Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция NMDA-рецепторами функций T-лимфоцитов у больных рассеянным склерозом

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция NMDA-рецепторами функций T-лимфоцитов у больных рассеянным склерозом"

На правах рукописи

КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ МУтА-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДВГ 2015

Уфа-2015

005571248

005571248

Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научные руководители:

Вахитова Юлия Венеровна Бахтиярова Клара Закиевна Официальные оппоненты: Веселое Станислав Юрьевич

Захарова Мария Николаевна

Ведущая организация:

Доктор биологических наук Доктор медицинских наук

Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет, г. Уфа

Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии, профессор кафедры нервных болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, г. Москва

ФГБУН Институт мозга человека

им. Н.П.Бехтеревой Российской академии наук,

г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «-it/» сентября 2015 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: vak.ed.gov.ru; ibg.anrb.ru, e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан « -/5"» LU-Ot2015г.

Учёный секретарь диссертационного /

совета Д 002.133.01 Гульназ Фаритовна

доктор биологических наук, доцент (/ Корытина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рассеянный склероз (PC) - широко распространенное хроническое прогрессирующее аутоиммунное демиелинизирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), поражающее преимущественно лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежно ведущее к инвалидизацпи (Столяров и др., 2008; Шмидт и др., 2012).

Существующие на сегодняшний день знания о PC позволяют рассматривать его патогенез как сложный многокомпонентный процесс, ведущую роль в котором играют аутоиммунные механизмы (Гусев и др., 2011). Установлено, что возможными причинами срыва иммунологической толерантности и развития аутоиммунной реактивности при PC являются нарушение функций, дифференцировки, а также изменение субпопуляционного баланса эффекторных CD4" Т-лнмфоцитов (Kuchroo et al., 2012; Raphael et al., 2014). Интенсивно изучается функциональная значимость в инициации, формировании, прогрессии и ремиссии PC IL-17-продуцирующих CD4+ Т-клеток (Brucklacher-Waldert et al., 2009; Jadidi-Niaragh et al., 2011; Huber et al., 2013). Особое внимание также уделяется определению роли эффекторных субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов (Saxena et al., 2011; Gravano et al., 2013). Кроме того, большое значение в формировании патологического процесса в мозге при PC имеет избыточная продукция провоспалительных цитокинов, сопровождающаяся снижением синтеза противовоспалительных цитокинов (Hollifield et al., 2003; Mikulkova et al„ 2010; Kallauret al., 2013).

Помимо аутоиммунных механизмов, значительная роль в разрушении миелина, гибели нейронов и, особенно, олигодендроцитов отводится нейромедиатору ЦНС глутамату, который образуется в больших количествах в мозге при PC (Pitt et al., 2000; Werner et al., 2000; Matute et al., 2001). Имеющиеся литературные данные свидетельствуют об участии глутамата в механизмах нейровоспаления, осуществляемом, в том числе за счет регуляции функций как поступивших в мозг аутореактивных Т-клеток, так и периферических Т-лимфоцитов (Schori et al., 2001). По данным ряда авторов, антагонисты NMDA-рецепторов мемантин и (+)-МК801 снижают выраженность неврологических нарушений у животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом, уменьшая воспаление в ЦНС вследствие ограничения проницаемости гемато-энцефалического барьера для цитокинов и Т-лимфоцитов, не препятствуя при этом развитию демиелинизации (Paul et al., 2002; Abdurasulova et al., 2004).

К настоящему времени доказана экспрессия ионотропных рецепторов глутамата (NMDA и АМРА подтипов) на поверхности Т-клеток человека, а также

установлена их роль в регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, таких как пролиферация и апоптоз, а также секреция цитокинов и дифференцировка субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов (Зайнуллина и др., 2011; Ganor et al., 2012). Важно отметить, что на настоящий момент в доступной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению роли глутаматных рецепторов NMDA подтипа, экспрессированных на клетках иммунной системы, в функционировании Т-лимфоцитов больных с рассеянным склерозом.

Цель исследования - изучение роли NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-лимфоцитов у больных рассеянным склерозом.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию продукции про- и противовоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами, полученных от здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

2. Охарактеризовать влияние NMDA-рецепторов на содержание CD4+ и CD8+ популяций Т-лимфоцитов и их соотношение у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

3. Исследовать роль NMDA-рецепторов в регуляции дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4* Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

4. Оценить участие NMDA-рецепторов в регуляции дифференцировки эффекторных субпопуляций CD8T Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

5. Установить спектр генов, дифференциально регулируемых NMDA-рецепторами, в Т-клетках здоровых лиц и больных рассеянным склерозом.

Научная новизна. В проведенном исследовании впервые получены данные о роли NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе PC. Выявлены особенности регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток при PC. Охарактеризовано влияние NMDA-рецепторов на секрецию и синтез Т-лимфоцитами, полученными от больных PC доноров, провоспалительных (IFNy, TNFa) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов, а также обладающего плейотропным действием IL-6. Показано, что уменьшение секреции цитокинов при блокаде NMDA-рецепторов селективным антагонистом (+)-МК801 связано с ингибированием экспрессии генов

соответствующих белков. По сравнению со здоровыми донорами, у больных PC данный негативный эффект блокады типа рецепторов менее выражен.

Показано, что блокада NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов антагонистом не сопровождается изменением относительного количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и их соотношения у пациентов с PC и здоровых лиц.

Установлена вовлеченность глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляцию дифференцировки и поддержание баланса эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8* Т-лимфоцитов при PC. Впервые показано ингибирующее действие (+)-МК801 на экспрессию цитокинов (IL-4, IL-17, IFNy) и генов транскрипционных факторов (ТВХ21, GATA3, RORyt, FOXP3) при PC. Отмечено, что различные субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток обладают разной чувствительностью к блокаде NMDA-рецепторов. Так, у больных PC по сравнению со здоровыми лицами эффект блокады NMDA-рецепторов был менее выражен в отношении Thl и Tel клеток и более - в отношении ТЫ 7 и Тс 17 лимфоцитов. Выявлено, что блокада рецепторов (+)-МК801 приводит к смещению субпопуляционного баланса CD4' и CD8' Т-лимфоцитов в сторону клеток 1 типа (Thl и Tel) в большей степени выраженному у больных PC.

Идентифицированы паттерны генов, регулируемые NMDA-рецепторами у здоровых лиц и пациентов с PC. Определены биологические процессы, в регуляцию которых могут быть вовлечены NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов при PC. Установлено ингибирующее влияние (+)-МК801 на экспрессию важных с точки зрения патогенеза PC генов (CCL20, ILS и др.).

Научно-практическая значимость работы. Выполненная работа имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Полученные новые экспериментальные данные расширяют и углубляют представления о роли глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции функции Т-клеток и в развитии иммунопатологических процессов при PC. Результаты проведенных экспериментов раскрывают возможные механизмы, посредством которых реализуются иммуномодулирутощие функции NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов, и позволяют рассматривать данные рецепторы в качестве новой мишени для фармакотерапевтической коррекции PC и, возможно, других аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды»

(Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013), VII Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Аутоиммунные заболевания нервной системы» - единство и многообразие» (Новосибирск, 2015), XX Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе, 2 статьи в журнале из перечня ВАК.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантом РФФИ № 15-04-01441 и грантом Президента РФ для ведущих научных школ НШ-5923.2014.4.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы (глава 1), описание материалов и методов исследования (глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы. Список цитированной литературы включает 559 наименования, в том числе 46 работ отечественных и 506 работ иностранных авторов. Работа изложена на 204 страницах машинописного текста и иллюстрирована 15 таблицами, 13 рисунками. Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной иммунологии и фармакологии ИБГ УНЦ РАН за ценные советы в период подготовки к защите диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали Т-лимфоциты периферической крови условно-здоровых доноров-добровольцев и больных PC.

Клиническая характеристика доноров. В исследование было включено 60 больных с достоверным диагнозом PC согласно критериям W. McDonald (Polman et al., 2005, 2011), состоящих на учете в Центре рассеянного склероза Республики Башкортостан на базе РКБ им. Г.Г. Куватова (г. Уфа). Группа больных PC состояла из 37 женщин и 23 мужчин в возрасте от 19 до 68 лет (средний возраст 38.5 ± 11.5 лет). Длительность заболевания была определена по году установления диагноза неврологом и составила 5.3 ± 3.8 лет (от 1 до 15 лет). В соответствии с классификацией, предложенной Lublin и соавторами (1996) ремиттирующе-рецидивирующий тип течения заболевания PC был установлен у 28 пациентов. PC в стадии вторичного прогрессирования наблюдался у 22 больных. Прогрессирующе-ремиттирующий характер заболевание носило у 7, а первично-прогрессирующее -у 3-х пациентов. Выраженность неврологического дефицита у больных PC была определена врачом неврологом однократно на момент взятия крови с помощью

шкалы инвалидизации Куртцке в модификации Weiner и Elisson (1983) Expanded Disability Status Scale (EDSS). Средний показатель по шкале EDSS составил 3.0 ±1.2 балла (от 1 до 5 баллов), что говорит о преобладании числа пациентов с умеренной степенью инвалидизации. Скорость прогрессирования заболевания составила 1.0 ± 0.8 балл EDSS в год (от 0.2 до 1.3 балл EDSS / год). На момент забора крови у всех пациентов наблюдалась стадия ремиссии заболевания, подтвержденная неврологом. Все больные PC, участвующие в исследовании, получали иммуномодулирующую терапию препаратами, изменяющими течение PC (ПИТРС): интерферон бета принимали 36 человек, глатирамера ацетат 24 человека. Контрольную группу составили 59 условно-здоровых добровольцев, среди которых 20 женщин и 39 мужчин. Средний возраст составил 28.9 ± 8.1 лет (от 21 до 54 лет). Для участия в исследовании у всех доноров было получено письменное информированное согласие. Работа получила одобрение в Локальном этическом комитете при ИБГ УНЦ РАН.

Забор крови (20 мл) осуществлялся из локтевой вены в амбулаторных условиях. Выделение мононуклеаров проводили по стандартной методике центрифугирования в градиенте плотности фнколла (1.077 г/см') (Boyum, 1968). Культивирование лимфоцитов проводили в полной среде культивирования RPM1-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США), 2 х 10"3 М ¿-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (ПанЭко, Россия). В работе использовали следующие методы стимуляции Т-клеток ш vitro: инкубация лимфоцитов с моноклональными антителами (МКА) к CD3 (aCD3 МКА, клон ОКТЗ, eBioscience, США) и к CD28 (aCD28 МКА, клон 37.51, BD Pharmingen™); добавление в культуру клеток 4-форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 25 нг/мл) и иономицина (1 мкг/мл). Для изучения роли NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-клеток данный вид рецепторов блокировали их неконкурентным антагонистом (+)-МК801 (10'4 М, Tocris, США). Определение содержание цитокинов проводили с помощью коммерческих наборов для твердофазного нммуноферментного анализа «ИФА-ILó», «ИФА-ILIO», «ИФА-TNFa», «ИФА-INFy» (Цитокин, Россия). Оптическую плотность образцов измеряли на мультипланшетном анализаторе «EnSpire® Multimode Plate Readers» (Perkin Elmer, США) при 450 им и референсной длине волны 650 нм. Иммунофенотинирование лимфоцитов осуществляли путем поверхностного окрашивания клеток МКА CD4-PE и CD8-PE-Cy5 в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя (eBioscience, США). Флуоресценцию регистрировали на проточном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США). В каждом измерении регистрировали 30000 событий. Для определения внутриклеточного уровня цитокинов Т-лимфоциты (2 х 106 кл/мл) окрашивали описанным выше

способом, затем фиксировали 1 %-ным параформальдегидом 10 мин при температуре 37 °С, пермеабилизовали 90 %-ным этанолом 30 мин при 4 °С. Далее лимфоциты инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте с МКА к IFNy-FITC, IL-4-Alexa Fluor® 488, IL-17A-FITC (eBioscience, США), TGFßl-CFS (R&D Systems, США). В качестве отрицательного контроля использовали изотопические антитела, рекомендованные производителем. Интенсивность флуоресценции детектировали с помощью проточного цитофлуориметра «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США). В координатах малого углового (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния выделяли область лимфоцитов и анализировали популяции CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов с одновременной детекцией одного из исследуемых цитокинов. В каждом образце анализировали 30000 событий. Последующую обработку данных проводили в программе «FCS Express 4.0» (De Novo Software, Канада). Суммарную РНК выделяли с использованием TRI Reagent (MRC, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Последующие выделение и очистку проводили с помощью коммерческого набора «Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit» (Zymo Research, США). Количество и качество выделенных препаратов РНК контролировали с помощью спектрофотометра NanoDrop 3000 (Thermo Scientific, США), а также электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле. кДНК получали из 0.5-2 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием 0.5 мкг oIigo(dT)i2.ig-npafiMepoB или «случайных» праймеров (наномеры) и 40 ед. акт. обратной транскриптазы RevertAid™ Reverse Transcriptase (Thermo Scientific, США). Анализ экспрессии генов осуществляли методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе «iQ™5 Multicolor RealTime PCR Detection System» (BioRad, США) с использованием 2.5 X реакционной смеси «ПЦР-Микс» (Синтол, Россия), содержащей интеркалирующий краситель «SYBR Green I». В качестве внутреннего контроля были использованы последовательности генов HPRT1 и PGK1. Праймеры к нуклеотидным последовательностям анализируемых генов подбирали с помощью программы «Primer 3 Plus» (www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) с последующим анализом в программах «DNAStar» (LaserGene, США) и «OligoAnalyzer» (www.eu.idtdna.com), а также «BLAST» (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov). Изменения в уровнях мРНК генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы «REST Tool V. 2.0.7» (Corbertt Research, США). Для идентификации генов, экспрессия которых регулируется NMDA-рецепторами, использовали коммерческий набор «Human Signal Transduction PathwayFinder™ RT2 Profiler ™ PCR Агтау» (SABioscienses, США). Для проведения реакции ОТ-ПЦР использовали набор «RT2 SYBR Green/Fluor qPCR Mastermix» (SABioscienses, США) в соответствии с протоколом производителя. Результаты

ОТ-ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения «RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.4» (SABioscienses, США). Функциональный кластерный анализ групп дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) проводили с помощью биоинформационной онлайн-программы «DAVID» (www.david.abcc.ncifcrf.gov) и классификационной системы «PANTHER» (www.pantherdb.org). Конструирование взаимосвязей белковых продуктов ДЭГ проводили с использованием программы «STRING» (www.string-db.org). Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием стандартного пакета программ статистического анализа «Statistica 6.0» для Windows (StatSoft, США). Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (М ± SEM). В случае распределения, отличного от нормального, результаты описывали медианой с указанием в скобках 80 % - интерпроцентильного размаха (10-ая -90-ая проценшли) (Me (10 - 90 - процентили)). Для выявления значимости различий между двумя независимыми выборками (здоровые доноры и доноры-больные PC) применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок (внутри экспериментальных групп) - t-критерии Вилкоксона. Различие групп считали статистически достоверным при р< 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Регуляция NMDA-рецепторамн продукции цитокипов Т-лимфоцитами у здоровых доноров и доноров-больных рассеянным склерозом

С целью определения участия NMDA-рецепторов в регуляции эффекторных функций Т-лимфоцитов нами было проведено изучение эффектов антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801 на синтез и секрецию TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 Т-лимфоцитами в группах здоровых доноров и больных PC в системе in vitro.

Из полученных нами данных следует, что инкубирование активированных через Т-клеточный рецептор (TCR) Т-клеток здоровых доноров с антагонистом NMDA-рецепторов (+)-МК801 сопровождается статистически значимым снижением уровня мРНК генов всех цитокинов. Интересно отметить, что блокада рецепторов в большей степени влияет на экспрессию генов провоспалительных цинокинов IFNG и TNFA (табл. 1, группы «aCD3/aCD28» и «aCD3/aCD28/(+)-MK801»),

Кроме того, при блокаде NMDA-рецепторов стимулированных Т-лимфоцитов также отмечается значительное снижение содержания в среде

культивирования исследуемых цитокинов (табл. 2, группы «аС03/аС028» и «аСТ>3/аС028/(+)-МК801»).

Аналогичное исследование нами проводилось и в группе больных РС, результаты которого выявили схожие закономерности при оценке блокады ЫМОЛ-рсцспторов на синтез мРНК и секрецию про- и противовоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами. При совместной инкубации активированных клеток с (+)-МК801 наблюдается снижение уровня мРНК генов всех цитокинов (табл. 1, группы «аСОЗ/аСЭ28» и «аСПЗ/аС028/(+)-МК801»). Однако более выраженное ингибирование было обнаружено для мРНК, кодирующих гены //-Ж? и №N¡¡2.

Таблица 1 - Экспрессия генов цитокинов в Т-клетках здоровых и больных рассеянным склерозом доноров на фоне блокады ЫМИА-рецепторов

Здоровые доноры (п=10)

^---^группа ген ........................ контроль аСБЗ/аС028 аС03/аС028 +(+)-МК801 (+)-МК801

1.3 (1.1-1.8) 7.4 (5.1 - 14.8)* 6.4 (2.9 - 13.1)# 2.9 (1.0-4.0)

Ш№2 1.1 (1.0-1.5) 2.0 (1.9-2.5)* 1.5 (0.9- 1.9)# 1.4 (1.1-1.8)

1.1 (1.0-1.4) 32.1 (16.4-82.3)* 18.9 (8.7 - 53.1)# 1.4 (1.2-1.9)

ТИРА 1.1 (1.0-1.5) 4.7 (3.0 - 10.9)* 1.9 (1.4 - 2.6)# 1.1 (0.7-1.9)

Больные РС доноры (п=10)

ген ---- контроль аС03/аС028 аС03/аС028 +(+)-МК801 (+)-МК801

СЛ7/-' 1.1 (1.0- 1.4) 1.7 (1.1-2.3)* 1.2 (1.1 - 1.4)# 1.6 (0.5 - 2.6)

№№2 1.0 (0.9-1.5) 1.4 (1.3-2.0)* 1.0 (0.9- 1.3)# 1.3 (0.8 - 2.0)

¡ЬКС 1.1 (0.9-1.3) 54.6 (4.4 - 128.4)* 39.6 (3.2-112.2) 1.1 (0.4-1.3)

ТИРА 1.1 (1.0-1.2) 1.9 (1.1-2.8)* 1.7 (1.1-2.4) 1.3 (0.7 - 1.8)

Примечание - Для определения относительного уровня мРНК генов цитокинов Т-лимфоциты (2х106 кл/мл) стимулировали аСЦЗ/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) в присутствии (+)-МК801 (10"4 М) в течение 8 часов (С57/=\ №№2, ТЫ У Л) и 24 часов (1РЫв). Данные представлены в виде Ме (10-90-процентили). Достоверность различий оценивали с помощью и-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры - больные РС) и ^критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп); * - р<0.05; ** - р<0.01 относительно группы «контроль»; *-р<0.05;р<0.01 относительно группы «аСОЗ/аСП28».

Результаты анализа содержания цитокинов в среде культивирования Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с РС, показали, что на фоне блокады ЫМОА-рецепторов стимулированных Т-клеток происходит статистически значимое

снижение содержание 1Ь-10, №N7 и ТОТа (табл. 2, группы «аСОЗ/аСП28» и «аСОЗ/аС028/(+)-МК801»). Изменений уровня 1Ь-6 в среде культивирования стимулированных Т-лимфоцитов с (+)-МК801 обнаружено не было. Отметим, что (+)-МК801 в наших экспериментальных условиях оказывал незначительное влияние на уровнень мРНК и белков, исследуемых цитокинов как у здоровых доноров, так у доноров-больных РС (табл. 1, группа «(+)-МК.801»; табл. 2, группа «(+)-МК80Ь>).

Таблица 2 - Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов у здоровых доноров и

доноров-больных РС при блокаде КМПА-рсцспторов

Здоровые доноры (п=20)

^хгруппа цитокин\ контроль аСПЗ/аС028 аСБЗ/аС028 +(+)-МК801 (+)-МК801

1Ь-10 (пг/мл) 126.9 (109.3- 146.8) 1318.3 (498.9 - 2557.3)" 768.9 (314.7- 1025.0)** 208.4 (151.7-244.2)"

II.-6 (пг/мл) 2787.7 (2581.2- 3188.7) 5208.8 (3360.2 - 7369.9)" 4161.5 (3211.3 - 4668.9)** 3993.8 (2111.9-4687.9)"

ШИу (пг/мл) 3874.4 (3729.0-4161.4) 12597.0 (7202.6- 16927.6)" 5089.3 (4378.4 - 6688.4)** 3580.3 (3336.7 - 3773.5)"

ТОТа (пг/мл) 705.9 (553.0 - 1000.5) 2618.3 (1815.6-3694.8)" 1324.2 (1170.3 - 1452.4)"* 699.3 (558.0 - 979.0)

Больные РС доноры (п=20)

\групна цитокин\ контроль аСОЗ/аСБ28 аСОЗ/аСШ8 +(+)-МК801 (+)-МК801

1Ь-10 (пг/мл) 202.8 (96.4 - 300.7) 448.4 (155.7 - 737.2)* 270.9 (124.5-463.9)"* 171.4 (100.6-285.9)'

1Ь-6 (пг/мл) 158.6 (154.1 - 165.8) 301.7 (274.9 - 322.6)" 306.1 (301.5-313.2) 137.3 (131.1 - 145.3)"

ШИу (пг/мл) 339.9 (325.9- 356.9) 1169.5 (315.5-2457.2)' 797.7 (245.3- 1755.9)*" 322.2 (304.0 - 333.5)"

TNFa (пг/мл) 60.4 (47.1 - 101.9) 206.5 (82.5 - 369.9)" 129.0 (64.0 - 205.1)** 58.8 (47.0 - 86.3)

Примечание - Т-клетки (2х 106 кл/мл) инкубировали в присутствии аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) и (+)-МК801 (К)" М) 24 часа (1Ы0, 1Ь-6, ТЫРа) и 48 часов (1Шу). Содержание цитокинов определяли в среде культивирования Т-лимфоцитов. Данные представлены в виде Ме (10-90-процентили). Достоверность различий оценивали с помощью и-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры — больные РС) и ^критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп); * — р<0.05; ** — р<0.01 относительно группы «контроль»; *-р<0.05; м-р<0.01 относительно группы «аСОЗ/аСШ8».

Результаты анализа содержания цитокинов в среде культивирования Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с РС, показали, что на фоне блокады ЫМПЛ-рсцспторов стимулированных Т-клеток происходит статистически значимое снижение содержание 1Ь-10, 1РЫу и ЮТа (табл. 2, группы «аСВЗ/аСП28» и «аСПЗ/аС028/(+)-МК801»). Изменений уровня 1Ь-6 в среде культивирования

стимулированных Т-лимфоцитов с (+)-МК801 обнаружено не было. Отметим, что (+)-МК801 в наших экспериментальных условиях оказывал незначительное влияние на уровнень мРНК и белков, исследуемых цитокинов как у здоровых доноров, так у доноров-больных РС (табл. 1, группа <<(+)-МК801»; табл. 2, группа «(+)-МК801»).

Сравнительный анализ данных, полученных при изучении эффекта блокады М\ША-рсцспторов на цитокиновый статус активированных Т-лимфоцитов здоровых и больных РС доноров, выявил следующие отличия. Так, согласно нашим данным, подавление продукции ЮТа было более выраженным у здоровых доноров по сравнению с больными РС. Схожий характер влияния антагониста показан и для 1Ь-10. В условиях активации Т-клеток МКА снижение уровня секреции 1ЕЫу на фоне действия (+)-МК801 у здоровых доноров отличалось от больных РС почти в 2 раза. Как уже отмечалось выше, блокада NMDA-peцeптopoв лимфоцитов у больных РС не сопровождается изменениями содержания 1Ь-б, тогда как у здоровых доноров эффект антагониста составил всего 20 %. Следует отметить, что действие антагониста ЫМОА-рецепторов схожим образом проявляется и на уровне мРНК генов соответствующих цитокинов.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований позволили установить участие ИМИА-рецепторов Т-лимфоцитов в регуляции продукции как про-, так и противовоспалительных цитокинов, реализуемое на уровне мРНК генов соответствующих белков как у здоровых лиц, так и у больных РС, однако Т-клетки больных характеризуются более высокой резистентностью к блокаде Ы\ША-рецепторов по сравнению с клетками здоровых лиц.

Эффект (+)-МК801 на экспрессию генов транскрипционных факторов, специфичных для Т-клеточных субпопуляций, в лимфоцитах здоровых допоров и доноров-больных рассеянным склерозом

Известно, что процесс терминальной дифференциации СБ4' и СБ8* Т-лимфоцитов в эффекторные клетки в значительной степени определяется активностью транскрипционных факторов (ТФ), специфичных для той или иной субпопуляции Т-клеток. Так, формирование «провоспалительных» ТЫ и ТЬ17 клеток регулируется транскрипционными факторами Т-Ье! (ТВХ21) и 11(Жу1 (КОНС), соответственно (БгаЬо й а1., 2000; Вави е1 а1., 2013). Важную роль в дифференцировке «противовоспалительных» ТЬ2 клеток играет транскрипционный фактор ОАТАЗ (ОЛТЛЗ), а ТФ БОХРЗ (ИОХРЗ) принимает участие в развитии регуляторных клеток Treg (Ра1 е1 а1., 2003; ОкЬига е1 а1., 2013). Доказано, что данные ТФ регулируют формирование субпопуляций СБ8Т Т-лимфоцитов (Тс1, Тс2, Тс 17, CD8+Treg) (Уеп е1

а1., 2009; РгапсевсЫш а а1., 2012; Со1-Ага е1 а1„ 2012).

12

При инкубации стимулированных индукторами дифференциации (ФМА и иономицин) Т-клеток в присутствии антагониста ЫМОА-рецспторов (+)-МК801 отмечалось изменение относительного уровня мРНК генов ТФ (ТВХ21, О Л ТАЗ, РОХРЗ, НО КС) в как у здоровых доноров, так и у доноров - больных РС. В частности, блокада ЫМИА-рецепторов вызывала увеличение экспрессии гена ТВХ21 в среднем на 24% и снижение уровня мРНК гена ЯОЯС в среднем на 50% (табл. 3, группы «ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-МК801»). Следует отметить, что у больных РС по сравнению со здоровыми донорами блокада КМОА-рецепторов угнетала экспрессию данных ТФ в большей степени.

Таблица 3 - Экспрессия генов транскрипционных факторов, специфичных для субпопуляций Т-лимфоцитов, на фоне блокады ^ША-рецепторов Т-клеток здоровых доноров и доноров-больных РС

Здоровые доноры (п=14)

ген контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо+ (+)-МК801

ТВХ21 0.9 (0.9-1.1) 0.9 (0.8-1.7) 1.2 (0.5-1.4) 1.5 (0.6 - 2.3)"

вАТАЗ 1.0 (0.9-1.1) 1.4 (0.5 - 3.0) 0.2 (0.2 - 0.3)* 0.2 (0.1-0.3)"

коле 1.1 (0.7-1.2) 1.0 (0.6-1.6) 3.7 (2.6 - 4.4)* 1.9 (0.6 - 3.0)"

ГОХРЗ 1.1 (0.9-1.2) 1.1 (0.9-1.4) 0.2 (0.1 -0.3)* 0.2 (0.2 - 0.3)

Больные РС доноры (п=15)

ген контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ИОНО+ (+)-МК801

ТВХ21 1.0 (0.8-1.2) 1.4 (0.5-1.5) 0.7 (0.4- 1.2)* 0.8 (0.5- 1.3)

вАТАЗ 0.9 (0.7-1.1) 0.9 (0.8-1.3) 0.4 (0.3 - 0.6)* 0.3 (0.1-0.3)"

ЯОЯС 1.0 (0.7-1.3) 0.8 (0.7-1.5) 1.2 (1.0-3.2) 0.6 (0.4-2.1)"

РОХРЗ 1.1 (0.7-1.3) 1.0 (0.6-1.3) 0.5 (0.3 - 0.7)* 0.2 (0.2-0.6)"

Примечание - Для моделирования дифференцировки Т-лимфоциты (2хЮ6 кл/мл) инкубировали с неспецнфнческими индукторами - форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) и кальциевым ионофором иономицином (25 нг/мл и 1 мкг/мл, соответственно) в течение 4-х часов и (+)-МК801 (10"4 М). Уровень мРНК генов транскрипционных факторов оценивали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Данные представлены в виде Ме (10 - 90 - процентили). Достоверность различий оценивали с помощью и-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры - больные РС) и (-критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп);* — р<0.05 - относительно группы «контроль»; * — р<0.05 относительно показателей в группе «ФМА/ионо».

Принимая во внимание тот факт, что баланс субпопуляций Т-клеток определяет направленность и активность иммунного ответа, представлялось важным оценить влияние блокады NMDA-рецепторов на данный параметр. О смещении баланса субпопуляций судили по изменению соотношения экспрессии маркерных ТФ. Согласно полученным данным, в условиях стимуляции клеток индукторами дифференциации, действие (+)-МК801 приводит к увеличению соотношения TBX21/GATA3 и TBX21/RORC в лимфоцитах здоровых индивидуумов, и менее значимо - в Т-клетках больных PC, и, вероятно, к смещению баланса Thl/Th2 и Thl/Thl7 в сторону Thl клеток. Помимо этого, в обеих экспериментальных группах нами было зафиксировано уменьшение соотношения RORC/FOXP3 при инкубации Т-клеток с (+)-МК801, что возможно, изменяет баланс между регуляторными Treg и IL-17-продуцирующими CD4+ (CD8+) Т-лимфоцитами в сторону Treg клеток.

Таким образом, нами установлено, что NMDA-рецепторы участвуют в регуляции направления дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов посредством влияния на экспрессию генов ТФ, контролирующих данный процесс. Действие антагониста (+)-МК801 на активность генов ТФ и их соотношение у больных PC схоже с таковым у здоровых доноров, однако более выражено.

Влияние (+)-МК801 на соотношение CD4+ и CD8+ Т-клеточных субпопуляций у здоровых доноров и доноров-больных рассеянным склерозом

Для исследования возможного участия NMDA-рецепторов в регуляции содержания основных популяций Т-лимфоцитов, мы оценили влияние (+)-МК801 (КГ4 М) на процентное содержание CD4' и CD8 Т-клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что блокада NMDA-рецепторов не оказывает влияния на содержание CD8+ CD4+ клеток в группах здоровых индивидуумов и пациентов с PC (табл. 4, группы «ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-МК801»). Инкубация интактных клеток с неконкурентным антагонистом (+)-МК801 не сопровождается изменениями отношения CD4+/CD8+ (табл. 4, группы «контроль» и <<(+)-МК801»), Подчеркнем, что значения ИРИ во всех экспериментальных группах в обеих исследованных нами группах доноров находились в диапазоне нормальных значений для данного параметра (1.3 - 2.6).

Таблица 4 - Показатели клеточного иммунитета при блокаде ЫМЭА-рецепторов Т-лимфоцитов здоровых и больных рассеянным склерозом доноров

Здоровые доноры (п = 20)

Иммунологический показатель (% от общей популяции Т-клсток) контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо/ (+)-МК801

%С04+ Т-клеток 48.8 (39.6-55.4) 47.3 (39.1 - 53.6) 45.3 (39.6-49.9)* 44.2 (39.0-49.4)*

%СЭ8Т Т- клеток 29.5 (26.4-31.8) 30.0 (26.8 - 33.3) 31.0 (26.4 - 36.8) 31.2 (26.3 - 37.2)

СЭ4+/С08+ (ИРИ) 1.7 (1.2-2.1) 1.6 (1.2-2.0) 1.5 (1.1-1.9) 1.4 (1.1-1.8)

Больные РС доноры (п = 20)

Иммунологический показатель (% от общей популяции Т-клеток) контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо/ (+)-МК801

%С04~ Т- клеток 48.1 (45.6 - 52.4) 48.7 (47.6-51.8) 45.2 (37.8 - 50.9)* 43.5 (37.0 - 49.5)*

%С08" Т- клеток 31.2 (30.4 - 34.9) 31.1 (29.5 - 32.0) 35.0 (31.6-37.7) 35.6 (30.2 - 39.0)

С04+/СР8+ (ИРИ) 1.6 (1.3-1.7) 1.6 (1.5-1.7) 1.4 (1.0- 1.6)* 1.2 (1.0-1.6)*

Примечание — Анализ СП4+ и С08* популяций Т-лимфоцитов проводили методом проточной цитофлуориметрин после 4-х часовой стимуляции клеток ФМА (10 иг/мл) с иономицином (1 мкг/мл) и (+)-МК801 (10"4 М). ПРИ - иммунорегуляторный индекс. Данные представлены в виде Ме (10 - 90 - процентили). Достоверность различий оценивали с помощью и-критсрия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры - больные РС) и ^критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * — р < 0.05 относительно показателей в группе «контроль».

Эффект блокады ^ЮА-рецепторов на направление дифференцировки и баланс С1)4+ Т-клеточных субпопуляций у здоровых допоров и доноров-больных рассеянным склерозом

Учитывая выявленную нами вовлеченность ЫМОА-рецспторов в регуляцию экспрессии генов ТФ, контролирующих дифференцировку Т-клеточных субпопуляций, нами были изучены последствия блокады ИМОА-рецепторов на субпопуляционный состав эффекторных СЭ4+ Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом. В условиях индуцированной ФМА/иономицином дифференцировки Т-лимфоцитов нами было проведено определение относительного содержания ТЫ, ТЬ2, ТЫ7 и Treg клеток в присутствии или отсутствии антагониста ИМСЛ-рецепторов (+)-МК801 (10"4 М) методом проточной цитофлуориметрин.

Воздействие антагониста ЫМИА-рецепторов на активированные СЭ4+ Т-лимфоциты вызывает снижение процентного содержания 1РКу-, 1Ь-4-, 17-продуцирующих клеток, полученных как от здоровых доноров, так и от больных РС (табл. 5, группы «ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-МК801»). Отметим, что блокада ЫМОА-рецепторов стимулированных лимфоцитов доноров-больных РС сопровождается уменьшением доли преимущественно 1Ь-17-позитивных СР4+ клеток по сравнению с 1Ь-4- и I РЫу-секретиругащими С04+ клетками.

Таблица 5 - Содержание цитокин-секретирующих CD4+ Т-лимфоцитов у здоровых доноров и доноров-больных РС на фоне блокады NMDA-рецепторов

Здоровые доноры (п=20)

Субпопуляция Th-клеток (% от общей популяции Т-кпеток) Группа

контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо/ (+)-МК.801

%CD4+IFNy+-KneTOK 0.1 (0.0-0.1) 0.1 (0.0-0.1) 4.0 (3.4-4.6)" 2.8 (2.3-3.3)"

%CD4+IL-4+-KaeTOK 0.2 (0.0 - 0.2) 0.2 (0.1 -0.2) 1.3 (1.1-1.6)" 1.0 (0.7-1.3)"

%CD4+IL-17+-клеток 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 0.4 (0.3-0.5)" 0.3 (0.2-0.4)"

Больные PC доноры (п=20)

Субпопуляция Th-клеток (% от общей популяции Т-клеток) Группа

контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо/ (+)-МК801

%CD4*IFNy*-KJieroK 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 5.1 (4.5-5.7)" 4.3 (3.8-4.8)"

%CD4'IL-4'-клеток 0.1 (0.1 -0.2) 0.1 (0.1 -0.1) 1.0 (0.9-1.2)" 0.7 (0.5-0.9)""

%CD4"IL-17+-клеток 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 0.4 (0.2 - 0.6)" 0.2 (0.1 -0.3)"*

Примечание — Т-клстки инкубировали с индукторами ФМА (25 нг/мл) и иономицином 1 (мкг/мл) и (+)-МК801 (Ю-4 М) 4 часа. Принадлежность клеток к субпопуляциям CD4" Т-лимфоцитов оценивали по их способности к спонтанной и ФМА/ионо - стимулированной внутриклеточной продукции маркерных цитокинов (IFN-y, IL-4, IL-17) Содержание цитокин-секретирующих клеток определяли методом проточной цитофлуориметрни. Данные представлены в виде Ме (10% - 90%). Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитнн (здоровые доноры и доноры — больные РС) и t-критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * - р<0.05; ** - р<0.01 относительно группы «контроль»; р<0.05; #*-р<0.01 относительно группы «1>МА/ионо».

Обращает на себя внимание факт более выраженного подавления синтеза IL-17 CD4+ лимфоцитами больных РС при сравнении с аналогичным показателем здоровых доноров. В тоже время, в группе пациентов продукция IFNy CD4+ клетками на фоне антагониста NMDA-рецепторов ингибирована в меньшей степени по сравнению со

здоровыми индивидуумами. Таким образом, сопоставление данных показало, что у больных PC, в отличие от здоровых лиц, Th2 и Thl7 клетки более чувствительны, а Thl - менее чувствительны к действию антагониста NMDA-рецепторов.

Последующий анализ соотношений CD4TIFNy7CD4+IL-4+ (Thl/Th2) и CD4+IFNyVCD4+IL-17+ (Thl/Thl7), являющихся маркерами Th-субпопуляцнонного баланса, выявил смещению баланса Thl и Th2 клеток в сторону Thl как у здоровых доноров, так и у больных PC. Помимо этого, анализ соотношения Thl/Thl7 также показал изменение баланса между данными субпопуляциями в сторону Th 1 клеток. К сожалению, в наших экспериментальных условиях нам не удалось провести детекцию CD4+TGFßl+ субпопуляции Т-клеток ввиду их чрезвычайно низкой представленности, в связи с чем данные о влиянии блокады глутаматных рецепторов NMDA подтипа на Treg клетки и баланс Thl7/Treg не представлены.

Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить участие NMDA-рецепторов в «тонкой» регуляции направления дифференцировки CD4+ Т-лимфоцитов. У больных PC изменения субпопуляционного состава CD4+ Т-клеток, наблюдаемые на фоне действия (+)-МК801, выражены сильнее, чем у здоровых лиц.

Эффект блокады NMDA-рецепторов на направление дифференцировки и баланс CD8+ Т-клеточных субпопуляций

Следующим этапом нашего исследования было изучение действия неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801 на содержание Tel (CD8+lFNy+), Тс2 (CD8+IL-4~) и Тс 17 (CD8"IL-17~) клеток у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом. В связи с отсутствием специфических маркеров CD8+ Treg и трудностью их идентификации (Gol-Ara et al., 2012) нами не проводилась оценка влияния блокады глутаматных рецепторов NMDA подтипа на данную субпопуляцию Т-клеток.

Как следует из данных, представленных в таблице 6, (+)-МК801 не оказывает влияние на содержание IFNy-, IL-4- и IL-17- продуцирующих CD8" Т-клеток как в группе здоровых доноров, так и больных PC. Экзогенная стимуляция ФМА/иономицином сопровождается увеличением содержания маркерных цитокинов в CD8+ Т-лимфоцитах здоровых лиц и больных PC. При блокаде NMDA-рецепторов выявлено существенное снижение содержания IL-17-продуцирующих CD8f клеток у больных PC и менее выраженное, статистически достоверное, уменьшение данного параметра у здоровых доноров. Индуцированный синтез IL-4 при действии антагониста NMDA-рецепторов был подавлен как в группе пациентов с PC, так и у здоровых индивидуумов.

Согласно полученным данным отдельные субпопуляции CD8+ Т-клеток проявляют разную чувствительность к действию антагониста. Менее чувствительными оказались Tel клетки, тогда как большую чувствительность к эффекту (+)-МК801 проявили Тс 17 клетки.

Таблица 6 - Содержание цитокин-секретирующих СБ8+ Т-лимфоцитов у здоровых доноров и доноров-больных РС на фоне блокады КМОА-рсцспторов

Здоровые доноры (п=15)

Субпопуляция Тс-клеток (% от общей популяции Т-клеток) Группа

контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо+ (+)-МК801

%CD8"lFNy*"-K.TCTOK 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 8.2 (6.9 - 10.5)" 6.1 (4.9 - 7.9)"

%CD8'lL-4 "-клеток 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 0.9 (0.6-1.2)" 0.7 (0.5 - 0.9)**

%CD8+IL-17+-клеток 0.1 (0.0-0.1) 0.1 (0.0-0.1) 0.3 (0.1-0.5)" 0.1 (0.1 -0.2)**

Больные PC доноры (п=15)

Субпопуляция Тс-клеток (% от общей популяции Т-клеток) Группа

контроль (+)-МК801 ФМА/ионо ФМА/ионо+ (+)-МК801

%CD8+IFNy+-KneTOK 0.1 (0.0-0.1) 0.1 (0.0-0.1) 15.8 (10.1 - 17.5)" 12.4 (9.0 - 13.8)*

%СЭ8+1Ь-4+-клеток 0.1 (0.0-0.1) 0.1 (0.0-0.1) 1.2 (0.8-1.9)" 0.7 (0.5 - 0.9)"

%CD8+IL-17+-клеток 0.0 (0.0-0.1) 0.0 (0.0-0.1) 0.3 (0.2 - 0.4)" 0.1 (0.1 -0.2)**

Примечание - Т-клетки инкубировали с индукторами ФМА (25 нг/мл) и иономицином 1 (мкг/мл) и (+УМК801 (10"4 М) 4 часа. Принадлежность клеток к субпопуляциям CD8+ Т-лимфоцитов оценивали по их способности к спонтанной и ФМА/ионо - стимулированной внутриклеточной продукции маркерных цитокинов (IFN-y, IL-4, IL-17) Содержание цитокин-секретирующих клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии. Данные представлены в виде Ме (10% - 90%). Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры — больные PC) и t-критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * - р<0.05; ** - р<0.01 относительно группы «контроль»; *-p<o.o5;**-p<o.oi относительно группы «ФМА/ионо».

Анализ изменения соотношений CD8TIFNy+/CD8+IL-4+ (Tcl/Tc2) и CD8+IFNy+/CD8+IL-17+ (Tcl/Tcl7) на фоне блокады NMDA-рецепторов показал увеличение соотношения Тс1/Тс2 и Тс1/Тс17, что свидетельствует о смещении баланса в сторону Tel у здоровых доноров. У больных PC наблюдалась аналогичная тенденция, однако, более выраженная.

Таким образом, показано, что NMDA-рецепторы участвуют в тонкой регуляции процесса и направления дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, как у здоровых лиц, так и у больных PC. Полученные данные об эффектах (+)-МК801 на Т-лимфоциты больных PC отражают важность данного типа рецепторов в патогенезе PC и подчеркивают перспективность использования данного подтипа рецепторов в качестве мишени для разработки новых терапевтических подходов.

Гены, дифференциально экспрессирующиеся при блокаде NMDA-рецепторов в Т-клетках у здоровых доноров и доноров-больных рассеянным склерозом

Поиск паттернов генов, регулируемых NMDA-рецепторами Т-клеток, был проведен с использованием коммерческого набора «Human Signal Transduction PathwayFinder PCR Array» в условиях TCR-опосредованной активации Т-клеток.

В ходе сравнительного анализа экспрессии 84 генов, представляющих 18 различных путей передачи сигнала, нами по результатам трех независимых экспериментов были установлены изменения уровня мРНК 24 генов в aCD3/aCD28-aKTHBnpoBaiiiibix Т-лимфоцитах на фоне действия (+)-МК801. Данные, полученные с помощью коммерческого набора, далее верифицировали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (п=10). Результаты нормализовали по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» HPRT1. Совокупные данные по результатам, полученным с помощью набора и ОТ-ПЦР, представлены в таблице 7.

При помощи онлайн ресурса «STRING» был проведен анализ возможных взаимодействии среди 12 продуктов генов, экспрессия которых изменилась при блокаде NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов. Реконструкция сети белок-белковых взаимодействии показала взаимосвязь 8 из 12 генов. С использованием программы «STRING» были установлены потенциальные функциональные партнеры выявленных генов, среди которых - TF (трансферрин), ТР53 (белок р53), DIABLO (митохондриальный белок, связывающий ингибиторы апоптоза, IAP), TRAF1 (фактор 1, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли), TRAF2 (фактор 2, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли), CDK4 (циклин-зависимая киназа 4), CDK6 (циклин-зависимая киназаб), MDM2 (онкоген, ЕЗ-лигаза системы убиквиган-зависимого протеолиза), PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), CASP9 (каспаза 9).

Последующий in silico анализ выявленных групп генов с помощью биоинформационного ресурса «DAVID» (Huang et al., 2009) и классификационной

системы «PANTHER» (Thomas et al., 2003) показал, что данные генов участвуют в регуляции таких ключевых функций Т-лимфоцитов, как пролиферация (IL4, VCAM1, CDKN2A), апоптоз (ВАХ, МУС, CDKN2A, HSPB1) активация (IL4R, IL4, VCAM1, CDKN2A) и дифференцировка (IL4, VCAM1, ВАХ).

Таблица 7 - Дифференциальная экспрессия генов в Т-клетках здоровых

доноров при блокаде NMDA-рецепторов на фоне TCR-опосредованной активации

Название гена Путь передачи сигнала Изменение уровня экспрессии Достоверность отличий (р)

HPRT1 - 1.00±0.13 -

IL4R .1ак-8ТАТ 0.02 ±0.01 0.00

VCAM1 NF-кB; РЬС-зависимый путь 0.14 ±0.02 0.00

IL4 .1ак-8ТАТ 0.25 ± 0.04 0.00

GADD45A р53 0.32 ±0.01 0.02

BIRC2 ОТ-кВ 1.73 ±0.22 0.04

ВАХ р53 2.13 ±0.30 0.03

HSPB1 стрессовый путь 3.18 ± 0.31 0.03

МУС инозитол-3 киназа/АКТ; Са2 -и РКС- зависимый путь 3.37 ±0.32 0.01

CDKN2A Тврр-зависимый путь 5.66 ± 0.24 0.00

TFRC Са~+ и РКС-зависимый путь 18.02 ±2.11 0.00

GYSI инсулин-зависимый путь 53.11 ± 1.98 0.00

ММР7 инозитол-3 киназа/АКТ-путь 77.04 ±5.11 0.00

В ходе исследования экспрессионного профиля антиген-активированных Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с PC, на фоне блокады NMDA-рецепторов нами выявлено 37 из 84 генов, изменяющих уровень экспрессии в Т-клетках в ответ на действие антагониста (+)-МК801. Дальнейшее подтверждение полученных результатов с использованием ОТ-ПЦР в режиме реальном времени подтвердила изменения экспрессионного статуса для 20 из 37 генов (табл. 8, п=6).

Анализ взаимодействий белковых продуктов 20 генов, проведенный с помощью программы «STRING», показал, что продукты 12 из 20 генов образуют взаимосвязанную сеть. Согласно данным программы, потенциальными функциональными партнерами выявленных ДЭГ, могут являться гены, кодирующие белки JUN (протоонкоген, фактор транскрипции c-Jun), CDK2 (циклин-зависимая киназа 2), CDK4 (циклин-зависимая киназа 4), IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1), CCND1 (циклин Dl), CCND3 (циклин D3), CSF2RA (рецептор колониестимулирующего фактора), SKP2 (киназа-ассоциированный белок S-фазы 2), CDC37 (ко-шаперон белка теплового шока HSP90), CASP8 (каспаза 8).

Функциональный анализ групп генов с помощью баз данных «DAVID» и «PANTHER» выявил, что блокада NMDA-рецепторов сопровождается изменением экспрессии генов, вовлеченных в процессы апоптоза (ВАХ, FAS , NAIP, BIRC3,

CDKN1B, GADD45A, MYC), контроля клеточного цикла (CDKN1B, GADD45A, MYC, FOS), клеточной активации (FAS, CCL20, CSF2, IL2, ILS), регуляции цитокиновой системы (FAS, CCL20, CSF2, IGFBP3, IL2, IL8), фосфорилирования (CSF2, CDKN1B, GADD45A. IGFBP3, IL2).

Таблица 8 - Дифференциальная экспрессия генов в Т-клетках доноров-больные PC

при блокаде NMDA-рецепторов на фоне TCR-опосредованной активации

Название гена Путь передачи сигнала Изменение уровня экспрессии Достоверность отличий (р)

HPRTI - 1.00 ±0.13 -

BIRC3 №-кВ 0.15 ±0.02 0.03

FASN Инсулин-зависимый путь 0.15 ±0.02 0.00

CSF2 Са2^ и РКС- зависимый путь 0.17 ±0.02 0.02

GADD45A р53 0.20 ±0.05 0.00

BCL2A1 ОТ-кВ 0.21 ±0.01 0.00

HSP90AA2 стрессовый путь 0.26 ± 0.03 0.00

ILS ОТ-кВ 0.27 ±0.06 0.01

CDKN1B ТСЬ|1 путь 0.28 ± 0.03 0.02

IGFBP3 р53 0.29 ± 0.02 0.00

CCL20 NF-кB 0.30 ±0.02 0.04

РТСН1 Hcdgchog-пyть 0.31 ±0.03 0.03

ODC1 Са2+ и РКС-зависимый путь 0.32 ± 0.06 0.00

1L2 ОТ-кВ 0.34 ± 0.02 0.01

FOS стрессовый путь 0.34 ± 0.03 0.04

ENI путь ретиноевой кислоты 0.34 ± 0.04 0.02

MYC инозитол-3 кииаза/АКТ; Са"^-н РКС-зависимый путь 0.36 ± 0.03 0.01

NAIP стрессовый путь 0.39 ±0.04 0.01

HOXAI путь ретиноевой кислоты 0.40 ± 0.06 0.03

FAS р53 0.45 ±0.11 0.04

WISPI Wnt-пyть 5.06 ± 0.95 0.04

Таким образом, впервые были идентифицированы гены и сигнальные пути, регулируемые КМОА-рецепторами Т-клеток у здоровых лиц и больных РС. Более того, подтверждено предположение о том, что ЫМОД-рсцепторы Т-лимфоцитов участвуют в модуляции жизненноважных функций клеток иммунной системы при РС.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние ЫМБА-рецепторов на секрецию и синтез Т-лимфоцитами, полученными от больных РС доноров, провоспалительных ОИКу, ТЫРа) н противовоспалительных (1Ь-10) цитокинов, а также обладающего плейотропным действием 1Ь-6. Показано, что уменьшение секреции при блокаде ЫМОА-рецепторов селективным антагонистом (+)-МК801 связано с ингибированием

экспрессии генов соответствующих цитокинов. По сравнению со здоровыми донорами, у больных PC негативный эффект блокады данного подтипа глутаматных рецепторов выражен слабее.

2. Показано, что блокада NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов неконкурентным антагонистом (+)-МК801 не сопровождается изменением иммунорегуляторного индекса (ИРИ, соотношения содержания CD4+/CD8 Т-клеток) у пациентов с PC и здоровых лиц.

3. Установлен ингибирующий эффект блокады NMDA-рецепторов на процесс дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов больных PC. Показано подавление (+)-МК801 экспрессии генов ключевых транскрипционных факторов GATA3, FOXP3, RORyt и увеличение уровня мРНК гена, кодирующего ТВХ21. При блокаде глутаматных рецепторов NMDA подтипа выявлено снижение относительного содержания IFNy-, IL-4-, IL-17-продуцирующих субпопуляций CD4+ и CD8", в большей степени выраженное у больных PC.

4. Показано, что различные субпопуляции CD4f и CD8' Т-клеток обладают разной чувствительностью к блокаде NMDA-рецепторов. Так, у больных PC по сравнению со здоровыми лицами эффект блокады NMDA-рецепторов оказался более значимым в отношении Thl7 и Тс 17 клеток.

5. Сопоставление данных, полученных при исследовании влияния блокады NMDA-рецепторов на субпопуляционный баланс CD4+ и CD8+ Т-клеток здоровых доноров и больных PC, показало у последних большее смещение направления дифференцировки лимфоцитов в сторону ТЫ и Tel клеток.

6. Выявлено, что блокада NMDA-рецепторов приводит к количественным изменениям уровней мРНК ряда генов, задействованных в различных сигнальных путях и биологических процессах в Т-лимфоцитах при PC, таких как апоптоз, клеточный цикл, пролиферация, продукция цитокинов и дифференцировка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов регулируют синтез цитокинов у больных рассеянным склерозом / У.Ш. Фаткуллина, Л.Ф. Зайнуллина, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Иммунология. - 2013. - Т.34. -№6. - С.339-343.

2. Кузьмина У.Ш. NMDA-рецепторы регулируют продукцию IL-17 CD4+ и CD8+ Т-клетками при рассеянном склерозе / У.Ш. Кузьмина, Л.Ф. Зайнуллина, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Иммунология. - 2015. - Т.36. - №1. - С. 13-18.

3. Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Регуляция NMDA-рецепторами Т-лимфоцитов экспрессии генов, специфичных для Th субпопуляций, у больных рассеянным

склерозом / У.Ш. Фаткуллина, С.М. Фаррахова, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Цитология. - 2012. - Т. 54. - №9. - С. 711-712.

4. Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Регулируемая NMDAR экспрессия генов в лимфоцитах больных рассеянным склерозом / У.Ш. Фаткуллина, С.М. Фаррахова, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», Москва. - 2012. - С. 65.

5. Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Поиск генов, регулируемых NMDA-рецепторами, в Т-лимфоцитах человека / Л.Ф. Зайнуллина, У.Ш. Фаткуллина, Ю.В. Вахитова // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», Москва. - 2012. - С. 27.

6. Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Идентификация путей сигнальной трансдукции от NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах / Л.Ф. Зайнуллина, У.Ш. Фаткуллина, Ю.В. Вахитова // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. Москва,- 2013. - Т. 1. - С. 28-33.

7. Кузьмина У.Ш. Роль NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-лимфоцитов человека / Л.Ф. Зайнуллина, У.Ш. Кузьмина, Э.Р. Кудояров, В.А. Вахитов // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды», Уфа. - 2013. - С. 82.

8. Fatkullina (Kuzmina) U.Sh. The subunit composition of NMDA-receptors in human T-lymphocytes / L. Zainullina, U.Sh. Fatkullina, Y.V. Vakhitova // 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology", Saint Petersburg. - 2013. - P. 192.

9. Fatkullina (Kuzmina) U.Sh. The involvement of NMDA-receptors in cytokine production of T-lymphocytes in MS / U.Sh. Fatkullina and Y.V. Vakhitova // 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology", Saint Petersburg. - 2013. - P. 275.

10. Кузьмина У.Ш. Влияние NMDA-рецепторов на дифференцировку CD4+ Т-клеток при рассеянном склерозе / У.Ш. Кузьмина, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Материалы VII Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Аутоиммунные заболевания нервной системы» -единство и многообразие», Новосибирск,- 2015,- С. 14.

11. Кузьмина У.Ш. Участие глутаматных рецепторов NMDA подтипа в иммунопатогенезе рассеянного склероза / У.Ш. Кузьмина, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Нейроиммунология. - 2015. - T. XII. -№ 1-2. - С. 61-62.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДЭГ - дифференциально экспрессирующиеся гены; ИРИ - иммунорегуляторный

индекс; МКА - моноклональные антитела; PC - рассеянный склероз; ФМА- 4-форбол-

12-миристат-13-ацетат; ХМ DA - //-мепи-£)-аспартат; Тс - цитотоксические

Т-лимфоциты; TCR - Т-клеточный рецептор; Th - Т-хелперные клетки.

Подписано в печать 08.07.2015. Бумага офсетная. Формат 60X84/16. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,40. Тираж 100 экз.

Типография ИИЯЛ УНЦ РАН Г.Уфа, пр. Октября, 71. тел. (347)235-60-50