Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гистона HI и протоонкогена c-myc при дифференциации эритролейкемических клеток мышей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Роль гистона HI и протоонкогена c-myc при дифференциации эритролейкемических клеток мышей"

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ПЕТНЮНАЙТЕ РУТА ПОВИЛО

РОЛЬ ГИСТОНА Н1° И ПРОТООНКОГЕНА с-шус ПРИ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭРИТРОЛЕЙКЕМИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЫШЕЙ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1992

Работа выполнена в лаборатории биологии развития Институте биохимии Литовской Республики.

Научный руковг житель г доктор биологических наук»

старший научный сотрудник А.А.ГИНЕЙТИС

Официальные оппоненты - доктор биологических наук.

Профессор В.И.ВОРОБЬЕВ

- член-корреспондент Литовской АН, доктор биологических наук, профессор А.А.ЯСАИТИС

Ведущая организация - Кафедра биохимии Естественного

Факультета Вильнюсского- Университета

Зашита состоится "16" июня 1992 г. в часов на заседании специализщ ованного совета к 011.05.01 в институте биохимии литовской Республики, ул. Мокслининку 12. 2021 г. Вильнюс.

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биохимии Литовской Республики.

Автореферат разоолан "15" мая 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета. f

кандидат биологических наук if. ¡XctAjjy- В.©. Зовите-Браженене

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность те.".;» Развитие тканей,! органов и их систем, а такзз собственно многоклеточных организмов зависит от координации процессов-пролиферации и дифференциации клеток. Поэтому исследования молекулярных механизмов дифференциации являются одной из центральных. задач клеточной биологии и индивидуального развития. Эта проблемма в сущности является теоретической предпосылкой разработки методов борьбы с такими нарушениями дифференциации» как злокачественное перерождение клеток,

Механизмы дифференциации любой клетки строго генетически детерминированы. В реализации программы дифференциации участвуют молекулы, обеспечивающие межклеточную сигнализацию, а также гены, ответственные за кодирование балков-рецепторов, принимающих эти сигналы* белков, активирующих и подавляющих репликацию дик. и белков, определяющих фенотип клетки < Mains сп. 1987: Dexter & spooncer, 1987). значительная часть регуляторных белков кодируются лротоонкогенами. поэтому выяснение функционирования этих генов во время дифференциации является задачей первостепенной важности. С другой сторокы потенциальная активность генов или. другими <xwzssfflu возможность индуцирования генов белками-регуляторами зависит от структуры хроматика, которая, в свою очередь, определяется белками* постоянно связанными с ДНК - гисгонами.

Накапливающиеся за последнее время экспериментальные сведения позволяют предположить. что белки-регуляторы» образующие транскрипционный комплекс (Alaouzni, 1990; wolffe, 1991). и гкстоны. в частности гистон HI. конкурируя за место на ДНК во время репликации, определяют расположение нуклеосом на промоторных (регуляторных) последовательностях генов. В этой связи чрезвычайно важным становится понятие регуляторных гханизмо'р, влияющих на экспрессию ядерных протоонкогенов и семейства гистона КГ. известно, что разные суотипы этого гистона неодинаково действуют на структуру ДНК. связываясь о . нею как во время репликации хроматина, так и после завершения транскрипции генов в течение всего клеточного цикла (Garrard.

При изучении взаимодействия регуляторннх белков и гиоюнсг удобной биологической моделью является дифференциация клеток эритроидного ряда - эритролейкемические клетки мыши (МЕЬ). трансформированные комплексом 1Т1епа на стадии проэритробластов (Гг1епа. 1957). меб клетки под воздействием разных химических веществ. таких как гексаметвденбисацетамид ТМБА). диметилсульфоксид (ДМСО) и бутират натрия, дифференцируются. в эритроците-подобные клетки. Эти клетки при проявлении фенотипа эритроцитов (синтез гемоглобина, белков цктоскелета) сохраняют ядро. Последнее предоставляет возможность мослгдовать изменения структуры хроматина и Функциональную активность генома во время терминальных стадий дифференциации.

Цель работы: _ исследование роли ядерного протоонкогена с-туе и гистоноз семейства Н1 в процесса индупируемог. дифференциации эритролейкемических клеток шши.

Задачи работы: при индукции дифференциации МЕХ клеток разными индукторами:

1) изучить динамику экспрессии мРНК с чаус;

2) исследовать экспрессию мРНК гистона Н10:

3) определить динамику количественных изменений субтипоь гистонов Н1 и

4) путем введения в МЕЬ клетки вектора, содержащего ген гистона Н1° под индуцибельным промотором» изучить эффект постоянной экспрессии трансфицированного гена гистона Е1° на процессы пролиферации-дифференциации в этих клетках.

Научная новизна. Исследована кинетика экспрзсоки протоонкогена с-туе р. проходяаих диффзренлиацию эритролэйкемических клетках мышей при использовании ДМСО. ГМБА и бутирата натрия в качестве индукторов дифференциации * Установлено^ что в течение двух часов после добавления в - среду указаниях индукторов транскрипция протоонкогена с-туо полностью блокируется, однако реэкспрасскя этого гена при индукции бутиратом натрия начинается раньше (18 ч). чем при индукции ДМЗО или ГМБА (24 ч). Показано. что гиперацетилирование гистонов НЗ и Н4 не препятствует нормальным процессам транскр:шции при дифференциации МЕЬ клеток, индуцированных бутиратом натрия.

Впервые исследована кинетика экспрессии мРНК гистона Н1°»

_ з -

увеличение количества этого оелка, а также изменения количества некоторых молекулярных вариантов гксгокз Н1 з хроматине-проходясих дифференциацию эритролейкемических клетках мкэеп. Установлено. что' во время первого клеточного цикла после начала индукции 16-12 °)> когда эритролейкемичеокие клетки становятся кок><1Ш1рованнами к эритроилной дифференциации. количество гиотона Н1° увеличивается в 5 раз- в то время как количество некоторых вариантов гиотона НТ уменьшается, на последние этапах дифференциации ЧЕ£ клеток (72-12О ч) количество гистона Н1° в хроматине составляло около 25-30% от гиотона Н1.

Впервые осуществлена трансфекция меь клеток рзкбмсинантной плазшдой рЮС~! содержащей экзогенный ген гистона под

икдуцкбельным промотором ммгу ши Исследована кинетика экспрессии мРКХ экзогенного гена гистона Н1° и протоонкогена с -туе в транафнцяровзнных МЕЬ клетках. Установлено, что. во время индукции ШГУ ЪТП промотора дексаметазонсм, мРНК экзогенного после изменений экспрессии в первом клеточном цикле и начиная со второго клеточного цикла (24 ч). постоянно увеличивается. Установлено, что при экспрессии экзогенного гена Н1° до 20% клеток проходят дифференциацию. Показано. что экспрессия экзогенного Ш° вызывает изменения экспрессии протоонкогена с-аус> сходные с изменениями при хшцческа® индукции дифференциации.

Практическая ценность работы, разработан метод транзакции клеток млекопитающих в'суспензии экзогенным геном я • отбора трансфектантоз на основе селективного уаркера. Транофицкрованные МШ, клетки могут быть использованы з дальнейших исследованиях механизмов дифференциации клеток. Результаты работы используются в лекциях по клеточной биологии на Естественном факультете Вильнюсского Университета..

Апробация работы. Материалы диссертационной работы, докладывались на X Всесоюзном симпозиуме по структуре ¿1 функциям клеточного ядра (Гродно- 1330) и на I международной конференции молодых ученых "Проблемы и методы з молекулярной биологии клетки г в биотехнологии" (Кзварна» Булгария. 1990).

Публикации. Но теме диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 2-х докладов. ' статья в печати.

Объем работы, диссертация состоит из введения, обзора

литературы, экспериментальной части» обсуждения результатов, обобщения, выводов и описка цитируемой литературы (ISO источника). Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунками и I таблицей.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являются эритролейкемические клетки мыши, линии F4N. а такте экзогенным геном гистона Ш° нами трансфшшрованные эти не клетки.

Для культивирования MEL клеток использованы среды RPMI-1640 (SIGMA) ' и DMEM (Flow)-. Плотность MEL клеток 3

с;

культуре поддерживалась в интервале 1-5 х 10 хпеток/мл при температуре культивирования 37° о. Для индукции дифференциации использованы 2.5 мм бутирата натрия, 2% ДМСО и 5 мм ГМБА, а как индуктор экзогенного гена гистона HI0 - I мкМ 'дексаметазон» Количество дифференцированных клеток в культуре определялось при помощи бензидиновой реакции ' (Orkin. 1975). Общее число клеток в культуре определяли подсчитыванием жизнеспособных клеток, применяя в качестве красителя 0*4% трипановый синий.

Для трансфекции использована векторная ялазмида pi.BG (Pharmacia), содержащая индуцибельный промотор MMTV LTR» под которым была вставлена кДНК гистона HI0 (Dr. R.N.Eiseman. США). Последовательность кДНК гистона ЕЕ0 такае содержит 5* нетраяслируемую последовательность и кодируемую область примерно из 15 нп. находящуюся за терминальным TGA кодоном» Трансфекция суспензных MEL клеток проведена кальций-фосфатным методом (Gorman. 19823. Совместно а рекомбинантной плазмидой pM3G трансфшгарована и плазмида ppsvneo* содержащая селективный маркер neo, который был использован для селекции грэнсГ'Шированных клеток.

Осшую РНК после разного, времени индукции выделяли с применением гуанидинизотиоциаката (Chomczynski «< Sacclu, 1987). впосл?дствии эта РНК была фракционирована при . помоши плектрофореза в денатурирующих условиях ь агарозном геле, переплела на мембраны Hybond-N и далее проведена ее лл->т-пх ридизация с соответствующими мечеными пробами ДНК <Ч£-чк ¡rise и др.. i¿84). Радиоактивность фракций нуклеиновых

кислот на мембранах после блот-гибридизации была определена методом радиоазтографии.

Ядра MEL клеток выделяли по методу Hall et ai. (1Э85) с некоторыми модификациями. Общий гистон из клеточных ядер экстрагировали 0.4 н H7S04, осаждали на холоду 96% этанолом. Выделенный общий гистон фракционировали при помоши электрофореза в полиакриламидном геле в анионной эяектреФоретической_системе. содержащей додеиилсульфат натрия (Laemmll. 1970). и в катионной электрофоретической системе, содержащей е М мочевину (Panylm chaiJdey, 1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

.С. Экспрессия Ггна гдобина

Индукторы дифференциации, такие как дмсо. гмба и оутират натрия могут нарушить вирусный блок развития MEL клеток и обусловить вход этих клеток в программу дифференциации. целью исследования накопления мРНК глобина во время дифференциации МЕЪ клетки индуцировали 2.5 Ш оутиратом натрия (риг,. I). Экспрессия мРНК гена глобина не была обнаружена в конт£Шй5йь"Г£ неиндуцированных клетках. Через б ч после начала индукда:и MFHK глооина црисутстзовала в малом количестве, а за период <.. 6 до 12 ч индукции увеличивалась более чем в два раза. За период процесса коммитирования и дифференциации (с 12 по 18 4J уровень мРНК глобина значительно вырастал, после чего постоянно увеличивалзя.

CX-GteBIÍ.

2« 49 ВРЕМ? Í4)

Рис. I. Динамика транскрипции глобинового гена в МЕЪ клетках« индуцированных к дифференциации 2.5 мМ бутиратом натрия. Блот-гибридизация оошей РНК. выделенной из контрольных (О ч) и индуцированных к дифференциации (соответствующее время) МЕЪ клеток с мечэной КГ.НК «-глобинового гена.

Таким образом, экспрессия гена глобина в MEL клетках» индуцированных бутиратом натрия, значительно увеличивала''ь в течение 12-48 ч. т.е. в периоде коммитирования. и определения пути к терминальной дифференциации;

2. Ацетилирование гистонов

Известно, что бутират натрия индуцирует гиперацетилироза-ние гистонов. блокируя действие ядерных деацетилаз.

Был исследован эффект разных индукторов дифференциации на уровень ацетилирования гистонов НЗ и Н4.

'12 3 4

Рис. 2. Гель электрофорез общего гистона. выделенного из контрольных MEL клеток (I) и клеток, индуцированных к дифференциации 2% ДМСО Hi Hi (2)* 5 ММ ГМБА (3) И 2.5 ММ

бутиратом натрия (Л). Общий гистон выделяли после 72 ч Н1<> ___ . ^ . индукции, электрофорез про-

, з водили в 15% полиакриламид-

2 ном геле, содержащем 8 М мо-нз А . чевину. Шфры I, 2. 3. 4 на

' , левой стороне картины

НЦ Ci^ о обозначают гистоны с соот-

л . ветствуюшим числом остатков • Л-ацетиллизина. О соответст-

3 вует неацетил!фованной форме 2 гистона.

Н4 1

- - <"* 0

аш» w

Степень ацетилирования гистонов показывает (рис. 2). . что в контрольных клетках (I) гистон Н4 представлен четырьмя ацетилированными формами, в клетках. индуцированных к дифференциаций .ДМСО (2) или ГМБА (3) клетках гистон Н4 в основном представлен неацетили^ованными молекулами (А0). В случае дифференцированных клеток, индуцированных бутиратом натрия, как и в контрольных. обнаружат все четыре ацетйлирозанные формы гистона Н4. Известно. что гипераистилировашше гистоны содержатся в активном хроматина и

казется естественным. что в активно пролиферируюших МЕЬ клеткззг эти гистсны являются гиперацетилирозанными. в случае индукции бутиратом натрия, з определенных участках хроматина, содержащих гиперацетилированные гистоны. должны координирований работать только гены» зызываюшие дифференциацию МЕЬ клеток. Однако при тотальном гиперацетилироваиии хроматина появляется'-воэмозность активации Генов не нужных для осуществления процессов дифференциации. Наиболее вероятным расузиением для объяснения этих фактов является следующее; I) изменения з структуре хроматина» вызванные гипераиетилированием гистонов. не влияют на механизмы дифференциации МЕЕ. клеток; 2) характерный обмен ацетильных групп у гистонов не является прочно сопряженным с регуляторными механизмами транскрипции.

3» Изменения уровня с-шус мРНК при диФФеренциацш * МЕи клеток

Учитывая различия в механизмах действия индукторов дифференциации, представлялось целесообразным исследовать кинетику экспрессии гена с -туе при индукции MEL клеток разными такого 'рода агентами (Рис. 3"). Даши исследования показали, что. независимо от использованного индуктора, з течение 2 ч после

2SS3 ss

14iс. 3. Количественная оценка с-туе транс крип-тов в контрольных MEL клетках и в клетках, .индуцированных к дифференциации 2.5 мм бутиратом натрия .(I). 5 мМ ПАЗА (2) и Z% ДМСО (3) после соответствующего времени индукции. Блот-гкеридизадия общей РНК о кзчепой кЯНК с-аус и 3APSH (для контроля количества РШО. Для количественной оценки экспрессии проведено деюитометрлчеокое ска -нироваиие автографов с-иус и GAPPH и вычислено ' соотношение С-ПУС/OAPDH (А).

добавления индуктора дифференциации происходит внезапное снижение экспрессии гена с-туе» Спустя некоторое время с начала индукции наступает новая волна с-туе экспрессии« Однако время этой реэкспрессии зависит от использованного индуктора» В дальнейшем происходит уменьшение уровня с-иус мРНК з случае индукции ГМБА и бутиратом натрия. Зта динамика с-туе экспрессии отличается от таковой в случае ДМСО: уровень с-туе экспрессии в этих клетках, начиная с 24 ч индукции. незначительно увеличивается.

Таким образом, при использовании любого из трех индукторов было показано, что транскрипция е-шус гена испытывает бифазные изменения. Установлено, что существует разница во времени восстановления уровня с-туе мРНК. При использовании бутиратг натрия в качестве индуктора с-иус реэкспрессирует раньше, чем в случая других индукторов. Мохно предположить, что такого рода ускорение реэкспрессии гена с-туе в ответ на индукцию бутиратом натрия обусловлено более эффективными механизмами передачи сигнала индукция, или способностью гиперацетилированного хроматина к более быстрой транскрипции.

4. количественный анализ субтипоь гистоное Ш и ш0

4.1. Экспрессия мРНК гистона Н1° . .

Для исследования индукции гена гистона Н1° и кинетики его экспрессии были применены описанные в предыдущем разделе

ВРЕМЯ [ч)

Рис. 4. Количественная оценка экспрессии гена гистона Н1 в контрольных (О ч) МЕЬ клетках и в соответствующее время при индукции 2.5 мм бутиратом натрия (I). 5 ММ* ГМБА (2) и 2% ДМСО (3).' Блот-гибридизация с меченой кДНК генов Н1 и ОАРПН (для контроля количества РНК;. Для количественной оценки проведено денси-тометрическое сканирование автографов гистона Н1и и С-АРШ и вычислено соотношение НГ'.'СгАРЬЯ I А).

с

индукторы дифференциации. Посла 72 ч воздействия на МЕЬ клетки бутиратсм нэтряя. ямсо л гмба уровень дифференцированных клеток з популяции составлял соответственно 50-60%. 60-70% и 70-80%. как видно из рис. 4, уровень мРНК гистона НГ° увеличивается при индукции всеми использованными индукторами, а к 72 ч он в десятки раз превышает уровень в контрольной культуре.

4.2« Синтез субтипов гистонов HI и НЕ0 во время дифференциации MEL клеток

Дифференциация MEL клеток сопровождается морфологическими изменениями клеток, зключая уменьшение ядра. конденсацию хроматина и увеличение количества гистонь HI0, Чтобы выявить зозмолную корреляцию между изменениями в структуре "хроматина и составом гистона HI был проведан анализ изменений субтипов гистсна HI во время дифференциации МЕГ' клеток» индуцированных бутиратом натрия и ГМБА* Для количественной оценки субтипов гистона HL белки, окрашенные coonassis Brilliant Blue G-250 в гелях после электрофореза в катионной электрофсретической системе, сканировали при длина волны 590 нм. Дснситограммы и количественные изменения в содержании субтипов ИТ и fH° представлены на рис. 5. А и,5 соответственно. 3 этих опытах была использована также система дсн-электрофореза, проведенные исследования показали, что во время дифференциации МЕЬ клеток происходят количественные изменения в содержании субгипов Ш и НГ°, В случае бутирата натрия общее количество субтипов К1а, HIb и Hid. уменьшается примерно на 10% в течение первого клеточного цикла после индукции (до 24 ч) и сстгется, на этом уровне до 72 ч. Общее количество субтипов Н1с и Hie сохраняется на постоянном уровне в течение 72 ч дифференциации. Количество гистона Н1° после индукции дифференциации обеими агентами увеличивается за это время до 10%. в то же время в MEL клетках, индуцированных ГМБА, количество гистона HI0 постепенно увеличивается, достигая уровня 20% от- общего содержания гистона HI !С 120 ч индукции.

Более детальный анализ с-убтипоз гистонов HI и HI0 в МЕ1 клетках, штудированных ПлБА (рис. 5, II), показывает, что ло

etd с. aî? Ml НГ

X «а +

Ç »

и\

о

•Li

А

(Л

»2 . С?ЕМЯ |Ч|

Г ,

;

шЬй с« и» H HI*

■

SreiAî! J4j

Рис. 5. Изменение количества. гистонов Н1 и Н1 во время дифференциации МЕЬ клеток, индуцированных 2.5 мМ бутиратом натрия (I) и.5 мМ ГМБА (II). (А) - денситограмш субткпов гистонов НЕ (а.Ь.с1.с,е) и КЕ (а.Ь) после проведения электрофореза в системе: уксусная кислота -мочевина. (3) -количественный анализ гистонов Н1 и 1Пи в разное время после йндукцик МЕЬ клеток, индуцированных разное время, проведен при подсчете плошадай каждого пика после окрашенных гелей. I - Н1 (а,Ь,с1). 2 - НЕ (с.е)

денситометрирования ,е), 3 - НГ7 (а.Ь).

Эб ч индукции количество субтипов Ша. HIb. Hid уменьшается при увеличен®: количества .HIc. Hie и HI0.. Это обстоятельство отчетливо выявляется при сравнении динамики отношения ЕГ/Н10 во время дифференциации МЕЬ клеток, индуцированных бутиратом натрия и ГМБА. Как показано на Рис. 6. хроматин контрольных клеток содержит, по крайней ыьре, в 50 раз больше гистона. HT. чем HI0. В ходе дифференциации гистон HI0 постепенно достигает

ВРСМЯ |ч|

Рис. 6. Изменение соотношения между количеством пшгйдаэ" tHI/HI^j зо время дифференциации МЕЬ клеток, индуцированных 2.5 мм бутиратом натрия (I) и 5 мМ ГМБА (2)/Количество гистонов HI и HI в клетках, культивированных в присутствии обоих индуктотзов разное время. анализировали в анионной электрофореткчр^кой системе CA) и в катионной системе (Б). Количественная оценка проведена при подсчете площадей пиков на денситограммах гистонов HI и HIU и вычислено соотношение HI/HI0.

1/3 от общего количества тистока HI в клетках, индуцированных ГКСБА. и I/IO - в случае индукции бутиратом натрия. Некоторые различия з накоплении гистона HI0 при использовании разных индукторов могут быть следствием различий числа дифференцирующихся клеток в культуре, индуцированной бутиратом натрия (50-60%) И ГМБА (70-80%).

Хроматин контрольных МЕЬ клеток содержит примерно 70% Hla. Hlb и Hid. 30% Hic и Ше и 2-3% гистока HI0, наши результаты ■ свидетельствуют о том. что: I) зо время первого клеточного цикла после индукции дифференциации (12-24 ч). когда МЕЬ клетки становятся коммигированными к зритроидной дифференциации.

наблюдается 5-кратное увеличение количества как мРНК гисгонэ Н10, так и самого белка: 2).с начальных стадий .дифференциации (до 24 ч) происходит постепенное уменьшение количества субтипов Н1а. ШЬ и HXd при синхронном увеличении количества гистона и вслед за этим (до 96 ч) - при увеличении Hic - HIe и HI° и. на терминальной стадии дифференциации (96-120 ч). - .только при увеличении субтипов Hic и Ше: 3)- на последней стадии дифференциации MEL клеток (72-120 ч) молекулы гистона HI0 составляют 25-30% от гистона HI. Так как изменения субтилов гистона Н1 могут быть непосредственно связаны с изменениями структуры хроматина и регуляцией транскрипции, в MEL клетках они могут определенным образом влиять на активность некоторых генов, ответственных за коммутирование этих клеток к дифференциации.

5. Экспрессия гена с-шус при индукции экзогенного гена Н1° в трансфицированных MEL клетках

5.1. Кинетика экспрессии экзогенного гена гистс^а К1°

Результаты предыдущих разделов показали, что при индукции MEL клеток химическими агентами дифференциации экспрессия протоонкогена с-туе испытывает бифазные изменения, а экспрессия гена гистона Н1° постоянно увеличивается. Эти результаты явились логической предпосылкой исследований экспрессии с-иус при индукции экзогенного гена гистона Н1°. т.е. в отсутствие химических агентов дифференциации. С этой целью МЕЪ клетки трансфицировали рекомбинантной плаэмидой pMSG. содержащей кДНК гистона НТ° под индуцибельным промотором MMTV LTR. Экспрессию экзогенного гена гистона HI0 индуцировали I мкМ дексаметазонсм.

Как видно на рис. 7, урозень мРНК экзогенного гистона Н1° после добавления в клеточную среду дексаметазона резко увеличивается и, вслед за этим, в интервале 13-24 ч. падает нз 50%. Качиная со второго клетс :зго цикла, . экспрессия гена гистона Я1° постоянно увеличивается. На 72 ч индукции уровень ,-иРНК H1L' является в 15.3 раза выле. чем ' уровень в кеинаутшрозанных MEL клетках, эти результаты показывают, что нг' !Л'НК накапливается в период комчитироьания клеток к -^екшг.чппи и поддер,тавс»гт<;я аъ достаточно высоком уровне в

терминально дифференцированных клетках. Представляется вероятным» что гисток Ш° играет важну>з роль в коммитировании клзтоя л дифференциации и в самом процессе дифференциации.

количественной оценки экспрессии гена

Рис. 7. Транскрипция экзогенного; гена гисто-на щ в трансфишфо-ванных МЕЬ клетках, индуцированных I мкМ дексаметазоном. Уровень 283 рРНК служило в качестве контроля количества РНК. оошая РНК выделена го контрольных трансфицированных клеток (О ч) и после соответствующего времени индукции * экзогенного ■П. Проведена • бл'от-гибридизапия с меченой хДНК гена ЛН1. для

гена ЛНГ гистона ш

проведено Н1и И 283

5.2. Кинетика экспрессии протоошсогена с-шус

Проведенные исследования показали. что экспрессия протоонкогеНа с-шус при экспрессии экзосенногЬ" Ш° испытывает

■■»Г

Рис. 8. с-шус транскрипты в трансфицированных МЕЬ клетках экзогенным геном гистона НГ\ Экспрессия

экзогенного гена

гистона щ ■ индуцирована I мкМ дексаметазоном. Уровень 28 Б РРНК служило в качестве контроля количества РНК. Общая РНК-выделена из контрольных трансфи-! • к " цированных клеток (О ч)

ВР£МЯ ,Ч| и после соответствующего времени индукции экзогенного НЬ^. Блог-гибридизация с меченой кДНК гена с-туе. Для количественной оценки экспрессии гена':, с-шус проведено денситиметрическое сканирование автографов с-иус и 285 рРНК и вычислено соотношение, с-гвус/283 рРНК с А).

11

/

и..

- и -

изменения сходные с теми, которые наблюдаются при индукции химическими агентами дифференциации (рис. 8). т.е. экспрессия с-аус язляется оифазной. а фазы увеличения к падения экспрессии совпадают во времени- Самым интригующим при этом является тот Факт, что периоды увеличения экспрессии гена Н1° совпадают с периодами уменьшения экспрессии с-шус,

Таким образом, можно предположить, что на экспрессию гена с-шус агенты дифференциации не оказывают прямого влияния» а действуют через другие ядерные агенты, з том числе и гистон Н1°. Не исключено, что именно гистон ЕЕ3, экспрессия которого индуцируется агентами дифференциации, обуславливает изменения в экспрессии гена с-эус.

5.3. Дифференциация МЕХ клеток при экспрессии эндогенного и экзогенного Н10

Увеличение количества дифференцированных клеток была исследована при разных условиях культивирования контрольных и

Рис. 9. Кинетика дифференциации контрольных (А) и трансфишрованных (Б) MEL- клетс.с в контрольной культуре. (I), при индукции I мкМ дексаметазоном (2), 2.5 мМ буткратом натрия (3) и при совместном воздействии I мкМ дексаметазоном и 2.5 мМ оутцратом натрия ¡4). Клетки были высеяны в концентрации I-I.5 х 10 клеток/мл. Для установления дифференцированных клеток £ культуре были взяты пробы после 24. 48. 72 и '96 * культивирования в соответствующих условиях. Дифференцированные клетки установлены при помощи бензидиновой реакции.

трансфишгоовакных МЕЬ клеток. Клетки обоих типов- а контрольные :? лри воздействии дексамгтазона. претерпевают спонтанную дифференциацию, которая составляет 1-2% от общего числа клеток в культура. При индукции эндогенного или экзогенного генов гкстсна НТС МЕЬ клетки дифференцируются в различной степени (рио. 9)« Следует отметить, что при достижении большей степени дифференциации удлиняется время клеточного деления.

ВЫВОДЫ

т. Гиперадетилирозание гистонов. вызваннов .индуктором дифференциации МЕГ. клеток - бутиратом натрия, не препятствует осуществлению генетической программы клеточной дифференциации.

2. Независимо от природы использованного индуктора ¡ГМБА, дмсо и бутират натрия) обнару;швается фазовый характер экспрессии протоонкогена с-шус: вслед за индукцией экспрессия полностью ингибкруется. с последующим восстановлегшем до контрольного уровня в терминальной фазе первого клеточного цикла и с постепенным снижением в терминальной Фязе дифференциации-

3. В 'течение первого клеточного цикла МЕЬ клеток, индуцированных к дифференциации ГМБА. ДМСО или бутиратом натрия» уровень экспрессии мРНК и количество самого гистона Н1° постепенно увеличивается, а количество субтипов а. Ь. с! гистона Щ уменьшается. На терминальной стадии дифференциации количество Н1° составляет треть от обшего количества' Н1.

4. индукция экспрессии экзогенного гена гистона Н1° 5 транефшированных МЕЕ. клетках, как и воздействие агентов дифференциации*, вызывают фазовые изменения в транскрипции протоонкогена с-туа и приводят МЖ. клетки к дифференциации.

5. Обратная корреляция увеличения . экспрессии транефшированноге гена Ш0 с подавлением транскрипции протоонкогена с-туе указывает на участие гистона НГ° в процессе коммитирсвания МЕЪ клеток х дифференциации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЖЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петнюнайтэ Р., Серапинеке К.. Ясинскао Ая с Гинейтис А* Экспрессия генов гистона HI0 и 'протоонкогена с-аус при индукции дифференциации эрктролейкемических клеток мыши бутиратом натрия / Тезисы к X Всесоюзный симпозиум по структуре и Функциям клеточного ядра.- Гродно, БССР.- I3S0.

2. R. Petniomite. N. Serapiniene. A. Jasinskas. A. Glnsitis Modulation of histone H1° and с-иус gene expression during ¡¡¡urine erythroleuicemia cells differentiation / >iaterials oi the First International Young Scientist conference "ProblsES and Methods in Molecular and cell. Biology and Biotechnology". - Kavarna, Bulgarija.- 1990.

3. R. Petnitmaii6. N. SerapinienS. G. Treisyt^, A. Jasinskas, A. Gineltis Murine 'erythroieiDceniia call differentiation >. Effect of different inducers on с-шуо pmconcoseae expression / Experimental 3iology.~ Vilnius.- 1992,- N bP. 3-9»

4. G. Trelgyt6. R. Petnionait6, A. Gineltis ' Murine erythroleukemia cell differentiation 2. Modulation in amounts of the histone HI and H1° subtypes / Experimental Biology.- Vilnius.- 1992.- N 1.- P. 10-16.

5. R. Petnionait6. A. Jasinskas, > A. Gineltis Murine erythroleukemia cell differentiation 3. Effect of transfected H1° gene overexpression on с-шуо' mRNA level / Experiraental Biology.- Vilnius.- 1992 (in press).

(3, ^/«¿¿ZtCfcíií'

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ПЕТНЮНАЙТЕ РУТА ПОВИЛО

РОЛЬ ГИСТОНА Hlb, И ПРОТООНКОГЕНА с-туе ПРИ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ. 1|ЭРИТР0ЛЕЙКЬМИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЫШЕЙ БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60х«4 1/1G. ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 3G0. УСЛ.ИЕЧ.Л.1.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ В ИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЛИТВЫ.2000.ВПЛЬНЮС,ТОТОРЮ 27.