Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные переходы в хроматине при транскрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные переходы в хроматине при транскрипции"

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени И. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА АКАДЕМИИ НАУК СССР

'-зон

На правах рукописи УДК 579.254

Л

КАРПОВ Вадим Львович

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ В ХРОМАТИНЕ ПРИ ТРАНСКРИПЦИИ

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1990

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии имени В. А. Энгель гардта АН СССР

(зав. лабораторией - академик А. Д. Мирзабеков)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик АН СССР доктор биологических наук, А. А. Баев

член-корреспондент АН СССР доктор химических наук, А. А. Богданов

доктор биологических наук, В. И. Воробьев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт общей генетики АН СССР

Защита состоится" " 1990 г. в часов на за-

седании Специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта АН СССР пс адресу: 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта АН СССР. Автореферат разослан " " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А. М. Крицын

Лк'Шхлышсхь проблемы и общая характеристика работы.

С увеличением сложности организмов возрастают размеры ДНК, одержащей информацию об их строении, и это приводит к еобходимоети ее компактной упаковки в клеточном ядре. Размеры олекулы ДНК эукариотческих организмов могут достигать нескольких етров, при этом она должна быть упакована в ядре, размер которого оставляет всего несколько микрон. Кроме того, каждая клетка, имея енетическую информацию о строении всего организма, должна ктивировать только определенный набор генов, определяющий ее енотип. Все это предъявляет высокие требования к способу упаковки НК в клеточном ядре. ДНК в клетках высших организмов упакована в иде сложного нуклеомротеидного комплекса - хроматина. Белки роматина, основную часть которых составляют гистоны, служат не злько для упаковки неактивной ДНК, но и для регуляции ее сгивности в нужное время и в определенных локусах. Таким образом, шлиз ДНК-белковых взаимодействий может дать ключ к пониманию не )лько структурной организации геномной ДНК в составе клеточного фа, но и механизма регуляции генной активности, что является той из наиболее актуальных проблем современной молекулярной юлогии.

Представления о нуклеосомной организации хроматина при )анскрипции являются наиболее противоречивыми. В компактном »стоянии ни нуклеосомы, ни 30 нм фибрилла не приспособлены для юдвижения молекул РНК-полимеразы вдоль ДНК. В ряде исследования :ли получены данные об удалении нуклеосом с ДНК, что должно было I облегчить прохождение молекул РНК-полимеразы вдоль ДНК. Однако и результаты противоречат данным о возможности транскрипции и в шсутствии нуклеосом. Эти противоречия требовали разрешения, и мы пытались найти новые подходы для решения этой проблемы.

PJ настоящей диссертационной работе был предложен новый метод я изучения характера ДНК-белковых взаимодействия в хроматине еточного ядра. Необходимость нового подхода возникла в связи с дом проблем, возникающих при работе с изолированным хроматином, . ежде всего из-за неконтролируемого перераспределения белков жду отдельными участками ДНК. В большинстве работ такое рераспределение приводило к недостоверности полученных данных, к ду неразрешимых противоречий. Метод фиксации ДНК-белковых

контактов позволяет преодолеть эти затруднения. Этот методический подход служит для сравнительного анализа качественного и количественного состава белков, участвующих в организации ДНК специфических участков различных генов, находящихся как в активированном, так и в неактивном состоянии.

Предлагаемый метод носит общий характер и может применяться практически для любых нуклеопротеидных комплексов как в составе клеточного ядра высших организмов, так и для простейших организмов, включая бактерии и вирусы. В основе данного подхода лежит метод фиксации ДНК-белковых контактов различными химическими агентами непосредственно в ядре (без предварительного выделения нуклеопротеидного комплекса) с последующим анализом ДНК-белковых комплексов с помощь» разделения в системе двумерного гель-электрофореза и гибридизации со специфическими клонированными участками генома. Это позволяет качественно и количественно оценить изменения ДНК-белковых контактов, происходящие в интересующем нас участке ДНК гена в ситуации, максимально приближенной той, которая существует в клетке.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы была разработка общего метода количественного и качественного сравнения белкового состава нуклеопротеидных комплексов специфических участков генома без предварительного изолирования этих комплексов и использование этого метода для анализа природы и характера структурного перехода хроматина при транскрипции. Прежде всего необходимо было решить вопрос о том, что происходит с нуклеосомами в участках хроматина, где происходит активный синтез РНК. Это включало изучение возможных изменений в количественном и качественном составе белков, взаимодействующих со специфическими участками ДНК генов до и после их активации, изменений возможных контактов этих белков с ДНК, связанных со структурными переходами в транскрибируемом хроматине. Кроме того, предполагалось использовать данный метод для обнаружения специфических белков, участвующих в регуляции активности генов, поскольку данный высокочувствительный метод гибридизации с "белковыми тенями" позволяет из огромного разнообразия контактов ДНК с различными белками выбрать только те,

оторые относятся к интересующему нас специфическому участку енома [например, регуляторному району гена).

аучная новизна и практическая ценность работы.

Е основу данной работы положен оригинальный метод изучения уклеопротеидной организации хроматина, приоритет которого ринадлежит диссертанту и его соавторам. Применение данного метода ля изучения структурных изменений в составе хроматина генов елков теплового шока во время их активации, а также рибосомальных енов дрозофилы позволило получить принципиально новые данные о арактере этих структурных переходов. Получены новые данные о азличиях в структурной организации нуклеопротеидного комплекса доль домена гена белка теплового шока (бтш 70). Основным езультатом этих исследований является то, что гистоны остаются вязанными с ДНК кодирующей области активнотранскрибируемых генов при этом не препятствуют продвижению молекул РНК-полимераэ вдоль .НК. Однако, набор ДНК-гистоновых контактов в составе такого роматина изменяется, т.е. происходят кон^ормационные переходы в труктуре активнотранскрибируемого хроматина, адаптированные к еспрепятственному считыванию информации с ДНК молекулами 'НК-полимерази. Удалось обнаружить ряд особенностей в организации уклеопротеидного комплекса регуляторных участков генов теплового юка и рибосомальных генов дрозофилы. Начаты исследования по эучению роли негистоновых белков в активации данных генов в словиях эксперимента максимально приближеннх к ситуации in vivo, ito является очень существенным преимуществом предложенного [етода.

Разработанный в диссертации метод получил широкое признание :ак в СССР, так и за рубежом. При выполнении работы получен ряд ювых и приоритетных научных данных, позволяющих глубже понять [рироду механизмов, лежащих в основе реализации генетической Шформации в клетке. Разработанный метод носит универсальный сарактер и может быть использован для изучения природы |уклеопротеидного комплекса в любых организмах. Данный метод ювместно с Институтом молекулярной биологии Минмедбиопрома Новосибирск I, используется при изучении нуклеопротеидной )рганизации вируса осповакцины, планируется проведение совместной заботы с Лабораторией клеточной биологии Французского колледжа

(Париж) на примере гена периферина (тканеспецифического цитоскелетного белка нейронов), получены новые данные об организации нуклеопротеидной организации глобинового гена эритроцитов цыплят (лаборатория молекулярной организации хромосом, ИМБ АН СССР, Белявский A.B. и Постников Ю.Е.).

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены на различных Всесоюзных и международных симпозиумах и конференциях, в том числе: 47-ом симпозиуме по структуре хроматина (Колд Спринг Харбор, США, 1962); двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1901: Кельн, ФРГ, 1983); двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982); двустороннем симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984; Ленинград, 19Ö6); 16-ой и 16-ой конференциях ФЕБО (Москва, 1964; Любляна, Югославия, 1967); 9-ом и 11-ом Европейских совещаниях по генетике дрозофилы (Сегед, Венгрия, 1985; Марсель, Франция, 1989).

Структура работы.

Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. Основная часть результатов получена диссертантом в соавторстве с Преображенской О.В. В ряде экспериментов принимали участие Начева Г.А., Джербашьян А.Р., Беликов C.B., Нагорская Т.В., Гущин Д.Ю, Эбралидзе К.К., Колчинский A.M., Вашакидзе Р.П., Бельговский А.И. Всем коллегам автор приносит благодарность за помощь в проведении экспериментов. Автор также выражает признательность академику А.Д.Мирзабекову за постоянный интерес и обсуждение работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Метод гибридизации с "белковыми тенями" 1.1. Предпосылки разработки метода и его основная идея.

Бурное развитие хроматиновой тематики во второй половине 70-х

годов позволило получить представление об. основных уровнях упаковки ДНК в составе клеточного ядра. Наибольший интерес вызывало изучение повторяющихся структурных субъединиц хроматина, названных нуклеосомами, образующихся на первом уровне упаковки ДНК в результате ее взаимодействия с гистонами. В эволюционном плане аминокислотная последовательность гистонов чрезвычайно консервативна, что определяет жесткие ограничения вариабильности пространственной организации молекул гистонов, а также и гистонового октамера, составляющего сердцевину нуклеосомы. Консервативность организации гистонов предполагает

сбалансированность пространственной архитектуры нуклеосомы. Нуклеосома является достаточно стабильной частицей, сохраняющей свои физико-химические параметры после ее выделения в виде мономера, что значительно облегчает изучение ее свойств и структурной организации. Именно поэтому в этой области был достигнут большой прогресс. Однако, как только предпринимались попытки перейти от структуры нуклеосомы к ее функции, начинали сказываться чрезвычайно неудобные в экспериментальном плане свойства нуклеосомы как частицы лабильной, склонной к перераспределению белков вдоль ДНК, чувствительной к ионному окружению, присутствию негистоновых белков,последовательности ДНК, на которой она располагается и т.д. Все это приводило к тому, что литература наполнилась множеством весьма противоречивых данных о судьбе и роли нуклеосомы в ходе таких важных биологических процессов, как транскрипция, репликация, репарация ДНК и т.д. Такая противоречивость была связана с необходимостью изолирования из клетки или даже из ядра нуклеопротеидного комплекса, в результате чего начинался процесс неконтролир уемого перераспределения множества компонентов, входящих в его состав. Каждый исследователь использовал свой подход к данной проблеме и, в зависимости от этого, получал новые данные. Таким образом возникла необходимость в разработке метода, позволяющего без предварительного изолирования хроматина получать информацию о его структуре.

Для этой цели нами был разработан высокочувствительный метод гибридизации с "белковыми тенями", в соответствии с которым ДНК-белковые контакты фиксируются непосредственно в клетке или на изолированных ядрах с помощью химических агентов с образованием прочной ковалентной связи, что позволяет в дальнейшем

клетки (пришивка с помощью ультрафиолета) ядра (пришивка с помощью дтетилсульфата)

I

лизис

удаление непршитои ДНК (в градиенте СгС!)

I

удаление непрмшитых белков (фенольный метод)

I

двумерный гель-электрофорез

1-направление: разделение ДНК-белковых комплексов II-направление:, разделение ДНК после

гидролиза белков проназой

электроперенос на мембрану I

гибридизация с радиоактивно меченными пробами специфических участков ДНК

I

сканирование радиоавтографов

Рис.1. Общая схема метода гибридизации с "белковыми тенями".

анализировать наличие и характер ДНК-белковых взаимодействий даже в очень жестких условиях. Общая схема метода гибридизации с "белковыми тенями" приведена на рис.1.

Для анализа образующейся сложной смеси ДНК-белковых комплексов был использован метод разделения в системе "диагонального" двумерного гель-электрофореза. Пришивка белков к ДНК уменьшает ее подвижность в геле при электрофорезе в первом направлении пропорционально молекулярной массе белка. После гидролиза белков проназой и электрофоретического разделения во втором направлении фрагменты ДНК, ранее связанные с различными белками, распределяются между отдельными диагоналями. Эти

диагонали не содержат белков, однако каждая из них является отражением ("белковой тенью") размера белка, ранее связанного с ДНК. Далее ДНК иммобилизуется на фильтрах и последовательно гибридиэуется с клонированными, радиоактивно меченными фрагментами ДНК специфических участков генома. Гибридизация позволяет из * большого разнообразия ДНК-белковых комплексов выбрать только те комплексы, которые относятся к данному участку генома, что сильно упрощает интерпретацию полученных данных. Относительная интенсивность гибридизации ДНК в отдельных диагоналях, соответствующих различным пришитым белкам (по сравнению с маркерной ДНК), будет отражать степень пришивки белков для каждой индивидуальной последовательности ДНК. Такой подход позволяет качественно и количественно оценить наличие различных контактов белков с ДНК в интересующих специфических участках генома, не прибегая к предварительному изолированию хроматина из ядра'.

1.2. Ковалентная фиксация ДНК-белковых контактов.

В основу метода была положена химическая фиксация ДНК-белковых контактов на изолированных ядрах или даже клетках. Использование сшивающих агентов нулевой длины позволяет утверждать, что образующиеся ДНК-белковые комплексы являются следствием непосредственного контакта белков с ДНК ln vivo. Для пришивки можно использовать химические сшивающие агенты, хорошо проникающие в клетку, или модифицировать уже имеющиеся во взаимодействующих молекулах химические группировки таким образом, чтобы они перешли в реакционноспособное состояние. При этом к условиям реакции предъявляются определенные требования: нейтральные значения рН, физиологическая ионная сила, минимальное повреждение биомолекул, приводящих к возмущению пространственной организации нуклеопротеидного комплекса, отсутствие специфического взаимодействия с определенными последовательностями ДНК.

В большинстве экспериментов данной диссертационной работы, где использовалась гибридизация с "белковыми тенями", применялся метод ковалентной сшивки белков с ДНК с помощью диметилсульфата. Химическая природа этой пришивки состоит в образовании альдиминной связи между e-аминогруппами лизинов, N-концевыми а-аминогруппами, а также имидазольными группами гистидинов и альдегидными группами

Рис.2. Схема пришивки с помощью диметилсульфата.

в частично апуринизованной ДНК, которые образуются после предварительного метилирования пуриновых оснований

диметилсульфатом. Этот метод был разработан в лаборатории молекулярной организации хромосом (Levlna et al. , 1981, Ebralldse et al., 1986) (рис.2 ).

Пришивка происходит в местах ионных взаимодействий положительно заряженных аминогрупп и ммидаэольных групп белка с фосфатами ДНК. При проведении экспериментов использовался достаточно низкий уровень сшивки белков с ДНК (5-10 % от суммарного колическтва белка). Условия были подобраны таким образом, что I метилъная группировка вводилась на 200-300 пар основании ДНК. Апуринизация метилированной ДНК (обычно при 37°С) в используемых временных условиях не превышала 20% от всех метилированных оснований. Такие условия пришивки (низкий уровень метилирования-апуринизации) мотивировались минимизацией влияния локальных структурных нарушений на всю структуру в целом. Во всех случаях использования этого метода пришивки проводили стабилизацию сшивки восстановлением с помощью или борогидрида натрия, или цианборогидрида натрия. В первом случае процесс сопровождается расщеплением ДНК в месте пришивки и связыванием только 5'-концевого фрагмента ДНК с молекулой белка, а также существенной Фрагментацией ДНК по апуриновым участкам, не участвующим в пришивке. И фрагментирование, и пришивка происходят статистически по всей длине ДНК по адениловым и гуаниловым остаткам., апуринизованным примерно в равной степени, поэтому зависимость от содержания АТ-пар ДНК мала. Пришивка протекает в мягких условиях при рН, близких к нейтральным, и, как показано на примере хроматина (SMck et al., 1980) и комплекса РНК-полимеразы с ДНК (Chenchick et al., 1931), мало влияет на структуру нуклеопротеидов. Ранее обнаруженные вариации в степени метилирования отдельных тринуклеотидных последовательностей ДНК (Gilbert et al., 19761 могут влиять на пришивку к ним белков. Однако на длинной ДНК такие вариации должны выравниваться. Поэтому мы считаем, что изменения в структуре ДНК, а также в конформационном состоянии различных, достаточно протяженных участков хроматина не должны оказывать большого влияния на степень пришивки гистонов. Следует также учитывать, что различия в последовательности ДНК исключаются при сравнении пришивки белков к одним и тем же участкам ДНК генов, находящихся в активном и

неактивном состоянии.

Как уже отмечалось ранее, все процедуры пришивки протекают в достаточно мягких условиях, кроме того, достоинством этого метода является относительно высокий выход и стабильность сшивки. К недостаткам следует отнести длительность процедуры пришивки, что увеличивает вероятность артефактных перераспределений и перестроек в структуре хроматина. Чтобы избежать этого нежелательного эффекта, в ряде экспериментов ядра предварительно фиксировали формальдегидом, при этом структура хроматина "завораживалась" за короткий промежуток времени 1Начева и др., 1989). Известно, что пришивка формальдегидом имеет "нулевую длину", т.е. к ДНК пришиваются только те белки, которые в момент реакции непосредственно взаимодействуют с ней (Бо1оиоп еХ. а1., 1985). Кроме того, формальдегидная фиксация не приводит к нарушению структуры хроматина. Показано, что при такой фиксации не меняется размер нуклеосомной ДНК и сохраняется нуклеосомный повтор (Мельникова и др., 1980).

На стадии пришивки белков к ДНК в общем методе гибридизации с "белковыми тенями" заложены большие возможности, поскольку каждый метод сшивки фиксирует определенные контакты белков с ДНК. Комбинирование различных методов сшивки оказалось удобным инструментом для изучения структурных изменений в составе хроматина. Если известно, какие аминокислотные остатки пришиваются к ДНК, то, анализируя изменения контактов при определенных структурных переходах хроматина, например, при транскрипции, можно составить представление о характере этих конформационных переходов.Такого рода исследования были проведены совместно с Эбралидзе К.К. и Гушиным Д.Ю., когда было установлено, что гистоны в составе активнотранскрибируемого хроматина теряют контакты с ДНК через их глобулярную часть (пришивка через гистидины) и сохраняют связь с ДНК за счет лизинов М-концевой части гистонов (Мас!^а еХ а1., 1969).

Перспективными являются работы по пришивке белков к ДНК с помошыо ультрафиолетового облучения. Этот метод имеет целый ряд преимуществ перед остальными способами пришивки. Процедура крайне проста, быстра и может быть завершена в течение нескольких минут. Кроме того, пришивку в этом случае можно проводить на интактных клетках. Отметим здесь также еще одно преимущество данного метода пришивки. Дело в том, что при использовании других известных нам

методов пришивки основными пришивающимися . бедками являются гистоны. Составляя большую часть от суммарного белка, они в значительной мере маскируют пришивку негистоновых белков. Этот недостаток в значительной мере отсутствует в случае ультрафиолетовой пришивки. Использование именно этого метода позволило нам обнаружить пришивку ряда негистоновых белков в регуляторннх областях генов белков теплового шока и рибосомальных генов (Беликов и др., в печати).

1.3. Выделение и очистка ДНК-белковых комплексов.

Выделение ДНК-белковых комЛлексов является важным этапом экспериментальной процедуры. Удаление из образца непришитых белков и ДНК существенно увеличивает чувствительность метода. Кроме того, в процессе очистки удаляются цитоплаэматические компоненты, которые приводят к агрегации материала. На первом этапе центрифугированием в градиенте хлористого цезия удаляются непришитые белки, липиды, гликопротеиды и т.д. Для удаления непришитой ДНК используется экстракция сшитого комплекса смесью фенол-хлороформ. Этот метод основывается на том факте, что белки и ДНК-белковые комплексы перераспределяются в органическую фазу и интерфазу, в то время как "свободная" ДНК остается в водной фазе во время экстракции. Все эти методы были разработаны в лаборатории молекулярной организации хромосом, и автор диссертации принимал в них активное участие.

1.4. Идрнтификация ДНК-белковых комплексов с помощью "диагонального" двумерного гель-электрофореза.

ДНК, пришитая к различным белкам, может быть разделена, а затем идентифицирована с помощью двумерного гель-электрофореза (БМск вЬ а1., 1980). Обшая схема этого метода приведена на рис.3. ДНК-белковые комплексы разделяются в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (в присутствии мочевины и ДДС-Ка). При этом ДНК-белковый комплекс мигрирует в геле первого направления в соответствии с размерами как ДНК, так и белкового компонента. Электрофоретическая подвижность молекул ДНК будет уменьшаться за

ГИСТОН Н1 -КОР-ГИСТОНЫ НЕПРИДШТАЯ ДНК

о— —

о-

-111Р т

ПРОНАЗА

М 12 3

Рис.3. Схема двумерного диагонального электрофореза сшитых ДНК-гистоновых комплексов. Гистоны ковалентно связываются с частично метилированной и апуринизированной ДНК.. Этот процесс сопровождается расщеплением ДНК по месту пришивки и по апуриновым участкам, не взаимодействующим с гистонами. В первом направлении (направления электрофореза обозначены стрелками) в денатурирующих условиях разделяются фрагменты свободной ДНК и ДНК, связанной с гистонами, которые уменьшают ее электрофоретическую подвижность. Затем гистоны гидролиэуются прямо в геле проназой и проводится электрофорез во втором направлении свободной от белков ДНК. Рядом находится дорожка с маркерной ДНК (М). Фрагменты свободной ДНК, которые в обоих направлениях двигаются в соответствии с их размерами, занимают положение на одной диагонали 3. Фрагменты ДНК, которые в первом направлении были связаны с кор-гистонами,

после второго направления образуют дополнительную диагональ 2. Фрагменты ДНК, связанные с молекулами гистона Н1, который еще сильнее уменьшает электрофоретическую подвижность ДНК в первом направлении за счет большей молекулярной массы, дают диагональ 3.

счет пришитого к ней белка. При этом степень уменьшения электрофоретической подвижности будет зависеть от молекулярного веса пришитого полипептила. Затем белки гидролиэовали непосредственно в геле с помощью пронаэы, а освободившуюся ДНК электрофоретически разделяли во втором направлении в соответствии с размером этой ДНК. В результате суммарная сложная смесь ДНК-белковых комплексов распределяется в геле второго направления в виде серии диагоналей, каждая из которых представлена фрагментами ДНК, ранее пришитыми к белку определенного молекулярного веса. Фрагменты ДНК, ранее не пришитые к каким-либо белкам ("свободная ДНК"), соответствуют диагонали, имеющей максимальную электрофоретическую подвижность. Каждая последующая диагональ соответствует белку с определенным молекулярным весом,и ее положение определяется размером белка, замедляющим электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК в первом направлении. Диагонали не содержат белок, однако их положение в геле является "тенью" ранее пришитого к ней белка, что дало название этому методу - гибридизация с "белковыми тенями". Положение диагоналей, а следовательно, и молекулярный вес пришитых белков, можно прокалибровать.пришивая белки с известной молекулярной массой. Отметим здесь также, что лучшее разделение отдельных диагоналей достигается для коротких фрагментов ДНК. В зависимости от метода пришивки ДНК фрагментируется разными способами. Так, например, в случае пришивки с помощью диметилсульфата (пришивка через гистидины) фрагментация происходит параллельно пришивке. В других случаях, например, с помощью ультрафиолетового облучения, фрагментация ДНК достигается обработкой ДНКазой I или рестриктазами (Беликов и др., 1989). По.сле электрофореза ДНК в геле окрашивается бромистым этидием,или переносится на нейлоновую мембрану для гибридизации с клонированными радиоактивно меченными фрагментами ДНК.

1.5. Гибридизация с "белковыми тенями".

Одним из существенных преимуществ метода гибридизации с "белковыми тенями", как уже отмечалось ранее, является возможность прямого сравнения качественного и количественного состава белковых контактов для разных специфических

последовательностей ДНК. в одном' эксперименте и в идентичных условиях. Для этой цели ДНК иэ геля переносится на фильтры, где она иммобилизуется. После этого на одной и той же реплике можно проводить последовательно серию гибридизаций с радиоактивно меченными клонированными последовательностями ДНК, соответствующими определенным генам или частям генов. Таким образом, не прибегая к предварительному изолированию хроматина, соответствующего данной последовательности ДНК, иэ большого разнообразия ДНК-белковых контактов мы избирательно анализируем только те, которые характерны для данного участка генома, что значительно упрощает интерпретацию результатов. Степень пришивки белков будет пропорциональна количеству этих белков на анализируемой последовательности ДНК. Для количественной оценки эффективности пришивки на второе направление геля наносится маркерная ДНК, которая является аликвотой нефракционированнои

депротеинизированной и дробленой ДНК из того же самого препарата сшитого комплекса. Выбор данного внутреннего стандарта гарантирует отсутствие возможного недопредставительства конкретной последовательности ДНК после процедуры очистки пришитого комплекса. Оценка эффективности пришивки с различными последовательностями ДНК проводится сравнением интенсивности гибридизации отдельных диагоналей по отношению к маркерной ДНК для одной и той же реплики после последовательной гибридизации с различными генами. Количественно это выражается в интенсивности засветки рентгеновской пленки, определяемой одномерным денситометрическим сканированием авторадиограмм реплик после последовательной гибридизации с различными пробами. Эффективность пришивки (Е) можно выразить в следующем виде:

Е = (А ,/ А , )/(А „/А „ ) х 100 %,

р , а , е1 р , е2 я , в2

где А - степень гибридизации диагонали (как величина

поглощения, соответствующая плошади пика после денситометрического сканирования I р - пришитый белок

проба 1 в2- проба 2 I - маркерная ДНК

Fi качестве гибридизационных проб, меченных ради^ктивным фосфором были использованы фрагменты ДНК генов,

клонированные в векторе на основе фага Ml 3. Мечение ДНК методом застройки второй цепи фага Ml 3, гибридизация и отмывка фильтров проводилась в соответствии с методом, описанным Чарчем и Гилбертом \ (Church and Gilbert, 1904). Это оказалось очень удобным для получения рнсокомеченных проб. При атом эффективность гибридизации повышалась до 1 и раз, при очень низком фоне, что существенно для гибридизации с короткими участками генома, представленными одной копией. Кроме того, в ряде случаев сравнивалась эффективность пришивки белков по разным цепям, что возможно только при использовании этого метода.

2. СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ Е ХРОМАТИНЕ ГЕНОВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

ПРИ ТРАНСКРИПЦИИ.

2.1. Гены белков теплового шока дрозофилы

Гены белков теплового шока представляют собой удобную систему для изучения структурных изменений, происходящих в хроматине при транскрипции. При повышении температуры с 25°С до 37°С в эмбрионах дрозофилы, в выделенных тканях, в культуре клеток происходит ингибирование транскрипции большинства генов и быстрая активация нескольких новых генов, кодирующих белки теплового шока. К таким же изменениям могут приводить не только повышение температуры, но и другие неблагоприятные воздействия, например, анаэробные условия, присутствие ионов тяжелых металлов, респираторных ядов и др. (Ashbumer arid Bonner, 1979).

Белки теплового шока найдены не только у дрозофилы, функциональная роль их в клетке до конца не выяснена. Было показано, что некоторые иэ белков теплового шока появляются в организме дрозофилы на определенных стадиях развития при нормальных условиях (Zimmerman et al., 1933), однако, механизм регуляции при этом отличается от индуцированного тепловым шоком синхронного включения этих генов.

У дрозофилы при тепловом шоке образуется семь различных белков с молекулярными весами 22000, 23000, 26000, 27000, 68000, 70000 и 84000. В нашей работе мы исследовали структуру хроматина

генов, продуцирующих белки теплового шока с молекулярными весами 70000 (бтш-70) И 22000 (бтш-22).

Ген бтш-70 представлен в гаплоидном геноме пятью копиями, две из них расположены в локусе 87А и имеют противоположную ориентацию, остальные три - в локусе S7C и ориентированы в одну сторону (Holmgren et al., 1979; Ish-Horowltcs et al., 1979). Уникальный ген бтш-22 находится в локусе 67Е, где вместе с ним расположены также гены белков теплового шока с молекулярными весами 23000, 26000, 28000 (Corees et al., 1980). На рис.-4,8 показаны участки гена бтш-70 из локуса 87А которые были использованы в нашей работе:

Участок А (5'-конец гена бтш-70) присутствует только в генах локуса 87А. Он располагается на расстоянии 16 п.н. от места начала транскрипции внутри участка, гиперчувствительного к ДНКазе I, и содержит регуляторные последовательности. Длина ДНК этого участка гена состовляет 177 п.н.

Участок Б содержит структурную часть гена бтш-70 длиной в 900 п.н. Эта область гомологична для всех пяти генов бтш-70.

Участок В находится за пределами транскрибируемой области. Он имеет длину около 500 п.н., уникален - содержится только в одном гене локуса 87А.

Участок Г удален от 3'-конца кодирующей области гена бтш-70 приблизительно на 1.5 т.п.н., имнет длину около 1500 п.н. и содержится только в одном гене локуса 07А.

Рис.4. Рестриктная карта плазмиды 122 (Goldschmldt-Clermont, 1980), содержащей два гена бтш-70 в локусе 87А7. Последовательности .комплементарные мРНК. гена бтш-70, и направление транскрипции указаны стрелками. Кодирующая область и 5'-концевой участок генов отмечены черными и белыми прямоугольниками, соответственно. Обозначения рестриктаз на рисунке: Ват для Barn HI; RI для Eco RI; Sal для Sal I; Xho для Xho I.

Структурная -Область гена переклонированл нами в рЕЙ 322 по плаэмиды 86.4 (Согсес е! а1. , структурной части гена и около последовательности.

бтш-^2 I субклон А) была с антам Para HI и H1nd III из 1980). Сюда входят 525 п.н. 300 п.н. из 3' прилегающей

2.2. Структурные изменения хроматина при транскрипции кодирующей области генов белков теплового шока.

Целью -них экспериментов являлось обнаружение возможных изменений ви валимодействии гистонов с ДНК гена Стш-70 после его активации. Или подход состоял и комбинировании двух методов пришивки г и'П ¡нов к ДНК и метода гибридизации с "белковыми тенями". Метод пришивки преимущественно через гистидины (условно "гистилмповыи" метод) (М1глаЬекоу е! а1., 1978; ЕЬгаПйве ег а1., 1988) включает следующие стадии: незначительное метилирование пуринов ДНК в составе ядер, апуринизацию метилированных основании в мягких условиях, формирование сшивки между апуринизированной дезоксирибозом и функциональными группами гистонов и последующую стабилизацию сшивки восстановлением ее с помощью борогидрила натрия. Метод пришивки преимущественно через лизины (условно "лизиновыи" метод) отличается от предыдущего тем, что последние две стадии проводятся одновременно с помощью цианоборогидрида натрия кчк постанавливающего агента. Отметим здесь сразу же, что в с луча»' "г■ и • • т идинового" метопа пришивки ковалентная связь гистонов с: ДНК происходит через центральную гидрофобную часть, поскольку иктидины отсутствуют в Ы- и С-терминальной части гистонов. Ь случае "лизинового" метода пришивки вероятность пришивки гигтонов вдоль их длины будет зависеть от распределения этих лизинив, а последние преимущественно локализуются в И-терминальнои ( кор. гистоны) или в С-терминальной (гистон Ш ) области гистоновых молекул.

Результаты пришивки гистонов к ДНК "гистидиновым" методом в составе ядер, выделенных из культуры клеток дрозофилы (линия Кс), подвергнутых тепловому шоку, когда происходит активация генов бтш-70, и контрольных клеток, когда гены неактивны, приведены на рис.5. После гибридизации ДНК диагоналей с пробой, соответствующей нетранскрибируемой рибосомальной вставке II типа (уровень

ТИСТИДИНОВЫИ" МЕТОД

'ЛИЗИНОВЫИ" МЕТОД

ПРОБЫ

ПРОМОТОР

АКТИВНЫ!! ХРОМАТИН

НЕАКТИВНЫЙ ХРОМАТИН

1 2 3

Рис.5. Двумерный электрофорез сшитых ДНК-белковых комплексов, выделенных из культуры клеток дрозофилы после теплового шока. Показана последовательная гибридизация с пробами, соответствующими промоторноя области гена бтш-70 (а, й), кодирующей области гена бтш-70 (Ъ, е) и нетранскрибируемой вставке II типа рибосомальных генов (с, Г). Пришивка на ядрах проводилась или "гистидиновым" методом (I), или "лиэиновым" методом (II). Диагонали соответствуют непришитой ДНК (1), пришивке коровых гистонов (2) и пришивке гистона Н1 (3). Вертикальная линия 4 соответствует маркерной ДНК. Цифры на блоте (с1) указывают размер одноцепочечной ДНК. Количественную оценку уровня пришивки гистонов к ДНК см. Таблицу 1.

транскрипции весьма низкий и число транскриптов не превышает 1-2 копии на клетку (Jamricti and Miller, 1934)), наряду с диагональю непришитой ДНК (диагональ 1), обнаруживается пришивка как коровых гистонов (диагональ 2), так и гистона HI (диагональ 3) (рис.5,с). Степень пришивки гистонов в таком неактивном хроматине принималась нами за 1002. Гибридизация с пробой, соответствующей сателлитной ДНК, обнаруживала такой же набор диагоналей ДНК со схожей относительной интенсивностью, но при этом возрастал общий фон за счет быстрой ренатурации ДНК в геле второго направления высокоповторяющихся последовательностей сателлитной ДНК (данные не приведены). В случае неактивных генов бтш-70 контрольных клеток гибридиэацей с пробой, соответствующей кодирующей части этих генов, также обнаруживается схожий набор диагоналей ДНК с относительной интенсивностью близкой к той, которая соответствует трем диагоналям после гибридизации с пробой неактивного хроматина (данные не приведены). На основании было этого сделано заключение, что используемая нами процедура позволяет прямо сравнивать уровень пришивки гистонов к ДНК в различных участках генома в одном и том же эксперименте, поскольку этот уровень не зависит от индивидуальной последовательности ДНК, а определяется только структурой хроматина. Когда же была проведена гибридизация сшитого материала из клеток, подвергнутых тепловому шоку, с пробой.соответствующей кодирующей области гена бтш-70, то степень "гистидиновой" пришивки значительно уменьшалась: до 10-40% от уровня пришивки в неактивном хроматине (рис.5,Ь; Табл.1).

В этих экспериментах процедура пришивки проводилась как с предварительной фиксацией формальдегидом, так и без префиксации. Качественно результаты не отличались, хотя количественно уровень "гистидиновых" пришивок, особенно для коровых гистонов, был несколько ниже в случае отсутствия префиксации, что можно объяснить или небольшой потерей гистонов в нефиксированных образцах, или тем, что формальдегидная фиксация предотвращает развитие процесса потери гистидиновых контактов в ответ на активацию транскрипции.

Для разделения различных фракций коровых гистонов в первом направлении двумерного гель-электрофореза была использована повышенная концентрация полиакриламидного геля. Результаты такого электрофоретического разделения с повышенной разрешающей способностью приведены на рис.6.

Таблица 1. Относительный уровень сшивок гистонов с ДНК транскрибируемых генов бтш-70 Б.гаеХагк^аБгег сравнительно с транскрипционно-неактивным хроматином.

Денситометрическое сканирование "белковых теней"

гибридизационные зонды Относительный выход сшивок *

"гистидиновые" сшивки "лиэиновые" сшивки

кор-гистоны гистон Н1 кор-гистоны гистон Н1

промоторная зона 5-10 < 5 5-10 < 5

бтш70

структурная зона 25 - 40 20 - 35 > 95 > 95

генов бтш70

Определялся как отношение выхода сшивок в зондируемой области к выходу сшивок в области рибосомальных генов со вставками второго типа, по результатам денситометрического сканирования авторадиограмм "гистоновых теней" после гибридизации с соответствующими зондами (см. текст). Уровень сшивок гистонов с ДНК неактивных рибосомальных генов принимался за 100%. Сопоставление данных сканирования обеспечивалось нормировкой по внутреннему стандарту - отмеренному количеству нефракционированной депротеиниэованной ДНК из сшитых ядер, которую наносили на гель второго направления.

После гибридизации с пробами, соответствующими активному и неактивному хроматину, было обнаружено различие в Эффективности пришивки через гистидины различных фракций гистонов в составе хроматина кодирующей области гена бтш-70. Пришивка падает особенно заметно для гистона Н1 (приблизительно в 10 раз), менее заметно для гистонов НЗ и Н4 (примерно в 3 раза) и в промежуточной степени для гистонов Н2А и Н2В (примерно в 5-6 раз) по сравнению с пришивкой этих же гистонов в составе неактивного хроматина.

Пришивка гистонов через лизины не обнаруживает заметного падения степени пришивки как коровых гистонов, так и гистона Н1 в составе активнотранскрибируемого хроматина кодирующей области гена бтш-70 по сравнению с неактивным хроматином нетранскрибируемой вставки II типа рибосомальных генов (рис.5). Степень пришивки гистонов "лиэиновым" методом в составе хроматина гена бтш-70

Рис.6. Двумерный электрофорез высокого разрешения сшитых ДНК-белковых комплексов, выделенных из культуры клеток дрозофилы после теплового шока.

(А,В) Последовательная гибридизация блота с пробами, соответствующими кодирующей области гена бтш-70 (А) и нетранскрибируемой вставке II типа рибосомальных генов (В). Отмечено положение разделенных диагоналей, соответствующих пришивке гистоноа Н1 , НЗ, Н2А+Н2В и Н4.

(С) Образец денситометрического сканирования авторадиографии блота после гибридизации с кодирующей областью гена бтш-70 (пунктирная линия) и нетранскрибируемой вставкой (непрерывная линия). Сканирование проводилось в горизонтальном направлении с помощью сканера иКгоЗсап XI. фирмы 1.КВ. АЪй - поглощение при 600 н.м. Отмечено положение пиков, соответствующих различным диагоналям. Кроме того, отмечено положение маркерной ДНК (Н), непришитой ДНК (Б) и фона, происходящего из точки нанесения в первом направлении (3). Картины двух сканирований были перерисованы и наложены друг на друга.

контрольных клеток качественно и количественно идентична таковой в составе неактивного хроматина (данные не приведены), что не удивительно, поскольку даже в случае "гистидиновой" пришивки, которая является тестом на структурные перестройки в составе транскрибируемого хроматина, не наблюдается различий в степени пришивки гистонов в составе хроматина неактивных генов бтш-70 и нетранскрибируемой вставки II типа рибосомальных генов. Отметим здесь также, что выбор пробы нетранскрибируемой вставки как образца неактивного хроматина объясняется не только отсутствием транскрипции на этих последовательностях. Другая причина заключается в том, что необходимо всегда вводить стандартную последовательность, относигельно которой можно сравнивать эффективность пришивки белков в различных экспериментах. Сравнение будет наиболее надежным, если последовательная гибридизация ДНК "белковых теней" с различными пробами проводится на одном и том же фильтре. Очевидно, что сравнение эффективности пришивки гистонов активных и неактивных генов бтш-70 невозможно проводить на одном и том же пришитом материале и на одной и той же реплике, т.е. неактивные гены бтш-70 не могут быть контролем индуцированных генов бтш-70.

Рис.7. Двумерный электрофорез сшитых комплексов из культуры клеток после теплового шока. Показана последовательная гибридизация с ДНК блотов проб, соответствующих структурной области гена бтш-22 (А) и нетранскрибируемой вставки II типа рибосомальных генов (Б). Отмечены диагонали, соответствующие пришивке к ДНК кор-гистонов (2), гистона Н! (3), а также непришитая ДНК (1).

НбР22 _

1

1 2 3

Данные об удалении глобулярной части гиетонов при транскрипции, фиксируемые нами как ослабление пришивки гиетонов к ДНК через гистидины, были получены также на примере однокопииного гена бтш-22. кодирующего белок с молекулярным весом 22000 и активирующегося при тепловом шоке (Преображенская и др.I (рис. 7).

Основным выводом из приведенных выше экспериментальных данных является то, что гистоны остаются связанными с ДНК кодирующей области акливнотранскрибируемых генов и при этом не препятствуют продвижению молекул FHK-полимераз вдоль ДНК. Однако, набор ДНК-гистоновых контактов в составе такого хроматина изменяется, т.е. происходят конформационные переходы в структуре хроматина, адаптированные к беспрепятственному считыванию информации с ДНК молекулами РНК-полимеразы. Эти результаты могут быть объяснены следующим образом.

Когда гистоны в составе ядер или целых фиксированных клеток пришиваются к ДНК через лизины, выход пришитых гиетонов на единицу массы ДНК. приблизительно одинаков как в транскрибируемом, так и в нетранскрибируемом хроматине, т.е. активный хроматин сохраняет полный набор гиетонов. Поскольку "лиэиновнй" метод пришивки является пришивкой нулевой длины, то из этого следует, что по крайней мере часть, лиэиновнх аминокислотных остатков гистоновых молекул находится в непосредственной близости от ДНК и способна образовывать ко валентную связь с ДНК.

Однако, когда анализ ДНК-гистоновых контактов проводится с помощью "гистидинового" метода пришивки, то степень пришивки гиетонов с ДНК кодирующей области активнотранекрибируемого гена бтш-70 значительно падает. При этом активация гена в большей степени сказывается на степени пришивки гиетонов Н2А, Н2В и, в особенности, гистона HI. Эти гистоны локализованы на концах нуклесомнои ДНК (Varshavsky et al., 1976; Shick et al., 1980; Belyavsky et al., 19801 и должны быть первыми подвергнуты воздействию молекул РНК-полимеразы, входящей на нуклеосому. Роль гистона HI в разворачивании нуклеосомрой фибриллы хорошо установлена (Thoma et al., 1979). Что касается гистонового димера Н2А-Н2В, то било показано, что он удаляется из нуклеосомы при связывании ее с РНК-полимеразой (Baer and Rhodes, 1983). Не удивительно поэтому, что в основе структурных изменений транскрибирующегося хроматина лежит ослабление связывания гиетонов с ДНК в следующем порядке: HI Н2А-Н2В > НЗ-Н4. Отдаление

глобулярного домена гистонов от ДНК, по-видимому, является обратимым процессом; схожесть в поведении гистонов НЗ и Н4 или Н2А и Н2В предполагает также, что пространственные перемещения (отдаление и приближение) гистонов могут происходить координированно для димера (Н2А-Н2В) и тетрамера (Н3-Н4)2 (Elcktjush and Moudrlanakls, 1978). Это можно также обозначить как смещение гистонового димера Н2А-Н2В от идеально симметричного положения в нуклеосомном кристалле (Richmond et al., 1984).

В настоящее время мы не можем локализовать положение всех пептидных сайтов гистонов, связанных с транскрибируемой ДНК. Эксперименты по ограниченному протеолизу, проведенные в группе К.К.Эбралидзе подтверждают, что гистидиновые сшивки с ДНК локализуются в центральном районе гистоновых молекул в то время, как лизиновые сшивки вовлекают как центральные районы (приблизительно две трети от всех сшивок через лизины), так и концевые области гистонов (приблизительно одна треть) (Nacheva et al., 1989). Очевидно, что ряд контактов с ДНК, локализованных в центральной части гистоновых молекул, теряется при активации хроматина, но при этом гистоны сохраняют связь с ДНК через некоторые другие участки. Действительно, во фракциях хроматина, обогащенных активнотранскрибируемыми последовательностями, набор пептидов, пришивающихся к ДНК,. отличается от того, что обнаруживается для неактивного хроматина. Это предполагает значительные изменения в характере взаимодействия гистонов с ДНК (Nacheva et al., 1989 ).

Взаимодействия гистонов с ДНК в составе неактивного хроматина через гистидины играют важную роль в упаковке нуклеосомноп ДНК и нуклеосомной фибриллы, как это было показано на примере картирования сайтов взаимодействия гистонов. Н4 и Н5 с ДНК (Ebralidse et al., 1980; Pruss et al., 1988). Мы полагаем, что это может быть экстраполировано и на роль других гистонов в упаковке ДНК. Поскольку именно эти взаимодействия ослабляются или вообще полностью разрушаются при активации транскрипции, то из этого следует, что нуклеосомы и наднуклеосомные структуры могут быть ослаблены и это приводит к разворачиванию транскрипционно активного хроматина. Происходит конформационный переход, и облегчается прохождение молекул РНК-полимеразы вдоль ДНК. Такое разворачивание нуклеосом и 30 нм фибриллы должно приводить к экспозиции сульфогидрильных групп, гистона НЗ в нуклеосомах, что и

наблюдалось в ряде работ (Prior et al. , 19ЯЗ; Chen and Allfrey, 1987). Предпочтительное взаимодействии N-концевых районов молекул гистонов с ДНК должно приводить к образованию необычных структур, наблюдаемых в электронный микроскоп, таких, как полунуклеосомы (Prior et al., 1983I или, как нити ДНК равномерно покрытые белками (Moyrie et al., 1982). В том случае, когда гибкие "хвосты" гистонов замешают относительно жесткие и прочные контакты глобулярной порции гистонов с ДНК, молекулы РНК-полимеразы могут свободно продвигаться через нуклеосомы, последовательно вытесняя эти гистоновые "хвосты". При этом в пространственном удалении гистонов с ДНК нет необходимости. Это напоминает последовательное удаление "цинковых пальцев" фактора TFIIIA при транскрипции (Miller et al., 1985; К lug and Rhodes, 1967).

2.3. Особенности нуклеопротеидной организации промоторной области

гена бтш-70.

5'-концевой участок гена бтш-70, который содержит регуляторные последовательности (Mlrault et al., 1982; Pelham, 1982) и возможно является входными воротами для молекул РНК-полимеразы, обнаруживает повышенную чувствительность к нуклеазам <Wu. 1980). Ряд данных указывает на отсутствие нуклеосом в этом районе г^на Otic-70 (Udvurdy and Schedl, 1984). Аналогичные результаты Сиг, и получены в случае активного fl-глобинового гена цыплят, на котором было показано, что промоторная область этого гена доступна к действию рестриктаз и гидролизуется ими с такой же скоростью, пак и свободная ДНК I McGhee et al., 1981). По-видимому, отсутствие гистонов в регуляторных областях является необходимым условием активации генов.

Независимо от метода пришивки после гибридизации с пробой, соответствующей промоторной области гена бтш-70, не удается обнаружить пришивки гистонов (менее 10% от уровня пришивки в неактивном хроматине) (рис.5, Табл.1). Некоторое количество пришитых гистонов на приведенных радиоавтографиях наблюдается для Фрагментов ДНК, размер которых превышает 300 нуклеотидов. В состав этих фрагментов входят соседние участки, контактирующие с гистонами. Таким образом, размер промоторной области, свободной от гистонов, можно оценить приблизительно в 200 пар оснований.

Причиной отсутствия гистонов в этом районе может служить измененная конформаиия ДНК, препятствующая образованию нуклеосом. Такие отклонения в структуре ДНК обнаруживаются в промоторной области гена бтш-70 по появлению гиперчувствительных к нуклеаэе 51 участков в районе коротких прямых повторов, которые могут образовывать петлеобразные структуры (Mace et al., 1983). С другой стороны, препятствовать посадке нуклеосом на этом участоке могут регуляторные белки, наличие которых было показано в работе Ву (Víu, 1984). По нашим данным с использованием индуцируемой ультрафиолетом пришивки в регуляторных последовательностях активированного гена бтш-70 обнаружены два негистоновых белка с молекулярными массами около 50 кД (р50) и 100 кД (рЮО), причем белок рЮО предпочтительно связывается с кодирующей цепью ДНК в то время, как р50 - с комплементарной цепью (Беликов и др., в печати). Такого рода подходы для изучения структуры транскрипционного комплекса являются весьма перспективными и могут быть широко использованы в будущем.

2.4. Структурные изменения хроматина в домене гена бтш-70 при

транскрипции.

Метод гибридизации с "белковыми тенями" позволяет сравнить структурные особенности конформационного перехода активированного хроматина для каждого участка домена гена бтш-70. Для этого достаточно последовательно прогибридиэовать одну и ту же реплику двумерного гель-электрофореза с ДНК из различных участков этого домена и сопоставить качественно и количественно наличие ДНК-белковых контактов.

На рис.8, 9 представлены результаты сравнительного анализа степени пришивки гистонов к ДНК в различных участках хроматина домена гена бтш-70 дрозофилы по "гистидиновому" или "лизиновому" протоколу пришивки с предварительной фиксацией ядер формальдегидом. (Начева и др., 1989). Ядра были выделены из культуры клеток К^, , подвергнутых тепловому шоку. При этом происходит активация и интенсивная транскрипция гена бтш-70. После гибридизации с пробой, представленной нетранскрибируемой вставкой II типа, обнаруживается пришивка как коровых гистонов, так и гистона Н1, степень пришивки которых принимается нами за 100%. Гибридизация с пробой Б, представляющей кодирующую область гена

бтш-70, указывает ма то, что степень пришивки гистонов через гистидины -заметно падает как для коровых гистонов, так и для гистона Н1 , вплоть до 20-40% от уровня пришивки гистонов в неактивном хроматине (см. рис.8, табл.2). Пришивка через лизинн не обнаруживает заметных различии в степени пришивки гистонов в * кодирующей области гена бтш-70 по сравнению с неактивным хроматином. Уменьшение степени пришивки гистонов через гистидины обнаруживается также и при гибридизации с пробой Г (до 30-40%), пробои В (до 15-25%) и пробой А (до 5-10% по отношению к неактивному хроматину) (см. рис.8, табл.2). Степень пришивки гистонов через лизины практически не отличалась от таковой в неактивном хроматине в районе домена гена бтш-70, соответствующего пробе Г (рис:.9, табл.2). Однако она значительно уменьшалась для районов, соответствующих промотору (проба А) и участку домена, удаленному на 1 т.п.н. от З'-конца кодирующей области гена бтш-70 (проба В), и составляла, соответственно, 5-10 и 15-25% от степени пришивки в неактивном хроматине. Таким образом, уменьшение степени пришивки гистонов в промоторной области и районе, соответствующем пробе В, наблюдается независимо от метода пришивки.

Комбинирование методов сшивки, фиксирующих различные контакты белков с ДНК, оказалось удобным инструментом для изучения структурных изменений в составе хроматина активнотранскрибируемых генов. Кок ужо было отмечено ранее, при транскрипции хроматина связь ДНК с глобулярной частью гистонов, играющей ключевую роль в компактизаиии хроматина, значительно ослабляется, что выражается в уменьшении степени пришивки гистонов к ДНК через гистидины. Таким образом, "гистидиновый" метод пришивки является хорошим тестом на конформационныи переходы в хроматине, приводящие к его декомпактизации и облегчающие продвижение молекул РНК-полимеразы. На основании полученных данных мы можем сделать вывод, что структурные перестройки в составе хроматина затрагивают не только кодирующую 'часть активированного домена, но и распространяются на прилегающие участки (по нашим данным, по крайней мере до 3 т.п.н. от сайта полиаденилирования). Нужно отметить здесь, что в случае пришивки гистонов к ДНК без предварительного фиксирования формальдегидом в области домена, соответствующей пробе Г, уменьшение степени пришивки гистонов обнаруживается только для гистона Н1 и всего в 1.5-2 раза (данные не представлены). Возможно, что при активации гена структурные изменения хроматина

Ген БТШ 70 Пробы

ХЬа

XhoJ К Sal —

Bam-

Sal —f*3,J

Bam-Xho—| Sal —

NaBHA

Rl

Неактивный хроматин

í

' s/*' I

Рис.8. Двумерный комплексов по методу 1 комплексы были выделены тепловому шоку. ДНК

электрофорез сшитых ДНК-гистоновых ("гистидиновый метод"). ДНК-белковые из клеток дрозофилы, подвергнутых после двумерного диагонального

гель-электрофореза переносили на нейлоновую метану НуЬопй N и последовательно гибридизовали с высокомеченными Р-эондами А,ь,ь и Г. Слева показана рестриктная карта гена бтш-70 из локуса

87 А.

А -промоторная зона гена.

Б -участок кодирующей области гена. Весь

обозначен черным прямоугольником, указано стрелкой.

В -ближний 3*концевой участок гена.

Г -дальний 3'концевой участок гена.

кодирующий район а направление транскрипции

Ген БТШ 70 Пробы

ХЬа^

ХЬо II К.

Ват— Ба!— 1з'-|

| Вст— | ХЬо*-I Ба1 -

I

т —

Неактивный хроматин

ЫаВН^СЫ

ЖЛ

ДНК Н2А Н1 м

Н2В НЗ Н4

Рис.9. Двумерный электрофорез сшитых ДНК-гистоновых комплексов по методу 2 ("лиэиновый метод"). Все обозначения, как и на рис.о.

Таблица 2.

Уровень пришивки гистонов для различных участков домена активнотранскрибируемого гена . бтш-70 дрозофилы сравнительно с транскрипционно-неактивным хроматином.

Денситометрическое сканирование "белковых теней".

гибридизационные зонды "гистидиновые" сшивки "лиэиновые" сшивки

коровые гистоны Н1 коровые гистоны Н1

проба А 5-10 < 5 5-10 < 5

проба Б 25 - 40 20 - 35 > 95 > 95

проба В 20 - 25 15 - 20 20 - 30 15 - 20

проба Г 30 - 40 30 - 35 > 95 > 95

Уровень пришивки гистонов к ДНК определяется, как отношение выхода сшивок в зондируемой области к выходу сшивок в области рибосомальных вставок II типа по результатам денситометрического сканирования в горизонтальном направлении (в области 200-300 п.н. ) авторадиограмм "гистоновых теней" после гибридизации с соответствующими зондами. Уровень сшивки гистонов с ДНК транскрипционно-неактивного хроматина рибосомальных вставок принимается за 100%. Сопоставление данных сканирования обеспечивалось нормировкой по внутреннему стандарту - отмеренному количеству нефракционированной депротеинизованной ДНК из сшитых ядер, которую наносили на гель второго направления.

затрагивают весь домен, однако эти изменения носят динамический характер. При снятии индукции (например, торэионного напряжения, создаваемого работающей РНК-полимераэой) происходит возвращение в исходное состояние с большей степенью компактизации, характерной для неактивного хроматина. Было показано, что процесс реконструкции начинается с точки прикрепления петли домена к матриксу и постепенно распространяется вдоль домена И^огкго-Ь)} е! а1., 1988; Гагинская и Цветков, 1988). В этом случае в ходе длительной процедуры пришивки процесс реконструкции неактивного состояния может затронуть и область домена гена бтш-70, соответствующую пробе Г, в то время как быстрая фиксация формальдегидом предотвращает этот процесс и замораживает "активную" форму хроматина.

В наших ранних работах было показано, что гистоны активнотранскрибируемых генов теряют способность пришиваться к ДНК

через гис1 ияйим I Кагроу а!., 19в4 >. и мн предполагали,что зто вызываете« придгижг'нием молекул РНК-полимеразы вдоль ДНК. В таком случаи наблюл о-мые нами конформз.шюннне переходы должны затрагивать только занятые РНК-полимеразои области. Однако структурные переходы наблюдаются и в областях, не занятых РНК-полимеразои (проба Г, например), и это указывает на то, что влияние может быть опосредованным. Конформационный сдвиг в активированном хроматине может вызваться, например, торзионным напряжением. сопровождающим движение молекул ГНК-полимеразы, которое может распространяться вдоль ДНК на какое-то расстояние. При атом |'уще,:тЕ"Нную роль должна играть плотность посадки молекул РНК-полимеразы и соответствующая ей величина торзионного напряжения со иг ем домене. Р. связи с этим нас интересовал вопрос о том, достаточно ли одного раунда транскрипции, чтобы вызвать структурны^ изменения в хроматине, фиксируемые нами, как уменьшение степени пришивки гистонов через гистидины. Для этой цели мы сравнили уровень пришивки гистонов "гистидиновым" методом для инертного хроматина и для хроматина однокопийного гена 0га22, локализованного в 3-ей хромосоме, максимальная транскрипция которого составляет около 2% от уровня транскрипции гена бтш-70 (Ко 1с-hin.sk;/ е1 а!., 1986). Оказалось, что уровень пришивки коровых гистонов и. гисгона Н1 практически такой же, как и в неактивном хроматине I данные не приведены). Эти данные указывают на то, что наблюдаемы" нами изменения в структуре хроматина (удаление глобулярных областей гистонов с сохранением связи с ДНК через Н-концевые участки ) не связаны с предсуществующеи компетентностью хроматина определенных генов к транскрипции, а являются следствием прямого или опосредованного воздействия транскрипционного комплекса на хроматин. Таким образом, потеря контактов гистонов с ДНК через их глобулярную часть будет зависеть от присутствия молекул РНК-полимеразы, а точнее от плотности их посадки на ДНК, когда с момента ухода одной молекулы РНК-полимеразы с нуклеосомы до прихода другой молекулы проходит время недостаточное для восстановления структуры нуклеосомы. При этом, как это было отмечено ранее, гистонам нет необходимости пространственно удаляться от ДНК. Достаточно сохранение контактов гистонов с ДНК через протяженные И-концевые участки, которые, по-видимому, не являются препятствием для продвижения РНК-полимеразы. Линейное расположение гистонов вдоль нуклеосомной ДНК практически при этом

не меняется (Studitsky et al., 1988), что создает благоприятные условия для быстрой реконструкции нуклеосомы после ухода молекулы РНК-полимераэы с нуклеосомы.

Сохранение неизменного линейного расположения гистонов при разворачивании нуклеосомы было показано нами также в экспериментах по изучение влияния мочевины на структуру нуклеосом (Zayetz et al., 1981). Было показано, что увеличение концентрации мочевины вплоть до 6 М не влияет на линейное расположение гистонов вдоль ДНК в нуклеосоме, хотя при этом происходит разворачивание нуклеосом, наблюдаемых в электронном микроскопе в виде вытянутых структур (011ns et al., 1977; Woodcock and Frado, 1977). Сохранение контактов гистонов с ДНК в неспецифически развернутых мочевиной нуклеосомах, возможно, в чем-то моделирует разворачивание нуклеосом активнотранскрибируемого хроматина, где разворачивание происходит за счет продвижения молекул РНК-полимераэы.

Обнаруженный нами структурный переход в хроматине при транскрипции вовсе не означает, что РНК-полимераза является единственным фактором, вызывающим деконденсацию хроматина. Имеется достаточно экспериментальных данных о том, что транскрибируемый хроматин находится в состоянии "компетентности" еще до начала транскрипции. Считается, что различные модификации гистонов, такие как ацетилирование, фосфорилирование или убихитинирование, могут приводить к декомпактизации хроматина. Так, например, показано, что дестабилизация нуклеосом и соответствующая декомпактизация хроматина достигается высокой специфичностью мест ацетилирования, специфичностью для каждой биологической функции, ассиметриеи ацетилирования (Loldl, 1988). По-видимому, только в этом случае прохождение молекул РНК-полимераэы может вызвать наблюдаемый нами структурный переход в хроматине.

Показано, что плотность посадки молекул РНК-полимераэы в кодирующей области гена бтш-70 достигает 10-20 молекул на 1 т.п.н., т.е. 2-3 молекулы полимеразы на нуклеосому (Gilmour and Lis, 1985). Не удивительно поэтому, что при таком уровне транскрипции удается зафиксировать довольно высокий процент нуклеосом, претерпевших конформационный переход, который выражается в ослаблении контактов гистонов через их глобулярную часть и, соответственно, в снижении уровня пришивки через гистидины. При такой интенсивности транскрипции и плотности

посадки молекул РНК-полимерази времени для реконструкции компактных нуклеосом не достаточно. Кроме того, в соседних с кодирующем областью районах может создаваться высокое тирайонное напряжение, возможно, также оказывающее влияние на кон формацию нуклеосом. В то же время для слаботранскриоируемых генов времени между прохождением следующих друг за другом молекул РНК-полимеразы достаточно для относительно быстрой реконструкции нуклеосом, и те локальные конформаиионные переходы в некоторых нуклеосомах, где в данный момент находится РНК-полимераза, но удается заметить на общем фоне нуклеосом, быстро восстанавливающих компактную структуру после ухода с них молекул РНК-полимеразы. Интересно, что к такому же ьывг.ду пришел Е>рнардин (Bernardin et al., 1984), который показал, что только на тех участках хроматина ЗУ 40, где шла интенсивная транскрипция, наблюдаются участки без нуклеосом, при этом наиболее протяженные безнуклеосомные участки видны там, где плотность образующихся транскриптов выше.

Степень пришивки гиетонов через лизины для кодирующей области гена бтш-70 (проба Б) и, области, удаленной на 1,5 т.п.н. от З'-конца гена (проба Г), практически неотличима от, таковой в неактивном хроматине, т.е. сохраняется пространственная близость гиетонов по отношению к ДНК, достаточная для образования ковалентнои связи "нулевой" длины. С другой стороны, выход пришивки для промоторной области (проба А! и области, соотретствуюдо'и зонду В, по-прежинему низок, что дает нам основание ллч предположения о низком содержании гиетонов или даже о полном их от'-у (ствии в этих районах, связанном, по-видимому, со спрцифич<-ч-юи }>нкциеи этих районов хроматина. Как уже было отмечено ранге, отсутствие нуклеосом, а возможно и гиетонов, в промоторнеи области является необходимым условием активации изученных к настоящему времени генов. Что же касается пониженного содержания гиетонов в участке, соответствующем пробе В, то в настоящее время однозначного ответа мы дать не можем. Вероятно, что этот участок связан с белками, участвующими в терминации транскрипции. Есть указания на связывание с этим участком молекул топоизомеразы П. (частное сообщение А.Удварди). Дополнительная информация об организации хроматина этого района домена гена бтш-70 может быть получена при использовании ультрафиолетовой пришивки, позволяющей зафиксировать присутствие пегистоновых белков.

3. ОСОБЕННОСТИ НУКЛЕОПРОТЕИДНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ

ДРОЗОФИЛЫ

3.1. Структура рибосомных генов дрозофилы

Рибосомные гены дрозофилы служат удобной модель» для изучения структуры хроматина активного и неактивного хроматина. Гены рибосомальных РНК представлены в геноме дрозофилы в виде 200-250 копий, организованных в виде тандемных повторов, в которых транскрибирующиеся районы разделены друг от друга так называемыми "нетранскрибируемыми" спенсерами I Long1 et al., 1961). Важная особенность рибосомных генов дрозофилы состоит в том, что более половины всех генов содержат чужеродные вставки на расстоянии приблизительно 7 т.п.н. от начала транскрипции. В клетках обнаруживается лишь ничтожное количество транскриптов со вставок и рибосомных1 генов, содержащих вставки (Long et al., 1981). Механизмы инактивации транскрипции генов под действием вставок остаются неясными. Вставки относятся в основном к двум семействам последовательностей, причем так называемые вставки типа II встречаются только в составе рибосомных генов (Колчинский и др., 1982 ).

Кроме того, некоторые рибосомные гены эукариот обладают общим свойством: нетранскрибируемые спенсеры содержат участки, гомологичные области начала транскрипции этих генов (Bach et al., 1981). Нетранскрибируемые спеисеры дрозофилы представляют собой простейший вариант такой структуры: участку инициации предшествуют 6-10 (в среднем 8) тандемных повторов по 240 п.н., в которых 50 п.н. в точности совпадают с промотором - участком (-24) - (+27Í относительно начала транскрипции рибосомного предшественника (Long et al., 1979). In vivo транскрипция инициируется сравнительно интенсивно на всех участках, гомологичных промотору, но транскрипты нетранскрибируемого спейсера быстро деградируют.

3.2. Градиентная конденсация хроматина в рибосомных генах

дрозофилы

Белковый состав различных участков хроматина рибосомного повтора дрозофилы исследовали с помощью метода гибридизации с

"белковыми тенями". В данной работе мы использовали "гистидиновый" метод фиксации гистонов к ДНК, который, как было указано ранее, является хорошим тестом на конформационные переходы в структуре хроматина. На рис.10 приведены результаты таких последовательных гибридизации с пробами, представлявшими различные участки рибосомного повтора. Сопоставление интенсивности диагоналей, соответствующих коревым гистонам и гистону HI (отмечены на рисунке), с интенсивностью маркерной ДНК позволяет сделать вывод о существенных различиях в степени пришивки гистонов по длине рибосомного повтора. Максимальный уровень пришивки гистонов к ДНК соответствует области рибосомальной вставки II типа (проба R15). Этот уровень пришивки принимается нами за 100%. Как уже отмечалось ранее,зта область практически не транскрибируется. Можно считать, что она входит в состав инертного, неактивного хроматина, с высокой степенью компактизации. Более низкий уровень пришивки гистонов к ДНК наблюдается в области, соответствующей пробе Н-Н 0.9, лежащей позади места внедрения вставок (70-80% от уровня пришивки в неактивном хроматине). Еще сильнее пришивка падает для кодирующей области рибосомального гена, расположенной до вставки (проба Н-Е 0.3) (50-60%), затем идет область нетранскрибируемого спейсера, состоящая из Alu-повторов М0-50Ж), и наконец, область начала транскрипции (проба А-В 0.96), где практически не удается детектировать пришивку гистонов к ДНК (менее 10%) (Таблица 3).

Из 200-?5и копии рибосомальных генов дрозофилы только около 50 генов вовлечены в транскрипцию, остальные же гены находятся в неактивном . состоянии. Считается, что во всех

активно'! ранекри.'мруишихся генах хроматин находится в активной конформации. есть даже указания на то, что при этом происходит удаление гистонов с ДНК (McKnight and Miller, 1976; Labhart and Koller, 1982). В этом случае можно было предполагать, что уровень пришивки гистонов при использовании "гистидинового" метода пришивки, детектирующего конформационные переходы в транскрибируемом хроматине, даст следующие результаты: гибридизация с пробой, соответствующей нетранскрибируемои вставке II типа, обнаружит максимальную пришивку гистонов к ДНК. Уровень пришивки для остальных районов должен быть одинаковым и уменьшенным, приблизительно, на одну четверть от такового в неактивном хроматине (с учетом пропорции активных генов). Однако реальная картина значительно отличается от предполагаемой

А-А 0.24

А-В 0.96

Н-Е 0.3

R15 ,

Н-Н 0.9

1 2 3

1 kb

Рис.10. Определение уровня пришивки коровых гистонов и гистона Н1 в различных участках рибосомного повтора методом гибридизации с "белковыми тенями". Справа - карта рибосомного повтора D.melanogaster (отмечены гибридизационные пробы). Светлые прямоугольники - области, кодирующие зрелые ' рибосомные 1öS и 265 РНК. Стрелка - начало и направление транскрипции, отдельно изображена вставка типа II, присутствующая в 15% рибосомных генов. Буквами обозначены только рестриктаэные участки, использованные для получения гибридизационных проб: А - Alu I; В - BspR; Н -HindiII; Н - EcoRI. Слева - радиоавтографы пяти последовательных гибридизаций указанных проб с одним и тем же фильтром, репликой одного двумерного гель-электрофореза. На нижней фотографии отмечены цифрами следующие диагонали: 1 - непришитой ДНК, 2 -коровых гистонов (в использованных условиях электрофореза они не делятся между собой), 3 - гистона Н1 . Маркерная ДНК отмечена цифрой 4.

Таблица

Уровень пришивки гистонов для различных участков рибосимного. повтора дрозофилы.

Денситометрическое сканирование "белковых теней".

гибридизационные .зонды "гистидиновые" сшивки

коровне гистоны Н1

проба А-к 40-50 40 - 50

проба А-В 0.96 0 - 10 5-10

проба Н-Е 0.3 50 - 60 50 - 60

проба R15 100 100

проба Н-Н 0.9 70 - 80 70 - 80

Уровень пришивки гистонов к ДНК определяется, как отношение выхода сшивок в зондируемой области к выходу сшивок в области рибосомальных вставок II типа по результатам денситометри^еского сканирования в горизонтальном направлении (в области 200-300 п.н.) авторадиограмм "гистоновых теней" после гибридизации с соответствующими зондами. Уровень сшивки гистонов с ДНК транскрипционно-неактивного хроматина рибосомальных вставок принимается за 100%. Сопоставление данных сканирования обеспечивалось нормировкой по внутреннему стандарту - отмеренному количеству нефракционированной депротеинизованной ДНК из сшитых ядер, которую наносили на гель второго направления.

(рис.10). Е составе хроматина протяженного участока, соответствующего району от -150 до + 810 относительно точки инициации транскрипции, обнаруживается очень низкий уровень пришивки гистонов (менее 10% от уровня пришивки в неактивном хроматине), т.е. активная конформация существует здесь практически во всех генах, несмотря на то, что большинство копий рибосомальных генов не транскрибируется. Аналогичные результаты были получены на примере дрожжей (Lohr et al., 1983), где было показано, что хроматин рибосомального промотора находится в активной конформации и не содержит нуклеосом независимо от

интенсивности транскрипции. Напомним, что такие же результаты были получены нами на примере организации промотора генов бтш-70. Значительно ниже предполагаемого обнаруживается уровень пришивки гистонов и в области Alu-повторов нетранскрибируемого спейсера (40-50% от уровня пришивки в неактивном хроматине). Особенности организации хроматина этого района будут обсуждены ниже. Двигаясь вдоль гена обнаруживается более высокое содержание гистонов (до 50-60% от неактивного хроматина, что опять же превышает ожидаемую величину) в области, соответствующей пробе Н-Н 0.3 (до места внедрения вставок), и достигает максимального значения в самой вставке, где наблюдается наибольшая степень компактизации хроматина. В конце гена (после вставки) уровень пришивки гистонов снижается до 70-80%, что приблизительно соответствует порции генов, которые не содержат вставок и могут быть транскрибированы беспрепятственно вдоль всей длины.

Для прояснения вопроса о механизме инактивации рибосомальных генов было использовано несколько разных подходов. Электронномикроскопические измерения длин транскрибирующихся районов указывают на то, что не более 1-2% от всех генов, содержащих вставки, могут быть транскрибированы (Jamrich and Miller, 1984). Было также обнаружено, что гены, не содержащие вставки, более чувствительны к действию ДНКазы I (Wayne et al., 19S5). Это предполагает некоторые различия в организации хроматиновой фибриллы генов без и со вставками. Основываясь на этих и наших данных, можно предположить, что инактивация рибосомальных генов происходит за счет жесткой компактной упаковки хроматина в районе вставок, которая оказывает влияние на соседние с ней участки вдоль хроматиновой фибриллы. Этот феномен был впервые описан именно на примере дрозофилы, получил название эффекта положения (Spofford, 1976) и заключался в том, что активность генов могла быть подавлена, когда они перемещались в область гетерохроматина. Одним из примеров такой супрессии на молекулярном уровне могут служить данные о внедрении мобильных генетических элементов (Pelfer and Bender, 1986).

Наше предположение о специфических функциях хроматиновой организации вставок, как супрессоров транскрипции, находится в соответствии с данными, полученными Давидом и Ребертом (David and Rebbert, 1986). Они показали, что интеркаляторы значительно активируют транскрипцию генов, содержащих вставки. Как известно,

-(нтеркаляторн вызывают деконденсацию хроматина, таким образом эаэрушая препятствие на пути продвижения молекул РНК-полимераэы, г.е. снимая супрессорный эффект компактного хроматина вставок.

S.3. Особенности организации хроматина "Alu-повторов" рибосомальных генов дрозофилы

Как уже было отмечено ранее, так называемый 'нетранскрибируемый" спейсер рибосомальных генов дрозофилы юдержит районы гомологичные промотору этих генов. Было показано, ITO этот район играет важную роль в активации транскрипции 1Ибосомных генов (Baker and Platt, 1986). Определенное >ункциональное значение имеет и величина повторяющейся юследовательности ДНК, которая для разных видов дрозофилы оставляет 240 пар оснований, хотя при этом гомологии в оследовательности ДНК между разными видами не существует (Соеп rid Dover, 1982 ). Ранее было показано, что микрококковая нуклеаэа асщепляет область 240-парных Alu-повторов быстрее, чем остальные частки рибосомного повтора, и при этом образуются необычные рагменты ДНК длиной около 240 п.н. (Колчинский и др., 1984), что дивительно совпадает с размером повтора ДНК, а не с размером тандартного нуклеосомного повтора хроматина дрозофилы. Оказалось, то необычные фрагменты ДНК появляются в продуктах гидролиза, олько если ядра выделены в присутствии полиаминов спермина и пермидина и при ионной силе, близкой к физиологической. Было так-е показано, что относительное содержание HI-содержащих нуклеосом хроматине, соответствующем Alu-повтору, существенно ниже, чем в эактивном хроматине (Джербашьян и др., 1988). На основании этих э-нных было сделано предположение о том, что имеется белок или элки, которые связываются с определенными участками повтора и лбо сами предопределяют картину расщепления нуклеазой, либо 1дают фазу в посадке нуклеосом. Для проверки этой гипотезы был ¡пользован метод гибридизации с "белковыми тенями" в комбинации с 1Ьтрафиолетовой фиксацией ДНК-белковых контактов, в результате jro было обнаружено два негистоновых белка с молекулярными юсами 50 и 70 кД, которые специфически связываются с участками юматина, соответствующими "Alu-повтору". Нужно отметить, что -руктура хроматина "Alu-повтора" рибосомальных генов может быть

схожа со структурой, описанной для 5S генов, где было показано, что нуклеосомы находятся в строго фиксированном положении относительно определенных последовательностей ДНК (Cartwright and Elgin, 1984). В функциональном значении возможно, что связывание этих белков стабилизирует положение нуклеосом на "Alu-повторе" ДНК и открывает или закрывает определенные последовательности, котрые узнаются регуляторными белковыми факторами и РНК-полимеразой, тем более что "Alu-повторы" расположены как раз перед местом инициации транскрипции и включают последовательности гомологичные промотору.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод гибридизации с "белковыми тенями". В основе этого метода лежит фиксация ДНК-белковых контактов различными химическими агентами непосредственно в ядре (без предварительного выделения нуклеопротеидного комплекса) с последующим анализом ДНК-белковых комплексов с помощью разделения в системе двумерного гель - электрофореза и их гибридизации со специфическими клонированными участками генома. Это позволяет качественно и количественно оценить изменения ДНК-белковых контактов, происходящие в хроматине интересующего участка ДНК гена в условиях, максимально приближенных тем, которые существуют в клетке.

2. Показано, что при транскрипции гистоны остаются связанными с ДНК кодирующей области активно-транскрибируемых генов белков теплового шока и при этом не препятствуют продвижению молекул РНК-полимераз вдоль ДНК. Однако, ДНК-гистоновые контакты в составе такого хроматина изменяются, т.е. происходят конформационные переходы в структуре активно-транскрибируемого хроматина, адаптированные к беспрепятственному считыванию информации с ДНК молекулами РНК-полимеразы.

3. Изучение структуры хроматина активно-транскрибируемых генов белков теплового шока позволило сделать несколько выводов об особенностях его организации в этих генах:

а). Показано, что ДНК промоторной области гена бтш-70 . » свободна от гистонов. Отсутствие гистонов на ДНК промотора не зависит от активации транскрипции гена. Обнаружено два негистоновых белка, связывающихся по разным цепям ДНК промотора.

б). Показано, что при транскрипции в кодирующей области гена бтш-70 нарушается эквимолярное соотношение во взаимодействии глобулярных областей кор-гистонов с ДНК. Это проявляется в двукратном ослаблении пришивки гистонов Н2А, Н2Е через гистидины по сравнению с гистонами НЗ, Н4, что отражает динамический характер структурного перехода в хроматине при транскрипции.

в). Ослабление контакта гистонов с ДНК через гистидины показано также и для кодирующей области гена бтш-22.

г). Детектируемые нами структурные переходы в хроматине при транскрипции затрагивают значительную часть домена и не ограничиваются кодирующей областью гена бтш-70.

д). Обнаружен участок хроматина с пониженным содержанием гистонов в 3'-концевой области гена бтш-70, расположенный на расстоянии приблизительно 0.5 т.п.н. от З'-конца кодирующей области этого гена.

4. Получены новые данные об организации хроматина рибосомных генов дрозофилы:

а). Несмотря на то, что менее 1/3 от всех рибосомных генов участвует в синтезе полноразмерных предшественников рибосомных РНК, практически во всех генах участки, соответствующие области начала транскрипции, находятся в активной конформации, характеризующейся отсутствием

гистонов.

0). В той части рибосомных генов, где идет транскрипция, хроматин кодирующей области претерпевает структурный переход, зафиксированный нами как ослабление контактов ДНК с глобулярной областью гистонов, аналогичный тому, который мы наблюдаем в генах белков теплового шока.

в). Хроматин, соответствующий нетранскрибируемой вставке II типа, находится в инертном, компактном состоянии с максимальным содержанием гистонов на единицу длины ДНК. Предполагается, что внедрение такой вставки может вызывать супрессорный эффект, и препятствовать образованию полноразмерных предшественников рибосомной РНК. Такого рода "эффект положения" может заключаться в градиентной конденсации хроматина, распространяющейся в обе стороы от инертной вставки.

г). Показано, что хроматин участка рибосомного повтора, соответствующего "А1и-повтору" нетранскрибируемого спейсера, обеднен гистонами. При расщеплении микрококковой нуклеазой образуются необычные нуклеопротеидные частицы, размер которых соответствует "А1и-повтору" ДНК и составляет приблизительно 240 пар оснований. В формировании этих частиц , по-видимому, принимают участие негистоновые белки, которые связываются с определенными последовательностями ДНК и задают фазу в посадке нуклеосом вдоль ДНК. Предполагается, что такая специфическая организация хроматина "А1и-повтора" определяется участием этого района в регуляции транскрипции рибосомных генов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карпов В.Л., Заец В.В., Бавыкин С.Г., Мирэабеков А.Д.

Стабильность первичной организации нуклеосомных кор частиц при некоторых конформационных переходах.

Тезисы II двустороннего симпозиума СССР-Италия, "Макромолекулы в функционирующей клетке", Пущино, 1980, стр.68-94.

2. Zayetz V.V., Bavykin S.G., Karpov V.L., Mirzabekov A.D. Stability of the primary organization of nucleosome core particles upon some conformational transitions.

Nucleic Acids Research, 9, 1053-1066, 1981.

3. Карпов В.Л., Преображенская О.В., Колчинский A.M., Мирзабеков А.Д.

Изучение структуры хроматина в функционально различающихся участках генов Drosophila.

Тезисы VI двустороннего симпозиума СССР-ФРГ, "Структура и транскрипция генома", Ереван, 1981, стр.75-76.

4. Карпов В.Л., Бавыкин С.Г., Преображенская О.В., Эбралидзе К.К. Тунеев В.М., Мирэабеков А.Д.

Структура хроматина и локализация белков на специфических участках ДНК.

Тезисы VI двустороннего симпозиума СССР-Франция, "Структура и Функция белков и нуклеиновых кислот", Цхалтуба, 1982, стр.8.

5. Колчинский A.M., Вашакидзе Р.П., Карпов В.Л., Преображенская О.В., Мирзабеков А.Д.

Изучение структуры хроматина дрозофилы, содержащего рибосомальние гены, методом гибридизационного картирования. Тезисы доклада на Всесоюзном симпозиуме "Рекомбинантная ДНК", Пушино, 1992, стр.57.

6. Mirzabekov A.D., Bavykin 5.G., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Ebralldze К.К., Tuneev V.M., Melrilkova A.F., Goguadze E.J., Chenchlck A.A., Beabealashvili R.S.

Structure of nucleosomes. Chromatin and RNA-polymerase promoter complex as revealed by DNA-protelri cross linking. Cold Spring Harbor Simposla on Quantitative Biology, 47, 504-510, 1982.

7. Вашакидзе P.П., Колчинский A.M., Карпов В.Л., Преображенская О.В., Мирзабеков А.Д. Организация хроматина рибосомальных генов дрозофилы.

Тезисы доклада на республиканском симпозиуме "Ядерные белки и экспрессия генома", Киев, 1983.

8. Mlrzabekov A.D., Bavykin S.G., Usachenko S.I., Shick V.V., Belyavsky A.V., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V. Structure of repressed and transcriptlonaly active chromatin. Abstracts of 5th German-Soviet symposium "Structure and activity of chromatin and genes", Ко In, 1983, p.14.

9. Преображенская O.B., Карпов В.Л., Нагорская Т.В., Мирэабеков А.Д.

Структура хроматина активного в транскрипции. Молекулярная биология, 18, 8-20, 1984.

10. Колчинский A.M., Вашакидзе Р.П., Преображенская О.В., Карпов В.Л., Мирэабеков А.Д.

Структура хроматина рибосомальных генов Dr.melanogaster. Молекулярная биология, 18, 1141-1150, 1984.

11. Преображенская О.Е., Карпов В.Л., Мирэабеков А.Д. Структура хроматина.

Журнал Всесоюзного Химического общества, 29, 171-175, 1984.

12. Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Mlrzabekov A.D. Chromatin structure of heat-shocked HSP-70 genes: selective removal of hlstines from the coding region and their absence from the 5' region.

5^ symposium "Structure and function of chromatin", Varna, 1984.

13. Вашакидзе P.П., Колчинский A.M., Преображенская О.В., Карпов В.Л.

Структура хроматина рибосомальных генов Dr.melanogaster. Тезисы 16ой конференции ФЕБО, Москва, 1984, стр.265.

14. Mlrzabekov A.D., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Bavykin S.G., Dzherbashajan A.R., Shlck V.V., Belyavsky A.V. The structure of nucleosomes and chromatin.

Current Trends in Life Sciences XII (Biological

Macroraolecules>, 1-7, 19S4.

15. Karpov V.L., Preobrashenskaya O.V., Mlrzabekov A.D. Chromatin structure of hsp70 genes, activated by heat shock: selective removal of hlstones from the coding region and their absence from the 5' region.

Cell, 36, 423-431 , 1984.

16. Мирзабеков А.Д., Карпов В.Л., Преображенская О.В., Нагорская Т.Е.

Динамические структурные переходы в хроматине при его активации.

Тезисы доклада на VI двустороннем симпозиуме СССР-Италия, "Макромолекулы в функционирующей клетке", Киев, 1984, 87.

17. Мирэабеков А.Д., Карпов В.Д., Преображенская О.В., Бавыкин С.Г., Усаченко С.И., Шик В.В., Белявский А.В. Структура активного и неактивного в транскрипции хроматина. Тезисы доклада на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра", Пущино, 1984-, 84-85.

18. Mlrzabekov A.D., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Bavykln S.G., Usachenko S.I., Lyshanskaya A.I., Undrltsov I.M., Shlck V.V., Belyavsky A.V.

Dynamic structure changes In chromatin upon transcription. In Proceedings of the 16th FEB5 Congress, Part B, 141-147, 1985.

19. Карпов В.Д., Преображенская О.В., Джербашьян А.Р., Мирэабеков Л.Д. >

Использование метода гибридизации с "белковыми тенями" для изучения структуры хроматина генов дрозофилы. Тезисы 9ой Европейской конференции по изучению дрозофилы, Сегед, 1985.

20. Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Dzerbashyajan A.R., Studitsky V.M., Belyavsky A.V., Mlrzabekov A.D. Chromatin structure and activation of different Drosophila genes.

6th Simposiura "Structure and function of chromatin", Varna, 1986.

21. Preobrazhenskaya O.V., Karpov V.L., Belikov S.V., Nacheva G.A., Mirzabekov A.D.

Dlnamic aspects of chromatin structure.

Abstracts of 18th FEBS Meeting, Ljubljana, 1987, p.290.

22. Mirzabekov A.D., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Belikov S.Y., Ebralldse K.K., Belyavsky A.V., Studltsky V.M. Structural dynamics of nucleosomes and chromatin upon transcription.

Organization and Functioning of the Eukaryotlc Genome". Eds. E.Bautz and H.Zachau, Sprlnger-Verlag, Berlin, FRG.-1987, p.16-17.

23. Джербашьян A.P., Вашакидэе P.П., Карпов В.Л., Колчинский A.M., Мирэабеков А.Д.

Градиентная конденсация хроматина в рибосомных генах

Drosophila melanogaster.

Молекулярная биология, 22, 231-241, 1988.

24. Belikov S.V., Guschin D.U., Ebralldze К.К., Nacheva G.A., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Mirzabekov A.D. Rearrangements in chromatin structure during transcription. Abstracts of 6t!l Simposlum "Macromolecules in functioning cell", Leningrad, 1986, p.98.

25. Гушин Д.Ю., Начева Г.А., Преображенская О.В., Карпов В.Л., Эбралидэе К.К., Мирзабеков А.Д.

Изменения во взаимодействии гистонов с ДНК при транскрипции. Доклады АН СССР, 303, 1496-1500, 1988.

26. Начева Г.А., Преображенская О.В., Мельникова А.Ф., Карпов В.Л. Структурные изменения хроматина гена бтш-70 дрозофилы при транскрипции.

Молекулярная биология, 23, 879-688, 1989.

27. Mirzabekov A., Bavykin S., Belyavsky A., Karpov V.,

Preobrazhenskaya 0., Shlck V., Ebralidze К. Mapping DNA-protein Interaction by cross-linking. Methods in Enzymology, 170, 386-408, 1989.

28. Nacheva G. , Guschlri D., Preobrazhenskaya 0., Karpov V. , Ebralldze K., Mlrzabekov A.

Changes in the pattern of hlstone binding to DNA upon transcriptional activation. Cell, 58, 27-36, 1989.

29. Preobrazhenskaya 0., Nacheva G., Guschin D. , Ebralidse K., Karpov V., Mlrzabekov A.

Chromatin structure rearrangements in hsp-70 Drozophlla genes during transcription.

Abstracts of 11-th European Drosophila Research Conference, Marseille, 1989, p.86.

Кроме того, в тексте цитированы следующие публикации, не вошедшие в диссертацию:

30. Беликов С.В., Бельговский А.И., Преображенская О.В., Карпов В.Л.

Картирование ДНК-белковых взаимодействий при помощи пришивки белков к ДНК, индуцированной ультрафиолетовым облучением, на примере активировнного гена белка теплового шока 70 (бтш-70) дрозофилы.

Доклады Академии Наук СССР, (в печати ).

31. Belikov S., Belgovsky A., Preobrazhenskaya 0., Karpov V., Mlrzabekov A.

Two rion-histone proteins are associated with the promoter region and hlstone HI with the coding region of the active hsp-70 genes as revealed by UV-induced DNA-protein cross linking in vivo. The EMBO J.,, (направлено в печать).

32. Belikov S., Vashakidze R., Kolchinsky A., Preobrazhenskaya 0., Karpov V., Mlrzabekov A.

Unusual structure of D.melanogaster "Alu-repeats" chromatin.