, виводя а спзсок ллтэрятури. Дгссортз1р:я идаостргрована 27 ^¡отографаяк! а рзеуккакз, 2 cxqmsjss,' I тойицоа. Бгблйографхчэскзй указатель- кшяаэ? 8 отзчостеоегсп н 172 ПЕостранЕнз ясточнпна.

УАТЕкша я isnuii ъсатшзт Объектен исследования лослухш; 7-8-даиша дэксо-цтарешашшв мопэсдойшв культура шхтка *~С-ДЕашшж крис лтпетя TTlater. В гхслэдовзнпа бшю кспользог^во 506 культур (таблица 1»>.

Иоходша материалом для полученая культур слуззш изолированные нервпиэ л глнахьано платка,

полученные с пошлдьи ферментно-шханическоЯ дассоц&ацни ткани ¡гозгечкз, проводкыоЯ по разработанному ваш методу (Викторов о соав*., 1980). Фрагешнти мозжечка инкубировали 15 ывн при 37°С в смеси ферментов, приготовленной на СМ? (солевоЯ раствор, лишенная ионов Са2+ в Kg2+; Moscona, 1968) в содврващей 0.06Х трипсина, 0.Q2X ЭДГА, 0,0045 ДНКаза, 0,8» глшоза и 3 мг/мд бычьего сывороточного альбумина. Затеи ткань подвергали иогаяяческоЁ диссоциации в питательной среда. Полученную клаточную суспензии (IQ6-5iI0K клеток/мл среда) понвпделн аа стекла, покрытые поашэтвлБнныивои (Викторов с со авт. 1990), поли-Ь-лнзаноы али высушенный слоеа коллагена с иошиюнпю связанным с тш тля-Ь-лизннси (Hasfrot, 1380). Культивирование проведали в шшсгшшш^ чашках Петра ддаштрсы ¿0 !si, содержащих I ил питательной среда следующего состава: 6S аабрнональноЯ телячьей сыворотка, 52 шшцантаршЯ сыворотки человека, 901 манямальноЯ среды Игла, 2 Ш глутаынва, 2 едАи шсулина, 0,8% глшозы, 10 M буфера НК?ES, рН 7,2 - 7,4. Через 24 часа культивирования в среду добавляла 10 w&I цатознн-еребшюзидв мя подавления пролиферации пашрваых клеток. Иргкаакеншю набладаная за развитием культур провода-ш в инвертированных ишфс-скоцах ЫБИ-13 s "Вшстер" (Рвбхерт).

Сзама проведения экспериментов

В настоящей исследовании 7-8-давьшй культуры дассоцин-ро&аяних клеток ьгшвчка обрабатывала по слвдуецэй схоиаа (çaOji.I ):

1. обработка нссладуоьъ&а ващрстваыа, влкящвш на даструк-твиаий вффэкт ВАК, до воэдэЯствня ВАК;

2. одновременная обработка втамя веществам в ВАК;

3. обработка гсслвдуы£*мз зещвствамз только посла дойеташг глут&мата, то есть в постгдута«атвом п&ркодв;

4. обработка культур ассаюдуемой вещэстве^а как во время ^эЁстеая глутаиата, так в на протяжении всего шстглу-¥&матного периоде.

Обработку культур гдутакатом а aro аналогами проводила s солевой растворе, лваашюм аоаов я содэркавдм Gа2*

(Сй^-СГ), сладувдаго состава (в Ш): 137 EaCl, 5 ECI, 0,036 12 MaHCOg, 2,3 СаС1г, II waseocsj.

Для выяснения воомозагой рола пврекисного ОКИСЛО НИЯ .4111 гидов пвйрональных мембран в нвйродеструктивннх процессах, ивдуца-рованных ВАК, культуры обрабатывали «-токоферолом (БхЮ-4Н) в солевом растворе Сикмса, затеи подвергала действии 100 мкй каиновой кислота в Са2+-СР.

Для изучения роли Ка+/Н* обиэна в пвйротоксзгшостп ВАК культура обрабатывали специфическим бдэкоторой этого обмена этализопропяи-амилоридом (ЕЕРА, 10 ккМ; 31®сЬо*Пй апй Сга^оо, 1386), который добавляли как в глутаматсодэретщий раствор, так и в Са2+-СР для инкубации культур в течение постглутаиатного периода. В отдельной серии экспериментов пржазняли длагальпув обработку культур атилгзопропал-аыалоридом как во время действия глутамата, так к в постглутаматвш периоде, В следувдей серна вкспэрзшнтов культур! обрабатывали солэвиа раствором при рН 6,8, что, по данным ряда авторов, такго шгибярует Ка+/Н+ обжи (?ге11п е£ а1., 1988Ь). Зффээт норугного ацкдозя изучали как во врелл действия глутьмата. так а в тстглутакатвш периода.

Кроиэ того, исследовали влияние ИРА в концентрациях ТО, 25, 50 н 100 икИ на нвйродаструктнвннй "аффект НИВА, а такпэ Е1РА (25 ккМ) и снягонного рЯ (6,8) на токсический эффект кашгата во вреггя действия этих нвйротоксинов.

Для исслэдвввпая ролн Ка+/Са2+ обмена в коханизках шоалв нейронов, индуцированной ВАК, культуры обрабатывала спвцЕфн-ческвки блокаторает этого обмена - дшгатилбензякдяш (ССВ, 30 шШ) п хлоробенз&лдяштгл-бвнзашцьоц (СВШВ, 10 кк!1), которно добавляла как глутЕматсодэряашнй (25 ш?У) раствор, так й в инкубационный раствор в хюстгдута?^атном портшдэ. С этой целъз такта произведши закону КаС1 в посттлутанатнои растворо яа хлорид-холила.

По истечение 4-х часового ыостглутаматного периода культура подвергала гистологической обработке.

Гясто-тогпчосквя обработка культур. Культура фиксировал», сшсыэ формалина, уксусной кислоты и абсолютного спирта (7:1:2) и окрашивала ванадиевым го гм ток силино« по 1»тоду И.В.Взкторова (13Э0).

ЗДЕЛЩ& I. Cöpaöonm куль?ур BÖSÖвдашрва с^шжгсш»^^ s СзсдагЕчзсхн ектявшыз ш^стваага, влйяздада на шс токcs^soKiâ

КэЁротоксан, Вещества, дай- Количество культур

коЕЦрнтрацзя стзущеа на Обработка Обработка ООра&жа обработка Еффэкт ВАК гарэд дзё ш вреия аосдэ âîS-ш врзш ствазы действия стезя яа-s аое-ла токскаа «жсша сгна дзЁстагя

ЙК1С2Ь9

Глутез» 60 ¡sai ВГРД, ю ïsdJ сциеанев hs— ^ухшто pH да &h, Í на 73 19 7 29 13 & 4

Глутаьыт £5 шУ DCB, СВШ ОЙа* 30 шМ 1, 10 ккЫ - IÛ 1 4 4 É 4 4

М-штаа-D-асгшртат IDO saá ЕГРА, 10 шМ 25 vsâà SO iSúS 100 ши 12 5 6 3 3 **

Rassa*. 100 к(ш «-тскофброл 0,5 Ы швТшшм ЕЕРА, 25 »scH chseshsb pH %> 6,8 (+АРУ) i ¿0 35 S7 8 5 - -

Преззчеида: о&грь колачество еогяролыал культур, ез

□ОДВбрГВКШХСЯ Д5ЙСТВЕ2 ВВЁрОГОЕСЗДОВ, ЕС ЕЗКубарЭЙШИХ 8

ооответствувда солевая растворах составляло Iii. Сократам: SIPA - атецщзшрогшд-аиядоряд ; DCB дехюробензамад; СВШВ - глоробэнзги-ддатад.'йнзёшл; ¿P7 -З-Ё^гаэ-Б-фосфовоЕалэрот CKa+ - содоаоЁ раствор, где NaCI esaasaa аа иоред íasxsa.

Кдлетвстшянал_о^а^тиа_пропа25тдв. На полученных гистологических препаратах подсчитывали количество интактпых а пшшотгческих ядер клеток-зерон мсззечка. Подсчэт проводили в 20 полях зрепия на общей площади 2,8 Результата подсчета

етрвтлн в процентах пикнотачэсхнх ядер по отношению к общему числу просчитанных клеток. Достоверность отличий определяла по критерию Стьвдента.

Ш?л^шэ_вщтриметочного_С§^ проводили в совгзэстонх экспериментах с сотрудникам лаборатории шмбрансшогни (рук. д.б.н. В.Г. Пшюлис, Институт педиатрии АМН СССР) по общепринятым иэтодакаи (ВоисЬе1оисЬе а1., 1989).

Использованное в нашей работе вощвство класса пространственно затрудненних фенолов (018), било синтезировано и любезно предоставленно к.х.н. Л.Ю.Узшпш (Ростовский Государственный Университет).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Уорфологические характеристики диссоциированных культур клеток-зерен иозгечка Набладениэ за анвымн культурами, а такта псслэдованг® гистологических препаратов показали, что нейронная популяция в 7-8-дневных культурах, полученных при диссоциации постаа'-тального мозгвчка, состоит практически полностью из клеток-зорен, которое легко кдентпфацирувтся как пряаазнетю, так ц на окрашенных ванадювнм гематоксилином препаратах как округлые, небольшого (6-9 мкм) даамвтра клетки с малым (2-Б) числом отростков и ядро«4, занимавдим почти вез клеточную соку. По данным некоторых авторов количество клеток-зерен в таких культурах составляет 952 всей клеточной популяции (?а?агоп ег а!.. 1988; МсСазПп ап1 Иогвап, 1987).

Такая специфичность нойронного состава этих культур объясняется, по-видимому, особенностями гистогенеза нозгечка. Как иззестно, 1слаткя-зерня на стадии взятия материала для диссоциации (6-8 дней постнатального развитая) прадегавлэш пролифярпрухщжа! или мнгриругцкми нвйробластота, а тага» клетками, находящимися на рззшп . стадиях даффарошщрошш, то ость назревала нейробластичесюми формами, которая сохраняв?

свои потенции н росту а хорошо развиваются г диссоциированных культурах. Другие более дифференцированные типы найрогав коры шстнатальаого ыозаечка - клетки Пуркннье, клетки Гольдам, корзиячатые в звездчатые клетки, не выянвавт после процедуры диссоциации. Эти данные хоросо объясняют гомогенность нейронной популяции, наблюдаемую в диссоциированных культурах гостаатальшго мозжечка.

Срока использования мобослойнше культур клеток-зэрен шзжечка 7-8-дневных крыся? для нсслэдованая кэйроцктоток-сячпости возбуждающих аминокислот была выбраны в соответствие с литературными данными, указывающими на то, что- вкспрессия глутаиатных рецепторов у атих клеток происходит после 5-го дня культивирования (Prandaen and Schousboe, 1990).

В заклэтеняе следует подчеркнуть, что использованные в настоящей исследовании диссоциированные культура постиаталь-ного мозжечка отличаются относительной однородностью нейронной шпуляциа и выразенюй чувствительностью к действию возбузда-щих аминокислот, что поз валяет считать эта культуру адекватной моделью для Есслододовадая нвйроцнтотоксячностя глутамата в его аяалогов.

Действие глутамата н его аналогов на

культивируема клетки-зерна шзтачка

При воздействии на 7-б-днашшэ культуры клеток-зерен шзашчка гдутаматоа (50 и 25 мкЫ) ахи другамн агошге.таии гдутааатных рецепторов - К-квтил-В-аспартетом (ICO я

кешовоа кислотой (100 ыкЫ) с последущям ах опашаназм в пареяоеоа культур в кондиционированную питательную среду или в солевой раствор (Са2+-СР), картина Евйродэструктнвшго процесса по данные световой фазовоконтрастшй прижизненной микроскопия бала сходной для кяздэхчэ нз нсследйванннх агошетов. Сразу поело отмывания ВАК клеткя слегка увеличивались в сОьокэ а теряла реЗрактерность, а в ах толах появлялись темные гранулы. Все етн признаки свидетельствовала с начинающемся отеке клеток-зерен. В дальнейшем отек нарастал а в течевго сссгвдующа 2-х часов цитоплазма клвтох сташвалась прозрачной в рази увеличенной в оОьймо. в ядра сжимались, превращаясь г

сальто рефрактерные небольшие (3-4 мкм в диаметре) округла о образования, которые на гистологических препаратах, исрашенных пжатоксшшном, выявлялись как темпоократртвыэ, сжатйе, так называете плш£нотжч8скиэп ядра. Такие клетки "можю считать необратимо поврегденныки, что подтверзЕдается данными две Злой прижизненной окрясхя флуоресцентными храситомми флуоресцеии-дяацетатом (ФДi) и пропидиум иодидом (ПИ). В результате этой окраски гивые клэтки с неговреадешюй иембрахюй окрашивается ФДА в ярко-зеленый цвет, а пикнотичаскио ядра поврандешшх клеток окрашивается ГШ в красныЭ цвет. Через 4 часа после воздействия глутаматом или его аналогами колкчэство погибших клеток достигало максимума и закатно яэ увеличивалось при дальнейшем культивировании в течение 24 часов.

Таквм образом, в настоящем исследовании была использована íзодаль так называемой "отсроченной" гибели нейронов, которая характеризуется той, что нейродвструктивше пзшнвппя развиваются в течение определенного промежутка времени (4 часа) поело непродолжительного воздействия токсическими дозяиг глутамата или его аналогов н дальнейшей инкубация культур в исходаоЗ плтптелыюЯ срадэ. По нашему кношго, такая модель позволяет более четко разделить процессы, протекащнэ в subtksx непосредственно во вреш5 действия ВАК и после их удаления.

Количественная обработка гистологических препаратов 1сультур, подвергну?!!! ЦКТОТОКСИЧ8СКОМУ воздействия ВАК показала, что тесло пикнотзческих ядер варьировало в зависимости от псвользуэаого аговаста к его концентрации. Уякскмадьаоб количество погибших нейронов наблвдали в культурах, обработанных 100 esdl ШВА, где оно колебалось от 60 до 90% (среднее значение '77,3+7-5,0%). В культурах, подвергнута: действии БО ихН глутамата, ото количество составляло в срода&м 6I.I+/-2.0S, а в культурах, обработанных 100 шШ канната -85,&+/-5,1£. Наименьший-токсический эффект ai наблвдаля пра пртаенэпта 25 мкМ глутамата, когда количество поврездешшг клеток нэ превышало 502 (ерэдпэе значение 35.2+/-4.4S).

Тагам образом, через 4 часа после кратковременного (15 - 30 шу) воздействия на культивируеше клетки-зерна ноззгачла глутачатом али его огопистамя появлялись признака нообратвшх

ЕоарвгдопиЗ. эти щиток. Токсжчоскяй аффект возбуздшрх тетиокнслот, оцешшаешй по количеству тврезденшк нейронов, варьировал и зависал о? Есполъзувыого агошста, концентрации, времена его воздействия, а также рада других параметров, таких как тешоратура в состав внкубацюнаого солевого раствора. В большанства вккюрязёэшгов условия шздвЛсгаая токсинов подобралась taxEis ойразок, чтоби гибель нейронов составляла из каша '65S вопуляцнн клеток-зерен.

Действие вгглгзосроггвл-акзлорада ж умеренного наружного ацидоза га не Зроцятотоксгчо скм2 ы{фэзг? глутамата в его аналогов &ЗШС7К0, TÍO КрЕКЭНЯОМОО HBJÍ3 СОеД5ШаН2Э - &-(Н-8ТЕЛ-З-нзонрашл)акалорад (ВЕРА), шдавляет теки чарез анакальныэ Ка-канша, Ошквруот оотеЕцзалозапасш&га Са2+ каналы. Однако, з кешльзуеши намз концентрациях КГР4 является сшзцзфаческш Енгабитором Ка^/Е* обмана (Slmchoelte and Cragoe, 1SS6).

Црк асслэдованин гистологических препаратов культур, обработанных 10 »кМ ЕГРА, добавленного в Са -CP, содзрзащиа 50 tetíá глуманата, било обнаружено значительное секезнео количества поврездонниа клеток по сравнаидв с контрольные культурам, беработенныш только гдуташтои. Количественный яяядвз показал, «?о i; результате совестного действия глутамата a ИРА чаало шггшотачеехкх ядер снижалось в среднем до 23.&+/-2.5S гю сравБонзю с 6I.I+/-2.0S э культурах, инкубироваших только з pácvaopü глутааата. Тахюа образом применение КГРА аазстэ с 50 ЙЛ гдугеиота вызывало значвтельнов s статистически достовараоо сниаяниэ иейродеетрухтиввого эффекта глутамата на культивЕ-руьшй клэтхв-зерва тзгэчха. Следует отмотать, что длительная обработка культур кра (10 кку) во время действия глутамато & в аостгдутаматвом параода оаагюстьа блокирует отссаяниЗ вш цзтжжскческаЗ аффект: количество пикаотическях ядер в таких культурах оостаакяло Ю.2+/-0.21.

Аяалогнчниа, во количественао авжьшшЯ зф^хт Oku получен пра обработке худьтур глутамвтом (50 istt) в раствора с тпжгааннш рй (6,7-6,Я). В &пя вксперемонтах чвело говрехденшх Еэйрошв снжаалось до 36,9*/-2,7$ по ерввяэнгг с 70,3+/-3,9Х г

культурах, обработанных 1'лутакатогг пря plî 7,8.

Поскольку BIP А, а тагов уьвронниЗ наругкай вцздоз Еф?ектЕВШ> нвтибзрухзт На Va* обмен, получышнэ данные ютао било ба объяснить таи, что этот обыэн опосредует icaitaM-jizöo образом иэйродеструктшкюо действие глута1£ата п его блокада праводат к значительному уианьиэпзп пейротоксяческого эффекта. Однако, в параллельных влтктрофпзнологическнх шсспзртентах, гптплквпгтах на изолированных нейронах гипшкаша (Andreeva et al., I9S2) бало показано, что добавление 10 !вй1 3IPA в глутЕУатсодзргаздЗ раствор аффективно (на 70$) сяазает пошшэ ?скя через КОА-каналы. Крслэ того, была тахзэ обнаружена высокая чувствительность ШГОА-каяалов к нзизнеяав концентрации швов Н4" в нарузюй срздв (йогаб et al., IS83). Есэ ста данные шзволяют сделать швод о тоа, что вырагевзшэ задатннз зф?акп) SIPA а нарузшго ацздозз во врэш действия глутаяата (южо обълслить полной нлп частичной блокадой ионных токов черэя ПШЗА-каналц. Зозшггю, шгггСнровашю На+/Н+ обшня такзэ вносит вклад в антидаструктиБвый эффект ЗГ?А в тшрузвого ацидоза, однако этот эффект полпостьв ыаскируетсл блокадой КШХА-каяазсв.

Дня исследования влияния SIPA га нэародеструютвпыа зффзн? ШВА дассоцияровашше культура клеток-зерен иозгечха обрабатывали раствором Ш (100 ккЫ) в Са2+-СР с йобавлвцяен КЕРА в концвнтрацнях 10, 25, 50 я ICO -hü. Анализ препаратов показал, что количество шпсюткческих ядер в культурах, обработанных ?шько SÏÏDA, составляло 70,0+-/-9,2$ от с-бпдаго числа клеток, в то время как SEPA в ковдентрацвях 25, 50 н 100 мкИ снизал число повредденкых нейронов соответственно до 28,7+/-4,33>, I4.2+/-1,9% и 10.5+/-2.3S по сравнений с- I2,3+/~0,9S повреадвнЕых клеток в контрольных культурах, не подвергавшееся действию K3DA. Следует отдатать, что концентрация ЫРА равная 10 tsdl, способная блокировать токсическое действие глутамята, оказалась неэффективней при добавлении в НЮЗА-содвряащва раствор, количество шосзэтжческнх ядер в атом случав составляло 79,5+/-3,93.

Роль HaVS* обдана в иэйроцитотоксическоа по вражда ней юшток-зерен ВАК

Как сягзчалось в предадут разделе, газетное дз&стшгэ И? А

в наружного ацидоза во время действия глутамата на культивируемые клетки-зерна мозжечка определяется преимущественно блокадой ШША-каналов. В этой связи была поставлена серия экспериментов по ингхбировашш Ка^/Н4" обмена после отюгаания глутамята, когда, как известно, прямая блокада ШВА рецепторов (каналов) нэ оказывает защитного действия (Иапеу ег. а1., 1989).

Эффект блокада Ка^/ВГ4" обмена в постглутаматном периоде. С этой целью культуры после обычной обработки глутанатом (50 мкЫ, 15 ш) помогали в Саг+-СР со снизанным рН (8,8) гли в раствор с нормальным рН (7,Б), содержащим 10 МРА, то есть помещали в у слагая, при которых обдан был значительно подавлен.

Количественный анализ препаратов показал, что число пшнотаческих ядер в культурах, подвергнутых действию глутамата (50 и?с.Ч, 15 мин), а затем инкубированных в Са2+-СР при нормальном рН (7,6) составляет в среднем 6о,2+/-2,7£, тогда как присутствие 10 мкУ ЕХ?А ила сниезние рН в постглутаматном периоде уменьшало количество поврежденных клеток, соответственно, до 43,8*7-3,02 е 48,3+/-3,4Ж. В данном случае аптндэструктивный аффект ИРА в наружного шщдоза не может быть овьясноя блокадой ЮЯЭА-каналов, поскольку дополнительные вкспе-рншнта с применением конкурентного антагониста ШМ-рецепторов - и,1г-2-амкно-5-фосфоновалерата (АРУ) показали, что обработка культур этим препаратом в постглутаматкш периоде не предотвращает гибели нейронов, в то время как в параллельных культурах Е1Р1 оказывал узренный, но достоверный зацктшй аффект.

Динамика изменений концентрации внутриклеточного кальция при действии глутамата и ИРА. В экспериментах по измерению концентрации свободного цитозольного кальция ((Са2+31) было показано, что в результате действия глутаиата (50 м&Ч, 8-15 мин) концентрация С&с+ возрастает в сродном с 30 до 500 нЫ и удерживается па атом уровне и после про кравши действия Х'дутаматв, то есть формируется так называемое "кальциевое плато" (Рас.1а). Известно, что это устойчивое иовыиениа 1Са24"11 в постглутаматном триода на взжет бить устранено двйствиэн Се^-ет-аганастов* (кнгрондипин. нкфедипкн, даетназем, Со?+} ж антагонистов Ш)А рецепторов (Магюу е1 а!., 1339). Б насих

вксгорныантах при применения таких воздействий, как блокада катаонних каналов с помощью четвертичного производного лидокаина QX 314, блокада NMDA рецепторов с помощью APV, а также стимуляция Ка+/Са2+ обмена с помощью гипертонического раствора (210 ?¿í NaCl), концентрация Са2+1 после глутаматного воздействия оставалась неизменной. Эффективное снязеяие Са2+ было достигнуто только при применении 20 мкН KIPA (Рис.10). Эти данные показывают, что спязвние [Ca^Jj под влиянием EIPA обусловлено его тордазящкы действие« па Na+/H'1" обмен.

Влияние EIPA и HapysHoro ацидоза на нейродеструктивный айбкт_каината. Дополнительные данные, свидетельствующие о важной роли Na+/}f" об»жна в нейроцятотоксическсм действии ВАК, били получвни нама при изучении деструктивного действия какаата за культивируемые нейроны мозкечка.

Известно, что каина? вызывает вход ионов Ка+ в клетст через

ионные каналы каянатного подтипа глутааатных рецепторов, что

р.

приводят к деполяризации кембраны и входу Са^ по потен-цизлозависишм каналам (Cbol, 1988; Ogura et al., I38Q). Кяялат-шздуцироваянне натриевые токи малочувствительны к изменениям наружного рН в пределах 6,8 - 7,6 (Traynelia and Cull-Cmdy, 1990), а, по нашим данным, слабо блокируются SIPA (па 10% ори действии 25 msóí HIPA). В то se время, в наших опытах наблвдался вырезанный защитный эффект SIPA и наружного ацидоза (снижение количества поврежденных нейронов с 64,5+/-8,5Ж при действии 100 мсМ каината в контрольном Ca2f-CP до 39,4+/-2,5% и 33,2+/-2,93 под влиянием соответственно 10 мкМ SIPA и Са2+-СР с рН 6,8), что можно объяснить жягабируицзм влиянием этих воздействий на Ка+/Н+ обмен.

Таким обрезом, анализ всех приведенных выше данных по изменению [Са2+)^ под влиянием глутвмата и SIPA, по занятному эффекту SIPA и наружного ацидоза а постглутаиатпом периоде, а тзкзэ по антздаструктнвному эффекту SIPA а стланного рН при повреадении клеток каинатои позволяет сделать вывод, что загрггные эффекта SIPA н наружного ацидоза обусловлены ингаби-рованнэы На^/Н4" обиена и что этот обмеп, активированный под влиянием токсических доз глутаката, усаливает его нойродо-струггавное действие.

Puc.I. A - Стойкое повышение [Ca 31 в зернзстоЁ клетке шзжечка, вызванное токсический действием глутамата. Клетки, нагруженные Л,1уоюсдватид1 зондом Рига-2АК, подвергали действии 50 мкы глутамата в растворе, лишенном Mg2+ (первая стрелха; Glu 50). Это воздействие вызывало даухфазниЯ подъем Са2+1. После 13 юга действия глутамзта начато отыаванвэ клеток контрольным раствором (вторая стрелка, N). По оси вбсцясс: время (сак), по оса ординат: слева - отношение кнтенсЕВносте£ флуоресценции на длина! волн 340 и 380 пм; справа - расчитанное по калябровочноЗ кривой значение Са2+1. Б - Влияние ELP А на ТСа2+Н в постглутаматном пвршде. Добавление 50 Midi глутамата (Glu, первая стрелка) вызывало стойкое повышение Са2+1, которое на устранялось прж отмывании клеток контрольным растворам (В). Добавление 20 weis El? A (El?А 20) вызывало достоверное сшаенже Са2+1.

Вявявкэ блокада IJaVca cässs на гпбэль шгрояов, внгваннуэ гдута&этоа

Для гсагэдоЕШШЯ роля Sa+/Ca2f о<5мвна в лэйродас-чфуктнзном процессе, шзвашюм глутекатои, ксшльзовахз блокзтора NaVcобаенвлка - щхйоводшэ аналорадз - 3,4-детлоробензакал (ВСП) s 5-(Я-4-злороб0Езяд)-2,4-дркетал-б?.язат»л (СЕШВ), з концентрациях соотзетстйзнйо 30 ш 10 ккй впй Sslth, 13öS), которые добавляла в гнкубзцвошйЕа раствор пах во spesís дейстоая 25 indi глутаната, так и а постглутЁШЗтпоа периоде. В атях акспоршзнтах баш oöeapysöHo, что DCB а СВКШ резко слагают порог чувстштвдьностп к глутешзту: уйзньшеаная в 2 раза доза гдутааата (25 >гШ) яра обработка ш культур совместно с DCB гля СВШВ обладала сашгш авЗродастру! .тжанм действием. В культурах, апкубнро-вашшх в Ca -CP с 25 ккН глута^та часл> гшхаотическях ядрр составляло 35,2+/-4,45, а в культурах, подвергнутых совгзост-зшу действию глутаиатв a ˆ ала СВШ2, ато число возрастаю, соответственно, до 90,1+/- I,7S u 88,5+/-3,23.

Анадогнтшй зффэкт ¡£щ*жбн*оров Na+/Ca2+ обзвпа наблвдался пра ах добавления к культуреа только в постглутяматаш периода. В атом случае палачество пзсснотаческжх ядер возрастало с I9,3+-/-Q,GS в культурах, впкубнровавных посла обработка гл?танатон в контрольном Св2+-СР, до 70,?+/-6,6S п 62,3+/-4,3S под* воздействием соответственно ECB а СЕШВ. Следует стаететь, что 4-х часовая инхубацзя культур с атЕка прокзводаша смааорзда в отсутстаю акаогзниого глутсмата на еызые-злл ^эструхтавных изненвнжй в клэтка1-зернах.

L О í J,

При другом способе блокада На /Оа обглэна (удалангв Ка из Са2+~СР в аостглутяматтюм периода путей замены NaCl на иворзд золила) число ¡юврезденных нейронов также резко возрастало а составляло 75,2*/-4,6S.

Таким образом, э*я серая акспержеиггсв показала, что то пркиаяеяпыв намз сгюсобы ннгкбкровяния lfa+/Ca2> cösses, как но время обработка клеток-зерен шзгочка глутакатсйа, так а э постглутяхмтном периоде, резко усаливают нэйродвструатшшыв процессы, шуопрфуен&м г дут гни том в дассоцгарованвых ауяьтурах шзтачхэ.

Эти данные позволили сделать вывод о том, что при действии 25 мкМ глутаиатв на культивируемые клетки-зерна мозжечка На+/Са2+ обменник не ножет служить путем для входе Са2+ в клетки, как предполагалось первоначально, а напротив, является важным защитным механизмом, обеспечивающим вывод избытка кальция, накапливающегося в клетках под влиянием а той дозы глутамата.

Роль Иа+/Н+ в На+/Са2+ обманников в регуляции баланса вонов Са2+ к Иа+ при нсйроцятотоксическом действии глутамата з его аналогов

Таким образом, результаты наших исследований роли На+/Н+ н Ыа+/Са2+ обшзнаков в нойродеструктивных процессах, вызванных гдутаматом, показывают, что если активация Ка /Са обмена оказывает защитное действие, то активация На+/Н+ обмена, напротив, опосредует в той или иной мере гибель клеток арг токсическом действии глутамата. Вероятный механизм взаимодействия эти двух важнейших мембранных иоквообменных систем шяэт быт', представлен следунпда образом. В работах, выполненных на культурах клоток-зарон мозжечка совместно с сотрудниками лаборатории ыэмбравологив Института подзатрга РАМН (Р1пе11е &1., 1991) бшю показано, что в этих клетках год влиянием 50 мкЫ глутамата происходи? резкое свшошв внутриклеточного рН (рН1), что, как известно, активирует На+/Н+ обмен, б результате чего, происходит повышенна внутриклеточной концентрации На4" (Ша+1,). Учитывая то, что эффективность вывода Са':+ через На+/Са обмоиняк зависит от трансмембранного градиента по На+, увеличение 1Еа+1< торшзи? На+- зависимое выведение Са2+. В то же время, блокада КаТн* обмена вызывает некоторое сшканяп внутриклеточной концентрации Ка+ и способствует тем самым шггенгафосациа ваводв Св2+ через На+/Са2+ обметай (Рас.2). Все этг данные указывает па существенную роль Иа^/П* н На+/Са2+ обшнншюв в регуляции концентрации датозольного Са"*: срыв а той регуляции в результате действжя токсически доз ВАК к пршюддт в конечной итоге к такому шзрусошш кальциевого гошостсза (а таш раваоввсм еояов Ка+, н" а, вероятно, мгогаз: других аонов).

которое приводит к необратимому повреждении нервных клеток.

Таким образом, при планировании настоящего исследования предполагалось, что в нарушении внутриклеточное Са2* гоиоостаза в постглутаматнш периоде иогут участвовать следущие механизма Ijj вюд Са2* через Na+/Ca2+ обмешшк; 2) нарушение выведения Са':+ а 3) неспоцга^ический вход Са2+ через швреядвплув нэмйрану (Manev et al., 1989). Наш эксперименты показали, что Ка+/Са ойменник не является путей для входа а напротив, по крайней иеро при действии слаботок-сачзскнх доз глутаиата на нвйропы шзгечха, обеспечивает Емведэнае Са2+. Вероятнее всего, что в постглутаматнои периоде низе? шото наруиэшю выведения Сз2+ из хлеток в результате спинепня уровня АТФ, блокады Са^1"- 1ТФазн (Blaustein, 1988; DIPolo and Beauge, .388) и тор&югения На+-завпсимого выхода Са2+ через NaVca2+ оСжняик, как было воказано в нашем исследования. Однако, нельзя отрицать и возможность входа Ca2f через поврезденнуэ цгггошш2»хат1ческув мембрану нааронюв, поскольку известно, что Са2+, цятозольяая концентрация которого пошпшется гюд влзятшеа ВАК, активируй Са2+~завас:ищв фэриент.1, isosBT стамулировать образование сгюбодних радикалов, которые в своп очередь могут дестабилизировать липада вэыбран. Для проверки этого предположения било проведено исследование влияния липофальккх антаоксадантоз на неЗродеструктивниа эффект каиновсЯ ¡околоты в культурах клетох-зерен аозгэчка.

Влияние лапофзльяых антаоксздаятоБ на неЗродвструктявный эффект кавиата.

Основанием для такой постановки задача явились данные ¡5укепз et al. (1387), укязнващке на то, что пеЗротоксическиЗ аффект ¡шшата иоаэт быть ослайлен с яоысхцьи чапяэтодв а супьроксаддасиутазы, подавляющих споСоднорздадальные реакция в клетках. Учативая то, что основным субстратом перекисного окяслешя являются липида яейронлльны1 шмбран, ах деструкция в результате этого приводит х нарушению барьарпоЭ футсцаа цагтоллазыятнчвскоя некорааы. ш предположила, что результатон такой дестабилизации шмораш может быть усиленный еторичгща вход Са'+, Для шясненля этого продпологег-яя э алиях

экспериментах был вспользовян я-токоферол как универсальный стабилизатор лнпядного Оасдоя нвйроналъных кэйбран (Ерин, 1991, азтореф. док. дасс.). Поьозло втого isj претязпялк другоЗ лншфильныЁ антиоксндант классе пространстве ию затрудненна фэнолов UI8. Культура зернистых клеткок воззззчкз преинкубвровали с а-токофоролом (0,5 Ш) вля U18 (10 ыкЫ), после чего подвергала действии каннате. КоличвствэяшЁ авалю гистологических препаратов показал, что кашювея квслота индуцировала гибель 53,e+/-I,0S нейрошэв, в то вреая как предварительная ннкубацая клвток-зерен с 0,5 tSá а-токофэрола шш 10 ыкм D18 слагала чеслю поврйгдэншх нейронов, соответственно, до 30,&*/-0,9% s 35,G+/-i,8S. Такшг образш оба изученных анткоксидакта сказавалЕ стятастнчесяз достоверный ващатный еффект прм гюврездэннн хультквжруешх клэток-зереа ыэзЕечка каинатом.

Результаты в тех 8кешр!аюнтов, а также данные Еу&елз et al., (IS67) указывагщкэ на участка активных фора кислорода в Евйроцатотокигпюств какната позволяв? продоолоаггь, что свободаорг-талыше реакция, s в пернув очередь пэрэкксноа окисление лшвдрв Езйронадьвых камбран, опосредует в той шш шоЭ kûpe пеВродэсгруктквныЗ аффект каиновой квс-лоты. Жсходя ез этого яредаплага&шЗ иахаяизы поврежденas вэйрошв каинатш может юшнать сладущие реакции: взагмодвйетвкз каннатя с рэцоптороы, вход На4' ш рецепторуправдяелаш шшалац, -> деполяризация клеточной мембраны -> вход Са2* по потенцнало-зокасией! Са2+ канала« -> активация Са2+-завзоюг£г протеаз -> образование ксантшюксадазы ез хсантждоги^фгл'енвзы -> образованна свободных радикалов (Еукеяз et ai., IS37) -> активация перекисшго Ькнслоаия дшшдрв -> сбрааовавза вэрвкисвых кластеров в нвйронлдьнах шмбранах (Вркн. 1931) -> массированный вторичный вход Са2<" б нейроны -> Са2+ гибель в результате активации липо- и иротесхлитмчесхих ферментов.

Следует подчеркнуть, что ошюанныа шханкза является гшютатичеокш а его обоснование требует дошташтельнах нсследаваааа. вкхичавдих в яврву» очередь прямое опредалелаэ уровня ib'.poKiir-Boro окясдааая лапидов в нвЗроаах опд влиятгои кеавоаоа кислоты.

выводы

I. Диссоциированные культуры аостнатзльного шзгвчка представляют собой шрфологическа а нэйрозсшяческн одаороднуэ нейронную популяцию, состощув аз клеток-зерен нозжечка, и являются, таким образом, адекватной модель» для исследования отсроченной гзбела найроиов, еузввнлой возбуждающими аминокислотами.

2. Обработка 7-8-дневвых культур клеток-зарэн мозжечка глутаиатом (25 и 50 икМ) а его аналога ил - ШЛА (100 iskU) а казиовоЭ кислотой (100 мкИ), в точение 15-30 мин з растворе, не содераащеи конов магния, вызывает послодуэдую дегенврацаю значительного числа перронов (от 35 до 771), развивающуюся п течение 4-1 часов посла прекращения действия возбуждающих аминокислот.

3. В период глутанатшго воздействия (50 tatíl, 15 мин) атзлизопропил-ашлорад (ЕГРА, 10 мкМ), так га как и снижение pH инкубационного раствора до 6,8 значительно ушньпает число погибшх нейронов при подсчете через 4 часа посла удаления глутаиата, что, по данным злэктрофизЕологзческнх исследовании, обусловлено блокадой NHDA-каналов.

4. Добавление 10 uxU KITA в постглутаиатный инкубационный раствор, так se как а сяк&эеив pH этого раствора до 6,8 оказывает умеренный защитный аффект: количество поврежденных клеток сниаается на 203. Поскольку специфический антагонист ШЭА-роцапторов - В,Ь-2-Ешно-5-фосфоновалврат - яе уменьшает отсроченную гкйель пвйронов пра пршвшшиа его а яостглутакатный перзаэд, a SIPA аффективно снижает содержанка взутршишточного Са2+ посла отьзгваная глутаиата, ысш прэдгюлокзть, что защитное действие EIPA и ушравшго ацидоза в гоетглутаиатноа перзода обусловлено торшззнввм Na^/IÍ* обмана.

б. Блокада Па+/Са обмана в период действия глутамата (25 t§íM) С помощь» производап ашсюрндз - дахлоробвязакждга л гл0р0бензал-дн>й5т1лбензпйзла прязодят к розкочу (до 90*) увеличению числа новрездвнша клвток-зереи мозжечка. Аяялогнчзюэ усиление отсроченной гибели нейронов происходит пря апгибирования NaVca2+ обмена в постглутаиатпом триоде с

помощью тех же препаратов или путем удалваяя На* яв ннкубациошюго раствора. Таким образок Иа^-вависямое выведение Са2+ из нейронов является вазшм защитным механизмом нейронов про токсической действии глутамата.

В. Предварительная обработка культур дшофыьными ентиокси-дантами (а-токоферолои я Ш.8) препятствует отсроченной гибели нейронов под влиянием каиновой кислоты, что свидетельствует о важной роли перекисного окисления липидов в нарушении барьершй функции цитогшазматнческоа мембраны нейронов в их поелодуидой деструкции шд влиянием возбукдашщх аминокислот.

СПИСОК РАБОТ, ОПШШКОВАЛНЫХ ПО ТЕМЕ"ДИССКРТАЩй "I. Caatillo I., Anäreeva К., Vlctoro? I. Dissociated nervoim cell cultures from rat cerebellura. Morphological characterisation // Int.J.Keuroacl.- 1989.- Vol. 49, КЗ-4,- P. 233.

2. Викторов Й.В., Андреева H.A., Исаев H.K. Использование г лиатилешашнового субстрата для культивирования диссоциированных клеток центральной нервной meiern // Цитология.- 1990.- Т. 32, N 7.- С. 81-04.

3. Andreeva К., VlctoroT I,, Cragpe Е., КЬойого? В. Ethyllsopropyl-aallorlde (МРА) prevents glutamate neurotoxicity in cerebellar granule cell cultures // Abs. 5tb Int. Congr. Neurotoxicology, Prague, 1990.- P.45.

4. Vlctoroy I.. Andreeva N., Krln A. Vitamin В attenuates neurocytotoxlc eftoct of kalnlc aclfl on cultured cerebellar granule cells // Aba. 5tb Int. Congr. Neurotoxicology, Prague, 1990.- P. 35.

5. Andreeva N., Kbaspefcov I., Xhodorov В., Vlctorov I. Pharmacological protection against neurocytotoxlclty of excitatory amino acids // Abs. Regional Keel. Int. Union Physiol. Sei., Prague, 1991,- P. 45.

6. Андреева К.A., Ернн A.H., Викторов R.B. Внтамкн E .енлааэт нейроцитотоксическоо действие кезшовой кислота в культуре нейронов шзаачка // Ешш. эксперты, басхл. кэд,-19Э1-- Т. III, N 5.- С.'189-191.

7. АпЛгвэта n.. Khodorov В., Stelmashook В., Cragoo В., Vlctorov I. The role or Na+/H>'- and Na+/Ca2+-exchange systems in glutanate-induced neuronal death in cerebellar granule cell cultures // Aba. Const. Congr. Psthophyslol., Mobcow, 1991,-P.24,

8. Khodorov В., Pinelis 7., Faiuk D., Andreeva M., Xhaspekov L., Vlctorov I. Intracellular calcium and glutamats-lnduced delayed neurotoxicity // Abs. Const. Congr. Patho-phyalol., Uoscow; 1991.- 217-218.

9. Andreeva tf., Khodorov B.. StelmsbooR 3., Cragoe B., Victorov I. Inhibition of Na+/Ca2+-exchange enhances delayed neuronal death elicited by glutaaate in cerebellar granule cell cultureз // Brain Res.- 1991.- Vol. 543,- P. 322-325.

10. Andreeva v., Krtn A., Xbaspefcov 1., Khodorov B,, Sofeolova 8., Victorov I. la vitro and In vivo studies of neuro-cytotoxlc efiects of excitatory amino oclds // Abs. Syap. Molecular Neuroblol., sponsored by Nat. Acad. Scl. (U3A) and Acad. Scl. (USSR), Xlev, 1991,- ?. 105-10T.

11. Андреева Я.А., Ходоров В,Я, Стельмаиуя Е.В., Соколова С.Н,, Вакторов И.В., Краго Э., КрыгапсвскаЯ Г.Н. 1&мг5раншв коха!шзми защитного двйствия аталнзопропал-ашлоряда я уиэрэшюго ацадоза на культивируемые клэтна-зерна юглмчха при токсическом воздваствая глутамата // Виол. IfetaJpami.- 1992.- Т. 9, N 3.- 0. 319-329.

12. Андреева Н.А., Ходоров Б.И., Викторов Й.В. Ушреншй паружшИ ацадоз ослайляет шзываеиов тсаянатом пейроцвто-•гоксачзское поврвздезяе культивируемых клеток-зорен ноззвчка // БЗОД. УемЙрЯПН.- 1992.- ?.9, МО.- С. 1055-1057.

13. Пштолзс В.Г., Ходоров Б.И., Фапк Д.А., Зягулова Д., Андреева Н.А., Уварова Т.Н., Хаспекоа 1.Г., Голована З.А., Шкторов И.В. Стойкой хялъцяазавяоямое сшззепжэ цдтоплвзиа-тстэдского рН в культивируемых нервных клетках посла токсчпеского воздоЗсггая глутаната // Пяол. йамсравы.- 1592.-Т.9, N 10.- С. I049-1061.

14. Ходороя Б.Я.. Пжюявс В.Г., Головина В.А., tone Д.А., Уварова T.U.. АЕ^фоева Н.А., Хэспевов Л.Г., Викторов а.Б. О

природе "кальцаевой перегрузки" нейрона после токсического воздействия глутаката // Виол. Мембраны.- 1932.- Т.Э, N 10.- С. 104Б-1049.

15. Ходоров Б.И., Пинелас Е.Г., Фамк Д.А., Головина В.А., Хаспеков Л.Г., Андреева Н.А., Викторов И.В. Ингибитор натрий-протонного об&еша гтюшзопропил-аиилорвд (КХРА) уменьшает кальциевую перегрузку нейрона пря прниэпенш в постглутвматный период // Виол. Мембраны.- 1Э92.- Т.Э, ОТО.- С. I05I-I055.

16. Богачев А.В., Быкова Л.П., Ходоров Б.И., Андреева Н.А., Хаспекоз Л.Г., Пняэлас В.Г., Викторов И.В. Стойкое снижение внутриклеточного содержания АТФ в хулътавнруемах нервных клетках нозяачка и гишюханпв во время к поело окончания токсического воздействия глутаката // Вкол. Тибрены.- 1992.- T.S, N10.- С. 1057-1059.

17. Andreeva N.. Khodorov В., Stelmasbook В., Sofcolova S., Cragoe S., Vlctorov I. 5-(N-etbyl-N-l3opropyl)aaitlorlde and mild acldosla protect cultured cerebellar granule cells against glutamate-1nduced delated neuronal death // Neurosclencs.-1992.- N1.- P.175-181.

IB. Викторов И.В., Хасдаков Л.Г., Андреева Н.А., Ерш АЛ!., Льпил а.а. Защитное дэйствдо антнекстдаитов прп гашксическон и нзйроцзстотокежчвеком повревд&хша культивкруе-иих нервных клеток гишюкампа н шзгечкв // В сб. 2-го Международного симпозиума по ресторатнвной неврологии.- 1992.- С.38.

19. Викторов И.В., Хаспеков Л.1\, Андреева Н.А., Барсков И.В., Исаев Н.К., Лыхкн А.А., Ерш А.Н., Дупин A.M. Роль свободнорадакальных реакций в двструкции нейронов In vitro в In vivo при действии возбуадаыцях аминокислот к пря гипоксии /ншемии // В сб. "Организованный мозг", Ыосква, I9S0.- С.42.

20. Khodorov В., Plnells V., Golovlna V., Fajuic D., Andreeva H., DvarovaT., Khaapekov L., Vlctorov I. On the origin or a sustained Increase In eytosollc tree Ca2+ concentration aJter a toxic glutaaate treatment о1 the nerve cell culture // FHS Letters.- 1993.- V.324, КЗ.- P.271-273.