Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение рекомбинантного гистона H1.3 для вирусного и невирусного переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Применение рекомбинантного гистона H1.3 для вирусного и невирусного переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток"

На правах рукописи

Соловьева Валерия Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИСТОНА Н1.3 ДЛЯ ВИРУСНОГО И НЕВИРУСНОГО ПЕРЕНОСА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 Ь ПАП 2014

Казань-2014

005549299

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, доцент - Ризванов Альберт Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», профессор кафедры биохимии

- Маянская Наиля Назибовиа; доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, зав. лаборатории молекулярной биологии и нанобиологии, зам. директора по научной работе - Чемерис Алексей Викторович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук.

Защита состоится «26» июня 2014 г. в 11:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, ауд.211. Телефон: 7(843)23-37-842

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.kpfu.ru

Автореферат разослан «1^1» 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Развитие методов и научных принципов генной терапии требует исследования строения, свойств и функционирования отдельных молекул нуклеиновых кислот и их надмолекулярных комплексов с молекулами-переносчиками (векторами). Генная терапия — новый подход к лечению заболеваний, который направлен на устранение первопричины заболевания. На современном этапе генную терапию можно определить как лечение наследственных и ненаследственных заболеваний путём введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций (Исламов и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. Т.2, №3).

Для введения в организм рекомбинантного генетического материала используют вирусные и невирусные методы доставки. Вирусные методы основаны на применении рекомбинантных вирусов, полученных с помощью генной инженерии и оптимизированных для переноса генов. Основные преимущества вирусных систем — высокая эффективность генетической модификации и длительность экспрессии трансгенов. Однако клиническое применение вирусных векторов ограничено их иммуногенностью и онкогенностью. В последнее время большие усилия были сосредоточены на разработке систем невирусной доставки генов: физические, химические, «голые» генетические конструкции (Супотницкий М.В. // Биопрепараты. 2011. Т.З).

Известно, что гистоновые и другие ядерные белки могут служить векторами для переноса нуклеиновых кислот в клетки (гистонофекция). Положительный заряд молекул гистоновых белков способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот, что приводит к нейтрализации зарядов и позволяет комплексам преодолевать отрицательно заряженную клеточную мембрану. Преимущество гистонов заключается в том, что они остаются в комплексе с ДНК после проникновения в цитоплазму, участвуют в активном транспорте комплексов ДНК/гистон в ядро, где ДНК участвует в процессах транскрипции (Соловьева и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. Т.6, №3).

Рекомбинантные гистоны и их производные находят применение в противораковой терапии. Рекомбинантный гистон Н1.3 в составе препарата ONCOHIST™ уже прошел в Германии I стадию клинических испытаний, доказавших его безопасность, а также косвенно подтвердивших эффективность при лечении острого миелолейкоза (Gross et al. // Patent US 20110034370 Al. 2008). В настоящее время препарат проходит Нб фазу клинических исследований в России.

В связи с тем, что рекомбинантный гистон Н1.3 показал свою безопасность в клинических исследованиях (хотя и не связанных с переносом ДНК внутрь клеток),

поиск дополнительных способов биомедицинского применения данного белка является актуальной задачей.

Изучение взаимодействия рекомбинантного гистона Н1.3 и рекомбинантных нуклеиновых кислот, а также процессов транспорта комплексов гистона и нуклеиновых кислот в клетки позволит разработать методы генной и генно-клеточной терапии на основе данной векторной молекулы.

Цель работы — характеристика влияния рекомбинантного гистона Н1.3 на вирусный и невирусный перенос нуклеиновых кислот в культуре клеток.

Задачи исследования:

1. Установить оптимальное соотношение и значение дзета-потенциала для комплексообразования нуклеиновых кислот и рекомбинантного гистона Н1.3.

2. Определить влияние рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами на активность митохондриапьных дегидрогеназ и цитотоксичность в культуре первичных и трансформированных клеток in vitro.

3. Исследовать влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность трансфекции клеток рекомбинантными нуклеиновыми кислотами и на эффективность трансдукции (инфекции) культур клеток рекомбинантными ленти- и аденовирусами.

Научная новизна работы

В результате проведенного комплексного исследования применимости рекомбинантного гистона Н1.3 для вирусного и невирусного переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток определены параметры комплексообразования плазмидной ДНК и рекомбинантного гистона Н1.3. Несомненной новизной обладают данные по определению цитотоксичности рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами. Впервые показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 и его комплексы с нуклеиновыми кислотами обладают низкой токсичностью по отношению к культурам клеток in vitro в широком диапазоне исследуемых концентраций, о чем свидетельствуют данные по активности митохондриальных дегидрогеназ. Принципиально новыми являются данные о том, что рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при кальций-фосфатном методе трансфекции. Впервые показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 влияет на инфекцию клеток рекомбинантным лентивирусом, повышая ее эффективность. Приоритетными следует признать результаты, полученные на модели рекомбинантного аденовируса серотипа 5, где впервые установлено, что рекомбинантный гистон Н1.3 снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro.

Практическая значимость работы

Настоящее исследование расширяет представления о возможностях биомедицинского применения рекомбинантного гистона Н1.3. В рамках

проведенного исследования предложен подход к повышению эффективности генетической модификации культур клеток in vitro рекомбинантным лентивирусом. Нами показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при лентивирусной трансдукции, что может быть использовано для повышения эффективности генетической модификации клеток при лентивирусной трансдукции. Получен патент на изобретение РФ №2478711 «Способ повышения эффективности вирусной трансдукции». Апробированный метод кальций-фосфатного метода трансфекции с добавлением гистона может быть использован для повышения эффективности доставки рекомбинантных нуклеиновых в культуры клеток. Впервые показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro. Таким образом, описан новый класс белков, обладающих противовирусной активностью. Это важно для разработки новых методов противовирусной терапии с применением рекомбинантного гистона Н1.3.

Экспериментальные и методические подходы, используемые в работе, открывают перспективу применения рекомбинантного гистона в противовирусной терапии и для повышения эффективности генетической модификации при создании генно-клеточных препаратов для использования в биомедицинских приложениях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при кальций-фосфатном методе трансфекции и лентивирусной трансдукции.

2. Рекомбинантный гистон Н1.3 снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на слудующих всероссийских и международных симпозиумах, конгрессах и конференциях: Международная научная конференция «Ломоносов» (Москва, 2011, 2013), Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011, 2012), Международная наукчно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), Международная научная интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2013), Ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2012, 2013), Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), The 4th International Congress of Molecular Medicine organized by Turkish Society of Molecular Medicine (Стамбул, 2011), Международная научная конференции студентов и молодых ученых

"Молодежь — медицине будущего" (Одесса, 2012), Международная конференции «Биология — наука XXI века» (Москва, 2012), Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011).

Личный вклад автора

Автор принимал участие в формулировании научной проблемы и планировании экспериментов. Автор лично выполнял все эксперименты, проводил статистическую обработку полученных данных, обсуждал и описывал полученные результаты. Автор участвовал в написании статей и патента на изобретение, проводил информационный поиск по исследуемой тематике.

На основании самостоятельной работы автора решена важная биохимическая задача исследования строения, свойств и функционирования надмолекулярных комплексов гистона Н1.3 с нуклеиновыми кислотами и вирусными частицами, что вносит важный вклад в разработку методов и научных принципов генной терапии. Данные, полученные лично автором, демонстрируют возможность расширения применения рекомбинантного гистона в биологии и медицине как для повышения эффективности переноса нуклеиновых кислот при трансфекции/трансдукции клеток, так и для применения в качестве нового противовирусного вещества.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертационной работы изложены на 164 страницах машинописного текста. Работа содержит 42 рисунка и 8 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (320 источников, среди которых 13 — отечественные, 307 — зарубежные).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клеточные культуры, культивирование

В работе использовали следующие клеточные линии: клетки из рака шейки матки HeLa (АТСС number: CCL-2); клетки аденокарциномы молочной железы MCF7 (АТСС number: НТВ-22); мезенхимные стволовые клетки (МСК), выделенные из зачатков третьих моляров человека (ЗТМ) МСК из ЗТМ (Yalvac et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo- and neurogenesis, 2010); Фибробласты человека, полученные из фрагментов кожи здорового пациента, удаленных в ходе косметической операции; иммортализированные линии первичных человеческих эмбриональных клеток почки НЕК293Т (АТСС Number: CRL-11268) и НЕК293А (Invitrogen, США). Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Для культивирования использовали среду Игла,

модифицированной по методу Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, США), к которой были добавлены 10% сыворотки крови плодов коровы (англ. Fetal bovine serum, FBS, Sigma, США), 2 мМ L-глутамин (Sigma-Aldrich, США) и 1х смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich, США). Пассирование клеток проводили с использованием 1х 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (Sigma-Aldrich, США).

Электрофоретические исследования

Метод задержки в агарозном геле заключается в нанесении комплексов плазмидной ДНК и гистонаШ.З (плДНК/Н1.3) в лунки агарозного геля и оценки задержки плДНК в лунке в зависимости от количества добавляемого при комплексообразовании гистона. Визуализация ДНК осуществляется с помощью окраски флуоресцентным красителем — бромистым этидием.

Навеску рекомбинантного гистона HI.3 «Онкогист» (ИБХ РАН, Россия) растворяли в стерильной воде MilliQ до концентрации 50 мкг/мкл, после чего проводили серийное разведение в 150 мМ растворе NaCl до его различных концентраций. Комплексы плДНК/Н1.3 готовили в 150 мМ растворе NaCl. Для этого в пробирку, содержащей 1 мкг плДНК pEGFP-N2 (BD Biosciences Clontech, Германия) в 49 мкл 150 мМ раствора NaCl, добавляли 1 мкл раствора гистона Н 1.3 (в разных концентрациях). Смесь перемешивали на вортексе, осаждали коротким центрифугированием и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего смесь использовали для нанесения в лунки агарозного геля.

Определение дзета-потенциала комплексов плДНК/Н1.3

Дзета-потенциал комплексов плДНК/Н1.3 определяли методом динамического рассеивания света на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) при 25°C. Автоматическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения Malvern Zetasizer, v. 2.2 (Malvern Instruments, Великобритания).

Для получения комплексов плДНК/Н1.3 в 1,5 мл пробирку, содержащую 150 мМ раствор NaCl (физраствор) добавляли плДНК pEGFP-N2 до конечной концентрации 1 мкг/мл и гистон Н1.3 до конечной концентрации 2 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 250 мкг/мл или 500 мкг/мл (соотношения плДНК/Н1.3 (\v:vv) 1:2, 1:5, 1:25, 1:250, 1:500, соответственно). Смесь инкубировалась в течение 30 мин при комнатной температуре.

Получение рекомбннантных вирусов

Рекомбинантный аденовирус Ad5-EGFP получали субклонированием гена улучшенного зеленого флуоресцентного белка egfp (англ. Enhanced green fluorescent protein) из вектора донора pDOND221 (plasmid ID №25899, AddGene) в вектор pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, США) по технологии Gateway® с

последующей продукцией аденовируса пакующей линии клеток НЕК293А, как описано в протоколе ViraPower™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, США).

Рекомбинантный лентивирус LV-GFP, экспрессирующий ген зеленого флуоресцентного белка GFP, получали ко-трансфекцией пакующей линии клеток НЕК293Т тремя плазмидами, которые были получены из некоммерческой организации AddGene (www.addgene.org): pCMV-VSV-G (plasmid ID №8454), psPAX2 (plasmid ID №12260) и pWPT-GFP (plasmid ID №12255).

Оценка активности митохондриальных дегидрогеназ в культурах клеток

Комплексы плДНК pEGFP-N2 и гистона Н1.3 готовили в 100 мкл питательной среды для клеточных культур без содержания FBS. Для этого в пробирку, содержащую питательную среду без FBS, добавляли пдДНК до конечной концентрации 2 мкг/мл и гистон Н1.3 до конечных концентраций 50, 250, 500 и 1000мкг/мл. Смесь перемешивали на вортексе, осаждали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего меняли культуральную среду клеток HeLa, MCF7, МСК из ЗТМ и фибробластов человека на смесь (100 мкл), содержащую комплексы плДНК/Н1.3 или только гистон Н1.3.

MTS-тест — колориметрический метод определения метаболитической активности клеток, который основан на способности митохондриальных дегидрогеназ в присутствии переносчика электронов феназинметасульфата конвертировать тетразолиевое соединение MTS в растворимую форму формазана. Способность клеток восстанавливать тетразолиевую соль до формазана служит показателем жизнеспособности и скорости полиферации клеток.

Цитотоксичность гистона H 1.3 и комплексов плДНК/Н1.3 определяли с помощью реагента CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) на планшетном анализаторе CERES 900HDi (Bio-Teklnstruments Inc., США) через 24, 48 и 72 часа инкубации в двухволновом режиме: основной фильтр — 490 нм, референс-фильтр — 630 нм. Эксперимент проводили в 4-х повторностях (п=4).

На основании данных, полученных в результате проведения MTS-теста, вычисляли цитотоксическую концентрацию гистона (СС50), при которой происходит ингибирование жизнеспособности клеток на 50% относительно контроля.

Трансдукция клеток HeLa рекомбинантным лентивирусом

Клетки HeLa культивировали во флаконе Т25 до плотности монослоя 50%. Клетки инфицировали рекомбинантным лентивирусом LV-GFP, с множественностью инфекции (англ. Multiplicity of infection, MOI) 10. Клетки инкубировали в течение 3 суток при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.

Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на вирусную трансдукцию

Влияние гистона на лентивирусную/аденовирусную трансдукцию (инфекцию) исследовали на моделях рекомбинантного лентивируса или аденовируса, экспрессирующих гены gfp и egfp (LV-GFP или Ad5-EGFP).

Клетки HeLa культивировали в 24-луночном планшете до плотности клеточного монослоя 50%. Далее клетки инфицировали рекомбинантными вирусами LV-GFP или Ad5-EGFP с MOI 0,1. Для этого к клеткам HeLa добавляли рекомбинантный ленти- или аденовирус, или смесь вируса с гистономШ.З пре-инкубированную в течение 1 часа, или смесь вируса с протамином сульфата. Гистон Н1.3 использовали в конечной концентрации 250 мкг/мл. Протамина сульфат (Invitrogen, США) добавляли в лунку в конечной концентрации 10 мкг/мл (положительный контроль). Клетки инкубировали в течение 48 часов при 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.

Для определения влияния рекомбинантного гистона Н 1.3 на способность аденовирусных частиц к образованию бляшек, при определении вирусного титра к рекомбинантному аденовирусу Ad5-EGFP в серийных разведениях (10"5, 10"6 и 10"7; 670, 67 и 6,7 БОЕ/мл, соответственно) добавляли гистон Н 1.3 до конечной концентрации 250 мкг/мл и инкубировали смесь в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации смесь добавляли к клеткам НЕК293А. Через 7 дней подсчитывали количество бляшек в каждом разведении как описано в протоколе ViraPower™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, США). В качестве контроля использовали Ad5-EGFP без добавления гистона Н1.3.

Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции

Трансфекцию клеток НЕК293Т проводили комплексами плДНК pEGFP-N2 и гистона Н1.3 в различных комбинациях (соотношения плДНК/Н1.3 (vv:w)—1:0, 1:0,1, 1:3, 1 мкг плДНК) в комбинации со стандартным методом кальций-фосфатной преципитации.

Клетки НЕК293Т культивировали в 24-луночном планшете до плотности клеточного монослоя 60-70%. Трансфекционную смесь для каждого соотношения готовили в 1,5 мл пробирке из расчета на 8 лунок: к 0,4 мл 0,5 М СаС12 добавляли 8 мкг плДНК и необходимое количество гистона Н1.3. Смесь перемешивали на вортексе, осаждали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смесь по каплям добавляли в 15 мл пробирку, содержащую 400 мкл 2х раствора HBS, одновременно перемешивая содержимое на вортексе. Смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре и добавляли к клеткам (по 100 мкл на лунку). Через 6-8 часов после трансфекции меняли культуральную среду на свежую.

Трансфекции культур клеток

Для трансфекции культур клеток HeLa, MCF7, МСК из ЗТМ и фибробластов человека применяли 24-луночные культуральные планшеты. Использовалась культура клеток с плотностью монослоя 60-70%. В лунках культурального планшета меняли культуральную среду на свежую (400 мкл), с содержанием 5 мМ СаС12 и добавляли 100 мкл комплексов плДНК/Н1.3 или киРНК/Н1.3. Комплексы плДНК/Н1.3 или киРНК/Н1.3 готовили в культуральной среде без FBS. Для этого в пробирку, содержащей 1 мкг плДНК pEGFP-N2 или 0,5 мкл киРНК Silencer® GFP siRNA (Ambion, США) в 95 мкл среды, добавляли 5 мкл гистонаШ.З (в разных концентрациях), растворенного в стерильной воде MilliQ. Смесь перемешивали на вортексе, осаждали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего использовали для трансфекции культур клеток. В лунках культурального планшета меняли культуральную среду на свежую (500 мл) с содержанием 5 мМ СаС12. К среде добавляли по 100 мкл комплексов плДНК/Н1.3 или киРНК/Ш.З.

Химическую трансфекцию культур клеток с использованием катионных липидов TransFast (Promega, США) и катионных полимеров TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc., США) проводили согласно рекомендациям фирм-производителей.

Проточная цитофлуориметрия и микроскопия клеток

Микроскопию клеток проводили с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioOberver.Z 1 (Carl Zeiss, Германия). Количество GFP позитивных клеток после трансфекции или вирусной трансдукции оценивали с использованием проточных цитометров Becton Dickinson FACSCalibur flow-cytometry system (Becton Dickinson, США) и Guava easyCyte 8HT Flow Cytometry System (Millipore, Германия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007. Статистическая достоверность разницы определялась с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин. // Биометрия. 1990. 352 е.).

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе данной работы было проведено исследование применимости рекомбинантного гистона Н1.3 для вирусного и невирусного переноса нуклеиновых кислот в культуре. Рекомбинантный гистон Н1.3 человека является рекомбинантной и высоко очищенной молекулой ^Ы-бис-метионин-гистона Н1.3, которая, в отличие от природного аналога, содержит два остатка метионина на N-конце. Наличие N-концевого метионина облегчает процесс выделения и очистки рекомбинантного белка (Giglione et al. // EMBO J. 2003. V.22, №1).

На первом этапе работы было исследовано взаимодействие рекомбинантного гистона Н1.3 и нуклеиновых кислот с помощью электрофоретических методов. При образовании комплексов нуклеиновых кислот с гистонами посредством электростатических взаимодействий происходит нейтрализация зарядов и увеличение размера, что приводит к снижению подвижности (мобильности) комплексов при электрофорезе.

В рамках выполняемой работы было исследовано комплексообразование плДНК/Ш.З не только в разных соотношениях, но и особенности комплексообразования в различных растворах, а также зависимость от времени инкубации и метода нанесении образцов в лунки агарозного геля. Показано, что двухвалентные ионы, такие как Mg2+ и Ca2*, способны к связыванию с ДНК и нейтрализации ее отрицательного заряда. Наличие этих ионов влияет на эффективность трансфекции с использованием катионных липидов (Lam et al. // Biochim Biophys Acta. 2000. V.1463, №2). Исходя из этого в качестве растворов для комплексообразования плДНК и гистона Н1.3 использовали 135 мМ MgC12, 135 мМ и 0,3 М СаС12, 135 мМ KCl, 135 мМ и 150 мМ NaCl, питательнуюя среду с содержанием 10% FBS и без FBS.

Определено оптимальное соотношение плДНК/Ш.З для комплексообразования (w:w) — 1:2. Показано, что наиболее эффективно гистон Н1.3 связывает релаксированные формы плДНК, такие как кольцевая релаксированная и линейная, в то время как компактные формы плДНК, суперскрученная и денатурированная, хуже связываются с гистоном Н1.3. Это по-видимому связано с изменением конформации ДНК и стерическими проблемами доступа гистона ко всей поверхности цепи ДНК. Полученные данные указывают на важность не только электростатических взаимодействий, но и конформации плДНК при взаимодействии плДНК и гистона Н1.3. Возможно, для повышения эффективности комплексообразования плДНК и гистона Н1.3 необходим перевод плазмиды в кольцевую релаксированную или линейную форму.

Комплексообразование плДНК и гистона Н 1.3 происходило приблизительно с одинаковой эффективностью во всех исследуемых растворах, однако использование культуральной среды с содержанием 10% FBS, приводило к размыванию полосок плДНК в геле, что, по-видимому, связано с взаимодействием сывороточных белков с плДНК и/или комплексами плДНК/Ш.З. Стоит отметить, что присутствие сыворотки в культуральной среде не повлияло на способность гистон Н1.3 связывать плДНК, оптимальное соотношение для комплексообразования также составило 1:2. Показано, что при длительном хранении комплексов плДНК/Ш.З снижается их стабильность.

M 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M

плДНК'П мкг) + + + + + + ++ + ++ ++ + +

ГисшкШ.З oner) 3,0 2.5 2.IJ 1.75 1.5 1,25 1.0 0.875 (1,75 0.(525 0.5 0.375 0J5 0,125 -

Рисунок 1 - Комплексообразование плДНК/Н1.3 в 150 мМ растворе NaCl. Длительная экспозиция при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием. Диапазон исследуемых количеств гистона H 1.3 (при количестве пазмидной ДНК 1 мкг): от 0,125 до 3,0 мкг. Плазмидная ДНК — pEGFP-N2. M — маркер Gene Ruller 1Kb DNA Lader. Лунки 1-15 — комплексы с разными соотношениями плДНК и гистона H 1.3 (w:w): 1 — 1:3, 2 — 1:2,5, 3 — 1:2, 4 — 1:1,75, 5 — 1:1,5, 6— 1:1,25, 7 — 1:1, 8 — 1:0,875, 9 — 1:0,75. 10— 1:0,625, 11 — 1:0,5, 12 — 1:0,375, 13 - 1:0,25, 14 — 1:0,125, 15 — 1:0. А — кольцевая релаксированная ДНК, Б — линейная ДНК, В — суперскрученная ДНК, Г — денатурированная ДНК.

Важную роль в эффективной трансфекции клеток играет значение дзета-потенциала (электрокинетического потенциала) комплексов нуклеиновых кислот с трансфекционным агентом. По литературным данным дзета-потенциал плазмидной ДНК варьирует от от -20 мВ до -40 мВ (Honary et al. // Trop J Pharm Res. 2013. V. 12, №2). В работе был определен дзета-потенциал плазмидной ДНК pEGFP-N2, который составил -22,2 мВ, и показано, что при соотношении плДНК/Н1.3 (w:w) 1:25 происходит наибольшая нейтрализация дзета-потенциала комплексов (9.61 мВ). Полученные результаты по взаимодействию рекомбинантных нуклеиновых кислот с гистоном H 1.3 были использованы при выборе оптимальных соотношений плДНЮТП.З для трансфекции культур клеток.

Рекомбинантный гистон H 1.3 показал свою безопасность в клинических исследованиях и эффективность при лечении острого миелолейкоза (Gross et al. // Patent US 20110034370 Al. 2008). Механизм действия гистона Hl на опухолевые клетки основан на его способности образовывать агрегаты с фосфолипидами, которые у опухолевых клетках смещены на внешнюю сторону мембраны, что приводит к серьезным перестройкам в клеточной мембране, образованию пор, и в конечном итоге к программируемой гибели клетки (апоптоз) (Zhao et al. // Biochemistry. 2004. V.43, №31).

В нашей работе для определения цитотоксичности рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами мы использовали тест по оценке активности митохондриальных дегидрогеназ в клетках (MTS-тест).

В экспериментах in vitro были использованы концентрации гистона 50 мкг/мл, 250 мкг/мл (предполагаемая максимальная нетоксичная концентрация в кровотоке) и 1000 мкг/мл. Были определены цитотоксические концентрации рекомбинантного гистона и его комплексов с плазмидной ДНК, ингибирующих жизнеспособность первичных и трансформированных клеточных линий на 50% (англ. Cytotoxic concentration 50, СС50) (Таблица 1).

Таблица 1

Цитотоксические концентрации (СС50) рекомбинантного гистона Н 1.3 и его

комплексов с плазмидной ДНК

Культура клеток СС50, мкг/мл

Гистон Н1.3 Комплексы плДНК/Н1.3

24 часа 48 часов 72 часа 24 часа 48 часов 72 часа

МСК из ЗТМ 716 250 567 515 486 509

Фибробласты 1362 520 637 722 486 609

HeLa 1612 1529 1256 3727 738 5230

MCF7 1336 1207 830 1271 463 692

Показано, что рекомбинантный гистонШ.З и комплексы плДНК/Н1.3 ингибируют жизнеспособность МСК из ЗТМ, фибробластов человека и клеток линии MCF7 в большей степени, чем клеточной линии HeLa. При инкубации в течение 72 часов добавление плДНК не оказывало существенного влияния на цитотоксичность гистона Н1.3. Цитотоксический эффект гистона Н1.3 и его комплексов зависит от клеточной линии. Например, для клеток линии HeLa добавление плДНК к гистонуШ.З повышало их жизнеспособность, что наблюдалось после 24 и 72 часов инкубации.

На основании полученных данных показано, что максимальную терапевтическую концентрацию рекомбинантного гистона Н1.3 250 мкг/мл можно использовать в качестве нетоксической в экспериментах in vitro.

Полученные результаты по цитотоксичности рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами были использованы при выборе оптимальных соотношений плДНК/Н1.3 для трансфекции культур клеток.

Следующим этапом нашей работы стала оценка эффективности трансфекции клеток-мишеней рекомбинантными нуклеиновыми кислотами с применением гистона Н1.3 в качестве трансфекционного агента. По данным флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии можно сделать вывод, что гистон Н1.3 мало эффективен для доставки плДНК в первичные (МСК из ЗТМ, фибробласты человека) и трансформированные (HeLa, MCF7) культуры клеток.

Например, при трансфекции МСК из 3 ТМ плазмидой pEGFP-N2 с помощью гистона Н1.3 процент EGFP-позитивных клеток составил 0,96% при фоновом

13

уровне флуоресценции 0,19%. Для трансфекционного агента ТгапзРаэ! (положительный контроль) процент ЕОРР-позитивных клеток составил 11,57%. Оптимизация условий комплексообразования в различных растворах не привела к увеличению эффективности трансфекции с использованием рекомбинантного гистона Н1.3.

Трансфекция киРНК, специфичной к ОРР, в культуру клеток НеЬа-ОРР с помощью гистона Н1.3 не привела к снижению их зеленой флуоресценции, что свидетельствует о низкой эффективности гистона Н1.3 для трансфекции киРНК. Клетки НеЬа-СРР содержат рекомбинантный ген ф, с которого происходила транскрипция (синтез мРНК) и трансляция (синтез белка ОРР). Белок детектируют по его зеленой флуоресценции. Если в клетку попадают киРНК, специфичные к мРНК гена ОРР, они приводят к специфичной деградации мРНК гена снижению синтеза и, соответственно, внутриклеточного накопления ОРР, что может быть обнаружено по снижению зеленой флуоресценции клеток. Количество клеток, в которых наблюдалось снижение зеленой флуоресценции при использовании гистона Н1.3 (17,36%), сопоставимо с нетрансфицированным контролем и составило (15,02%).

В настоящее время для введения рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки широко используют кальций-фосфатный метод, при котором нуклеиновая кислота образует с фосфатами комплекс, который затем поглощается клеткой. Кальций-фосфатный метод характеризуется простотой применения и низкой стоимостью, однако эффективность этого способа зависит от образования комплексов нуклеиновых кислот с фосфатом, которые чувствительны к значению рН растворов. Актуальной проблемой остается также разработка подходов к повышению эффективности кальций-фосфатного метода, не требующих специального оборудования и сохраняющих низкую стоимость метода.

В нашей работе было показано, что использование рекомбинантного гистона Н1.3 повышало эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции клеток НЕК293Т в 1,4 раза по отношению к клеткам, трансфицированных только кальций-фосфатным методом (Рисунок 2). Стоит отметить, что максимальная эффективность достигалась при добавлении небольшой концентрации гистона, что не приводило к полному связыванию плДНК, таким образом, ДНК продолжала нести суммарный отрицательный заряд (соотношение плДНК/Н1.3 (\у:\у) 1:0,1), необходимый для комплексообразования с фосфатом. В то же время наличие единичных молекул гистона Н1.3 на плДНК, возможно, повышало эффективность ядерного транспорта после проникновения комплексов в клетку.

Новым подходом, потенциально способным повысить эффективность генной и клеточной терапии, может стать использование генетических векторов на основе вирусов. Широкое применение в генной терапии нашли векторные системы на основе ретровирусов, находящиеся на разных стадиях клинических испытаний.

А Б

Рисунок 2 - Проточная цитофлуориметрия клеток НЕК293Т, трансфицированных с помощью кальций-фосфатного метода в комбинации с гистонофекцией. 48 часов после трансфекции. Клетки трансфицировали плДНК рЕСРР-Ы2. Фоновый уровень флуоресценции составил 0,73% (А). Б — трансфекция с помощью кальций-фосфатного метода. В — трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение плДНК/Н1.3 — 1:0,1 (ш:\у), и кальций-фосфата. Г — трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение плДНК/Н1.3 — 1:3 и кальций-фосфата.

На сегодняшний день используют различные вещества для повышения эффективности вирусной трансдукций: поликатион декстрана, поликатион полибрена, протамина сульфат и др. Однако эти методы обладают рядом недостатков, препятствующих их применению в клинике. В связи с этим остро стоит вопрос поиска новых эффективных и биологически безопасных методов генетической модификации клеток.

Для исследования влияния рекомбинантного гистона Н1.3 на лентивирусную трансдукцию клеток линии НеЬа была выбрана максимальная нетоксичная концентрация рекомбинантного гистона — 250 мкг/мл.

В работе использовали рекомбинантный лентивирус ЬУ-ОРР на основе ВИЧ-1, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок вРР. Эффективность вирусной трансдукции определяли по экспрессии репортерного гена ^р. Ранее в нашей лаборатории было показано, что рекомбинантный лентивирус ЬУ-ОРР может быть использован в качестве модели для тестирования химиопрепаратов, а также для скрининга новых способов воздействия на клетки человека, включая генную терапию (Головин и др. // Современные технологии в медицине. 2012. Т1).

Перед транедукцией клеток HeLa рекомбинантный лентивирус инкубировали с рекомбинантным гиетоном Н1.3. Показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность лентивирусной трансдукции в 2,5 раза (Рисунок 3).

Показано, что рекомбинантный гистон Н1,3 снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro. Аденовирусы вызывают различные заболевания у человека, в том числе инфекции дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Особенно опасны аденовирусные инфекции для пациентов с ослабленным иммунитетом. Лечение аденовирусных инфекций осложняется наличием различных серотипов аденовируса. В настоящее время ведется активный поиск новых препаратов для терапии аденовирусной инфекции.

В нашей работе были исследованы противовирусные свойства рекомбинантного гистона Н1.3 в культуре клеток in vitro. В работе использовали рекомбинантный репликационно-дефектный аденовирус серотипа 5 Ad5-EGFP, экспрессирующий улучшенный зеленый флуоресцентный белок EGFP. Ранее в нашей лаборатории было показано, что рекомбинантный репликационно-дефектный аденовирус Ad5-EGFP может быть использован в качестве тест-системы для скрининга противовирусных препаратов (Мартынова и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012. Т.7, №3).

Раствор аденовируса Ad5-EGFP обрабатывали рекомбинантным гиетоном Н1.3, после чего добавляли к клеткам линии HeLa. Эффективность вирусной трансдукции определяли по экспрессии репортерного гена egfp. Показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 в нетоксичной для клеток концентрации снижает эффективность аденовирусной трансдукции в 5,5 раз (Рисунок 3).

Анализ образования бляшек при инфицировании клеток линии НЕК293А рекомбинантным аденовирусом Ad5-EGFP показал, что пре-инкубация аденовируса Ad5-EGFP с гиетоном Н1.3 приводит к ингибированию процесса образования бляшек, что указывает на противовирусные свойства рекомбинантного гистона Н1.3. Добавлении гистона Н1.3 к аденовирусу в разведении 10"6 (67 БОЕ/мл) привело к сокращению образования бляшек в 7,7 раз. Добавлении гистона Н1.3 к аденовирусу в разведении 10"7 (6,7 БОЕ/мл) привело к полному ингибированию образования бляшек (Таблица 2).

Стоит отметить, что данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии соотносятся с данными, полученными при подсчете количества бляшек, образуемых клетками НЕК293А после инфицирования аденовирусом — одинаковый порядок ингибирования.

Различное действие на ленти- и аденовирусную инфекцию гистона Н1.3 возможно объясняется различиями в строении и размерах ленти- и аденовирусных частиц.

g

a 10

14.5 +

Вирус tlnpyc f I |ртшш Ннрус I lfl.3

сульфат

□ AdSFGFP QLV-GFP

Рисунок 3 — Влияние гистона Н1.3 на ленти- и аденовирусную инфекцию. Процент ОГР-позитивных клеток подсчитывали через 48 часов после трансфекции с помощью проточной цитофлуориметрии. Фоновый уровень флуоресценции составил 0,5%. Вирус — клетки НеЬа, трансдуцированные рекомбинантным вирусом (Ас15-ЕОРР или ЬУ-йГР). Вирус + Протамина сульфат — клетки, трансдуцированные вирусом с добавлением протамин сульфата. Вирус + Н1.3 — клетки, трансдуцированные смесью вируса и гистона Н1.3. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (п=3).

Таблица 2

Образование БОЕ клетками НЕК293А при аденовирусной трансдукции

Разведение вируса Количество бляшек

Ad5-EGFP Предварительная инкубация Ad5-EGFP с гистоном Н1.3

ю-5 Обширный цитопатический эффект 30

10"6 70 9

ю-' 5 0

Аденовирус серотипа 5 связывается с рецептором CAR (англ. Coxsackie and adenovirus receptor) на поверхности клетки через головку фибры. Затем интегрины взимодействуют с пептидным мотивом RGD в основании пентона (капсидный белок на основании фибры), и аденовирус проникает внутрь клетки посредством эндоцитоза, после чего вирус проникает в ядро клетки, где происходит его репликация (для аденовируса дикого типа). Рекомбинантный гистон Н1.3 может стерически (пространственно) блокировать фибры аденовируса, в результате мешая взаимодействию вирусных частиц с плазматической клеточной мембраной и не давая вирусу проникнуть внутрь клетки.

Слияние мембран является основным механизмом доставки вирусного генома оболочечных вирусов (таких как лентивирусы) в клетки-мишени. После первичной неспецифической адгезии вируса к клеточной поверхности, вирусные гликопротеины специфически связываются с родственными рецепторами, после чего происходит слияние липидных мембран вируса и клетки-мишени и, вирусный нуклеокапсид высвобождается в цитоплазму. Гистон в этом случае может выступать как катионная биомолекула, действуя по аналогии с протамином сульфата, неспецифически связываясь с вирусной частицей за счет электростатического взаимодействия. При этом происходит снижение отрицательного заряда, снижение электростатическогоотталкивания отрицательно заряженных вирусных частиц и плазмитической клеточной мембраны, что приводит к повышению эффективности первичной неспецифической адгезии вируса к клеточной поверхности.

Для выявления механизма взаимодействия рекомбинантного гистона Н1.3 с ленти- и аденовирусными частицами необходимы дальнейшие исследования, например с использованием сканирующей электронной микроскопии вирусных частиц в комплексе с гистонами.

ВЫВОДЫ

1. Установлено оптимальное соотношение плазмидной ДНК и рекомбинантного гистона Н1.3 для комплексообразования — 1:2 . Показано, что наиболее эффективно гистон Н1.3 связывает релаксированные формы плазмидной ДНК, такие как кольцевая релаксированная и линейная формы, в то время как компактные формы плазмидной ДНК, суперскрученная и денатурированная, хуже связываются с гистоном Н1.3.

2. Определена максимальная нетоксичная концентрация рекомбинантного гистона Н 1.3 (250 мкг/мл) и СС50 для первичных и трансформированных культур клеток. Добавление плДНК к гистону Н 1.3 не оказывало существенного влияния на жизнеспособность клеток.

3. Рекомбинантный гистон Н 1.3 в чистом виде мало эффективен для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в различные культуры клеток. Однако, использование рекомбинантного гистона Н 1.3 повышало эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции в 1,4 раза по отношению к клеткам, трансфицированных только кальций-фосфатным методом.

4. Рекомбинантный гистон Н 1.3 повышает эффективность лентивирусной трансдукции в 2,5 раза. В то же время гистон Н1.3 в 5,5-7,7 раз снижает эффективность аденовирусной трансдукции и оказывает ингибирующее действие на формирование бляшек клетками НЕК293А, инфицированными аденовирусом серотипа 5, что указывает на противовирусные свойства гистона Н 1.3 по отношению к аденовирусам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, 13 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах, получен 1 патент на изобретение РФ.

1. Патент на изобретение РФ: Способ повышения эффективности вирусной трансдукции. Заявитель: ОАО «Институт стволовых клеток человека». Авторы: Ризванов A.A., Соловьева В.В., Исаев A.A., Генкин Д.Д. Патент на изобретение №2478711. Заявка №2011151506/10. Приоритет изобретения 19 декабря 2011 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10 апреля 2013 г. Срок действия патента истекает 19 декабря 2031 г.

2. Соловьева В.В. Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков / В.В. Соловьева, Н.В. Кудряшова, A.A. Ризванов // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2011. - Т.6, №3. - С. 29-40. (Список ВАК, РИНЦ 0,243)

3. Соловьева В.В. Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность лентивирусной трансдукции клеток человека in vitro / B.B. Соловьева, A.A. Исаев, Д.Д. Генкин, A.A. Ризванов // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2012. - Т.7, №3. - С. 151-154. (Список ВАК, РИНЦ 0,243)

4. Соловьева В.В. Исследование эндогенной секреции сосудистого эндотелиального фактора роста мультипотентными стволовыми клетками из зачатков третьих моляров человека / В.В. Соловьева, H.JI. Блатт, А.К. Шафигуллина, A.A. Ризванов // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия.-2012.-Т.7, №3.-С.155-158. (Список ВАК, РИНЦ 0,243)

5. Blatt N.L. Application of Cell and Tissue Culture Systems for Anticancer Drug Screening / N.L. Blatt, R.N. Mingaleeva, V.V. Solovyeva, S.F. Khaiboullina, V.C. Lombardi, A.A. Rizvanov // World Applied Sciences Journal. - 2013. - V.23, №3. -P.315-325. (Список ВАК)

6. Мингалеева P.H. Применение культур клеток и тканей для скрининга противоопухолевых препаратов ш vitro / P.H. Мингалеева, B.B. Соловьева, Н.Л. Блатт, A.A. Ризванов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Т.8, № 2. - С.20-28. (Список ВАК, РИНЦ 0,243)

7. Solovyeva V.V. Human Adipose Derived Stem Cells Do Not Alter Cytokine Secretion in Response To The Genetic Modification With pEGFP-N2 Plasmid / V.V. Solovyeva, I.I. Salafutdinov, E.V. Martynova, S.F. Khaiboullina, A.A. Rizvanov // World Applied Sciences Journal. - 2013. - V.26, №7. - P.968-972. (Список ВАК)

Список сокращений

Ad (англ. Adenovirus) — аденовирус

DMEM (англ. Dulbecco's modified Eagle's médium) — среда Игла, модифицированная по методу Дульбекко

DPBS (англ. Dulbecco's modified Phosphate Buffered Saline) — раствор Дульбекко EGFP (англ. Enhanced Green Fluorescent Protein) — улучшенный зеленый флуоресцентный белок

FBS (англ. Fetal Bovine Sérum) — сыворотка крови плодов коровы LV (англ. Lentivirus) — лентивирус

MOI (англ. Multiplicity Of Infection) — множественность инфицирования

NTC (англ. Non-transfection Control) — нетрансфицированный контроль

OD (англ. Optical Density) — оптическая плотность

PBS (англ. Phosphate Buffered Saline) — натрий-фосфатный буфер

PMS (англ. Phenasin Methosulphate) — феназинметасульфат

w:w — весовое соотношение двух веществ

а.о. — аминокислотные остатки

БОЕ — бляшкообразующая единица

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

киРНК — короткая интерферирующая РНК

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

МСК из ЗТМ — культура МСК, выделенных из зачатков третьих моляров человека

МСК — мезенхимная стволовая клетка

плДНК — плазмидная ДНК

РНК — рибонуклеиновая кислота

т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, к. 105, отдел аттестации научно-педагогических кадров, e-mail: RGDzjubenko@kpfu.ru, факс 8(843)233-78-67. Диссертационный совет Д212.081.08. Ученый секретарь Абрамова Зинаида Ивановна. Факс 8(843)238-76-01. E-mail автора: solovyovavv@gmail.com

Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага офсетная №1 Печать RISO. Уч.-изд.л.1,2. Тираж 100 экз. ЦЕНТР ПЕЧАТИ "Линк". Казань, ул. Карла Маркса, 51

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соловьева, Валерия Владимировна, Казань

Федеральное государственное автономное образовательное учреяедение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

04201459526 Соловьева Валерия Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИСТОНА Н1.3 ДЛЯ ВИРУСНОГО И НЕВИРУСНОГО ПЕРЕНОСА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., доцент Ризванов A.A.

Казань-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................11

1.1 Гистонные белки.....................................................................................................11

1.1.1 Нуклеосомные гистоны.......................................................................................12

1.1.2 Линкерный гистон Н1 и его варианты...............................................................13

1.2 Рекомбинантный гистон Н1.3................................................................................16

1.3 Методы переноса нуклеиновых кислот в клетки.................................................17

1.3.1 Вирусные методы переноса нуклеиновых кислот............................................18

1.3.1.1 Векторы на основе аденовирусов....................................................................20

1.3.1.2 Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов...................................21

1.3.1.3 Векторы на основе вируса простого герпеса..................................................22

1.3.1.4 Векторы на основе ретровирусов....................................................................22

1.3.1.5 Векторы на основе поксвирусов и другие вирусные векторы.....................24

1.3.2 Невирусные методы переноса нуклеиновых кислот........................................24

1.3.2.1 Физические методы доставки нуклеиновых кислот......................................26

1.3.2.2 Химические методы доставки нуклеиновых кислот.....................................29

1.4 Гистонофекция........................................................................................................31

1.4.1 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов и других ядерных белков.................................................................................................32

1.4.1.1 Трансфекция с помощью линкерного гистона Н1.........................................33

1.4.1.2 Трансфекция с помощью нуклеосомных гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4.....34

1.4.1.3 Трансфекция с помощью гистоноподобных белков и пептидов неэукариотического происхождения...........................................................................36

1.4.1.4 Трансфекция с помощью негистонных ядерных белков..............................37

1.4.1.5 Безопасность доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонных и других ядерных белков..........................................................................38

1.4.2 Механизм доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов..........................................................................................................................40

1.4.3 Комбинированные системы доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки...........................................................................................................................44

1.5 Заключение по обзору литературы........................................................................47

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................50

2.1 Комплексообразование нуклеиновых кислот и рекомбинантного гистона Н1.3

.........................................................................................................................................50

2.1.1 Приготовление комплексов плазмидной ДНК и гистона Н1.3 для электрофоретических исследований...........................................................................50

2.1.2 Приготовление комплексов гистона Н1.3 и плДНК/Н1.3 для MTS-теста.....51

2.1.3 Приготовление комплексов плДНК/Н1.3 для определения жизнеспособности клеток окрашиванием Акридиновым оранжевым/Бромистым этидием.................51

2.1.4 Определение дзета-потенциала комплексов плДНК/Н1.3...............................51

2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами.......................................................52

2.2.1 Электрофорез в агарозном геле..........................................................................52

2.2.2 Выделение нуклеиновых кислот (плазмидной ДНК).......................................53

2.2.3 Субклонирование гена улучшенного зеленого флуоресцентного белка в аденовирусный плазмидный вектор по технологии Gateway®.................................54

2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)................................................................55

2.2.5 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами......................56

2.2.6 Очистка проб после рестрикционного расщепления.......................................57

2.3 Методы работы с прокариотическими клетками.................................................58

2.3.1 Культивирование бактериальных клеток..........................................................58

2.3.2 Трансформация бактериальных клеток.............................................................58

2.3.3 Криоконсервация бактериальных клеток..........................................................59

2.4 Методы работы с эукариотическими клетками...................................................60

2.4.1 Клеточные культуры, культивирование............................................................60

2.4.2 Процедура пассирования клеточных культур...................................................62

2.4.3 Криоконсервация клеточных культур................................................................62

2.5 Оценка жизнеспособности культур клеток in vitro.............................................63

2.5.1 Оценка активности митохондриальных дегидрогеназ в кульурах клеток in vitro..................................................................................................................................63

2.5.2 Определение жизнеспособности клеток с помощью окрашивания Акридиновым оранжевым/Бромистым этидием........................................................64

2.6 Получение рекомбинантных вирусов...................................................................65

2.6.1 Получение рекомбинантного летнивируса, экспрессирующего репортерный ген зеленого флуоресцентного белка..........................................................................65

2.6.2 Получение рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего репортерный ген улучшенного зеленого флуоресцентного белка EGFP.......................................66

2.6.2.1 Получение плазмидного аденовирусного вектора, экспрессирующего ген66

2.6.2.2 Получение рекомбинантых аденовирусных частиц в пакующей линии клеток..............................................................................................................................66

2.6.2.3 Определение титра рекомбинантного аденовируса......................................68

2.7 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки

(трансфекция и вирусная трансдукция)......................................................................68

2.7.1 Трансдукция клеточных культур рекомбинантными вирусами.....................68

2.7.1.1 Трансдукция клеток HeLa рекомбинантным лентивирусом........................68

2.7.1.2 Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективноть лентивирусной или аденовирусной трансдукции.................................................................................68

2.7.2 Кальций-фосфатный метод трансфекции..........................................................70

2.7.2.1 Ко-трансфекция пакующей линии клеток НЕК293Т для продуктции рекомбинантных лентивирусных частиц....................................................................70

2.7.2.2 Влияние рекомбинантного гистона HI .3 на эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции................................................................................70

2.7.3 Трансфекция клеточных культур с помощью комплексов нуклеиновых кислот и гистона Н1.3...................................................................................................71

2.7.3.1 Трансфекция клеточных культур с помощью комплексов плДНК/Н1.3 .... 71

2.7.3.2 Трансфекция клеток HeLa-GFP с помощью комплексов киРНК/Н1.3........71

2.7.4 Химическая трансфекция с использованием катионных липидов и катионных полимеров...................................................................................................72

2.7.4.1 Трансфекционный агент TransFast..................................................................72

2.7.4.2 Трансфекционный агент TurboFect.................................................................73

2.7.5 Анализ эффективности трансфекции.................................................................74

2.7.5.1 Микроскопия клеток.........................................................................................74

2.7.5.2 Проточная цитофлуориметрия.........................................................................74

2.8 Статистическая обработка результатов................................................................74

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................................75

3.1 Исследование взаимодействия рекомбинантного гистона Н1.3 и нуклеиновых кислот in vitro.................................................................................................................75

3.2 Определение цитотоксичности рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами в культуре клеток in vitro........................83

3.3 Применение рекомбинантного гистона Н1.3 в качестве вектора доставки нуклеиновых кислот в культуре клеток....................................................................101

3.4 Применение рекомбинантного гистона Н1.3 в комбинации с другими

методами доставки нуклеиновых кислот in vitro.....................................................117

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................120

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................132

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................134

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................................................135

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................................137

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Развитие методов и научных принципов генной терапии требует исследования строения, свойств и функционирования отдельных молекул нуклеиновых кислот и их надмолекулярных комплексов с молекулами-переносчиками (векторами). Генная терапия — новый подход к лечению заболеваний, который направлен на устранение первопричины заболевания. На современном этапе генную терапию можно определить как лечение наследственных и ненаследственных заболеваний путём введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций (Баранов, 1999).

Для введения в организм рекомбинантного генетического материала используют вирусные и невирусные методы доставки. Вирусные методы основаны на применении рекомбинантных вирусов, полученных с помощью генной инженерии и оптимизированных для переноса генов (Balicki et al., 2002; Kovesdi et al., 1997). Основные преимущества вирусных систем — высокая эффективность генетической модификации и длительность экспрессии трансгенов. Однако клиническое применение вирусных векторов ограничено их иммуногенностью и онкогенностью. В последнее время большие усилия были сосредоточены на разработке систем невирусной доставки генов: физические, химические, «голые» генетические конструкции (Feigner et al., 1997).

Известно, что гистоновые и другие ядерные белки могут служить векторами для переноса нуклеиновых кислот в клетки (гистонофекция) (Balicki et al., 2000). Положительный заряд молекул гистоновых белков способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот, что приводит к нейтрализации зарядов и позволяет комплексам преодолевать отрицательно заряженную клеточную мембрану. Преимущество гистонов заключается в том, что они остаются в комплексе с ДНК после проникновения в цитоплазму, участвуют в активном транспорте комплексов ДНК/гистон в ядро, где ДНК участвует в процессах транскрипции (Balicki et al., 2002).

Рекомбинантные гистоны и их производные находят применение в противораковой терапии. Рекомбинантный гистонШ.З в составе препарата ONCOHIST™ уже прошел в Германии I стадию клинических испытаний, доказавших его безопасность, а также косвенно подтвердивших эффективность при лечении острого миелолейкоза (Gross, 2008). В настоящее время препарат проходит 116 фазу клинических исследований в России.

В связи с тем, что рекомбинантный гистон Н1.3 показал свою безопасность в клинических исследованиях (хотя и не связанных с переносом ДНК внутрь клеток), поиск дополнительной возможности биомедицинского применения данного белка является актуальной задачей.

Изучение взаимодействия рекомбинантного гистонаШ.З и рекомбинантных нуклеиновых кислот, а также процессов транспорта комплексов гистона и нуклеиновых кислот в клетки позволит разработать методы генной и генно-клеточной терапии на основе данной векторной молекулы.

Цель работы: характеристика влияния рекомбинантного гистона HI.3 на вирусный и невирусный перенос нуклеиновых кислот в культуре клеток.

В соответствии с целью работы определены следующие экспериментальные задачи:

1. Установить оптимальные условия для комплексообразования нуклеиновых кислот и рекомбинантного гистона Н1.3.

2. Определить влияние рекомбинантного гистона HI .3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами на активность митохондриальных дегидрогеназ и цитотоксичность в культуре первичных и трансформированных клеток in vitro.

3. Исследовать влияние рекомбинантного гистона HI .3 на эффективность трансфекции клеток рекомбинантными нуклеиновыми кислотами и на эффективность трансдукции (инфекции) культур клеток рекомбинантными ленти- и аденовирусами.

Научная новизна:

В результате проведенного комплексного исследования применимости рекомбинантного гистона Н1.3 для вирусного и невирусного переноса

6

нуклеиновых кислот в культуре клеток определены параметры комплексообразования плазмидной ДНК и рекомбинантного гистонаШ.З. Несомненной новизной обладают данные по цитотоксичности рекомбинантного гистонаШ.З и его комплексов с нуклеиновыми кислотами. Впервые показано, что рекомбинантный гистонШ.З и его комплексы с нуклеиновыми кислотами обладают низкой токсичностью по отношению к культурам клеток in vitro в широком диапазоне исследуемых концентраций, о чем свидетельствуют данные по активности митохондриальных дегидрогеназ. Принципиально новыми являются данные о том, что рекомбинантный гистонШ.З повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при кальций-фосфатном методе трансфекции. Впервые показано, что рекомбинантный гистонШ.З влияет на инфекцию клеток рекомбинантным лентивирусом, повышая ее эффективность. Приоритетными следует признать результаты, полученные на модели рекомбинантного аденовируса серотипа 5, где впервые установлено, что рекомбинантный гистонШ.З снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный гистонШ.З повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при кальций-фосфатном методе трансфекции и лентивирусной трансдукции.

2. Рекомбинантный гистонШ.З снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro.

Теоретическая и научная значимость

Настоящее исследование расширяет представления о возможностях биомедицинского применения рекомбинантного гистонаШ.З. В рамках проведенного исследования предложен подход к повышению эффективности генетической модификации культур клеток in vitro рекомбинантным лентивирусом. Нами показано, что рекомбинантный гистонШ.З повышает эффективность переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток при лентивирусной трансдукции, что может быть использовано для повышения

7

эффективности генетической модификации клеток при лентивирусной трансдукции. Получен патент на изобретение РФ №2478711 «Способ повышения эффективности вирусной трансдукции».

Апробированный метод кальций-фосфатного метода трансфекции с добавлением гистона может быть использован для повышения эффективности доставки рекомбинантных нуклеиновых в культуры клеток и получения генетически модифицированных клеток.

Впервые показано, что рекомбинантный гистонШ.З снижает эффективность аденовирусной трансдукции и обладает противовирусным эффектом in vitro. Таким образом, описан новый класс белков, обладающих противовирусной активностью. Это важно для разработки новых методов противовирусной терапии с применением рекомбинантного гистона Н1.3.

Экспериментальные и методические подходы, используемые в работе, открывают перспективу применения рекомбинантного гистона в противовирусной терапии и для повышения эффективности генетической модификации при создании генно-клеточных препаратов для использования в биомедицинских приложениях.

Личное участие автора в полученных результатах

Автор принимал участие в формулировании научной проблемы и планировании экспериментов. Автор лично выполнял все методы исследования, проводил статистическую обработку полученных данных, обсуждал и описывал полученные результаты. Автор участвовал в написании статей и патента на изобретение, проводил информационный поиск по исследуемой тематике.

На основании самостоятельной работы автора решена важная биохимическая задача исследования строения, свойств и функционирования надмолекулярных комплексов гистона Н1.3 с нуклеиновыми кислотами и вирусными частицами, что вносит важный вклад в разработку методов и научных принципов геной терапии. Данные, полученные лично автором, демонстрируют возможность расширения применения рекомбинантного гистона в биологии и медицине как для повышения эффективности переноса нуклеиновых кислот при

трансфекции/трансдукции клеток, так и для применения в качестве нового противовирусного вещества.

Связь работы с базовыми научными программами

1. Хоздоговор с ОАО «Институт стволовых клеток человека» «Исследование эффективности наноразмерных векторов для генной терапии» (2010-2011).

2. Грант компании ОПТЭК "Генетическая модификация мононуклеарных клеток пуповинной крови человека ex vivo для генно-клеточной те