Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических В-клеток

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических В-клеток"

На правах рукописи

Степанов Алексей Вячеславович

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ-КИЛЛЕРОВ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ В-КЛЕТОК

Специальность 03.01.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

6 ИХ:ЦШ

005061132

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научные руководители: Кандидат химических наук

Белогуров Алексей Анатольевич Доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна

Официальные оппоненты: Доктор химических наук

Уткин Юрий Николаевич. Доктор биологических наук Купраш Дмитрий Владимирович.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук.

Защита состоится «27» июня 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Автореферат разослан _ _2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор физико-математических наук Олейников В. А.

I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Рассеянный склероз - это хроническое воспалительное нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы с неизвестной этиологией. Патогенез данного заболевания включает в себя повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. Более миллиона человек болеет рассеянным склерозом во всем мире. Основную роль в патологическом процессе демиелинизации аксонов отводят Т- и В-клеткам, специфичным к компонентам миелиновой мембраны. Список потенциальных аутоантигенов постоянно расширяется и включает в себя различные белки, ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Аутореактивные лимфоциты, специфичные к данным белкам, совместно с макрофагами проникают через гематоэнцефалический барьер и индуцируют процессы воспалительной демиелинизации в ЦНС.

Вопреки впечатляющему массиву клинических, иммунологических и биохимических данных, а также частично изученным молекулярным механизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшний день не существует лекарства, способного полностью остановить патологические процессы при рассеянном склерозе. Препараты, имеющиеся в распоряжении врачей, могут лишь снизить частоту и тяжесть обострений, а также замедлить темпы накопления неврологического дефицита, что подтверждается данными магнитно-резонансной томографии головного и спинного мозга.

Таким образом, дальнейшее совершенствование существующих подходов или же разработка новых перспективных методов терапии рассеянного склероза является задачей первостепенной важности.

Цель работы и основные задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в разработке подходов антиген-специфичной терапии, включающих в себя индукцию иммунотолерантности, а также селективную элиминацию аутореактивных В-клеток, специфичных к миелиновым антигенам.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определение и сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

2. Создание композиций иммунодоминантных фрагментов ОБМ, инкапсулированных в однослойные маннозилированные липосомы, и последующая терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс линии DA.

3. Создание панели белков-киллеров, способных к специфической элиминации В-клеток, на основе барназы, каталитических доменов псевдомонадного и шига-подобного токсинов, а также константных доменов иммуноглобулинов мыши и человека. Сравнительный анализ функциональной активности созданных молекул и выбор наилучшего цитотоксического агента.

4. Направленная элиминация аутореактивных В-клеток in vivo у мышей линии SJL полученными белками-киллерами на основе иммунодоминантного фрагмента ОБМ и выбранного цитотоксического агента.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые были определены иммунодоминантные по В-клеточному ответу фрагменты основного белка миелина (ОБМ) у пациентов с рассеянным склерозом (РС) в сравнении с рядом животных моделей, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). Совместное введение данных пептидов в составе маннозилированных однослойных липосом в DA крыс с ЕАЕ показало существенное снижение общего течения заболевания, значительно ускорило полное восстановление животных и привело к подавлению демиелинизационного процесса. При терапии липосомированными пептидами ОБМ было обнаружено снижение уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИФНу, а также стимуляция секреции нейротропного фактора мозга в ЦНС. Полученные результаты послужили основой для дальнейшего продвижения разработанных композиций в качестве перспективного лекарственного средства для терапии рассеянного склероза, которое на сегодняшний день находится на второй стадии клинических испытаний.

В процессе выполнения работы была создана панель селективных белков-киллеров В-клеток на основе РНКазы барназы, каталитических доменов псевдомонадного токсина и шига-подобного токсина E.coli, а также константных доменов иммуноглобулинов мыши и человека. После ex vivo экспериментов, проведенных на модельных системах, были отобраны наиболее перспективные цитотоксические молекулы на основе барназы и константного домена иммуноглобулина. Заключительный эксперимент, проведенный in vivo на мышах линии SJL с индуцированным ЕАЕ, подтвердил значительный терапевтический потенциал константного домена иммуноглобулина мыши, слитного с иммунодоминантным фрагментом ОБМ. Двукратное внутривенное введение данной молекулы приводило к полному подавлению популяции В-клеток, специфичных к выбранным на первом этапе фрагментам ОБМ. Полученные данные могут служить основой для дальнейшего получения препаратов антиген-специфичной терапии, способных не только купировать обострение, но и существенно облегчить течение рассеянного склероза.

Публикация и апробация работы.

По теме работы опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК. Результаты работы были представлены на 4 конференциях: Biocatalysis 2009: Fundamentals & Applications, (2007, Архангельск); Российская школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (2010, Казань); V Российский симпозиум «Белки и пептиды», (2011, Петрозаводск); Научная конференция «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», (2011, Москва);

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 107 страницах и содержит 36 рисунков и 7 таблиц.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Для анализа специфичности сывороточных аутоантител использовали созданную

ранее эпитопную библиотеку фрагментов ОБМ, слитных с белком-носителем тиоре-

доксином (Рис. 1). Каждый белок эпитопной библиотеки содержал белок-носитель

тиоредоксин (Тгх), один из 12 взаимно перекрывающихся фрагментов ОБМ, а также

шус эпитоп. Для подтверждения работоспособности созданной библиотеки эпитопов,

очищенные белки разделяли в 12% ПААГ, а затем, после переноса на нитроцеллю-

лозную мембрану, гибридизовали с анти-myc и анти-ОБМ антителами (Рис. 1).

А (тгкнониелГ^у-ЛимеЯ^ЩЩ^ЦРис. 1. Схематическое изображение эпитоп-

ной библиотеки фрагментов ОБМ, слитных с

Б эпитопная библиотека ОБМ беЛКОМ-НОСИТеЛеМ ТИОреДОКСИНОМ. Электро-

■ ., : # ^ .л / форетический анализ белков эпитопной биб-

лиотеки в 12% ПААГ, окрашенный Кумасси.

----~ оккшинанто Кумасси ВеСТерн-блОТ аНЭЛИЗ белков ЭПИТОПНОЙ биб-

— ^ — щт !■ ^ ^ **—* — ^---гибридизация с ¿> myc mai лиотеки с контрольными анти-myc и анти-

ОБМ антителами.

гибридизация с а-ОБМ мАг

9 10 11 12

После проведенной верификации библиотека эпитопов была использована для дальнейшего тестирования сывороточных аутоантител из пациентов с РС и грызунов с индуцированным ЕАЕ (Рис. 2). Наличие перекрывающихся последовательностей ОБМ в составе белков эпитопной библиотеки позволяет более точно детерминировать предположительный эпитоп ауторе-активных В-кпеток. В результате анализа полученных данных у мышей линии С57В176 был обнаружен один иммунодоминантный эпитоп ОБМ!24 -¡47, в то время как у мышей линии 8.117.1 и у крыс линии П)А два (ОБМ24-44, ОБМ72-139 и ОБМ40-бо, ОБМ107-17П соответственно). У пациентов с рассеянным склерозом были выявлены три имуно-доминантных эпитопа: ОБМц.бб, ОБМ84.юо и ОБМ) 15-170, что оказалось в значительной степени схоже с данными по связыванию аутоантител, полученных из ОА крыс (Рис.

5

2Б). На основе первичного скрининга для дальнейшего изучения подходов по индукции толерантности и направленной элиминации В-клеток были выбраны крысы линии ОЛ и мыши линии 8.1 Ь, соответственно.

Для формирования аутоантител у крыс ЭА с ЕАЕ не только к С-концевой последовательности, но и к иммунодоминантному фрагменту ОБМ8з_ю4, а также для получения более стабильно воспроизводимой модели ЕАЕ, для дальнейших иммунизаций нами был выбран пептид ОБМ6з-81- Образцы крови, полученные у крыс, иммунизированных ОБМ(,з.8ъ были проанализированы на наличие связывания аутоантител с ОБМ и его фрагментами в составе эпитопной библиотеки (Рис. ЗА). В результате данного эксперимента были обнаружены 3 иммунодоминантные последовательности ОБМ: МОНА1ШСРЬР1Ш, ООЕЫРУУНРРКМУ и 1РКЬСОкП>81«С8РМАЯК.

Для количественной оценки аффинности сывороточных аутоантител, полученных из ВА крыс с ЕАЕ, к выбранным фрагментам ОБМ нами были произведены измерения констант диссоциации аутоантител методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе ВтСоге Т-200. Анализ полученных данных показал, что константа диссоциации сывороточных аутоантител составляет 2-10"8 М в случае ОБМ как ли-ганда, МО'8 М для энцефалитогенного и 0.8-10"8 М для С-концевого фрагмента ОБМ. Константу диссоциации процесса взаимодействия аутоантител с пептидом МОНАК! ЮРЬРКН посчитать не представлялось возможным (Рис. ЗБ). В конечном

итоге для дальнейшего создания действующих композиций антиген-специфической терапии,

Рис. 2. А) Индивидуальный профиль связывания сывороточных аутоантител, изолированных из пациентов с РС (градиентная окраска) в сравнении со здоровыми донорами (верхняя левая панель) и грызунами с индуцированным ЕАЕ (мыши 5Л, крысы линии РА, мыши линии С57В1_/6; по часовой стрелке, начиная с правой верхней панели. Профили сравнения представлены голубым сетчатым полем). Б) Интегральная специфичность сывороточных аутоантител в каждой из исследуемых групп. Латинскими буквами А-й отмечены обнаруженные иммунодоминантные фрагменты ОБМ. Цифрами 1- 12 обозначены перекрывающиеся фрагменты ОБМ в составе эпитопной библиотеки.

индуцирующих иммунотолерантность, нами были отобраны следующие пептиды: ОБМ46.62 (ОБМ1), ОБМ|24_,39 (ОБМ2) и ОБМ|47.,70 (ОБМЗ).

При анализе сывороточных аутоантител, выделенных из мышей линии SJL с ЕАЕ, индуцированным ОБМ, уровень гибридизации с 7 фрагментом оказался значительно выше по сравнению с 6 и 8 фрагментами библиотеки эпитопов ОБМ (Рис. 2). Можно предположить, что основной сайт связывания с сывороточными антителами включает в себя полностью последовательность пептида 7 (TQDENPVVHF-FKNIVTPRTPPPS), а связывание с 6 и 8 фрагментами объясняется взаимодействием с С-концевой последовательностью 6 пептида (QDENPVVHFFK) и N-концевой последовательностью 8 пептида (FKNIVTPRTPPPSQG). Помимо центральной части ОБМ, высокий уровень сигнала ИФА был обнаружен для 10 пептида ОБМ.

Рис. 3. Анализ специфичности и аффинности поликлональных аутоантител изолированных из DA крыс, иммунизированных пептидом ОБМбэ-81. А) Гибридизация с белками эпитопной библиотеки ОБМ сывороточных антител, выделенных из крыс DA с индуцированным ЕАЕ. Б) Измерение констант диссоциации поликлональных антител из крыс DA с индуцированным ЕАЕ по отношению к ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам.

Аналогично крысам линии DA мы провели оптимизацию протокола и в случае индукции ЕАЕ у мышей линии SJL. Для этого в качестве основного нейроантигена был использован гомогенат спинного мозга мыши (ГСММ). Известно, что при индукции ЕАЕ ГСММ у SJL, по сравнению с ОБМ, происходит более интенсивное развитие симптомов заболевания. Данный способ индукции приводит к более воспроизводимой модели данной патологии. При индукции ЕАЕ у мышей SJL с применением ГСММ, профиль специфичности аутоантител к ОБМ в большей степени совпадает с сыворотками больных рассеянным склерозом. Так как при индукции ЕАЕ у мышей SJL с помощью ГСММ наибольший титр анти-ОБМ антител формируется к иммунодоминантному фрагменту ОБМ (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG), данная аминокислотная последовательность была интегрирована в состав рекомбинантных молекул, способных селективно элиминировать аутореактивные В-клетки. Белки-киллеры, содержащие фрагмент 11 ОБМ (RASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKL), к которому не наблюдается формирования аутоантител, были использованы в качестве отрицательного контроля.

Создание липосом, содержащих инкапсулированные фрагменты ОБМ.

Для повышения эффективности антиген-специфичной терапии отобранные ранее иммунодоминантные пептиды ОБМ были инкапсулированы в однослойные липо-сомы (SUV), несущие остатки маннозы на своей поверхности. Основное преимущество данной композиции заключается в том, что немодифицированные иммунодоминантные пептиды представлены в нативном виде внутри липосомы, в то время как маннозные остатки на ее поверхности обеспечивают адресную доставку липосомных наноконтейнеров в антиген-представляющие клетки (АПК).

Липосомы состояли из смеси L-a-фосфатидилхолина (Egg PC) с мономаннозил диолеил глицерином DOG (MannDOG) (Рис. 4А) в молярном соотношении 100 к 1. Процесс получения наноконтейнеров включал в себя следующие этапы (Рис. 4Б): (12) Формирование неупорядоченных липидных слоев при выпаривании органического растворителя с последующей первичной регидратацией, приводящей к формированию многослойных липосом. (3) Обработка липосом высоким давлением с образованием однослойных липосом. (4) Криосушка однослойных липосом с добавленными пептидами. В результате осуществления данной стадии пептиды оказывались расположены между сжатыми однослойными липосомами. (5) Инкапсуляция пептидов в однослойные липосомы размера 60-100 нм, содержащих 1% маннозных остатков на своей поверхности, происходит во время вторичной регидратации.

Рис. 4. Схема создания наноконтейнеров с инкапсулированными фрагментами ОБМ. А) Химические формулы липидов Egg PC и MannDOG, использованных для создания липосом. Аминокислотные последовательности пептидов ОБМ1, ОБМ2 и ОБМЗ, использованных для создания липосо-мальных композиций. Б) Процесс получения липосомных наноконтейнеров.

Для подтверждения преимущества доставки пептидов в составе маннозилированных липосом по сравнению с липосомами без остатков маннозы, были созданы липосомные композиции полипептида, содержащего последовательность myc-эпитопа: myc mSUV и туе SUV (индекс т означает наличие маннозы). Далее полученные липосомы в различных концентрациях инкубировали 2 часа с дендритными клетками, изолированными из крови крысы. После этого клетки отмывали, лизировапи и далее осветленный гомогенат переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Количество myc пептида, интернализованного в дендритные клетки, в зависимости от изначальной концентрации липосом и наличия или отсутствия маннозы на их поверхности анализировали гибридизацией с анти-myc антителами. Для определе-

ния эквивалентности количества нанесенных клеточных лизатов мембрану дополнительно гибридизовали с антителами, специфичными к актину (Рис. 5А). Интенсивность сигнала после окрашивания была оценена денситометрически на приборе Ver-saDoc (BioRad) (Рис. 5Б). Как видно из Рис. 5, количество туе пептида в клеточном лизате после инкубации дендритных клеток с шус-содержащими маннозилированны-ми mSUV липосомами заметно выше, чем при инкубации с шус SUV. Данное наблюдение подтверждает более высокую эффективность захвата дендритными клетками маннозилированных липосом, по сравнению с не маннозилироваными.

^ Лизат дендритных клеток ^

Липосомы содержащие 20 с-тус пептид (мг/мл)

2.5 О 1/200

m!

о <

MannüOG +

анти-актин Ат контроль конц. белков

Рис. 5. Сравнение эффективности ин-тернализации полипептида, содержащего туе эпитоп, в составе липосом с МаппРОб и без. А) Гибридизация клеточного лизата дендритных клеток с антителами к туе эпитопу и актину. Б) Денситометрический анализ количества интарнализованного туе пептида.

Антиген-специфичная иммуномодулирующая терапия ЕАЕ у крыс линии DA пептидами ОБМ, инкапсулированными в липосомы.

Для проведения дальнейших экспериментов были созданы четыре варианта различных композиций липосом, включающих в себя как индивидуально каждый из трех пептидов, так и эквимолярную смесь пептидов для изучения потенциального си-нергетического эффекта. Для изучения терапевтических свойств полученных форму-ляций мы проводили подкожные инъекции пептидов в составе липосом крысам линии DA с индуцированным ЕАЕ (Рис. 6А). В качестве положительного и отрицательного контроля нами были использованы терапевтический препарат Copaxone (синтетический сополимер L-аминокислот Glu, Lys, Ala и Туг) и липосомы, не содержащие пептиды ОБМ, соответственно. Терапию начинали в момент проявления первых клинических признаков развития заболевания. В группе животных, которым вводили пустые липосомы, наблюдалась наибольшая смертность (3/20), один смертельный случай был зарегистрирован в группе ОБМ2 mSUV (1/23), в остальных группах смертельных случаев зафиксировано не было (Табл. 1).

Табл. 1. Средние максимальная и кумулятивная степень развития ЕАЕ у крыс линии DA при введении различных липосомальных композиций в сравнении с Copaxone и контрольной группой.

Средняя максимальная степень Средняя кумулятивная степень развития заболевания (IQR3) развития заболевания (IQR3)

22(12.5) 17 (5.5)' 17.5 (26.75)2

Инъекции

3 (0.5) 2(1)' 3 (0.75)2

Количество летальных исходов

3/20 0/22 1/23

3(0У 15 (II)2 0/25

3(0.75)' 14(5.25)' 0/24

22 2(1.25)' 18.5 (12.5)2 0/22

21 3 (0.5)2 19.5 (22)2 1/21

'р<0.05 статистически достоверное различие в сравнении с отрицательным контролем; дисперсионный анализ для непара-мегрической статистики методом Вилкоксона. 2р>0.05 статистически недостоверное различие в сравнении с отрицательным контролем; дисперсионный анализ для непараметрической статистики методом Вилкоксона. 3Интерквартильное значение.

без терапии ОБМ1 mSUV ОБМ2 mSUV ОБМЗ mSUV ОБМ 1/2/3 mSUV Copaxone ОБМ1

Количество животных в группе 20

22

23 25

24

Из данных таблицы i следует, что в группах животных, которым вводили ОБМ1 mSUV, ОБМ 1/2/3 mSUV и Copaxone, наблюдалось максимальное статистически достоверное снижение уровня развития заболевания. Введение ОБМ1 mSUV эффективно подавляло развитие заболевания на начальной стадии (Рис. 6Б), в то время как пептиды ОБМ2 и ОБМЗ снижали уровень развития заболевания на стадии вторичного обострения (Рис. 6Б). Совместное введение пептидов ОБМ1/2/3 значительно снижало степень развития симптомов ЕАЕ на всех стадиях, о чем свидетельствует самое низкое во всех группах значение средней кумулятивной степени развития заболевания (Табл. 1; Рис. 6В). Применение Copaxone (Рис. 6) оказалось близким по эффективности к действию смеси ОБМ1/2/3 в составе липосом. Основным преимуществом терапии инкапсулированными пептидами ОБМ над Copaxone является полное восстановление крыс после проведения терапии. Как и ожидалось, введение пептида ОБМ1 без предварительной инкапсуляции в липосомы значительно снижает его терапевтический эффект (Рис. 6), что свидетельствует о важности использования процесса липо-сомирования в предложенном подходе.

Для подтверждения терапевтического эффекта созданных композиций из каждой экспериментальной когорты нами было отобрано по одному животному со средним профилем развития ЕАЕ, характерным для каждой группы (Рис. 7А). Криосрезы спинного мозга отобранных животных были обработаны красителем гемактоксилин-эозин (Рис. 7Б) для визуализации процессов глиозиса и демиелинизации в ЦНС (в баллах от 0 до 3). В результате проведенного гистологического анализа было подтверждено изначальное наблюдение, свидетельствующее об эффективности ОБМ2 по подавлению пиковой тяжести заболевания. Из рисунка 17 очевидно, что ОБМ1 и ОБМ2, в свою очередь, ускоряют выход животных на стадию полного выздоровления.

Дополнительно в опытных группах нами были сопоставлены титры сывороточных антител к полноразмерному ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам ОБМ8,_ юз и ОБМ|46_|70. При введении композиций ОБМ1 mSUV, ОБМ1/2/3 mSUV и Copaxone, в сравнении с контрольной группой, наблюдалось значительное снижение титра антител к ОБМ и его фрагментам (Рис. 8). Несмотря на то, что иммунодоминантный фрагмент ОБМ8]_юз не был включен в состав ни одной из липосомных композиций, следует отметить снижение уровня аутоантител к данному эпитопу в сыворотках леченых крыс. Одновременно с понижением титра аутоантител введение ОБМ1 mSUV, ОБМ1/2/3 mSUV и Copaxone крысам DA с ЕАЕ значительно снижает присутствие в ЦНС провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФНу, а также повышает концентрацию нейротрофического фактора головного мозга (НФГМ), ответственного за развитие нейронов (Рис. 9). Эти данные находятся в соответствии с гистологическими срезами спинного мозга, окрашенными красителем luxol fast blue, который визуализирует повреждения миелиновой оболочки аксонов.

т!>иу 0БМ1т*>ЦУ 0ЬМ2т$ЦУ ОЬМЗпАЦУ

• «А ф А

гнЬиУ ОЬМ1

ндукция ЕАЕ

I IIЩ

гсии, ' г 4-1

| Вц^

I ■

"I

ЧШТ

20 28

Рис. б. Терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в крысах линии РА иммуно-доминантными петидами ОБМ, инкапсулированными в липосомы. А) Схематическое изображение вводимых композиций с указанием состава и количества инкапсулированных пептидов. Б) Экспериментальные группы животных оценивали по усредненной степени развития симптомов заболевания. В) Сравнительный анализ средней кумулятивной и средней максимальной степени развития ЕАЕ у РА крыс в различных экспериментальных группах (В, левая и средняя панель, соответственно). Сопоставление интегральной терапевтической эффективности (произведение тяжести развития заболевания на дни) пептидов ОБМ в составе липосом по сравнению с контролем (В, левая панель).

гкфеаяатаю РАР

, "'^ойос -»о» , ,ОШ2т$ич 1 ОбМ) тОД 1\ ' „«--

» _/Ч_____/ Ж 1 _1 ч 1

глиоз/демиелинизация з.о/з.о

Рис. 7.

А) Из каждой экспериментальной группы было выбрано животное с профилем развития ЕАЕ (сплошная линия), наиболее приближенным к среднему профилю по всей группе (продольные зеленые и красные линии). Б) Гистологический анализ повреждений в ЦНС у крыс ЭА с индуцированным ЕАЕ в различных экспериментальных группах.

Рис. 8.

Сравнение титра сывороточных аутоантител к полноразмерному ОБМ и его иммунодоминантным фрагментам ОБМ8ыо3 и ОБМ 146-170 у крыс линии РА с ЕАЕ, подвергнутых терапии, в сравнении животными из контрольной группы с ЕАЕ без лечения и интактных животных.

Рис. 9.

Гистологические срезы спинного мозга крыс DA из групп mSUV, Copaxone, ОБМ1 mSUV и ОБМ123 mSUV. Для выявления повреждений миелиновой оболочки аксонов использовали краситель luxol fast blue. Гибридизация срезов с антителами, специфичными к ИФНу, ИЛ-2 и НФГМ, для определения цитокинового статуса ЦНС.

Таким образом, в настоящей работе нам удалось впервые определить иммуно-доминантные фрагменты ОБМ при развитии ЕАЕ у крыс линии ОА. На основании проведенных экспериментов были отобраны пептиды ОБМ для создания препаратов антиген-специфичной терапии ЕАЕ. Совместное введение данных пептидов в составе маннозилированных однослойных липосом существенно снижает общее течение заболевания, улучшает выход опытных животных из стадии обострения, подавляет де-миелинизацию, а также снижает уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИФНу и стимулирует секрецию нейротропного фактора мозга в ЦНС. Наши данные свидетельствуют, что введение пептидов ОБМ в составе маннозилированных липосом способствует увеличению терапевтического эффекта вследствие экспонированных остатков маннозы. Так как АПК имеют на своей поверхности большое количество ман-нозных рецепторов, адресная доставка антигена в этом случае проходит наиболее эффективно. В нашем исследовании липосомы вводили подкожно, поэтому представляется маловероятным, что они могли проникнуть через гематоэнцефалический барьер

мкг/мп 2.5

I i ОП 450 1.2 - | 5 1.0 9

mSUV 0.8-

iff , 0.6- ^ 0.4 5

HS 1 о

1.2- ; 1.0 О 0.8-

0.60.4 0.2

iif

краситель luxol fast blue

щ шж

V*-,. \ «f - WW-

анти-ИЛ2

щшя^шш \ Copaxone " If«*"'.: .. '--

ОБМ123 mSUV fv, - . ОБМ1 mSUV i

анти-ИФНу

HSKl ... « -'v . - - t, «r .* Cop^:

06M123 mSUV r »,v - - OBMTmSUV

анти-НФГМ

mSUV 'Л r: Copaxone ^ '¿S c Ш...

Ш ш&гзт 06Ml'mSUV ' *> • ■ V ' . - .

в ЦНС. Предположительно, после интернализации фрагменты ОБМ презентируются на поверхности АПК в составе МНС II класса, после чего происходит стимуляция образования популяции регуляторных клеток, способных проникать через ГЭБ и подавлять аутореактивные клетки (Рис. 10).

Полученные результаты послужили основой для дальнейшего продвижения разработанных композиций в качестве перспективного лекарственного средства для терапии рассеянного склероза, которое на сегодняшний день находится во второй

стадии клинических испытании.

днтигенпрезеи тирующая

Рис. 10. Предположительный механизм терапевтического действия пептидов ОБМ, инкапсулированных в маннозилированные липосомы.

Направленная элиминация В-клеток белками-киллерами.

Вторым перспективным направлением разработки препаратов для лечения PC является создание цитотоксических молекул высокой избирательности, способных направленно удалять популяцию аутореактивных В-клеток с заранее известной специфичностью. Молекулы данного класса состоят из двух функциональных частей -цитотоксического агента и сигнальной последовательности, направляющей белок-киллер к клетке-мишени.

В результате анализа литературных данных в качестве цитотоксической составляющей белков-киллеров были выбраны: РНКаза барназа, каталитические домены

псевдомонадного токсина (ЕТА) и шига-подобного токсина E.coli (ШПТ), а также константный домен иммуноглобулина мыши и человека (Fc домен IgG).

Рис. 11. Схематическое изображение выбранных механизмов специфической элиминации В-клеток.

Таким образом, нами был отобран ряд цитотоксических белков-киллеров, каждый из которых приводит к гибели клетки-мишени по различному механизму (Рис. 11).

Для сравнения эффективности различных цитотоксических молекул и подтверждения работоспособности предложенной концепции, нами были созданы ре-

Барназа Шим-подобиый Псеедомонадный Ft домен АЗКЦ

комбинантные молекулы на основе барназы, ЕТА, ШПТ и Fe домена IgG, слитные с сигнальной последовательностью - пептидом, содержащим туе эпитоп (CEQKLI-SEEDL) (Рис. 12 и Рис. 13). В свою очередь, в качестве модельной линии В-клеток была выбрана гибридома C-MYC, имеющая на своей поверхности БкР, специфичный к туе эпитопу. Сравнительный анализ эффективности цитотоксических агентов на модельной системе C-MYC позволил выбрать лучший агент для дальнейшей элиминации природных антиген-специфичных B-клеток при ЕАЕ.

Создание генетических конструкций рекомбинантных белков-киллеров.

Для получения генетической конструкции, кодирующей рекомбинантный ши-га-подобный токсин E.coli, слитный с туе эпитопом, была использована геномная ДНК E.coli штамма серотипа 0157:Н7, которую любезно предоставили Скрябин К.Г. и Равин Н.В. Источником нуклеотидной последовательности Fe домена человеческого антитела класса IgGyl послужил вектор pBudCE4.1/CMV LeadH, созданный ранее в нашей лаборатории, в который была дополнительно интегрирована последовательность туе эпитопа (Рис. 12). Генетические конструкции, кодирующие барназу и псевдомонадный токсин, слитных с туе эпитопом (Рис. 12), были любезно предоставлены заведующим лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН д.б.н. чл-корр. РАН профессором Деевым С.М.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков-киллеров.

Полученные генетические конструкции были использованы для препаративной наработки рекомбинантных белков-киллеров в клетках E.coli.

Рис. 12. Карты генетических конструкций, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантный псевдомонадный токсин А), барназу Б), шига-подобный токсин E.coli В) и константный домен иммуноглобулина человека Г), слитных с туе эпитопом.

Блрнам-тус

Т7 terminatoi

о-™

— линкернып III

— 6xHis

Рис. 13. Схематическое изображение структуры созданных белков-киллеров В-клеток.

ч—<Q»| fMinhtr-myt [с

—OHI

Так как молекулы барназы-тус, ЕТА-тус и ШПТ-тус содержали в своем составе 6-ти гистидиновый кластер (Рис. 13), то качестве первой стадии очистки белков из клеточных лизатов применяли металлохелатную хроматографию, с последующей финальной очисткой на гель-фильтрационной колонке 8ире^ех75.

14

Для получения стабильной линии клеток, продуцирующих рекомбинантную молекулу Рс-Нпкег-тус и контрольную молекулу Рс-Нпкег, клетки линии СНО транс-фицировали методом липофекции с помощью набора ЫроГейатте ЬТХ (1пу1йт^еп) генетическими конструкциями рВис1СВ4.1СМУ Ьсас111-Ппкег-с-тус и рВи(1СЕ4.1СМУ LeadH-linker соответственно. Рс-содержащие молекулы очищали из ростовой среды методом аффинной хроматографии на смоле с иммобилизованным в белком и далее на гель-фильтрационной колонке Бирег£1ех200. После очистки наличие рекомбинант-ного белка нужного размера определяли с помощью электрофоретического разделения очищенных фракций в 12% ПААГ по Лэммли и окраской красителем Кумасси (Рис. 14А).

А Окрашивание Кумасси Б Гибридизация с анти-тус и ати-Рс антителами

л ^^ ЙР*

✓ £ е -/ Рис. 14. „*„ А) Электрофоретический анализ степени '' 1 — _ ___гомогенности очищенных молекул.

— Б) Гибридизация рекомбинантных

молекул с анти-тус и анти-Рс антителами.

■ i-m>t T-FC

Анализ функциональной активности полученных белков-киллеров.

Все очищенные рекомбинантные белки были протестированы на наличие туе эпитопа гибридизацией с моноклональными анти-тус антителами, методом имму-ноблоттинга по Вестерну с использованием моноклональных антител к туе эпитопу (Рис. 14Б).

Функциональную активность выделенных рекомбинантных белков на основе барназы подтверждали инкубацией с РНК в отсутствии и с добавлением ингибитора РНКазы А. Было показано, что барназа эффективно гидролизует дрожжевую РНК, при этом ингибитор РНКазы А не оказывает ощутимого влияния на ее ферментативную активность (Рис. 15).

Для анализа эффективности подавления трансляции in vitro созданными имму-нотоксинами, различные концентрации рекомбинантной барназы, псевдомонадного и шига-подобного токсинов добавляли к S30 экстракту клеток мышиного асцита, содержащего экзогенную мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. После чего измеряли люциферазную активность (Рис. 16).

Для подтверждения функциональной активности рекомбинантных Fc в формате ИФА была определена степень их связывания с С1 q компонентом системы комплемента в сравнении с полноразмерными антителами (Рис. 17).

Ингибитор РНКазы А

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 Концентрация рибонуклеазы, мкМ

Барназа

РНКаза А Контроль

Рис. 15. РНК-гидролизующая активность реком-бинантных молекул барназы и барназы-тус.

Концентрация иммунотоксина, мкМ

Рис. 16. Влияние барназы, барназы-тус А), псевдомонадного и шига-подобного токсинов Б) на трансляцию люциферазы в кле-^сГ^ точном экстракте.

Рис.17. Связывание Clq компонента системы комплемента рекомбинантными молекулами Fc-linker и Fc-linker-c-myc.

Исследование цитотоксических свойств белков-киллеров ex vivo.

Для сравнения цитотоксического потенциала полученных иммунотоксинов выделенные рекомбинантные белки инкубировали с гибридомной линией клеток С-MYC, в качестве отрицательного контроля применяли гибридомную линию клеток 1B4F4, не несущую на своей поверхности анти-myc БкР.

Согласно полученным данным были построены кривые зависимости процента живых клеток в зависимости от концентрации цитотоксических молекул (Рис. 18). В качестве отрицательного контроля для молекул барназа-myc и Fc-linker-myc использовали молекулы барназы и Fc-linker, не содержащих туе эпитопа (Рис. 18Б,Г)-

Рис. 18. Зависимость процента выживших клеток C-MYC (сплошная линия) и 1B4F4 (пунктирная линия) от концентрации рекомбинантных белков-

киллеров. Время инкубации 72 часа.

Анализ функциональной активности панели рекомбинантных белков-киллеров, проведенной на модельных клетках С-МУС, продемонстрировал высокую степень специфической цитотоксичности созданных молекул. На основании полученных результатов была определена ЬЭ5о рекомбинантных иммунотоксинов для клеток линии С-МУС (Табл. 2). Наиболее сильным цитотоксическим действием обладал рекомби-нантный псевдомонадный токсин, однако данная молекула продемонстрировала и наиболее высокую неспецифическую цитотоксичность. Шига-подобный токсин показал средние показатели специфичности и цитотоксичности на модельных клетках. Поэтому для дальнейшей работы нами были выбраны белки-киллеры на основе бар-назы и Рс домена антитела, так как они показали наименьшую степень неспецифического цитотоксического действия, и эффективно элиминировали клетки-мишени (Табл. 2).

Табл. 2. Значения Ю5о действия полученных иммунотоксинов на модельную линию клеток С-МУС.

Рекомбинантная молекула Наличие тус эпитопа Ю50 для клеток линии С-МУС

псевдомонадный токсин шига-подобный токсин Е.соН + 0,05 мкМ

+ 0,44 мкМ

барназа + 0,11 мкМ

- > 10 мкМ

Рс домен ^у! + ~0.002 мкМ

- > 10 мкМ

Селективная элиминация целевых В-клеток в культуре спленоцитов. В дальнейшем для достоверного подтверждения разрабатываемой концепции нами был предложен ряд дополнительных экспериментов на нативных В-клетках.

Для идентификации шус-специфичных В-клеток был создан химический конь-югат БСА-ФИТЦ-шус (Рис. 19).

тх

и« ^

n !»^1го«уя1сс|г1п11<)с с!

Рис 19. Схематическое изображение получения молекулы БСА-ФИТЦ-тус.

БСА-ФИТЦ-с-тус +

з-тус мАт БСА-ФИТЦ-тус

а-тус мАт

Бирегйех 200, обьем элюции.

Флуоресценция

Рис. 20. Подтверждение функциональной активности молекулы БСА-ФИТЦ-тус.

А) Изменения профиля хроматографии молекулы БСА-ФИТЦ-тус после гибридизации с анти-тус антителами по сравнению с контрольными разделениями. Б) Анализ хроматографи-п| ческих фракций в ПААГ __ на наличие флуоресцентной группы в составе белковых молекул.

тус БСА-ФИТЦ-т,

В результате проведенного анализа было подтверждено, что созданный конью-гат взаимодействует с анти-шус антителами и несет на себе флуоресцентные группы (Рис. 20). Подобные свойства могут быть использованы для визуализации популяции шус-специфичных В-клеток при анализе на проточном цитофлуориметре.

У мышей линии ВАЬВ/с стимулировали иммунный ответ к туе пептиду путем их иммунизации химически конъюгированным белком КЬН-тус. Через 3 недели после иммунизации из селезенки опытных мышей была получена культура спленоци-тов, содержащая популяцию В-клеток, специфичных к туе эпитопу. В качестве основных подходов для анализа эффективности действия иммунотоксинов применяли два метода: проточная цитофлуориметрия и анализ концентрации суммарных и тус-специфических антител. Для подсчета процента тус-специфичных В-клеток выделенные спленоциты инкубировали с молекулой БСА-ФИТЦ-шус и анти-В220-АРС антителами (В220 - поверхностный маркер В-клеток, еВюзаепсе), после чего клетки анализировали на проточном цитофлуориметре РАС801Уа (ВО). В результате проведенных экспериментов, нами было показано наличие В-клеток, специфичных к туе эпитопу в культуре спленоцитов из иммунизированной мыши (Рис. 21 секция 1), в то время как в культуре клеток, изолированных из неиммунизированной мыши, данная популяция клеток отсутствовала (Рис. 21 секция 2). Для изучения цитотоксического действия созданных белков-киллеров культуру спленоцитов инкубировали с барназой и константным доменом иммуноглобулина, слитными с туе эпитопом. Как видно из представленных данных, инкубация клеток с контрольными молекулами барназы (Рис. 21 секция 4) и Тгх-тус (Рис. 21 секция 5) не приводит к статистически значимому подавлению целевой популяции. В то время как инкубация клеток с молекулой барназа-тус приводит к значительному, приблизительно трехкратному, уменьшению популяции целевых клеток (Рис. 21 секция 3).

Для изучения цитотоксического действия молекулы Рс-Нпкег-тус на тус-специфичные В-клетки данная молекула была аналогичным образом добавлена в культуру спленоцитов, изолированных из мыши линии ВАЬВ/с, иммунизированной конъюгатом КЬН-тус. В качестве отрицательного контроля цитотоксического действия мы использовали молекулу Рс-Нпкег. Инкубацию спленоцитов с Рс-Нпкег-тус и Рс-Нпкег производили в течение 72 часов, ежедневно отбирая образец культуральной среды. Далее в отобранных образцах методом ИФА был определена тотальная концентрация иммуноглобулинов, а также концентрация специфических анти-тус антител (Рис. 22).

Как видно из Рис. 22, при инкубации изолированных спленоцитов с молекулой Рс-Нпкег-тус в сравнении с контролями происходит значительное снижение продукции тус-специфичных антител, в то время как общая концентрация остается неизменной. Данный факт однозначно свидетельствует о способности молекулы Рс-Нпкег-тус селективно подавлять экспрессию тус-специфичных антител.

обработанные спленоциты

95.4 Барназэ-тус 4.6 К ■

- (D

Гс ю! Го' Го5

90.7 т Барназа 9.3

- ©

ío! га i'o* Со*

90.7 Тгх-тус 9.3

*г ®

тотальные IgG, нг/мл 70

нашивные спленоциты

j 88.8 Jfjjp 11.2 pi

fc; ф

.....То-......to......'to.......lo'

J 100.0 0.0

ш " (D

Дни

БСА-ФИТЦ-myc Рис. 22. Снижение титра анти-myc антител в

Рис. 21. Анализ подавления популяции В-клеток, культуре спленоцитов при инкубации с моле-

специфичных к туе эпитопу, в культуре спленоцитов кулой Fc-linker-myc (квадраты) по сравнению с

после инкубации с рекомбинантными молекулами контрольными белками Fc-linker (треуголь-

барназа-myc (3), барназа (4) и Тгх-тус (5), по сравне- ники) и Тгх-тус (круги). Тотальный уровень

нию с контрольной культурой (1) и интактными иммуноглобулинов в культуре оставался не-

спленоцитами из неиммунизированной мыши (2). изменным во всех образцах

Элиминация аутореактивных В-клеток in vivo.

Заключительной стадией изучения терапевтического потенциала созданных белков-киллеров являлось проведение селективной элиминации аутореактивных ОБМ-специфичных В-клеток in vivo у мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ. В результате тестирования панели созданных белков-киллеров на предыдущих этапах наиболее перспективными оказались молекулы барназы и константного домена иммуноглобулина. Для финального теста из двух озвученных кандидатов нами был выбран константный домен иммуноглобулина. Основное преимущество Fe при проведении экспериментов in vivo состоит в меньшей иммуногенности и в значительной молекулярной массе, превышающей 60 кДа, что позволяет молекуле долгое время не отфильтровываться в почечных гломерулах.

При проведении предварительных in vitro и ex vivo экспериментов нами был использован Fe домен иммуноглобулина человека. Для предотвращения иммунной реакции организма мыши на вводимый препарат нами были созданы генетические конструкции, кодирующие Fe домен антитела мыши, слитный с фрагментами ОБМ. Для этой цели нами был использован коммерчески доступный плазмидный вектор pFUSE (lnvivogen), содержащий константный домен иммуноглобулина мыши класса IgG2a. В данный вектор была интегрирована нукпеотидная последовательность фрагментов ОБМ 7 (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG) и 11 (RASDYK-SAHKGFKGVDAQGTLSKIFKL). Рекомбинантные молекулы pFm-7 и pFm-11 были

наработаны и очищены по аналогичному протоколу получения молекул Fc-linker-myc и Fc-linker. Гомогенность полученных препаратов, согласно электрофоретическому анализу, составила более 95%. Все выделенные рекомбинантные белки тестировали на наличие пептида ОБМ путем их блоттинга по Вестерну и дальнейшей гибридизации с анти-ОБМ (Рис. 23Б) и анти-Fc (Рис. 23А) антителами. Гибридизация с анти-ОБМ антителами подтвердила, что молекулы pFm-7 и pFm-11 содержат пептиды ОБМ, в то время как контрольная молекула pFm не содержит его фрагментов в своем составе.

д Для формирования популяции аутореактивных В-клеток,

||| е специфичных к ОБМ, ЕАЕ был индуцирован у мышей линии —» SJL. Для этого животным производили двукратные подкожные jp инъекции гомогената спинного мозга мыши в эмульсии ПАФ,

дополнительно для усиления развития ЕАЕ в те же дни живот-Б S. ным внутривенно вводили раствор Pertussis toxin. В качестве

Ё 1 1 I" отрицательного контроля была использована группа интактных мышей без заболевания (группа - Контроль). Мышей с индуци-М^м рованным ЕАЕ разделили на 5 экспериментальных групп по 10

голов в каждой: (1) без терапии; (2) животным однократно вводили 200 мкг Copaxone (Teva) (группа - Copaxone); животным в каждой группе дважды внутривенно вводили (3) pFm (группа -pFm), (4) pFm-7 (группа - pFm) или (5) pFm-11 (группа - pFm-11) (Табл. 3).

Табл. 3. Экспериментальные группы.

Животных _. „ .. Количество День мкг/ ЕАЕ Инъекции , в группе_инъекции_инъекции_гол

Рис. 23. Гибридизация рекомбинантных молекул pFm-7, pFm-11 и pFm с анти-Fc А) и анти-ОБМ антителами Б).

Группа

Контроль 5 - - -

Без терапии 10 +

Copaxone 10 + Copaxone 1 1 200 мкг

pFm 10 + pFm 2 5 и 10 50 мкг

pFm-7 10 + pFm-7 2 5 и 10 50 мкг

pFm-11 10 + pFm-11 2 5 и 10 50 мкг

На седьмой день с начала индукции ЕАЕ и до окончания эксперимента во всех группах производили оценку развития симптомов ЕАЕ по 5 бальной шкале. На 14-15 день после индукции заболевания у мышей во всех группах начинали развиваться симптомы ЕАЕ, а на 17-19 дни заболевание достигало пика обострения. На 23 день после начала эксперимента из каждой экспериментальной группы были отобраны мыши SJL с одинаковой клинической картиной развития ЕАЕ (Рис. 24А). Культуры спленоцитов, полученные из этих мышей, анализировали на наличие В-клеток, специфичных к иммунодоминантной и С-концевой последовательностям ОБМ. Для этого клетки инкубировали с фрагментами ОБМ 7 и 12, конъюгированных с биотином. Для визуализации В-клеток использовали конъюгат анти-В220 антител с флуорофо-ром APC (eBioscience), в свою очередь биотинилированные пептиды ОБМ, связанные

20

с поверхностными рецепторами, детектировали добавлением конъюгата стрептавиди-на с флуорофором Pacific Blue™ (eBioscience). Образцы анализировали методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSDiva (BD), результаты представлены на (Рис. 24Б).

г id f *

1 в i1 fA L с/

¡1 i О A . I.. 1 L f

1 tn J L. rs' tpv. r.ll-.'. " Ei

i V L —> - i.. iL

Рис. 24.

А) Степень развития ЕАЕ у мышей линии Б Л, отобранных из каждой экспериментальной группы. Б) Анализ изолированных спленоцитов на наличие В-клеток, специфичных к 7 и 12 фрагментам ОБМ, методом проточной цитофлуориметрии.

Дни

7 пептид

12 пептид

Как видно из Рис. 24Б у мыши из группы "контроль" отсутствовала популяция В-клеток, специфичных к ОБМ, в то время как в культуре спленоцитов, полученной у животного из группы "без терапии", существует большая популяция В-клеток, специфичных к обоим пептидам ОБМ. При однократном введении препарата Copaxone в культуре клеток оставалась популяция В-клеток, имеющих на своей поверхности БкР, специфичный только к 12 фрагменту. Данное наблюдение в очередной раз подтверждает, что терапевтическое действие Copaxone направленно на популяцию В-клеток, специфичных к иммунодоминантному эпитопу ОБМ (7 пептиду). Как и ожидалось, внутривенные инъекции контрольной молекулы pFm, не содержащей пептиды ОБМ, а также контрольной молекулы pFm-l 1 не привело к подавлению целевой популяции В-клеток. В свою очередь введение молекулы pFm-7 приводило к полной элиминации В-клеток, специфичных не только к 7 фрагменту, который присутствует в составе молекулы pFm-7, но и к 12 фрагменту. Таким образом, после терапии молекулой pFm-7, пул В-клеток, специфичных к ОБМ, в культуре спленоцитов из леченой мыши совпало с профилем здорового животного. Полученные результаты позволяют предположить, что молекула pFm-7 наряду с селективной элиминацией В-клеток, специфичных к иммунодоминантному фрагменту ОБМ (7), также подавляет формирование В-клеток, специфичных к 12 фрагменту ОБМ.

III. выводы

1. При развитии ЕАЕ у крыс линии DA, а также мышей линии SJL и C57BL/6 определены иммунодоминантные фрагменты ОБМ, определяющие вектор экспансии аутореактивных В-клеток. Показано, что характер В-клеточного ответа при рассеянном склерозе наиболее схож с ЕАЕ, индуцированном в крысах линии DA и мышах линии SJL.

2. Иммунодоминантные фрагменты ОБМ, инкапсулированные в однослойные маннозилированные липосомы, существенно снижали тяжесть протекания ЕАЕ в крысах линии DA. Продемонстрировано, что применение липосомных композиций понижает титр сывороточных анти-ОБМ аутоантител, подавляет демиелинизацию, а также снижает уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФНу и индуцирует выработку нейротропного фактора мозга в ЦНС.

3. Была создана панель рекомбинантных молекул, способных к специфической элиминации В-клеток, на основе барназы, каталитических доменов псевдо-монадного и шига-подобного токсинов, а также константных доменов иммуноглобулинов мыши и человека. В результате ex vivo экспериментов на культуре спленоцитов наиболее перспективными признаны белки-киллеры на основе барназы и константного домена иммуноглобулина. Показано, что введение мышам линии SJL с индуцированным ЕАЕ рекомбинантной молекулы константного домена иммуноглобулина мыши, слитной с иммунодоминант-ным фрагментом ОБМ, селективно подавляет популяцию ОБМ-специфичных аутореактивных В-клеток.

IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи:

Stepanov A.V.. Belogurov А.А., Ponomarenko N.A., Stremovskiy O.A., Kozlov L.V., Bi-chucher A.M., Dmitriev S.E., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Balabashin D.S., Sashchen-ko L.P., Tonevitsky A.G., Friboulet A., Gabibov A.G., Deyev S.M. Design of targeted В cell killing agents. PLoS One. 2011; 6(6):e20991.

A.B. Степанов. A.A. Белогуров, А.Э. Мамедов, Д. Меламед, И.В. Смирнов, Е.С. Кузина, Д.Д. Генкин, А.Н. Бойко, С.Н. Шаранова, А. Бэкон, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габи-бов. Терапевтический эффект иммунодоминантных пептидов основного белка миелина, инкапсулированных в наноконтейнеры, на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в крысах линии DA. Биоорганическая химия. 2012 Май-Июнь; 38(3):306-14.

Belogurov A.A. Jr., Stepanov A.V.. Smirnov I.V., Melamed D., Bacon A., Mamedov A.E., Boitsov V.M., Sashchenko L.P., Ponomarenko N.A., Sharanova S.N., Boyko A.N., Dubina M.V., Friboulet A., Genkin D.D., Gabibov A.G. Liposome-encapsulated peptides protect against experimental allergic encephalitis. FASEB Journal. 2013 Jan; 27(1):222-31

Опубликованные тезисы конференций и доклады:

Stepanov А.У.. Belogurov A.A. Jr., Ponomarenko N.A., Kozlov.L.V., Dmitriev S.E., Stre-movsky O.A., Deyev S.M. and Gabibov A.G. Approaches to Multiple Sclerosis therapy by selective autoreactive B-cells depletion. Poster. Biocatalysis 2009: Fundamentals & Applications, 2007, Arkhangelsk, Russian Federation.

Степанов A.B.. Белогуров A.A., Пономаренко H.A., Козлов JI.B., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г._Подходы к терапии рассеянного склероза путем селективной элиминации аутореактивных В-клеток. Постер. Российская школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», 2010, Казань, Российская Федерация.

Belogurov A.A., Stepanov А.У.. Ponomarenko N.A., Gabibov A.G. Myelin basic protein peptide 46-62 ameliorates ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats. FEBS Journal. 2010. 277:54-54

Степанов A.B.. Белогуров A.A. Мл., Пономаренко H.A., Козлов JI.B., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г. Направленная элиминация аутореактивных В-клеток. Доклад. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 8-12 августа (2011), Петрозаводск, Российская Федерация.

Степанов А.В.. Белогуров А.А. Мл., Пономаренко Н.А., Козлов Л.В., Дмитриев С.Е., Стремовский О.А., Деев С.М., Габибов А.Г. Направленная элиминация аутореактивных В-клеток. Доклад. Научная конференция «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», 14-17 ноября (2011), Москва, Российская Федерация.

Заказ № 24-р/05/2013 Подписано в печать 24.05.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанов, Алексей Вячеславович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

04201359608

Степанов Алексей Вячеславович

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ-КИЛЛЕРОВ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ В-КЛЕТОК.

Специальность 03.01.03 - «молекулярная биология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: к.х.н. Белогуров A.A. д.б.н. Пономаренко H.A.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................................................................3

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР......................................................................................................................................................5

Рассеянный склероз.................................................................................................................................................................................5

основный белок миелина....................................................................................................................................................................7

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит........................................................................................................9

Роль T-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного

энцефаломиелита..................................................................................................................................................................................11

Роль В-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза и экспериментального аутоиммунного

энцефаломиелита..................................................................................................................................................................................12

Современные подходы к терапии рассеянного склероза....................................................................................................17

Иммуномодулирующие препараты для терапии РС...................................................................................................17

Моноклональные антитела в терапии РС.......................................................................................................................20

Иммунотоксины в терапии рассеянного склероза и аутоиммунных заболеваний...................................22

Антиген-специфическая терапия рассеянного склероза.........................................................................................30

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................................................................34

Химические реактивы и сопутствующие материалы...........................................................................................................34

Работа с нуклеиновыми кислотами..............................................................................................................................................36

Работа с эукариотическими клетками........................................................................................................................................40

Методы работы с бактериями E.coli..............................................................................................................................................44

Хроматографические процедуры....................................................................................................................................................46

Работа с белками....................................................................................................................................................................................48

Работа с животными.............................................................................................................................................................................52

Пациенты с рассеянным склерозом..............................................................................................................................................54

Приготовление липосом.....................................................................................................................................................................55

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................................................................................56

Сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и

экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.....................................................................................................56

Терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита фрагментами ОБМ,

инкапсулированными в липосомы................................................................................................................................................62

Создание липосом, содержащих инкапсулированные фрагменты ОБМ...........................................................62

Антиген-специфичная иммуномодулирующая терапия ЕАЕу крыс линии DA пептидами ОБМ,

инкапсулированными в липосомы.........................................................................................................................................65

Направленная элиминация В-клеток белками-киллерами..............................................................................................72

Создание генетических конструкций рекомбинантных белков-киллеров.....................................................74

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков-киллеров.......................................................................................76

Анализ функциональной активности полученных белков-киллеров................................................................79

Исследование цитотоксических свойств белков-киллеров ex vivo.....................................................................82

Селективная элиминация целевых В-клеток в культуре спленоцитов..........................................................84

Элиминация аутореактивных В-клеток in vivo............................................................................................................90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................................................................................96

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................98

ПРИЛОЖЕНИЕ.....................................................................................................................................................................106

Л

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

At - антитело

АПК - антигенпредставляющая клетка

ГКГС (МНС) - главный комплекс гистосовместимости

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецилсульфат натрия

ЕАЕ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

ЕТА - псевдомонадный токсин

ИЛ - интерлейкин

ИФНб - интерферон-бета

ИПЛ - измененные пептидные лиганды

ИТ - иммунотоксин

кДа - килодальтон

МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин

монАт - моноклональное антитело

НФГМ - нейротрофический фактор головного мозга

ОБМ (МВР) - основный белок миелина

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PC - рассеянный склероз

РИБ - рибосом-инактивирующие белки

СКВ - системная красная волчанка

ФЭ-2 - фактор элонгации 2

ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат

ШПТ - шига-подобный токсин E.coli

IgG - иммуноглобулины класса G

PLP - протеолипидный белок

SUV - однослойные липосомы

TGF - трансформирующий фактор роста

Тх - Т-хелперы

Tr, Treg - Т-регуляторные клетки

ВВЕДЕНИЕ.

Рассеянный склероз (РС) - это хроническое воспалительное нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы с неизвестной этиологией. Патогенез данного заболевания включает в себя повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. Более миллиона человек болеет рассеянным склерозом во всем мире. Основную роль в патологическом процессе демиелинизации аксонов отводят Т- и В-клеткам, специфичным к компонентам миелиновой мембраны. Список потенциальных аутоантигенов постоянно расширяется и включает в себя различные белки ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Среди них особо выделяют основный белок миелина (ОБМ) и миелин олигодендрацитарный гликопротеин (МОГ). Аутореактивные лимфоциты, специфичные к данным белкам, совместно с макрофагами проникают через гематоэнцефалический барьер и индуцируют процессы воспалительной демиелинизации в ЦНС. Известно, что Т-клетки ответственны за острый иммунный ответ по отношению к олигодендроцитам, в то время как В-клетки продуцируют патогенные аутоантитела и являются активными антигенпредставляющими (АПК) и цитокинпродуцирующими клетками. Ещё одним подтверждением важности В-клеток при патологии РС является наличие каталитических антител к ОБМ в сыворотке больных, которые могут не только связывать ОБМ, но и гидролизовать его.

Современное понимание особенностей механизмов индукции и патогенеза заболевания значительно изменили взгляды на терапию РС. На сегодняшний день существует несколько подходов к лечению данного заболевания: А) Введение так называемых "измененных пептидных лигандов" (ИПЛ), взаимодействующих с Т-клеточными рецепторами (ТкР). ИПЛ являются модифицированными, мутированными или укороченными участками последовательностей, связывающихся с ТкР. ИПЛ могут частично активировать Т-клетки, переключая их

с фенотипа Тх-1 на Тх-2, а также в некоторых случаях индуцировать обращение Т-клетки в анергию.

В настоящее время среди препаратов патогенетического лечения PC (препаратов, изменяющих течение PC или ПИТРС) активно используется Copaxone Б) - синтетический сополимер L-аминокислот Glu, Lys, Ala и Туг. Copaxone стимулирует образование популяции регуляторных Тх-2 клеток, способных проникать через ГЭБ и продуцировать противовоспалительные цитокины. В) Введение ИФНр. Г) Применение моноклональных антител, специфичных к поверхностным клеточным рецепторам: Rituximab (антитело к CD20, содержится на мембране зрелых В-клеток), Daclizumab (антитело к CD25, альфа-субъединица рецептора ИЛ-2, презентирован на активированных Т-клетках), Alemtuzumab (антитело к CD52, гликопротеин с неизвестной функцией, представленный на поверхности всех зрелых лимфоцитов и моноциов). Д) Терапия per os препаратом FTY720 (в фосфорилированной форме - ингибитор SP1-ассоциированных G-опосредованных рецепторов); Teriflunomide - ингибитор пролиферации Т клеток; BG-12, индуцирует продукцию цитокинов Тх-2 типа; Laquinimod, блокирует способность Т-клеток и макрофагов перемещаться через ГЭБ, а также переключает фенотип Тх-2 на Тх-3; Cladribine, ингибитор для дезоксицитидин киназы, влияющий на ДНК репарацию и опосредованно индуцирующий смерть лимфоцитов. (6) Введение инактивированных Т-клеток или вакцинация гипервариабельными регионами ТкР для стимуляции ТкР-специфичных CD8+-клеток. (7) Индукция "назальной" или "оральной толерантности" аутоантигеном.

Тем не менее, стоит отметить, что вопреки впечатляющему массиву клинических, иммунологических и биохимических данных, а также частично изученным молекулярным механизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшний день не существует препарата, способного полностью остановить патологические процессы при PC. Таким образом, дальнейшее совершенствование существующих подходов или же разработка новых перспективных методов терапии PC является задачей первостепенной важности.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Рассеянный склероз.

Рассеянный склероз - это хроническое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы, при котором повреждается миелиновая оболочка нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного [1-6]. Впервые морфологическую картину рассеянного склероза описали французские ученые Крювелье и Красвелл в 1835 году. Ими были обнаружены "островки серой дегенерации, разбросанные по спинному мозгу, стволу мозга, мозжечку и иногда по большим полушариям". Первое подробное описание рассеянного склероза принадлежит известному французскому невропатологу Жану Мартену Шарко (1856 г.), который считал наиболее характерными следующие симптомы заболевания: нистагм (подергивание глазных яблок), интенционное дрожание рук (усиливающееся при приближении к цели) и прерывистую речь (т.н. "триада Шарко"). Детальное микроскопическое описание поражений мозга при рассеянном склерозе принадлежит Джемсу Даусону (1916 г.). Томас Риверс в 1935 году впервые экспериментально воспроизвел демиелинизирующее заболевание на животных и высказал предположение об аутоиммунном характере патогенеза рассеянного склероза. Известный американский невропатолог Джон Куртцке в 1955 году, используя вычислительную технику, установил, что при рассеянном склерозе встречаются 685 симптомов, однако он не выявил ни одного симптома специфического именно для этого заболевания [7].

Распространенность рассеянного склероза неодинакова в различных регионах. До недавнего времени было принято выделять три зоны, различающиеся по степени заболеваемости рассеянным склерозом [6, 8, 9]. Зона высокого риска возникновения заболевания: более 30 случаев рассеянного склероза на 100 тыс. населения. К этой зоне относятся регионы, расположенные выше 30-й параллели на всех континентах. Зона среднего риска — от 5 до 29 случаев на 100 тыс. населения; и зона низкого риска — менее 5 случаев на 100 тыс. населения. Исходя из этого распределения, в ряде регионов России заболеваемость рассеянным склерозом

довольно высокая и находится в пределах 20 — 40 случаев на 100 тыс. населения, также она выше в крупных промышленных районах и городах. По результатам изучения эпидемиологии рассеянного склероза в последние годы получены новые интересные факты. Например, ежегодно наблюдается увеличение числа больных рассеянным склерозом за счет истинного роста заболеваемости, а также за счет повышения качества диагностики и расширения возможностей терапии. Улучшение качества жизни и медико-социальной адаптации привело к увеличению продолжительности жизни больных, что также обусловливает рост показателей распространенности рассеянного склероза. Известно, что риск развития рассеянного склероза связан с местом проживания, принадлежностью к определенной расе и этнической группе [10]. В большей степени болезнь распространена среди лиц белого населения Земли. Рассеянный склероз редко встречается в Японии, Корее, Китае: от 2 до 6 случаев на 100 тыс. населения [5, 11]. Применение новых подходов при изучении эпидемиологии рассеянного склероза привело к изменению привычных классических понятий о распространенности заболевания. Значительно возросли показатели в зонах высокого, среднего и низкого риска, сглаживаются границы этих зон, появились данные о существенных различиях эпидемиологических показателей в близко расположенных регионах или в пределах одного региона. Хотя остается тенденция, выражающаяся понятием «градиент широты»: распространение заболевания увеличивается с юга на север. Статистический анализ показал, что чаще рассеянным склерозом болеют женщины, также у женщин заболевание начинается в среднем на 1 — 2 года раньше, однако у мужчин преобладает прогрессирующая форма течения заболевания.

Различают две формы рассеянного склероза: RR-MS (relapsing-remitting multiple sclerosis) - наиболее распространенная форма заболевания (85-90%), характеризующаяся чередованием процессов де- и ремиелинизации с полным восстановлением пациента при ремиссии. RR-MS в большинстве случаев через некоторое время переходит в SP-MS (secondary progressive multiple sclerosis). Подобное течение болезни приводит к необратимому повреждению миелинового покрова, которое усиливается с течением времени. В 10-15% случаев после первого клинического проявления заболевание сразу переходит в прогрессирующее

течение, так называемое PP-MS (primary progressive multiple sclerosis) [12, 13]. При развитии рассеянного склероза в разных отделах белого вещества центральной нервной системы формируются очаги демиелинизации ("бляшки"), которые имеют характерную форму и локализацию. Размеры очагов, как правило, составляют 1-5 мм, но иногда за счет слияния и отека они достигают 10 мм. Наиболее типичные места локализации очагов - вдоль боковых желудочков и в мозолистом теле. Очаги могут также быть выявлены в стволе мозга, мозжечке или в спинном мозге.

Симптомы рассеянного склероза различны и зависят от того, какой именно участок ЦНС подвергся поражению, большинство больных имеют сразу несколько признаков болезни, но, в свою очередь, не было обнаружено ни одного пациента имеющего все симптомы одновременно. Из наиболее часто встречающихся симптоматических проявлений PC следует отметить следующие: нарушения зрения - нечеткость зрения, диплопия, снижение остроты зрения, нистагм, временная полная потеря зрения; нарушение координации - нарушение равновесия, тремор, атаксия, головокружение, нарушение координации движения; спастичность -спастика и спазмы; нарушение речи - скандированная речь, замедленная речь, смазанность речи, дисфагия; а также различные типы боли, хроническая усталость, учащенное мочеиспускание, недержание мочи, импотенция, фригидность, ухудшение кратковременной памяти, характеризуемое снижением способности к концентрации внимания, логическому мышлению.

Основный белок миелина.

При развитии патологии PC одним из превалирующих иммуногенных компонентов миелина для B-клеток человека является основный белок миелина (ОБМ), он же является наиболее сильным индуктором экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у животных. Основная информация о структуре миелина получена с помощью электронной микроскопии. Уникальной морфологической особенностью миелина является то, что он формируется в результате спирального обвитая отростков олигодендроглиоцитов (в центральной нервной системе) и шванновских клеток (на периферии, вокруг аксонов нейронов). Т�