Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние транскрипционного фактора Dlx5 на онкотрансформацию T-лимфоцитов у трансгенных мышей, экспрессирующих активированную форму протеинкиназы Akt2

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние транскрипционного фактора Dlx5 на онкотрансформацию T-лимфоцитов у трансгенных мышей, экспрессирующих активированную форму протеинкиназы Akt2"

На правах рукописи 005010028

ТИМАХОВ РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА DIx5 НА ОНКОТРАНСФОРМАЦИЮ Т-ЛИМФОЦИТОВ У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АКТИВИРОВАННУЮ ФОРМУ ПРОТЕИНКИНАЗЫ Akt2

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

і с о:з ¿сії

Москва - 2012

005010028

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Фаворова Ольга Олеговна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Защита состоится "2" марта 2012 года в 11.00 часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, НИИ физикохимической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан "4." февраля 2012 года.

Коробко Игорь Викторович

кандидат биологических наук

Зборовская Ирина Борисовна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной клинической практике для борьбы с онкологическими заболеваниями используется широкий набор лекарственных средств, однако даже при использовании всех доступных препаратов доля больных, отвечающих на терапию, очень невелика. Это свидетельствует о необходимости разработки новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний, основанных на глубоком понимании молекулярных механизмов канцерогенеза.

За прошедшее время было выяснено, что в механизмах канцерогенеза одну из ключевых ролей играют протеинкиназы. Так, у мышей было идентифицировано семейство, включающее три изоформы Akt-протеинкиназ, гомологичных онкобелку v-akt. Показано, что Akt-киназы играют ключевую роль в процессах онкотрансформации, контролируя такие важные процессы как пролиферация и выживаемость, стабильность генома, клеточный размер/рост, метаболизм глюкозы и неоваскуляризацию. Стало очевидно, что Akt-киназы -важные участники сигнального каскада, состоящего из таких белков как PI3K, PTEN, mTOR, eIF4E и NF-kB. В то же время была обнаружена частая гиперактивация АКТ-киназ в опухолях человека, а в дальнейшем показано, что большинство из белков АКТ каскада ассоциировано с развитием онкологических заболеваний.

Исследования in vivo показали, что повреждения отдельных звеньев сигнального каскада Akt (АКТ) приводят к развитию новообразований, а кооперация с другими онкогенами определяет возникновение более агрессивных фенотипов. Однако, было установлено, что конститутивная активация той или иной изоформы самой Akt-киназы в клетках молочной железы, простаты и поджелудочной железы трансгенных модельных мышей не приводит к опухолеобразованию, тогда как в незрелых Т-клетках происходит раковое перерождение. Наличие у этих мышей латентного периода продолжительностью в 10-20 недель, предшествующего развитию злокачественных лимфом, позволил предположить, что механизм генерации лимфом является опосредованным, и для полной трансформации требуются дополнительные генетические события/участники.

Цель и задачи работы. Целью этой работы было выяснение на моделях трансгенных мышей механизмов онкотрансформации, происходящей при активации протеинкиназы Akt2 в Т-лимфоцитах.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать трансгенные линии мышей, в которых используется Lek промотор для запуска экспрессии конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 на ранних стадиях развития тимоцита; у этих Lck-MyrAkt2 мышей изучить случаи спонтанного опухолеобразования и цитогенетические изменения, возникающие в Т-клеточных лимфомах.

2. Идентифицировать гены, затронутые хромосомными перестройками у Lck-MyrAkt2 мышей, и показать, что они обладают онкогенным потенциалом.

3. Разработать низкомолекулярные ингибиторы для продуктов найденных генов и выяснить, блокируют ли эти молекулы пролиферацию Lck-MyrAkt2 лимфомных клеток, содержащих специфические хромосомные перестройки.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получена новая Akt-трансгенная мышиная модель, уникальной особенностью которой является способность развивать опухоли спонтанно. При кариотипировании развивающихся злокачественных лимфом в нескольких независимых линиях мышей наблюдали две повторяющиеся от опухоли к опухоли (recurrent) соматические хромосомные абберации, затрагивающие локусы генов Т-клеточных рецепторов: транслокацию хромосом 14 и 15 t( 14; 15) и инверсию хромосомы 6

- inv(6). Показано, что результатом транслокации t( 14; 15) является повышение экспрессии известного онкогена с-шус.

Что касается инверсии хромосомы 6, то ее границы затрагивают ген эмбрионального транскрипционного фактора Dlx5, что приводит к драматическому повышению продукции последнего. Впервые показано, что ген Dlx5 является онкогеном: сверхэкспрессия Dlx5 в клетках мыши вызывает повышение пролиферативной активности, а подавление его экспрессии с помощью РНК-интерференции, напротив, снижает пролиферативный потенциал клеток. Сверхэкспрессия гена DLX5 была обнаружена в клинических образцах 3 из 7 исследованных лимфом человека. По результатам скрининга панели образцов опухолей человека NCI-60 экспрессия DLX5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.

На основании анализа кристаллической структуры транскрипционного фактора DLX5 предсказано несколько десятков химических структур его лигандов. После тестирования на культурах клеток 14-ти предсказанных соединений для 2 из них впервые показана специфическая способность блокировать пролиферацию Ак12-трансгенных лимфомных клеток мыши с инверсией хромосомы 6, характеризующихся повышенной экспрессией Dlx5, в отличие от Akt2-трансгенных лимфомных клеток, не экспрессирующих Dlx5.

Поиск и изучение молекулярных процессов, вовлеченных в развитие опухолей, является необходимым условием для создания новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний. Настоящая работа позволила идентифицировать ген Dlx5 (DLX5) как ранее неизвестный онкоген, который может служить мишенью для терапевтического воздействия при Т-клеточных лимфомах, а, возможно, и при других злокачественных новообразованиях, и выявила несколько перспективных низкомолекулярных ингибиторов белка DLX5.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” и “14th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” (Филадельфия, США, 2008 и 2009 гг), на научной конференции Фокс-Чейзовского Онкологического центра, Филадельфия, США (2007 г) и на семинарах кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (2009 и 2011 г). Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы . Работа изложена на 108 страницах и включает 23 рисунка, 1 таблицу. Список литературы содержит 185 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа с трансгенными животными Линии трансгенных мышей были созданы с использованием ранее охарактеризованного вектора (Mende et al 2001) на основе мышей линии С57Ы6. Мыши были генотипированы с помощью ПЦР с использованием праймеров для НА (hemagglutinin-tag) и Akl2.

Выделение, генотинирование и секвенирование нуклеиновых кислот. Для выделения ДНК использовали набор GENTRA PUREGEN или Qbiogene Genclean III. Плазмиды выделяли с помощью наборов QIAGEN Maxi prep и Qbiogene RapidPure. Для выделения РНК использовали наборы Qiagen RNeasy, RNAqueous® или Invitrogen TRIZOL. Для генотипирования использовали полимеразу Taq (Invitrogen). Для секвенирования центромерной точки разрыва использовали полимеразу Platinum Taq (Invitrogen). Праймеры для границ инверсии: 5’ atagagacttgcactaaaggtgagggt 3' и 5’ tcacttagccaattctaccacaaagc 3'. Пробы для оценки экспрессии генов с-тус, DlxS и ТЬр синтезированы фирмой «Applied Biosystems». Культивирование клеток проводили на среде Iscove’s MDM, содержащей 10% ЭТС, или среде RPMI с 10% ЭТС. Пролиферацию клеток оценивали с помощью набора Celltiter 96 Aqueous One Solution Assay («Promega»).

FISH гибридизация. Для создания зонда использовали Invitrogen BioPrime DNA labeling System (SpectrumOrange-dUTP/SpectrumGreen-dUTP Vysis). Зонды очищали на колонке

AmershamBiosciense MicroSpim G-50, прегибридизовали с мышиной ДНК Cotí (Invitrogen) и растворяли в Hybrisol VII (Q Biogene). Слайды окрашивали DAPI (Roche Diagnostics). РНК-интереференция. Последовательности, использованные для нокдауна экспрессии 01x5, были выбраны с использованием siRNA Design Tools (Ambion). Синтезированные короткошпилечные олигонуклеотиды были включены в вектор pLVTHM. Клетки котрансфицировали лентивирусным вектором, упаковочной плазмидой и плазмидой, содержащей гены оболочки.

Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах (array CG HJ. Определение копийности ДНК проводили согласно протоколу для анализа геномной ДНК Agilent’s Oligonucleotide Array-based CGH protocol, Version 4.0. Геномную ДНК в количестве 0.5-3 мкг из лимфомных клеток обрабатывали рестриктазами A luí и Rsa\. ДНК метили с использованием набора Agilent’s Genomic DNA Labeling Kit PLUS красителями цианин-5 -dUTP либо цианин-3’-dUTP, продукты были очищены на колонках Microcon YM-30 (Millipore, Billerica, Massachusetts). Количество ДНК и включение метки определяли на спектрофотометре ND-1000. Образец гибридизовали на микрочипах Agilent 244К Mouse Genome CGH Microarray (G4415A) с использованием гибридизационной камеры SureHyb. Слайды анализировали с использованием сканера Agilent. Выходные файлы анализировали в программе Agilent’s CGH Analytics for DNA.

Молекулярный докинг соединений из исходной библиотеки производили на жесткую структуру белка DLX5 2DJN, взятую из базы Protein Data Bank (PDB). Для молекулярного докинга выделяли область на трехмерной структуре размером 20 х 20 х 20А. Лиганды с наилучшими предсказанными энергиями связывания исследовали in vitro.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание линий грансгепных мышей LCKmyrAkt2, спонтанно развивающих агрессивные Т-клеточные лимфомм

Создание трансгенных мышиных моделей, в клетках которых селективно сверхпродуцируется белок Akt2, дает возможность установить роль этого белка in vivo. С

использованием ранее

описанного вектора Lck-MyrAkt2 (Mende et al., 2001), который содержит Lek промотор для запуска на ранних стадиях развития тимоцита экспрессии

конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 (MyrAkt2), было получено шесть трансгенных линий Lck-MyrAkt2 мышей. Животных трех линий (42, 55 и 72) наблюдали в течение длительного времени с целью оценки вероятности опухолеобразования и агрессивности опухолей. В этих линиях в 95-100% случаев развивались спонтанные Т-клеточные лимфомы

Рис. 2. Сверхэкспрессия с-Мус в Т-клеточных лимфомах LCK-myr-Akt2 трансгенных мышей линий 42, 55 и 72 {первые цифры в номерах образцов опухолей), по сравнению с тимоцитами дикого типа (WTI. WT2), по данным вестерн-блоттинга. Также наблюдается активация Akt/mTor сигнального каскада,

выражающаяся в повышении уровней фосфорилированной Akt (p-Akt), mTor и р-mTor.

с медианой выживаемости от 75 до 140 дней (Рис. 1). Иммуноблоттинг белков выявил в опухолях по сравнению с тимоцитами дикого типа повышенный уровень Akt2 (за счет экспрессии MyrAkt2 трансгена), а также повышенные уровни с-Мус и активацию сигнального каскада Akt/mTor (Рис. 2). Для каждой из шести трансгенных линий проведено

Days

Рис. 1. Кривые выживаемости Ьск-МугАШ трансгенных мышей линий 42, 55 и 72. Усреднены данные по 30 животным каждой линии.

кариотипирование нескольких опухолей. У мышей линии 42 во всех 15 кариотипированных лимфомах обнаруживалась одинаковая хромосомная перестройка - ту(6) (инверсия хромосомы 6) с идентичными точками разрыва (А2;В1) (Рис. ЗА), в то время как в нормальных тканях тех же мышей выявлялся нормальный кариотип. В лимфомах,

полученных от линий мышей 72 и 54, выявлялся другой тип хромосомной перестройки

транслокация 1( 14; 15)(С2;01) (Рис. ЗВ).

Рис. 3 Клональные хромосомные перестройки, наблюдаемые в Т-клеточных лимфомах от Ьск-МугА1а2 мышей. Стрелками отмечены аномальные хромосомы, скобками аномальные сегменты. (А). Инверсия в хр. 6. Левая панель: частичный кариотип опухоли с ¡пу(6) в сравнении с нормой (N6). Правая панель: схематическое изображение

частичных кариотипов N6 (показано расположение точек разрыва А2 и В1) и хромосомы с ту(6)(А2;В1). (В).

Транслокация между хр. 14 и 15. Верхняя панель: частичный кариотип опухоли с 1(14;15)(С2;01) и дополнительной копией (с!ег(15); N14 и N15 - нормальные хромосомы. Нижняя панель:

схематическое изображение частичных кариотипов нормальных хр. 14 и 15 (показано расположение точек разрыва С2 и Э1) и хр. 14 и 15 после транслокации (с!ег14 и с1ег15) опухоли с 1(14;15)(С2;Э1), где чертой обозначены границы транслокации.

В лимфомах, полученных от линий мышей

55, 62 и 79, выявлялся один из

вышеописанных типов хромосомных

перестроек: либо инверсия шу(6), либо

транслокация г( 14; 15), а также наблюдались

другие цитогенетические изменения. Суммарно в 31 из 37 кариотипированных лимфом

(84%) наблюдалась либо шу(6), либо 1(14; 15). Из остальных 6 опухолей две демонстрировали

трисомию хромосомы 16, две - трисомию хромосом 10 и 15, еще две имели различные

сложные кариотипы с множественными хромосомными перестройками. Трисомия хромосом

14 и 15 наблюдалась в 21 из 37 опухолей. Все 14 опухолей, несущие транслокацию 1(14;15),

содержали одну или реже две дополнительные копии модифицированного варианта

хромосомы 15, с1ет(15)1(14;15), но только 5 из этих опухолей имели дополнительную копию

модифицированного варианта от хромосомы 14, <1ег(14)1(14;15). Положение границ

N6 ¡то(6)

А2+. В1 —_

В

С2-

N14 с!ег(14)

А А

п п

ш

■

■ -I

■

N14 с!ег(14)

N6 ¡пу(6)

II 1|{

01-

N15 с!ег(15)

А А

- ■

■

N15 с!ег(15)

перестроек inv(6) и t( 14; 15) может указывать на вовлечение TCR локуса, который подвергается RAG-опосредованной рекомбинации (RAG Recombination Activating Genes) с привлечением рекомбиназ Rag 1/2 при созревании Т-клеток в тимусе в тот период времени, когда Lek промотор, управляющий экспрессией MyrAkt2 трансгена, активен (Mende et al., 2001).

Рис 4. FISH-картирование границ транслокации t(14;15)(C2;Dl) в лимфомных клетках. Ко-

гибридизация ВАС-клонов,

содержащих энхансер гена Тега (зеленые сигналы) или

последовательность Мус (красные сигналы), в аномальных хр. 15 (Ab 15). N14 и N15 нормальные хромосомы, гибридизующисся с ВАС-клонами, выявляющими ген Тега или Мус, соответственно.

Детальный анализ транслокации 1(14; 15)

Для того чтобы определить границы транслокации 1(14; 15), проведено РКН-картирование метафазных хромосом опухолей с использованием пробы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС). РКН-картирование границ транслокации в хромосоме 15 с помощью ВАС клонов, содержащих последовательности Мус (красные сигналы) и Тега

Рис 5. Сравнительная геномная гибридизация на биочипах ДНК мыши и ДНК опухоли с 1(14; 15) и дополнительной копией der( 15) (как на рис. ЗВ). Присутствие второй копии deг( 15) приводит к дупликации дистальной части хр. 14 и проксимальной части хр. 15, что позволяет установить точные границы транслокации в областях 14С2 и 1501. Карты высокого разрешения границ транслокации в хр. 14 и 15 выявили, что увеличение копийности ДНК начинается в дистальной части локуса Тега в хр. 14 (вверху) и Рч11 локусе в хр. 15 (внизу), приводя к увеличению копийности гена Мус. энхансера (зеленые сигналы), выявило ко-гибридизацию этих проб на аномальной

хромосоме 15 (Рис. 4). Для детального картирования границ инверсии был использован CGH анализ. Обычно сбалансированные транслокации не могут быть обнаружены при помощи CGH анализа, однако наличие дополнительной копии der(15)t(14;15) предоставило нам уникальную возможность идентифицировать точное расположение границ транслокации с помощью этой технологии. CGH анализ опухолей с транслокацией t(14; 15) и дополнительной копией der(15)t(14;15) выявил увеличение сигнала в дистальной части хромосомы 14 и проксимальной части хромосомы 15; детальное исследование выявило, что увеличения сигнала в хромосоме 14 начинается с проксимальной части Тега локуса. Усиление сигнала в хромосоме 15 начинается в Pvtl локусе и приводит к увеличению копийности гена Мус (Рис. 5). Следует отметить, что в хромосоме 14 присутствует делеция размером ~1 Mb, приводящая к удалению большей части Тега локуса. Гомозиготность делении свидетельствует о том, что V(D)J перестройки происходят и в нормальной хромосоме 14. Для того чтобы определить границы транслокации t(14;15), кДНК из 10 1(14;15)-позитивных лимфом анализировали методом RT-PCR с различными праймерами к кодирующим последовательностям локусов Myc-Pvtl и Тега,. При использовании пары праймеров к экзону 1 Pvtl и константному участку Тега наблюдали образование ПЦР-продукта длиной 740 п.о. Его секвенирование выявило в двух опухолях наличие слитной последовательности, включающей экзон 1 Pvtl и константный участок Тега (Рис. 6). Таким образом, транспозиция Тега и Myc-Pvtl приводит к сверхпродукции Мус, которую мы наблюдали с помощью вестерн-блоттинга в лимфомах линии мышей 72, несущих эти

■ Pvtl sequence _______Tcra sequence_________________

Pvtl normal Tumor 1

Tumor 2 ______________________________

Tcra M16118 CCAAGCTCAC ATTCGOAGGG QGAACAAGGT TAACGGTCAG ACCCGACATC CAOAACCCAG AACCTGCTGT GTACCAGTTA AAAOATCCTC _________________________________________________♦___________________________________

Рис 6. Анализ последовательностей кДНК для Т-клеточных опухолей с t( 14; 15) (Tumor 1 и Tumor 2), выявивший точку соединения разорванных концов хр.14 и хр.15 при транслокации (показана стрелкой). Верхняя последовательность соответствует кДНК экзона 1 гена Pvtl в нормальной хр.15, нижняя кДНК константного участка Тега в нормальной хр.14.

хромосомные перестройки (см. Рис 2).

Детальный анализ inv(6)

Для того чтобы определить границы inv(6), был проведено FISH-картирование с ВАС-клонами, содержащими известные участки хромосомы 6. Дистальная граница инверсии была картирована в области расположения генов бета-цепи Т-клеточного рецептора (Terb) в участке 6В1 (Рис. 7А). Проксимальная граница инверсии была обнаружена в пределах ЮОКЬ

TGGCAGCCCC GGTGACCTCG GAGTCACGGC TGGATCCACC CTCTTGTCTG ATTTTCTTAA CTCTACTACG GTAAGAAGAT GCCCTCCATC TGGCAGCCCC GGTGACCTCG GAGTCACGGC TGGATCCACC CTCTlf TGGCAGCCCC GGTGACCTCG GAGTCACGGC TGGATCCÍSCC CTCTTV

CATC CAGAACCCAG AACCTGCTGT GTACCAGTTA AAAOATCCTC CATC CAGAACCCAG AACCTGCTGT GTACCAGTTA AAAOATCCTC

области, содержащей ген £>.«/ (Рис. 7В). Участок размером 4.5 КЬ, содержащий проксимальную границу инверсии, был клонирован и секвенирован с использованием праймеров, специфичных к последовательностям генов DssI и ТсгЬ. Все праймеры выбирали так, чтобы они оказывались ориентированными в одну сторону

Рис 7. FISH-картирование границ inv(6) показывает, что дистальная граница инверсии располагается в области расположения гена ТсгЬ (А), а проксимальная - гена Dssl (В). А, ВАС-клон RP23-442M8, содержащий часть вариабельного и константного участков гена ТсгЬ, включая энхансер (красный), гибридизуется с участком 6В1 нормальной хромосомы 6 (N6), но дает два сигнала в хромосомах с inv(6). В, ВАС-клон RP24-204P9, содержащий полностью локус Dssl, гибридизуется с центромерной областью нормальной хромосомы 6 (N6), тогда как в хромосоме с inv(6) сигнал разбивается на два. Вставки на диаграммах А и В показывают N6 (слева) и хр.6 с инверсией (справа).

на нормальной хромосоме 6, не приводя к синтезу ПЦР-продукта. Однако при наличии inv(6)

некоторые из них будут ориентированы таким образом, что обеспечат синтез полноценного

ПЦР-продукта. Расположение одного такого праймера было известно (это праймер,

□ - Tcrb sequence □_ Dss1 sequence

Тсг(3 normal tccttttttgtataaagctgtaacattgtggggacagggggccacggtgattcaattctatgggaagcctttacaaaaacc

Tитог 1 TCCTTTTTTGTATAAAGCTGTAACATTGTGGGGACAÍ GG —AGG ^GGGTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA

Tumor 2 TCCTTTTTTGTATAAAGCTGTAACATTGTGGGGACAÍ

Tumor 3 TCCTTTTTTGTATAAAGCTGTAACATTGTGGGGACAC

Tumor 4 TCCTTTTTTGTATAAAGCTGTAACATTGTGGGGACAÍ

Tumor 5 TCCTTTTTTGTATAAAGCTGTAACATTGTGGGGACAqGGGATAT^TATTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA

Dss1 normal ATGTAGTGTTTTAGTTTTAGTGAAAGAGAACATTAGTGTGTATAATATTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA

Рис. 8. Последовательности ДНК проксимальной границы инверсии у ту(б)-позитивных лимфом (Tumors 1 - 5). Верхняя последовательность ДНК соответствует гену ТсгЬ, нижняя

- гену Dssl в нормальной хромосоме 6. Нуклеотиды, расположенные на Гранине инверсии между Dssl и ТсгЬ (красный прямоугольник), вариабельны.

используемый для синтеза зонда 2F для Dssl), а для локуса TCRb было подобрано 4 праймера. С использованием этой стратегии и был получен 4.5 КБ ПЦР-продукт с геномной ДНК для пяти inv(6) позитивных лимфом. Его клонирование и секвенирование подтвердило

MATTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA •ATÜTATTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA GGGAAAT VTATTATGCAACCTCATAAACCAATTCAGAAGATATA

наличие границ инверсии в гене Dssl (Рис. 8). Анализ последовательности границ инверсии выявил наличие сигнальных последовательностей рекомбинации (recombination signal sequence, или RSS) на границе перестройки в локусах Tcrb и Dssl (Рис. 9, верхняя панель), что указывает на участие в формировани инверсии RAG-опосредованного механизма V(D)J рекомбинации. Механизм inv(6) схематически изображен на Рис. 9, (нижняя панель). Позерн блот анализ выявил, что в i nv(6(-позитивных лимфомных клетках выявляется эндогенный Dssl транскрипт и больший по размеру химерный транскрипт Dssl ~ Tcrb, что было подтверждено ОТ-ПЦР в 20 из 20 ¡пу(6)-позитивных опухолей, а также секвенированием ПЦР-продукта, которое выявило наличие химерного фрагмента кДНК, содержащего экзон 1 Dssl и константный регион Tcrb. Кроме того, анализ методом ПЦР в реальном времени что экзон 1 гена

показал,

DSS1

RSS hcptamcr

RSS и ОП21 nu r

г А Т ATZT т CTGAAT Г ССПТ АТСАОСТТССАТ А А Т А Г НОСАСТ ААТ GTTCTCTTT “ACT ААААСТААА ACACT АСАТТ АТ АС" * Т Ат AGAAGACTT ААСС АААТ ACTСС AACGT ATT АТА TGTGTGATT АС AAGAfGAAAGT G ATTTTGATTTTGTG ATGT AAT ATGA

RSS 23 bp spaccr

RSS 12 bp spacer ▼

VjACAGAA11.ЭЗТТTTTGTAAA3GCTTCCCA7 aSAATT GAATCACCGTGGC ICCCT'jTCCCCACAATGTT ftCAGCTTTAT ACAAAA fCTrrrCTTAOZAAAAACAI TTCOjAAGjGT ATCT7 AACTTAGTGGCACC ] SGGGACAGGGGT GT Т AC * A T GT GGAAA T ATGTT^T

RSS iii*namer

RSS he planter

■0

, Ф

5 “Г*

I

j

Dssl exons 2, 3

I 01x5 Dlx6

¡0 ♦ E

inv(6)

Dssl exons 1

Рис 9. Механизм формирования inv(6). Верхняя панель. Последовательности ДНК на границе инверсии 6 в Т-клеточных лимфомах содержат сигнальные последовательности рекомбинации (RSS-сайты). Один из них, нестандартный RSS-сайт, расположен в интроне I гена Dssl (первая последовательность), другой - в гене разнообразия Dl локуса Tcrb (вторая последовательность). Красные стрелки показывают расположение точек разрыва в геномной последовательности нормальной хромосомы 6. Гептамерные (выделены желтым) и нонамерные (выделены серым) последовательности, сходные с RSS, примыкают к точкам разрыва. Нижняя панель. Схематическая диаграмма inv(6). Границы инверсии (обозначена красными стрелками) в локусе Tcrb и интроне I гена Dssl показаны пунктирной линией. Перестройка помещает гены 01x5 и Dlx6 под контроль энхансера Tcrb (Ер). Ориентация на диаграмме от центромеры (сеп) к теломере (tel).

Dssl сверхэкспрессирован, в то время как сверхэкспрессии экзонов 2 и 3 не наблюдалось. Однако вестерн-блоттин с анти-Dssl антителами, полученными на основе целого белка или

N-конца Dssl, не детектировал Dssl-Tcrb в ¡пу(6)-лимфомных клетках. В полном соответствии с этими данными, иммуноблотинг с антителами к Tcrb и иммунопреципитация/Вестерн-блоттинг с использованием различных комбинаций антител против Dssl и Tcrb также не показали наличия химерного белка. Секвенирование оставшегося интактным аллеля Dssl в шести 1пу(6)-позитивных лимфомах не выявило каких-либо точковых мутаций или других изменений.

Dlx5

Actin

Т lymphocytes

Рис. 10. Дерегуляция экспрессии Dlx5 и Dlx6 в ту(6)-позитивных лимфомах. А. Анализ экспрессии Dlx5 и Dlx6 методом мультиплекс-ОТ-ПЦР. Дорожки 1-4: LCK-Myr-Akt лимфомы, не содержащие inv(6), дорожка 5: тимоциты от мыши дикого типа, дорожки 6-8: Lck-Myr-Akt2 лимфомы с inv(6). Ldbl (Lim domain binding 1) -внутренний контроль. В.. Вестерн-блоттинг анализ, демонстрирующий сверхэпродукцию белка Dlx5 в inv(6)- позитивных лимфомах из Lck-Myr-Akt2 мышей. Дорожки 1-3: лимфомы из опухолей, не содержащих inv(6); дорожка 4, тимоциты от мыши дикого типа; дорожки 5-7: лимфомы с inv(6). *, положение белка Dlx5, соответствует 38 kDa; **, полоса 34 kDa, может представлять собой один из вариантов продукта альтернативного сплайсинга Dlx5. С. Анализ методом иммунопреципитации/вестерн

блоттинга, демонстрирующий сверхэкспрессию белка Dlx6 в ту(6)-позитивных лимфомах. В 3 1пу(6)-позитивных лимфомах наблюдается различный уровень продукции Dlx6. Dlx6 не был детектирован в лимфомах, не содержащих инверсии (-), и в тимоцитах мышей дикого типа (WT). Клетки кожи и тестикул: негативный и позитивный контроли.

Выявление потенциальных онкогенов на границах инверсии

Так как онкогенные перестройки, происходящие в TCR локусе, часто приводят к транслокациям генов в регуляторную область и к их сверхэкспрессии, мы провели в участке генома ¡пу(6)-позитивных лимфом,

локализованном в пределах активности Т-клеточного энхансера, поиск

потенциальных онкогенов. Анализ баз данных выявил присутствие генов Dlx5 и Dlx6 в пределах 250-300Kb от энхансерного элемента Tcrb. Вопрос, могут ли гены Dlx5 и Dlx6 быть сверхэкспрессированы в Т-клеточных лимфомах, исследовали с помошью ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и

иммунопреципитации/вестерн-блоттинга

Рис. 11. Экспрессия 01x5 ускоряет пролиферацию клеток. Клетки JML-5 трансдуцировали DIx5. Контрольные или трансдуцированные ретровирусом GFP-позитивные клетки JML-5 выделяли с помощью проточной сортировки. 104 клеток засевали в 100 мкл среды и определяли их количество после инкубирования в течение 24 час.

(Рис. 10). Во всех исследованных inv(6)-позитивных лимфомах, но не в тимоцитах мышей дикого типа или других Т-клеточных лимфомах без inv(6), наблюдали сверхэкспрессию Dlx5 и/или Dlx6. Однако,' уровень продукции белков может отличаться от опухоли к опухоли. ПЦР в реальном времени и Нозерн-блот анализ подтвердили сверхэкспрессию Dlx5.

Свойства Dlx5 как онкогена

Ген 01x5 ранее не был известен как онкоген, и дальнейшие эксперименты были направлены на исследование его онкогенной функции. Для того чтобы определить способность Dlx5 увеличивать пролиферативную активность клеток, мы трансдуцировали Dlx5 в клетки JML-5. Сверхэкспрессия Dlx5 приводила после 24 час инкубации к 40%-ному увеличению количества клеток по сравнению с контролем (Рис. 11). Показано также, что рост на мягком агаре колоний Rat-1 фибробластов, трансфицированных Dlx5 плазмидой, ускорялся на 25% по сравнению с контролем, трансфицированным «пустым» вектором. Эти

данные согласуются с представлением об

Рис.12. Нокдаун Dix5 в ту(6)-позитивных лимфомных клетках с помощью shRNA ингибирует клеточную пролиферацию, sh 1 и sh4 - конструкции с shRNA против двух различных участков Dlx5; shLuc -

конструкция с shRNA против гена люциферазы (использовалась в качестве негативного контроля). Соп - контроль (пролиферация нетрансдуцированных клеток). А). Оценка уровня пролиферации лимфомных клеток после

трансдукции. В). Вестерн-блоттинг,

демонстрирующий снижение

продукции Dlx5 в ту(6)-позитивных

лимфомных клетках, несущих

конструкцию sh4. После трансдукции клеток конструкцией sh4 снижалась также продукция циклина (Cyclin D1 ).

1400000 t 1200000 | 1000000 I 800000

Z 600000 g 400000 200000

1111

Соп

sh1

Dlx5

Cyclin D1 p-Actin

Jml-5 cell proliferation

20000

Negative Vector D!x5

онкогенности сверхэкспрессии Dlx5. Наблюдали также, что ко-экспрессия Dlx5 и Myr-Akt2 в клетках Rati приводит к 25%-ному увеличению количества колоний по сравнению с Rat-1 клетками, экспрессирующими только Myr-Akt2. Эти данные наводит на мысль о кооперации Dl.\5 и Akt2 при росте колоний на мягком агаре. Как можно было ожидать, нокдаун Dlx5 с помощью специфической shRNA после инфицирования клеток конструкцией sh4 приводил к снижению уровня продукции Dlx5 и подавлению клеточной пролиферации (Рис. 12).

Потенциальная клиническая

Lymphomas

-------------------- важность транскрипционного фактора

DLX5 человека была показана детекцией его экспрессии в нескольких Т-клеточных лимфомах (Рис. 13). Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ выявил, в сравнении с контролем,

Рис. 13. ОТ-ПЦР анализ экспрессии DLX5 и свеРхэкспрессию DLX5 в трех из семи

DLX6 в семи Т-клеточных лимфомах человека клинических образцов Т-клеточных

(1-7), в сравнении с экспрессий DLX5 и DLX6 в

клетках из нормального лимфоузла (N). (-), лимфом, в то время как ни в одном из

негативный контроль; (+), позитивный контроль. этих клинических образцов лимфом не GAPDH, внутренний контроль.

наблюдали сверхэкспрессии DLX6. Более того, по результатам скрининга панели образцов опухолей человека NCI-60 экспрессия DLX5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака человека.

Поиск низкомолекулярных

ингибиторов DIx5

Исходя из полученных данных, Dlx5 (DLX5) может оказаться

перспективной мишенью для

терапевтического воздействия при

Рис. 14. Молекулярный докинг одного из лимфомах, а, возможно, и при других

отобранных для дальнейших исследований злокачественных новообразованиях. Для соединений: химическая структура и

расположение в активном сайте поиска низкомолекулярных ингибиторов транскрипционного фактора DLX5. DLX5 мы использовали ранее

К QB 012 Q9 Q13 Oi ОН 011 07 015010 06 OS Q2 Q3 A

8-

К 08 013 012 03 09 010 014 011 Q5 02 QI5 Q7 06 04

разработанный алгоритм (Joce et al., 2010), основанный на анализе кристаллической структуры белка-мишени. В основе алгоритма лежит молекулярный докинг химических соединений на известную трехмерную модель белка-мишени, определяющий вероятное положение химического соединения в лиганд-связывающем центре белка, а расчет молекулярной динамики применяется для уточнения энергии связывания лучших соединений.

Для поиска новых молекул-лигандов DLX5 использовали программный комплекс QUANTUM. Поиск был затруднен отсутствием

предварительной информации о связывании известных соединений с

Рис. 15. Экспериментальная оценка свойств 14-ти соединений, для которых предсказана высокая энергия связывания с трехмерной структурой белком ЭЬХ5, поэтому исследования БЬХ5: их эффективность, оцениваемая по

влиянию на пролиферацию В1х5-позитивных ПР0В°ДИЛИ «вслепую». Лучшие

клеток лимфомы мышей 42-936 (А) и молекулы и все их структурные

цитотоксичность, определяемая по влиянию на и

пролиферацию нормальных клеток эпителия аналоги из исходной библиотеки

яичника человека (Б). К - уровень пролиферации ENAMINE были отсортированы по

клеток в контроле, ()2 - 014 - уровни

пролиферации клеток в присутствии величине предсказанной энергии

соответствующих лигандов (в концентрации 10 связывания. По результатам мкМ) относительно контроля. Звездочками

отмечены столбцы, отражающие эффект молекулярного докинга отобрали ' 100

наиболее перспективных соединений с>12 (*) и лигандов, из них 14 с наилучшей

09 (**). „

предсказанной энергией связывания

белка БЬХ5 были заказаны и синтезированы в компании ENAMINE, а затем проверены на

культурах клеток. Пример молекулярного докинга с активным сайтом 0ЬХ5 одного из этих

лигандов показан на Рис. 14.

Рис. 16. Селективность соединений 09 и 012 (в концентрации 10 мкМ) на клетках лимфомы мышей. Левая панель: влияние на пролиферацию £>/л'5-экспрессирующих лимфомных клеток 42-936. Правая панель: влияние на пролиферацию

лимфомных клеток \vtl36, не экспрессирующих 01x5. Остальные обозначения как на рисунке 15.

Рис. 17. Селективность соединения 012 на клетках лимфомы человека. Слева: пролиферация 01x5-экспрессирующих (Э1х5+) лимфомных клеток мыши 42-577 и 42-588 в присутствии 10 мкМ 012 и без него (К). Справа: пролиферация лимфомных клеток человека 1игка1 и Мок]6, не экспрессирующих ОЬХ5 (ЭЬХ5-), в аналогичных условиях.

В качестве модели для проверки специфической

активности выбранных лигандов использовали ¡пу(6)-позитивые клетки линии 42 Т-клеточной лимфомы 1ХКтугАКТ2 мышей. Лимфомные клетки 42-936 инкубировали с каждым из 14 выбранных лигандов ЭЬХ5 и оценивали влияние последних на пролиферацию. Как видно из Рис.

15А, лиганды с разной эффективностью влияют на пролиферацию лимфомных

клеток; лучшую ингибирующую активность проявили соединения под номерами 08, 012, 09 и 013. Возможное неспецифическое цитотоксическое действие

отобранных соединений проверяли на нормальных клетках эпителия яичника человека, не

экспрессирующих ОЬХ5 (Рис. 15Б). При сравнении с контролем видно, что большинство молекул-лигандов, за исключением

соединений 08 и 013, не

проявляют значительной

цитотоксичности. 08 и 013 исключили из дальнейшего рассмотрения. Вещества 012 и 09 выбрали для дальнейшего

изучения как наиболее перспективные.

Для исключения возможности неспецифического влияния Q12 и Q9 на клетки лимфоидного ряда их действие проверяли на клетках линии 72 Т-клеточной лимфомы Akt2-

трансгенных мышей, не

экспрессирующих DIx5 (Рис. 16). Клетки линии 72 содержат хромосомную перестройку другого

типа - транслокацию между

хромосомами 14 и 15 (t( 14:15 )),

которая приводит к повышенной экспрессии протоонкогена с-тус. На Рис. 17 приведены также результаты влияния соединения Q12 на пролиферацию еще двух подтипов

лимфомных клеток, экспрессирующих Рис. 18. Влияние соединения Q12 на экспрессию

c-mvc и Dlx5 в лимфомных клетках мыши 42-936, Dlx5 42-577 и 42-588, а также на экспрессирующих 01x5. Методом ОТ-ПЦР в иф ацию лимфомных клеток реальном времени оценивали уровни мРНК с-тус

и Dlx5 относительно мРНК ТАТА-связывающего Jurkat и Moltlô человека, в которых не белка (ТЬр) при культивировании клеток в экспрессируется DLX5. Из данных, присутствии 10 мкМ Q12 и без него (контроль).

представленных на Рис. 16 и 17, можно сделать общий вывод, что соединения Q9 и Q12 не влияют на пролиферацию клеток, не экспрессирующих 01x5, однако высокоэффективно подавляют пролиферацию клеток, в которых экспрессируется этот ген. Известно, что транскрипционный фактор DLX5 может прямо регулировать экспрессию протоонкогена с-тус [8, 30]. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени исследовали влияние Q12 на экспрессию с-тус в лимфомных клетках 42-936, экспрессирующих 01x5. На Рис. 18 представлены уровни мРНК с-тус относительно эндогенного контроля - мРНК ТАТА-связывающего белка (ТЬр) или мРНК Dlx5, а также мРНК Dlx5 относительно мРНК ТЬр в присутствии ЮмкМ Q12 и без добавления последнего. Видно, что экспрессия с-тус значительно снижается под действием Q12, тогда как экспрессия Dlx5 при этом не меняется. Эти результаты свидетельствуют об ингибиторном эффекте лиганда Q12 на транскрипционную активность фактора Dlx5 (DLX5) и позволяют предположить, чтосвязывание этого лиганда носит специфический характер.

c-myc/Tbp c-myc/Dlx5 Dlx5/Tbp

H Q12, 10 мкМ Я Контроль

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что трансгенные мыши, экспрессирующие в Т-клетках активированную форму протеинкиназы АШ, способны развивать злокачественные Т-клеточные лимфомы. При кариотипировании нескольких независимых линиях мышей обнаружены две повторяющиеся от опухоли к опухоли соматические хромосомные перестройки: транслокация -1(14; 15) хромосом 14 и 15 или инверсия - щу(6) хромосомы 6.

Полученные в работе данные согласуются с представлением, что механизмом возникновения опухолей при сверхэкспрессии АШ в незрелых Т-клетках является нарушение в процессе перестройки Т-клеточного рецептора, в результате чего нестандартные сайты распознавания рекомбиназ (ЯББ), расположенные в гене Охз 1 и, "возможно, в гене Ру/У, узнаются рекомбиназами Ragl/2 и вовлекаются в рекомбинацию с

локуса ТсгЬ. Это приводит к перемещению генов 01x5 при туб и с-тус при 1(14; 15) в область расположения регуляторных элементов Т-клеточного рецептора и к сверхэкспрессии этих генов.

Показано, что ген 01x5 обладает онкогенными потенциалом. Сверхэкспрсссия 01x5 в клетках млекопитающих приводит к повышению клеточной пролиферации. Подавление экспрессии 01x5 с помощью РНК-интерференции приводит к понижению пролиферативного потенциала клеток. Кроме того, сверхпродукция белка ЭЬХ5 была обнаружена в 3 из 7 клинических образцов лимфом человека. По результатам скрининга панели образцов опухолей N0-60 экспрессия 01X5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.

На основании анализа кристаллической структуры 0ЬХ5 разработаны первые низкомолекулярные лиганды БЬХ5, способные блокировать пролиферацию ¡пу(6)-позитивных лимфомных клеток. Эти соединения могут использоваться для последующей химической оптимизации и разработки высокоэффективных противоопухолевых средств.

ВЫВОДЫ

1. Создано несколько линий трансгенных мышей 1ХКтугА1а2, экспрессирующих в Т-клетках активированную форму А1и2; в 95—100% случаев у них развивались тимические лимфомы с медианой выживаемости в 75-140 дней. В лимфомах этих мышей наблюдали активацию каскада АМтТог и сверхэкспрессию Мус.

2. При кариотипировании большинства лимфом от трансгенных мышей Ьск-тугАШ обнаружены соматические хромосомные перестройки двух типов: или транслокация -Г( 14; 15), или инверсия - т\'(6). Установлены точные границы хромосомных перестроек,

которые при ту(6) располагаются в генах Оха 1 и ТсгЪ и при 1(14;15)— в генах Р\ч! и Тега. На границе ¡пу(6) в гене Ds.il обнаружены сигнальные последовательности рекомбинации (Я55).

3. Установлено, что транслокация - 1(14; 15) приводит к сверхэкспрессии Мус, а инверсия ¡пу(6) - к сверхэкспрессии ряда расположенных на ее границе генов, включая 01x5. Сверхэкспрессия й!х5 является ключевым событием, поскольку кодируемый им транскрипционный фактор 01x5 обладает онкогенным потенциалом. Действительно, сверхэкспрессия 01x5 в клетках млекопитающих приводит к повышению уровня клеточной пролиферации, а подавление его экспрессии с помощью 5ЫША - к понижению пролиферативного потенциала клеток.

4. Сверхэкспрессия БЬХ5 обнаружена в 3 из 7 клинических образцов лимфом человека. Кроме того, по результатам скрининга панели образцов опухолей человека N01-60 экспрессия ОЬХ5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.

5. На основании анализа кристаллической структуры транскрипционного фактора ОЬХ5 человека разработаны его низкомолекулярные лиганды. Показано, что эти соединения избирательно блокируют пролиферацию клеток лимфомы мыши с ¡пу(6), но не влияют на пролиферацию лимфомных клеток мыши с 1(14;15) и на пролиферацию ряда лимфомных клеток человека. В ¡пу(6)-позитивных клетках они также снижают экспрессию Мус. Эти результаты согласуются с представлением об ингибиторном эффекте исследованных лигандов на транскрипционную активность фактора Б1х5 (ОЬХ5). На основе найденных соединений могут быть разработаны высокоэффективные противоопухолевые средства.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимахов Р. А., Федичев П. О., Винник A. A., Testa J. R, Фаворова О. О. Транскрипционный фактор DLX5 как новая мишень для перспективных противоопухолевых препаратов // Acta Naturae. 2011, V. 3. P. 49-53

2.Timakhov R.A., Tan Y., Rao M„ Liu Z., Altomare D.A., Pei J„ Wiest D.L., Favorova O.O., Knepper J.E., Testa J.R. Recurrent chromosomal rearrangements implicate oncogenes contributing to T-cell lymphomagenesis in Lck-MyrAkt2 transgenic mice // Genes Chromosomes and Cancer. 2009. V. 48 P. 786-794.

3. Tan Y, Timakhov R.A., Rao M, Altomare D.A., Xu J„ Liu Z„ Gao Q„ Jhanwar S.C., Di Cristofano A., Wiest D.L., Knepper J.E., Testa J.R. A novel recurrent chromosomal inversion implicates the homeobox gene Dlx5 in T-cell lymphomas from Lck-Akt2 transgenic mice // Cancer Res. 2008. V. 68 P. 1296-1302.

Список использованных сокращений. БСА - бычий сывороточный альбумин; ДНК -дезоксирибонуклеиновая кислота; кДНК - кодирующая ДНК; мРНК - матричная РНК; ОТ-ПЦР - ПЦР после обратной транскрипции; п.н. - пары нуклеотидов; ПЦР -полимеразная цепная реакции; РНК - рибонуклеиновая кислота; рРНК - рибосомная РНК; Ig - иммуноглобулин; FBS - fetal bovine serum (эмбриональная телячья сыворотка); PBS - Phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер); PIN - prostate intraepitelial neoplasia (простатическая интраэпителиальная неоплазия);, PIP3 -фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат; PIP2 - фосфатидилинозитол 4,5-дифосфат; ТЬр -ТЛТА-связывающий белок; TBS - Tris buffer saline (трис-солевой буфер); 5'ТОР - 5’ концевой олигопипримидиновый участок; РКА - протеинкиназа А; РКС -протеинкиназа С; RAG - специфичные для Т-лимфоцитов рекомбиказы, продукты генов, активирующих рекомбинацию (recombination activating genes RAG), RSS -сигнальная последовательность рекомбинации (recombination signal sequence), распознаваемая рекомбиназами RAG.

Подписано в печать.

Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная.

Уел. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 817 Типография ООО “Ай-клуб” (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимахов, Роман Анатольевич, Москва

61 12-3/580

На правах рукописи

ТИМАХОВ РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА Dlx5 НА ОНКОТРАНСФОРМАЦИЮ Т-ЛИМФОЦИТОВ У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АКТИВИРОВАННУЮ ФОРМУ ПРОТЕИНКИНАЗЫ

Akt2

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Киназа АКТ. История открытия. 7

1.2. Строение АКТ 7

1.3. Активация АКТ и ее роль в передачи сигнала 8

1.3.1. Роль АКТ-киназы в контроле пролиферации 10

1.3.2. АКТ-киназы и выживаемость клеток 10

1.3.3. АКТ-киназы как регуляторы метаболизма 11

1.3.4. АКТ и клеточный рост 12

1.4. Процессы, происходящие при повреждении сигнального пути АКТ 14

1.5. in vivo модели активации АКТ 18 1.5.1. Активация АКТ в Т-клетках 22

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23

2.1 Реактивы 23

2.2 Создание трансгенной линии мышей 23

2.3 Работа с культурами клеток 24

2.3.1. Культивирование клеток в жидких средах 24

2.3.2. Культивирование клеток в мягком агаре 24

2.4. Кариотипирование и FISH 25

2.5. Выделение ДНК 25

2.6. Выделение РНК 25

2.7. Нозерн-блоттинг 26

2.8. ПЦР 26

2.9. ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени 27

2.10. FACS/проточная сортировка клеток 27

2.11. Ретровирусная трансдукция лимфоцитов 28

2.12. РНК-интерференция 2 8

2.13. Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах 29 (array CGH)

2.14. Вестерн-блоттинг 29

2.15. Подготовка лигандов и молекулярный докинг 3 0

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 32

3.1. Создание линий трансгенных мышей LCKmyrAkt2, 32 спонтанно развивающих агрессивные Т-клеточные лимфомы

3.2. Детальный анализ транслокации t( 14; 15) 37

3.3.Детальный анализ inv(6) 42

3.4. Выявление потенциальных онкогенов на границах инверсии 51

3.5. Свойства Dlx5 как онкогена 54

3.6. Поиск низкомолекулярных ингибиторов Dlx5 58

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 66

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 74

6. ВЫВОДЫ 76 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 78

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

кДНК - кодирующая ДНК,

мРНК - матричная РНК,

ОТ-ПЦР - ПЦР после обратной транскрипции,

п.н. - пары нуклеотидов,

ПЦР - полимеразная цепная реакции,

РНК - рибонуклеиновая кислота,

рРНК - рибосомная РНК,

т.п.н. - тысячи пар нуклеотидов,

Ig-подобный - иммуноглобулин-подобный,

FBS - fetal bovine serum (эмбриональная телячья сыворотка),

PB S - Phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер),

PIN - prostate intraepitelial neoplasia (простатическая интраэпителиальная

неоплазия), PIP3 - фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат,

PIP2 - фосфатидилинозитол 4,5-дифосфат,

Runx2 - Runt-подобный транскрипционный фактор 2 (Runt-related transcription factor 2),

T-ALL - Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, TBS - Tris buffer saline (трис-солевой буфер), 5'ТОР - 5' концевой олигопипримидиновый участок, РКА - протеинкиназа А, РКС - протеинкиназа С,

RAG - Специфичные для Т-лимфоцитов рекомбиназы, продукты генов, активирующих рекомбинацию (recombination activating genes — RAG) RSS - сигнальная последовательность рекомбинации (recombination signal sequence), распознаваемая рекомбиназами RAG.

ВВЕДЕНИЕ

В современной клинической практике для борьбы с онкологическими заболеваниями используется широкий набор лекарственных средств, однако даже при использовании всех доступных препаратов доля больных, отвечающих на терапию, очень невелика. Это свидетельствует о необходимости разработки новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний, основанных на глубоком понимании молекулярных механизмов канцерогенеза.

За прошедшее время было выяснено, что в механизмах канцерогенеза одну из ключевых ролей играют протеинкиназы. Так, у мышей было идентифицировано семейство, включающее три изоформы Akt-протеинкиназ, гомологичных онкобелку v-akt. Показано, что Akt-киназы играют ключевую роль в процессах онкотрансформации, контролируя такие важные процессы как пролиферация и выживаемость, стабильность генома, клеточный размер/рост, метаболизм глюкозы и неоваскуляризацию. Стало очевидно, что Akt-киназы - важные участники сигнального каскада, состоящего из таких белков как PI3K, PTEN, mTOR, eIF4E и NF-kB. В то же время была обнаружена частая гиперактивация АКТ-киназ в опухолях человека, а в дальнейшем показано, что большинство из белков АКТ каскада ассоциировано с развитием онкологических заболеваний.

Исследования in vivo показали, что повреждения отдельных звеньев сигнального каскада Akt (АКТ) приводят к развитию новообразований, а кооперация с другими онкогенами определяет возникновение более агрессивных фенотипов. Однако, было установлено, что конститутивная активация той или иной изоформы самой Akt-киназы в клетках молочной железы, простаты и поджелудочной железы трансгенных модельных мышей не приводит к опухолеобразованию, тогда как в незрелых Т-клетках происходит раковое перерождение. Наличие у этих мышей латентного периода продолжительностью в 10-20 недель, предшествующего развитию

злокачественных лимфом, позволил предположить, что механизм генерации лимфом является опосредованным, и для полной трансформации требуются дополнительные генетические события/участники.

Цель и задачи работы. Целью этой работы было выяснение на моделях трансгенных мышей механизмов онкотрансформации, происходящей при активации протеинкиназы Akt2 в Т-лимфоцитах.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать трансгенные линии мышей, в которых используется Lck промотор для запуска экспрессии конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 на ранних стадиях развития тимоцита; у этих Lck-MyrAkt2 мышей изучить случаи спонтанного опухолеобразования и цитогенетические изменения, возникающие в Т-клеточных лимфомах.

2. Идентифицировать гены, затронутые хромосомными перестройками у Lck-MyrAkt2 мышей, и показать, что они обладают онкогенным потенциалом.

3. Разработать низкомолекулярные ингибиторы для продуктов найденных генов и выяснить, блокируют ли эти молекулы пролиферацию Lck-MyrAkt2 лимфомных клеток, содержащих специфические хромосомные перестройки.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получена новая Akt-трансгенная мышиная модель, уникальной особенностью которой является способность развивать опухоли спонтанно. При кариотипировании развивающихся злокачественных лимфом в нескольких независимых линиях мышей наблюдали две повторяющиеся от опухоли к опухоли (recurrent) соматические хромосомные абберации, затрагивающие локусы генов Т-клеточных рецепторов: транслокацию хромосом 14 и 15 — t(14;15) и инверсию хромосомы 6 - inv(6). Показано, что результатом транслокации t(14;15) является повышение экспрессии известного онкогена с-тус.

Что касается инверсии хромосомы 6, то ее границы затрагивают ген эмбрионального транскрипционного фактора Dlx5, что приводит к

драматическому повышению продукции последнего. Впервые показано, что ген Э1х5 является онкогеном: сверхэкспрессия Б1х5 в клетках мыши вызывает повышение пролиферативной активности, а подавление его экспрессии с помощью РНК-интерференции, напротив, снижает пролиферативный потенциал клеток. Сверхэкспрессия гена БЬХ5 была обнаружена в клинических образцах 3 из 7 исследованных лимфом человека. По результатам скрининга панели образцов опухолей человека N0-60 экспрессия БЬХ5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.

На основании анализа кристаллической структуры транскрипционного фактора БЬХ5 предсказано несколько десятков химических структур его лигандов. После тестирования на культурах клеток 14-ти предсказанных соединений для 2 из них впервые показана специфическая способность блокировать пролиферацию АкЙ-трансгенных лимфомных клеток мыши с инверсией хромосомы 6, характеризующихся повышенной экспрессией 01x5, в отличие от АШ-трансгенных лимфомных клеток, не экспрессирующих В 1x5.

Поиск и изучение молекулярных процессов, вовлеченных в развитие опухолей, является необходимым условием для создания новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний. Настоящая работа позволила идентифицировать ген й1х5 (ОЬХ5) как ранее неизвестный онкоген, который может служить мишенью для терапевтического воздействия при Т-клеточных лимфомах, а, возможно, и при других злокачественных новообразованиях, и выявила несколько перспективных низкомолекулярных ингибиторов белка ВЬХ5.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 АКТ. История открытия

В 1977 г в Национальном институте здоровья США (NHI) от мышей линии AKR, развивающих Т-клеточные лимфомы, был выделен ретровирус, в последствии названный АКТ8 (AKR Thymoma №8) [1]. Оказалось, что ретровирус несет онкоген, названный \-Akt, для которого у человека в дальнейшем были найдены гомологи. Первым картированным гомологом л?-Akt у человека стал ген АКТ1 на хромосоме 14 [2], позднее ген А KT2 был картирован на хромосоме 19 [3, 4]. Чуть позже на хромосоме 1 был обнаружен и ген АКТЗ [5]. Анализ последовательности у-Akt выявил высокую степень гомологии с киназами группы протеинкиназы С (РКС).

1.2. Строение АКТ-киназ

Все АКТ-киназы человека относятся к классу AGC-киназ (related to AMP/GMP kinase and protein kinase С), который включает также все 3'-фосфотидилинозитид-зависимые киназы (РКА, РКС, PDK1). АКТ-киназы содержат три консервативных домена: N-концевой PH-домен (гомологичный плекстрину), киназный домен и С-концевой гидрофобный домен [6].

Кристалическая структура PH-домена АКТ была разрешена с высокой точностью; было показано, что с ним с одинаковой афинностью взаимодействует фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфат (PIP3) и фосфатидилинозитол-(3,4)-дифосфат (PIP2) [7].

Аминокислотные последовательности киназных доменов всех трех изоформ АКТ различаются на один аминокислотный остаток в АТФ-связывающей области: А1а230 в АКТ1 заменен на А1а232 в АКТ2 и Val228 в АКТЗ. Киназные домены АКТ-киназ высокогомологичны киназным доменам других представителей класса AGC-киназ [8].

Третий домен каждой из изоформ АКТ представляет собой С-концевой «хвост» длиной около 40 аминокислотных остатков. Эта область содержит FXX-F/Y-S/T-Y/F гидрофобный мотив (где X - любой аминокислотный остаток), который характерен для семейства протеинкиназ AGC. Этот гидрофобный мотив - характерная особенность всех AGC-киназ, а также киназ р70 и р90 рибосомного белка S6 [9].

1.3. Активация АКТ-киназы и ее роль в передаче сигнала

Активация АКТ - это многоступенчатый процесс передачи сигнала, который инициируется связыванием гормона роста или цитокинов со своими рецепторами и включает транслокацию АКТ из цитоплазмы в мембрану с последующим фосфорилированием АКТ [10]. Отдельные этапы этого процесса схематически представлены на рис. 1 и будут поэтапно рассмотрены ниже.

Критический этап передачи сигнала - фосфорилирование фосфатидилинозитол-3-киназой PI3K мембрансвязанных фосфатидилинозитов с образованием PIP3 и PIP2. Оба фосфолипида связываются с РН-доменом АКТ и способствуют ее транслокации в плазматическую мембрану. В мембране АКТ фосфорилируется по двум положениям: в киназном домене по остатку треонина (Thr308 в АКТ1, Thr309 в АКТ2 или Thr305 в АКТЗ) и в С-концевом домене по остатку серина (Ser473, Ser474 или 472), что приводит к активации АКТ.

»Himvtf«

у

/ V

У 1

tell growth, transtotian

cell proliferation

Рис 1. Сигнальный каскад АКТ

Фосфорилирование в киназном домене абсолютно необходимо для активации АКТ, тогда как С-концевое фосфорилирование повышает активность АКТ, вероятно, способствуя копформационным изменениям в киназном домене. Фосфорилирование 5ег473 в С-концевом домене осуществляется с помощью РВК1, другой РН-домен-содержащей АСС-киназы, также активируемой через Р1РЗ и Р1Р2 [11, 12].

Наряду с активацией, существуют и механизмы инактивации АКТ. Сигнальный каскад РТЗК/АКТ напрямую ингибируется фосфатазой РТПМ, дефосфорилиругощей по З'-положению фосфорилированые фосфоинозитидь! [13]. В инактивации АКТ также могут участвовать некоторые другие серин-треониновые фосфат азы. включая протеи нфосфатазу 2А, [14, 15].

1.3.1. Роль АКТ-киназы в контроле пролиферации

АКТ участвует в огромном спектре происходящих в клетке процессов, начиная с контроля пролиферации и выживаемости клеток до метаболизма глюкозы и роста сосудов (Рис 1). Большинство субстратов АКТ, за некоторыми исключениями, содержат консенсусную последовательность RXRXXS/T, распознаваемую и фосфорилируемую киназой.

Пролиферативное действие АКТ связано с фосфорилированием множества субстратов. К примеру, фосфорилирование белка GSK3P, приводящее к его ингибированию, предотвращает деградацию циклина D1 [16]. По такому же механизму происходит активация mTOR-пути, в результате чего усиливается трансляция мРНК циклинов D1 и D3 [17]. Кроме того, АКТ напрямую ингибирует действие белков-ингибиторов клеточного цикла p21WAF1 и p27Kipl: фосфорилирование с помощью АКТ остатков, расположенных в этих белках рядом с сигналом ядерной локализации, приводит к задержке их переноса из цитоплазмы в ядро [18].

1.3.2. АКТ-киназы и выживаемость клеток

Известно, что АКТ может ингибировать процессы апоптоза посредством нескольких независимых механизмов, что в конечном итоге приводит к повышению выживаемости клеток [17, 19, 20]. АКТ - одна из киназ, фосфорилирующих про-апоптотический фактор BAD, что предотвращает выход цитохрома С из митохондрий и является ключевым моментом, запускающим каспазный каскад [21]. Параллельно, АКТ напрямую способна ингибировать каспазный каскад, фосфорилируя прокаспазу-9, а также фосфорилированием повышая стабильность ингибитора каспазы-3, PED/PEA15 [22]. Как упомянуто выше, АКТ, фосфорилируя p21WAF1[23], ограничивает его вход в ядро, в

результате чего он связывается в цитоплазме с киназой ASK1, ингибируя апоптоз. АКТ также ограничивает вход в ядро транскрипционных факторов семейства forkhead по механизму, сходному с ингибированием p27Kipl, а именно фосфорилируя его сигнал ядерной локализации, и тем самым препятствует транскрипции проаптотических генов Fas ligand, BIM, TRAIL и TRADD.

Кроме того, АКТ повышает транскрипцию антиапоптотические генов BFL1, cIAPl и сIAP2, регулируемую NF-кВ. Это достигается тем, что АКТ активирует путем фосфорилирования киназу IKK, которая в свою очередь инактивирует белок-ингибитор 1кВ, способствующий выведению NF-кВ из ядра.

Все больше данных указывает и на анти-апоптотические функции AKT/mTOR сигнального пути, но в то же время, все детали процесса до конца не исследованы и, скорее всего, связаны с регулируемой mTOR трансляцией мРНК [24].

Кроме того, АКТ может ингибировать р53-зависимые точки контроля клеточного цикла, влияя на апоптоз через регуляцию субклеточной локализации ингибитора р53, Mdm2. Известно, что фосфорилирование Mdm2 с помощью АКТ необходимо для локализации Mdm2 в ядро, где этот белок может образовывать комплекс с р53 и усиливать его убиквитин/протеасомно-опосредованную деградацию [25].

1.3.3. АКТ-киназы как регуляторы метаболизма

Одна из важных функций АКТ-киназ связана с регуляцией метаболизма глюкозы [26, 27]. Первым свидетельством, указывающим на эту роль АКТ-киназ, стало наблюдение, что синтез гликогена возрастает после фосфорилирования АКТ-киназой и последующей инактивации киназы 3 гликогенсинтазы GSK3ß [28]. Кроме того, известно, что инсулин усиливает

транспорт глюкозы, что опосредовано через фосфорилирование с помощью АКТ транспортеров глюкозы GLUTI и GLUT4 [29] (Рис 1). АКТ также стимулирует гликолиз через фосфорилирование фосфофруктокиназы 2 [30]. Действительно, в последнее время было обнаружено, что активация АКТ напрямую ответствена за усиленный гликолиз в опухолевых клетках в анаэробных условиях [31]. В раковых клетках, постоянно экспрессирующих активную форму АКТ, гликолиз проходит на повышенном уровне, в связи с чем увеличивается образование молочной кислоты, а также отношение NAD(P)H/NAD(P) [31]; в то же время потребление кислорода, влияющее на окислительное фосфорилирование, остается прежним [31]. Это явление было описано как "эффект Варбурга" более 50 лет назад [32].

1.3.4. АКТ и клеточный рост

Клеточный рост - это ответ клетки на увеличение количества питательных веществ. Роль АКТ-семейства в росте клетки была открыта в экспериментах на мушках Drosophila. Гомолог АКТ у Drosophila, Daktl, в раннем эмбриогенезе регулирует апоптоз [33], а в позднем эмбриогенезе модулирует передачу сигнала с рецептора инсулина, что стимулирует рост клетки и увеличивает размер органа [34]. Таким образом, Daktl участвует в клеточном ответе на питательные вещества и действует в том же направлении, что и белки клеточного цикла, которые ограничивают деление клеток при недостатке питательных веществ [35].

Клеточный рост модулируется АКТ через киназу mTOR, которая стимулирует синтез белков. Механизм активации mTOR связан с опухолевыми супрессорами TSC1 и TSC2, известными также как гамартин и туберин, дефект каждого из которых приводит к наследственному синдрому, известному как туберозный склероз (см. ниже). Комплекс белков TSC1 и TSC2 ингибирует GTP-азу Rheb, в функцию которой входит активация mTOR (Рис 1). Киназа

АКТ фосфорилирует Т8С2, дестабилизируя его взаимодействие с ТБО [36, 37], что повышает уровень активной, свя�