Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках

Карпова, Лариса Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи УДК 577.353.2

004692315

КАРПОВА ЛАРИСА ВИКТОРОВНА

УЧАСТИЕ а-ИЗОФОРМ №,К-АТРазы В АКТИВАЦИИ ЕШС1/2 КИНАЗЫ В НЕЙРОНАЛЬНЫХ И ПОДОБНЫХ ИМ КЛЕТКАХ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой стспспи кандидата биологических наук

Специальность 03.01.04 - биохимия

Москва, 2010 2 О МД'1 23!0

004602315

Работа выполнена па кафедре биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В.

Ломоносова

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

профессор

Гривенников Игорь Анатольевич

Доктор физико-математических наук, профессор

Твердислов Всеволод Александрович

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 24 мая 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Представления о роли облигатного мембранного белка Na,K-ATPa3bi (синоним - Na-насос) в жизни животной клетки помимо выполнения основной функции - поддержание ионных градиентов Na+ и К+, в настоящее время дополнились фактами, свидетельствующими об участии этого белка в процессах клеточной сигнализации. Было показано, что Na,K-ATPa3a может выступать в роли рецептора кардиотоничсских стероидов, связывание которых с №,К-АТРазой приводит к инициации сигнального каскада, завершающегося активацией транскрипционных факторов, регулирующих гены раннего и позднего ответов (Kometiani et al, 1998; Xie et al, 1999; Peng ct al, 2006). Исследование сигнального каскада с участием №,К-АТРазы проводилось преимущественно па кардиомиоцитах и клетках почечного эпителия, где присутствуют al (почечный эпителий, кардиомиоциты) и а2 изоформы (кардиомиоциты) №,К-АТРазы (Xie, Askari, 2002; Aizman, Aperia, 2003; Akimova ct al, 2005), различающиеся no чувствительности к переносимым ионам Na+ и К+, АТФ (Mobashcri et al, 2000) и активным формам кислорода (АФК) (Huang et al, 1994; Boldyrev ct al, 2003), а у некоторых животных и по чувствительности к кардиотоническим стероидам (Charlemagne ct al, 1993).

Наиболее интересным, на наш взгляд, является исследование участия Na-nacoca в сигнальных каскадах нейрональных клеток, поскольку Na,K-ATPa3a имеет особое значение для функционирования нервной ткани. В тканях мозга Na,K-ATPa3a представлена al, a2 и a3 изоформами, причем а2 типична преимущественно для глиальных клеток, а аЗ - для нейронов (Urayama et al, 1989; McGrail et al, 1991; Peng et al, 1997). Показано, что мутация аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi сопряжена с развитием нейрональных заболеваний, таких как паркинсонизм и семейная гемиплегическая мигрень И типа (Aguiar et al, 2004); а а2 изоформа отвествепна за повышение кровяного давления в результате накопления уабаина в кровеном русле после продолжительного введение уабаина в организм (Dostanic et al, 2005; Van Huyssc, 2007). Другая особенность нервной ткани - это разнообразие глутаматных рецепторов, нарушение функций которых приводит к развитию окислительного стресса и, как следствие, к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний (Boldyrev et al, 2004). Наиболее важными для этих процессов являются глутаматные рецепторы, активируемые N-метил-О-аспартатом (NMDA). Более того, было показано, что низкие концентрации уабаина оказывают

нейропротекторное действие и предотвращают развитие апоптоза клеток нервной ткани, вызванное действием каиновой кислоты (агонист глутаматных рецепторов) (Golden et al, 2006).

В этом отношении возникает оправданный вопрос, существует ли взаимодействие между этими белками - №,К-АТРазой и глутаматными рецепторами. Показано, что гиперактивация NMDA-рецепторов, относящихся к классу ионотропных глутаматных рецепторов, приводит к снижению активности только а2 и аЗ, но не а1 изоформы Na,K-АТРазы в гранулярных клетках мозжечка (Boldyrev et al, 2003). Нельзя исключить и обратного влияния -№,К-АТРазы 11а активность глутаматных рецепторов.

В данной работе мы предполагали исследовать внутриклеточные события, к которым приводит ингибирующее действие уабаина на работу №,К-АТРазы в нейрональных клетках, а также определить роль разных а изоформ Na,K-ATPa3w в осуществлении этих событий. Поскольку известно, что в других типах клеток действие уабаина приводит к активации митогеп-зависимого сигнального каскада, мы сконцентрировали наши исследования впервую очередь на участниках именно этого сигнального каскада. Кроме того, мы предполагали оценить вовлечение глутаматных рецепторов NMDA-класса в процесс активации сигнального каскада, вызванного действием уабаина на нейрональные клетки. Цель и задачи работы

Целью данной работы явилась оценка участия разных изоформ а-субъединицы Na,K-ATPa3bj в реализации возможного сигнального каскада, активирующегося в нейрональных и подобных им клетках, при действии уабаина. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать активацию Erkl/2 киназы, центрального белка митоген-активируемого сигнального каскада, в нейрональных клетках при действии различных концентраций уабаина

2. Выявить зависимость активации Erkl/2 киназы от свободных радикалов и концентрации внутри- и внеклеточного Са2+ при действии уабаина в нейрональных клетках

3. Выявить участие различных протеинкиназ в активации Erkl/2 киназы в нейрональных клетках

4. Создать клетки с раздельным подавлением в них экспрессии а1 и аЗ изоформ Иа,К-АТРазы

5. Оценить жизнеспособность клеток, в которых подавлена экспрессия а1 или аЗ изоформы №,К-ЛТРази при действии уабаина

6. Сравнить активацию уабаипом Егк1/2 киназы в клетках с подавленной экспрессией а1 или аЗ изоформы №,К-ЛТРачы

Научная и практическая новизна

Впервые показано, что в активации Егк1/2 киназы, вызванной ингибировапием №,К-АТРазы уабаипом в нейрональных клетках, принимают участие NMDA-peцeптopы. Впервые были созданы разные типы клеток нейробластомы ЯК-М-ЛБ, в которых осуществляется раздельное подавление экспрессии преимущественно а1 или аЗ изоформы Ыа,К-АТРазы с помощью механизма РНК-интерференции и охарактеризовано действие уабаина на их жизнеспособность. Обнаружено, что удаление любой из исследованных изоформ 1Ча,К-АТРазы приводит к гибели клеток. Это указывает, что в условиях активации сигнального каскада, вызванного иигибирующим действием уабаина па работу Ыа,К-АТРазы, ни одна из исследованных изоформ №,К-АТРазы не способна компенсировать отсутствие другой. Исследование клеток нейробластомы 8К-Ы-А8 с подавленной экспрессией аЗ изоформы Ыа,К-ЛТРазы, показало непосредственное участие этой изоформы в активации Егк1/2 киназы, что отражает сигнальную роль аЗ изоформы в этих клетках и указывает на функциональные различия изоформ а субъединицы фермента. Полученные данные о сигнальной роли аЗ изоформы в клетках могут стать основой для уточнения молекулярных механизмов различных нейродегенеративных заболеваний, поскольку известно, что их развитие сопряжено с наличием мутаций в гене аЗ изоформы Ш,К-АТРазы (Уапшо1ко1 сЛ а1, 2003; с1с СагуаШо Авшаг й а1, 2004). Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на VII Международной конференции по АТРазам, связанным с различной клеточной активностью (Киренчестср, Англия, 2007), XII Международной конференции по АТРазам Р-типа (Орхус, Дания, 2008), II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010 г). По

материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ. Структура и о til, ем диссертации

Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 49 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 194 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Исследования особенностей сигнального каскада, активирующегося в 71ейропальных клетках при действии уабаина, осуществляли в гранулярных клетках мозжечка. Суспензию клеток выделяли из мозжечка 9-12 дневных крыс. В суспензии гранулярных клеток мозжечка одновременно присутствуют нейроны, экспрессирующие al и аЗ изоформы, и глиальные клетки, экспрессирующие al и а2 изоформы №,К-АТРазы (Казей, 2006). Высокочувствительными к уабаину являются а2 и аЗ изоформы, a al изоформа Na,K-АТРазы резистентна к этому сердечному гликозиду (Marks, Seeds, 1978). Изменение уровня Са2+, свободных радикалов и активацию Erkl/2 кипазы после действия различных концентраций уабаина оценивали в нейрональных клетках, присутствующих в суспензии гранулярных клеток мозжечка, методом проточной цитометрии, позволяющим избирательно анализировать различные популяции клеток. Первичную культуру гранулярных клеток мозжечка, в которой предварительно подавляли пролиферацию глиапьных клеток, использовали для определения способности уабаина вызывать апоптотическую гибель нейрональных клеток. Изучение роли разных изоформ а субъединицы Na,K-ATPa3u в сигнальном каскаде, опосредованном действием уабаина, осуществляли в клетках нейробластомы человека SK-N-AS. Культивирование клеток

Гранулярные клетки мозжечка крыс культивировали в среде NBM (Neurobasal Medium) (Gibco, США), содержащей 2% Supplement В-27 (Gibco, США), 0,5 мМ GlutaMax (Gibco, США), 100 U/мл смеси пенициллин/стрептомицин (Gibco, США) и 20 мМ KCl (Sigma, США).Условия культивации стандартные (37 С, 5% С02, относительная влажность

98%). На 3-4 сутки культивирования в среду инкубации добавляли 5 цМ арабинозинмоноцитозида (Sigma, США) для остановки пролиферации глиальных клеток.

Культивирование клеток нейробластомы SK-N-AS осуществляли в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium) (PromoCell, Германия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят (PromoCell, Германия) и 100 ед/мл смеси пенициллина и стрептомицина (Pen/Strep) (PromoCell, Германия). Условия культивации стандартные (37 С, 5% С02, относительная влажность 98%). Проточная иитомстрин

Данным методом проводили детекцию уровня Са2+, свободных радикалов, активации (фосфорилирования) Erkl/2 киназы, а также тип клеточной смерти. При анализе данных из общей популяции клеток выделяли клетки по размерам соответствующие нейронам, таким образом действие низкой концентрации уабаина, относилось к ипгибированию высокочувствительной аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi.

Для измерения уровня Са2+ использовали флуоресцентный зонд Fluo-3-AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-

ксантенил)фенокси]-2-(2-амипо-5-метилфепокси)этан^,К,К^'-тетрауксуспой кислоты) (Calbiochem, Германия) ().сх = 488 нм, ).сш = 530 нм). Концентрация Fluo-3-AM составляла 20 цМ. Уровень свободных радикалов оценивали с помощью DCFH2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат) (Invitrogen, Германия) ()хх = 485 нм, лет = 535 нм). Концентрация DCFH2-DA составляла 100 цМ. Определение доли мертвых клеток в исследуемой популяции проводили по окраске клеток йодидом пропидия (PI) (Sigma, США) (Хех = 485 нм, Хеш = 610 нм). Концентрация PI составляла 10 fiM. Для детекции типа клеточной смерти использовали набор «TACS™ Annexin V-FITC apoptosis detection kit.» (Molecular Probes, США). Измерение активации Erkl/2 киназы осуществляли с помощью моноклональных антител к суммарному (или общему) белку Erkl/2 и фосфорилированиому белку Erkl/2 киназы согласно протоколу производителя. Для окрашивания связавшихся первичных антител использовали ФИТЦ-коныогат вторичных антител (Alexa Fluor© 488, США).

Измерения проводили на приборе «EPICS XL» (Beckman Couller, США), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм. В каждом измерении регистрировали 10000 событий (клеток). Результаты анализировали с помощью программы «WinMDI2.7» (Scripps Institute, La Jolla, USA). С помощью данной программы

оценивали распределение в популяциях клеток интенсивности флуоресценции в красной и зеленой областях и получали среднее значение флуоресценции (или медиану флуоресценции).

Подавление биосинтеза мРИК я субъединицы Na.K-АТРазы и ОТ-ПЦР

Изменение биосинтеза мРНК al и аЗ изоформ Na,K-ATPa3bi в клетках пейробластомы SK-N-AS осуществляли с помощью малых интерферирующих РНК (сиРНК). Концентрация сиРНК для al и аЗ изоформ №,К-АТРазы составляла 100 нМ. Для доставки сиРНК в клетки использовали липосомную трапсфекцию с помощью липофектамина-2000. мРНК выделяли с помощью набора «QIAGEN RNeasy Mini Kit» (Qiagen, Германия). ОТ-ПЦР проводили с праймерами, специфичными к al, a2 и аЗ изоформам №,К-АТРазы и NR1, NR2A, NR2B, NR2C и NR2D субъединицам NMDA-рецепторов с помощью набора «QIAGEN OneStep RT-PCR Kit» (Qiagen, Германия) и прибора «MasterCycler Gradient» (Eppendorf, Германия). Вестерп-блоттинг

Данным методом проводили оценку активации (фосфорилировапия) различных белков, участников сигнальных каскадов, при действии уабаина на клетки пейробластомы SK-N-AS. Первичные антитела использовали в разведении, указанном в протоколе производителя (Cell Signaling Technology, Германия). Связывание первичных антител детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью набора «Amersham™ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents» (GE Healthcare Life Sciences, Германия).

Оценка жизнеспособности клеток (МТТ-тест)

Изменение количества живых клеток пейробластомы SK-N-AS до и после подавления экспрессии al и аЗ изоформ Ыа,К-АТРазы проводили с помощью МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) (AppliChem, Германия). Концентрация МТТ составляла 0,5 мг/мл. Оптическую плотность формазапа, образовавшегося в живых клетках, определяли при 540 им с помощью «Labsystems iEMS Reader MF». Для работы с прибором использовали программу «Genesis». Статистическая обработка результатов

Анализ результатов проводили с помощью компьютерной программы «GraphPadPrism4». Достоверную значимость отличий в данных, полученных методом вестерп-блоттинг, проверяли с помощью одностороннего непараметрического критерия

Манпа-Уитни и критерия Дунетта. Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали критерий Смирнова-Колмогорова (коэффициент D/S(n), который отражает достоверность различий двух гистограмм), а для результатов остальных экспериментов - t-критерий Стыодснта. Данные, полученные методом МТТ-теста, анализировали методом «Опе-Way ANOVA» с поправкой Дунпета, проводя сопоставление всех данных по отношению к контролю. Достоверность различий соответствовала р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. УЧАСТИЕ NA,K-ATPa3bi В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ В НЕЙРОНАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ Влияние уабаина на жизнеспособность нейрональных клеток. Для исследования механизма сигнального каскада мы сопоставляли эффект двух концентраций уабаина - 100 пМ (приводит к частичному ингибированию а2 и аЗ изоформ Na,K-ATPa3bi) и 1 мМ (обеспечивает полное ингибирование al, a2 и аЗ изоформ Ыа,К-АТРазы) (Marks, Seeds, 1978) для того, чтобы иметь возможность отделить вклад высокочувствительной (аЗ) от вклада низкочувствительной (al) изоформы в реализацию сигнального каскада.

Мы провели исследование влияния уабаина на развитие апоптотической гибели в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка, инкубируя их в течение 24 ч с используемыми концентрациями уабаина. Из Рис. 1 видно, что после 24 ч инкубации с 1 мМ уабаином 32,5% клеток начинают метиться аннексипом V, коныогированным с ФИТЦ, что является признаком апоптотической гибели клеток. Это вдвое больше, чем в популяции интактных клеток (16,2%). В то же время, только 8,5% клеток являются аннексин-положительными после 24 ч инкубации со 100 нМ уабаином, что говорит о том, что низкие концентрации уабаина способны предотвращать развитие апоптоза. Эти данные, по нашему мнению, являются показателем активации специфического сигнального каскада, вызванного ингибированием высокочувствительной аЗ изоформы Ыа,К-АТРазы в присутствии 100 нМ уабаина, участниками которого вероятнее всего являются белки, препятствующие развитию апоптоза нейрональных клеток.

Высокая концентрация уабаина, которая ингибирует активность всех а изоформ Na,K-ATPa3bi, за длительное время инкубации (24 ч) не только приводит к активации сигнального каскада, но одновременно вызывает дисбаланс ионных градиентов Na+ и К+,

который сам по себе способен приводить к развитию апоптотической смерти клеток (Рапау'юМ'ю Ы а1, 2006).

6.5% 1.4%

77.3%; 'к 16.2% & 90.1% 8.5%

Айв пав V ФПТЦ ь в ,/■ V Л» .<■> V ФИШ

6.2%

61.5%.;[ • 32.2%

Рис. 1. Эффект 100 пМ и 1 мМ уабаина па развитие апоптоза в нейрональных клетках после 24 ч инкубации. А - контрольные клетки, Б - после действия 100 нМ уабаина; В — после действия 1 мМ уабаина. В нижнем левом квадранте - живые клетки; нижний правый квадрант - апоптотически гибнущие клетки; верхний квадрант - некротически гибнущие клетки. Процент каждой клеточной популяции показан внутри каждого квадранта.

Таким образом, двойственный эффект уабаина на жизнеспособность нейрональных клеток указывает на возможные различия в вовлеченности разных изоформ фермента в клеточную сигнализацию.

Эффект уабаина на уровень свободных радикалов и Са2+ в нейрональных клетках.

Мы измеряли уровень свободных радикалов при кратковременной (60 мин) инкубации выделяемых нейрональных клеток в присутствии 100 нМ или 1 мМ уабаина, при этом величина мертвых клеток во всех случаях оставалась на низком уровне (6-8%). В то же время, инкубация, как с низкой, так и с высокой концентрацией уабаина проводила к увеличению в клетках уровня свободных радикалов, при этом наблюдалось пропорциональное концентрации уабаина возрастание как средней величины флуоресценции, соответствующей накоплению, свободных радикалов, так и количества клеток, в которых накапливались свободные радикалы (Рис. 2). В дальнейших экспериментах мы обнаружили, что в этих условиях уровень внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са21];,,) также повышается: при концентрации 100 нМ уабаина уровень Са2+ возрастает на 15%, а при концентрации 1 мМ - на 25% (Рис. 3).

Таким образом, инкубация нейрональных клеток с уабаином в низкой концентрации, вызывающей ингибирование высокочувствительной изоформы Ыа,К-АТРазы, приводит к достоверному повышению уровня свободных радикалов и [Са2+]|п, что указывает на участие данной изоформы в активации начальных стадий сигнального каскада.

й'

ЮОнМуабаин

1 мМуабаин

ш t:'

ч f"

Г--V

, -чж,

■ :ф ■ ■ -W Ш''

..... т S5

■в

US ш

100 нМ Уабаин

Рис. 2. Продукция свободных радикалов в нсйрональных клетках. А - распределение популяции клеток в координатах флуоресценция ОСР (ось X) Ув. Р1 (ось У) в интактных клетках и в клетках после инкубации с 100 нМ или I мМ уабаином. Верхние квадранты показывают количество мертвых клеток (метящихся Р1), нижние квадранты - клетки, метящиеся ОСР; Б - гистограмма распределения флуоресценции ОСР в популяции клеток. Ось X -интенсивность флуоресценции ОСР (отн.ед.), ось У - количество событий (клеток); В - диаграмма зависимости уровня свободных радикалов от концентрации уабаина. (п = 3, М ± вЕМ; * соответствует достоверному отличию от контроля с р<0,05).

Рис. 3. Изменение уровня [Са ]|„ в нсйрональных клетках после действия уабаина. А - гистограмма распределения флуоресценции Р1ио-3 в популяции клеток. Ось X -интенсивность флуоресценции Р1ио-3 (отн.ед.), ось У - количество событий (вертикальная линия соответствует среднему значению флуоресценции интактных клеток); Б -диаграмма зависимости уровня

внутриклеточного Са21 от концентрации уабаина (п = 3, М±8ЕМ; * соответствует достоверному отличию от контроля с р<0,05).

Б iK-

i Т

=Ё

шЛт И

Швв

Ш SSS

Повышающиеся концентрации уабаина приводят к дополнительному росту свободных радикалов и Са2+, так что из представленных результатов невозможно провести раздельную оценку вклада уабаин-резистентной и уабаии-чувствительной изоформ фермента в реализацию сигнального каскада.

Влиинис уабаина на активность Erkl/2 кипазы в нсйрональных клетках. Мы

определяли активацию Erkl/2 кипазы в нейрональных клетках после 180 мип инкубации с уабаином. В качестве положительного контроля мы использовали активацию Erkl/2

киназы в нейрональных клетках при действии NMDA, поскольку известно, что гиперактивация NMDA-рецепторов в нейронах приводит к повышению уровня свободных радикалов, увеличению внутриклеточного Са2^ и активации различных протеинкипаз, в том числе, и Erkl/2 киназы (Grewal et al, 1999; Wang et al, 2007).

Инкубация клеток с 500 цМ NMDA в течение 30 мин не приводила в наших опытах

к активации Erkl/2 киназы (Рис. 4 А, В, Д), однако при продлении времени инкубации до

180 мин в клетках появляется фосфорилированный белок Erkl/2 киназы (Рис. 4 Б, Г, Д).

Рис. 4. Фосфорилированная и общая Erkl/2 киназа в нейрональных клетках после инкубации с 500 цМ NMDA в течение 30 (А, В) и 180 мин (Б, Г) (гистограммы с черным контуром) по отношению к контрольным клеткам (гистограммы, заполненные серым цветом). Д - доля активной Erkl/2 киназы в разных условиях. Увеличение интенсивности I флуоресценции ФИТЦ-меченых антител, связавшихся с фосфо Erkl/2 киназой (Б), свидетельствует о появлении

фосфорилировапного белка Erkl/2 киназы в клетках после 180 мин инкубации с 500 цМ NMDA (черный контур). Из данных гистограмм было определено среднее значение флуоресценции ФИТЦ-мсченых антител, связавшихся либо с фосфо Erkl/2 кипазой, либо с общей Erkl/2 киназой и найдено их соотношение (Д), принятое в контроле за 1. Белые столбики - интактные клетки, черные столбики - клетки после инкубации с 500 цМ NMDA (п = 3, M ± SEM).

То, что активация Erkl/2 киназы вызвана специфическим действием NMDA, подтверждается зависимостью активации от присутствия антагонистов NMDA-рецепторов - МК-801 и D-AP5. MK-80I является неконкурентным антагонистом, блокирующим ионный канал NMDA-рецепторов, D-AP5 - высокоселективный конкурентный антагонист, препятствующий связыванию лиганда с соответствующим участком NMDA-рецептора. Из Рис. 5 видно, что преинкубация клеток как с МК-801, так и с D-AP5 препятствует активации Erkl/2 киназы. Кроме того, преинкубация клеток с N-ацетилцистеином (NAC) (проникающий в клетки тушитель свободных радикалов) и ВАРТА (хелатор внутриклеточного Са2+) также предотвращает активацию Erkl/2 киназы.

Р,

фосфо Elk 1/2 мша Ja

овщаяЕ1Н1/2п<на>а

общли Elk |'2 мша) J

Рис. 5. Предотвращение активации Erkl/2 киназы в условиях 180 мин инкубации нейронов с 500 цМ NMDA после 10 мин прсинкубации нейронов с МК-801 (10 цМ), D-AP5 (10 цМ), N-ацстилцистеипом (NAC, 1 мМ) или кальциевым хелатором ВАРТА (50 цМ). Соотношение медианы флуоресценции фосфо фракции к общей фракции Erkl/2 киназы в контроле принято за 1 (п = 3, M±SEM).

-8-с

■в-

гИ

Консоль фосфо Егк1/2

КИПЯ JA

500MKMN№A

Эти опыты указывают, что в используемых нами условиях активация NMDA-рецепторов приводит к росту уровня свободных радикалов и Са2', выступающих в качестве вторичных мессепджеров (Boldyrev et al, 2003; Bulygina et al, 2003) и способных приводить к активации Erkl/2 киназы в нейрональных клетках. Поэтому мы сочли применяемые условия инкубации приемлемыми для изучения эффекта уабаина на состояние Erkl/2 киназы в пейроиалыгых клетках. Инкубация этих клеток с уабаином в течение 30 мин не приводила к активации Erkl/2 киназы так же, как и в случае с NMDA, но при 180 мин инкубации происходило накопление активного белка Erkl/2 киназы в клетках (Рис. 6).

Рис. 6. Влияние уабаина на активацию Erkl/2 киназы

в иейрональпых клеток после 30 мин (А) и 180 мии

(Б) инкубации. Контроль - I; клетки,

инкубированные с 100 нМ уабаина - 2; клетки,

инкубированные с I мМ уабаина - 3. По оси Y -

количество клеток, по оси X - интенсивность

флуоресценции ФИТЦ-меченных вторичных

антител, связавшихся с антителами к фосфо Erkl/2

киназе (отн.ед.). На рис. 6 Б видно усиление

интенсивности флуоресценции ФИТЦ-меченных

вторичных антител (сдвиг вправо), связавшихся с

антителами к фосфо Erkl/2 киназе в популяции

нейрональных клеток после действия I00 нМ (2) и I

мМ (3) уабаина, свидетельствующее о том, что в

___ клетках появляется активный белок Erk 1/2 киназы.

10' 10" фосфо Erk1i2 кип л, л

Представленные результаты показывают, что при инкубации нейрональных клеток в присутствии низкой (100 нМ) концентрации уабаина прирост активной формы Erkl/2

фосфо Erk 112 кин аза

киназы оказывается достоверным, но меньшим, чем в присутствии высокой концентрации уабаина (1 мМ). Таким образом, и эти эксперименты не давали возможности различить участие низкочувствительной и высокочувствительной изоформ №,К-АТРазы в процессах внутриклеточной сигнализации.

Так же, как и в случае NMDA, в эффект уабаина вовлекаются свободные радикалы и ионы кальция (Таблица 1), преинкубация нейрональных клеток как с NAC, так и с ВАРТА препятствует последующей активации Erkl/2 киназы уабаином. Следовательно, активация Erkl/2 киназы, вызванная действием уабаина па нейронапьные клетки, является зависимой от свободных радикалов и от ионов кальция.

Таблица 1. Падение активации Erkl/2 киназы (отн. ед.) после 10 мин преинкубации с NAC или ВАРТА в нейрональных клетках. После преинкубации клетки выдерживали в среде с уабаином в течение 180 мин. Исходные значение фосфо Erkl/2 киназы в контрольных клетках принято за 1 (п = 3, М ± SEM).

Концентрация уабаина Без добавок NAC, 1 мМ ВАРТА, 50 цМ

100 нМ 1,74±0,05 0,76±0,04 0,87±0,04

1 мМ 2,30±0,07 1,05±0,05 0,89±0,04

Таким образом, в нейрональных клетках при ипгибировапии Na.K-АТРазы уабаином происходит повышение уровня свободных радикалов, Са2+ и активация Erkl/2 киназы, что также наблюдается при гиперактивации NMDA-рецепторов в нейронах. Кроме того, известно, что при гиперактивации NMDA-рецепторов наблюдается подавление активности №,К-АТРазы, которое можно предотвратить как NAC, так и МК-801 (Булыгина и соавт., 2003). Таким образом, косвенные данные позволяют предположить, что за взаимодействие с NMDA-рецепторами ответственны уабаин-чувствительпые изоформы Na,K-ATPa3bi (Boldyrev et al, 2004). Исходя из этих данных, мы сочли целесообразным проверить активацию Erkl/2 кипазы при действии уабаина в условиях преинкубации клеток с антагонистами NMDA-рецепторов.

Из Рис. 7 А и Б видно, что количество фосфорилированного белка Erkl/2 киназы, вызванного действием как низкой, так и высокой концентрациями уабаина, уменьшается в присутствии D-AP5. Преинкубация с МК-801 таюке снижает активацию Erkl/2 киназы

(Рис. 7 В). Следовательно, эффект антагонистов ЫМОА-рецепторов при действии уабаина на клетки отражает участие ЫМОЛ-рецепторои в сигнальном каскаде, опосредованном связыванием уабаина с №,К-АТРазой и приводящем к активации ЕгкШ кииазы.

Уабанн Без добавок: МК-801, 1(1 яМ D-AP5, IOjiM

юо »M 1,74±0,06 1,12±0,05 1,19±0,05

1 ыМ 2,3±О,07 1 ,-№<), 07 J,-J6±0,Ü6

Рис. 7. А и Б - активация Erkl/2 кииазы в присутствии антагонистов NMDA-рецепторов. Гистограмма распределения флуоресценции фосфо фракции Erkl/2 кипазы после действия 100 нМ и 1 мМ уабаина. Контроль - 1; клетки, инкубированные с уабаином и D-AP5 - 2; клетки, инкубированные с уабаином - 3. По оси Y - количество клеток, по оси X -интенсивность флуоресценции ФИТЦ-меченных вторичных антител, связавшихся с антителами к фосфо Erkl/2 киназе (отн.ед.). В - таблица значений активации Erkl/2 киназы в разных условиях. В контроле величина фосфо Erkl/2 киназы принята за 1 (п = 3, М ± SEM).

Мы предположили, что участие NMDA-рецепторов в сигнальном каскаде, связанном с активацией Erkl/2 кипазы, может происходить вследствие активации работы кальциевых каналов NMDA-рецепторов. Для того, чтобы проверить вклад внеклеточного Са2+ в активацию Erkl/2 киназы, мы преинкубировали клетки с ЭГТА (хелатор Ca2t). Из Рис. 8 видно, что активация Erkl/2 кииазы, вызванная уабаином, частично зависит от Са2+, который поступает в клетку из внеклеточной среды, что подтверждает участие NMDA-рецепторов в сигнальном каскаде, опосредованном ингибировапием Na,K-ATPa3bi, и приводящем к активации Erkl/2 киназы.

По нашему мнению, полученные результаты свидетельствуют, что в механизмах клеточной сигнализации существует взаимное влияние NMDA-рецепторов и Na,K-

АТРазы, поскольку не только активация ЫМОА-реценгоров влияет па активность чувствительных к уабаину изоформ №,К-АТРазы (ВоМугеу е1 а1, 2003), но и присутствие уабаина вовлекает NlVIDA-peцcптopы в реализацию сигнального каскада. Механизмы взаимодействия этих двух белков требуют специального исследования.

е- о.5

Контроль 100 нМ фосфо уабаин Erk1/2 киназа

ЮОнМ уабаин + 1 мм ЕГТА

1 ММ уабаин

1 мМ уабаин + 1 мМ ЕГТА

1 мм ЕГТА

Рис. 8. Влияние ЭГТА (хелатор Ca ) па активацию Erkl/2 киназы. По оси ординат - значение фосфо Erkl/2 киназы (отн.ед). Значение фосфо Erkl/2 киназы определено из средних значений интенсивности

флуоресценции ФИТЦ антител, связавшихся с антителами к фосфо Erkl/2 киназе. В контроле исходное значение фосфо Erkl/2 киназы принято за I (п = 3, М ± SEM).

Таким образом, связывание уабаина с №,К-АТРазой в нейрональных клетках приводит к повышению уровня свободных радикалов и Са21, наблюдающееся уже через 60 мин инкубации с уабаином. Увеличение уровня внутриклеточного Са2+ частично происходит за счет входа Са2' в клетки через кальциевые каналы NMDЛ-peцeптopoв, активирующихся при ингибировании Ыа,К-АТРазы уабаином. Увеличение уровня внутриклеточного Са2+ и свободных радикалов приводит к активации Егк 1 /2 киназы, обнаруживаемой после более длительной (180 мин) инкубации.

Участие протеипкииаз в активации 15гк1/2 киназы, вызванной действием уабаина на нейрональные клетки. Известно, что протсинкиназа С (РКС) и фосфоинозитол-3-киназа (Р13К) активируются вследствие повышения внутриклеточной концентрации Са2' и могут приводить к трансактивации других протеинкиназ, в частности, Егк I/2 киназы. Кроме того, в активации Егк 1 /2 киназы могут принимать участие тирозиновые киназы, как это было показано для клеток почек и кардиомиоцитов (Наав е1 а1, 2000). Для определения участия РКС, РОК и тирозиновых киназ в активации Егк 1 /2 киназы мы использовали хслсритрин (ингибитор РКС), ЬУ 294002 (ингибитор Р13К), гениетеин (ингибитор белков из семейства тирозиновых протеинкиназ) и гербимицин А (ингибитор белков из семейства вге киназ: V-вге, у-АЫ и Всг-АЫ киназ).

Из таблицы 2 видно, что только преипкубация клеток с ЬУ 294002 (ингибирование Р13К) вызывает ингибирование Егк 1/2 киназы, независимое от концентрации уабаина; в

присутствии хелеритрипа (иигибироваиие РКС) наблюдается ингибирование Erkl/2 киназы, усиливающееся с увеличением концентрации сердечного гликозида, а в присутствии генистеина и гербимицина А слабое ингибирование Erkl/2 киназы (17-18%) при высокой концентрации уабаина сменяется ее некоторой активацией (10-15%) при низкой концентрации этого кардиостероида (см. Таблицу 2).

Таблица 2. Эффект уабаина на активацию Erkl/2 киназы в присутствии ингибиторов нротеинкиназ. Активация Erkl/2 киназы рассчитана как соотношение медиан флуоресценции фосфосфорилированного белка Erkl/2 киназы к суммарному белку Erkl/2 киназы и в контроле данное соотношение было принято за 100%. Время инкубации с уабаином составило 180 мин. В таблице представлен процент ингибирования активации Erkl/2 киназы. Знак «-» соответствует активации Erkl/2 киназы ( п = 3, М ± SEM).

Ингибиторы протеинкиназ Условия инкубации с ингибитором Ингибирование Erkl/2 киназы, %

100 нМ уабаип 1 мМ уабаин

Хелеритрин (РКС) 10 рМ/20 мин 48 (±5) 65 (±3)

LY 294002 (PI3K) 40 цМ /20 мин 41 (±5) 40 (±3)

Генистеин (Тирозиновые киназы) 100 цМ/ЗОмин -10 (±6) 18 (±3)

Гербимицин А (семейство Src кипаз) 1 рМ/2 ч -15 (±4) 17 (±3)

Представленные данные свидетельствуют, что в регуляции активности Егк 1 /2 киназы могут принимать участие все классы исследованных протеинкиназ, хотя их участие различно в зависимости от того, какие изоформы Ыа,К-АТРазы вовлечены в активацию сигнального каскада. Р13К вовлекается при ингибировании уабаин-чувствительной изоформы фермента, и увеличение концентрации уабаина ничего не добавляет к эффекту его низкой концентрации. Это указывает, что Р13К функционально связана с уабаин-чувствительной изоформой фермента. Напротив, РКС включается в сигнальный каскад при ингибировании как высокочувствительной, так и низкочувствительной изоформы насоса, а тирозиновые киназы проявляют различное действие па Егк 1 /2 киназу в зависимости от того, какие изоформы насоса включаются в активацию Егк1/2 киназы, ипгибируя ее при участии высокочувствительной и активируя - при вовлечении иизко-чувствитслыюй к уабаину изоформы фермента.

Общий анализ представленных в этом разделе данных показывает, что для получения конкретной информации об участии разных изоформ Na-nacoca во внутриклеточной сигнализации, связанной с активацией Erkl/2 киназы, необходимо применять более однозначные подходы.

II. РОЛЬ РАЗНЫХ ИЗОФОРМ NA,K-ATPa3bi В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ SK-N-AS Определение изоферментного состава Na,K-ATPa3bi и субъедипичного состава NMDA-рецепторов в клетках иейробластомы SK-N-AS. Для решения поставленной цели нами была выбрана линия нсйробластомы человека SK-N-AS. В первую очередь, мы определили изоформный состав Na,K-ATPa3i>i и наличие NMDA-рецепторов в клетках иейробластомы SK-N-AS. Мы показали, что в исследуемых клетках осуществляется экспрессия мРПК а! и аЗ изоформ Na,K-ATPa3b< и отсутствует ПЦР продукт для а2 изоформы Na.K-АТРазы (Рис. 9 А). При этом экспрессия мРНК а1 и аЗ изоформ Na,K-АТРазы осуществляется в одинаковой степени. Одновременно в клетках иейробластомы обнаруживаются NR1 и NR2C субъединицы NMDA-рецепторов, хотя отсутствуют ПЦР-продукты для NR2A, NR2B, и NR2D субъедипиц NMDA-рецепторов (Рис. 9 Б).

Рис. 9. Электрофореграммы образцов, полученных после проведения ОТ-ПЦР, показывающие экспрессию мРНК а изоформ №,К-АТРазы (А) и NR-субъедипиц NMDA-рецепторов в клетках иейробластомы SK-N-AS. А: 1,7 - «лестница ДНК фрагментов» от 1000 до 100п.о.;2-а1 изоформа (560 и.о.); 3 - а2 изоформа (557 и.о.); 4 - аЗ изоформа (560 и.о.); 5 - положительный контроль к гену ГАФД (469 п.о.); 6 - отрицательный контроль. Б: 1 - «лестница ДНК фрагментов»; 2 - NR1 субъсдиница (333 п.о.); 3 - NR2A субъединица (224 п.о.); 4 - NR2B субъединица (222 п.о.); 5 - NR2C субъединица (204 п.о.); 6 - NR2D субъединица (224 и.о.); 7 - положительный контроль к гену ГАФД (469 п.о.).

Известно, что в разных структурах мозга субъединичный состав NMDA-рецепторов различен, но в гранулярных клетках мозжечка NR1 и NR2C субъедипицы являются облигатпыми (Chen el al, 2009). Все эти свойства делает клетки нсйробластомы SK-N-AS похожими на нейроны головного мозга.

1000 п.о ЧЯ

iЩЦЩИР ^^^^^ш

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

Влияние уабаина па жизнеспособность клеток нейробластомы SK-N-AS. Вследствие высокой чувствительности Na.K-АТРазы в клетках нейробластомы человека SK-N-AS к уабаину (Dobretsov et al, 2005) мы провели оценку жизнеспособности клеток для выбора оптимальных условий для выяснения роли различных изоформ Na,K-ATPa3bi в сигнальном каскаде. Мы инкубировали клетки в среде с повышающимися концентрациями уабаина в течение 180 мин, после чего отмывали уабаин и продолжали инкубировать клетки в течение 5 суток (Рис. 10). Результаты демонстрируют, что при более длительной инкубации клетки нейробластомы SK-N-AS, находившиеся в течение 180 мин в среде с высокими концентрациями уабаина (1000 нМ и 10 цМ), продолжают интенсивно гибнуть. В присутствии 1000 нМ уабаина на 5 сутки культивирования количество живых клеток сокращается на 40%, а в случае 10 цМ сокращение количества живых клеток происходит на 90%. Инкубация клеток нейробластомы SK-N-AS с более низкими концентрациями уабаина (1 нМ, 10 нМ и 100 нМ) не приводит к значительной гибели клеток. На основании полученных данных концентрации уабаина 10 нМ, 100 нМ и 1000 нМ были выбраны нами для продолжения исследований, поскольку они не оказывают токсического действия па I клетки нейробластомы SK-N-AS после 180 мин инкубации.

Активация ключевых белков сигнальных каскадов в клетках нейробластомы SK-N-AS при действии уабаина. Для выяснения того, приводит ли действие уабаина на Na,K-АТРазу к активации сигнального каскада в клетках нейробластомы SK-N-AS, мы определили активацию уабаином ключевых белков участников различных сигнальных каскадов: Erkl/2 киназы, Akt киназы и р38 киназы.

В первую очередь, мы исследовали активацию Erkl/2 киназы при инкубации клеток

нейробластомы SK-N-AS с повышающимися концентрациями уабаина. Мы установили, что после 180 мин инкубации клеток с уабаином (Рис. 11) рост количества фосфо Erkl/2

0 24 48 72 96 120

Время (часы)

Рис. Ю. Жизнеспособность клеток нейробластомы 8К^-А8 после инкубации с разными

концентрациями уабаина (ось X -время инкубации; ось У количество живых клеток). Количество живых клеток для каждой концентрации уабаина нормировано на уровень живых клеток в контроле, принятый за 100% (п = 9, М ± ЙЕМ).

киназы происходит в 1,3; 1,5 и 2,0 раза при концентрации уабаина 10 нМ, 100 мМ и 1000 нМ, соответственно. Действие уабаина на клетки приводит к активации и Akt киназы. Достоверное увеличение фосфорилированного белка Akt киназы происходит при концентрациях уабаина 100 нМ и 1000 нМ (Рис. 12).

ЛОкДа

Общая ERK 1/2кимазз

Уабаин

ЮиМ ЮОнМ 1000нМ

Фосфо ERK 1/2 (Thr202/Tyr?04) нимй.оа

Рис. 11. Детекция Erkl/2 киназы в клетках нейробластомы SK-N-AS после 180 мин инкубации с уабаином (метод весгерн-блоттинг). А - детекция общей Erkl/2 киназы; Б - детекция фосфо Erkl/2 киназы; В - диаграмма зависимости интенсивности сигнала от концентрации уабаина. Ось Y - фосфо Erkl/2 кииаза в процентах от контроля. Интенсивность сигнала фосфо Erkl/2 киназы в контроле принята за 100% (п = 4, М ± SEM; **= р<0,05).

Рис. 12. Активация Akt киназы при действии уабаина на клетки нейробластомы SK-N-AS (метод вестерн-блоттинг). А - фосфо Akt киназа после 180 мин инкубации с уабаином; Б - пан-актин (нормирующий белок). В -диаграмма зависимости интенсивности сигнала от концентрации уабаина. Ось Y - фосфо Akt киназа в процентах от контроля. Интенсивность сигнала фосфо Akt киназы в контроле принята за 100% (п = 3, М ± SEM; ** соответствует достоверному отличию от контроля с р<0,05).

А Уабаин Б

0 ЮнМ 100ММ ШОнМ 0 i*. • *

Фосфо Akt (Ser4?3) киназа

Уабаин

ЮнМ 10QHM 1000 Hl

IS" ¡1,

C-xW

р38 Киназа, наряду с Erk 1/2 кипазой, принадлежит к семейству митоген-активируемых протеинкиназ (MAP киназ) и включается в регуляцию широкого круга клеточных ответов - пролиферацию, дифференцировку и жизнеспособность (Su, 1996; Grewal et al, 1999). Мы обнаружили, что инкубация клеток нейробластомы SK-N-AS с уабаином вызывает также активацию р38 киназы (Рис. 13). Количество активного белка р38 киназы увеличивается концептрациоппо-зависимым образом и возрастает в 3 раза при максимальной концентрации уабаина - 1000 нМ по сравнению с контролем.

Исходя из полученных данных можно сделать заключение, что в клетках нейробластомы SK-N-AS при связывании уабаина с №,К-АТРазой одновременно

активируются несколько сигнальных путей, которые могут быть связаны как с индукцией

апоптоза, так и с активацией механизмов, ответственных за выживание клетки.

Рис. 13. Активация р38 киназы при действии уабаипа на клетки нейробластомы SK-N-AS (метод вестерн-блоттинг). А - фосфо р38 киназа после 180 мип инкубации с уабаипом; Б - пан-актин (нормирующий белок). В - диаграмма зависимости интенсивности сигнала от концентрации уабаина. Интенсивность сигнала фосфо р38 киназы в контроле принята за 100% (п = 3, М ± SEM; ** соответствует достоверному отличию от контроля с р<0,05).

Подавление биосинтеза «I и аЗ изоформ Na,K-ATPa3i>i в клетках нейробластомы SK-N-AS. Для выполнения этой задачи мы создали клетки, в которых была избирательно подавлена экспрессия ctl или аЗ изоформ №,К-АТРазы. Подавление экспрессии осуществляли с помощью малых интерферирующих РНК (сиРНК), специфичных для al и аЗ изоформ Na,K-ATPa3b!. Через 72 ч после трансфекции сиРНК, направленных на подавление экспрессии al субъединицы Na,K-ATPa3bi, в клетках нейробластомы SK-N-AS наблюдается достоверное снижение экспрессии мРНК на 50% (Рис. 14 А, Б). В случае трансфекции сиРНК, специфичных для аЗ субъедипицы Na,K-ATPa3bi, после 72 ч наблюдается подавление экспрессии аЗ изоформы па 75% (Рис. 14 В, Г). В клетках трансфецировапных сиРНК, представляющими собой негативный контроль, или только липофектамином 2000, экспрессия как al, так и аЗ изоформ остается па прежнем уровне. Для того, чтобы оценить, происходит ли за время эксперимента изменение содержания al и аЗ изоформ №,К-АТРазы на клеточной мембране, мы пометили клетки с помощью антител к al и аЗ изоформам №,К-АТРазы и обнаружили, что после подавления экспрессии мРНК на мембранах клеток нейробластомы (анализ методом конфокальной микроскопии) наблюдается существенное уменьшение количества соответствующих изоформ фермента.

Жизнеспособность клеток нейробластомы SK-N-AS с подавленной экспрессией al и аЗ изоформ Na,K-ATPa3bi при действии уабаина. Известно, что экспрессия а изоформ Na,K-ATPa3bi являются критической для выживания клеток (James et al, 1999). Поэтому мы определили, будет ли изменение экспрессии al или аЗ изоформ №,К-АТРазы приводить к

Уабаин юим моим юоо нм

50кДа «и» 40 кДа ЗОеда

Фосфо р38 (Т1 ц 1 «Ofiyr 182) I В 300-

If £ 2 2008 5

50кДа 40кда

ru mm

й*¥ я

щ я..

Уабаин о ЮнМ МОиММООнМ

10 100 1000 Уабаин(нМ)

гибели клеток в условиях нашего эксперимента. Для этого мы с помощью МТТ-теста измеряли жизнеспособность клеток, имеющих дефицит по а1 или аЗ изоформам АТРазы, в течение 8 суток.

М СИ о2 аЗ а1 о2 аЗ о1 а2 аЗ м

а1 а2 аЗ а1 а2 <дЗ а1 а2 аЗ глфд и,о

о ! еиРНК Трлисфо

100

Котуо.ть Лллофск- Htm. ач сиРНК тэмхн контроль скРИК

JCL

Контроль Ляплфек Нггат. .з СиРНК ко тро -гг. с кРНК

Рис. 14. Влияние трансфекции различных сиРНК на экспрессию мРНК al изоформы (А, Б) и аЗ изоформы (В, Г) Na,K-ATPa3bi в клетках нейробластомы SK-N-AS. А, В - экспрессия разных изоформ Na,K-ATPa3bi в присутствии и в отсутствии сиРНК. Б, Г - изменение экспрессии al изоформы и аЗ изоформы Na.K-АТРазы, соответственно, выраженное в процентах от контроля, принятого за 100% (п = 3, М ± SEM; ** соответствует достоверному отличию от контроля с р<0,05).

Рис.15. Пролиферация клеток нейробластомы SK-N-AS с дефицитом al и аЗ изоформы №,К-АТРазы. (I I) -контрольные клетки, (о) - клетки, трансфецированпые сиРНК для al изоформы, Д) - клетки, трансфецированпые сиРНК для аЗ изоформы. Ось X -оптическая плотность при 540 нм, ось Y - время после трансфекции, часы (n = 6-12, М ± SEM).

-I—г-

24 48 72 96 120 144 168 192

часы после трансфекции

После 48 ч инкубации клетки с подавленной экспрессией а-изоформ №,К-АТРазы продолжают делиться, как и контрольные клетки, что выражается в нарастании оптической плотности за счет увеличения образования кристаллов формазана живыми клетками (Рис. 15). Однако после 48 ч количество живых клеток начинает сокращаться, в случае дефицита как а1, так и аЗ изоформы фермента, и к 8 суткам (192 ч) только 30% клеток остаются живыми по сравнению с контрольным уровнем. Таким образом, подавление экспрессии как а!, так и аЗ изоформы №,К-АТРазы вызывает гибель клеток, что свидетельствует о том, что подавление экспрессии а1 изоформы №,К-АТРазы не побуждает аЗ изоформу к выполнению компенсаторных функций и наоборот. Это прямо указывает па тот факт, что

обе эти изоформы важны для процессов жизнедеятельности, и, судя по всему, выполняют в клетке различные функции.

Активация Егк1/2 киназы при действии уабаипа на клетки пейробластомы 8К-1Ч-А8 с подавленной экспрессией а1 и аЗ изоформ К-АТРазы. Для того, чтобы оценить вклад различных изоформ №,К-АТРазы в реализацию сигнального каскада, опосредованного связыванием уабаина с а] и аЗ изоформами К-АТРазы, мы оценили активацию Егк 1 /2 киназы в клетках пейробластомы 8К^-А8 с подавленой экспрессии а! I и аЗ изоформы №,К-АТРазы (Рис. 16).

д Уабаин [нЩ В Уабаин (нМ)

О 10 100 1000 о 10 100 1000

1000

Рис. 16. Активация Erkl/2 киназы в клетках пейробластомы SK-N-AS с подавленной экспрессией al (А, Б) или аЗ изоформы (В, Г) Na,К-АТРазы. А, Б - фосфо Erkl/2 кипаза после 180 мин инкубации с уабаином. В, Г - диаграмма зависимости интенсивности сигнала от концентрации уабаина. Ось Y - фосфо Erkl/2 киназа в процентах (п = 4, М ± SEM, р<0,05).

Как видно из Рис. 16 А и Б, подавление экспрессии мРНК al изоформы Na/K-АТРазы не влияет на фосфорилирование Erkl/2 киназы в клетках пейробласгомы SK.-N-AS | при действии уабаина. Повышающиеся концентрации уабаина приводят к появлению фосфорилировапного белка Erkl/2 киназы как в контрольных клетках, гак и в клетках, дефицитных по al изоформе. Противоположенная картина наблюдается при инкубации j клеток с дефицитом аЗ изоформы Na,К-АТРазы после действия на них уабаина (Рис. 16 В, С). В таких клетках даже самая высокая концентрация уабаипа - 1000 нМ не приводит к активации Erkl/2 киназы. Таким образом, в клетках пейробластомы SK-N-AS аЗ изоформа выполняет сигнальную функцию, которую не способна выполнять al изоформа.

3 1006

50-

mfillfl

Уабаин <нИ) 0

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нейроны, экспрсссирующие al и аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi, до настоящего времени остаются малоизученными с точки зрения вовлечения этих изоформ в сигнальные каскады клетки. В своей работе мы показали, что сигнальный каскад, активирующийся в пейрональных клетках, имеет отличие от сигнальных каскадов, активирующихся в клетках почек и кардиомиоцитах при связывании уабаина с №,К-АТРазой. В пейрональных клетках при связывании уабаина с №,К-АТРазой происходит активация Erkl/2 киназы при участии NMDA-рецепторов, вовлеченных в процессы передачи информации, связанные с функционированием пейрональных клеток.

Удаление al или аЗ изоформы №,К-АТРазы приводит через некоторое время к гибели клеток пейробластомы, что указывает на распределение функций a-изоформ Na,K-АТРазы в этих клетках и их не полную взаимозаменяемость - подавление экспрессии одной изоформы не может быть компенсировано работой оставшихся изоформ фермента. В клетках с подавленной экспрессией аЗ изоформы не наблюдается активации Erkl/2 киназы при действии уабаина, что указывает на выполнение этой изоформой преимущественно сигнальной функции, в отличии от al изоформы, чья роль, по-видимому, связана преимущественно с подержанием ионного гомсостаза.

ВЫВОДЫ

1. Действие уабаина на уабаин-чувствитсльную изоформу (аЗ) Na,K-ATPa3bi в нейропалытых клетках приводит к активации Erkl/2 киназы.

2. Активация Erkl/2 киназы в пейрональных клетках определяется ионами кальция и свободными радикалами.

3. В активацию Erkl/2 киназы, опосредованную действием уабаина на Na,K-ATPa3y в пейрональных клеток, вовлечены NMDA-рецепторы.

4. Уабаин-чувствительиая изоформа (аЗ) №,К-АТРазы пейрональных клеток регулирует активность Erkl/2 при участии протеинкиназы С и фосфоинозитол-3-киназы.

5. Подавление экспрессии как al, так и аЗ изоформ №,К-АТРазы приводит к развивающейся во времени гибели клеток нейробластомы SK-N-AS.

6. Подавление экспрессии аЗ изоформы, по не al изоформы Na,lC-ATPa3bi отменяет активацию Erkl/2 киназы при действии уабаина на клетки нейробластомы SK-N-AS.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Boldyrev A.A., Bulygina E.R., Karpova L.V., Akkuratov Е.Е. (2007). Involvement of different conformers of the neuronal Na,K-pump in cell signaling. 7th Int. Conf. on AAA proteins. England. Poster 10.

2. Карпова Л.В., Аккуратов E.E., Булыгипа E.P., Болдырев А.А. (2008). Уабаин-чувствительная и уабаин-резистентная изоформы №,К-АТРазы гранулярных клеток мозжечка регулирует активность МАР-киназы. Биол. мембраны 25(2): 131-136.

3. Karpova L.V., Bulygina E.R., Boldyrev А.А. (2008). Specificity of Na-pump participation in signaling cascade of neuronal cell. 12th Int. Conf. on Na,K-ATPase and related transport ATPases of P-type. Denmark, p. 188.

4. Тунева E.O., Карпова Л.В., Читтур Ш.В., Карпентер Д.О., Джонсон П., Болдырев А.А. (2009). Амилоид-Р и ионы алюминия усиливают повреждение нейронов, опосредованное глутаматными рецепторами NMDA-класса. Биол. мембраны 26(6): 479-^485.

5. Akkuratov Е.Е., Karpova L.V., Boldyrev А.А. (2009). Rat brain Na,K-ATPase is a sensor of oxidative stress. 2nd Int. Workshop on expression, structure and function of membrane proteins. Italy, p. 93.

6. Karpova L.V., Bulygina E.R., Boldyrev A.A. (2010). Different neuronal Na,K-ATPase isoforms are involved in diverse signaling pathways. Cell. Biochem. Func. 28(2): 135-141.

7. Karpova L.V., Eva A., Kirch U., Boldyrev A.A., Scheiner-Bobis G. (2010). Sodium pump al and a3 subunit isoforms mediate distinct responses to ouabain and are both essential for survival of human neuroblastoma. FEBS J., 277: 1853-1860.

Подписано в печать 22.04.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпова, Лариса Викторовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Общая характеристика 1Ча,К-АТРазы.

1.1.1. Структура Ка,К-АТРазы.

1.1.2. Каталитический цикл ИаД-АТРазы.

1.1.3. Йзоформы Иа,К-АТРазы.

1.1.4. Кардиотонические стероиды - специфические ингибиторы ИаД-АТРазы.

1.2. Сигнальные каскады с участием №,К-АТРазы.

1.3. Участие NMDA-peцeптopoв в сигнальных каскадах в нспрональных клетках

1.4. Предпосылки участия NMDA-peцeптopoв в реализации сигнального каскада, опосредованном действием уабаина.

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II.1. Получение суспензии гранулярных клеток из мозжечка крыс.

Н.2. Первичная культура гранулярных клеток мозжечка.

И.З. Условия инкубации гранулярных клеток мозжечка.

11.4. Культивирование клеток нейробластомы 8К-1Ч-А8.

Н.5. Условия инкубации клеток нейробластомы БК-М-Ав.

Н.6. Проточная цитометрия.

11.6.1. Определение уровня свободных радикалов.

11.6.2. Определение уровня внутриклеточного Са2+.

11.6.3. Определение доли мертвых клеток в клеточной суспензии.

11.6.4. Определение типа клеточной смерти.

И.6.5. Определение активности Егк1/2 киназы (р42/44 МАР киназы) в клетках.

11.7. Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

11.7.1. Выделение тотальной мРНК.

11.7.2. Получение кДНК в реакции обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция.

11.7.3. Электрофорез в агарозном геле.

11.8. Подавление биосинтеза мРНК, кодирующих а йзоформы 1Ча,К-АТРазы, малыми интерферирующими РНК (сиРНК).

11.8.1. Тестирование эффективности трансфекции клеток нейробластомы БК-М-ЛЗ.

11.8.2. Липосомная трансфекция клеток нейробластомы БК-Ы-АБ сиРНК.

И.9. Приготовление клеточных лизатов.

11.10. Определение концентрации белка.

11.11. Разделение белков методом электрофореза и вестерн блоттинг.

II. 11.1. Электрофорез в ЗБЗ-полиакрнламидном геле.

II. 11.2. Вестерн блоттинг.

II. 11.3. Метод усиленной хемилюминесценции (ЕСЬ).

11.13. Приготовление образцов для конфокальной микроскопии.

11.14. Статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. 1. Участие 1Ча,К-АТРазы в процессах клеточной сигнализации в нейрональных клетках.

III. 1.1. Эффект уабаина на жизнеспособность нейрональных клеток.

III. 1.2. Эффект уабаина на уровень свободных радикалов и Са2+ в нейрональных клетках.

III. 1.3. Влияние уабаина на активность Егк1/2 киназы в нейрональных клетках.

III. 1.4. Участие протеинкиназ в активации Егк1/2 киназы. вызванной действием уабаина на нейрональные клетки.

Ш.2. Роль а изоформ ^,К-АТРазы в процессах клеточной сигнализации в клетках нейробластомы 8К-1Ч-А8.

111.2.1. Определение изо ферментного состава ИаД-АТРазы и субъединичного состава ^ГОА-рецепторов в клетках нейробластомы ЭК-И-АЗ.

111.2.2. Влияние уабаина на жизнеспособность клеток нейробластомы ЭК-Н-ЛБ.

111.2.3. Активация ключевых белков различных сигнальных каскадов в клетках нейробластомы БК-И-АЗ при действии уабаина.

И.2.4. Подавление биосинтеза а 1 и аЗ изоформ Ка,К-АТРазы в клетках нейробластомы ЭК-И-ЛБ.

111.2.5. Жизнеспособность клеток нейробластомы БК-К-АБ с подавленной экспрессией а! и аЗ изоформ К-АТРазы.

111.2.6. Активация Егк1/2 киназы при действии уабаина на клетки нейробластомы БК-К-АБ с подавленной экспрессией а1 и аЗ изоформ №,К-АТРазы.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках"

Представление о роли облигатного белка Ыа,К-АТРазы (синоним - Na-насос) в жизни клеток помимо выполнения основной функции - поддержание ионных градиентов Na+ и К+, в настоящее время расширилось. Данные о том, что Na,K-ATPa3a способна регулировать экспрессию генов, полученные еще в 70-х годах прошлого столетия, привели в конце 90-х годов к исследованияхм, сконцентрированным на изучении механизмов этой регуляции. Результатами этих исследований стало открытие еще одной важной функции Ыа,К-АТРазы - участие в процессах внутриклеточной сигнализации. Было показано, что №,К-АТРаза в клетках сердца и почек может выступать в роли рецептора кардиотонических стероидов (специфических ингибиторов активности Na,K-ATPa3bi), связывание которых с Na,K-ATPa3oft, приводит к инициации сигнального каскада, завершающегося активацией транскрипционных факторов, регулирующих гены раннего и позднего ответов (Peng et al, 1996; Kometiani et al, 1998; Xie et al, 1999). Детальному исследованию сигнального каскада с участием Na,K-АТРазы подвергались преимущественно кардиомиоциты и эпителиальные клетки почек (Xie, Askari, 2002; Aizman, Aperia, 2003; Akimova et al, 2005).

Известно, что в организме а-субъединица Na,K-ATPa3bi экспрессируется в виде четырех изоформ (al-a4), имеющих различную чувствительность к переносимым ионам Na+ и К+, к ATP (Mobasheri et al, 2000) и к активным формам кислорода (АФК) (Huang et al, 1994; Boldyrev et al, 2003), а у некоторых видов животных и разную чувствительность к кардиотоническим стероидам (Charlemagne et al, 1993). Хотя распределение изоформ фермента в организме является тканеспецифичным, относительно мало исследований направлено на изучение роли разных изоформ Na,K-АТРазы в механизмах клеточной сигнализации.

Наиболее интересным объектом для этой цели, на наш взгляд, являются нейрональные клетки, поскольку Na,K-ATPa3a имеет особое значение для функционирования нервной ткани. Na,K-ATPa3a выполняет в нервной ткани поддержание ионного гомеостаза, сдвигающегося после деполяризации нейрональной мембраны, происходящей в результате электрического возбуждения. В нейрональных клетках до 50% АТФ тратится на осуществление этого процесса. Кроме того, Na,K-ATPa3a в нервной ткани представлена наибольшим количеством из существующих изоформ - al-, а2-и аЗ-изоформами (Urayama etl al, 1989; McGrail et al, 1991; Peng et al, 1997). Известно, что существование нескольких изоформ одного белка предопределяет разнообразие клеточных ответов, и нарушения в работе разных изоформ могут приводить к развитию патологических состояний. Так, показано, что мутации а2 и аЗ изоформ Na,K-ATPa3bi сопряжены с развитием таких нейрональных заболеваний, как паркинсонизм (de Carvalho et al, 2004) и семейная гемиплегическая мигрень II типа (Vanmolkot et al, 2003). Обнаружено, что а2 изоформа отвественна за повышение кровяного давления, в результате накопления уабаина в кровеном русле после продолжительного введение уабаина в организм (Dostanic et al, 2005; Van Huysse, 2007).

Еще одна особенность нервной ткани - это обилие различных глутаматных рецепторов, нарушение функций которых приводит к развитию окислительного стресса и, как следствие, к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний (Boldyrev et al, 2004). Наиболее важными для этих процессов являются глутаматные рецепторы, активирумьте N-метил-D-аспартатом (NMDA).

Возникает вопрос, существует ли взаимодействие между этими наиболее важными для функционирования нервной ткани белками - Na,K-АТРазой и глутаматными рецепторами, активирумые К-метил-Э-аспартатом (или NMDA-рецепторами). Имеется предпосылки в пользу того, что такое взаимодействие существует. Так, например, показано, что гиперактивация NMDA-рецепторов приводит к подавлению активности только а2 и аЗ изоформ, а не al изоформы Na,K-ATPa3bi (Boldyrev et al, 2003). В то же время, остается не ясным, осуществляется ли обратное влияние и приводит ли изменение в активности Ка,К-АТРазы к модификации свойств ИМОА-рецепторов.

Исходя из этого, в данной работе мы предполагали исследовать внутриклеточные события, к которым приводит ингибирующее действие уабаина на работу №,К-АТРазы в нейрональных клетках, а также определить роль разных а изоформ Ыа,К-АТРазы в осуществлении этих событий. Поскольку известно, что в других типах клеток действие уабаина приводит к активации митоген-зависимого сигнального каскада, мы сконцентрировали наши исследования впервую очередь на участниках именно этого сигнального каскада. Кроме того, мы предполагали оценить вовлечение глутаматных рецепторов ММБА-класса в процесс активации сигнального каскада, вызванного действием уабаина на неирональпые клетки.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилась оценка участия разных изоформ а-субъединицы Ма,К-АТРазы в реализации возможного сигнального каскада, активирующегося в нейрональных и подобных им клетках, при действии уабаина. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать активацию Егк1/2 киназы, центрального белка митоген-активируемого сигнального каскада, в нейрональных клетках при действии различных концентраций уабаина

2. Выявить зависимость активации Егк1/2 киназы от свободных радикалов и концентрации внутри- и внеклеточного Са2+ при действии уабаина в нейрональных клетках

3. Выявить участие различных протеинкиназ в активации Егк1/2 киназы в нейрональных клетках

4. Создать клетки с раздельным подавлением в них экспрессии а1 и аЗ изоформ №,К-АТРазы

5. Оценить жизнеспособность клеток, в которых подавлена экспрессия а1 или аЗ изоформы Ма,К-АТРазы при действии уабаина

6. Сравнить активацию уабаином Егк1/2 киназы в клетках с подавленной экспрессией а1 или аЗ изоформы Ыа,К-АТРазы

Научная и практическая новизна

Впервые показано, что в активации Егк1/2 киназы, вызванной ингибированием №,К-АТРазы уабаином в нейрональных клетках, принимают участие ШША-рецепторы. Впервые были созданы разные типы клеток нейробластомы БК-М-АЗ, в которых осуществляется раздельное подавление экспрессии преимущественно а1 или аЗ изоформы №,К-АТРазы с помощью механизма РНК-интерференции и охарактеризовано действие уабаина на их жизнеспособность. Обнаружено, что удаление любой из исследованных изоформ Ка,К-АТРазы приводит к гибели клеток. Это указывает, что в условиях активации сигнального каскада, вызванного ингибирующим действием уабаина на работу На,К-АТРазы, ни одна из исследованных изоформ №,К-АТРазы не способна компенсировать отсутствие другой. Исследование клеток нейробластомы ЭК-И-ЛБ с подавленной экспрессией аЗ изоформы Ыа,К-АТРазы, показало непосредственное участие этой изоформы в активации Егк 1 /2 киназы, что отражает сигнальную роль аЗ изоформы в этих клетках и указывает на функциональные различия изоформ а субъединицы фермента. Полученные данные о сигнальной роли аЗ изоформы в клетках могут стать основой для уточнения молекулярных механизмов различных нейродегенеративных заболеваний, поскольку известно, что их развитие сопряжено с наличием мутаций в гене аЗ изоформы Ка,К-АТРазы (Уапто1ко1:, е1 а!, 2003; с1е СагуаШо Agшar е1 а1, 2004).

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на VII Международной конференции по АТРазам, связанным с различной клеточной активностью (Киренчестер, Англия, 2007), XII Международной конференции по АТРазам Р-типа (Орхус, Дания, 2008). II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010 г). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Карпова, Лариса Викторовна

VI. выводы

1. Действие уабаина на уабаин-чувствительную изоформу (аЗ) №,К-АТРазы в нейрональных клетках приводит к активации Егк1/2 киназы.

2. Активация Егк1/2 киназы в нейрональных клетках зависит и от ионов кальция и от свободных радикалов.

3. В активацию Егк 1 /2 киназы, опосредованную действием уабаина на Ыа,К-АТРазу, в нейрональных клетках вовлечены КМОА-рецепторы.

4. Уабаин-чувствительная изоформа (аЗ) На,К-АТРазы нейрональных клеток регулирует активность Егк1/2 при участии протеинкиназы С и фосфоинозитол-3 киназы.

5. Подавление экспрессии как а1, так и аЗ изоформ №,К-АТРазы приводит к развивающейся во времени гибели клеток нейробластомы БК-М-А8.

6. Подавление экспрессии аЗ изоформы, но не а1 изоформы Ка,К-АТРазы отменяет активацию Егк1/2 киназы при действии уабаина на клетки нейробластомы 8К-1Ч-А8.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность Александру Александровичу Болдыреву за научное руководство. Особую благодарность выражаю Е.Р. Булыгиной. М.С.Степановой. А.В.Прокопенко, которые помогали мне на разных этапах выполнения этой работы, а также профессору О.Д.Лопиной за ценные рекомендации и полезные советы при оформлении диссертации. Благодарю профессора Г. Шайнер-Бобиса, а также А. Ефу и У. Кирх, за предоставленную возможность исследований по проекту № 325 (ДААД, Германия). Я признательна профессору Т. Ямамото, любезно предоставившему ингибитор тирозиновых киназ, использование которого помогло решению поставленных в работе задач. Я глубоко благодарна коллективу кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на которой я получила свое профессиональное образование.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нервная ткань, экспрессирующая al, a2 и a3 изоформы Na,K-ATPa3bi, до настоящего времени остается малоизученной с точки зрения вовлечения этих изоформ в сигнальные системы клетки. В своей работе мы показали, что сигнальный каскад, активирующийся в нейрональных клетках, имеет отличие от сигнальных каскадов, активирующихся в клетках почек и кардиомиоцитах при связывании уабаина с Na,K-ATPa3oñ. В нейрональных клетках при связывании уабаина с Ыа,К-АТРазой происходит активация Erkl/2 киназы при участии NMDA-рецепторов, вовлеченных в процессы передачи информации, связанные с функционированием нейрональных клеток.

Удаление al или аЗ изоформы Na,K-ATPa3bi приводит через некоторое время к гибели клеток нейробластомы, что указывает на распределение функций у разных a изоформ Na,K-ATPa3bi в этих клетках и их не полную взаимозаменяемость - подавление экспрессии одной изоформы не может быть компенсировано работой оставшихся изоформ фермента. В клетках с подавленной экспрессией аЗ изоформы не наблюдается активации Erkl/2 киназы при действии уабаина, что указывает на выполнение этой изоформой преимущественно сигнальной функции, в отличие от al изоформы, чья роль, по-видимому, связана преимущественно с подержанием ионного гомеостаза.

В проделанной работе мы использовали уабаин как инструмент избирательного «выключения» той или иной изоформы фермента, оставляя в стороне вопрос о том, имеется ли аналогичная возможность реализации действия эндогенных уабаин-подобных соединений в условиях функционирования нервной ткани (Schoner, Scheiner-Bobis, 2005). Однако, по нашему мнению, кардиостероиды являются не единственным инструментом регуляции активности Na-насоса in vivo - регуляторный эффект проявляют различные киназы, изменение внутриклеточного соотношения Na/K, АТФ и другие факторы (ВоШугеу й а1, 1997). Все это позволяет считать, что в нейрональной клетке аЗ изоформа ТЧа-насоса регулирует активность внутриклеточных протеинкиназ, ограничивая их активность. Подавление работы Ыа-насоса эндогенными КТС или другими факторами будет включать работу специфических протеинкиназ, модулируя внутриклеточные сигнальные механизмы. Такие представления, основанные на полученных нами данных, могут стимулировать исследование вклада разных изоформ №,К-АТРазы в процессы клеточной сигнализации под влиянием разнообразных природных регуляторов как в норме, так и при развитии нейродегенеративных состояний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Лариса Викторовна, Москва

1. Болдырев, А., Булыгина, Е., Герасимова, О., Ляпина, Л., Шонер, В. (2004). Функциональная взаимосвязь между Na,K-ATPa3oi1 и NMDA-рецепторами в гранулярных клетках мозжечка крыс. Биохимия, 69: 530536.

2. Булыгина, Е.Р., Карпова, Л.В., Степанова, М.С., Болдырев, А.А. Экспериментальная нейрохимия. Практические работы (электронная версия). М. «Икар». 2009.

3. Казей, В.И. (2006). Роль глутаматных рецепторов и Na/K-Hacoca в регуляции окислительного стресса. Дисс. канд. биол. наук, Москва.

4. Лопина О.Д. (2000). №,К-АТРаза: структура, механизм и регуляция. Биол. мембр., 13: 721-744.

5. Лопина О.Д. (2001). Взаимодействие каталической субъединицы Na,K-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия, 66: 1389-1400.

6. Пиндель, Е.В. (1992). Влияние лигандов на конформационного состояние Na,К-АТРазы. Дисс. канд. биол.наук, Москва.

7. Aizman, О., Aperia, А. (2003). Na/K-ATPase as a signal transducer. Ann. NY. Acad. Sci., 986: 489-496.

8. Aizman, O., Uhlen, P., Lai, M., Brismar, H., Aperia, A. (2001). Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 13420-13424.

9. Akera, Т., Brody, T.M. (1977). The role of Na,K-ATPase in the inotropic action of digitalis. Pharmacol. Rev., 29: 187-220.

10. Akimova, O.A., Lopina, O.D., Rubtsov, A.M., Gekle, M., Tremblay, J., Harriet, P., Orlov, S.N. (2009). Death of ouabain-treated renal epithelial cells: evidence for p38 MAPK-mediated Na(i)(+)/K(i)(+)-independent signaling. Apoptosis, 14: 1266-1273.

11. Akiyama, M., Ogura, M., Iwai, M., Iijima, M., Numazawa, S., Yoshida, T. (1999). Effect of bufalin ogrowth and differentiation of human skin carcinoma cells in vitro. Hum. Cell, 12: 205-209.

12. Akiyama, T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., Itoh, N., Shibuya, M., Fukami, Y. (1987). Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. J. Biol. Chem., 262: 5592-5595.

13. Albensi, B.C., Igoechi, C., Janigro, D., Ilkanich, E. (2004).Why do many NMDA antagonists fail, while others are safe and effective at blocking excitotoxicity associated with dementia and acute injury. Am. J. Alzheimer's Dis., 19: 269-274.

14. Alford, S., Brodin, L. (1994). The role of NMDA receptors in synaptic integration and the organization of motor patterns. New York: Oxford University Press.

15. Arystarkhova, E., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., Sweadner, K.J.(1999). The gamma subunit modulates Na and K affinity of the renal Na/K-ATPase. J. Biol. Chem., 274: 33183-33185.

16. Garty, H., Karlish, S.J.D. (2006). Role of FXYD protein in ion transport. Anna. Rev. Physiol., 68: 431-459.

17. S.Arystarkhova, E.,Wetzel, R. K. Asinovski, N.K.,Sweadner, K. J. (1999).The g subunit modulates Na and K affinity of the renal Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 274, 47: 33183-33185.

18. Attali, B., Latter, H., Rachamim, N., Garty, H. (1995). A corticosteroidinduced gene expressing an "IsK-like" K+ channel activity in Xenopus oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6092-6096.

19. Aydemir-Koksoy, A., Abramowitz, J., Allen, J.C. (2001). Ouabain-induced signaling and vascular smooth muscle cell proliferation. J. Biol. Chem., 276: 46605-46611.

20. Bagrov, A.Y. Shapiro, J. I., Fedorova O.V. (2009). Endogenous cardiotonic steroids: physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets. Pharmacol Rev., 61: 9-38.

21. Bear, M.F., Malenka, R.C. (1994). Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr. Opin. Neurobiol., 4: 389.

22. Beguin, P., Crambert, G., Guennoun, S., Garty, H., Horisberger, J.D., Geering, K. (2001). CHIF, a member of the FXYD protein family, is a regulator of Na/K-ATPase distinct from the y-subunit. EMBO J., 20: 39934002.

23. Beguin, P., Crambert, G., Monnet-Tschudi, F„ Uldry, M., Horisberger, J.D., Garty, H., Geering, K. (2002). FXYD7 is a brain-specific regulator of Na/K-ATPase al-pisozymes. EMBO J., 21: 3264-3273.

24. Beguin, P., Wang, X.Y., Firsov, D., Puoti, A., Claeys, D., Horisberger, J.D., Geering, K. (1997). The y-subunit is a specific component of the Na/K-ATPase and modulates its transport properties. EMBO J., 16: 4250-4260.

25. Bertorello, A.M., Katz, A.I. (1993). Short-term regulation of renal Na-K-ATPase activity: physiological relevance and cellular mechanisms. Am. J. Physiol, 265: 743-755.

26. Blanco, G. (2005). Na/K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation. Semin. Nephrol, 25: 292-303.

27. Blanco, G., Mercer, R.W. (1998). Isozymes of the Na/K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol., 275: 633650.

28. Bogaev, R.C., Jia, L.G., Kobayashi, Y.M., Palmer, C.J., Mounsey, J.P., Moorman, J.R., Jones, L.R., Tucker, A.L. (2001). Gene structure and expression of phospholemman in mouse. Gene, 271: 69-79.

29. Boldyrev, A., Bulygina, E., Carpenter, D., Schoner, W. (2003). Glutamate receptors communicate with Na/K-ATPase in rat cerebellum granule cells. J. Mol. Neuroscl, 21: 213-222.

30. Boldyrev, A., Bulygina, E., Yuneva, M., Schoner, W. (2003). Na/K-ATPase regulates intracellular ROS level in cerebellum neurons. Ann. N. Y. Acad. Sci USA., 986: 519-521.

31. Boldyrev, A.A, Bulygina, E.R. (1997). Na/K-ATPase and oxidative stress. Ann. NY. Acad. Sci. USA., 834: 666-668.

32. Brodie, C., Tordai, A., Saloga, J., Domenico, J., Gelfand, E.W. (1995). Ouabain induces inhibition of the progression phase in human T-cell proliferation. J. Cell. Physiol., 165:246-253.

33. Bulygina, E., Gerassimova, O., Boldyrev, A. (2003). Glutamate receptors regulate Na/K-ATPase in cerebellum neurons. Ann. NY. Acad.Sci. USA, 986: 611-613.

34. Burns, E.L., Nicholas, R.A., Price, E.M. (1996). Random mutagenesis of the sheep Na/K-ATPase al subunit generating the ouabain-resistant mutant L793P. J. Biol. Chem., 271: 15879-15883.

35. Charlemagne, D. (1993). Molecular and cellular level of action of digitalis. Herz. 18: 79-85.

36. Chen, B., Roche, K.W. (2009). Growth factor-dependent trafficking of cerebellar NMDA receptors via protein kinase B/Akt phosphorylation of NR2C. Neuron, 62: 471-478.

37. Chen, H.S., Lipton, S.A. (2006). The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists. J. Neurochem., 97: 1611-1626.

38. Chibalin, A.V., Zierath, Jr., Katz, A.I., Berggren, P.O., Bertorello, A.M. (1998). Phosphatidylinositol 3-kinase-mediated endocytosis of renal Na/K-ATPase alpha subunit in response to dopamine. Mol. Biol. Cell, 9: 12091220.

39. Chow, D.C., Forte, J.G. (1995). Functional significance of the |3-subunit for heterodimeric P-type ATOases. J. Exp. Biol., 198: 1-17.

40. Chueh, S.C., Guh, J.H., Jun, C., Lai, M.K., Teng, C.M. (2001). Dual effects of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human prostatic smooth muscle cells. J. Urol., 166: 347-353.

41. Colonna, T., Kostich, M., Hamrick, M., Hwang, B., Rawn, J.D., Fambrough, D.M. (1997). Subunit interactions in the sodium pump. Ann. NY. Acad. Sci. USA, 834:498-513.

42. Courtneidge, S. A. (2002). Role of Src in signal transduction pathways. Biochem. Society Transactions, 30: 11-17.

43. Crambert, G., Fuzesi, M., Garty, H., Karlish, S., Geering, K. (2002). Phospholemman (FXYD1) associates with Na/K-ATPase and regulates its transport properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 11476-11481.

44. Crambert, G., Hasler, U., Beggah, A.T., Yui, C., Modyanov, N., Horisberger, J.-D., Lelievre, L., Geering, K. (2000). Transport and pharmacological properties of nine different human Na/K-ATPase isozymes. J. Biol. Chem., 275: 1976-1986.

45. Crossthwaite, A. J., Valli, H., Williams, R. J. (2004). Inhibiting Src family tyrosine kinase activity blocks glutamate signaling to ERK1/2 and Akt/PKB but not JNK in cultured striatal neurons. J. Neurochem., 88: 1127-1139.

46. Dempski, R.E. Friedrich, T., Bamberg, E. (2005). The subunit of the Na/K-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme. J. Gen. Physiol., 125: 505-520.

47. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S.F. (1999). The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. Rev., 51: 7-61.

48. Dobretsov, M., Stimers, J.R. (2005). Neuronal function and alpha3 isoform of the Na/K-ATPase. Frontiers in Bioscience, 10: 2373-2396.

49. Emanuel, J. R., Garetz, S., Stone, L., Levenson, R. (1987). Differential expression of Na,K-ATPase a- and P-subunit mRNAs in rat tissues and cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Cell Biology, 84: 9030-9034.

50. Emptage, N., Bliss, T.V., Fine, A. (1999). Single synaptic events evoke NMDA receptor-mediated release of calcium from internal stores in hippocampal dendritic spines. Neuron, 22: 115-124.

51. Faller, L.D. (2008). Mechanistic studies of sodium pump. Archives of Biochemistry and Biophysics, 476: 12-21.

52. Fedorova, O.V., Kolodkin, N.I., Agalakova, N.I., Lakatta, E.G., Bagrov, A.Y. (2001). Marinobufagenin, an endogenous a-1 sodium pump ligand, in hypertensive Dahl salt-sensitive rats. Hypertension, 37: 462-466.

53. Fedorova, O.V., Lakatta, E.G., Bagrov, A.Y. (2000). Differential effects of acute NaCl loading on endogenous ouabain-like and marinobufagenin-like ligands of the sodium pump in Dahl hypertensive rats. Circulation, 102: 3009-3014.

54. Feschenko, M.S., Donnet, C., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., Jones, L.R., Sweadner, K.J. (2003). Phospholemman, a single-span membrane protein, is an accessory protein of Na/K-ATPase in cerebellum and choroid plexus. J. Neurosci., 23: 2161-2169.

55. Fu, X., Kamps, M. (1997). E2a-Pbxl induces aberrant expression of tissuespecific and developmentally regulated genes when expressed in NIH 3T3 fibroblasts. Mol. Cell Biol., 17: 1503-1512.

56. Garthwaite, J. (1994). NMD A receptors, neuronal development, and neurodegeneration. New York: Oxford University Press.

57. Gatto, C., Mcloud, S.M., Kaplan J.H. (2001). Heterologous expression of Na/K-ATPase in insect cells: intracellular distribution of pump subunits. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 281: 982-992.

58. Geering, K. (2001). The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases. J. Bioenerg. Biomembr., 33: 425-438.

59. Geering, K. (2006). FXYD proteins: new regulators of Na-K-ATPase, Am. J. Physiol. Renal Physiol, 290: 241-250.

60. Ghosh, A. (2002). Neurobiology. Learning more about NMDA receptor regulation. Science, 295: 449-451.

61. Golden, W.C., Martin, L.J. (2006). Low-dose ouabain protects against exitotoxic apoptosis and up-regulates nuclear Bcl-2 in vivo. Neuroscience, 137: 133-144.

62. Golomb, E., Hill, M.R., Brown, R.G., Keiser, II.R. (1994). Ouabain enhances the mitogenic effect of serum in vascular smooth muscle cells. Am. J. Hypertens., 7: 69-74.

63. Grewal, S.S., York, R.D., Stork, P.J.S. (1999). Extracellular-signal-regulated kinase signalling in neurons. Curr. Opin. Neurobiol., 9: 544-553.

64. Haas, M., Askari, A., Xie, Z. (2000). Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal-transducing function of Na/K-ATPase. J.Biol. Chem., 275: 27832-27837.

65. Haas, M., Wang, H., Tian, J., Xie, Z. 2002. Src-mediated inter-receptor cross-talk between the Na/K-ATPase and the epidermal growth factor receptor relays the signal from ouabain to mitogen-activated protein kinases. J.Biol. Chem., 277: 18694-18702.

66. Hamlyn, J.M., Blaustein, M.P., Bova, S., DuCharme, D.W., Harris, D.W., Mandel, F., Mathews, W.R., Ludens, J.H. (1991). Identification and characterization of an ouabain-like compound from human plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 6259-6263.

67. Hieber, V., Siegel, G.J., Fink, D.J., Beaty, M.W., Mata, M. (1991). Differential distribution of Na, K-ATPase alpha isoforms in the central nervous system. Cell Mol. Neurobiol, 11: 253-62.

68. Huang, W.H., Wang, Y., Askari, A. (1992). Na/K-ATPase: inactivation and degradation induced by oxygen radicals. Int. J. Biochem24: 621-624.

69. James, P.F. Grupp, I. L., Grupp, G., Woo, A. L., Askew, G. R., Croyle, M. L., Walsh, R.A., Lingrel, J.B. (1999). Identification of a specific role for the Na/K-ATPase a2 isoform as a regulator of calcium in the heart. J. Mol. Cell, 3: 555-563.

70. Jorgensen, P. L., Hakansson, K.O., Karlish, S. J. D. (2003). Structure and mechanism of Na/K-ATPase: Functional sites and their interactions. Annu. Rev. Physiol., 65: 817-849.

71. Kaplan, J.H. (2002). Biochemistry of Na/K-ATPase. Annu. Rev. Biochem., 71: 511-535.

72. Kawamura, A., Guo, J., Itagaki, Y., Bell, C., Wang, Y., Haupert, G.T.Jr., Magil, S., Gallagher, R.T., Berova, N., Nakanishi, K. (1999). On the structure of endogenous ouabain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 66546659.

73. Kawazoe, N., Watabe, M. Masuda, Y., Nakajo, S., Nakaya, K. (1999). Tiaml is involved in the regulation of bufalin-induced apoptosis in human leukemia cells. Oncogene, 18: 2413-2421.

74. Ko, II. W., Park, K. Y., Kim, H., Han, P. L., Kim, Y. U., Gvvag, B. J., Choi, E. J. (1998). Ca2+-mediated activation of c-Jun N-terminal kinase and nuclear factor kappa B by NMDA in cortical cell cultures. J. Neurochem., 71: 1390-1395.

75. Kometiani, P., Li, J., Gnudi, L., Kahn, B.B., Askari, A., Xie, Z. (1998). Multiple signal transduction pathways link Na/K-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes. J.Biol. Chem., 273: 15249-15256.

76. Krapivinsky G., Krapivinsky L., Manasian Y., Ivanoy A., Tyzio R., Pellegrino C., Ben-Ari Y., Clapham D. E. and Medina I. (2003). The NMDA receptor is coupled to the ERK pathway by a direct interaction between NR2B and RasGRFl. Neuron, 40: 775-784.

77. Kulikov, A., Eva, A., Kirch, U., Boldyrev, A., Scheiner-Bobis, G. (2007). Ouabain activates signaling pathways associated with cell death in human neuroblastoma. Biochimica et. Biophysica Acta, 1768: 1691-1702.

78. Kuner, T., Seeburg, P.H., Guy, H.R. (2003). A common architecture for K+ channels and ionotropic glutamate receptors. Trends Neurosci., 26: 27-32.

79. Kurella, E.G., Tyulina, O.V., Boldyrev, A.A. (1999). Oxidative resistance of Na/K-ATPase. Cell Molec. Neurobiol., 19: 133-140.

80. Law, A.J., Weickert, C.S., Webster, M.J., Herman, M.M., Kleinman. J.E., Harrison, P.J. (2003). Expression of NMDA receptor NR1, NR2A and NR2B subunit mRNAs during development of the human hippocampal formation. Eur. J. Neurosci., 18: 1197-1205.

81. Leonard, A.S., Hell, J.W. (1997). Cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase C phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites. J. Biol. Chem., 272: 12107-12115.

82. Levenson, R. (1994). Isoforms of the Na/K-ATPase: family members in search of function. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 123: 1-45.

83. Li, W., Cha, L. (2007). Predicting siRNA efficiency. Cell. Mol. Life Set, 64: 1785-1792.

84. Liang, M., Cai, T., Tian, J., Qu, W., Xie, Z. (2006). Functional characterization of Src-interacting Na/K-ATPase using RNA interference assay. J. Biol Chem. 281: 19709-19719.

85. Lingrel, J. B„ Kuntzweiler, T. (1994). Na/K-ATPase. J. Biol. Chem., 269: 19659-19662.

86. Lipton, S.A. (2006). Paradigm shift in neuroprotection by NMDA receptor blockade: Memantine and beyond. Nat. Rev. Drug Discov., 1-11.

87. Liu, J., Kesiry, R., Periyasami, S. M., Malhotra, D., Xie, Z., Shapiro, J. (2004). Ouabain induces endocytosis of plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by a clathrin-dependent mechanism. Kidney Int., 66: 227241.

88. Liu, J., Tian, J., Haas, M., Shapiro, J.I., Askari, A., Xie, Z. (2000). Ouabain interaction with cardiac Na/K-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J. Biol. Chem., 275: 27838-27844.

89. Liu, L., Abramowitz, J., Askari, A., and Allen, J.C. (2004). Role of caveolae in ouabain-induced proliferation of cultured vascular smooth muscle cells of the synthetic phenotype. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 287: 2173-2182.

90. Liu, L., Mohammadi, K., Aynafshar, B., Wang, H., Li, D., Liu, J., Ivanov, A. V., Xie, Z., Askari, A. (2003). Role of caveolae in signal-transducing function of cardiac Na/K-ATPase. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 284: 15501560.

91. Liu, L., Zhao, X., Pierre, S. V., Askari A. (2007). Association of PI3K-Akt signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 293: 1489 -1497.

92. Liu, X., Spicarova, Z., Rydholm, S., Li, J., Brismar, H., Aperia, A. (2008). Ankyrin B modulates the function of Na/K-ATPase/Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor signaling microdomain, J. Biol. Chem., 283: 1146111468.

93. Lo,C.S., August,T.R., Liberman, U.A., Edelman, I.S. (1976). Dependence of renal (Na+-K+)-adenosine triphosphatase activity on thyroid status. J.Biol. Chem., 251: 7826-7633.

94. Lynch, D.R., Guttmann, R.P. (2001). NMDA receptor pharmacology: perspectives from molecular biology. Curr. Drug Targets, 2: 215-231.

95. MacDonald, J.F., Kotecha, S.A., Lu, W.Y., Jackson, M.F. (2001). Convergence of PKC-dependent kinase signal cascades on NMDA receptors. Curr. Drug Targets, 2: 299-312.

96. Mahmmoud, Y.A., Cornelius, F. (2002). Protein kinase C phosphorylation of purified Na/K-ATPase: C-terminal phosphorylation sites at the a- and y-subunits close to the inner face of the plasma membrane. Biophys. J., 82: 1907-1919.

97. Marks. M. J., Seeds, N.W. (1978). A heterogeneous ouabain ATPase interaction in mouse brain. Life Sci., 23: 2735-2744.

98. Mathews, W.R, DuCharme, D.W., Hamlyn, J.M., Harris, D.W., Mandel, F., Clark, M.A., Ludens, J.H. (1991). Mass spectral characterization of an endogenous digitalis like factor from human plasma. Hypertension, 17: 930935.

99. McConkey, D.J., Lin, Y., Nutt, L.K., Ozel, H.Z., Newman, R.A. (2000).j i

100. Cardiac glycosides stimulate Ca increases and apoptosis in androgen-independent, metastatic human prostate adenocarcinoma cells. Cancer Res., 60: 3807-3812.

101. McGrail, K., Phillips, J.M., Sweadner, K.J. (1991). Immunofluorescent localization of three Na/K-ATPase isozymes in the rat central nervous system: both neurons and glia can express more than one Na/K-ATPase. J. Neurosci., 11: 381-391.

102. Mcllhinney, R.A., Philipps, E., Le Bourdelles, B., Grimwood, S., Wafford, K., Sandhu, S., et al (2003). Assembly of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Biochem. Soc. Trans., 31: 865-868.

103. Mercer, R. W. (1993). Structure of the Na/K-ATPase. Int. Rev. Cytol., 137: 139-168.

104. Mercer, R.W., Biemesderfer, D., Bliss, D.P., Collins, J.H., Forbush, B. (1993b). Molecular cloning and immunological characterization of the y-polypeptide, a small protein associated with the Na/K-ATPase. J. Cell. Biol., 121: 579-586.

105. Mohammadi, K., Kometiani, P., Xie, Z., Askari, A. (2001). Role of protein kinase C in the signal Pathways that link Na/K-ATPase to ERK1/2. J. Biol. Chem., 276: 42050-42056.

106. Morris, R.G.M., Davis. M. (1994). The role of NMDA receptors in learning and memory. 2nd Ed. New York: Oxford University Press.

107. Morth, J. P., Pedersen, B.P., Toustrup-Jensen, M.S., Sorensen, T. L.-M., Petersen, J., Andersen, J.P., Vilsen, B., Nissen, P. (2007). Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature, 450: 1043-1050.

108. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65: 55-63.

109. Palmer, C.J., Scott, B.T., Jones L.R. (1991). Purification and complete sequence determination of the major plasma membrane substrate for cAMP-dependent protein kinase and protein kinase C in myocardium. J. Biol. Chem., 266: 11126-11130.

110. Panayiotidis, M.I., Bortner, C.D., Cidlowski, J.A. (2006). On the mechanism of ionic regulation of apoptosis: would the Na+/K+-ATPase please stand up? Acta Physiol (OxJ% 187:205-215.

111. Peng, L, Martin-Vasallo, P., Sweadner K. J. (1997). Isoforms of Na/K-ATPase alpha and beta subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures. J. Neuroscl, 17: 3488-3502.

112. Peng, M., Huang, L., Xie, Z., Huang, W.-H., Askari, A. (1996). Partial inhibition of Na/K-ATPase by ouabain induces the Ca2+-dependent expressions of early-response genes in cardiac myocytes, J. Biol. Chem., 271: 10372-10378.

113. Pierre, S. V., Sottejeau, Y., Gourbeau, J.M., Sanchez, G., Shidyak, A., Blanco, G. (2008). Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling. Am. J. Physiol. Renal Physiol., 294: 859-866.

114. Pierre, S.V., Xie, Z. (2006). The Na/K-ATPase receptor complex its organization and membership. CellBioch. Bioph., 46: 303-315.

115. Rafiki, A., Bernard, A., Medina, I., Gozlan, H., Khrestchatisky, M. (2000). Characterization in cultured cerebellar granule cells and in the developing rat brain of mRNA variants for the NMDA receptor 2C subunit. J. Neurochem., 74: 1798-1808.

116. Rose, A.M., Valdes, R.Jr. (1994). Understanding the sodium pump and its relevance to disease. J. Clin. Chem., 40: 1674-1685.

117. Rose, E.M., Koo, J.C. P., Antflick, J.E., Ahmed, S.M., Angers, S. Hampson, D.R. (2009). Glutamate transporter coupling to Na/K-ATPase. J. Neurosci., 29: 8143-8155.

118. Roskoski Jr, R. (2005). Src kinase regulation by phosphorylation and dephosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 331: 1-14.

119. Scheiner-Bobis, G., Schoner, W. (2001). A fresh facet for ouabain action, Nature Med., 7: 1288-1289.

120. Schneider, R., Wray, V., Nimtz, M., et al (1998). Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump. J. Biol. Chem., 273: 784-792.

121. Schoner, W. (2000). Ouabain, a new steroid hormone of adrenal gland and hypothalamus. J. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 108: 449-454.

122. Schoner, W. (2002). Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur. J. Biochem., 269: 2440-2448.

123. Schoner, W., Scheiner-Bobis, G. (2005). Endogenous cardiac glycosides: hormones using the sodium pump as signal transducer. Semin Nephrol., 25: 343-351.

124. Schoner, W., Scheiner-Bobis, G. (2007). Endogenous and exogenous cardiac glycosides: their roles in hypertension, salt metabolism, and cell growth. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 293: 509-536.

125. Schwartz, A., Lindenmeyer, G.E., Allen, J.C. (1975). The sodium-potassium adenosine triphosphatase: Pharmacological, physiological and biochemical aspects. Pharm. Rev., 27: 3-137.

126. Shamraj, O. I., Lingrel, J. B. (1994). A putative fourth Na/K- ATPase a subunit gene is expressed in testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1295212956.

127. Shinoda, T., Ogawa, H., Cornelius, F., Toyoshima. C., (2009). Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4A° resolution, Nature, 459: 446-451.

128. Shull, G. E., Greeb, J., Lingrel, J.B. (1986). Molecular cloning of three distinct forms of the Na/K-ATPase a subunit from rat brain. Biochemistry, 25: 8125-8132.

129. Shull, G. E., Schwartz, A., Lingrel. J. B. (1985). Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the (Na/K)-ATPase deduced from a complementary DNA. Nature, 316: 691-695.

130. Skou, J. (1988). The Na/K-pump. Methods Enzymol., 156: 1-25.

131. Soga, T.M., Nakayama, T., Inoue, N. (2001). Expression and regulation of Na pump isoforms in cultured cerebellar granule cells. J. Neuroreport, 12: 829-832.

132. Stelmashook, E.V., Weih, M., Zoro, D., Victorov, I., Dirnagl, U., Isaev, N. (1999). Short-term block of Na/K-ATPase in neuro-glial cell cultures of cerebellum induces glutamate dependent damage of granule cells. FEBS Letters, 456: 41-44.

133. Su, B., Karin, M. (1996). Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Curr. Opin. Immunol., 8: 402-411.

134. Sweadner, EC. J. (1979). Two molecular forms of (Na/K)-stimulated ATPase in brain. Separation, and difference in affinity for strophanthidin. J. Biol. Chem., 254: 6060-6067.

135. Sweadner, K.J., Rael, E. (2000). The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics, 68: 41-56.

136. Sweadner, K.J., Rael, E. (2000). The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics, 68: 41-56.

137. Szamel, M., Schneider, S., Resch, K. (1981). Functional interrelationship between (Na -K)-ATPase and lysolecithin acyltransferase in plasma membrane of mitogen-stimulated rabbit thymocytes. J. Biol. Chem., 256: 9198-9204.

138. Szamel, M., Resch, K. (1981). Inhibition of lymphocyte activation by ouabain interference with the early activation of membrane phospholipid metabolism. Biochim. Biophys. Acta, 647: 297-301.

139. Therien, A.G., Blostein, R. (2000). Mechanisms of sodium pump regulation. Am. J. Physiol. Cell Physiol, 279: 541-566.

140. Therien, A.G., Pu, H.X., Karlish, S.J., Blostein, R. (2001). Molecular and functional studies of the gamma subunit of the sodium pump. J. Bioenerg. Biomembr., 33: 407-414.

141. Thomas, R., Gray, P., Andrews, J. (1990). Digitalis: its mode of action, receptor, and structure-activity relationships. Adv. Drug Res., 19: 311-562.

142. Thompson, C.L., Drewery, D.L., Atkins, H.D., Stephenson, F.A., Chazot, P.L. (2000). Immunohistochemical localization of N-methyl-D-aspartate receptor NR1, NR2A, NR2B and NR2C/D subunits in the adult mammalian cerebellum. Neurosci. Lett., 283: 85-88.

143. Thornton, T.M., Rincon, M. (2009). Non-classical p38 Map kinase functions: cell cycle checkpoints and survival. Int. J. Biol. Sci., 5: 44-52

144. Tian, J., Cai, T., Yuan, Z., Wang, H., Liu, L., Haas, M., Maksimova, E., Huang, X., Xie, Z. (2006). Binding of Src to Na/K-ATPase forms a functional signaling complex. Mol.Biol.Cell, 17: 317-326.

145. Tian, J., Li, X., Liang, M., Liu, L., Xie, J.X., Ye, Q., Kometiani, P., Tillekeratne, M., Jin, R., Xie, Z. (2009). Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cell growth. J. Biol. Chem., 284: 14921-14929.

146. Tian, X., Gotoh, T., Tsuji, K., Lo, E. H., Huang, S., Feig, L. A. (2004). Developmental regulated role for Ras-GRFs in coupling NMDA glutamate receptors to Ras, Erk and CREB. EMBO, 23: 1567-1575.

147. Tingley, W.G., Roche, K.W., Thompson, A.K., Huganir. R.L. (1993). Regulation of NMDA receptor phosphorylation by alternative splicing of the C-terminal domain. Nature, 364: 70-73.

148. Toyoshima, C., Nakasako, M., Nomura, H., Ogawa, H. (2000). Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6A resolution. Nature, 405: 647-655.

149. Uddin, M.N., Horvat, D., Glaser, S. S. Mitchell, B. M., Puschett J.B. (2008). Examination of the cellular mechanisms by which marinobufagenin inhibits cytotrophoblast function. J. Biol. Chem., 283:17946-1795.

150. Urayama, O., Shutt, H., Sweadner, K.J. (1989). Identification of three isozyme proteins of the catalytic subunit of the Na/K-ATPase in rat brain. J. Biol. Chem., 264: 8271-8280.

151. Van Huysse, J.W. (2007). Endogenous brain Na pumps, brain ouabain-like substance and the alpha2 isoform in salt-dependent hypertension. Pathophysiology, 14: 213-220.

152. Venkateswarlu, K., Cullen, P. J. (1999). Molecular cloning and functional characterization of a human homologuc of centaurin-alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun., 262: 237-244

153. Wang, H., Haas, M., Liang, M., Cai, T., Tian, J., Li, S., Xie, Z. (2004). Ouabain assembles signaling cascades through the caveolar Na/K-ATPase. J. Biol. Chem., 279: 17250-17259.

154. Wang, J. Q., Tang, Q., Parelkar, N. K., Liu, Z., Samdani, S., Choe, E. S., Yang, L., Mao, L. (2004). Glutamate signaling to Ras-MAPK in striatal neurons. Mol. Neurobiol., 29: 1-14.

155. Wang, J., Velotta, J. B., McDonough, A. A., Farley, R. A. (2001). All human Na(+)-K(+)-ATPase alpha-subunit isoforms have a similar affinity for cardiac glycosides. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 281: 1336-1343.

156. Wang, J.Q., Fibuch E.E., Mao, L. (2007). Regulation of mitogen-activated protein kinases by glutamate receptors. J. Neurochem., 100: 1-11.

157. Watabe, M., Ito, K., Masuda, Y., Nakajo, S., Nakaya, K. (1998). Activation of AP-1 is required for bufalin-induced apoptosis in human leukemia U937 cells. Oncogene, 16: 779-787.

158. Watabe, M., Kawazoe, N., Masuda, Y., Nakajo, S., Nakaya, K. (1997). Bcl-2 protein inhibits bufalin induced apoptosis through inhibition of mitogen-activated protein kinase activation in human leukemia U937 cells. Cancer Res., 57: 3097-3100.

159. Waxman, E.A., Lynch, D.R. (2005). N-methyl-D-aspartate receptor subtypes: multiple roles in excitotoxicity and neurological disease. Neuroscientist, 11:37-49.

160. West, A.E., Chen, W.G., Dalva, M.B., Dolmetsch, R.E., Kornhauser, J.M., Shaywitz, A.J, Takasu, M.A., Tao, X., Greenberg, M.E. (2001). Calciumregulation of neuronal gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 11024-11031.

161. Woo, A.L., James, P.F., Lingrel J.B. (1999). Characterization of the fourth alpha isoform of the Na/K-ATPase. J. Membrane Biol., 169: 39-44.

162. Xiao, A.Y., Wei, L., Xia, S., Rothman, S., Yu, S.P. (2002). Ionic mechanism of ouabain-induced concurrent apoptosis and necrosis in individual cultured cortical neurons. J. Neurosci., 22: 1350-1362.

163. Xie, Z., Askari, A. (2002). Na/K-ATPase as a signal transducer. Eur. J. Biochem., 269: 2434-2439.

164. Xie, Z., Koinctiani, P., Liu, Li, J.J., Shapiro, J.I., Askari, A. (1999). Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na/K-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes. J. Biol. Chem., 274: 19323-19328.

165. Xie, Z., Wang Y., Askari, A., Huang, W., Klaunig, J.E., Askari, A. (1990). Studies on the specificity of the oxygen free radical effects on cardiac sodium pump. J. Mol. Cell. Cardiol., 22: 911-920.

166. Yuan, Z., Cai, T., Tian, J., Ivanov, A.V., Giovannucci, D.R., Xie, Z. (2005). Na/K-ATPase tethers phospholipase C and IP3 receptor into a calcium-regulatory complex. Mol. Biol.Cell, 16: 4034-4045.

167. Zhang, S., Malmersjo, S., Li, J., Ando, H., Aizman, O., Uhlen, P., Mikoshiba, K., Aperia, A. (2006). Distinct role of the N-terminal tail of the Na/K-ATPase catalytic subunit as a signal transducer, J. Biol. Chem., 281: 21954-21962.

168. Zhang, X.Q., Qureshi, A., Song, J., Carl, L.L., Tian, Q., Stahl, R.C., Carey, D.J., Rothblum, L.I., Cheung, J.Y. (2003). Phospholemman modulates

169. Zhao, H., Pestov, N.B., Korneenko, T.V., Shakhparonov, M.I., Modyanov, N.N. (2004). Accumulation of beta (m), a structural member of X,K-ATPase beta-subunit family, in nuclcar envelopes of perinatal myocytes. Am. J. Physiol., 286: 757-767.

170. Zhou, X., Jiang, G., Zhao, A., Bondeva, T., Hirszel, P., Balla, T. (2001). Inhibiton of Na/K-ATPase activates PI3 kinase and inhibits apoptosis in LLC-PK1 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 285: 46-51.

171. Services/Applications/Cell-Culture/Transfection/RNAi

172. Transfection/Transfection-Reagent-FAQs.htmlhttp://www.cellsignal.com/1. Цитируемые Интернет-сайты

Информация о работе

Карпова, Лариса Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Участие α-изоформ Na,K-ATPазы в активации ERK1/2 киназы в нейрональных и подобных им клетках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы