Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53

Струнина, Светлана Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

Йа правах рукописи

СТРУНИНА Светлана Михайловна

ТРАНСАКТИВАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА АНТИОНКОГЕНА р53 В РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК: РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОЙ РЕПОРТЕРНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ р53

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2004

Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

П.М. Чумаков

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Н.Л. Лазаревич

кандидат биологических наук Д.В. Купраш

Ведущая организация ГНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

час на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 в Институте молекулярной биологии им В А Энгелыардга РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН

Защита диссертации сотоится,

46" кШКА

,2004 года в

Автореферат разослан

Ученый секретарь

¿оо^-ц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт уальност ь проблемы

Возникновение злокачественных клеток в организме может быть связано с накоплением генетических повреждений, приводящих к нарушениям контроля деления и гибели клеток. Антионкоген р53 участвует в ликвидации генетически дефектных клеток организма. Продукт гена р53 представляет собой транскрипционный фактор, активирующий ряд генов, которые задерживают клеточное деление или запускают программированную клеточную смерть - апоптоз. Широкий спектр внешних воздействий, стрессов и внутренних сбоев клеточной физиологии функционально активирует белок р53, который накапливается благодаря выключению механизмов его деградации и повышает свою транскрипционную активность за счет конформационных перестроек внутри белковой молекулы. Процесс активации белка р53 может контролироваться посредством множества сигнальных механизмов, отвечающих многообразию стрессовых воздействий, внутренних нарушений и различной функциональной специфичности тканей.

Функциональная инактивация гена или белка р53 - наиболее часто встречающийся дефект в раковых опухолях человека. Поэтому выявление конкретных механизмов повреждений биохимических путей, ведущих к активации р53, важно для понимания природы канцерогенеза, а также для разработки адекватных терапевтических и профилактических схем для лечения рака.

Основная активность белка р53 - функционирование в качестве транскрипционного фактора, что и определяет его супрессирующую пролиферацию активность. Белок р53 связывается с определенными последовательностями ДНК палиндромной структуры, называемыми р53-респонсивными элементами, и, как правило, активирует промоторы, содержащие такие элементы Поэтому изучение повреждений сигнальных путей, ведущих к активации р53, удобно проводить, ориентируясь на изменения характера индукции р53-зависимых генов в ответ на известные активаторы р53. Такого рода анализ в конкретных опухолевых клетках может привести к обнаружению тех звеньев сигнальных путей, активирующих р53, в которых локализован дефект передачи сигнала.

Ранее показана достаточно четкая корреляция между активностью р53-зависимого репортера и супрессорной активностью белка р53. Обычно репортерная конструкция вводится в клетку временно, а затем клетки подвергаются воздействиям, индуцирующим активность р53. Для сравнения состояния биохимических путей активации р53 требуется доставлять репортерную конструкцию в различные типы клеток с высокой и стандартной эффективностью. Это требование трудно достижимо, поскольку имеются значительные различия в эффективности трансфекции и интеграции трансгенов в клетки различного происхождения. В нормальных клетках процедура трансфекции, сопровождающаяся введением экзогенной ДНК, как правило, приводит к активации р53. Это, в свою очередь, может приводить к ограничению пролиферации, или даже гибели обработанных клеток. В опухолевых клетках могут наблюдаться различного рода эффекты, приводящие к интеграции нескольких копий трансгена, к перестройкам репортерной конструкции, к интеграции в области гетерохроматина, и, в случае двух последних событий - к инактивации работы трансгена. Кроме того, обычные методы трансфекции часто сопровождаются затухающей во времени экспрессией трансгена, что связано с влиянием эпигенетической супрессии на экспрессию трансгена. В дополнение к перечисленным артефактам при эффективно прошедшей кальций-фосфатной трансфекции клеток, методом которой мы вначале пользовались, не более 10% клеток получают репортерную конструкцию. Этот факт, конечно, приводит к неадекватному отражению результатов активации репортера в малой части выживших после селекции на антибиотике клеток массовой культуры или отдельно выделенных клонов культуры.

В отличие от пассивной трансфекции ДНК, перенос генов с помощью ретровирусных векторов обеспечивает ряд преимуществ, позволяющих преодалеть перечисленные

трудности Ретровирусный перенос - наиболее физиологический метод доставки генетического материала Ретровирусный вектор интегрируется преимущественно в транскрипционно-активные участки генома в виде единичной копии, причем структура интегрированной вставки предсказуема, а индукции стрессовых сигнальных путей не происходит. Высокая эффективность и стандартизированность интеграции позволяет в дальнейшем работать на поликлональных популяциях трансгенных клеток, избегая тем самым возникновения нежелательных эффектов клональной вариабильности

Исходя из вышеизложенных преимуществ ретровирусной доставки генетического материала, для создания эффективной репортерной системы для определения активности р53 в клетках мы решили использовать самоинактивирующийся ретровирусный вектор. До настоящего времени не предлагался универсальный инструмент, позволяющий проводить подробный количественный анализ транскрипционной активности р53 в любых типах эукариотических клеток.

Цель и задачи исследования

Основная цель работы заключалась в создании универсальной ретровирусной репортерной системы, которая бы позволила проводить количественное определение и сравнение трансактивационных свойств антионкогена р53 в культурах клеток различного происхождения

В задачи исследования входило.

1. Получить ряд ретровирусных самоинактивирующися репортерных конструкций, несущих гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), бактериальной галактозидазы (lacZ), a также гена устойчивости к антибиотику гигромицину (hygгo) под р53-зависимым промотором

2. Провести тестирование р53-зависимой экспрессии полученных конструкций в крысиных, мышиных и человеческих культурах клеток различного происхождения, используя системы транзиторной, регулируемой и эндогенной экспрессии р53, разработать метод количественного измерения транскрипционной активности р53.

3. Провести сравнительный количественный анализ транскрипционной активности р53 в культуре карциномы толстого кишечника человека НСТ116 в ответ на обработку клеток химиотерапевтическими агентами в зависимости от внутриклеточного контекста -наличия активной экспрессии гена-ингибитора транскрипционной активности р53 -mdm2 или гена-стимулятора активности р53 - ARF; провести подобный сравнительный количественный анализ транскрипционной активности р53 в ответ на обработку клеток химиотерапевтическими агентами в четырех культурах, являющихся производными клеток соединительной ткани человека.

4. На основе разработанной репортерной системы с геном lacZ получить линии клеток опухолей человека, в которых активность р53 подавлена либо точечной мутацией в кодоне 273 гена р53 (эпидермоидная карцинома А431), либо за счет деградации р53 под действием вируса папиломы 16 типа (карцинома шейки матки SiHa); провести скрининг химической библиотеки соединений на реактивацию транскрипционной функции р53 в клетках А431 и SiHa

Научная новизна и практическая ценность работы

Созданы и проверены самоинактивирующиеся ретровирусные конструкции р81Р-ConA-GFP, pSIP-ConA-lacZ и pSIP-ConA-hygгo, несущие репортерные гены белков GFP, (5-галактозидазы, а также гена устойчивости к гигромицину (hygгo) под контролем промотора, содержащего р53-респонсивные элементы С помощью полученных конструкций можно добиваться до 100% эффективности доставки репортерных генов в высокопролиферативные культуры клеток. Экспрессия репортеров сравнительно гомогенна в клетках каждой используемой культуры. Первые две конструкции позволяют количественно оценивать уровень активности р53 в культурах клеток в ответ на различные воздействия

Впервые предложен инструмент в виде ретровирусного самоинактивирующегося репортерного вектора для количественной оценки транскрипционной активности р53. Преимущество репортерной конструкции с геном lacZ заключается в недолгом времени жизни Р-галактозидазы (около 2 ч), что позволяет с помощью pSIP-ConA-lacZ изучать динамику повышения и понижения активности р53 в реальном времени. Система pSIP-ConA-GFP менее пригодна для изучения динамики, поскольку белок GFP является более долгоживущим. Однако эта система оказывается удобной для наблюдения за активацией р53 в живых клетках, без предварительной фиксации, а также для изучения кинетики р53-зависимой трансактивации в отдельных клетках. Это позволяет, например, проводить отбор клеток с активированным р53 с помощью клеточного сортера. Конструкция pSIP-ConA-hygro теоретически может позволить отбирать клетки с постоянно активным р53 с помощью селекции на антибиотике гигромицине, хотя успех такой селекции во многом может зависеть от чувствительности данного типа клеток к супрессорному действию самого р53.

С использованием конструкции pSIP-ConA-lacZ проведен сравнительный анализ активации р53 в ответ на обработку двенадцатью различными химиотерапевтическими агентами в клетках трех сублиний карциномы человека НСТ116, HCT116/mdm2 и HCT116/ARF, которые экспрессируют гены, влияющие на транскрипционную активность р53. Проведен также анализ активации р53 в четырех культурах клеток человека, имеющих соединительнотканное происхождение - HEF, WI-38, U2OS и НТ1080. Результаты свидетельствуют о том, что становится возможным выявлять с помощью созданной системы тонкие различия в способности клеток активировать р53 в ответ на разнообразные стрессовые воздействия.

Созданные ретровирусные репортерные конструкции позволяют создавать из любых культур клеток репортерные линии, пригодные для отбора химических и генетических модуляторов активности р53 с помощью библиотек химических соединений и генетических элементов. В результате скрининга химической библиотеки отобраны соединения, реактивирующие трансактивационную функцию р53 в клетках А431 и SiHa, в которых подавлена функция эндогенного р53. Показано, что реактивированный р53 способен индуцировать р53-зависимые гены и вызывать апоптоз. Идентифицированные модуляторы активности р53 в дальнейшем могут быть использованы в качестве новых противоопухолевых препаратов.

Апробация диссертации

Материалы диссертации были доложены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, май 2000); XVI зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, февраль 2004); на лабораторном научном коллоквиуме лаборатории пролиферации клеток ИМБРАН.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на,Ц5 страницах машинописного текста, содержит^брисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (всего m ссылок).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение р53-зависимой транскрипции проводят с использованием репортерных конструкций, в которых такие репортерные гены, как гены CAT (хлорамфеникол-ацетилтрансферазы), р-галактозидазы, люциферазы, GFP (green fluorescent protein - зеленого флуоресцентного белка) или других находятся под контролем промоторов, содержащих р53-респонсивные элементы. Для сравнения состояния р53-зависимых путей необходимо добиться эффективного попадания репортерного трансгена в клетки культуры, предсказуемого встраивания в геном и возможности стабильной, чувствительной к

функциональной активации р53 экспрессии трансгена в каждой клетке культуры. Мы поставили перед собой задачу создания такой универсальной ретровирусной репортерной системы, которая бы позволила проводить количественное определение и сравнение транскрипционной активности р53 в культурах клеток различного происхождения.

1. Создание самоинактивирующихся ретровирусных конструкций, несущих различные гены, для оценки транскрипционной активности р53 в клетках

Для обеспечения максимально стандартного и не зависящего от типа клеточной линии способа введения репортерной кассеты мы решили использовать самоинактивирующийся ретровирусный вектор. В ДНК самоинактивирующегося вектора внесена делеция З'-ЬТЯ, которая в процессе ретровирусного заражения благодаря особенностям обратной транскрипции ретровирусной РНК переходит в ДНК левого 5'-ЬТЯ. Таким образом, интегрирующаяся в геном клетки ретровирусная ДНК, ограниченная двумя последовательностями ЬТЯ, оказывается неспособной экспрессировать вирусные элементы и влиять на экспрессию внутренней репортерной кассеты из-за инактивации промоторных свойств левого 5'-ЬТЯ. Эта особенность конструкции отвечает важному требованию -отсутствию в репортерной конструкции каких-либо транскрипционных энхансеров, активность которых могла бы повлиять на работу р53-зависимого промотора. При длительном пассировании некоторые конструкции могут инактивироваться за счет эпигенетических механизмов (метилирование, деацетилирование и прочее) или утраты трансгена. От подобных последствий позволяет избавиться постоянное культивирование клеток в среде с селективным антибиотиком. Поэтому конструкция должна содержать ген устойчивости к какому-либо антибиотику, позволяющий отбирать клетки, в которые попадает репортерная кассета.

Нами были созданы репортерные конструкции pSIP-ConA-GFP (с геном зеленого флуоресцентного белка), pSIP-ConA-lacZ (с геном бактериальной Р* галактозидазы), pSIP-ConA-AP (с геном щелочной фосфатазы), а также конструкция pSIP-ConA-hygro (с геном устойчивости к антибиотику

гигромицину). Конструкции были построены на основе

самоинактивруюшегося ретровирусного вектора pSIP, в котором ген устойчивости к пуромицину находится под контролем промотора гена гистона Н4 человека, не содержащего энхансера. Репортерная кассета расположена слева от промотора Н4 и контролируется минимальным промотором гена основного белка теплового шока Hsp70 (45 п.н.) и блоком р53-респонсивных элементов СопА, состоящим из высокоаффинного консенсусного р53-связьшающего сайта CON (20 пн.) и фрагмента А (49 п.н.) рибосомного кластера генов (рис.1).

Рис.1. Схема репортерной конструкции р81Р-СопА-1ас2. Схемы р81Р-СопЛ-ОБР, р81Р-СопЛ-АР, р81Р-СопА-Ьу;р'о аналогичны, вместо гена бактериальной (}- галактозидазы (1ас2) они содержат гены зеленого флуоресцентного белка (ОБР), щелочной фосфатазы (АР), антибиотика гигромицина (hygгo) соответственно.

2. Проверка системы р53-зависимой активации искусственного промотора

Проверку системы р53-зависимой активации искусственного промотора проводили на зараженных полученными векторами и прошедших селекцию на пуромицине культурах клеток как содержащих, так и не содержащих эндогенный р53 дикого типа.

Первоначально, когда вектор pSIP-ConA-GFP был введен в культуру крысиных фибробластов Ref52, мы наблюдали зеленую флуоресценцию этих клеток. Клетки Ref52 обладают высоким пролиферативным потенциалом, поэтому процент заражения этой культуры оказался высоким, и не было острой необходимости проводить длительную селекцию на антибиотике пуромицине для отбора клеток, содержащих конструкцию. Большинство клеток Ref52/ConA-GFP проявляли специфическую гомогенную флуоресценцию в ультрафиолетовом свете (УФ) (данные не показаны) Как известно из ранее проведенных исследований, р53 в клетках Яе£52 транскрипционно активен, несмотря на то, что содержание самого белка находится ниже предела чувствительности метода. При обработке клеток Ref52 ДНК-повреждающим агентом этопозидом (ингибитор топоизомеразы II) мы наблюдали заметное усиление флуоресценции (данные не показаны).

Интересным представлялось введение репортерной конструкции в клетки, не содержащие эндогенного р53, поскольку в такой системе возможна отработка минимального фонового уровня экспрессии репортера. Для этой цели мы выбрали линию спонтанно иммортализованных ЗТЗ-подобных мышиных фибробластов 10(1), утерявших экспрессию р53 благодаря делециям обеих аллелей гена.

С целью достижения высокой чувствительности и гомогенности эффектов экспрессии репортера мы решили получить индивидуальный клон 10(l)'ConA-GFP. Первый же взятый клон, полученный предельным разведением в 96-луночном плато, оказался чувствительным к экспрессии р53 дикого типа. Как мы и ожидали, клетки, не содержащие эндогенного р53, проявляли лишь невысокую зеленую флуоресценцию, связанную с неспецифическим свечением клеток в УФ (рис.2). При заражении клеток 10(1) ретровирусом, несущим ген дикого р53 под сильным промотором Ц^ мышиного ретровируса (вектор pPS-wtp53) через 3-4 суток после заражения мы наблюдали появление в культуре флуоресцирующих клеток. Этот эффект усиливался обработкой клеток 10/ConA-GFP этопозидом. Культура 10(1)СопА-GFP, зараженная ретровирусом, полученным на основе контрольного вектора pPS-neo, лишенного гена дикого р53, проявляла только неспецифическую флуоресценцию.

Рис.2. Фотографии клона 10(1), несущего конструкцию ConA-GFP, через 4 суток после заражения ретровирусными векторами pPS-neo (А) и pPS-wtp53 (Б, В), в случае В клетки обрабатывались этопозидом (200 нг/мл) в течение последних 36 часов.

Аналогичным образом были получены клоны 10(l)ConA-lacZ Как видно на фотографии (рис 3), только при заражении клеток тем же ретровирусом, несущим ген дикого р53 под сильным промотором, в фиксированной и окрашенной на стекле культуре 10(l)/ConA-lacZ появляются синего ту бые клетки

рР8-пео

рР8-\уф53

Рис. 3. Фотографии клона 10(1), несущего конструкцию ConA-lacZ, через 4 суток после заражения ретровирусными векторами pPS-neo и pPS-vvtp53

Мы также ввели репортерные конструкции в культуру немелкоклеточной карциномы легкого Ш299 человека, которая утеряла экспрессию эндогенного р53 Предельным разведением в 96-луночном плато были получены клоны Ш299/ConA-GFP и Ш299/СопА-lacZ При заражении вектором pPS-wtp53 мы наблюдали в этих клетках активацию экспрессии соответствующих репортерных генов Эффект активации репортерных генов за счет экспрессии р53 дикого типа усиливался обработкой клеток этопозидом (данные не показаны)

Важной характеристикой репортерных линий является кинетика активации репортера под действием индукторов Для этих целей мы использовали клон H1299/Twtp53 с тетрациклин-регулируемым р53 Поскольку в клетках Ш299 нет эндогенного р53, это позволило превратить их в систему для регулируемой экспрессии р53 В эту культуру были последовательно введены ген тетрациклинового активатора ЛА и кДНК р53 дикого типа, клонированная под тетракциклин-регулируемый промотор При удалении тетрациклина из среды тетрациклин-зависимый активатор tTA в клетках H1299/Twtp53 связывается с элементом TRE синтетического промотора и таким образом запускает экспрессию р53 В свою очередь белок р53 активирует промотор с элементом СопА, что приводит к экспрессии репортерных генов и накоплению белков - GFP или Р-галактозидазы

Для тщательною исследования кинетики мы по-прежнему преследовали цель достижения высокой чувствительности к присутствию р53 дикого типа, также гомогенности экспрессии и синтеза репортера в разных клетках культуры Поэтому предельным разведением в 96-луночном плато нами были отобраны индивидуальные клоны H1299/Twtp53/ConA-GFP с введенным репортером pSIP-ConA-GFP и Ш299/Twtp53/ConA-lacZ с введенным репортером pSIP-ConA-lacZ В клетках культур H1299/Twtp53/ConA-GFP, начиная с четвертых-пятых суток культивирования в среде без тетрациклина, наблюдается флуоресценция зеленого бежа (рис 5)

Подобно заражению клеток H1299/ConA-GFP ретровирусом, несущим вектор pPS-wtp53, эффект активации репортерного GFP в клетках H1299/Twtp53/ConA-GFP за счет активации р53 при удалении тетрациклина из среды культивирования усиливался обработкой клеток этопозидом (данные не показаны)

Рис.5. Фотографии клона

H1299/Twtp53/ConA-GFP с тетрациклин-регулируемым р53, несущего

конструкцию ConA-GFP: A - контроль и инкубация в среде без тетрациклина в течение 5 сут.; Б - инкубация в среде без тетрациклина в течение 5 сут., крупный план.

Диаграмма индукции репортерного гена Р-галактозидазы во времени на примере культуры клеток Н1299/Т\у1р53, содержащих конструкцию р81Р-СопА-1ас2, показывает, как происходит функциональная активация р53 во времени (рис.6). Синтез р* галактозидазы на порядок возрастает только на 5-е сутки после культивирования клеток Н1299/Г\у1р53/СопА-lacZ в среде без тетрациклина. Действительно, для активации синтеза р-галактозидазы должно произойти несколько событий: освобождение тетрациклин-зависимого активатора ЛА, активация экспрессии р53, накопление белка р53, активация экспрессии гена Р* галактозидазы и, наконец, накопление в клетке самой галактозидазы.

Рис.6. Кинетика индукции экспрессии репортерного гена галактозидазы, контролируемого р53-зависимым промотором, в клетках H1299/Twtp53/ConA-lacZ (клона 3), содержащих

тетрациклин-регулируемый р53. Экспрессия р53 начинается при удалении тетрациклина ^^ из среды. По оси ординат отложен относительный уровень Р" галактозидазы. Уровень Р-галактозидазы в клетках, культивированных в среде с тетрациклином, принят за единицу.

Мы проверяли ряд клонов Ш299/Twtp53/ConA-lacZ, фиксированных и окрашенных на стекле X-gal после 3-х и 6-ти суток культивирования в среде без тетрациклина (рис.7). На фотографиях видно, что после 3-х суток культивирования в среде без тетрациклина лишь у небольшой группы клеток Ш299/Twtp53/ConA-lacZ появляется слабая голубая окраска. На парных фотографиях, соответствующих тем же клонам после 6-ти суток культивирования в среде без тетрациклина, появляется значительное количество клеток, окрашенных в интенсивно-синий цвет.

Время без тетрациклина

Клон 5 СооА-1асг

Клон 6 СопА-1ас2

Клон 7 СопА-1асг

3 сут

бсут

РМт

4 Ч'

Рис.7. Фотографии клонов

И1299Т\у1р53 СопА-1ас2 с тетрациклин-регулируемым р53, несущих конструкцию СопЛ-1ао2 Клетки инк>бировали в среде без тетрациклина в течение 3 и б суток

Практически все клетки каждого клона к 6 дню культивирования синтезируют -галактозидазу и

окрашиваются в синий цвет Интенсивность окраски клеток в популяции может варьировать, возможно, в зависимости от стадии клеточного цикла Среди полученных клонов

Ш299/Т«1р53/СопА-1ас2 встречаются также клоны очень слабо

экспрессирующие р-галактозидазный репортер (например, клон 7)

При раститровке ингибирующего действия тетрациклина клетки И1299/Т«'1р53/СопА-ОБР выдерживали 5 суток в среде с малыми концентрациями тетрациклина (0001-0 05 мкг/мл) Было обнаружено небольшое различие в свечении клеток, выдержанных в среде без тетрациклина и клеток, выдержанных в среде с небольшими концентрациями тетрациклина (данные не показаны) Для получения более наглядных результатов подобный опыт был проведен на клонах И1299/Т«'1р53/СопА-1ас2 (рис 8) Содержание 0,050 мкг/мл тетрациклина в среде практически полностью отменяет экспрессию р-галактозидазы с промотора СопА В исходной культуре И1299, не содержащей р53, при введении р81Р-СопА-1ас2 голубой окраски клеток не наблюдается (данные не показаны), что указывает на строгую зависимость экспрессии от р53

Рис 8 Фотографии клонов И1299/Т«'1р53/СопА-1ас2 с тетрациклин-регулируемым р53, несущих конструкцию СопА-1ас2 клетки инкубировали в среде с различными концентрациями тетрациклина в течение 5 суток

Нами была предпринята попытка разработать систему позитивной селекции клеток, экспрессирующих функциональный р53. Для этого мы создали конструкцию pSIP-ConA-hygro, которая содержит два гена устойчивости к антибиотикам - ген устойчивости к пуромицину (puro), контролируемый конститутивным промотором гена Н4, и ген устойчивости к гигромицину (hygro), находящийся под контролем р53-зависимого промотора. Конструкция pSIP-ConA-hygro была испытана на фибробластах крысы Ref52, содержащих р53 дикого типа, и клетках Ref52 с введенным доминантно-негативным мутантом р53 (Ref52/GSE22).

Контрольные клетки Ref52, а также клетки Ref52/GSE22, несущие конструкцию pSIP-ConA-hygro, рассевали с одинаковой плотностью и культивировалии в присутствии гигромицина (данные не показаны). Для контроля клетки каждой линии культивировали в среде без антибиотика и в среде с пуромицином. При большой плотности рассева заметной разницы в пролиферации клеток Ref52 и Ref52/GSE22, несущих конструкцию ConA-hygro и культивирующихся в среде в гигромицином не было обнаружено. При меньшей плотности рассева и большей концентрации гигромицина (1000 мкг/мл) обнаруживалось некоторое уменьшение числа колоний Ref52/GSE22 по сравнению с Ref52, хотя они имели больший размер, вероятно, за счет более высокого пролиферативного потенциала, связанного со снижением активности р53.

В альтернативной постановке эксперимента мы использовали р53-негативные клетки Н1299 и клетки Н1299 с тетрациклин-регулируемым р53 дикого типа (H1299/Twtp53), несущие конструкцию ConA-hygro.

Клетки рассевали с одинаковой плотностью и инкубировали часть рассева H1299/Twtp53 с тетрациклином, а часть без добавления тетрациклина, тем самым, влияя на экспрессию р53 в клетках H1299/Twtp53. При этом культуры инкубировали с различными концентрациями гигромицина. Как и в случае опыта с культурами Ref52, негативное влияние р53 на пролиферацию клеток не позволило выявить достоверного снижения числа гигромицин-устойчивых колоний р53-негативных клеток (данные не приведены).

Таким образом, указанным способами нам не удалось провести позитивную селекцию клеток, экспрессирующих р53 дикого типа. С одной стороны, присутствие гигромицина в среде дает преимущество пролиферации клеток с активным р53, несущих конструкцию ConA-hygro; с другой - клетки, экспрессирующие активный р53, подвергаются задержке пролиферации.

Учитывая эти данные, мы сосредоточились на использовании репортерных конструкций на основе GFP и lacZ. Мы получили ряд культур клеток человека из нормальных и опухолевых тканей, сохранивших эндогенный р53 дикого типа, с введенными pSIP-ConA-GFP и pSIP-ConA-lacZ, и протестировали индукцию репортеров после обработки несколькими химиотерапевтическими препаратами, приводящими к активации р53. Мы исходили из предположения, что по характеру активации репортерного гена можно достаточно уверенно судить о состоянии р53-зависимых сигнальных путей в данном типе клеток. В данных экспериментах, а также в последующих опытах мы использовали поликлональные массовые культуры, прошедшие селекцию на пуромицине и содержащие репортерные конструкции.

После обработки повреждающим ДНК агентом доксорубицином клеток карциномы НСТ116 (рис. 9 А, Б) и клеток рака легкого человека А549 (рис. 9 В, Г) (оба типа клеток содержат ген р53 дикого типа) с введенной конструкцией pSIP-ConA-lacZ, наблюдается значительный синтез р-галактозидазы, которая при окраске X-gal придает клеткам синий цвет. В клетках НСТ116 с введенным репортером pSIP-ConA-GFP после обработки доксорубицином наблюдается хорошо видимая зеленая флуоресценция (Рис. 9 Д, Е).

Рис.9. Фотографии клеток НСТ116, несущих конструкцию СопЛ-1ас2 А - контроль, Б - обработка клеток доксорубицином (100 нг/мл) в течение 20 час

Фотографии клеток А549, несущих конструкцию СопЛ-Ьао2 В контроль, Г - обработка клеток доксорубицином (100 нг/мл) в течение 20 час

Фотографии клеток НСТ116, несущих конструкцию СопЛ-ОБР Д - контроль, Е - обработка клеток доксорубицином (100 нг/мл) в течение 20 час

3. Разработка метода количественного измерения транскрипционной активности р53

Измерение уровня Р-галакгозидазы можно проводить количественно в цветной реакции с О-нитрофенилгалактопиранозидом (ОМРО) Это позволило нам разработать количественный метод для оценки транскрипционной активности р53 в изучаемых типах клеток Активность Р-галактозидазы в клетках, выращиваемых в 96-луночных плато и обработанных тем или иным индуктором р53, оценивалась нами следующим образом Сначала измеряли величины поглощения реакционной смеси в лунках и нормировали эти величины на величину поглощения в лунке с необработанными клетками (рис 10 А) Чтобы ввести поправку на гибель клеток под действием проводимых обработок, измеряли величины поглощения раствора в лунках с клетками, прошедшими подобную обработку тем же агентом после окраски по методу Гимза, и нормировали эти величины на величину поглощения лунки с необработанными клетками Таким образом, получали кривые гибели клеток (рис 10 Г)

Поэтому график реальной активации Р-галакгозидазы учитывал только вклад выживших клеток (рис 10 Б) Активация экспрессии р-галактозидазы в клетках карциномы НСТ116 (содержит эндогенный р53 дикого типа) после обработки химиотерапевтическим препаратом 5-фторурацилом (5-Би) (рис 10 А, Б) сопровождается накоплением белка р53, что хорошо согласуется с накоплением белка р21 (рис 10 В) - продукта эндогенной транскрипционной мишени р53, гена р21ЖЛР1/С,р1, ответственного за остановку клеток в фазе О1 клеточного цикла Таким образом, нами было установлено, что данная репортерная система вполне адекватно отражает изменения функциональной активности р53

Рис.10 Демонстрация результатов измерения в 96-луночном плато на

примере обработки клеток НСТ116 5-фторурацилом (5-Би):

А - Изменение относительного уровня р-галактозидазы (отложен по оси ординат) в клетках НСТ116 после обработки 5-ри без нормирования на количество живых клеток в лунке. Уровень Р* галактозидазы в необработанных клетках НСТ116 принят за единицу.

Б - Изменение относительного уровня {}-галактозидазы (отложен по оси ординат) в клетках НСТ116 после обработки 5-FU с нормированием по количеству живых клеток в лунке. Уровень галактозидазы в

необработанных клетках НСТ116 принят за единицу.

-НСГ116

—О—НСГ116

50 100 150 200 0 5-Щ млк! ^

100 150 200 5-Щ мкг/мл

р53-

5-П1, мкг/мл 0

р21-

5-ГС1, мкг/мл о

В - Вестерн-блот анализ изменения количества белков р53 и р21 в клетках НСТ116 после обработки 5-ри.

100 150 200 5-111, мьг/мл

Г - Зависимость гибели трех сублиний НСТ116/тёш2, НСТ116 и НСГП6/АКР под действием 5-Би, полученная путем измерения интенсивности окраски фиксированных клеток по методу Гимза. Интенсивность окраски на количество живых клеток в лунках, не обработанных 5-Би, принята за единицу для каждой линии.

Л Сравнительный анализ трансактивационных свойств р53 в различных культурах клеток

Для определения тонких различий в характере функционирования р53-зависимых сигнальных путей нами были использованы субкультуры клеток карциномы толстого кишечника НСТ116 с введенными генами, для которых известно, что они влияют на транскрипционную активность р53. Культура НСТ116/тёш2 экспрессирует ген введенного природного ингибитора белка р53, белка шёш2. Культура НСГП6/АКР экспрессирует ген АИБ, продукт которого препятствует тс1т2-зависимой деградации р53. Данные клетки, а также контрольную культуру НСТ116, высевали на 96-луночные плато и обрабатывали параллельно двенадцатью веществами, известными как индукторы активности р53 и применяющимися в химиотерапии рака. Результаты данного опыта могли указывать на роль генов шёш2 и АИР в модуляции ответа опухолевых клеток на химиотерапевтическую индукцию р53.

Как видно из диаграмм рис. 11, во всех трех линиях транскрипционная

активность белка р53 относительно активности в контрольных необработанных клетках, повышается приблизительно одинаково в ответ на обработку всеми исследованными веществами, за исключением 5-FU и PALA.

Рис11. Сравнительный анализ изменения относительного уровня р-галактозидазы (отложен по оси ординат) в клетках трех сублиний HCT116/mdm2, HCT116/ARF и НСТ116 под действием различных химиотерапевтических агентов с нормированием по количеству живых клеток. Уровень Р-галактозидазы в необработанных клетках принят за единицу для каждой линии. Клетки обрабатывали в течение 24 час. каждым из веществ, за исключением доксорубицина и этопозида, в случае которых обработку проводили в течение 36 часов. Принятые сокращения: ММС - метил-метан сульфонат, ЭМС - этил-метан сульфонат, 5-FU - 5-fluoro uracil (5-фторурацил), DFO - deferoxaminum (дефероксамин), PALA - N-(phosphonacetyl)-L-aspartic acid ^-фосфонацетил^ аспарагиновая кислота). Полученные результаты -усреднение трех независимых опытов.

По-видимому, расхождение графиков активности р-галактозидазы в

случае обработки 5-Би (приводит блокированию синтеза ДНК и к образованию структурно несовершенной РНК) клеток ИСТ116/шдш2, НСТ116/АКР и НСТ116 обусловлено большой относительной величиной активации р53 (больше, чем в 7 раз). В случаях обработки всеми остальными веществами при невысокой степени активации р53 (меньше, чем в 7 раз) очевидно пропорциональное элиминирование различий, обусловленных разницей между уровнями Р-галактозидазы (рис.12) в клетках трех линий НСТ116, при подсчете относительного уровня активности р-галактозидазы в ответ на обработку в клетках каждой линии (рис. 11). Возможно, предел ингибирующего действия шёш2 на трансактивацию р53 объясняет то, почему при существенной активации р53 (больше, чем в 7 раз) в клетках ИСТ116/шёш2 в ответ на 5-Би относительная активность Р-галактозидазы проявляется сильнее, чем в родительской линии НСТ116. Подобно последнему замечанию, возможно, активирующего действия АКБ при высокой активации р53 в клетках НСТ116/АКР недостаточно, и график относительной активности р-галактозидазы в клетках НСТ116/АКР проходит ниже графика родительской линии НСТ116.

Рис 12. Соотношение уровней р-галактозидазы в необработанных клетках трех сублиний ИСТ116/шёш2, НСТ116 и НСТ116/АКР. За единицу принят уровень Р-галактозидазы в клетках НСТ116.

Определение количества белка в этих клетках с помощью метода вестерн-блотинга указывает на то, что уровень р53 и его транскрипционной мишени - белка р21 - в контрольных необработанных клетках НСТ116/АКР (по сравнению с контрольными необработанными клетками НСТ116/шёш2 и НСТ116) более высок (рис. 13). Повышенное содержание белков р53 и р21 в контролях согласуется с данными, представленными на диаграмме рис. 12 и может быть объяснено активирующим действием АКБ на р53. В случае обработки 5-Би во всех трех культурах накапливается и р53, и р21; однако в клетках НСТ116/АКР различие в количестве белка р53 между контролем и обработанными клетками невелико, поскольку уровень белка р53 в контрольных клетках достаточно высок и без обработок (рис. 13).

Рис.13. Вестерн-блот анализ изменения количества белков р53 и р21 в клетках НСТ 116, содержащих эндогенный р53 дикого типа, после обработки 5-фторурацилом (5-Би) в течение 24 час.

Следует отметить, обработка PALA приводит к реактивации подавленных путей индукции белка р53 в клетках HCT116/mdm2, в результате чего в этих клетках наблюдается в два раза более высокое повышение относительного уровня (J- галактозидазы в ответ на обработку PALA по сравнению с контролем, чем в клетках НСТ11 б и HCT116/ARF (рис. 11). В ответ на обработку PALA происходит накопление белка р53 во всех трех культурах, но это не сопровождается увеличением синтеза бежа р21 (данные не показаны). Возможно, это объясняется относительно слабой индукцией активности р53. Эффект PALA связан с угнетением фермента аспартат-транскарбамилазы, что приводит к подавлению в клетках синтеза цитозин- и уридинтрифосфатов, которое через определенный промежуток времени приводит к нарушениям синтеза нуклеиновых кислот, повреждениям ДНК и активации р53. Интересно отметить, что PALA используется для повышения терапевтического действия 5-FU при раке толстого кишечника.

Клетки НСТ116 являются классической моделью клеток рака толстого кишечника, использованной для выявления ряда конкретных генетических повреждений, имеющих место в этом типе раковых клеток. В клетках НСТ116 из-за мутации в 13 кодоне постоянно активирован Ki-ras ген. В них также отсутствует одна аллель гена-стимулятора апоптоза Ьах, который также является транскрипционной мишенью р53. Это может частично объяснять тот факт, что устойчивость клеток НСТ116 к апоптозу в ответ на обработку 5-FU повышена. Наблюдается в этих клетках также гиперэкспрессия гена бежа mdm2, что, вероятно, обусловливает высокую пролиферативную активность клеток НСТ116 и, соответственно, их устойчивость к обработке химиотерапевтическими агентами. В наших опытах мы наблюдали, что при дополнительной экспрессии mdm2 выживаемость клеток HCT116/mdm2 в ответ на обработку практически всеми химиотерапевтическими препаратами по сравнению с клетками НСТ116 и НCТ116/ARF повышается еще более (рис. 10, пример обработки 5-FU).

Для многих раковых опухолей характерна гиперэкспрессия mdm2 при сохраненной функции р53. Нам кажется, что более сильное повышение при обработке PALA и 5-FU относительного уровня активности р53 в клетках культуры HCT116/mdm2 по сравнению с родительской линией НСТ116, которой уже присуще повышение экспрессии mdm2, и клинически испытанное совместное использование PALA и 5-FU для лечения рака толстого кишечника - неслучайная корреляция. Объяснение этих наблюдений требует дальнейшего исследования. Оба химиотерапевтических антиметаболита вызывают нарушения пула нуклеотидов в клетке: PALA является ингибитором фермента аспартат-транскарбамилазы, а 5-FU - превращается в раковых клетках в 5-фтор-2-дезоксиуридин-5'-монофосфат, который является конкурентным ингибитором фермента тимидилатсинтетазы. Кривые гибели клеток линий НCТ116/ARF и НСТ116 в ответ на обработку PALA (данные не показаны), также как и в ответ на обработку 5-FU (рис. 10, Г) практически совпадают, а кривые гибели клеток HCT116/mdm2 в ответ на обработку PALA и 5-FU идут выше кривых гибели других двух линий. Возможно поэтому, в клетках линии HCT116/mdm2 активация р53 проявляется сильнее в ответ на обработку PALA и 5-FU благодаря завышенному пролиферативному потенциалу HCT116/mdm2 по сравнению с родительской линией НСТ 116. В клетках HCT116/mdm2 ускоренно протекают такие пролиферативные метаболические процессы, как синтез нуклеиновых кислот. Соответственно, ускоренное накопление повреждений, специфично вызванное именно нарушениями пула нуклеотидов в клетках HCT116/mdm2, может способствовать повышенной относительной активации р53 в этих клетках по сравнению с родительской линией и линией НCТ116/ARF.

Кроме различий в активации р53 в трех линиях НСТ116 в ответ на обработку 5-FU и PALA заметно также, что в ответ на обработку ММС (алкилирующий ДНК агент) культура HCT116/mdm2 проявляет более высокий цитотоксический порог чувствительности к действию данного агента по сравнению с родительской культурой НСТ 116, а также с культурой НСТ 116/ARF.

Активация р53 может происходить с использованием различных сигнальных путей. Например, в отличие от реакции клеток НСТ116 трех сублиний на обработку 5-БИ, которая сопровождается повышением уровней белков р53 и р21, обработка ММС не приводит к заметному накоплению этих белков (данные не показаны), хотя активность р-галактозидазы в клетках НСТ116 и повышается в 3-5 раз (рис. 11). Это хорошо согласуется с данными, указывающими на возможность повышения активности р53 под действием ММС за счет конформационных перестроек белка. Как известно, активация белка р53 не всегда сопровождается количественным увеличением его уровня. Аналогично, не наблюдается накопления этих белков в клетках ИСТ116/шдш2, НСТ116/АКР и НСТ116 в ответ на обработку цитохалазином Э, блокирующим рост актиновых филаментов (данные не показаны), что согласуется с фактом слабой (1,5 раза) активации в них экспрессии репортера Р-галактозидазы (рис. 11). В то же время, в ответ на обработку клеток колцемидом, разрушающим микротрубочки, происходит накопление небольшого количества белка р53 и слабая активация синтеза р21 (данные не показаны) при относительно низком уровне синтеза репортера.

Для того, чтобы показать другие возможности репортерной системы, мы сравнивали характер индукции р53 в четырех культурах, являющихся производными клеток соединительной ткани человека (рис.14). Клетки НЕБ (фибробласты 8-недельного эмбриона человека) и "Ш38 (фибробласты легкого 5-месячного эмбриона человека) представляют собой нормальные первичные клетки. Клетки НТ1080 и И208 соответственно происходят из фибро- и остеосарком человека. Несмотря на то, что культуры нормальных клеток НЕБ и "Ш38, как можно ожидать, не должны иметь повреждений в р53-зависимых путях, были отмечены некоторые различия в характере индукции репортерного гена в ответ на различные обработки в этих культурах.

Рис.14. Соотношение уровней р-галактозидазы в необработанных клетках линий НЕБ, "Ш-38, НТ1080 и И208. За единицу принят уровень р. галактозидазы в клетках НЕБ.

Так, в ответ на добавление доксорубицина (блокирует матричную активность ДНК в системах ДНК-полимеразы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы) и цисплатины (алкилирует и сшивает нити ДНК) функциональная активация р53 в клетках НЕБ проявляется сильнее, чем в других клетках; в том числе она выше, чем в клетках "Ш38 (рис.15). Оба агента (доксорубицин и цисплатина) приводят к нарушению синтеза ДНК. Но после обработки цитохалазином Э (блокирует рост актиновых филаментов) активация р53 в клетках НЕБ не наблюдается (рис. 15). В клетках "Ш38 р53 активируется наиболее заметно при обработке 5-БИ (в 10 раз), тогда как в других культурах, в том числе и клетках НЕБ, он активируется всего лишь в 3-5 раз (рис. 15). При этом наблюдается значительное накопление белка р53 во всех культурах (рис. 16), в том числе в клетках И208, где его уровень низок, возможно, вследствие метилирования промотора гена АИР. Активацию синтеза р21 при обработке 5-БИ удалось обнаружить только в клетках "Ш38 и И208 (рис. 16).

Рис.15. Сравнительный анализ изменения относительного уровня р-галактозидазы (отложен по оси ординат) в клетках четырех фибробластоподобных линий НЕБ, "Ш-38, НТ1080 и ШО8 под действием различных химиотерапевтических агентов с нормированием по количеству живых клеток. Уровень. Р-галакгозидазы в необработанных клетках принят за единицу для каждой линии. Клетки обрабатывали в течение 24 час. каждым из веществ, за исключением доксорубицина и этопозида, в случае которых обработку проводили в течение 36 часов. Принятые сокращения - как на рис. 11. Полученные результаты - усреднение трех независимых опытов.

Рис.16. Вестерн-блот анализ изменения количества белков р53 и р21 в клетках четырех линий, содержащих эндогенный р53 дикого типа, после обработки 5-фторурацилом (5-Би) в течение 24 час.

Интересно отметить, что в клетках НТ1080, в ответ на обработку ингибиторами топоизомеразы II - доксорубицином и этопозидом, а также при обработке таксолом и колцемидом, препятствующими правильной сборке микротрубочек, активность р-галактозидазы практически не повышается (рис. 15). Это не может объясняться только исходно высоким уровнем экспрессии р53-зависимого репортера в необработанных клетках НТ1080 (рис. 14), т.к. в ответ на обработку остальными веществами в клетках НТ1080 происходит индукция Р-галактозидазной активности, сравнимая с реакцией других типов клеток (рис. 15). Возможно, в активации р53 в ответ на действие этих четырех веществ задействованы сигнальные биохимические пути, испорченные в опухолевых клетках НТ1080. Например, известно, что в индукции р53 под действием таксола участвуют MAP-киназные пути. Клетки НТ1080 экспрессируют активированный онкоген Ras, что сопровождается постоянной активацией МАР-киназного каскада в них и, соответственно, повышением уровня белка и активности р53 (см. рис. 14, 16). Если предположить, что за активацию р53 под действием таксола отвечают те же каскады, которые активированы в клетках НТ1080 экспрессией онкогена Ras, становится понятно, почему мы в данном случае не наблюдаем повышения активности р53.

Особенностью клеток U2OS является отсутствие реакции на обработку колцемидом (рис.15). На остальные вещества клетки реагировали приблизительно одинаково, хотя можно отметить несколько более низкий уровень активации р53 в более медленно растущих клетках U2OS и HEF в опытах, где клетки обрабатывали дефероксамином (имитатор гипоксии) и гидроксимочевиной, ингибирующей синтез ДНК. Практически одинаковая реакция характерна для всех типов клеток в ответ на обработку этилметансульфонатом (ЭМС, алкилирующий агент), хотя заметное накопление белка р53 при этом наблюдалось только в клетках WI3 8 (данные не показаны).

Каждая человеческая культура, несущая репортерную конструкцию р-галактозидазы, проявляет собственный портрет активации р53 в ответ на различные химиотерапевтические агенты, в соответствии с специфическим состоянием сигнальных путей в клетках этой культуры. Предлагаемый в работе способ оценки транскрипционной активности р53 по р53-засисимому синтезу Р-галактозидазы (метод окраски ОМРО) в 9б-луночном плато позволяет количественно характеризовать изменения активации антионкогена р53 в зависимости от вариаций внутриклеточного контекста. Мы использовали двенадцать химиотерапевтических агентов различной природы, вызывающих повреждения ДНК или цитоскелета. В литературе есть сведения о вызываемой этими веществами активации определенных биохимических каскадов в клетке. При надлежащем выборе химических агентов, вызывающих активацию р53, возможно выбрать тестовую систему для проверки состояния сигнальных путей клетки, связанных с р53.

5. Применение р53-зависимых репортерных систем для поиска химических реактиваторов р53 в опухолевых клетках

Как известно, функция р53 повреждена в подавляющем числе злокачественных заболеваний человека. Утрата активности р53 сопровождается значительным уменьшением генетической стабильности и быстрым отбором наиболее агрессивно растущих опухолевых клеток. Известно также, что опухолевые клетки приобретают повышенную чувствительность к экспрессии экзогенно-введенного р53 дикого типа. Это обстоятельство в последнее время служит основой для разработки новых терапевтических схем, например, подхода с использованием рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих дикий р53. Альтернативным подходом для терапевтического восстановления активности р53 в опухолевых клетках может быть химическая реактивация р53. Известно, что приблизительно половина опухолей человека экспрессирует высокий уровень мутантного р53. В случае подбора химического вещества, способного при взаимодействии с мутантным р53 исправлять его конформацию и восстанавливать транскрипционную активность, можно ожидать проявления выраженного токсического эффекта, который должен быть специфичным в отношении опухолевых клеток и не затрагивающим нормальные клетки. Кроме точечных мутаций в самом гене, функция р53 может повреждаться за счет других механизмов. В частности, более 95% случаев рака шейки матки связано с инактивацией р53 под действием продукта гена Е6 вируса папилломы человека HPV16. Взаимодействие белка Е6 с р53 приводит к активации клеточной ЕЗ лигазы Е6-АР и быстрой протеолитической деградации р53. Благодаря тому, что в клетке сохраняются неповрежденными все компоненты р53-зависимой системы, в случае подавления активности вирусных генов может происходить индукция р53, сопровождающаяся ограничением пролиферации и гибелью клеток рака шейки матки. Таким образом, в данном случае можно проводить поиск химических соединений, препятствующих взаимодействию вирусного белка Е6 с р53, или атакующих другие стадии вирус-специфического подавления активности р53. Подобные соединения могут стать прототипами новых высокоспецифичных химиотерапевтических противоопухолевых препаратов.

Разработанная нами высокочувствительная система определения активности р53 может быть использована для широкомасштабного поиска химических реактиваторов р53 в различных опухолевых клетках человека. Для демонстрации возможностей данного подхода нами были использованы две модели опухолевых клеток человека, в которых р53 инактивирован за счет различных механизмов. В клетках А431 (эпидермоидная карцинома человека) ген р53 мутирован в 273 кодоне, в результате чего клетки экспрессируют высокий уровень мутанта p53-His273. В клетках SiHa (рак шейки матки) активность р53 подавлена за счет экспрессии гена Е6 вируса папилломы HPV16. При введении р53-зависимого репортера pSIP-ConA-lacZ в клетки А431 и SiHa и окраске X-gal активность Р-галактозидазы не детектируется (рис. 17). При заражении клеток А431 рекомбинантным лентивирусом, экспрессирующим р53 дикого типа, появляются клетки с ярко выраженной активностью галактозидазы, что указывает на появление в них транкрипционной активности р53. При аналогичном введении р53 дикого типа в клетки SiHa индукция активности р53 происходит слабо, так как экзогенный р53 подвергается быстрой деградации под действием бежа Е6 вируса папилломы. Для подбора условий, при которых активность репортера проявляется, мы провели экспрессию специфической siPHK против гена Е6 HPV16. Мы провели заражение клеток SiHa рекомбинантным лентивирусным конструктом, в котором шпилечная РНК, соответствующая участку гена Е6, экспрессируется под контролем промотора гена HI РНК (транскрибируется РНК полимеразой III). Кроме того, мы провели обработку клеток SiHa рядом известных индукторов активности р53 и обнаружили, что ММС (метилметан сульфонат) вызывает исключительно сильную активацию галактозидазы в клетках SiHa (рис.17). Механизм действия ММС на активность р53 в клетках SiHa не совсем ясен.

позитивным контролем при поиске других

Однако данная обработка могла служить химических соединений, реактивир)ющих р53

Рис.17. Фотографии

клеток А431 и 81На, А431 несущих конструкцию СопА-1ас2.

контроль, через 4 суток после заражения

лентивирусными векторами,

экспрессирующими р53 дикого типа, а также 81Н g, обработка ММС (40 мкг/мл) в течение 24 часов в случае клеток 81На

Из массовых культур клеток А431 и SiHa были отобраны клоны, обладающие минимальным фоном экспрессии ß-галактозидазы без действия индуктора, но демонстрирующие максимальную индукцию репортера при контрольных обработках (введение рекомбинантного р53 дикого типа для линии Л431 и действие ММС дня линии SiHa) Эти клоны были переданы в компанию "Quark Biotech Inc " (Ness Ziona, Israel) для проведения широкомасштабного скрининга химической библиотеки Скрининг проводился следующим образом репортерные линии клеток высевали на 384-луночные плато, в каждую лунку добавляли ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл индивидуального соединения из химической библиотеки (46 тыс соединений, производитель - компания "ChemBndge Corp", San Diego, California) После этого клетки инкубировали 20 часов в инкубаторе Далее инкубационную среду удаляли, клетки инкубировали в лизирующе-красящем буфере, содержащем ONPG, в течение 2 часов Реакцию активации ß-галактозидазы измеряли с помощью прибора Microplate Reader при длине волны 414 нм Процедуру скрининга проводили трехкратно, усредняли результат, после чего отбирали химические соединения, вызывающие двух и более кратное повышение активности ß-галакгозидазы Наиболее активные из отобранных соединений затем тестировали на определение дозозависимой индукции репортера в соответствующей репортерной культуре (рис 18) Структура одного из соединений, активирующих репортер в клетках А431 - А-343, и одного соединения, влияющего на р53-зависимую транскрипцию в клетках SiHa - S-742 показана на рис 19

Рис 18. Дозозависимая индукция галактозидазного репортера в клетках А431, обработанных четырьмя соединениями, выявленными при скрининге химической библиотеки Уровень активности галактозидазы (отложен по оси ординат) в необработанных клетках принят за единицу

Рис. 19. Структура двух

соединений, активирующих р53-зависимый р-галактозидазный репортер в клетках А431 (А-343) nSiHa(S-742).

А-343 Б-742

Отобранные соединения подвергали дополнительному тестированию на специфичность их действия, инкубируя с рядом контрольных репортерных линий. В число контрольных входили следующие линии клеток человека с введенным конструктом pSIP-ConA-LacZ: НСТ116, экспрессирующие р53 дикого типа; Н1299, негативные по экспрессии р53; СЗЗА -клетки рака шейки матки, экспрессирующие мутант p53-Cys273 и негативные по экспрессии генов вируса HPV16; SiHa клетки с подавленной экспрессией эндогенного р53 (за счет введенной siPHK). Обработка клеток А431 (рис. 20 А) и SiHa (рис. 20 Б) отобранными соединениями А-343 и S-742 приводила к зависимому от дозы возрастанию экспрессии Р-галактозидазного репортера. Соединение А-343, отобранное на линии клеток А431, не вызывало ицдукции репортера на р53-негативных клетках Ш299, также как и на экспрессирующих эндогенный р53 дикого типа клетках НСТ116, что говорит о специфичности соединения А343 к реактивации мутанта p53-His273. Соединение S-742, отобранное на клетках SiHa, не вызывало активации р-галактозидазы в НРУ16-негативных клетках СЗЗА. Обработка клеток вШа 81РНК к р53 приводила к практической потере способности индуцировать (5-галактозидазу под действием S-742, что указывает на роль реактивированного р53 в индукции репортера.

Рис. 20. Определение зависимости индукции (Цгалактозидазного репортера под действием соединения А-343 (А) и 8-742 (Б) от состояния р53-зависимых сигнальных путей в различных культурах клеток. Уровень активности галактозидазы в необработанных клетках принят за единицу.

Адекватность индукции репортера по отношению к повышению

трансактивирующих свойств р53 была продемонстрирована с помощью Northem-

гибридизаций РНК из клеток SiHa, обработанных соединением S-742 с пробами на р53-респонсивные гены р21, IGF-BP3 и hdm2 (рис. 21).

Контроль S-742

Рис. 21. Индукция р53-зависимых генов после обработки клеток SiHa соединением S-742 (при 10 мкг/мл в течение 20 часов), ^гШстп-гибризизация.

SiHa SiHa-si-p53

Рис. 22. Ицдукция апоптоза через 48 часов после добавления к клеткам SiHa и SiHa-si-p53 соединения S-742 (10 мкг/мл), процент Annexin V-положительных клеток.

Кроме того, в клетках SiHa, обработанных соединением S-742 (10 мкг/мл) детектировался повышенный уровень апоптоза при окраске Аннексином V (рис. 22). При обработке клеток SiHa с введенной siPHK к р53 уровень апоптоза был значительно снижен, что указывает на роль реактивированного р53 в индукции апоптоза под действием обработки соединением S-742.

Приведенные примеры применения репортерных систем для идентификации соединений, которые реактивируют поврежденные р53-зависимые пути в опухолевых клетках, указывают на возможности, открываемые использованием данных систем. В настоящее время в нашей лаборатории в сотрудничестве с несколькими компаниями продолжается поиск химических соединений, влияющих на активность р53-зависимых сигнальных путей в нормальных, а также в опухолевых клетках различного происхождения. Такие соединения могут стать прототипами новых противоопухолевых препаратов.

Помимо использования для поиска химических веществ, влияющих на активность р53, данная система может найти применение для поиска новых генов или отдельных генетических элементов, активность которых влияет на функцию р53. Экспрессионные библиотеки кДНК, или библиотеки siPHK, соответствующие различным генам, могут быть введены в культуры, содержащие р53-зависимый GFP-репортер, после чего клетки с измененной активностью р53 могут отбираться на клеточном сортере с последующим анализом кДНК или siPHK. Данный подход в настоящее время активно разрабатывается в нашей лаборатории в сотрудничестве с компанией "System Biosciences" (Mountain View, California). По аналогии с описанной здесь р53-зависимой репортерной системой создаются и используются системы для анализа других транскрипционных факторов, активность которых меняется при различных патологических состояниях, например, факторов E2F, NFKB, p73, HIFla и других. Создание семейства репортеров, обнаруживающих активность определенных транскрипционных факторов, безусловно, даст новый мощный инструмеш1 для функциональной геномики, а также для поиска новых противоопухолевых препаратов.

Выводы

1. Созданы самоинактивирующиеся ретровирусные р53-зависимые репортерные конструкции pSIP-ConA-GFP (с геном зеленого флуоресцентного белка), pSIP-ConA-lacZ (с геном бактериальной Р-галактозидазы) и конструкция pSIP-ConA-hygro (с геном устойчивости к гигромицину), которые обеспечивают эффективное и стандартизированное введение репортерного гена в культуры клеток различного происхождения.

2. Получена панель крысиных, мышиных и человеческих культур, гомогенно экспрессирующих полученные репортерные конструкции. Репортерная конструкция pSIP-ConA-lacZ благодаря недолгому времени жизни ß-галактозидазы дает преимущество для исследования кинетики активации р53, конарукция pSIP-ConA-GFP удобна для визуального обнаружения отдельных клеток с активным р53. Использование репортерных конструкций pSIP-ConA-GFP и pSIP-ConA-hygro позволяет проводить позитивную селекцию клеток с функционально-активным р53.

3. Метод определения репортерной рчгалактозидазы в 96-луночном плато дает количественную оценку транскрипционной активности р53, что подтверждено четкой корреляцией между активацией синтеза репортерной галактозидазы, накоплением белка р53 и активацией продукта гена-мишени р53 - белка р21.

4. С использованием конструкции pSIP-ConA-lacZ проведен сравнительный анализ активации р53 в трех сублиниях карциномы человека НСТ116, экспрессирующих гены mdm2 и ARF, влияющие на транскрипционную активность р53, а также в четырех независимых культурах клеток человека, имеющих соединительнотканное происхождение. Продемонстрирована возможность выявления тонких различий в активации р53 в ответ на различные воздействия, что позволяет оценивать функциональное состояние отдельных элементов сигнальных путей активации р53 и получать индивидуальный портрет клеточной культуры по характерным реакциям на обработку стрессовыми агентами.

5. С использованием полученных конструкций в результате скрининга химической библиотеки отобраны соединения, реактивирующие транскрипционно-активный р53 в репортерных культурах человека А431 (эпидермоидной карциномы с мутантным р53) и SiHa (карциномы шейки матки с инактивированным белком р53). Показано, что реактивированный р53 способен индуцировать р53-зависимые гены и вызывать апоптоз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Струнина СМ., Иванов А.В., Чумаков П.М. "Разработка репортерной системы для тонкой количественной оценки активности бежа р53 в культурах клеток" - Молекулярная биология, 2003, том 37, № 6, с. 1007-1018.

2. Моргункова АА., Алмазов В.П., Струнина СМ., Копнин Б.П., Чумаков П.М. "Доминантно-негативная инактивация р53: влияние количественных соотношений трансдоминантного ингибитора и его мишени" - Молекулярная биология, 2003, том 37, № 1, с. 112-120.

3. Струнина СМ. "Сравнительное изучение транскрипционной активности белка р53 в иммортализованных фибробластах". - XL Юбилейная научная конференция МФТИ, Долгопрудный, 28-29 ноября 1997. Тезисы докладов, вып.З, с.84.

4. Струнина СМ., Иванов А.В., Чумаков П.М. "Система, позволяющая изучать трансактивационную функцию антионкогена р53". - Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 28 мая-2 июня 2000. Тезисы, том 2, УШ.28, с.138-139.

5. Струнина СМ. "Измерение функциональной активности онкосупрессора р53: сравнительный портрет активации в человеческих линиях в ответ на обработку химиотерапевтическими агентами" - XVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 912 февраля 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с.95.

Отпечатано 0 00 «РЕГЛАНТ» Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 327 115230, г. Москва, Электролитный пр., д. ЗБ, ар. 1-7.

Тел.: 317-70-09.

Р19Ш

РНБ Русский фонд

2005-4

16736

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Струнина, Светлана Михайловна

с« СТР

Список сокращений.

Таблица сведений о химиотерапевтических препаратах, использующихся в работе.

Введение.

Обзор литературы.

1. Характеристика гена р53.

2. Характеристика белка р5 3.

2.1. Структура белка р5 3.

2.2. Внутриклеточная локализация р53.

2.3. Регуляция деградации р53 в клетке.

3. Участие р53 в различных клеточных процессах.

4. Участие р53 в регуляции транскрипции.

4.1. Трансактивационные свойства р53.

4.1.1 Мишень р53 ген р21™/сф1.

4.1.2 Мишень р53 ген тс1т2 (Ь(1т2).

4.2 Клеточные гомологи р53 - белки рбЗ и р73.

4.2. Репрессирующая активность р53.

4.3 Методы оценки трансактивирующей способности р53.

5. Конформационные изменения р53 и вызывающие их факторы, отвечающие за функциональную активность р53.

6. Воздействия, приводящие к активации р53.

7. Влияние р53 на клеточный цикл и апоптоз.

8. Нарушения функции р53 в опухолях.

Материалы и методы.

1. Получение компетентных клеток ОН5а (Е.СоК) и бактериальная трансформация плазмидной ДНК.

2. Препаративное выделение плазмидной ДНК.

3. Аналитическое выделение плазмидной ДНК.

4. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами).

5. Получение векторной ДНК и олигонуклеотидных вставок.

6. Реакция лигирования.

7. Отжиг и достройка олигонуклеотидов фрагментом Кленова.

8. Получение ретровирусных векторов, несущих репортерные гены.

9. Клеточные культуры и условия их культивирования.

10. Введение плазмидной ДНК в эукариотические клетки.

11. Определение концентрации тотального белка в клеточном лизате методом Бредфорд.

12. Определение Р-галактозидазы.

13. Определение щелочной фосфатазы.

14. Разделение и обнаружение белков.

15. Выделение тотальной РНК из эукариотических клеток.

16. Определение РНК в образцах методом Northern гибридизации.

17. Определение процента апоптирующих клеток.

Результаты и их обсуждение.

1. Создание самоинактивирующихся ретровирусных конструкций, несущих различные гены, для оценки транскрипционной активности р53 в клетках.

2. Проверка системы р53-зависимой активации искусственного промотора.

3. Разработка метода количественного измерения транскрипционной активности белка р53.

4. Сравнительный анализ трансактивационных свойств р53 в различных культурах клеток.

5. Применение р53-зависимых репортерных систем для поиска химических реактиваторов р53 в опухолевых клетках.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53"

Обзор литературы.15

5'В ^2 5'Е^р<шс)е ГУЕРЕвГО) Этопозид Смах=3 мкг/мл ММв {МеЛу1 теЛапе-виКо^е) ММС (Метил-метан суль<Ьонат) Смах = 50 мкг/млМеханизм действия связан с ингибированием топоизомеразы II. Этопозид специфичен в отношении следующих фаз митотического цикла: блокирует вг фазу, вызывает гибель клеток в вг фазе и поздней Б-фазе. Этопозид не ингибирует сборку микротрубочек. Высокие концентрации (10 мкг/мл и выше) вызывают лизис клеток на входе в митоз. Низкие концентрации (0.3-10 мкг/мл) ингибируют вхождение клеток в профазу. Связывание с белками плазмы составляет примерно 90% (при концентрации 10 мкг/мл). Цитотоксическое действие в отношении нормальных здоровых клеток наблюдается только при использовании препарата в высоких дозах. Алкилирующий ДНК агент.

Противоопухолевый препарат. Является полусинтетическим производным подофиллотоксина.

Острый монобластный и миелобластный лейкоз, лимфогранулематоз, неходжкинские лимфомы, герминогенные опухоли (опухоли яичка, хорионкарцинома); рак яичников; мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого; рак желудка (для монотерапии и в составе комбинированной терапии), саркома Юинга, нейробластома. Дозы: 50-60 мг/м2 0.4-0.5 мкг/мл внутривенно в течение некольких дней, общая доза не более 400 мг/м г, 3.2 мкг/мл. EMS (Ethyl methane-sulfonate) ЭМС (Этил-метан сульфонат) Смах = 1 мг/мл 5-FU (Phthoruracilum, 5-FIuoro uracil) 5-Фторурацил, 2,4-Диоксо-5-фторпиримидин смах = 130 мкг/мл Taxol (paclitaxel) Таксол смах = 0-7 мкг/млАлкилирующий ДНК агент. Превращается в раковых клетках в 5-фтор-2-дезоксиуридин-5'-монофосфат, который является конкурентным ингибитором фермента тимидилатсинтетазы, принимающей участие в синтезе нуклеиновых кислот, приводит блокированию синтеза ДНК и к образованию структурно несовершенной РНК (вследствие внедрения флуороурацила в ее структуру). Механизм действия связан с влиянием на процесс деления клетки. Нарушает процесс сборки и разборки микротрубочек митотического веретена, что приводит к накоплению в клетке аномальных пучков нефункционирующих микротрубочек и, тем самым, нарушает процесс митоза.

Противоопухолевое средство из группы антиметаболитов, блокирующее деление клеток. Противоопухолевый препарат.

Противоопухолевое средство, содержит центральный атом платины, соединенный с двумя аммониевыми радикалами в цис-положении. Комплексообразующее соединение.

Оксипроизводное мочевиныИспользуется для повышения терапевтического индекса фторурацила при раке желудка и толстой кишки. Хронический миелолейкоз, лимфогранулематоз, лейкоз, меланома, пустулезный псориаз, эритремия, меланомалигнома, псориатическая эритродермия, синдром Снеддона-Уилкинсона, метастазы рака молочной железы, рак яичников, хорионкарцинома матки, опухоли головы и шеи, опухоль мозга. Дозы: внутрь 0.5 г гидроксимочевины 3-4 раза в день (3-4 нед); 80 мг/кг 0.08 мг/мл 1 раз в 3 дня; 20-30 мг/кг 0.02-0.04 мг/мл ежедневно (6 нед).

СМосИа^т РЦитохалазин Р сМах -1-2 мкг/млФункционально цитохалазины напоминают кепирующие белки. Они связываются с оперенным (быстро растущим) концом актинового филамента и блокируют как присоединение, так и отсоединение субъединиц на этом конце, хотя блокирование может быть неполным. На процесс элонгации актинового филамента с острого (медленно растущего) конца цитохалазины не влияют. Цитохалазины могут также разрезать актиновоые филаменты. Наиболее активным является Цитохалазин Б. Цитохалазины широко используются для исследования живых клеток благодаря тому, что они способны проникать через клеточную мембрану.

ВведениеКлеточный белок р53 относится к классу антионкогенов благодаря своей способности негативно регулировать пролиферацию клеток. Более чем в половине случаев новобразований человека обнаруживаются либо мутации в гене р53, либо функциональная инактивация белка р53. Функциональный белок р53 участвует в регуляции клеточного цикла и апоптоза, при экзогенном введении он способен останавливать рост опухолевых и искусственно трансформированных клеток. Мутантный белок р53, напротив, способен кооперировать с известными клеточными и вирусными онкогенами в трансформации клеток. Многие биохимические каскады в клетке, вызывая конформационные перестройки белковой молекулы р53, влияют на его функциональную активность, которая; повышается при стрессовых внешних воздействиях на клетки, а также при внутренних сбоях клеточной физиологии. Антионкоген р53 играет определенную роль в процессах поддержания генетической стабильности и дифференцировки клеток.

Белок р53 функционирует в ядре в качестве транскрипционного фактора. Молекулы р53, группируясь в тетрамеры, распознают и связываются со специфическими последовательностями ДНК палиндромной структуры. Найдены десятки генов, содержащих в своих промоторах последовательности для связывания с р53, экспериментально показана р53-зависимая активация их экспрессии. Как правило, эти гены кодируют белки, участвующие в регуляции клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК, а также отвечающие за функционирование цитоскелета, процессы клеточной адгезии и взаимодействие с внеклеточным матриксом.

Хотя проведенные исследования свидетельствуют о взаимодействиях р53 с другими белками, а также о его связывании с одноцепочечной ДНК с помощью карбоксильного конца, трансактивационные свойства р53 изучены наиболее детально. Транскрипционная активация р53 своих генов-мишеней, по сути, является основной регулирующей антипролиферативной функцией этого антионкогена в клетке. Для косвенной оценки транскрипционной активности р53 используются различные плазмидные конструкции, содержащие репортерные гены под р53-зависимыми промоторами. Как правило, такие конструкции вводятся в клеточные культуры транзиторно с помощью процедуры трансфекции, что само по себе может вызвать стрессовое состояние клеток и активацию р53. При прямой трансфекции плазмидной ДНК лишь в небольшую часть клеток культуры (порядка 5-10%) попадает много копий репортера, которые непредсказуемо интегрируются в геном клеток. При дальнейшем проведении эксперимента над такими клеточными культурами сказывается12неадекватное отражение активации р53 в силе экспрессии репортера. При использовании отселектированных клеточных культур и линий, стабильно экспрессирующих репортер, может происходить постепенное ослабление экспрессии репортерного трансгена за счет его эпигенетической супрессии. Кроме того, картину реальной активации р53 может сильно искажать клональная вариабельность клеточных линий.

Основная задача нашей работы заключалась в разработке универсального генетического репортера, пригодного для стандартизированной оценки транскрипционной активности р53 в культурах клеток. Для этого на первом этапе на основе самой нактивирующегося ретровирусного вектора получены генетические конструкции с различными репортерными генами, поставленными под зависимость промотора, содержащего специфические участки связывания для белка р53. Ретровирусный перенос трансгена позволяет избежать всех перечисленных неудобств и артефактов, связанных с трансфекцией. - Одна копия репортерного трансгена попадает в большинство клеток заражаемой культуры, не вызывая активации стрессовых биохимических каскадов. При ретровирусном заражении интеграция трансгена происходит структурно предсказуемым образом в активные участки хроматина без перестроек, обеспечивая возможность высокого, но физиологического и сравнительно одинакового для всех клеток уровня экспрессии репортера.

Особенности р53-зависимой экспрессии репортеров изучались на примере разных культур клеток мыши, крысы и человека с различным статусом р53, в которые мы вводили полученные ретровирусные конструкции. Отбирать клетки с транскрипционно активированным р53, а также визуально следить за активацией р53 во времени отдельных живых клеток позволяет р53-зависимая конструкция с зеленым флуоресцентным белком (вРР) в качестве репортера. По ряду преимуществ наиболее удобной оказалась методика численного измерения в 96-луночном плато количества синтезированной Р-галактозидазы в клетках, несущих репортерный ген lacZ под р53-зависимым промотором. Эту методику нам удалось адаптировать для количественного измерения транскрипционной активности р53. Мы провели сравнительный анализ р53-зависимого синтеза Р-галактозидазы в различных нормальных и опухолевых культурах клеток человека, в ответ обработку препаратами, использующимися в химиотерапии онкологических заболеваний. На основе репортерных линий клеток опухолей человека с репортерным геном 1ас2, в которых активность р53 подавлена либо точечной мутацией в кодоне 273 р53 (эпидермоидная карционома А431), либо за счет ускоренного разрушения р53 под действием белка Е6 вируса папилломы 16 типа(карцинома шейки матки БШа) проведен скрининг химической библиотеки веществ. В результате скрининга отобраны соединения, реактивирующие транскрипционно-активный р53 в клетках А431 и Б ¡На. Показано, что найденные соединения специфичны по отношению к опухолевым клеткам человека А431 и 8Ша; их действие приводит к индукции р53-зависимых генов и вызывает апоптоз в этих культурах. Данный подход может быть использован для поиска новых противоопухолевых препаратов.

Обзор литературыБелок р53 обнаружен в 1979 году как белок, ко-преципитирующий с разными вирусными онкогенами, а также реагирующий с антителами, полученными от онкологических больных (См. обзор (Soussi, Carón de Fromentel et. al. 1990). Накопление p53 в опухолях, кооперация с онкогенами в трансформации первичных клеток позволила отнести его к классу клеточных онкогенов. Однако позже стало ясно, что накапливается в опухолевых клетках и кооперирует с онкогенами мутантный белок р53, а потеря функционального гена р53 характерная черта многих опухолей (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Белок p53 является значимым клеточным антионкогеном. 1. Характеристика гена р53Ген р53 вначале был найден у позвоночных организмов и лишь сравнительно недавно ген р53 был обнаружен у беспозвоночных - дрозофилы (Brodsky, Nordstrom et al. 2000; Jin, Martinek et al. 2000; Ollmann, Young et al. 2000) и нематоды (С. Elegans) (Schumacher, Hofmann et al. 2001). Экспрессия p53 человека в дрожжах приводит к подавлению пролиферации, повышению чувствительности к действию УФ излучения, что указывает на гомологию защитных механизмов эукариот, на которые влияет р53 (Bureik, Jungbluth et al. 1997).

Ген p53 человека состоит из 11 экзонов и 10 интронов, причем первый интрон составляет половину общего размера гена (Buchman, Chumakov et al. 1988; Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Гены p53 человека, мыши, лягушки (Xenopus laevis) имеют высокую степень структурной гомологии (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). В последовательности гена выделяют пять районов, имеющих до 100% гомологии у разных организмов (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Ген p53 человека содержит дополнительный промотор в начале первого интрона. Обнаружены альтернативно сплайсированные формы мРНК р53 (Matlashewski, Pim et al. 1987), и даже укороченные по С-концу формы белка р53 в нормальных человеческих лимфоцитах, возникающие вследствие альтернативного сплайсинга мРНК (Flaman, Waridel et al. 1996), однако биологическое значение этих наблюдений непонятно.

Промотор р53 не содержит ТАТА-мотива (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990), но зато в промоторе присутствуют сайты связывания для многих транскрипционных факторов: Spl, AP-l, Myc/Max/USF,NF-l, PF1, PF2, PBF I, PBF II (Reisman, 1998 #333), NF-кВ (Wu and Lozano 1994). Промотор р53 содержит НОХ-связывающий мотив, и НОХА5 способен активировать промотор р53, что может приводить к включению апоптозного процесса в раковых клетках (Raman, Martensen et al. 2000).

15Мутации гена р53 присутствуют приблизительно в половине опухолей человека (Lozano and Elledge 2000). Существуют так называемые "горячие точки" мутирования гена р53, часто встречаемые в различных случаях онкологических заболеваний человека. Наиболее часто встречаются точечные мутации гена в районе, соответствующем центральному ДНК-связывающему домену белка р53. Такие мутации, как правило, разрушают взаимодействие белка р53 с ДНК, тем самым, предотвращая активацию транскрипции р53-зависимых генов.

Сравнительно редко встречаются мутации р53 при лейкемиях, но с при лейкемиях (AML) с нарушениями гена р53 часто бывают так называемые температурочувствительные мутантные белки р53, которые при определенной температуре преобразуют свою молекулярную конформацию в конформацию, характерную для белка р53 дикого типа (Pavlova, Mayer et al. 2003).

Более того, известен полиморфизм гена р53, кодирующего в 72 аминокислотном : остатке либо пролин (р53Рго), либо аргинин (p53Arg) (Buchman, Chumakov et aL 1988). Оба варианта белка относят к дикому типу по всем биохимическим и биологическим характеристикам. Обе формы не отличаются друг от друга по способности связывать специфические последовательности ДНК, но отличаются в способности связывать компоненты транскрипционной машины, активировать транскрипцию, запускать программу апоптоза, а также репрессировать трансформацию первичных клеток (Thomas, Kalita et al. 1999).

Обнаружены клеточные гомологи белка р53 - белки рбЗ и р73 (Moll, Erster et al. 2001). Структура генов рбЗ и р73 значительно сложнее и многообразнее структуры р53, имеющего высокую степень подобия в разных организмах. Существует множество продуктов альтернативго сплайсинга рбЗ и р73, дающих варианты различной длины С-конца или даже с дополнительным С-концевым доменом SAM, а также варианты, лишенные трансактивационного домена на N-конце ANp63 и ANp73 (Moll, Erster et aL 2001).

Мутантные формы белка р53 не только теряют защитную функцию усиливать транскрипцию генов, негативно влияющих на пролиферацию аномальных клеток, корректное влияние на другие молекулярные взаимодействия в клетке,, но и приобретают свойства, не характерные для р53 дикого типа (так называемое явление gain of function). К примеру, 61 белок разных мутантных типов р53 подавляют трансактивационную функцию ß-формы р73 (Monti, Campomenosi et al. 2003).

2. Характеристика белка р53 2.1. Структура белка р53Белок р53 состоит из 393 аминокислот, его условно разделяют на несколько доменов, отвечающих за разные функции. N-конец р53 отвечает за активацию транскрипции, что впервые было продемонстрировано с помощью гибридного белка, искусственно сшитого из ДНК-связывающего белка Gal4 (дрожжевого транскрипционного фактора) и N-концевого фрагмента р53 (первые 160 а.о.). Такой гибридный белок оказался способен активировать транскрипцию репортерной плазмиды (O'Rourke, Miller et al. 1990). Другие авторы определили к трансактивационному домену первые 73 а.о. белка (Fields and Jang 1990). N-конец р53 содержит в основном кислые аминокислотные остатки и заряжен отрицательно (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Для трансактивации наиболее важны первые 42 а.о. (Unger, Mietz et al. 1993). Стоит внимания также то, что некоторые авторы выделяют два трансактивационных домена (1-42 а.о. и 64-91 а.о.) в белке р53, способные к трансактивации генов-мишеней (Zhu, Zhang et al. 2000).

На N-конце молекулы р53 (11-27 а.о.) сигнал ядерного экспорта NES (от англ. nuclear export signal) (Zhang and Xiong 2001) попадает в один (-13-23 а.о.) из пяти районов белка с высокой гомологией между разными организмами (May and May 1999), что указывает на значение этого участка для функции р53.

Следующий функционально важный домен р53 — центральная часть молекулы (92-293 а.о.), отвечающая за связывание с ДНК (el-Deiry, Kern et al. 1992). Он обладает гидрофобными свойствами и заряжен слабо (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). ДНК-связывающий домен в основе своей имеет "сандвич" из двух антипараллельных Р-листов, на которых крепятся структура типа петля-лист-спираль и две петли, соединенные между собой атомом цинка (Cho, Gorina et al. 1994). Такой структурный домен "обнимает" ДНК р53-зависимых элементов в промоторах генов по большому и малому желобку ДНК соответственно. В районе гена р53, соответствующем этому домену, находятся основные "горячие точки" мутирования, разрушающие конформацию белка р53, необходимую для связывания со специфическими р53-зависимыми последовательностями промоторной области ДНК. Антитела к ценральному ДНК-связывающему домену р53 дикого типа не распознают мутантный белок р53 и, наоборот, антитела, распознающие центральный домен мутантного р53, не связываются р53 дикого типа (Milner and Medcalf 1991). В ДНК-связывающем домене р53 выделяют четыре области с высокой гомологией у разных организмов (May and May 1999), три из которых соответствуют петлям вторичной структуры белка.

Изменение конформации центральной области молекулы, прекращающее связывание р53 с ДНК, является ключевой особенностью часто встречаемых мутантных форм р53.

Между трансактивационным и ДНК-связывающими доменами есть небольшой богатый пролином участок РР (-63-97 а.о.), имеющий высокую степень гомологии с БНЗ-связывающими белками и содержащий пять повторов РХХР (Р-пролин, Х-любая аминокислота) (May and May 1999). Возможно, эта часть молекулы участвует в молекулярной передаче сигналов подобно SH3-связывающими белкам. Делеция этого участка, по-видимому, не влияет на трансактивацию генов-мишеней р53 - WAF1, Mdm2 и Вах, способность р53 вызывать остановку клеточного роста (Sakamuro, Sabbatini et al. 1997; May and May 1999), но изменяет картину р53-зависимой транскрипционной репрессии (May and May 1999). Удаление этой части молекулы может отменять запуск р53-зависимого апоптоза, который происходит при экспрессии р53 дикого типа (Walker and Levine 1996; Sakamuro, Sabbatini et al. 1997). Недавно появились сведения, что богатый пролином участок белка р53 важен для его связывания коактиватором р53-зависимой транскрипции рЗОО, а удаление этого участка РР делает невозможным ацетилирование р53 с помощью белка рЗОО, но связывание р53 со специфическими промоторными последовательностями ДНК при этом сохраняется (Doman, Shimizu et al. 2003).

Карбоксильная часть молекулы р53 содержит много основных аминокислотных остатков, заряжена положительно и проявляет гидрофильные свойства (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Она состоит из "гибкого" промежуточного участка (300-318 а.о.), основного участка тетрамеризации (319-360 а.о.), а также регуляторного С-концевого участка (361-393 а.о.) (May and May 1999). На карбоксильном конце молекулы (316325 а.о., 369-375 а.о., 379-384 а.о.) находятся три сигнала ядерной локализации NLS (от англ. nuclear localization signal) (May and May 1999), а также сигнал ядерного экспорта NES в тетрамеризационном домене (Stommel, Marchenko et al. 1999).

Сначала выделяли так называемый олигомеризационный домен белка р53 (319360 а.о.), способный составлять тетрамеры (Clore, Omichinski et al. 1994). С помощью метода ядерно-магнитного резонанса определи структуру этого домена и структуру образованных из него тетрамеров. Каждый мономер содержит два элемента вторичной структуры белка - a-спираль и ($-нить. Каждый димер включает в себя две антипараллельные a-спирали, сшитые ^-листом с помощью антипараллельных р-нитей мономеров. Тетрамер собирается из двух димеров исключительно за счет гидрофобных и электростатических контактов между a-спиралями (Clore, Omichinski et al. 1994). Показано, что активная и неактивная формы р53 находятся in vivo в виде тетрамеров18(Hupp and Lane 1994). Позже стало ясно, что для поддержания а-спиралями тетрамера важен чуть меньший участок молекулы, его стали называть тетрамеризационным доменом р53 (p53tet; 325-355 а.о.) (Brokx, Bolewska-Pedyczak et al. 2003), с помощью этого участка молекулы р53 группируются в димеры в растворе. Но, р53, как известно, взаимодействует с ДНК и активирует транскрипцию в виде тетрамера. Изучена роль в формировании тетрамера взаимодействий между заряженными аминокислотами на поверхности димеров (Brokx, Bolewska-Pedyczak et al. 2003).

Белок p53 дикого типа, экзогенно введенный в опухолевые клетки, приводит остановке их роста и даже гибели клеток (Thomas, Kalita et al. 1999; Zhang, Labrecque et al. 2001). Однако многие мутантные белки р53 обладают так называемым доминантно негативным действием - отменяют функцию р53 дикого типа. С помощью специфичных к р53 моноклональных антител показано, что мутантный белок р53 образует комплексы с белком р53 дикого типа, и такие смешанные комплексы имеют конформацию мутантного типа (Milner and Medcalf 1991). Мутантные белки р53 действуют подобно онкогенам: кооперируют с разными онкогенами в экспериментах по трансформации клеток за счет угнетения функции дикого р53 или за счет новых приобретенных функций (явление gain of function). Возможно, это происходит при образовании смешанных тетрамеров, состоящих из белков р53 мутантного и дикого типа.

Основная роль С-конца р53, включающего 355-393 а.о., возможно, заключается в регулировании функции р53, т.к. эта часть молекулы может претерпевать различные ковалентные модификации и взаимодействовать с различными вирусными белками и белками-элементами транскрипционной машины (См. подробнее раздел 5) (May and May 1999). В этой части молекулы р53 находятся два из трех С-концевых (369-375 а.о., 379-384 а.о.) сигналов ядерной локализации NLS (May and May 1999). Благодаря положительному заряду С-конец р53 неспецифично связывается ДНК, РНК, а также с дву- и однонитивыми разрывами ДНК.

Как отмечалось выше, найдены клеточные гомологи р53 - белки р73 и рбЗ, способные активировать транскрипцию р53-зависимых генов (Moll, Erster et al. 2001). Оба белка структурно схожи с р53, имеют трансактивационный, ДНК-связывающий и тетрамеризационный домены, образуют тетрамеры, все это позволило отнести их вместе с р53 к одному белковому семейству. ДНК-связывающие домены этих белков имеют более 60% гомологии с ДНК-связывающим доменом р53, вступающие во взамодействие с ДНК аминокислоты совпадают у всех трех белков семейства (Moll, Erster et al. 2001). Однако они, по-видимому, не предназначены для подстраховкифункции р53, связанной с супрессией пролиферации, нормальное функционирование рбЗ и р73 существенно для развития организма (см. ниже).

2.2. Внутриклеточная локализация р53Основное влияние на жизнеспособность клетки р53 оказывает в качестве транскрипционного фактора в ядре, поэтому регулирование ядерной локализации этого белка претерпевает тонкую настройку. Белок может менять свое положение в цитоплазме на местонахождение в ядре и обратно в течение нескольких минут (Middeler, Zerf et al. 1997).

Регуляция локализации р53 осуществляется с помощью специальных сигналов ядерного экспорта NES, находящихся на С- и N-концах молекулы. Например, фосфорилирование N-концевого NES, вызванное ультрафиолетовым облучением (УФ) клеток, отменяет экспорт белка в цитоплазму (Zhang and Xiong 2001). Возможно, что при формировании ; тетрамеров р53 закрывается участок NES, находящийся в С-концевом тетрамеризационном домене р53, в таком случае белок р53 в виде тетрамеров сохраняет свою локализацию в ядре для осуществления специфичной транскрипции (Stommel, Marchenko et al. 1999). Для ядерной локализации р53 существенны все три сигнала ядерной локализации NLS, которые находятся на С-конце молекулы р53 (May and May 1999).

Для белка р53 дикого типа характерна локализация в ядре клетки, мутантные белки обнаруживают, в основном, в цитоплазме (Levine, Momand et al. 1991). Белок p53 в комплексе с такими вирусными белками, как большой Т антиген вируса SV40, аденовирусный белок El В 55К и другие, обнаруживается в различных структурах клетки (Levine, Momand et al. 1991).

Взаимодействие с другими клеточными белками влияет на местоположение р53 в клетке. Например, клеточный ингибитор р53 - белок mdm2 связывает р53 и обеспечивает его транспорт из ядра клетки (Shimizu and Hupp 2003). Ингибиторная субъединица IkBa транскрипционного фактора NF-кВ может связывать и удерживать р53 в цитоплазме (Zhou, Gu et al. 2003). Аналогично удерживает белок р53 в цитолазме белок Parc (Kastan and Zambetti 2003).

2.3. Регуляция деградации р53 в клеткеБелок р53 присутствует в нормальных клетках на очень низком уровне, содержание белка находится на пределе чувствительности метода. Время жизни р53 в нормальных клетках при нормальных (нестрессовых) условиях около 20 минут (Levine 1989). Деградация р53 регулируется в клетке по убиквитиновому механизму, который обеспечивает ее специфическую направленность (Ciechanover 1994).

Продукт одного из транскрипционных генов-мишеней р53, клеточный белок mdm2, являясь ЕЗ убиквитиновой лигазой, специфично связывается с р53 и способствует навешиванию молекул убиквитина на лизиновые аминокислоты молекулы р53 с помощью Е2 переносчиков убиквитина (Honda, 1997 #170; Pray, 2002 #61). Такая убиквитинизация р53 приводит к деградации белка на протеосомах. Аналогичным образом комплекс белка Е6 вируса папилломы человека с клеточным белком Е6-АР (от англ. E6-associated protein) может направлять деградацию р53. Белок Е6 папилломавирусов человека связывается с клеточным Е6-АР, представляющим собой, как и mdm2, ЕЗ убиквитиновую лигазу, и такой комплекс специфично иннактивирует антионкоген р53 (Scheffner, Huibregtse et al. 1993). Возможно, вирусы папилломы неслучайно используют такой механизм инактивакции р53 при трансформации человеческих клеток. Аналогично белок ICP0 вируса простого герпеса проявляет свойства ЕЗ лигазы и направляет р53 по пути протеосомной деградации (Boutell and Everett 2003). Связывание р53 с аденовирусным белком El А стабилизирует р53 и может привести клетки к запуску апоптоза, однако в процессе аденовирусного заражения вирусные белки Е1В 55 kDa и E4orf6, также непосредственно взаимодействующие с р53, препятствуют такой стабилизации р53 с помощью El A (Querido, Marcellus et al. 1997). Возможно, что аденовирусный белок El В 55kDa способствует деградации р53, взаимодействуя с компонентами системы убиквитиновой деградации (Harada, Shevchenko et al. 2002). Связывание p53 с большим Т-антигеном обезьяннего вируса SV40 стабилизирует белок р53 (Tiemann and Deppert 1994), однако при этом инактивирует его функции (Chang, Syijanen et al. 1993). Вирусные протеазы могут расщеплять р53 и другие транскрипционные факторы при заражении клетки (Weidman, Sharma et al. 2003).

Клеточный белок ARF препятствует mdm2-3aBHCHMOñ деградации р53. Экспрессия ARF приводит к значительному уменьшению полиубиквитинизированной фракции белка р53 (Xirodimas, Saville et al. 2001). Коактиватор р53-зависимой транскрипции генов рЗОО, с одной стороны, способствует стабилизации р53 при повреждениях ДНК, вызванных ионизирующей радиацией (Yuan, Huang et al. 1999), что было показано на клетках, дефектных по экспрессии рЗОО. С другой стороны, последняя работа приводит данные, что, обладая ЕЗ лигазной активностью, белок рЗОО способствует полиубиквитинизации моноубиквитинизированного белка р53 in vitro, приводя к деградации р53. При этом mdm2 способствует только моноубиквитинизации in vitro, а ингибирование рЗОО через связывание рЗОО с вирусным онкобелком Е1А способствует стабилизации р53 in vivo (Grossman, Deato et al. 2003). Кроме того, белокрЗОО, связывая mdm2 и удерживая последний в ядре, способствует стабилизации mdm2, и эта функция рЗОО не связана с ацетилированием mdm2 (Zeng, Jin et al. 2003). Если учитывать активирующую роль рЗОО в опосредованной р53 активации генов (Avantaggiati, Ogryzko et al. 1997; Scolnick, Chehab et al. 1997), данные о влиянии белка рЗОО на функциональную активность р53 достаточно противоречивы.

Убиквитин-специфичная протеаза USP7 (другое название HAUSP) может непосредственно связывать р53 и способствовать его деубивитинизации, что приводит к стабилизации белка р53 (Li, Chen et al. 2002). Транскрипционная мишень р53 - белок Pirh2 способствует убиквитиновой деградации р53, связывая р53 подобно mdm2 (Leng, Lin et al. 2003). Онкосупрессор PTEN положительно регулирует уровень белка р53 (Freeman, Li et al. 2003), это влияние объясняется частично деградацией природного ингибитора р53 - белка mdm2 (Mayo, Dixon et al. 2002).

В ответ на стресс р53 накапливается в клетке в основном за счет стабилизации, связанной с различными регуляторными ковалентными модификациями белка (См. раздел 5) и влиянием других белковых факторов, а не за счет усиления транскрипции гена р53 (el-Deiry, Kern et al. 1992; Funk, Pak et al. 1992). 3. Участие p53 в различных клеточных процессахЗамечено повышение уровня мРНК р53 при созревании плода у разных организмов (Soussi, Carón de Fromentel et al. 1990). Однако мыши, с делецией по гену р53, развиваются в целом нормально (Jones, Roe et al. 1995; Montes de Oca Luna, Wagner et al. 1995). Мыши, с делецией по главному негативному регулятору функции р53 -гену mdm2, погибают на стадии раннего эмбрионального развития за счет некоордированного р53-зависимого апоптоза. Эта патология развития полностью снимается выключением обоих генов (Jones, Roe et al. 1995; Montes de Oca Luna, Wagner et al. 1995).

Белок SIRT1 регулирует деацетилирование p53, вызывая ослабление апоптозного процесса, а также ослабление процесса клеточного старения. Это было подтверждено с помощью искусственно выведенных мышей, полностью утерявших ген SIRTI или утерявших его каталитический домен (Cheng, Mostoslavsky et al. 2003). Клетки от таких мышей проявляли гиперацетилирование р53 после повреждений ДНК и усиление апоптоза. Оба типа мышей-мутантов имели одинаковый фенотип: были небольшого размера и проявляли заметные деффекты в развитии сердца и оболочки глаза, к тому же немногие из них достигали послеродового периода (Cheng, Mostoslavsky et al. 2003).

Видимо, активность р53 находится под строгим негативным контролем многих факторов во время эмбрионального развития, если инактивация всего лишь одногогена-регулятора р53 приводит к таким значительным патологиям в развитии плода. Скорее всего, основная роль р53 в эмбриональном развитии сводится к запуску процесса апоптоза в аномальных клетках, возможных предшественниках опухолей.

Несмотря на то, р53 не вмешивается в процессы развития организма, он играет определенную роль в клеточной дифференцировке тканей взрослого организма. Эстроген, участвующий в дифференцировке остеокластов и остеобластов в клетки костной ткани, одновременно вызывает в них и функциональную активацию р53 (Bovenkerk, Lanciloti et al. 2003). Миостатин, задерживащий пролиферацию и дифференцировку миобластов, использует р53-зависимые пути (Joulia, Bernardi et al. 2003). Уровень p53 снижается при дифференцировке моноцитов в макрофаги (Basta, Knoetig et al. 1999).

Функциональная активность р53 повышается в стареющих (прошедших большое количество пассажей) человеческих диплоидных фибробластах вместе с повышением уровня ингибитора циклин-зависимых киназ р21, ген которого является мишенью белка р53. Однако при этом не происходит повышения уровня белка или мРНК р53 (Atadja, Wong et al. 1995). Функциональный p53 дикого типа необходим человеческим диплоидным фибробластам, чтобы подвергнуться процессу необратимой остановки клеточного цикла, называемому репликативным старением. Экспериментально показано, что инактивирование р53 с помощью экспрессии папилломавирусного белка Е6 или удаление главного эффектора р53 — гена р21 с помощью гомологичной рекомбинации, увеличивают продолжительность жизни человеческих диплоидных фибробластов. Однако ведущая роль р53 в этом процессе спорна. Например, возможно, доминантно-негативный р53 (143(а1а)) увеличивает продолжительность жизни фибробластов не за счет уменьшения количества ингибитора циклин-зависимых киназ р21, а за счет увеличения в клетке количества несвязанных с р21 комплесов циклин-зависимой киназы cdk2, способных связываться с циклином Е и способствовать дальнейшей пролиферации клеток (Wyllie, Haughton et al. 2003). Следует отметить, что в нормальных мышиных фибробластах, по-видимому, главную роль в регуляции клеточного репликативного старения играет повышенная экспрессия ингибитора циклин-зависимых киназ pl6(INK4a), а не повышение функциональной активности р53 и р21, как это происходит в стареющих человеческих и куриных фибробластах, что коррелирует у мышиных фибробластов с менее продолжительным пролиферативным потенциалом (Atadja, Wong et al. 1995). При этом мышиные фибробласты в отличие от человеческих и куриных поддерживают теломеразную активность и экспрессию теломеразной мРНК в течение культивирования их in vitro.

Белок р53 вовлечен в контроль стабильности генома. Клетки от р53-/- мышей в течение 3-4 пассажей в культуре проявляют значительные нарушения числа хромосом в отличие от нормальных первичных фибробластов мыши, которые сохраняют свой кариотип в течение 10-15 пассажей (Harvey, Sands et al. 1993). Потеря p53 в человеческих опухолях часто коррелирует с анеуплодией, высокой частотой гомологичных рекомбинаций. Белок р53 предотвращает появление двойных разрывов ДНК в мышиных эмбриональных фибробластах MEF р53+/+, но не в MEF р53-/- в ответ на действие гидроксимочевины, возможно, препятствуя вызванному гидроксимочевиной процессу остановки репликативных вилок (Kumari, Schultz et al. 2004).

Не исключено, что стабильность генома р53-содержащих клеток обеспечивается репарационными процессами. Во-первых, вызванная р53 остановка клеточного цикла вследствие индукции генов-регуляторов клеточного цикла предоставляет клетке время для репарации ДНК. Во-вторых, репарация поврежденной ДНК зависит от экспрессии специфических генов-мишеней р53, вовлеченных в процесс репарации. Среди них, например, ген рибонуклеотид-редуктазы (Nakano, Balint et al. 2000; Tanaka, Arakawa et al. 2000), ген XPE DDB2 (от англ. Xeroderma Pigmentosum Complementation group E (XPE) mutated Damaged-DNA binding protein p48 (DDB2)) (Takimoto, MacLachlan et al. 2002), ген XPC (от англ. xeroderma pigmentosum group С gene) (Adimoolam and Ford 2002). Белок p53 при малой концентрации в клетке активирует транскрипцию с промотора PCNA (Morris, BischofF et al. 1996) - гена кофактора ДНК-полимераз 5 и е, который активируется в ответ на повреждения ДНК и участвует в репликации и репарации ДНК. Продукт р53-зависимого гена WAF1 - белок p21WAF1 связывается с PCNA, ингибирует репликационную активность PCNA (Waga, Hannon et al. 1994), не препятствуя при этом репарационной функции PCNA (Li, Waga et al. 1994). В-третьих, репарация поврежденной ДНК зависит также от взаимодействия р53 с репарационными факторами и неспецифического сродства положительно заряженного С-конца белка р53 к одно- и двунитевым разрывам ДНК (Fei and El-Deiry 2003). Неспецифическая ДНК-связывающая активность р53 способствует репарации двунитевых разрывов после облучения клеток у-радиацией (Fei and El-Deiry 2003). Описанная 3'-5' экзонуклеазная активность р53 может быть вовлечена в процессы репарации (Lilling, Elena et al. 2003), предотвращать точечные мутации при репликации генов (Huang 1998; Ballal, Zhang et al. 2002). Белок p53 в виде мономера неспецифически связывается преимущественно с однонитевой ДНК и эффективно удаляет 3'-терминальные неспаренные основания (Skalski, Lin et al. 2000; Lilling, Elena et al. 2003). Более того, белок p53 формируеткомплекс с ДНК-полимеразной а-праймазой in vivo и благодаря своей 3'-5' экзонуклеазной активности способствует элонгации праймера с неспаренным последним нуклеотидом in vitro (Melle and Nasheuer 2002). На основе флуоресцентной репортерной системы показано, что белок р53 некоторым образом может негативно регулировать процесс гомологичной рекомбинации в случае недостаточной гомологии последовательностей ДНК обмена, а также процесс негомологичного соединения двойных разрывов ДНК (Akyuz, Boehden et al. 2002).

Возможно также, что перечисленные процессы, связанные с дифференцировкой, с поддержанием целостности генома, клеточным старением, зависят от удаления клеток с ненормальным кариотипом, хромосомными перестройками или повреждениями ДНК с помощью р53-зависимого апоптоза. Белок р53 активирует транскрипцию множества генов, участвующих в апоптозе (См. подробнее раздел 7).

Белок р53 активирует экспрессию генов, имеющих отношение к самым разным процессам в клетке (el-Deiry 1998). Например, среди них экспрессию гена белка теплового шока (Gao, Zou et al. 2000), генов PIGs (от англ. р53 inducible genes), отвечающих на окислительный стресс (Polyak, Xia et al. 1997), гена циклина G (Okamoto and Beach 1994). Антионкоген p53 активирует ряд генов, негативно действующих на процессы ангиогенеза и метастазирования. Среди них, например, гены тромбоспондина-1 (Dameron, Volpert et al. 1994) и -2 (Adolph, Liska et al. 1997), ген BAI1 (от англ. brain-specific angiogenesis inhibitor 1) (Nishimori, Shiratsuchi et al. 1997). Среди транскрипционных генов-мишеней p53 много генов, отвечающих за функционирование цитоскелета, а также вовлеченных в процессы клеточной адгезии и подвижности (Zhao, Gish et al. 2000; Fontemaggi, Kela et al. 2002). Некоторые из генов, вовлеченных во взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом и отвечающих за клеточную подвижность, оказались также мишенями транскрипционно активной формы р73а (Fontemaggi, Kela et al. 2002). Потеря функционального р53 способствует снижению миграции клеток in vitro (Sablina, Chumakov et al. 2003), поэтому, как предполагают авторы, р53 может играть определенную роль в заживлении ран и в воспалительных ответах организма. 4. Участие р53 в регуляции транскрипции 4.1.Трансактивационные свойства р53Основное онкосупрессирующее действие р53 выражается в регуляции транскрипции, поэтому эта функция р53 остается наиболее изученной. Белок р53 является транскрипционным фактором, узнающим и связывающимся со специфическими последовательностями ДНК. Эти последовательности представляют25собой два участка вида PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy, отделенными друг от друга 0-13 нуклеотидами, и называются р53-зависимыми элементами. Группа Фогельстейна идентифицировала 18 геномных клонов, содержащих последовательности ДНК, с которыми р53 связывается in vitro (el-Deiry, Kern et al. 1992). Картированием этих последовательностей и был составлен обобщенный внутренне симметричный консенсус связывания для р53. Было установлено, что для связывания с р53 необходимы оба участка консенсуса. Незначительные изменения последовательности этого р53-зависимого элемента, даже при наличии нескольких копий, приводили к отмене взаимодействия р53 с ним. Мутантные белки р53 не были способны связываться с консенсусом in vitro (el-Deiry, Kern et al. 1992). Несмотря на это, p53-зависимые элементы из естественных промоторов р53-зависимых генов могут все же неточно соответствовать обобщенному консенсусу из двух полусайтов PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy. Функ и соавторы инкубировали двуцепочечные олигонуклетиды с ядерными экстрактами нормальных человеческих фибробластов в качестве источника белка р53 дикого типа (Funk, Pak et al. 1992). Продукты связывания отбирались при помощи антител к р53 и амплифицировались в ПЦР. Таким образом, параллельно работе группы Фогельстейна был найден преимущественный палиндромный консенсус связывания ДНК с белком р53, имеющий последовательность GGACATGCCC GGGCATGTCC и названный элементом CON (Funk, Pak et al. 1992), использующийся в нашей репортерной конструкции. В настоящее время с помощью компьютерного алгоритма поиска, опирающегося на экспериментально полученную группой Фогельстейна последовательность консенсуса связывания для р53, в геноме человека просканировано 2583 гена, а также просканировано 1713 ортологов этих генов в геноме мыши. В результате было найдено около 300 генов, в промоторах которых имеются р53-зависимые элементы. Авторы выбрали из них 16 генов; с предположительно высокой аффинностью связывания р53-зависимых элементов, но неизвестных как мишени влияния р53, а затем показали р53-зависимую регуляцию 10 из 16 выбранных генов экспериментально (Höh, Jin et al. 2002).

Симметрия р53-зависимых элементов наводила на мысль, что р53 связывается со своим консенсусом в тетрамерной форме. Молекулы р53 собираются в виде тетрамеров, соединяясь между собой карбоксильными концами, и взаимодействуют со специфическим консенсусом ДНК (Friedman, Chen et al. 1993). Как тетрамеры, так и мономеры р53 могут садиться на тандемно и удаленно расположенные специфические консенсусы ДНК и связываться между собой, при этом удаленно расположенные р53-зависимые элементы приближаются к промоторному ТАТА-элементу, образуютсяпетли ДНК. Этот процесс приводит к усилению транскрипции с промотора (Stenger, Tegtmeyer et al. 1994). Возможно, для узнавания тетрамером р53 специфичных палиндромных элементов ДНК определенную роль играет сгибание этих элементов в виде микропетель (Balagurumoorthy, Lindsay et al. 2002).

Вскоре после открытия р53-зависимых элементов было показано, что способность р53 репрессировать трансформацию клеток четко коррелирует со способностью действовать в качестве транскрипционного активатора.- Постепенно возрастало количество изучаемых генов, транскрипция которых зависела от р53 в силу наличия в промоторных областях этих генов р53-зависимых элементов.

Группа Левина проводила анализ экспрессии мРНК различных генов. на олигонуклеотидных матрицах в различных клеточных линиях в ответ на различную стимуляцию активности р53 - с помощью цинк-зависимой индукции р53, в ответ на облучение у-радиацией и УФ светом. Было проверено около 6000 генов, активация 107 из проверенных генов, а также репрессия 54 из них зависела от наличия активного белка р53. Часть генов определили в категорию генов, отвечающих за апоптоз или за остановку клеточного цикла, часть - в категорию генов, отвечающих за функции цитоскелета, а часть - в категорию ростовых факторов, их ингибиторов, генов внеклеточного матрикса и адгезии. Набор и кинетика активации генов, экспрессия которых изменяется после стимуляции активности р53, зависит от характера активации р53, типа клеточной линии и уровня белка р53 (Zhao, Gish et al. 2000).

Присутствие в промоторных областях ДНК р53-зависимых элементов, по-видимому, не является достаточным условием р53-зависимой стимуляции гена. Например, в случае гена гистон-деацетилазы-5 (HDAC5), в промоторе которого содержится шесть р53-зависимых элементов, наличие этих элементов не приводит ни к активации репортерного гена, ни к экспрессии мРНК HDAC5 при активации р53 различными агентами (Pray, 2002 #61). Ген кофактора репликации PCNA содержит неполный (18 из 20 п.н.) р53-зависимый сайт связывания в своем промоторе, однако р53 в малых концентрациях способен активировать промотор PCNA (Morris, Bischoff et al. 1996). Недавно показана р53-зависимая активация мРНК и белка PCNA в ответ на облучение клеток ионизирующей радиацией (Shan, Xu et al. 2003). В промоторе плацентарного трансформирующего ростового фактора PTGF-P наряду с двумя р53-зависимыми элементами идентифицирован элемент длиной в 21 п.о., который отвечает за репрессию р53-зависимой активации этого гена. Поэтому PTGF-P проявляет более позднюю кинетику р53-зависимой активации по сравнению с р53-зависимым геном p21(WAFl) (Wong, Li et al. 2002), вызванную взаимодействием некоторого белкового27фактора с репрессорным элементом промотора PTGF-P. Ген ингибитора циклин-зависимых киназ p21WAFI обладает сильным р53-зависимым промотором, однако два нуклеотида в р53-чувствительном элементе промотора не соответствуют последовательности обобщенного консенсуса, установленного группой Фогельстейна (el-Deiry, Tokino et al. 1993). Возможно, различные р53-зависимые элементы просто из-за особенностей своей последовательности значительно различаются по силе, что было продемонстрировано в работе, сравнивающей силу связывания р53 консенсусами из промоторов разных генов и силу р53-зависимой активации репортерного гена, стоящего под зависимостью этих промоторов (Kondratov, Kuznetsov et al. 1996). Подобным образом в клетках дрожжей и млекопитающих исследована активация уже известных и потенциальных р53-зависимых элементов, выделенных из различных генов (Qian, Wang et al. 2002). Элементы из генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и репарации ДНК, из гена mdm2, а также из генов-рецепторов апоптозных путей ("рецепторов смерти"), активируются в ответ на повреждения ДНК. Но белок р53 не способен активировать две трети из всех выделенных р53-зависимых элементов, проверенных в этой системе и принадлежащих генам, осуществляющим запрограммированную клеточную гибель.

После определения преимущественного консенсуса связывания CON для р53, группа, установившая его последовательность, исследовала трансактивационные свойства белка р53 на примере активации репортерного гена люциферазы (Chen, Funk et al. 1993). Было установлено, что белок р53 дикого типа способен активировать экспрессию промотора, содержащего элемент CON, а также "фрагмент А" из кластера рибосомных генов (ribosomal gene cluster (RGC)), имеющий сходство с обобщенным р53-зависимым консенсусом из двух полусайтов PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy. Мутантные формы белка р53 теряли способность активировать промоторы с элементами CON и фрагментом A (RGC). Следует отметить, что 273 мутант сохранял некоторую транскрипционную активность по отношению к элементу CON, но не к RGC (Chen, Funk et al. 1993). Это заставило задуматься, как заставить мутантные формы белка р53 в раковых клетках восстановить конформацию и привести в норму свои защитные трансактивационные свойства. Сравнение трех разных р53-зависимых промоторных элементов - обобщенного палиндромного консенсуса, последовательности из рибосомного кластера генов, а также элемента из промотора мышиной мускульной креатинкиназы показало, что палиндромный консенсус является самым сильным и единственным из трех, проявляющим транскрипцию репортерного гена при экспрессии 273 мутанта р53 (Park, Chumakov et al. 1996). Однако недавноуставили, что микросателлитная последовательность внутри промотора проапототического гена PIG3 вида (TGYCC)n обеспечивает р53-зависимую регуляцию этого гена (Contente, Dittmer et al. 2002). Наблюдается полимофизм количества повторов вида TGYCC (10, 15, 16 или 17 повторов), белок р53 связывавается с такими последовательностями и активирует экспрессию гена с силой, соответствующей количеству пятичленных повторов. Кроме того, есть работы о важности кооперации р53 с другими транскрипционными факторами в положительной регуляции транскрипции не через связывание со специфическим конценсусом ДНК, а через р53 взаимодействие с транскрипционными факторами (Zhan, Chen et al. 1998).

Последовательность, обеспечивающую правильную инициацию транскрипции многокомпонентным комплексом РНК-полимеразы И, называют основным промотором. Он расположен в районе старта транскрипции гена и содержит, как правило, такие элементы, как TATA-мотив, инициатор (Inr), распознаваемый транскрипционным фактором TFIIB элемент В RE, а также "нижний" элемент основного промотора (DPE) (Butler and Kadonaga 2002). Комлекс РНК-полимеразы II содержит множество компонентов: базальные транскрипционные факторы TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH и TFIIJ, представляющие собой белковые комплексы. Фактор TFIID, например, содержит ТАТА-связывающий белок (англ. ТВР) и факторы, связывающиеся с ТВР (англ. TAF). Цепь событий, влияющих на транскрипционную активацию гена, в конечном итоге отражается на работе основной транскрипционной машины комплекса РНК-полимеразы II, которая интегрирует множество сигналов регулировки, поступающих от различных транскрипционных факторов.

Некоторое количество белка р53 находится связанным со своими ДНК-элементами при отсутствии влияния стресса на клетку (Kaeser and Iggo 2002). В ответ на повреждения ДНК уровень белка р53 в клетке в течение 4х часов может значительно повыситься (Espinosa, Verdun et al. 2003). Однако в течение 1-2 часов еще не наблюдается накопления белка, но почти весь имеющийся в наличии белок р53 в клетке переходит в фосфорилированную по серину 15 форму. Именно количество этой формы р53 резко возрастает в комплексе с р53-зависимыми последовательностями в течение первых часов стресса. Это событие коррелирует с переходом комплекса РНК-полимеразы И, связанного с основным промотором, в стадию элонгации в течение первых часов стресса. Такая картина продемонстрирована на р53-зависимом промоторе гена p21WAF1 в ответ на облучение клеток УФ (Espinosa, Verdun et al. 2003).

Клетки, лишенные эндогенного р53, содержат меньшее количество РНК-полимеразы II, а также транскрипционных факторов ТВР, TFIIB, TFIIF, TFIIH,связанных с основным промотором гена p21WAFl в нестрессовом состоянии. Это было показано на примере клеток U20S р53+/+, SAOS2 р53-/-, НСТ116 р53+/+ и НСТ116 р53-/- (Espinosa, Verdun et al. 2003). Заметны различия в порядке сборки компонентов комплекса РНК-полимеразы II в зависимости от типа р53-зависимого промотора и от характера повреждения ДНК - например, в ответ на обработку клеток доксорубицином или УФ излучением. Кинетика связывания р53 со своими ДНК-элементами и кинетика активации транскрипции р53-зависимого гена p21WAF1 и проапоптотического гена FAS/AP01 проявляют тонкие различия в ответ на обработку клеток доксорубицином или облучением УФ излучением (Espinosa, Verdun et al. 2003).

Интересно то, что р53-зависимые гены, вовлеченные в регуляцию репарации и задержки клеточного цикла, в отсутствие стресса содержат большее количество РНК-полимеразы II, связанной с их основным промотором, чем проапоптотичекие р53-зависимые гены (Espinosa, Verdun et al. 2003). Возможно поэтому, не только сила р53-зависимого элемента ДНК влияет на кинетику и силу активации гена, но и отличительное дострессовое состояние компонентов полимеразного комплекса и самой РНК-полимеразы Несвязанных с основным промотором р53-зависимого гена. Как известно, экспрессия р53-зависимых генов, отвечающих за остановку клеточного цикла, включается в первую очередь при небольшом увеличении уровня белка р53 в клетках, тогда как активация проапоптотических р53-зависимых генов требует существенной активности р53 и проявляется позже (Zhao, Gish et al. 2000).

Активацию транскрипции осуществляет N-конец р53 (O'Rourke, Miller et al. 1990). через взаимодействие с транскрипционными факторами РНК-полимеразы И: ТВР (Horikoshi, Usheva et al. 1995) и белками TAF (Uesugi and Verdine 1999; Buschmann, Lin et al. 2001).

Необходимость участия белка р53 в многокомпонентном комплексе РНК-полимеразы II до стрессового воздействия на клетку говорит о необходимости р53 в процессе инициации транскрипции. N-конец р53, например, взаимодействует с белками TAF основного транскрипционного фактора TFIID из комплекса РНК-полимеразы II (Thut, Chen et al. 1995; Uesugi and Verdine 1999; Buschmann, Lin et al. 2001). Однако p53 также непосредственно взаимодействует с факторами элонгации транскрипции TFIIH (Xiao, Pearson et al. 1994) и FACT (Keller, Zeng et al. 2001). Кроме того, в течение процесса транскрипции белок р53, связываясь со своим ДНК-консенсусом, способствует ацетилированию нуклеосом гистоновыми ацетилтрансферазами (Espinosa and Emerson 2001).

На р53-зависимую активацию транскрипции влияют другие белковые факторы. Например, гистоновые ацетилтрансферазы рЗОО, СВР и PCAF являются коативаторами р53-зависимой транскрипции (Avantaggiati, Ogryzko et al. 1997; Scolnick, Chehab et al. 1997). Транскрипционный фактор Etsl необходим для р53-зависимой активации генов в ответ на действие УФ излучения: он важен для формирования комлекса СВР/р53, связи р53 с ДНК и активации гистоновых ацетилтрансфераз (Xu, Wilson et al. 2002). Белок рЗОО имеет сходство с CREB-связывающим белком (англ. СВР), относится к тому же семейству белков и коактивирует, как и СВР, транскрипцию, опосредованную транскрипционным фактором СREB (Blobel 2000). На С- и N-конце белка рЗОО картированы участки, с помощью которых он взаимодействует с белком р53 (Doman, Shimizu et al. 2003). Белок рЗОО, по-видимому, активно связывается с фосфорилированным по серину 20 белком р53, образуя комплекс. Связанное состояние р53-тетрамера со своим консенсусом в промоторе транскрибируемого гена способствует ДНК-зависимому ацетилированию р53 с помощью белка рЗОО в комплексе р53/р300, что в конечном итоге стабилизирует комплекс р53/р300 (Doman, Shimizu et al. 2003). Однако данные о влиянии рЗ00 на стабильность р53 очень противоречивы (См. раздел 2.4). Возможно также, что решающим для активации р53-зависимой транскрипции гена является ацетилирование белком рЗОО нуклеосом вблизи промотора, а не ацетилирование С-конца самого р53 (Espinosa and Emerson 2001). Для успешной активации промотора гена ингибитора циклин-зависимых киназ p21WAF1/Cipl необходима кооперация между транскрипционным фактором Spl, связывающимся непосредственно с промоторной областью p21WAF1/Cipl, и р53 (Koutsodontis, Tentes et al. 2001). Кофактор JM-Y, связываясь с рЗОО, усиливает р53-зависимую транскрипцию генов (Shikama, Lee et al. 1999). Коактиваторами опосредованной р53 транскрипции являются также белок BRCA1 (Ouchi, Monteiro et al. 1998), и транскрипционная мишень р53 - белок 14-З-Зс (Yang, Wen et al. 2003), которые непосредственно взаимодействуют с р53 in vivo, способствуют стабилизации р53 и усиливают транскрипцию с р53-зависимых промоторов в присутствии р53 дикого типа. Белок BRCA1, по-видимому, коактивирует транскрипцию р53-зависимых генов, отвечающих за репарацию ДНК и остановку клеточного цикла (MacLachlan, Takimoto et al. 2002). Таким образом, избирательная активация р53-зависимых генов может регулироваться с помощью других белковых факторов.

Гомологичный белок р73, как и р53, использует рЗОО и PCAF в качестве коактиваторов транскрипции (Zhao, Liu et al. 2003). Но p73 не нуждается в адетилировании белком рЗОО для стимулирования своей транскрипционной активности(Moll, Erster et al. 2001). Факторы ASPP взаимодействуют с р53 и способствуют транскрипционной активации проапоптотических р53-зависимых генов (Samuels-Lev, O'Connor et al. 2001). Они связывают также и белки р53-семейства рбЗ и р73 in vitro and in vivo, приводя к активации проапоптотических генов-мишеней р53, но не генов-регуляторов клеточного цикла (Bergamaschi, Samuels et al. 2004). Третий член ASPP-семейства - iASPP, напротив, ингибирует транскрипционную функцию р53 (Bergamasclii, Samuels et al. 2003)4.1.1 Мишень p53 ген рг!^™0?1Наиболее характерной мишенью р53 является ген p21VVAF1/Cipl, ингибитор циклин-зависимых киназ (англ. CDK - суclin-depended kinases). После определения последовательности обобщенного р53-зависимого элемента методом субтрактивной гибридизации бьш найден ген, названный WAF1 (от англ. wild-type activated factor), индукция которого зависела от экспрессии р53 дикого типа. Ген WAF1 локализован на хромосоме 6р21.2, консенсус связывания с р53 бьш обнаружен на 2.4 тыс. п.о. выше кодирующей последовательности гена WAF1 (el-Deiry, Tokino et al. 1993). На репортерных конструкциях была показана р53-зависимая транскрипция с промотора, содержащего р53-зависимый элемент гена WAF1. Одновременно с этой работой в 1993 году вышло несколько статей (Harper, Adami et al. 1993; Xiong, Hannon et al. 1993; Zhang, Xiong et al. 1993) о роли универсального ингибитора циклин-зависимых киназ -гена Cipl (от англ. CDK inhibiting protein). Белковый продукт этого гена, р21, весом в 21 кДа, связывается с комлексами циклин-зависимых киназ, что приводит к ингибированию комплексов. В результате семейство белков ретинобластомы (Rb) остается недофосфорилированным, белки этого семейства не выпускают факторы транскрипции типа E2F, что не позволяет клеткам вступить в фазу S. Такой защитный механизм включается в ответ на различные стрессовые воздействия на клетки. Белковые продукты генов WAF1 и Cipl оказались одним и тем же белком, участвующим в негативной регуляции клеточного цикла.

Белок р53 с разной силой связывается с двумя удаленными консенсусами в промоторе р21 (2.4 тыс. п.о. и 1.3 тыс. п.о. выше старта транскрипции) в ответ на обучение клеток УФ светом (Espinosa, Verdun et al. 2003). При этом практически весь р53 переходит в фосфорилированную по серину 15 форму и запускает транскрипцию р21 в течение первых часов после действия УФ.

Кроме значения в остановке клеток в фазе Gl, наличие функционального р21 важно для функционирования репарационных механизмов, что было показано на экспрессии поврежденной репортерной конструкции в клетках двух сублиний НСТ116p21 +/+ и HCT116 p21 -/- (McDonald, Wu et al. 1996). Действуя через ингибирование циклин-зависимых киназ, р21 может задерживать S фазу клеточного цикла (Ogryzko, Wong et al. 1997), что способствовует успешному репарационному процессу. Экспрессия р21 является маркером стареющих клеток (Atadja, Wong et al. 1995). Коактиватор ДНК-полимераз S и е - белок PCNA и р21 обнаруживают в комплексе с циклинами и циклин-зависимыми киназами (Waga, Hannon et al. 1994). Показано в опытах in vitro, что белок р21 взаимодействует с PCNA и задерживает синтез ДНК, препятствуя участию PCNA в репликации, но не в репарации ДНК (Li, Waga et al. 1994). Возможно, ослабление процесса экзиционной репарации ; в р21 -/- клетках связано с отсутствием взаимодействия р21 с фактором PCNA на этапе, последующим за присоединением PCNA к точкам репарации ДНК (Stivala, Riva et al. 2001).

Белок p21 может "защищать" клетки от апоптоза, связываясь с апоптозной киназой ASK1 (от англ. signal-regulating kinase 1) (Huang, Shu et al. 2003). Кроме того, он способен каким-то образом ингибировать расщепление каспаз, вызванное активацией DR4 TRAIL "рецептора смерти" TNF семейства, таким образом, отменяя запуск алоптозного каспазного сигнального каскада (Xu and El-Deiry 2000). В совокупности, последние исследования свидетельствуют, что р21 существенен для протекания таких клеточных процессов, как остановка клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК, репарация ДНК, апоптоз, клеточное старение, дифференцировка и остановка клеточного цикла под воздействием внеклеточных сигналов (Fotedar, Bendjennat et al. 2004).

Недавно появилось сообщение о новом гене-мишени р53, p53RFP, обладающим : ЕЗ убиквитин-лигазной активностью и способным положительно регулировать деградацию p21 (Ng, Arakawa et al. 2003). Так что регуляция р21 через р53 оказывается более сложной, чем считалось ранее.

4.1.2 Мишень р53 ген mdm2 (hdm2)Другой функционально значимой транскрипционной мишенью р53 является ген mdm2 (от англ. murine double minute 2 gene). Его человеческий гомолог называется hdm2. До открытия взаимосвязи mdm2 с р53 было замечено, что ген mdm2 пятидесятикратно амплифицирован в спонтанно трансформированной опухолеродной ; мышиной линии 3T3DM. При искусственной амплификации mdm2 в мышиных клетках NIH3T3, а также крысиных клетках Rat2, они приобретали способность вызывать развитие опухолей у голых мышей (Fakharzadeh, Trusko et al. 1991). С помощью моноклональных и поликлональных антител было найдено по крайней мере четыре дополнительных полипептида к белку mdm2/p90 (р85, р76, р74, р58-р57),возникающих вследствие алтернативного сплайсинга мРНК. Эти белки амплифицированы в мышиной клеточной линии 3T3DM (Oison, Maréchal et al. 1993). Часть из набора этих белков способна взаимодействовать с белком р53. В клетках 3T3DM р90 имеет такое же короткое время полураспада (20 мин) и локализован в ядре, как и р53. В покоящихся клетках 3T3DM уровень белка р90, а также уровень комлексов р90/р53 возрастает при стимуляции клеток сывороткой в поздней Gl фазе клеточного цикла (Oison, Maréchal et al. 1993). Оказалось, что связывание mdm2 с р53 препятствует р53-зависимой активации транскрипции (Momand, Zambetti et al. 1992).

Ген mdm2 содержит внутренний р53-зависимый промотор Р2 (Juven, Barak et al. 1993; Barak, Gottlieb et al. 1994), что может объяснять наличие альтернативных транскриптов разного молекулярного веса. В ответ на повреждения ДНК происходит быстрая р53-зависимая активация этого промотора (Barak, Gottlieb et al. 1994). Внешний р53-зависимый промотор PI гораздо более слабый (Barak, Gottlieb et al. 1994). Наблюдаются также некоторые различия в регуляции гена mdm2 у мыши и человека. Регуляция с внутреннего Р2 промотора hdm2 в клетках рака мозга человека может происходить независимо от действия р53 (Phelps, Darley et al. 2003).

В настоящее время взаимодействие белков р53 и mdm2 хорошо изучено. Клеточный белок mdm2 связывает своим N-концом (первые —110 а.о.) N-конец р53 (-15-29 а.о.) и тем самым препятствует регуляции р53-зависимой транскрипции, т.е. негативной регуляции клеточного цикла (Shimizu and Hupp 2003). Принята точка зрения о том, что амплификация гена mdm2 возникает в человеческих опухолях на стадии прогрессии. У трансгенных мышей, содержащих несколько копий гена mdm2 под своим собственным промотором, наблюдается. четырехкратное повышение экспрессии мРНК mdm2 во многих тканях и ускоренное развитие опухолей (Jones, Hancock et al. 1998). Т.е., аномальное повышение экспрессии mdm2 вызывает онкогенный эффект в клетке. Кроме того, сейчас существует богатая статистика совпадения случаев раковых заболеваний человека с дерегулированной экспрессией mdm2 (См. раздел 9). Ингибирование mdm2 разрабатывается как один из сопутствующих терапевтических подходов, приводящих к регрессии опухоли (Wang, Wangetal. 2002).

Белок mdm2 относится к классу ЕЗ убиквитиновых лигаз - белковых факторов и комплексов, которые специфично связывают определенные белки, способствуют навешиванию на последние молекул убивитина и направляют белки к протеосомам клетки, с помощью которых белки подвергаются быстрой деградации посредством убиквитин-зависимого биохимического механизма (Pray, 2002 #61). Белок mdm2отвечает за транспорт из ядра и убиквитиновую деградацию р53 (Honda, Tanaka et al. 1997). Кроме того, комплекс белков, содержащий гистон-деацетилазу-1 (HDAC1), связываясь с белком mdm2, деацетилирует р53 по всем известным лизиновым отстаткам in vivo. Посредством этих модификаций mdm2 также способствует быстрой деградации р53 по убиквитиновому механизму (Ito, Kawaguchi et al. 2002). Интересно то, что mdm2 способен направлять собственную деградацию по убиквитиновому механизму (Fang, Jensen et al. 2000).

Белок mdm2 содержит так называемый RING-домен, в котором четыре пары аминокислот удерживают два атома цинка, структура домена отвечает за ЕЗ-лигазную активность mdm2 (Fang, Jensen et al. 2000). Скрытый сигнал ядерной локализации (NLS) был идентифицирован в этом домене, с областью NLS сигнала, по-видимому, связывается клеточный белок pl4(ARF) (Lohrum, Ashcroft et al. 2000), который отменяет негативное влияние mdm2 на р53 (Honda and Yasuda 1999). RING-домен белка mdm2 содержит также мотив, способный связывать аденин-нуклеотиды, что изменяет конформацию С-конца белка и локализует mdm2 в ядре клетки (Poyurovsky, Jacq et al. 2003).

В 1995 году вышли две статьи о полученных гомологичной рекомбинацией mdm2-/- мышах с делецией гена mdm2. Такие мыши не были жизнеспособны и погибали на эмбриональной стадии. Однако мыши с двойной делецией mdm2-/- р53-/-развивались подобно нормальным мышам (Jones, Roe et al. 1995; Montes de Oca Luna, Wagner et al. 1995). Позже, используя модель рыбы (полосатого данио), получили эмбрионы с аналогичными делениями генов (Langheinrich, Hennen et al. 2002). Нормальные эмбрионы и эмбрионы р53-/- развивались морфологически неотличимо, эмбрионы mdm2-/- погибали на ранней стадии от апоптоза. Двойная делеция р53-/-mdm2-/- полностью снимала этот эффект, как это происходит при эмбриональном развитии мыши с подобной делецией генов.

Похоже, главная функция клеточного mdm2 состоит в сдерживании антипролиферативных эффектов р53, что наиболее важно при эмбриональном развитии организма. Однако возможно, что mdm2 активирует пролиферацию клеток также и через р53-независимые механизмы. Белок mdm2 имеет ингибиторный домен (50-222 а.о.), с помощью которого он связывается с ТВР, а также малой субъединицей транскрипционного фактора TFIIE и ингибирует трансрипцию генов (Thut, Goodrich et al. 1997). Кроме того, mdm2 связывается с TFIID in vivo: С-конец mdm2 взаимодействует с TAFII250/CCG1, а центральный кислый домен mdm2 взаимодействует с ТВР (Leveillard and Wasylyk 1997). В зависимости от интенсивности,экспрессия mdm2 способствует активации или репрессии промотора циклина А, этот эффект устранется при делеции С-концевого участка mdm2. Трансформация клеток с помощью экспрессии mdm2 коррелирует с повышенным содержанием мРНК циклина А в трансформированных клетках (Leveillard and Wasylyk 1997). Белок mdm2 связывает р21 в р53-/- клетках, способствует деградации р21 и дерегуляции Gl блока клеточной пролиферации, не задействуя убиквитиновые механизмы деградации белков (Jin, Lee et al. 2003). Существуют сведения о том, что mdm2 способен связываться с транскрипционным фактором E2F1 и его партнером по трансактивационному комплексу DP-1, при этом mdm2 усиливает транскрипцию, опосредованную этими транскрипционными факторами. Белок mdm2 связывает С-конец E2F1, необходимый для взаимодействия Rb с E2F1, ингибируещего E2F1 (Xiao, Chen et al. 1995). Однако эффект шс!ш2-зависимой активации E2F1 в клетке, скорее всего, в основном связан с ингибированием р53 и, соответвенно, уменьшением белка р21 и освобождением E2F1 из комплекса с Rb (Wunderlich and Berberich 2002).

Фосфорилирование аминокислотных остатков N-конца (серина 15, треонина 18, серина 20) молекулы р53 важно для функциональной активации р53 и может осуществлятся различными клеточными протеинкиназами. Участок молекулы р53 приблизительно с 10 по 26 а.о. иногда называют Box-I (Doman, 2001 #262). Предполагали, что фосфорилирование принадлежащих ему трех аминокислотных остатков разрушает связывание р53 с mdm2 (Shimizu and Hupp 2003). Однако, по-видимому, лишь фосфорилирование треонина 18 существенно ослабляет связывание р53 с mdm2 (Schon, Friedler et al. 2002). Такое заключение сделали из исследования связывания белка mdm2 с короткими полипептидами различных модификаций, соотвествующими участку Вох-1 в молекуле р53. Сам mdrn2 претерпевает значительные конформационные изменения при связывании с полипептидами Вох-Г р53 (Schon, Friedler et al. 2002).

Кроме регуляции N-концевого домена р53, на связывание белков р53 и mdm2 может влиять модификация самого белка mdm2. Фосфорилирование mdm2 по серину 17 протеинкиназой DNA-PK, активирующейся в ответ на повреждения ДНК, препятствует взаимодействию mdm2 с р53 и позволяет р53 осуществить негативную регуляцию клеточной пролиферации (Mayo, Turchi et al. 1997). Недавно с помощью метода ядерно-магнитного резонанса было обнаружено, что кроме регуляции модифицируемого участка 25-109 а.о. молекулы mdm2, непосредственно взаимодействующего с р53, белок mdm2 может регулироваться с помощью собственного домена-'крышечки" 16-24 а.о. Этот домен способен закрыватьгидрофобный участок mdm2 для связывания р53, т.е. тем самым ингибировать связывающий р53 эпитоп mdm2 (McCoy, Gesell et al. 2003). Фосфорилирование по серину 17 домена-"крышечки" (16-24 а.о.) mdm2, по-видимому, способствует "захлопыванию" р53-связывающего эпитопа и объясняет разрушение в таком случае взаимодействия mdm2 с р53. Кроме протеинкиназы DNA-PK, киназа ATM сама связывается с mdm2 и фосфорилирует белок mdm2 по сериновым и треониновым остаткам после повреждений ДНК, вызванных ионизизирующей радиацией (de Toledo, Azzam et al. 2000). В ответ на воздействие ингибиторов репликации ДНК активируется киназа ATR, которая фосфорилирует белок mdm2 по серину 407, что, по-видимому, препятствует экспорту р53 с помощью mdm2 из ядра в цитоплазму (Shinozaki, Nota et al. 2003). Фосфорилирование mdm2 по серину 395 киназой ATM в ответ на повреждения ДНК, возможно, тоже способствует отмене транспорта р53 из ядра с помощью mdm2 (Maya, Balass et al. 2001).

Коактиватор р53-опосредованной транскрипции рЗОО связывается с mdm2 и способствует стабилизации последнего и негативному влиянию mdm2 на функцию р53, при этом рЗОО не задействует свою ацетилтрансферазную активность (Zeng, Jin et al. 2003). Стабильность и локализация белка mdm2, а также экспрессия мРНК может регулироваться другими белками, например: отрицательно фосфатазой PTEN (Мауо, Dixon et al. 2002; Chang, Freeman et al. 2004) и положительно протеазой HAUSP (Li, Brooks et al. 2004) (убиквитин-специфичная протеаза USP7, которая препятствует также деградации р53). Т.е., HAUSP является интересным узлом в регуляции p53-mdm2 взаимодействий. Продукт гена-мишени р53 белок 14-З-За, связывая mdm2, препятствует тс1т2-зависимой деградации и экспорту р53 из ядра, тем самым, усиливая трансактивационную функцию р53 (Yang, Wen et al. 2003).

Амундсон с соавторами изучали индукцию генов в ответ на малые дозы у-радиации. Ген mdm2 оказался среди группы генов, отвечающих за регуляцию клеточного цикла, чья активация не зависит от величины дозы облучения (Amundson, Lee et al. 2003). Экспрессия mdm2 нарастает вместе с другими генами-мишенями белка р53 в ответ на повреждения ДНК и другие клеточные стрессы. Поэтому mdm2 негативно регулируется на уровне белка посредством модификаций клеточными протеинкиназами, фосфорилирование которыми препятствует связыванию mdm2 с р53.

Сейчас найдено несколько белков, близких к mdm2 по структуре и по гомологии. Например, белок MDMX имеет подобный N-домен для связывания р53. Хотя этот белок не регулируется р53 и не может заменить необходимого негативного влияния mdm2 на р53 при эмбриональном развитии, он все же участвует в регуляции р53.

37MDMX при наличии р53-связывающего домена не имеет ЕЗ лигазной активности и, связывая р53, способствует его стабилизации, предотвращая тс1т2-зависимую деградацию р53 (Bottger, Bottger et al. 1999). Возможно, что несколько аминокислотных остатков на N-конце MDMX являются; мишенью для клеточных протеинкиназ, регулирующих сам MDMX и, таким образом, приводящих. к конкуренции между белками mdm2 и MDMX за связывание с белком р53.

4.2 Клеточные гомологи р53 - белки рбЗ и р73Изоформы белков рбЗ и р73, содержащие трансактивационные домены, могут трансактивировать гены-мишени р53, вызывать апоптоз, супрессировать аналогично р53 экспрессию некоторых: генов. При этом сила трансактивации различными формами рбЗ и р73 генов-мишеней р53 может очень сильно варьировать (Moll, Erster et al. 2001). Только трансактивационная форма р73а способна вызывать апоптоз, сравнимый по силе с р53-зависимым апоптозом, в экспериментах по искусственной экспрессии различных форм р53-семейства. Различные формы р73, по-видимому, конкурируют за связывание с р53-зависимыми элементами (Moll, Erster et al. 2001). Варианты ANp63 и ANp73, лишенные трансактивационных доменов, напротив, действуют как доминантно-негативные ингибиторы всех членов семейства.

Экспрессия рбЗ необходима для нормального развития многих органов. У мышей, дефектных по рбЗ, отсутствуют или развиваются укороченные конечности, а также наблюдается черепно-лицевой порок развития. Животные живут не более нескольких дней после рождения (Moll, Erster et al. 2001). В нормальной эпителиальной ткани человека синтезируются изоформы рбЗ, преимущественно ANp63. В процессе дифференцировки эти клетки, по-видимому, перестают синтезировать ANp63.

Экспрессия р73 необходима для нормального развития и функционирования нервной системы и мозга, разные формы р73 важны для дифференцировки некоторых типов клеток (Moll, Erster et al. 2001). Однако, несмотря на значительную дисфункцию развития, мышь р73-/- не подвергается спонтанному развитию опухолей даже после двух лет наблюдения (Yang, 2000 #265).

Животные, дефектные по гену р53, развиваются в целом нормально, но у них достаточно быстро начинается спонтанное формирование опухолей. Эмбриональному развитию сопутствует, по-видимому, синтез ANp63 и ANp73 форм, способных ингибировать р53 и сдерживать его антипролиферативную функцию (Moll, Erster et al. 2001).

Клеточный ингибитор р53 - белок mdm2 никак не влияет на деградацию белков р73 и рбЗ, хотя она происходит, как и деградация р53, на протеосомах клетки (Moll, Erster et al. 2001). Но белок р73 способен активировать транскрипцию mdm2, приводя уменьшению количества р53 в клетке (Wang, Ongkeko et al. 2001). При значительном количестве белок mdm2 в клетке конкурирует за связывание N-конца белка рЗОО с белком р73 и разрушает взаимодействие р73, но не р53, с коактиватором транскрипции рЗОО (Moll, Erster et al. 2001). Накопление белка р53, вызванное, например, облучением клеток УФ светом, каким-то образом способствует деградации ингибиторной для белка р53 формы ANp63.

Мутации генов р73 и рбЗ встречаются в человеческих опухолях редко (Moll, Erster et al. 2001). (Исключение в случае р73 составляют лимфомы.) Однако часто в опухолях встречается амплификация гена рбЗ и значительное увеличение экспрессии формы ANp63. Также часто встречается гиперэкспрессия р73, особенно содержащей трансактивационный домен формы р73.

Таким образом, существует тонкая регуляционная настройка внутри р53-подобного семейства. Белки рбЗ и р73 скорее настраивают трансактивационную функцию р53, чем заменяют ее.

4.3. Репрессирующая активность р53Механизмы транскрипционной репрессии генов, опосредованной р53, еще недостаточно изучены. До сих пор, например, неясно, всегда ли необходимо связывание р53 с ДНК промоторных областей и транскрипционной машиной РНК полимеразы II при такой репрессии, единообразны ли механизмы р53-зависимой репрессии. Возможно, что в основе механизма р53-зависимой репрессии, в противоположность р53-зависимой трансактивации (Espinosa and Emerson 2001) лежит свойство р53 привлекать с помощью корепрессора mSin3a не гистоновые ацетилтрансферазы, а гистоновые деацетилазы, удаляющие ацетильные группы с нуклеосом (Murphy, Ahn et al. 1999). Корепрессор mSin3a и p53 связывают и репрессируют промотор Мар4 in vivo преимущественно тогда, когда он связан с деацетилированными гистонами (Murphy, Ahn et al. 1999). Белок p53, гистон-деацетилазу-l (HDAC1) и mSin3a обнаружили связанными с промотором гена MAD1 in vivo. Авторы картировали участок промотора MAD 1 длиной в 38 п.н., необходимый для р53-зависимой репрессии гена. Белок р53, по-видимому, при содействии mSin3a репрессирует промотор MADI (от англ. Mitosis Arrest Deficiency 1), белковый продукт которого способствует отмене митотической остановке клеточного цикла (Chun and Jin 2003). Интересно то, что несколько точечных мутантов р53 репрессировали промоторMAD1 также эффективно, как и белок р53 дикого типа (Chun and Jin 2003). Возможно, в репрессионной функции р53 тонкая конфомационная настройка молекулы р53 не так существенна, как при р53-зависимой активации транскрипции. С другой стороны, в литературе описаны случаи потери мутантами р53 репрессионных свойств. Не всегда для р53-зависимой репрессии генов требуется взаимодействие р53 с промоторной ДНК гена. Как и несколько лет назад, в настоящее время предполагают, что р53 репресссирует экспрессию генов через взаимодействие с ТАТА-связывающим белком ТВР (Slee, O'Connor et al. 2004). Кроме того, белок p53 трансактивирует ген транскрипционного репрессора ATF3, активирующегося в ответ на стресс (Zhang, Gao et al. 2002).

Белок p53 взаимодействует с транскрипционным фактором SL1 РНК-полимеразы I, препятствуя связыванию факторов SL1 и UBF (Zhai and Cornai 2000). Таким образом, р53 предотвращает возникновение инициирующего комплекса SL1-UBF-PHK-полимераза I и репрессирует транскрипцию рибосомной ДНК, регулируемой РНК-полимеразой I. Белок р53 репрессирует промоторы, регулируемые полимеразой III. Эксперименты с делециями разных участков р53 показали, что для этого эффекта имеют значение разные домены молекулы р53 (Stein, Crighton et al. 2002). Разрушая взаимодействие транскрипционного фактора АР-1 с базальными транскрипционными факторами, белок р53 репрессирует промотор металлопротеиназы-1 матрикса (Sun, Zeng et al. 2004). Предполагают, что белок Rb, связывая mdm2 и р53 и не препятствуя связыванию mdm2 с р53, усиливает репрессионную, но не мешает ингибированию трансактивационной функции р53 (Slee, O'Connor et al. 2004). Богатый пролином участок (61-94 а.о.) необходим белку р53 для эффективной репрессии генов (Slee, O'Connor et al. 2004).

Белок p53 репрессирует промоторы таких генов, как ДНК топоизомеразы II, киназы Weel (Leach, Scatena et al. 1998), транскрипционного фактора DPI, белка presenilin-l, металлопротеиназ матрикса -1 и 13 (Но and Benchimol 2003), антиапоптотических генов BcI-2, survivin, Мар4 и stathmin (Murphy, Ahn et al. 1999; Slee, O'Connor et al. 2004). Белок р53 репрессирует экспрессию генов-регуляторов клеточного цикла cdc2 и циклина В1 (Passalaris, Benanti et al. 1999; Park, Chae et al. 2000), а также промоторы интерлейкинов IL-2 и IL-4 (Pesch, Brehm et al. 1996).

Белок p53 репрессирует экпрессию эндотелиального ростового фактора сосудов (от англ. vascular endothelial growth factor) VEGF (Bellamy 2002), а также гена NO-синтетазы (Chiarugi, Magnelli et al. 1998), стимулирующих ангиогенез. Появление в клетке NO-синтетазы, взаимообратно, приводит к синтезу NO и, как следствие,РОССИЙСКАЯ ГССУДЛРСТОЕНКАЯ Е^ЗГ.'ОТЕКАповреждениям ДНК и накоплению р53 (Forrester, Ambs et al. 1996). Клеточные гомологи р53 также способны к репрессии генов. Например, белок р73 репрессирует транкрипцию гена VEGF (Salimath, Marme et al. 2000).

Репрессия генов с помощью белка р53 может регулировать биохимические каскады в клетке в нескольких узловых точках. Например, вирусные и клеточные онкогены способствуют усилению экспрессии циклооксигеназы СОХ-2. Белок р53 негативно регулирует транскрипцию СОХ-2, активная экспрессия которой запускает биохимический путь, способствующий прогрессии опухолей за счет подавления межклеточной адгезии, процессов апоптоза, а также за счет стимуляции ангиогенеза и инвазивности новообразований (Kim, Gunther et al. 2003). Один из метаболитов, стоящих биохимически ниже СОХ-2 - ТХА-2, преобразуется из простагландина Н2 с помощью тромбоксан-синтетазы TXSA, экспрессия которой также способствует прогрессии опухолей. Транскрипционный фактор Ets-1, активирующий гены, способствующие метастазированию, ангиогенезу и инвазии опухолей, активирует в том числе транскрипцию и TXSA. Эта активация находится под строгим негативным контролем р53 и связана, по-видимому, со способностью р53 связывать своим С-концом фактор Ets-1 (Kim, 2003 #269). Однако, с другой стороны, фактор Ets-1 нужен р53 для трансактивации генов и запуска апоптоза в ответ на облучение клеток УФ светом (Xu, Wilson et al. 2002).

4.4 Методы оценки трансактивирующей способности р53После обнаружения трансактивационного домена р53 (O'Rourke, Miller et al. 1990), позволившего предположить, что белок р53 в клетке служит транскрипционным фактором, активно изучалось связывание белка р53 с ДНК. Вскоре после открытия обобщенного консенсуса и преимущественной последовательности для связывания белка р53 с ДНК (el-Deiry, Kern et al. 1992; Funk, Pak et al. 1992) для оценки транскрипционной активности р53 стали использовать плазмиды, содержащие репортерные гены люциферазы, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (англ. CAT), бактериальной ß-галактозидазы. Репортерный ген обычно клонировали под минимальный промотор, дополняя его последовательностями ДНК-элементов для связывания р53. Такие конструкции вводили в клетки эукариот, используя метод кальций-фосфатной трансфекции. После проведения экспериментов над трансфецированными культурами клеток исследовали изменения активности р53: определяли количество синтезированного белка, соответвующего репортерному гену, т.е. косвенно оценивали способность р53 усиливать экспрессию генов.

Например, одна из первых таких статей посвящена изучению трансактивационных свойств дикого и мутантных форм р53 в клетках рака легкого Н1299 человека, утерявших эндогенный р53, (в качестве модели для исследования они используются ив нашей работе). Методом котрансфекции в клетки вводились конструкция репортерного гена люциферазы под промотором, содержащим р53-зависимый элемент CON или "фрагмент А" из из кластера рибосомных генов, а также плазмида, содержащая кДНК р53 под сильным CMV промотором (Chen, Funk et al. 1993).

В настоящее время используют множество подходов, позволяющих оценивать трансактивационные свойства р53.

Создана плазмида, содержащая репортерный ген зеленого флуоресцентного белка GFP (от англ. green fluorescent protein) под р53-чувствительным промотором (Zhang, Labrecque et al. 2001). Преимущество этого репортера заключалось в возможности наблюдать за активностью р53 отдельных живых клеток, не собирая клеточные экстракты. Но первоначальная плазмида, содержащая только естественный промотор из гена WAF1 -транскрипционной мишени р53, при введении в клетки не приводила к синтезу обнаруживаемого белка GFP. Определяемого синтеза репортера удалось добиться усилением WAF1 промотора энхансером PG13 (Kern, Pietenpol et al. 1992), содержащим 13 повторов р53-зависимых элементов. Экспрессия клеточного гомолога р53, белка р73а, тем не менее не приводила к заметной активации усиленного промотора созданной конструкции (Zhang, Labrecque et al. 2001).

Дубровин и соавторы использовали самоинактивирующуюся ретровирусную конструкцию TKGFP, содержащую под р53-засисимым промотором два слитых белка-тимидинкиназу вируса простого герпеса типа 1 (от англ. ТК) и белок GFP. Такую конструкцию вводили в клетки человеческой глиомы U87, содержащую эндогенный р53 дикого типа, наблюдали активацию в них зеленой флуоресценции при обработке ДНК-повреждающими агентами. Клетки U87, содержащие конструкцию TKGFP, клетки U87, не содержащие TKGFP в качестве негативного контроля, а также клетки U87, содержащие активно экспрессируемый TKGFP в качестве позитивного контроля вводили крысам одновременно друг с другом. Половине мышей проводили инъекции ДНК-повреждающего агента BCNU, а также всем мышам вводился субстрат для определения тимидинкиназы с помощью метода позитронной эмиссионной томографии (от англ. positron-emission tomography (PET)), который был разработан применительно к репортерному гену тимидинкиназы ранее. Метод PET позволяет наблюдать активацию р53-зависимой экспрессии TKGFP in vivo в объеме ткани, получая несравненно большеинформации об активации антионкогена р53. Активация экспрессии сшитого репортерного гена TKGFP, обнаруживаемая с помощью метода PET, контролировалась наблюдением зеленой флуоресценции кусочков ткани трансплантанта, высаженных на подложку, а также определением накопления мРНК и белков р53 и p21WAF1 обычными методами (Doubrovin, Ponomarev et al. 2001).

Монти и соавторы изучали влияние мутантных форм белка р53 человека на трансактивационные свойства гомологичной белку р53 формы р73р. Все гены экспрессировали в дрожжевой системе S. Cerevisiae, исключая влияние природного для этих белков биохимического контекста (Monti, Campomenosi et al. 2003). В дрожжевую линию, несущую репортерный ген ADE2 под р53-зависимым промотором, вводили экспрессируемые в дрожжах плазмиды, несущие конструкты гена р73р, а также гены р53 дикого или мутантного типов. Культивированием дрожжей на субстрате, лишенном определенной кислоты, добивались появления колоний, которые синтезировали изучаемые белки. Цвет колоний (красный, розовый, белый) менялся в зависимости от статуса экпрессии репортерного гена ADE2. Аналогичным образом с помощью "питательной" селекции Биттер с соавторами сравнивали три дрожжевые репортерные системы, экспрессирующие репортерные гены ADE2, HIS3 и URA3 с укороченных дрожжевых промоторов, содержащих встроенные р53-зависимые элементы (Bitter, SchaefFer et al. 2002). Для количественной оценки активации репортера использовалься также ген бактериальной Р-галактозидазы. Активация репортерных систем в дрожжах зависела от силы экспрессии кДНК гена р53 (Bitter, Schaeffer et al. 2002).

5. Конформационные изменения р53 и вызывающие их факторы, отвечающие за функциональную активность р53Белок р53 в клетке может подвергаться множеству модификаций аминокислотных остатков. Известны такие модификации р53, как фосфорилирование, ацетилирование, убиквитинизация, рибозилирование, О-гликозилирование, а также навешивание малых убиквитин-подобных петидов SUMO. Кроме того, постоянно возрастает число известных белковых факторов, непосредственно связывающихся с р53 и влияющих на его функцию в клетке. Вероятно, белок р53 в ядре представлен в виде двух молекулярных фракций - конформационно способной и неспособной связывать ДНК р53-зависимых элементов (Buzek, Latonen et al. 2002). Восстановленное состояние цистеиновых остатков (например, цистеина 277) ДНК-связывающего домена способствует связыванию р53 с р53-зависимыми элементами промоторов (Buzek, Latonen et al. 2002). Внутри молекулы р53 при окислении цистеиновых остатков могут43возникать дисульфидные связи, задействующие тиоловые группы цистеинов. Например, такая дисульфидная связь с цистеином 182, вероятно, ослабляет связывание р53 с ДНК (Sun, Vinci et al. 2003).

Процесс убиквитинизации р53 (навешивание молекул убиквитина на лизиновые аминокислотные остатки) приводит к деградации онкосупрессора на протеосомах, следовательно, уменьшает время жизни и способствует снижению функциональной активности р53. ЕЗ убиквитиновая лигаза mdm2, экспрессия которой зависит от транскрипционной активности р53, регулирует уровень белка р53 в клетке (см. об этом подробнее разделы 2.4 и 4.1.2) (Honda, Tanaka et al. 1997). Во-первых, mdm2 сам связывается с трансактивационным N-концом р53, препятствуя работе р53 в качестве транскрипционного фактора. Во-вторых, mdm2 переносит р53 из ядра в цитоплазму и благодаря; своей ЕЗ убиквитиновой лигазной активности способствует быстрой деградации р53 на протеосомах. Онкосупрессор pl9ARF, связывая mdm2, защищает р53 от шс!т2-зависимой деградации (Honda and Yasuda 1999). Клеточный гомолог р53 — белок р73 способен активировать транскрипцию mdm2, приводя к уменьшению количества р53 в клетке (Wang, Ongkeko et al. 2001). Рибосомный белок LI 1 способен подобно белку pl9ARF связывать р53, приводя к стабилизации последнего (Lohrum, Ludwig et al. 2003). Такие вирусные белки, как Е1В-55 kDa, белок X гепатовируса В связывают трансактивационный N-конец р53 и ингибируют его трансактивационную функцию (May and May 1999).

Многие сериновые и треониновые протеинкиназы способны фосфорилировать р53. Выявлены очень многие, но охарактеризованы наиболее значимые модификации фосфорилирования р53. Фосфорилирование серина 15 очень важно для функциональной активации р53. После повреждений ДНК в клетке происходит фосфорилирование р53 по серину 15 в течение первых часов стресса (Espinosa, Verdun et al. 2003), которое ослабляет взаимодействие р53 с mdm2, что было показано in vivo and in vitro (Shieh, Ikeda et al. 1997). Это фосфорилирование может осуществлять протеинкиназа DNA-PK по сериновым остаткам 15 и 37, что снижает способность mdm2 ингибировать р53-зависимую активацию транскрипции (Shieh, Ikeda et al. 1997). Хотя возможно, что только фосфорилирование треонина 18 существенно ослабляет связывание р53 с mdm2, что было показано в более поздней работе, изучавшей связывание р53-полипептидов с mdm2 (Schon, Friedler et al. 2002). Лин и соавторы показали на примере линии клеток рака предстательной железы, что ресвератрол вызывает в них процесс апоптоза посредством активации каскада митоген-активирующихся киназ (англ. МАРК). Активация этого каскада приводит кфосфорилированию р53 по серину 15 и увеличению силы связывания р53 со специфичным консенсусом ДНК, что необходимо для включения апоптозного процесса в этих клетках (Lin, Shih et al. 2002). Сигнал ядерного экспорта был идентифицирован на участке с 11 по 27 а.о. белка р53, где находятся два сериновых остатка (Serl5, Ser20), которые подвергаются фосфорилированию после повреждений ДНК (Zhang and Xiong 2001). Фосфорилированный по серину 15 р53 не экспортируется из ядра клетки при облучении УФ светом, т.е. фосфорилирование способствует накоплению р53 в ядре, по-видимому, не только засчет ингибирования взаимодействия р53 с mdm2, а также засчет ингибирования сигнала ядерного экспорта на N-конце молекулы.

Такие воздействия на клетки, как ионизирующая радиация, приводят к повреждением ДНК: одно- и двуцепочечным разрывам, повреждениям оснований и Сахаров. В настоящее время принята трехступенчатая схема внутриклеточного ответа на повреждения ДНК (Fei and El-Deiry 2003). К первой ступени относят белки-сенсоры, которые обнаруживают повреждение. Ко второй ступени относят белки-передатчики, к ним у млекопитающих относят протеинкиназы ATM (от англ. ataxia telangiectasia mutated) и ATR (от англ. rad3-related). Киназы ATM и ATR фосфорилируют и активируют две эффекторные протеинкиназы третьей ступени - Chkl и Chk2, обеспечивающие функционирование трех главных процессов ответа на повреждение ДНК - задержки пролиферации, репарации ДНК и включение запрограммированной клеточной гибели (апоптоза). Киназа ATM непосредственно фосфорилирует еще множество белков-мишеней в ответ на повреждения ДНК, среди них р53 по серину 15 (Banin, Moyal et al. 1998) и mdm2 по серину 395 (Maya, Balass et al. 2001). ATR-киназа фосфорилирует p53 по серинам 15 и 37 (Tibbetts, Brumbaugh et al. 1999).

Протеинкиназа Chkl, являющаяся одним из главных компонентов регуляции задержки клеток в фазе G2 в ответ на радиацию, и связывает р53, и фосфорилирует р53 по серину 20 (Tian, Faje et al. 2002). Киназа Chkl имеет постоянню фосфорилирующую активность к треонину 18 молекулы р53, которая может переключается на фосфорилирование серина 20 (Craig, Scott et al. 2003). Протеинкиназа Chk2 рапознает участки в ДНК-связывающем домене р53 и фосфорилирует N-конец р53 по треонину 18 и серину 20 в ответ на повреждения ДНК (Craig, Scott et al. 2003). Основная функция по отношению к р53 киназы Chk2 - фосфорилирование по серину 20, которая переключается и на фосфорилирование треонина 18.

Казеин киназа 1 может фосфорилировать р53 поврежденных клеток по треонину 18 (Sakaguchi, Saito et al. 2000). Стресс-киназа JNK связывает и фосфорилирует р53,активация ее экспрессии посредством МАР-киназного каскада JNKK(DeltaMEKKl)-JNK приводит к снижению убиквитиновой деградации р53, активации р53-зависимой транскрипции и активации апоптозных механизмов (Fuchs, Adler et al. 1998).

Киназа HIPK2, которая активируется в ответ облучение клеток УФ светом, связывает и фосфорилирует р53 по серину 46, что стимулирует в клетках р53-зависимую транскрипцию и включение апоптозной программы (D'Orazi, 2002 #271). Возможно, что физическое взаимодействие между членами р53-семейства и HIPK2 играет опреденную роль в усиление апоптоза (Kim, Park et al. 2002). Именно фосфорилирование р53 по серину 46 относят к характерной модификации, связанной с апоптозом (Fridman and Lowe 2003). Например, трансактивация р53-зависимого проапоптотического гена р53А1Р1 зависит от этой модификации (Oda, Arakawa et al. 2000). Возможно, что индукция другого р53-зависимого гена p53DINPl (от англ. р53-dependent damage-inducible nuclear protein 1) при повреждениях ДНК усиливает фосфорилирование р53 по серину 46 с помощью привлечения киназного комплекса и, соответственно, за счет этого усиливается экспрессия р53AIP 1 и апоптоз клеток. (Okamura, Arakawa et al. 2001).

Митоген-зависимая киназа р38(МАРК) фосфорилирует р53 по серину 33 в ответ на осмотический шок (Kishi, Nakagawa et al. 2001; Okamura, Arakawa et al. 2001). Авторы считают эту модификацию, а также ацетилирование лизина 382 специфичными для этого стресса модификациями р53, т.к. ингибирование р38(МАРК) приводило к отмене этих модификаций в ответ на осмотический шок, а также отмене индукции р21, несмотря на сохраняемое накопление р53.

Пептидил-пролил изомераза Pinl, регулирующая многие белки-регуляторы клеточного цикла и апоптоза, в случае повреждений ДНК в клетке взаимодействует с белком р53, изменяя его конформацию, и усиливает трансактивационную функцию р53 (Zacchi, Gostissa et al. 2002). Это взаимодействие зависит от фосфорилированного состояния р53 по серину 33, треонину 81 и серину 315.

Фосфорилирование р53 по серину 392 на порядок увеличивает стабильность тетрамера, составленного из тетрамеризационных доменов р53 (Ser303-Asp393). Фосфорилирование р53 по серину 315 снимает этот эффект (Sakaguchi, Sakamoto et al. 1997).

Регуляция активности р53 осуществляется также через ацетилирование белка. Ацетилирование антионкогена р53 способствует его стабилизации, а, следовательно, повышению функциональной активности р53. Комплекс белков, содержащий деацетилазу HDAC1, связываясь с mdm2 независимо от р53, деацетилирует р53 по всемизвестным лизиновым отстаткам in vivo (Ito, Kawaguchi et al. 2002). Экспрессия доминантно-негативного мутанта HDAC1 восстанавливает ацетилирование р53, обусловленное комплексом рЗОО/СВР. Поэтому фибробласты, экспрессирующие доминантно-негативный мутант HDAC1, при повышенном ацетилировани и р53 в ответ на повреждения ДНК проявляют увеличенный уровень белка р53, а также усиленную активацию генов-мишеней р53 - р21 и mdm2. Т.к. большинство лизиновых остатков р53 перекрывается с сайтами убиквитинизации, скорее всего главная роль ацетилирования р53 - это защита от т<1т2-зависимой убиквитиновой деградации (Ito, Kawaguchi et al. 2002). Аналогично показано, что деацетилаза Sir2a ослабляет апоптозную функцию р53 (Luo, Nikolaev et al. 2001). В положительной регуляции деацетилования р53 участвует белок SIRT1, что было продемострировано с помощью искусственно выведенных мышей, утерявших функцию этого белка (Cheng, Mostoslavsky et al. 2003).

Ацетилируя белок р53, связанный со специфичным консенсусом ДНК, белок рЗОО способствует стабилизации комлекса р53/р300 (Doman, Shimizu et al. 2003). Однако замечено негативное влияние рЗОО на трансактивационную функцию р53 через стабилизацию mdni2 (Zeng, Jin et al. 2003), через ЕЗ лигазную по отношению к р53 активность рЗОО (Grossman, Deato et al. 2003) (См. раздел 2.4). Несмотря на это, белок рЗОО, непосредственно взаимодействующий с р53, относят к коактиваторам р53-зависимой транскрипции (Avantaggiati, Ogryzko et al. 1997; Scolnick, Chehab et al. 1997; Espinosa and Emerson 2001 ; Fei and El-Deiry 2003).

Коактиваторы транскрипции рЗОО и PCAF ацетилируют р53 по лизину 382 на карбоксильном конце молекулы и лизину 320 в районе сигнала ядерной локализации соответственно (Sakaguchi, Herrera et al. 1998). Обе модификации увеличивают силу связывания р53 со своими специфическими последовательностями. В ответ на обработку клеток УФ излучением и ионизирующей радиацией происходит ацетилирование р53 по лизину 382 и фосфорилирование по серинам 33 и 37 in vivo. Однако в экспериментах in vitro фосфорилированные по серинам 33 и/или 37 пептиды, соответствующие N-концу р53, препятствуют ацетилированию молекулы р53 по этим двум лизиновым сайтам (Sakaguchi, Herrera et al. 1998). Благодаря ацетилированию и фосфорилированию двух сайтов происходит модификация С-концевого сегмента р53, приводящая к усилению сродства белка к регуляторным элементам р53-зависимых генов (Chiarugi, et al. 1998). Фосфорилирование по серину 20 и треонину 18 значительно стабилизирует комплекс р300/р53 (Dornan, et al. 2001), а фосфорилирование по серину 20 кроме того способствует ацетилированию р53 спомощью рЗОО (Doman, et al. 2003). Т.е., в клетке в ответ на различные условия могут возникать взаимозависимые каскады модификаций фосфорилирования-ацетилирования.

Ацетилирование р53 по 320 и 373 лизиновым остаткам, возможно, отвечает за трансактивацию проапоптотических р53-зависимых генов PIG3 и NOXA и протекание апоптозного процесса в ответ на ингибиторы гистоновых деацетилаз (Terui, Murakami et al. 2003).

Белок p53 подвергается О-гликозилированию (Shaw, Freeman et al. 1996), значительно изменяя свою элекрофоретическую подвижность в акрилимидном геле (Fiordaliso, Leri et al. 2001). Например, повьппенное содержание глюкозы (гипергликемия) приводит к последовательному каскаду реакций в крысиных миоцитах: О-гликозилированный р53 массой 55,6 кДа появляется в течение 20 мин. гипергликемии, достигая пика к концу 1го часа, вызывает активацию своих генов-мишеней ренин-ангиотенсиновой системы (англ. RAS). Далее система RAS приводит к формированию ангиотенсина II в период от 45 мин до 1 часа гипергликемии, ангиотенсин II приводит к активации МАР-киназы р38, которая, по-видимому, своей активностью производит замену О-гликозолированного состояния р53 на фосфорилированное по серину 390 (Fiordaliso, Leri et al. 2001). Кроме серина 390, р53 фосфорилируется по серину 18 начиная с 1 го часа гипергликемии. Эти события коррелируют с транкрипционной активацией гена Вах и активацией апоптоза миоцитов in vitro при повышенном содержании глюкозы в среде.

На активность р53 и взаимодействие с другими белками влияет убиквитин-подобная ковалентная модификация р53 - навешивание небольшого полипептида SUMO-1 (Melchior and Hengst 2002). Клеточный: ингибитор mdm2 и клеточный активатор ARF функции р53 способствуют навешиванию на молекулу р53 полипептидов SUMO-1, причем при их кооперации этот эффект усиливается (Chen and Chen 2003). Возможно, навешивание полипептидов SUMO-1 способствует ядерной локализации р53 (Chen and Chen 2003), хотя регуляторное значение таких модификаций не понятно. Например, навешивание SUMO-1 на лизин 386 в р53, по-видимому, не влияет ни на клеточную локализацию р53, ни на транскрипционную активацию генов-мишеней р53, ни на р53-зависимую регуляцию клеточного роста, что было показано на культуре 293, а также на опухолевых человеческих культурах MCF7 и НТ1080 (Kwek, Derry et al. 2001).

Разнообразие ковалентных модификаций р53 и многочисленность белковых факторов, влияющих на конформационное состояние р53, отвечает множеству возможностей регулирования этого онкосупрессора клеткой. 6. Воздействия, приводящие к активации р53Любая ионизирующая радиация вызывает повреждения ДНК и приводит к повышению синтеза и функциональной активации р53 и, как следствие, к повышенной экспрессии генов-мишеней р53 (Fei and El-Deiry 2003). Как рентгеновское облучение (Scott, Crocker et al. 2001), так и облучение клеток УФ светом (Hall, МсКее et al. 1993; Ponten, Berne et al. 1995) приводит к остановке их пролиферации за счет накопления и активации р53 и повышения экспрессии p21WAFI.

Белок р53 активируется в ответ на экспрессию онкогенов. Например, аденовирусный онкоген El А активирует р53 засчет стабилизации белка и приводит к апоптозу, а экспрессия онкогена Ras приводит к процессу клеточного старения (Lowe 1999). Экспрессия таких активных клеточных онкогенов, как с-шус и Ras приводит к активации р53 через сигнальный путь, связанный с белком pl9ARF (Palmero, Pantoja et al. 1998; Zindy, Eischen et al. 1998). Экспрессия онкогена Ras стимулирует накопление белка р53 через активацию продукта гена ARF (Lin and Lowe 2001), но, возможно, также через активацию МАР-киназных каскадов (Agarwal, Ramana et al. 2001). В ответ на пролиферативные онкогенные сигналы уровень белка ARF повышается, белок ARF противодействует пк!т2-зависимой деградации р53 (Honda and Yasuda 1999), приводя в результате к процессам остановки клеточного цикла и апоптоза за счет повышения количества р53 в клетке (Sherr and Weber 2000; Sherr 2001).

Специфические сигнальные пути контролируют активацию р53 в ответ на самые различные стрессы. Среди них разнообразные повреждения ДНК (Lakin and Jackson 1999), разрушение тубулинового цитоскелета (Tishler, Lamppu et al. 1995) и актиновых фибрилл (Rubtsova, Kondratov et al. 1998), появление полиплоидных клеток (Di Leonardo, Khan et al. 1997), остановка синтеза РНК (Chernova, Chernov et al. 1995), окислительный стресс (Sandau, Pfeilschifter et al. 1998), тепловой шок (Ohnishi, Wang et al. 1996), осмотический шок (Kishi, Nakagawa et al. 2001), гипоксия (Graeber, Peterson et al. 1994). Кроме того, клетки из различных тканей в ответ на стресс могут использовать разные сигнальные механизмы, приводящие к активации р53.

Экспрессия в клетках NO-синтетазы, результатом которой является синтез NO и повреждения ДНК, приводит к накоплению и активации р53 (Forrester, Ambs et al. 1996). Белок p53 повышает свою функциональную активность в клетках при удалении ростовых факторов из среды (Vousden and Lu 2002), в ответ на воздействие гормонов(Bovenkerk, Lanciloti et al. 2003), повышенное содержание глюкозы в среде (гипергликемию) (Fiordaliso, Lcri et al. 2001). Даже бактериальная инфекция способна вызвать активацию р53 в эпителиальных тканях (Petersson, Borch el al. 2002).

Мы в нашей работе использовали 12 химиотерапевтических веществ, вызвающих клеточные повреждения различной природы и функциональную активацию р53. Их можно разбить на три группы. К агентам, вызывающим пореждения ДНК различными способами относятся: ингибирующис синтез ДНК или РНК доксорубицин, 5-фторурацил, PALA и гидроксимочевина, ингибитор топоизомеразы II этопозид, алкилирующие ДНК агенты EMC. ММС и цисплатина. Ко второй группе относятся агенты, вызывающие повреждения цитоскелета клетки (микротрубочек или актиновых филаментов): таксол, колцемид и цитохалазин D, К третьей группе относится дефероксамин. который формирует комплексы, в основном, с трехвалентными ионами железа и алюминия, способствуя выведению этих ионов из организма.

Почти все агенты используюся в химиотерапии рака и активно изучаются. Они вызывают различные эффекты, связанные с действием антионкогена р53. Например, химиотерапевта чес кие агенты 5-фторурацил и доксорубицин в модели мыши действуют с заметной положительным преимуществом в подавлении опухолей, сохранивших р53 дикого типа, в отличие от цисплатины, которая не проявляет разницы в замедлении роста опухолей с различным статусом р53 (Dart, Picksley et al. 2004). 7. Влияние p53 на клеточный цикл и апоптозРис.1. Схема, демонстрирующая сборку активного циклин-киназного комплекса. Указаны необходимые компоненты и модификации, а также белковые факторы, от которых зависит появление активного циклин-киназного комплекса.

Течение клеточного цикла управляется с помощью регуляции активности комплексов циклин-зависимых киназ (англ. СОК), т.е. регуляции экспрессии циклинов,а также регуляции активности активаторов (англ. САК) и ингибиторов (англ. CKI) циклин-зависимых киназ. Кроме того, оно зависит и от активности киназы Weel и фосфатазы Cdc25, которые навешивают или убирают необходимые фосфатные группы с циклин-зависимых киназ (рис. 1). В течение нескольких десятилетий известно, что в ответ на ионизирующую радиацию клетки различного происхождения останавливаются в Gl, G2 и S фазах клеточного цикла. Задержка пролиферации происходит в основном в переходных Gl и G2 фазах клеточного цикла, называемых сверочными точками клеточного цикла (от англ. checkpoint). В этих точках происходит проверка правильности выполнения клеточных физиологических процессов.

Как известно, для вступления клеток в S фазу клеточного цикла необходима активность белка Мус, а также транскрипционных факторов E2F семейства. В случае фосфорилирования активными комплексами циклин-зависимых киназ белки семейства ретибластомы Rb лишаются связывающей активности и освобождают факторы E2F из своего комплекса. В случае недофосфорилирования циклин-зависимыми киназами белков Rb происходит задержка клеток в фазе Gl клеточного цикла за счет связывания семейством Rb транскрипционных факторов E2F.

Белок р53 активирует экспрессию универсального ингибитора циклин-зависимых киназ — гена WAF1, белковый продукт которого, р21, вызывает задержку клеточной пролиферации через этот сигнальный путь (См. подробнее раздел 4.1.1) (el-Deiry 1998). Возможно также, что р53 взаимодействует непосредственно с САК, снижает ее активность и, таким образом,, вызывает уменьшение фосфорилированных и, соответсвенно, активных форм CDK2 (Schneider, Montenarh et al. 1998). Прямой транскрипционной мишенью р53 является фосфотаза МКР1, которая негативно регулирует МАРК-киназные каскады и способствует задержке клеток в Gl фазе клеточного цикла (Li, Zhou et al. 2003).

Белок p53 повышает свою транскрипционную активность за счет конформационных перестроек (См. раздел 5) в ответ на различные внешние стрессовые воздействия на клетки, а также в ответ на внутренние нарушения клеточной физиологии. Как правило, это приводит к активации экспрессии гена WAF, белок р21 которого приводит к ингибированию циклин-киназных комплексов, белки семейства Rb остаются недофосфорилированными, поэтому они не освобождают транскрипционные факторы E2F. Таким образом, клетки не вступают в S фазу клеточного цикла, происходит задержка пролиферации в фазе Gl.

Кроме влияний, приводящих к конформационным изменениям белковой молекулы, активность р53 сдерживают или стимулируют различные белковые факторы.

Например, ингибиторная субъединица IkBa транскрипционного фактора NF-kB, которая связывает NF-kB и не позволяет ему проникать в ядро клетки для регуляции транскрипции, может также связывать и удерживать в цитоплазме р53 (Zhou, 2003 #270). С одной стороны, эта субъединица удерживает NF-kB, транскрипционная активность которого способствует пролиферации и защищает клетки от апоптоза. С другой стороны, эта субъединица удерживает р53 в цитоплазме, ингибируя функцию р53 включения задержки клеточного цикла и апоптоза. Таким образом IkBa является узлом анипролиферативных и пролиферативных сигналов.

Как известно, клеточный белок mdm2, ген которого также является транскрипционной мишенью р53, связывает р53 и способствует его протеосомной деградации (См. подробнее раздел 4.1.1). Клеточный белок ARF (от англ. alternative reading frame), закодированный в виде альтернативной рамки считывания вместе с ингибитором циклин-зависимых киназ р16 в локусе INK4a, напротив, способен активировать р53 через отмену негативного влияния mdm2 на активность р53 (Honda and Yasuda 1999). Онкосупрессор ARF связывается с mdm2, тем самым, отменяя mdm2-зависимый транспорт р53 из ядра в цитоплазму для деградации на протеосомах. Путь активации р53 через ARF задействуют клеточные онкогены (Palmero, Pantoja et al. 1998; Zindy, Eischen et al. 1998).

У мышей с делецией трех генов - ARF, mdm2 и р53, а также у мышей ARF-/-р53-/- опухоли развиваются примерно с такой же скоростью, как и у р53-/- мышей. Однако спектр опухолей у первых двух типов мышей-мутантов значительно шире. Кроме того, восстановление экспрессии ARF в мышиных фибробластах ARF-/- mdm2-/-р53-/- частично восстанавливает функцию Gl блока (Weber, Jeffers et al. 2000), что свидетельствует в пользу самостоятельного р53-независимого супрессирующего клеточный цикл действия ARF. К настоящему времени собранные наблюдения могут свидетельствовать в пользу того, что онкосупрессирующее действие ARF может задействовать и р53-независимые пути (Eymin, Leduc et al. 2003; Kuo, Duncavage et al. 2003). С другой стороны, одна из последних работ свидетельствует о том, что для осуществления задержки человеческих клеток НСТ116 в фазах Gl и G2 клеточного цикла белку ARF необходимо содействие р53 (Weber, Samuel et al. 2002).

Промоторы генов pl6(INK4a) и pl4(ARF) метилированы в линии костнойостеосаркомы человека U20S, использующейся в нашей работе. В клетках U20S геныRB и р53 дикого типа. Соответственно, экзогенная экспрессия ингибитора циклинзависимых киназ pl6(INK4a), экзогенная экспрессия pl4(ARF) репрессируют ростклеток U20S (Park, Park et al. 2002). Клетки MG63, дефектные по гену р53 и утерявшие52pl6(INK4a)/pl4(ARF) локус, но содержащие ген RB дикого типа, задерживаются при экпрессии pl6(INK4a), но не при экпрессии pl4(ARF). Этот факт говорит в пользу того, что действие ARF происходит через р53-зависимые пути. Экспрессия одного р53 не способна влиять на рост MG63 клеток, однако коэкспрессия pl4(ARF) и р53 увеличивает фракцию GO/Gl-фазных клеток MG63 (Park, Park et al. 2002). В клетках U20S, имеющих функциональный р53, в отличие от клеток Saos2, утерявших гены р53 и RB, процесс апоптоза, вызванный экспрессией белка pl9(ARF), ослабляется дополнительной экспрессией mdm2 (Tsuji, Mizumoto et al. 2002). Данные примеры подтверждают активирующее влияние ARF и ингибирующее влияние mdm2 на р53-зависимые пути задержки клеточной пролиферации и апоптоза.

Много данных накоплено о том, что программа запрограммированной клеточной гибели - апоптоза - включается в клетке в ответ на одновременно действующие противоречивые сигналы. Один биохимический сигнал может стимулировать клетку в пролиферации, а другой, наоборот, сигнализировать к остановке клеточного цикла. Экспрессия Мус препятствует р53-зависимой транскрипции р21, т.к. белковый фактор Mizl способствует посадке Мус на промотор р21 (Seoane, Le et al. 2002). Таким образом, экспрессия Мус должна способствовать освобождению факторов E2F. Например, клетки U20S (p53+/Rb+) имеют дефекты экспрессии ARF/p 16 и при активной экспрессии в них одного белка Мус не подвергаются алоптозу (Santoni-Rugiu, Duro et al. 2002). При попытке восстановления в них биохимически активного ARF-p53 пути в сочетании сывороточного голодания и без него, апоптоз также не наблюдается. Однако массовая гибель таких клеток происходит при экспрессии Мус в кооперации с действием различных факторов, приводящих к ингибированию активности E2F. Такими факторами могут быть экспрессия стабилизированной активной мутантной формы белка Rb (RbDeltacdk), ингибитора циклин-зависимых киназ р16, стабильного ингибитора циклин-зависимых киназ мутанта р27 (р27Т187А), доминантно-негативной формы циклин-зависимой киназы cdk2 (dnDP-1), гиперэкспрессия олигонуклетидов, содержащих сайты связывания для факторов E2F. Факт того, что два подобных противоречивых сигнала - активная экспрессия Мус и ингибирование активности E2F запускают в раковой клетке апоптозную программу, подверждается еще другими данными. Подобный апоптозный процесс наблюдался при экспрессии RbDeltacdk или dnDP-1 в человеческой лейкемийной линии HL-60 (ARF-; р53-), имеющей амплификацию гена Мус, а также при котрансфекции Мус и RbDeltacdk в человеческие клетки остеосаркомы SAOS-2 (ARF+; р53-). Но первичные человеческие фибробласты не подвергались апоптозу при тех же условиях (Santoni-Rugiu, Duro et al. 2002). Повидимому, опухолевые клетки вне зависимости от статуса р53 теряют более мягкие механизмы защиты от противоречивых пролиферативных сигналов и запускают процесс запрограммированной клеточной смерти.

Восстановление экспрессии р53 дикого типа в клетках, утерявших эндогенный р53, может приводить к запуску апоптозной программы, как это происходит в клетках человеческой остеосаркомы SAOS-2 (Thomas, Kalita et al. 1999; Zhang, Labrecque et al. 2001). Возможно, это также отражает дисгармонию активных пролиферативных сигналов, приобретенных такими р53-/- клетками, (клетки SAOS-2, например, дефектны также по гену Rb), с активацией в клетках антипролиферативных сигналов, вызванных экспрессией р53.

Связь р53 с семейством E2F на самом деле более сложная, чем это казалось вначале, когда предполагали, что р53 только ингибирует E2F через сигнальный путь р53—р21—циклин-зависимые киназы—Rb—E2F, вызывая задержку клеточной пролиферации в фазе G1. Гиперэкспрессия E2F1 приводит к запуску апоптоза (Ginsberg 2002), сигнальные пути этого механизма достаточно хорошо изучены. Т.е. с одной стороны, E2F1 стимулирует пролиферацию, с другой стороны - вызывает апоптоз. Возможно, это зависит от наличия противоречия пролиферативных и антипролиферативных сигналов.

С одной стороны, транскрипционный фактор E2F1 в комплексе с DPI стимулирует экспрессию ARF, который через ингибирование клеточного mdm2 препятствует убиквитиновой деградации р53, приводя к активации процесса р53-зависимого апоптоза (Hitchens and Robbins 2003). Кроме того, димер E2F1/DP1 может включать р53-зависимый апоптоз и в отсутствие ARF через увеличение в клетке количества специфичной к р53 ATM киназы, или даже непосредственное связывание с р53. Оба последних события приводят к повышению транскрипционной активности р53 (Hitchens and Robbins 2003). В то же время ARF сам регулирует E2F1 : способствует протеолизу и перемещению E2F1 из нуклеоплазмы в ядрышко, ингибируя при этом E2F1-зависимую транскрипцию. Однако комплекс E2F1/DPI уже не подчиняется регулированию с помощью ARF (Datta, Nag et al. 2002). Возможно, в ответ на повреждения ДНК белок E2F1 накапливается в клетке подобно р53 через отмену связывания с mdm2, т.к. п^т2-связывающий домен E2F1 имеет высокую гомологию с пк!т2-связывающим доменом р53 (Blattner, Sparks et al. 1999). Кроме задействия р53-зависимых путей, E2F1 активирует множество проапоптотических генов: гены семейства bcl-2, апоптозный фактор 1 (англ. Apaf-1), каспазы апоптозного биохимического каскада (Ginsberg 2002). E2F1 приводит к ингибированию клеточныхсигналов выживания, запускаемых транскрипционным фактором NF-кВ, а также приводит к активации р73 и связанного с активацией этого белка апоптоза (Ginsberg 2002).

С другой стороны, было показано в опытах на мышах с делецией гена р53, гена E2F1 или двойной делецией обоих генов, что экспрессия E2F1 супрессирует апоптоз, вызванный УФ излучением в клетках кожи облученных мышей (Wikonkal, Remenyik et al. 2003). При этом р53 действует биохимически выше E2F1 и препятствует супрессии апоптоза, вызванной E2F1. Можно преположить, что р53 действует через белки Rb, которые связывают E2F1.

Таким образом, связанная с р53 регуляция клеточного цикла и апоптоза, устроена посредством; множества биохимических взаимосвязей, часто петлеобразных. По-видимому, большую роль играет внутриклеточный контекст экспрессии генома и функциональность биохимических каскадов в клетке.

Ингибирование факторов семейства E2F, приводящее к задержке клеток в фазе G1 клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК может происходить р53-независимо, например, через активацию р73 и его транскрипционной мишени p21(WAFl) (De Laurenzi and Melino 2000). Возможно, активация клеточного гомолога р53 - белка р73 происходит через сигнальный путь киназа ATM—киназа с-АЫ—р73 (Lee and La ® Thangue 1999). Процесс апоптоза, вызванный экспрессией фактора E2F1 в первичныхмышиных фибробластах (MEF), характеризуется кооперацией между р73 и р53 (Moll, Erster et al. 2001). Это заключили из того, что 77% нормальных MEF уходят в апоптоз в таких условиях, и лишь малая часть (12-15%) р53-/-р73+/+ и р53+/+р73-/- MEF подвергаются апоптозу при тех же условиях.

Собрано множество косвенных данных о том,. что нормальные клетки, не имеющие множества генетических повреждений, обычно реагируют задержкой клеточной пролиферации в ответ на различные неблагоприятные для пролиферации условия. Например, существует так называемая система разрешения репликации, которая заключается в посадке на начальные точки репликации специального Мсш2-7 комплекса в течение позднего митоза и фазы G1, и которая функционирует в нормальных клетках. Эта система функционально блокируется с помощью циклин-зависимых киназ и небольшого белка, называемого геминином, в течение остальных фаз клеточного цикла. При экспрессии нераспадающейся формы этого белка, обычно приводящей к уменьшению связывания Мсш2-7 с хроматином и блокировке клеточной ^ пролиферации, опухолевые клетки U20S (p53+/Rb+) подвергаются остановке в раннейфазе S (Shreeram, Sparks et al. 2002). Клетки Saos2 (p53-/Rb-), также опухолевые,накапливаются в поздней фазе S и фазе G2/M, что согласуется с потерей контрольного механизма внутри фазы S и согласуется с потерей р53-зависимого механизма остановки клеток на границе фазы Gl клеточного цикла. Геминин вызывает апоптоз у обех клеточных линий. Первичные человеческие фибробласты IMR90 (p53+/Rb+), экспрессирующие стабильный геминин, напротив, останавливаются в фазе Gl без проявления апоптозных признаков (Shreeram, Sparks et al. 2002).

Этот пример еще раз говорит в пользу того, что нормальные клетки отвечают преимущественно задержкой клеточной пролиферации в ответ на неблагоприятные биохимические сигналы.

При облучении клеток у-радиацией происходит задержка процесса репликации в S фазе клеточного цикла, в процесс которой вовлечены многие клеточные белки, в том числе киназа ATM. Это позволяет отнести S фазу к сверочной точке клеточного цикла, где действуют молекулярные механизмы проверки и защиты нормального функционирования клеточных процессов, в которые, возможно, вносит свой вклад и р53 (Fei and El-Deiry 2003). Однако величина этого вклада р53 невелика и еще мало понятна (Taylor and Stark 2001).

Долгое время участие р53 в остановке клеток в фазе G2 клеточного цикла оставалось мало определенным. Но на многие стрессовые ситуации, связанные сШ2повреждениями ДНК, как, например, в ответ на у-радиацию, клетки реагируют задержкой в обеих переходных фазах Gl и G2 клеточного цикла. Роль р53 в остановке клеток в фазе Gl клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК была очевидна. Но, например, в ответ на действие химиотерапевтического агента этопозида - ингибитора топоизомеразы II, приводящего к накоплению повреждений ДНК во время репликации, клетки с различным статусом р53 обычно реагируют задержкой в фазе G2 клеточного цикла (Bozko, Larsen et al. 2002). Однако, например, из пяти линий рака толстого кишечника лишь одна с эндогенным р53 дикого типа и одна без функционального р53 подвергались предварительной задержке в фазе G2 клеточного цикла, а затем апоптозу (Arita, Kambe et al. 1997). Остальные раковые клетки приобрели устойчивость к действию этопозида и не проявляли задержки в фазе G2.

Более того, р53 способствует выходу из G2 блока и включению программы апоптоза при определенном внутриклеточном контексте.

Несмотря на вышеизложеное, на сегодняшний день наиболее важными негативными регуляторами G2 блока считают протеинкиназу Chkl, которая активируется с помощью ATM и ATR киназ, и р53 (Tian, Faje et al. 2002). Белок p53 регулирует G2 блок посредством активации своих генов-мишеней (Taylor and Stark 2001): ингибитора циклин-зависимых киназ р21 (слабого по отношению к специфичной к G2 фазе киназе CDK1), гена продукта GADD45, способствующего диссоциации комплекса CDK1 с циклином В1, гена белка 14-З-Зст, удерживающего комплекс CDKl/циклин В1 в цитоплазме. Киназа Chkl реагирует с р53, р21 и 14-З-Зст (Tian, Faje et al. 2002), что коррелирует с фосфорилированным состоянием ее серина 345, происходящим при облучении клеток. Кроме активации генов-мишеней, белок р53 ингибирует CDKl(cdc2) киназу, а также экспрессию генов CDKl(cdc2), циклина В1, и даже гена клеточной топоизомеразы II (Park, Chae et al. 2000; Taylor and Stark 2001). Еще активация трех р53-зависимых генов - reprimo, В99 и meg 10 вносят свой вклад в процесс остановки клеточного цикла в фазе G2 (Taylor and Stark 2001). Белок reprimo, например, влияет на активность cdc2(CDKl) и местонахождение циклина В1 (Ohki, Nemoto et al. 2000). Недавно был обнаружен белок SMAR1, короткая форма которого непосредственно связывается с р53 in vivo, участвует в негативной регуляции в фазе G2 клеточного цикла, способствует задержке роста опухолей, вызывает активацию р53-зависимого репортера, а также активацию гена p21 (Kaul, Mukheijee et al. 2003). Рибонуклеотид-редуктаза-подобный белок p53R2, ген которого содержит р53-зависимый элемент, регулируется р53-зависимо в ответ на повреждения ДНК различной природы, вызывает G2 блок клеточного цикла и участвует в репарации ДНК (Tanaka, Arakawa et al. 2000).

Кофеин снимает G2 задержку клеточного цикла в ответ на этопозид в клетках, где функция р53 инактивирована (Clifford, Beljin et al. 2003). Клиффорд и соавторы показали, что при этом в 3 раза увеличивается число погибших после прохождениямитоза клеток фибросаркомы НТ1080 с блокированной функцией р53, но не число погибших клеток НТ1080 с функциональным р53, (которые используется и в нашей работе). Т.е. выключение р53 в обработанных этопозидом клетках НТ1080 явно способствует потере G2 блока в ответ на кофеин и вхождению клеток в апоптоз. Исследуя возможные механизмы задержки клеток в фазе G2, авторы показали, что в ответ на этопозид фосфорилированный по серину 15 р53 в этих клетках приводит к ингибированию синтеза компонентов прохождения фазы G2 — циклина В1 и киназы CDK1, а также увеличению синтеза ингибитора циклин-зависимых киназ p21 (Clifford, Beljin et al. 2003). Однако задержка клеточной пролиферации в фазе G2, вызванная другим ингибитором топоизомеразы II - мербароном, эффективно снимается действием кофеина вне зависимости от статуса р53 (Clifford, Beljin et al. 2003). Фосфорилированный по серину 15 р53 при этом активирует р21, однако уровень CDK1 не падает.

Возможно, клетки используют два пути задержки в фазе G2. Один связан с активацией р53, фосфорилирование и накопление которого снижает кофеин только в больших концентрациях (Clifford, Beljin et al. 2003). Кофеин в малых дозах блокирует функцию ATM и ATR (Sarkaria, Busby et al. 1999), поэтому другой путь связан с активацией специфичных к повреждениям ДНК киназ — ATM и ATR. Киназы ATM и ATR фосфорилируют протеинкиназы Chkl и Chk2 (Taylor and Stark 2001), которые, в свою очередь, фосфорилируют фосфатазу cdc25, и, в таком случае, последняя удерживается в цитоплазме факторами семейства 14-3-3, комплекс CDK1 остается неактивным и клетки задерживаются в фазе G2. Однако киназы ATM и ATR влияют и на активность р53, фосфорилируя его по серинам 15 и 37 (Banin, Moyal et al. 1998; Khanna, Keating et al. 1998; Tibbetts, Brumbaugh et al. 1999).

Белок 14-3-Зет способствует задержке клеток в сверочной точке G2 клеточного цикла, транспортируя регуляторные комплексы циклин Bl-cdc2 (другое название CDK1) в цитоплазму после повреждений ДНК, ген этого белка содержит консенсус для связывания р53 и является транскрипционной мишенью р53 (Hermeking, Lengauer et al. 1997). Интересно то, что белок 14-З-Зст связывается с р53 и способствует его стабилизации в ответ повреждения ДНК, вызванные доксорубицином. Оказалось, что 14-З-Зст действует подобно белку ARF, препятствуя тс1т2-зависимому экспорту р53 из ядра и убиквитинизации (Yang, Wen et al. 2003). Кроме того, 14-З-Зст усиливает тетрамеризацию молекул р53 и р53-зависимую активацию транскрипции. Таким образом, обнаружена еще одна обратная связь р53 со своим зависимым геном.

Белок р53 негативно регулирует экспрессию cdc2(CDKl) и циклина В1, что приводит к инактивации cdc2 киназы и остановки клеток в фазе G2 клеточного цикла (Park, Chae et al. 2000). В последующей работе та же группа исследователей предложила объяснение подобной репрессии этих генов. Транскрипционный фактор NF-Y, запускающий при прохождении границы G1/S транскрипцию cdc2(CDKl), циклина В1 и других генов, необходимых для прохождения G2 фазы, становится активным за счет фосфорилирования с помощью комплекса циклин-зависимой киназы CDK2. Активность этого комплекса ингибируется через р53-р21 путь, что приводит к ослаблению связывания NF-Y с ДНК, ослаблению экспрессии cdc2, циклина В1 и других генов и, в конечном итоге, задержке клеток в фазе G2 клеточного цикла (Yun, Chae et al. 2003).

Таким образом, р53 через активацию р21 в фазе G1 клеточного цикла опосредованно может влиять на экспрессию 02-фазных генов.

Удаление одного из двух р53-зависимых генов - р21 или 14-З-Зст- значительно увеличивает количество апоптирующих клеток в культуре рака толстого кишечника НСТ116, (которая используется и в нашей работе,) в ответ на обработку повреждающим ДНК агентами доксорубицином (адриамицином), 5-фторурацилом (5-FU), а также в случае экзогенной экспресии р53 дикого типа, но не мутантного (Chan, Hwang et al. 2000). Этот эффект заметно усиливается при двойной делеции этих генов. Обычные клетки НСТ116 останавливаются в обеих фазах G1 и G2 клеточного клеточного цикла в ответ на доксорубицин. Потеря р21 коррелирует с потерей задержки клеток НСТ116 в G1 фазе клеточного цикла и способности поддерживать длительную задержку в фазе G2 клеточного цикла в ответ на доксорубицин. Потеря 14-З-Зст лишает клетки НСТ116 возможности поддерживать стабильную задержку в фазе G2, но клетки эффективно задерживаются в G1 в ответ на доксорубицин, приводящий к повреждениям ДНК. Авторы подтвердили также, что для апоптоза НСТ116 клеток от повреждений ДНК, вызванных 5-FU, необходим р53, т.к. клетки НСТ116 р53-/-подвергались задержке клеточного цикла, а не уходили в алоптоз. Кроме того, клетки НСТ116 с двойной делецией генов р21 и 14-З-Зст практически не давали колоний в присутствии доксорубицина в опытах на определение количества образующихся колоний. Последнее наблюдение говорит в пользу того, что в клетках с наиболее полной потерей контрольных механизмов сверочных точек включается программа апоптоза. Потеря р21 способствует накоплению именно митотических клеток, а не клеток в фазе G2. Белок 14-З-Зст защищает клетки от митотического апоптоза (Chan, Hwang et al. 2000).

Клетки человеческой глиомы подвергаются остановке в фазе G2 клеточного цикла в ответ на воздействие темозоломида - метилирующего ДНК агента - вне зависимости от наличия функционального р53 (Hirose, Berger et al. 2001). Однако только 02-остановка клеток с активированными р53 и р21 была более продолжительна и приводила к процессу репликативного старения. Клетки с инактивированным р53 преодолевали G2 блок и продолжали пролиферировать даже с 8п содержанием ДНК.

Похоже, роль р53 в остановке в фазе G2 клеточного цикла в зависимости от внутриклеточного биохимического контекста заключается в регуляции ее продолжительности, т.е. сводится к решению дальнейшей судьбы клетки.

Итак, после выхода клеток из G1 или G2 блока при неблагоприятном биохимическом контексте в клетках запускается программа апоптоза.

Наконец, интересны биохимические пути, ведущие непосредственно от р53 к включению апоптозной программы, а не к регуляции клеточного цикла.

Амундсон с соавторами, изучавшие индукцию генов в ответ на малые дозы гамма-радиации, разделили гены на две группы. Активация первой группы генов, отвечающих преимущественно за апоптоз, зависела от дозы облучения. К ним относились р53-зависимые гены CDKN1A и GADD45A. Активация второй группы генов, отвечающих за регуляцию клеточного цикла, не зависела от дозы облучения. M Представителем этой группы являлся р53-зависимый mdm2. Кроме того, не меняласьтакже эффективность и длительность остановки клеточного цикла от величины дозы облучения (Amundson, Lee et al. 2003). Это наблюдение хорошо согласуется с тем исследованием силы р53-зависимых промоторов, которое было упомянуто выше, в разделе 4. Киан и соавторы установили, что в системе in vitro в ответ на повреждения ДНК активируются р53-чувствительные элементы из генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и репарации ДНК, из гена mdm2, а также из генов-рецепторов апоптозных путей ("рецепторов CMepra")(Qian, Wang et al. 2002). Но две трети из всех выделенных р53-зависимых элементов, принадлежащих генам, участвующим в регуляции запрограммированной клеточной гибели, не активировались.

Интересным остается вопрос, каким образом клетка, в которой произошла активация р53 дикого типа, делает выбор между остановкой пролиферации и апоптозом. На сегодняшний день этот выбор объясняют, во-первых, силой активации р53, т.е. количеством белка и спецификой конформационных изменений р53 (Fridman and Lowe 2003). Как обсуждалось в разделе 4, сила промоторов р53-зависимых % апоптических генов слабее, чем остальных генов (Zhao, Gish et al. 2000; Qian, Wang etal. 2002; Amundson, Lee et al. 2003). Кроме того, специфика стрессового воздействияможет влиять на перечень активируемых генов (Zhao, Gish et al. 2000), т.е. соответствовать специфике конформационных изменений р53 или специфике сборки ^ полимеразных комплексов с белком р53 на р53-специфичных промоторах (Espinosa,Verdun et al. 2003), и таким образом определять судьбу клетки. Во-вторых, выбор явно зависит от клеточного типа, условий роста и от внутриклеточного контекста экспрессии генов, т.к. экспрессия про- и антиапоптических генов, а также наличие в среде культивирования ростовых факторов и сигнальных молекул может изменять поведение одной и той же клеточной культуры (Fridman and Lowe 2003).

Существует два пути активации запрограммированной клеточной гибели — апоптоза. Первый, называемый внутренним, связан с освобождением цитохрома С и других апоптогенных факторов из митохондрий, приводящих к запуску каспазного сигнального каскада. Второй путь, называемый внешним, связан с активацией так называемых "рецепторов смерти", находящихся на поверхности клетки. Этот путь также приводит к активации каспаз. Белок р53 контролирует оба пути через активацию своих генов-мишеней (Fridman and Lowe 2003). Однако есть исследования, что р53 может запускать апоптоз независимо от активации генов-мишеней. Такая активация апоптоза связана с локализацией р53 в митохондриях (Moll and Zaika 2001).

Внутренний путь активации апоптоза регулируется поредством про- и 74 антиапоптотических факторов bcl-2 семейства, которые отслеживают выход цитохромаС и других белков из митохондрий. Экспрессия ингибитора апоптоза bcl-2 полностью снимает супрессорную апоптозную функцию р53 (Fridman and Lowe 2003). В опытах с трансгенными мышами, экспрессирущими онкоген Мус, показано, что лимфомы, возникающие при повышенной экспрессии bcl-2, развиваются столь же стремительно, как и р53-/- лимфомы (Fridman and Lowe 2003). Белок р53 трансактивирует четыре гена bcl-2 семейства: ген-антагонист bcl-2, называемый Вах (Miyashita and Reed 1995), а также BID (Sax, Fei et al. 2002), NOXA (Oda, Ohki et al. 2000), PUMA (Nakano and Vousden 2001). В ответ на у-радиацию наблюдается тканеспецифичная активация проапоптотических генов-мишеней р53 в тканях облученных мышей (Fei and El-Deiry 2003; Slee, O'Connor et al. 2004): например, PUMA индуцируется преимущественно в белой пульпе селезенки, NOXA в тимусе, BID в поперечной ободочной кишке (Fei and El-Deiry 2003).

Апоптозный фактор 1 (Apaf-1), активирующий протеазы (от англ. apoptosis protease-activating factor 1), который, соединяясь с цитохромом С, выступает % эффектором активации апоптотического каспазного каскада, является прямойтранскрипционной мишенью р53 (Moroni, Hickman et al. 2001; Rozenfeld-Granot,Krishnamurthy et al. 2002). Кроме того, транскрипционный фактор Zac-1 усиливает р53-зависимую трансактивацию Apaf-1, сам являясь транскрипционной мишенью р53 (Rozenfeld-Granot, Krishnamurthy et al. 2002).

Белок p53 непосредственно активирует экспрессию каспазы 6 (Fridman and Lowe 2003), а также некоторых генов, способных вызывать клеточную гибель: ген белка клеточной мемраны PERP (Attardi, Reczek et al. 2000), а также гена PIG3 (Contente, Dittmer et al. 2002). Гены PIGs (от англ. р53 inducible genes) регулируют пояление в клетке активных кислородных радикалов, которые приводят к разрушению митохондрий и запуску запрограммированной клеточной гибели (Polyak, Xia et al. 1997). Белок p53 положительно влияет на метаболизм свободных кислородных радикалов (Fridman and Lowe 2003), что способствует активному апоптозному процессу. Например, ген ферродоксин-редуктазы, которая увеличивает количество свободных кислородных радикалов в клетке, активируется в ответ на обработку 5-фторурацилом только в клетках, содержащих р53. И, взаимообратно, свободные кислородные радикалы способствуют стабилизации р53 (Fridman and Lowe 2003).

Белок р53 транскрипционно активирует ген локализующегося внутри митохондрий апоптозного фактора р53А1Р1 (от англ. p53-regulated Apoptosis-Inducing Protein 1) (Oda, Arakawa et al. 2000), индукция которого зависит от фосфорилированного состояния р53 по серину 46, а также ген белка p53DINPl (от англ. р53-dependent damage-inducible nuclear protein 1) (Okamura, Arakawa et al. 2001), способствующего фосфорилированию р53 по серину 46 и экспрессии фактора р53 AIP1.

К проапототическим р53-зависимым генам относят также такие гены, как IGF-ВРЗ, PAG608, DRAL, Scotin (Slee, O'Connor et al. 2004). Последний способствует запуску апоптоза через биохимический путь, связанный с эндоплазматической сетью.

В индукции апоптоза существенно влияние р53-зависимой трансрепрессии генов (Fridman and Lowe 2003; Slee, O'Connor et al. 2004), например, антиапоптотического гена Вс1-2, гена Survivin, а также Мар4 and stathmin (Murphy, Ahn et al. 1999).

Клеточные гомологи р53 - белки рбЗ и р73 активируются в ответ на повреждения ДНК, гиперэкспрессию E2F1, активацию онкогенов и могут вызывать апоптоз, возможно, частично затрагивая р53-подобные механизмы (Fridman and Lowe 2003). Однако формы р73 и рбЗ, лишенные трансактивационного домена, ингибируют трансактивационные способности транскрипционно активных форм всех членов семейства (Moll, Erster et al. 2001). К примеру, такая трансактивационно неспособная форма р73 ингибирует р53-зависимый апоптоз (Fillippovich, Sorokina et al. 2001). В литературе описано взаимодействие способных к активации транскрипции форм р73 смутантными формами р53, которое приводит в инактивации трансактивационной функции р73 (Moll, Erster et al. 2001). Это явление значительно ослабляет апоптоз, вызванный химиотерапевтическими агентами. Однако подобное взаимодействие таких форм р73 с диким р53 обнаружено не было. Возможно, что такое взаимодействие мутантных форм р53 с р73 является одним из проявлений приобретенных свойств мутантов (явление gain of function). Факторы ASPP1 и ASPP2 (от англ. Apoptotic-Stimulating Proteins of p53) взаимодействуют со всеми членами р53-семейства, усиливая их трансактивационную функцию по отношению к проапоптотическим генам (Samuels-Lev, O'Connor et al. 2001). Факторы ASPP1 и ASPP2 усиливают рбЗ и р73-зависимую транскрипцию генов РЮЗ и PUMA, однако не усиливают транскрипцию mdm2 or p21waf/cipi (Bergamaschi, Samuels et al. 2004). Ингибирование рбЗ и р73 с помощью siRNA показало, что р53-независимый апоптоз, запукаемый ASPP1 и ASPP2, обусловлен биохимическими путями, зависящими от активности именно этих белков р53-семейства (Bergamaschi, Samuels et al. 2004).

Транскрипционный фактор STAT-1 негативно регулирует mdm2, а также непосредственно связывается с р53 и способствует активному апоптозу в ответ на повреждения ДНК в клетках (Townsend, Scarabelli et al. 2004). Транскрипционный фактор Etsl необходим мышиным стволовым эмбриональным клеткам для трансактивации генов-мишеней р53 и включения р53-зависимого апоптоза в ответ на облучение УФ светом (Xu, Wilson et al. 2002).

К включению в клетке внешнего апоптоза приводит связывание "рецепторов смерти" со своими лигандами. Активные TNF-подобные (от англ. Tumor Necrosis Factor) рецепторы запускают активацию каспазного биохимического каскада, который ведет к апоптозному разрушению клетки самой себя. Онкосупрессор р53 может приводить к активации экспрессии таких "рецепторов смерти" как Fas/AP01/CD95 (Muller, Wilder et al. 1998), TRAIL-R (KILLER/DR5) (Takimoto and El-Deiry 2000; Guan, Yue et al. 2001) и гена PIDD (Lin, Ma et al. 2000), белки которых содержат "домен смерти", а также к активации экспрессии Fas-лиганда TNFSF6 (Fridman and Lowe 2003). Активация TRAIL-R (KILLER/DR5) может зависеть и не зависеть от р53, однако р53 активирует экспрессию этого рецептора только в апоптирующих клетках, но не в клетках, подвергающихся задержке клеточного роста (Sheikh, Burns et al. 1998; Wu, Burns et al. 1999). Интересна работа, в которой было показано, что восстановление статуса р53 дикого типа в клетках крупноклеточной карциномы легкого человека IGR-Неи, имеющих мутацию в 132 кодоне эндогенного р53, усиливало процесс лизиса этих клеток цитотоксическими Т лимфоцитами аутологичного (т.е. взятого из того жеорганизма) к ним клона Heul 27 (Thiery, Dorothee et al. 2003). Начальные эксперименты показали, что клетки IGR-Heu резистентны к сигнальным путям апоптоза, действующим через "рецепторы смерти" Fas, TNF и TRAIL, т.е. Т лимфоциты Неи127 осуществляют лизис клеток IGR-Heu только путем экзоцитоза. Восстановление р53 в клетках IGR-Heu достигли заражением их рекомбинантным аденовирусом, несущим ген р53 дикого типа (Adwtp53), что восстановило в них экспрессию только Fas рецептора. Было установлено, что в усиление лизиса клеток IGR-Heu вовлечен, по крайней мере, Fas-опосредованный путь апоптоза этих клеток (Thiery, Dorothee et al. 2003). Таким образом, путем регуляции : апоптоза р53 может регулировать даже клеточный иммунитет. 8. Нарушения функции р53 в опухолях

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Струнина, Светлана Михайловна

Выводы

Созданы самоинактивирующиёся ретровирусные р53-зависимые репортерные конструкции р81Р-СопА-ОРР (с геном зеленого флуоресцентного белка), р81Р-СопА-1ас2 (с геном бактериальной Р-галактозидазы) и конструкция р81Р-СопА-Ьудго (с геном устойчивости к гигромицину), которые обеспечивают эффективное и стандартизированное введение репортерного гена в культуры клеток различного происхождения.

Получена панель крысиных, мышиных и человеческих культур, гомогенно экспрессирующих полученные репортерные конструкции. Репортерная конструкция р81Р-СопА-1ас2 благодаря недолгому времени жизни Р-галактозидазы дает преимущество для исследования кинетики активации р53, конструкция р81Р-СопА-ОРР удобна для визуального обнаружения отдельных клеток с активным р53. Использование репортерных конструкций р81Р-СопА-ОРР и р81Р-СопА-1^го позволяет проводить позитивную селекцию клеток с функционально-активным р53.

Метод определения репортерной Р-галактозидазы в 96-луночном плато дает количественную оценку транскрипционной активности р53, что подтверждено четкой корреляцией между активацией синтеза репортерной Р-галактозидазы, накоплением белка р53 и активацией продукта гена-мишени р53 — белка р21. С использованием конструкции р81Р-СопА-1ас2 проведен сравнительный анализ активации р53 в трех сублиниях карциномы человека НСТ116, экспрессирующих гены шс1ш2 и АИР, влияющие на транскрипционную активность р53, а также в четырех независимых культурах клеток человека, имеющих соединительнотканное происхождение. Продемонстрирована возможность выявления тонких различий в активации р53 в ответ на различные воздействия, что позволяет оценивать функциональное состояние отдельных элементов сигнальных путей активации р53 и получать индивидуальный портрет клеточной культуры по характерным реакциям на обработку стрессовыми агентами. С использованием полученных конструкций в результате скрининга химической библиотеки отобраны соединения, реактивирующие транскрипционно-активный р53 в репортерных культурах человека А431 (эпидермоидной карциномы с мутантным р53) и 8Ша (карциномы шейки матки с инактивированным белком р53). Показано, что реактивированный р53 способен индуцировать р53-зависимые гены и вызывать апоптоз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Струнина С.М., Иванов A.B., Чумаков П.М. "Разработка репортерной системы для тонкой количественной оценки активности белка р53 в культурах клеток" -Молекулярная биология, 2003, том 37, № 6, с. 1007-1018.

2. Моргункова A.A., Алмазов В.П., Струнина С.М., Копнин Б.П., Чумаков П.М. "Доминантно-негативная инактивация р53: влияние количественных соотношений трансдоминантного ингибитора и его мишени" - Молекулярная биология, 2003, том 37, №1, с. 112-120.

3. Струнина С.М. "Сравнительное изучение транскрипционной активности белка р53 в иммортализованных фибробластах". - XL Юбилейная научная конференция МФТИ, Долгопрудный, 28-29 ноября 1997. Тезисы докладов, вып.З, с.84.

4. Струнина С.М., Иванов A.B., Чумаков П.М. "Система, позволяющая изучать трансактивационную функцию антионкогена р53". - Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 28 мая-2 июня 2000. Тезисы, том 2, VIII.28, с.138-139.

5. Струнина С.М. "Измерение функциональной активности онкосупрессора р53: сравнительный портрет активации в человеческих линиях в ответ на обработку химиотерапевтическими агентами" - XVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 9-12 февраля 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с.95.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Струнина, Светлана Михайловна, Москва

1. Adimoolam, S. and J. M. Ford (2002). "p53 and DNA damage-inducible expression of thexeroderma pigmentosum group C gene." Proc Natl Acad Sei U S A 99(20): 12985-90.

2. Adolph, K. W., D. J. Liska, et al. (1997). "Analysis of the promoter and transcription start sites of the human thrombospondin 2 gene (THBS2)." Gene 193(1): 5-11.

3. Agarwal, M. L., C. V. Ramana, et al. (2001). "Regulation of p53 expression by the RAS-MAP kinase pathway." Oncogene 20(20): 2527-36.

4. Akyuz, N., G. S. Boehden, et al. (2002). "DNA substrate dependence of p53-mediated regulation of double-strand break repair." Mol Cell Biol 22(17): 6306-17.

5. Amundson, S. A., R. A. Lee, et al. (2003). "Differential Responses of Stress Genes to Low Dose-Rate gamma Irradiation." Mol Cancer Res 1(6): 445-52.

6. Arita, D., M. Kambe, et al. (1997). "Induction of p53-independent apoptosis associated with G2M arrest following DNA damage in human colon cancer cell lines." Jpn J Cancer Res 88(1): 39-43.

7. Atadja, P., H. Wong, et al. (1995). "Increased activity of p53 in senescing fibroblasts." Proc Natl Acad Sei U S A 92(18): 8348-52.

8. Attardi, L. D., E. E. Reczek, et al. (2000). "PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family." Genes Dev 14(6): 704-18.

9. Avantaggiati, M. L., V. Ogryzko, et al. (1997). "Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways." Cell 89(7): 1175-84.

10. Baker, S. J., A. C. Preisinger, et al. (1990). "p53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis." Cancer Res 50(23): 7717-22.

11. Balagurumoorthy, P., S. M. Lindsay, et al. (2002). "Atomic force microscopy reveals kinks in the p53 response element DNA." Biophvs Chem 101-102: 611-23.

12. Ballal, K., W. Zhang, et al. (2002). "Suppression of mismatched mutation by p53: a mechanism for guarding genomic integrity." J Mol Med 80(1): 25-32.

13. Banin, S., L. Moyal, et al. (1998). "Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage." Science 281(5383): 1674-7.

14. Barak, Y., E. Gottlieb, et al. (1994). "Regulation of mdm2 expression by p53: alternative promoters produce transcripts with nonidentical translation potential." Genes Dev 8(15): 1739-49.

15. Basta, S., S. M. Knoetig, et al. (1999). "Modulation of monocytic cell activity and virussusceptibility during differentiation into macrophages." J Immunol 162(7): 3961-9.

16. Bellamy, W. T. (2002). "Vascular endothelial growth factor as a target opportunity in hematological malignancies." Curr Qpin Oncol 14(6): 649-56.

17. Bergamaschi, D., Y. Samuels, et al. (2004). "ASPP1 and ASPP2: common activators of p53 family members." Mol Cell Biol 24(3): 1341-50.

18. Bergamaschi, D., Y. Samuels, et al. (2003). "iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53 conserved from worm to human." Nat Genet 33(2): 162-7.

19. Beroud, C. and T. Soussi (2003). "The UMD-p53 database: new mutations and analysis tools." Hum Mutat 21(3): 176-81.

20. Bitter, G. A., T. N. Schaeffer, et al. (2002). "Reporter gene regulation in Saccharomycescerevisiae by the human p53 tumor suppressor protein." J Mol Microbiol Biotechnol 4(6): 539-50.

21. Blattner, C., A. Sparks, et al. (1999). "Transcription factor E2F-1 is upregulated in response to DNA damage in a manner analogous to that of p53." Mol Cell Biol 19(5): 3704-13.

22. Blobel, G. A. (2000). "CREB-binding protein and p300: molecular integrators of hematopoietic transcription." Blood 95(3): 745-55.

23. Bottger, V., A. Bottger, et al. (1999). "Comparative study of the p53-mdm2 and p53-MDMX interfaces." Oncogene 18(1): 189-99.

24. Boutell, C. and R. D. Everett (2003). "The herpes simplex virus type 1 (HSV-1) regulatoryprotein ICP0 interacts with and Ubiquitinates p53." J Biol Chem 278(38): 36596-602.

25. Bovenkerk, S., N. Lanciloti, et al. (2003). "Induction of p53 Expression and Function by Estrogen in Osteoblasts." Calcif Tissue Int.

26. Bozko, P., A. K. Larsen, et al. (2002). "Influence of G2 arrest on the cytotoxicity of DNA topoisomerase inhibitors toward human carcinoma cells with different p53 status." Acta Biochim Pol 49(1): 109-19.

27. Brattain, M. G., W. D. Fine, et al. (1981). "Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma." Cancer Res 41(5): 1751-6.

28. Brodsky, M. H., W. Nordstrom, et al. (2000). "Drosophila p53 binds a damage response element at the reaper locus." Cell 101(1): 103-13.

29. Brokx, R. D., E. Bolewska-Pedyczak, et al. (2003). "A stable human p53 heterotetramer based on constructive charge interactions within the tetramerization domain." J Biol Chem 278(4): 2327-32.

30. Buchman, V. L., P. M. Chumakov, et al. (1988). "A variation in the structure of the protein-coding region of the human p53 gene." Gene 70(2): 245-52.

31. Bueso-Ramos, C. E., Y. Yang, et al. (1993). "The human MDM-2 oncogene is overexpressed in leukemias." Blood 82(9): 2617-23.

32. Bureik, M., A. Jungbluth, et al. (1997). "Human p53 restores DNA synthesis control in fission veast." Biol Chem 378(11): 1361-71.

33. Buschmann, T., Y. Lin, et al. (2001). "Stabilization and activation of p53 by the coactivator protein TAFII31." J Biol Chem 276(17): 13852-7.

34. Butler, J. E. and J. T. Kadonaga (2002). "The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression." Genes Dev 16(20): 2583-92.

35. Buzek, J., L. Latonen, et al. (2002). "Redox state of tumor suppressor p53 regulates itssequence-specific DNA binding in DNA-damaged cells by cysteine 277." Nucleic Acids Res 30(11): 2340-8.

36. Chan, T. A., P. M. Hwang, et al. (2000). "Cooperative effects of genes controlling the G(2)/M checkpoint." Genes Dev 14(13): 1584-8.

37. Chang, C. J., D. J. Freeman, et al. (2004). "PTEN Regulates Mdm2 Expression through the PI Promoter." J Biol Chem 279(28): 29841-8.

38. Chang, F., S. Syrjanen, et al. (1993). "Tumourigenesis associated with the p53 tumour suppressor gene." Br J Cancer 68(4): 653-61.

39. Chen, J. Y., W. D. Funk, et al. (1993). "Heterogeneity of transcriptional activity of mutant p53 proteins and p53 DNA target sequences." Oncogene 8(8): 2159-66.

40. Chen, L. and J. Chen (2003). "MDM2-ARF complex regulates p53 sumoylation." Oncogene 22(34): 5348-57.

41. Chene, P. (2003). "Inhibiting the p53-MDM2 interaction: an important target for cancer therapy." Nat Rev Cancer 3(2): 102-9.

42. Cheng, H. L., R: Mostoslavsky, et al. (2003). "Developmental defects and p53hyperacetylation in Sir2 homolog (SIRTl)-deficient mice." Proc Natl Acad Sci USA.

43. Chernova, O. B., M. V. Chernov, et al. (1995). "The role of p53 in regulating genomicstability when DNA and RNA synthesis are inhibited." Trends Biochem Sci 20(10): 431-4.

44. Chiarugi, V., L. Magnelli, et al. (1998). "Cox-2, iNOS and p53 as play-makers of tumor angiogenesis (review)." Int J Mol Med 2(6): 715-9.

45. Cho, Y., S. Gorina, et al. (1994). "Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations." Science 265(5170V. 346-55.

46. Chun, A. C. and D. Y. Jin (2003). "Transcriptional regulation of mitotic checkpoint gene MAD1 by p53." J Biol Chem 278(39): 37439-50.

47. Ciechanover, A. (1994). "The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway." Cell 79(1): 13-21.

48. Clifford, B., M. Beljin, et al. (2003). "G2 arrest in response to topoisomerase II inhibitors: the role of p53." Cancer Res 63(14): 4074-81.

49. Clore, G. M., J. G. Omichinski, et al. (1994). "High-resolution structure of theoligomerization domain of p53 by multidimensional NMR." Science 265(5170): 38691.

50. Contente, A., A. Dittmer, et al. (2002). "A polymoiphic microsatellite that mediates induction ofPIG3 by p53." Nat Genet 30(3): 315-20.

51. Craig, A., M. Scott, et al. (2003). "Allosteric effects mediate CHK2 phosphorylation of the p53 transactivation domain." EMBO Rep 4(8): 787-92.

52. Cummings, M., T. Siitonen, et al. (2002). "p53-mediated downregulation of Chkl abrogates the DNA damage-induced G2M checkpoint in K562 cells, resulting in increased apoptosis." Br J Haematol 116(2): 421-8.

53. Dameron, K. M., O. V. Volpert, et al. (1994). "The p53 tumor suppressor gene inhibitsangiogenesis by stimulating the production of thrombospondin." Cold Spring Harb Svmp Quant Biol 59:483-9.

54. Dart, D. A., S. M. Picksley, et al. (2004). "The role of p53 in the chemotherapeutic responses to cisplatin, doxorubicin and 5-fluorouracil treatment." Int J Oncol 24(1): 115-25.

55. Datta, A., A. Nag, et al. (2002). "Differential regulation of E2F1, DPI, and the E2F1/DP1 complex by ARF." Mol Cell Biol 22(24): 8398-408.

56. Di Leonardo, A., S. H. Khan, et al. (1997). "DNA rereplication in the presence of mitoticspindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function." Cancer Res 57(6V. 1013-9.

57. Dornan, D., H. Shimizu, et al. (2003). "The proline repeat domain of p53 binds directly to the transcriptional coactivator p300 and allosterically controls DNA-dependent acetylation of p53.M Mol Cell Biol 23(23): 8846-61.

58. Dornan, D., H. Shimizu, et al. (2003). "DNA-dependent acetylation of p53 by the transcription coactivator p300." J Biol Chem 278(15): 13431-41.

59. Dosen, A. (1993). "Diagnosis and treatment of psychiatric and behavioural disorders inmentally retarded individuals: the state of the art." J Intellect Disabil Res 37 Suppl 1: 1-7.

60. Espinosa, J. M. and B. M. Emerson (2001). "Transcriptional regulation by p53 throughintrinsic DNA/chromatin binding and site-directed cofactor recruitment." Mol Cell 8(1): 57-69.

61. Espinosa, J. M., R. E. Verdun, et al. (2003). "p53 functions through stress- and promoter-specific recruitment of transcription initiation components before and after DN A damage." Mol Cell 12(4): 1015-27.

62. Eymin, B., C. Leduc, et al. (2003). "pl4ARF induces G2 arrest and apoptosis independently of p53 leading to regression of tumours established in nude mice." Oncogene 22(12): 1822-35.

63. Fakharzadeh, S. S., S. P. Trusko, et al. (1991). "Tumorigenic potential associated withenhanced expression of a gene that is amplified in a mouse tumor cell line." Embo J 10(6): 1565-9.

64. Fang, S., J. P. Jensen, et al. (2000). "Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53." J Biol Chem 275(12): 8945-51.

65. Fei, P. and W. S. El-Deiry (2003). "P53 and radiation responses." Oncogene 22(37): 5774-83.

66. Ferguson, A. T., E. Evron, et al. (2000). "High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer." Proc Natl Acad Sci USA 97(11): 6049-54.

67. Fields, S. and S. K. Jang (1990). "Presence of a potent transcription activating sequence in the p53 protein." Science 249(4972): 1046-9.

68. Fillippovich, I., N. Sorokina, et al. (2001). "Transactivation-deficient p73alphap73Deltaexon2) inhibits apoptosis and competes with p53." Oncogene 20(4): 514-22.

69. Fiordaliso, F., A. Leri, et al. (2001). "Hyperglycemia activates p53 and p53-regulated genes leading to myocyte cell death." Diabetes 50(10): 2363-75.

70. Flaman, J. M., F. Waridel, et al. (1996). "The human tumour suppressor gene p53 is alternatively spliced in normal cells." Oncogene 12(4): 813-8.

71. Fontemaggi, G., I. Kela, et al. (2002). "Identification of direct p73 target genes combining

72. DNA microarray and chromatin immunoprecipitation analyses." J Biol Chem 277(45): 43359-68.

73. Forrester, K., S. Ambs, et al. (1996). "Nitric oxide-induced p53 accumulation and regulation of inducible nitric oxide synthase expression by wild-type p53." Proc Natl Acad Sci U SA 93(6): 2442-7.

74. Fotedar, R., M. Bendjennat, et al. (2004). "Functional Analysis of CDK Inhibitor p21 WAF1." Methods Mol Biol 281: 55-72.

75. Freeman, D. J., A. G. Li, et al. (2003). "PTEN tumor suppressor regulates p53 protein levels and activity through phosphatase-dependent and -independent mechanisms." Cancer Cell 3(2): 117-30.

76. Fridman, J. S. and S. W. Lowe (2003). "Control of apoptosis by p53." Oncogene 22(56): 9030-40.

77. Friedl, F., I. Kimura, et al. (1970). "Studies on a new human cell line (SiHa) derived from carcinoma of uterus. I. Its establishment and morphology." Proc Soc Exp Biol Med 135(2): 543-5.

78. Friedman, P. N., X. Chen, et al. (1993). "The p53 protein is an unusually shaped tetramer that binds directly to DNA." Proc Natl Acad Sci US A 90(8): 3319-23.

79. Fuchs, S. Y., V. Adler, et al. (1998). "MEKK1/JNK signaling stabilizes and activates p53." Proc Natl Acad Sci US A 95(18): 10541-6.

80. Funk, W. D., D. T. Pak, et al. (1992). "A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes." Mol Cell Biol 12(6): 2866-71.

81. Furukawa, Y. (1993). "Tumor suppressor genes and their role in abnormal production of leukocytes (leukemogenesis)." Rinsho Ketsueki 34(5): 572-7.

82. Gao, C., Z. Zou, et al. (2000). "p53-dependent induction of heat shock protein 27 (HSP27) expression." Int J Cancer 88(2): 191-4.

83. Gasco, M., A. K. Bell, et al. (2002). "Epigenetic inactivation of 14-3-3 sigma in oral carcinoma: association with pl6(INK4a) silencing and human papillomavirus negativity." Cancer Res 62(7): 2072-6.

84. Giard, D. J., S. A. Aaronson, et al. (1973). "In vitro cultivation of human tumors:establishment of cell lines derived from a series of solid tumors." J Natl Cancer Inst 51(5): 1417-23.

85. Ginsberg, D. (2002). "E2F1 pathways to apoptosis." FEBS Lett 529(1): 122-5.

86. Gossen, M. and H. Bujard (1992). "Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline- responsive promoters." Proc Natl Acad Sci U S A 89(12): 5547-51.

87. Graeber, T. G., J. F. Peterson, et al. (1994). "Hypoxia induces accumulation of p53 protein, but activation of a Gl-phase checkpoint by low-oxygen conditions is independent of p53 status." Mol Cell Biol 14(9): 6264-77.

88. Grossman, S. R., M. E. Deato, et al. (2003). "Polyubiquitination of p53 by a ubiquitin ligase activity of p300." Science 300(5617): 342-4.

89. Guan, B., P. Yue, et al. (2001). "Evidence that the death receptor DR4 is a DNA damage-inducible, p53-regulated gene." J Cell Physiol 188(1): 98-105.

90. Haapajarvi, T., K. Pitkanen, et al. (1997). "p53 transactivation and protein accumulation are independently regulated by UV light in different phases of the cell cycle." Mol Cell Biol 17(6): 3074-80.

91. Hall, P. A., P. H. McKee, et al. (1993). "High levels of p53 protein in UV-irradiated normal human skin." Oncogene 8(1): 203-7.

92. Harada, J. N., A. Shevchenko, et al. (2002). "Analysis of the adenovirus ElB-55K-anchored proteome reveals its link to ubiquitination machinery." J Virol 76(18): 9194-206.

93. Harper, J. W., G. R. Adami, et al. (1993). "The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin- dependent kinases." Cell 75(4): 805-16.

94. Harvey, D. M. and A. J. Levine (1991). "p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts." Genes Dev 5(12B): 2375-85.

95. Harvey, M., A. T. Sands, et al. (1993). "In vitro growth characteristics of embryo fibroblasts isolated from p53-deficient mice." Oncogene 8(9): 2457-67.

96. Hermeking, H., C. Lengauer, et al. (1997). "14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression." Mol Cell 1(1): 3-11.

97. Hibi, K., B. Trink, et al. (2000). "AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinoma." Proc Natl Acad Sci US A 97(10): 5462-7.

98. Hirose, Y., M. S. Berger, et al. (2001). "p53 effects both the duration of G2/M arrest and the fate of temozolomide-treated human glioblastoma cells." Cancer Res 61(5): 1957-63.

99. Hitchens, M. R. and P. D. Robbins (2003). "The role of the transcription factor DP in apoptosis." Apoptosis 8(5): 461-8.

100. Ho, J. and S. Benchimol (2003). "Transcriptional repression mediated by the p53 tumour suppressor." Cell Death Differ 10(4): 404-8.

101. Hoh, J., S. Jin, et al. (2002). "The p53MH algorithm and its application in detecting p53-responsive genes." Proc Natl Acad Sci U S A 99(13): 8467-72.

102. Honda, R., H. Tanaka, et al. (1997). "Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53." FEBS Lett 420(1): 25-7.

103. Honda, R. and H. Yasuda (1999). "Association of pl9(ARF) with Mdm2 inhibits ubiquitin ligase activity of Mdm2 for tumor suppressor p53." Embo J 18(1): 22-7.

104. Horikoshi, N., A. Usheva, et al. (1995). "Two domains of p53 interact with the TATA-binding protein, and the adenovirus 13S El A protein disrupts the association, relieving p53-mediated transcriptional repression." Mol Cell Biol 15(1): 227-34.

105. Huang, P. (1998). "Excision of mismatched nucleotides from DNA: a potential mechanism for enhancing DNA replication fidelity by the wild-type p53 protein." Oncogene 17(3): 261-70.

106. Huang, S., L. Shu, et al. (2003). "Sustained activation of the JNK cascade and rapamycin-induced apoptosis are suppressed by p53/p21(Cipl)." Mol Cell 11(6): 1491-501.

107. Hupp, T. R. and D. P. Lane (1994). "Allosteric activation of latent p53 tetramers." Curr Biol 4(10): 865-75.1.o, A., Y. Kawaguchi, et al. (2002). "MDM2-HDAC1-mediated deacetylation of p53 is required for its degradation." Embo J 21(22): 6236-45.

108. Jaiswal, A. S. and S. Narayan (2002). "SN2 DNA-alkylating agent-induced phosphorylation of p53 and activation of p21 gene expression." Mutat Res 500(1-2): 17-30.

109. Jin, S., S. Martinek, et al. (2000). "Identification and characterization of a p53 homologue in Drosophila melanogaster." Proc Natl Acad Sci U S A 97(13): 7301-6.

110. Jin, Y., H. Lee, et al. (2003). "MDM2 promotes p21wafl/cipl proteasomal turnover independently of ubiquity lation." EmboJ 22(23): 6365-77.

111. Jones, S. N., A. R. Hancock, et al. (1998). "Overexpression of Mdm2 in mice reveals a p53-independent role for Mdm2 in tumorigenesis." Proc Natl Acad Sci U S A 95(26): 15608-12.

112. Jones, S. N., A. E. Roe, et al. (1995). "Rescue of embryonic lethality in Mdm2-deficient mice by absence of p53." Nature 378(6553): 206-8.

113. Joulia, D., H. Bernardi, et al. (2003). "Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and differentiation by myostatin." Exp Cell Res 286(2): 263-75.

114. Juven, T., Y. Barak, et al. (1993). "Wild type p53 can mediate sequence-specifictransactivation of an internal promoter within the mdm2 gene." Oncogene 8(12): 3411-6.

115. Kaeser, M. D. and R. D. Iggo (2002). "Chromatin immunoprecipitation analysis fails tosupport the latency model for regulation of p53 DNA binding activity in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A 99(1): 95-100.

116. Kamb, A., N. A. Gruis, et al. (1994). "A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types." Science 264(5157): 436-40.

117. Kastan, M. B. and G. P. Zambetti (2003). "Parc-ing p53 in the cytoplasm." Cell 112(1): 1-2.

118. Kaul, R., S. Mukheijee, et al. (2003). "Direct interaction with and activation of p53 by

119. SMAR1 retards cell- cycle progression at G2/M phase and delays tumor growth in mice." Int J Cancer 103(5): 606-15.

120. Keller, D. M., X. Zeng, et al. (2001). "A DNA damage-induced p53 serine 392 kinase complex contains CK2, hSptl6, and SSRP1." Mol Cell 7(2): 283-92.

121. Kern, S. E., K. W. Kinzler, et al. (1991). "Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein." Science 252(5013): 1708-11.

122. Kern, S. E., J. A. Pietenpol, et al. (1992). "Oncogenic forms of p53 inhibit p53-regulated gene expression." Science 256(5058): 827-30.

123. Khanna, K. K., K. E. Keating, et al. (1998). "ATM associates with and phosphorylates p53: mapping the region of interaction." Nat Genet 20(4): 398-400.

124. Kim, E., W. Gunther, et al. (2003). "Tumor suppressor p53 inhibits transcriptional activation of invasion gene thromboxane synthase mediated by the proto-oncogenic factor ets-1." Oncogene 22(49): 7716-27.

125. Kim, E. J., J. S. Park, et al. (2002). "Identification and characterization of HIPK2 interacting with p73 and modulating functions of the p53 family in vivo." J Biol Chem 277(35): 32020-8.

126. Kishi, H., K. Nakagawa, et al. (2001). "Osmotic shock induces G1 arrest through p53phosphorylation at Ser33 by activated p38MAPK without phosphorylation at Serl5 and Ser20." J Biol Chem 276(42): 39115-22.

127. Komarova, E. A., M. V. Chernov, et al. (1997). "Transgenic mice with p53-responsive lacZ: p53 activity varies dramatically during normal development and determines radiation and drug sensitivity in vivo." Embo J 16(6): 1391-400.

128. Kondratov, R. V., N. V. Kuznetsov, et al. (1996). "Functional heterogeneity of p53-responsive elements." Mol Biol (Mösle) 30(3): 613-20.

129. Konikova, E. and J. Kusenda (2003). "Altered expression of p53 and MDM2 proteins in hematological malignancies." Neoplasma 50(1): 31-40.

130. Konishi, N., M. Nakamura, et al. (2002). "DNA hypermethylation status of multiple genes in prostate adenocarcinomas." Jpn J Cancer Res 93(7): 767-73.

131. Konishi, N., M. Nakamura, et al. (2002). "Heterogeneous methylation and deletion patterns of the INK4a/ARF locus within prostate carcinomas." Am J Pathol 160(4): 1207-14.

132. Koutsodontis, G., I. Tentes, et al. (2001). "Spl plays a critical role in the transcriptionalactivation of the human cyclin-dependent kinase inhibitor p21(WAFl/Cipl) gene by the p53 tumor suppressor protein." J Biol Chem 276(31): 29116-25.

133. Krimpenfort, P., K. C. Quon, et al. (2001). "Loss of pl6Ink4a confers susceptibility to metastatic melanoma in mice." Nature 413(6851): 83-6.

134. Kritchevsky, D. and B. V. Howard (1966). "The lipids of human diploid cell strain WI-38." Ann Med Exp Biol Fenn 44(2): 343-7.

135. Kumari, A., N. Schultz, et al. (2004). "p53 protects from replication-associated DNA doublestrand breaks in mammalian cells." Oncogene 23(13): 2324-9.

136. Kuo, M. L., E. J. Duncavage, et al. (2003)."Arf induces p53-dependent and -independent antiproliferative genes." Cancer Res 63(5): 1046-53.

137. MacLachlan, T. K., R. Takimoto, et al. (2002). "BRCAl directs a selective p53-dependenttranscriptional response towards growth arrest and DNA repair targets." Mol Cell Biol 22(12): 4280-92.

138. Matlashewski, G., D. Pim, et al. (1987). "Alternative splicing of human p53 transcripts." Oncogene Res 1(1): 77-85.

139. Matsumura, F., J. J. Lin, et al. (1983). "Differential expression of tropomyosin forms in the microfilaments isolated from normal and transformed rat cultured cells." J Biol Chem 258(22): 13954-64.

140. May, P. and E. May (1999). "Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein." Oncogene 18(53): 7621-36.

141. Maya, R., M. Balass, et al. (2001). "ATM-dependent phosphorylation of Mdm2 on serine 395: role in p53 activation by DNA damage." Genes Dev 15(9): 1067-77.

142. Mayo, L. D., J. E. Dixon, et al. (2002). "PTEN protects p53 from Mdm2 and sensitizes cancer cells to chemotherapy." J Biol Chem 277(7): 5484-9.

143. Mayo, L. D., J. J. Turchi, et al. (1997). "Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein. kinase prevents interaction with p53." Cancer Res 57(22): 5013-6.

144. McCoy, M. A., J. J. Gesell, et al. (2003). "Flexible lid to the p53-binding domain of human Mdm2: implications for p53 regulation." Proc Natl Acad Sci U S A 100(4): 1645-8.

145. McDonald, E. R., 3rd, G. S. Wu, et al. (1996). "Repair Defect in p21 WAF1/CIP1 -/- human cancer cells." Cancer Res 56(10): 2250-5.

146. McKenzie, P. P., M. K. Danks, et al. (2003). "P21 Wafl/Cipl dysfunction in neuroblastoma: a novel mechanism of attenuating G0-G1 cell cycle arrest." Cancer Res 63(13): 3840-4.

147. Melchior, F. and L. Hengst (2002). "SUMO-1 and p53." Cell Cycle 1(4): 245-9.

148. Melle, C. and H. P. Nasheuer (2002). "Physical and functional interactions of the tumor suppressor protein p53 and DNA polymerase alpha-primase." Nucleic Acids Res 30(7): 1493-9.

149. Middeler, G., K. Zerf, et al. (1997). "The tumor suppressor p53 is subject to both nuclear import and export, and both are fast, energy-dependent and lectin-inhibited." Oncogene 14(12): 1407-17.

150. Miller, A. D. and G. J. Rosman (1989). "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression." Biotechniques 7(9): 980-2,984-6,989-90.

151. Milner, J. and E. A. Medcalf (1991). "Cotranslation of activated mutant p53 with wild type drives the wild-type p53 protein into the mutant conformation." Cell 65(5): 765-74.

152. Mitsudomi, T., S. M. Steinberg, et al. (1992). "p53 gene mutations in non-small-cell lung cancer cell lines and their correlation with the presence of ras mutations and clinical features." Oncogene 7(1): 171-80.

153. Miyashita, T. and J. C. Reed (1995). "Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene." Cell 80(2): 293-9.

154. Moll, U. M., E. Chalas, et al. (1996). "Uterine papillary serous carcinoma evolves via a p53-driven pathway." Hum Pathol 27(12): 1295-300.

155. Moll, U. M., S. Erster, et al. (2001). "p53, p63 and p73—solos, alliances and feuds among family members." Biochim Biophys Acta 1552(2): 47-59.

156. Moll, U. M. and A. Zaika (2001). "Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53." FEBS Lett 493(2-3): 65-9.

157. Momand, J., D. Jung, et al. (1998). "The MDM2 gene amplification database." Nucleic Acids Res 26(15): 3453-9.

158. Momand, J., G. P. Zambetti, et al. (1992). "The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation." Cell 69(7): 1237-45.

159. Montes de Oca Luna, R., D. S. Wagner, et al. (1995). "Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53." Nature 378(6553): 203-6.

160. Monti, P., P. Campomenosi, et al. (2003). "Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay." Oncogene 22(34): 5252-60.

161. Moore, L., S. Venkatachalam, et al. (2003). "Cooperativity of pl9ARF, Mdm2, and p53 in murine tumorigenesis." Oncogene 22(49): 7831-7.

162. Mori, S., G. Ito, et al. (2004). "p53 apoptotic pathway molecules are frequently andsimultaneously altered in nonsmall cell lung carcinoma." Cancer 100(8): 1673-82.

163. Moroni, M. C., E. S. Hickman, et al. (2001). "Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53." Nat Cell Biol 3(6): 552-8.

164. Morris, G. F., J. R. Bischoff, et al. (1996). "Transcriptional activation of the humanproliferating-cell nuclear antigen promoter by p53." Proc Natl Acad Sci U S A 93(2): 895-9.

165. Muller, M., S. Wilder, et al. (1998). "p53 activates the CD95 (APO-l/Fas) gene in response to DNA damage by anticancer drugs." J Exp Med 188(11): 2033-45.

166. Murphy, M., J. Ahn, et al. (1999). "Transcriptional repression by wild-type p53 utilizeshistone deacetylases, mediated by interaction with mSin3a." Genes Dev 13(19): 2490501.

167. Nakano, K., E. Balint, et al. (2000). "A ribonucleotide reductase gene is a transcriptional target of p53 and p73." Oncogene 19(37): 4283-9.

168. Nakano, K. and K. H. Vousden (2001). "PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53." Mol Cell 7(3): 683-94.

169. Ng, C. C., H. Arakawa, et al. (2003). "p53RFP, a p53-inducible RING-finger protein, regulates the stability of p21 WAFl." Oncogene 22(28): 4449-58.

170. Nishimori, H., T. Shiratsuchi, et al. (1997). "A novel brain-specific p53-target gene, BAI1, containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis." Oncogene 15(18): 2145-50.

171. O'Connell, M. J., C. G. Moertel, et al. (1984). "Clinical trial of sequential N-phosphonacetyl-L-aspartate, thymidine, and 5-fluorouracil in advanced colorectal carcinoma." J Clin Oncol 2(10): 1133-8.

172. Oda, E., R. Ohki, et al. (2000). "Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis." Science 288(5468): 1053-8.

173. Oda, K., H. Arakawa, et al. (2000). "p53AIPl, a potential mediator of p53-dependentapoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53." Cell 102(6): 849-62.

174. Ogryzko, V. V., P. Wong, et al. (1997). "WAFl retards S-phase progression primarily by inhibition of cyclin-dependent kinases." Mol Cell Biol 17(8): 4877-82.

175. Ohki, R., J. Nemoto, et al. (2000). "Reprimo, a new candidate mediator of the p53-mediated cell cycle arrest at the G2 phase." J Biol Chem 275(30): 22627-30.

176. Ohnishi, T., X. Wang, et al. (1996). "p53-dependent induction of WAFl by heat treatment in human glioblastoma cells." J Biol Chem 271(24): 14510-3.

177. Okamoto, K. and D. Beach (1994). "Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein." Embo J 13(20): 4816-22.

178. Okamura, S., H. Arakawa, et al. (2001). "p53DINPl, ap53-inducible gene, regulates p53-dependent apoptosis." Mol Cell 8(1): 85-94.

179. Ollmann, M., L. M. Young, et al. (2000). "Drosophila p53 is a structural and functional homolog of the tumor suppressor p53." Cell 101(1): 91-101.

180. Olson, D. C., V. Marechal, et al. (1993). "Identification and characterization of multiple mdm-2 proteins and mdm- 2-p53 protein complexes." Oncogene 8(9): 2353-60.

181. O'Rourke, R. W., C. W. Miller, et al. (1990). "A potential transcriptional activation element in the p53 protein." Oncogene 5(12): 1829-32.

182. Ouchi, T., A. N. Monteiro, et al. (1998). "BRCA1 regulates p53-dependent gene expression." Proc Natl Acad Sei U S A 95(5): 2302-6.

183. Palmero, I., C. Pantoja, et al. (1998). "pl9ARF links the tumour suppressor p53 to Ras." Nature 395(6698): 125-6.

184. Park, D. J., A. M. Chumakov, et al. (1996). "p53 transactivation through various p53-responsive elements." Mol Carcinog 16(2): 101-8.

185. Park, M., H. D. Chae, et al. (2000). "Constitutive activation of cyclin B1-associated cdc2 kinase overrides p53-mediated G2-M arrest." Cancer Res 60(3): 542-5.

186. Park, Y. B., M. J. Park, et al. (2002). "Alterations in the INK4a/ARF locus and their effects on the growth of human osteosarcoma cell lines." Cancer Genet Cvtogenet 133(2): 10511.

187. Passalaris, T. M., J. A. Benanti, et al. (1999). "The G(2) checkpoint is maintained by redundant pathways." Mol Cell Biol 19(9): 5872-81.

188. Pavlova, S., J. Mayer, et al. (2003). "High frequency of temperature-sensitive mutations of p53 tumor suppressor in acute myeloid leukemia revealed by functional assay in yeast." Int J Oncol 23(1): 121-31.

189. Pesch, J., U. Brehm, et al. (1996). "Repression of interleukin-2 and interleukin-4 promoters by tumor suppressor protein p53." J Interferon Cytokine Res 16(8): 595-600.

190. Petersson, F., K. Borch, et al. (2002). "Gastric epithelial proliferation and p53 and p21expression in a general population sample: relations to age, sex, and mucosal changes associated with H. pylori infection." Dig Pis Sei 47(7): 1558-66.

191. Pietenpol, J. A., T. Tokino, et al. (1994). "Sequence-specific transcriptional activation isessential for growth suppression by p53." Proc Natl Acad Sei U S A 91(6): 1998-2002.

192. Pogribny, I. P. and S. J. James (2002). "Reduction of p53 gene expression in human primary hepatocellular carcinoma is associated with promoter region methylation without coding region mutation." Cancer Lett 176(2): 169-74.

193. Polyak, K., Y. Xia, et al. (1997). "A model for p53-induced apoptosis." Nature 389(6648): 300-5.

194. Ponten, F., B. Berne, et al. (1995). "Ultraviolet light induces expression of p53 and p21 inhuman skin: effect of sunscreen and constitutive p21 expression in skin appendages." J Invest Dermatol 105(3): 402-6.

195. Ponten, J. and E. Saksela (1967). "Two established in vitro cell lines from human mesenchymal tumours." Int J Cancer 2(5): 434-47.

196. Poyurovsky, M. V., X. Jacq, et al. (2003). "Nucleotide binding by the Mdm2 RING domain facilitates Arf-independent Mdm2 nucleolar localization." Mol Cell 12(4): 875-87.

197. Pugacheva, E. N., A. V. Ivanov, et al. (2002). "Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of the dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil." Oncogene 21(30): 4595-600.

198. Qian, H., T. Wang, et al. (2002). "Groups of p53 target genes involved in specific p53downstream effects cluster into different classes of DNA binding sites." Oncogene 21(51): 7901-11.

199. Querido, E., R. C. Marcellus, et al. (1997). "Regulation of p53 levels by the E1B 55kilodalton protein and E4orf6 in adenovirus-infected cells." J Virol 71(5): 3788-98.

200. Raman, V., S. A. Martensen, et al. (2000). "Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours." Nature 405(6789): 974-8.

201. Rasheed, S., W. A. Nelson-Rees, et al. (1974). "Characterization of a newly derived human sarcoma cell line (HT-1080)." Cancer 33(4): 1027-33.

202. Reifenberger, G., L. Liu, et al. (1993). "Amplification and overexpression of the MDM2 gene in a subset of human malignant gliomas without p53 mutations." Cancer Res 53(12): 2736-9.

203. Renzing, J. and D. P. Lane (1995). "p53-dependent growth arrest following calciumphosphate-mediated transfection of murine fibroblasts." Oncogene 10(9): 1865-8.

204. Roman-Gomez, J., J. A. Castillejo, et al. (2002). "5' CpG island hypermethylation isassociated with transcriptional silencing of the p21(CIPl/WAFl/SDIl) gene and confers poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia." Blood 99(7): 2291-6.

205. Rozenfeld-Granot, G., J. Krishnamurthy, et al. (2002). "A positive feedback mechanism in the transcriptional activation of Apaf-1 by p53 and the coactivator Zac-1." Oncogene 21(10): 1469-76.

206. Rubtsova, S. N., R. V. Kondratov, et al. (1998). "Disruption of actin microfilaments by cytochalasin D leads to activation of p53." FEBS Lett 430(3): 353-7.

207. Sablina, A. A., L. S. Agapova, et al. (1999). "p53 does not control the spindle assembly cell cycle checkpoint but mediates Gl arrest in response to disruption of microtubule system." Cell Biol Int 23(5): 323-34.

208. Sablina, A. A., P. M. Chumakov, et al. (2003). "Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration." J Biol Chem 278(30): 27362-71.

209. Sakaguchi, K., J. E. Herrera, et al. (1998). "DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade." Genes Dev 12(18): 2831-41.

210. Sakaguchi, K., S. Saito, et al. (2000). "Damage-mediated phosphorylation of human p53threonine 18 through a cascade mediated by a casein 1-like kinase. Effect on Mdm2 binding." J Biol Chem 275(13): 9278-83.

211. Sakaguchi, K., H. Sakamoto, et al. (1997). "Effect of phosphorylation on tetramerization of the tumor suppressor protein p53." J Protein Chem 16(5): 553-6.

212. Sakamuro, D., P. Sabbatini, et al. (1997). "The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest." Oncogene 15(8): 887-98.

213. Salimath, B., D. Marme, et al. (2000). "Expression of the vascular endothelial growth factor gene is inhibited by p73." Oncogene 19(31): 3470-6.

214. Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

215. Samuels-Lev, Y., D. J. O'Connor, et al. (2001). "ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53." Mol Cell 8(4): 781-94.

216. Sandau, K., J. Pfeilschifter, et al. (1998). "Nitrosative and oxidative stress induced heme oxygenase-1 accumulation in rat mesangial cells." Eur J Pharmacol 342(1): 77-84.

217. Santoni-Rugiu, E., D. Duro, et al. (2002). "E2F activity is essential for survival of Myc-overexpressing human cancer cells." Oncogene 21(42): 6498-509.

218. Sarkaria, J. N., E. C. Busby, et al. (1999). "Inhibition of ATM and ATR kinase activities by the radiosensitizing agent, caffeine." Cancer Res 59(17): 4375-82.

219. Sax, J. K., P. Fei, et al. (2002). "BID regulation by p53 contributes to chemosensitivity." Nat Cell Biol 4(11): 842-9.

220. Scheffner, M., J. M. Huibregtse, et al. (1993). "The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53." Cell 75(3): 495-505.

221. Schneider, E., M. Montenarh, et al. (1998). "Regulation of CAK kinase activity by p53." Oncogene 17(21): 2733-41.

222. Schon, O., A. Friedler, et al. (2002). "Molecular mechanism of the interaction between MDM2 and P53." J Mol Biol 323(3): 491-501.

223. Schumacher, B., K. Hofmann, et al. (2001). "The C. elegans homolog of the p53 tumorsuppressor is required for DNA damage-induced apoptosis." Curr Biol 11(21): 1722-7.

224. Scolnick, D. M., N. H. Chehab, et al. (1997). "CREB-binding protein and p300/CBPassociated factor are transcriptional coactivators of the p53 tumor suppressor protein." m Cancer Res 57(171: 3693-6.

225. Scott, N. A., I. R. Crocker, et al. (2001). "Inhibition of vascular cell growth by X-rayirradiation: comparison with gamma radiation and mechanism of action." Int J Radiat Oncol Biol Phvs 50(2): 485-93.

226. Seoane, J., H. V. Le, et al. (2002). "Myc suppression of the p21(Cipl) Cdk inhibitorinfluences the outcome of the p53 response to DNA damage." Nature 419(6908): 72934.

227. Shan, B., J. Xu, et al. (2003). "Induction of p53-dependent activation of the humanproliferating cell nuclear antigen gene in chromatin by ionizing radiation." J Biol Chem 278(45): 44009-17.

228. Sharpless, N. E., N. Bardeesy, et al. (2001). "Loss of pl6Ink4a with retention of pl9Arf predisposes mice to tumorigenesis." Nature 413(6851): 86-91.

229. Shaw, P., J. Freeman, et al. (1996). "Regulation of specific DNA binding by p53: evidence for a role for O-glycosylation and charged residues at the carboxy-terminus." Oncogene 12(4): 921-30.

230. Sheikh, M. S., T. F. Burns, et al. (1998). "p53-dependent and -independent regulation of the ■ death receptor KILLER/DR5 gene expression in response to genotoxic stress andtumor necrosis factor alpha." Cancer Res 58(8): 1593-8.

231. Sherr, C. J. (1998). "Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway." Genes Dev 12(19): 2984-91.

232. Sherr, C. J. (2001). "The INK4a/ARF network in tumour suppression." Nat Rev Mol Cell Biol 2(10): 731-7.

233. Sherr, C. J. and J. D. Weber (2000). "The ARF/p53 pathway." Curr Qpin Genet Dev 10(1): 94-9.

234. Shieh, S. Y., M. Ikeda, et al. (1997). "DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2." Cell 91(3): 325-34.

235. Shikama, N. C. W. Lee, et al. (1999). "A novel cofactor for p300 that regulates the p53 response." Mol Cell 4(3): 365-76.

236. Shimizu, H. and T. R. Hupp (2003). "Intrasteric regulation of MDM2." Trends Biochem Sci 28(7): 346-9.

237. Shinozaki, T., A. Nota, et al. (2003). "Functional role of Mdm2 phosphorylation by ATR in attenuation of p53 nuclear export." Oncogene 22(55): 8870-80.

238. Shreeram, S., A. Sparks, et al. (2002). "Cell type-specific responses of human cells to inhibition of replication licensing." Oncogene 21(43): 6624-32.

239. Skalski, V., Z. Y. Lin, et al. (2000). "Substrate specificity of the p53-associated 3-5* exonuclease." Oncogene 19(29): 3321-9.

240. Skladanowski, A. and A. K. Larsen (1997). "Expression of wild-type p53 increases etoposide cytotoxicity in Ml myeloid leukemia cells by facilitated G2 to M transition: implications for gene therapy." Cancer Res 57(5): 818-23.

241. Slee, E. A., D. J. O'Connor, et al. (2004). "To die or not to die: how does p53 decide?" Oncogene 23(16): 2809-18.

242. Soussi, T. (2000). "The p53 tumor suppressor gene: from molecular biology to clinical investigation." Ann N Y Acad Sci 910: 121-37; discussion 137-9.

243. Soussi, T., C. Caron de Fromentel, et al. (1990). "Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution." Oncogene 5(7): 945-52.

244. Stein, T., D. Crighton, et al. (2002). "Several regions of p53 are involved in repression of RNA polymerase III transcription." Oncogene 21(36): 5540-7.

245. Stenger, J. E., P. Tegtmeyer, et al. (1994). "p53 oligomerization and DNA looping are linked with transcriptional activation." Embo J 13(24): 6011-20.

246. Stivala, L. A., F. Riva, et al. (2001). "p21(wafl/cipl)-null human fibroblasts are deficient in nucleotide excision repair downstream the recruitment of PCNA to DNA repair sites." Oncogene 20(5): 563-70.

247. Stommel, J. M., N. D. Marchenko, et al. (1999). "A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking." Embo J 18(6): 1660-72.

248. Sun, X. Z., C. Vinci, et al. (2003). "Formation of disulfide bond in p53 correlates withinhibition of DNA binding and tetramerization." Antioxid Redox Signal 5(5): 655-65.

249. Sun, Y., X. R. Zeng, et al. (2004). "P53 down-regulates matrix metalloproteinase-1 bytargeting the communications between AP-1 and the basal transcription complex." J Cell Biochem 92(2): 258-69.

250. Suzuki, H., F. Itoh, et al. (2000). "Inactivation of the 14-3-3 sigma gene is associated with 5' CpG island hypermethylation in human cancers." Cancer Res 60(16): 4353-7.

251. Takimoto, R. and W. S. EI-Deiry (2000). "Wild-type p53 transactivates the KILLER/DR5 gene through an intronic sequence-specific DNA-binding site." Oncogene 19(14): 1735-43.

252. Takimoto, R., T. K. MacLachlan, et al. (2002). "BRCA1 transcriptionally regulates damaged DNA binding protein (DDB2) in the DNA repair response following UV-irradiation." Cancer Biol Ther 1(2): 177-86.

253. Tanaka, H., H. Arakawa, et al. (2000). "A ribonucleotide reductase gene involved in a p53-dependent cell-cycle checkpoint for DNA damage." Nature 404(6773): 42-9.

254. Taylor, W. R. and G. R. Stark (2001). "Regulation of the G2/M transition by p53." Oncogene 20(15): 1803-15.

255. Terui, T., K. Murakami, et al. (2003). "Induction of PIG3 and NOXA through acetylation of p53 at 320 and 373 lysine residues as a mechanism for apoptotic cell death by histone deacetylase inhibitors." Cancer Res 63(24): 8948-54.

256. Thiery, J., G. Dorothee, et al. (2003). "Potentiation of a tumor cell susceptibility to autologous CTL killing by restoration of wild-type p53 function." J Immunol 170(12): 5919-26.

257. Thomas, M., A. Kalita, et al. (1999). "Two polymorphic variants of wild-type p53 differ biochemically and biologically." Mol Cell Biol 19(2): 1092-100.

258. Thut, C. J., J. L. Chen, et al. (1995). "p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60." Science 267(5194): 100-4.

259. Thut, C. J., J. A. Goodrich, et al. (1997). "Repression of p53-mediated transcription by MDM2: a dual mechanism." Genes Dev 11(15): 1974-86.

260. Tian, H., A. T. Faje, et al. (2002). "Radiation-induced phosphorylation of Chkl at S345 is associated with p53-dependent cell cycle arrest pathways." Neoplasia 4(2): 171-80.

261. Tibbetts, R. S., K. M. Brumbaugh, et al. (1999). "A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53." Genes Dev 13(2): 152-7.

262. Tiemann, F. and W. Deppert (1994). "Stabilization of the tumor suppressor p53 duringcellular transformation by simian virus 40: influence of viral and cellular factors and biological consequences." J Virol 68(5): 2869-78.

263. Tishler, R. B., D. M. Lamppu, et al. (1995). "Microtubule-active drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53." Cancer Res 55(24): 6021-5.

264. Townsend, P. A., T. M. Scarabelli, et al. (2004). "STAT-l interacts with p53 to enhance DNA damage-induced apoptosis." J Biol Chem 279(7): 5811-20.

265. Tsuji, K., K. Mizumoto, et al. (2002). "p53-independent apoptosis is induced by the pl9ARF tumor suppressor." Biochem Biophys Res Commun 295(3): 621-9.

266. Uesugi, M. and G. L. Verdine (1999). "The alpha-helical FXXPhiPhi motif in p53: TAFinteraction and discrimination by MDM2." Proc Natl Acad Sci U S A 96(26): 148016.

267. Unger, T., J. A. Mietz, et al. (1993). "Functional domains of wild-type and mutant p53 proteins involved in transcriptional regulation, transdominant inhibition, and transformation suppression." Mol Cell Biol 13(9): 5186-94.

268. Violette, S., L. Poulain, et al. (2002). "Resistance of colon cancer cells to long-term 5-fluorouracil exposure is correlated to the relative level of Bcl-2 and Bcl-X(L) in addition to Bax and p53 status." Int J Cancer 98(4): 498-504.

269. Vousden, K. H. and X. Lu (2002). "Live or let die: the cell's response to p53." Nat Rev Cancer 2(8): 594-604.

270. Waga, S., G. J. Hannon, et al. (1994). "The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA." Nature 369(6481): 574-8.

271. Walker, K. K. and A. J. Levine (1996). "Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression." Proc Natl Acad Sci U S A 93(26): 15335-40.

272. Wang, L. G., X. M. Liu, et al. (1999). "The effect of antimicrotubule agents on signaltransduction pathways of apoptosis: a review." Cancer Chemother Pharmacol 44(5): 355-61.

273. Wang, X. Q., W. M. Ongkeko, et al. (2001). "A possible role of p73 on the modulation of p53 level through MDM2." Cancer Res 61(4): 1598-603.

274. Weber, H. O., T. Samuel, et al. (2002). "Human pl4(ARF)-mediated cell cycle arrest strictly depends on intact p53 signaling pathways." Oncogene 21(20): 3207-12.

275. Weber, J. D., JR. Jeffers, et al. (2000). "p53-independent functions of the pl9(ARF) tumor suppressor." Genes Dev 14(18): 2358-65.

276. Weidman, M. K., R. Sharma, et al. (2003). "The interaction of cytoplasmic RNA viruses with the nucleus." Virus Res 95(1-2): 75-85.

277. Wikonkal, N. M., E. Remenyik, et al. (2003). "Inactivating E2fl reverts apoptosis resistance and cancer sensitivity in Trp53-deficient mice." Nat Cell Biol.

278. Wu, G. S., T. F. Burns, et al. (1999). "Induction of the TRAIL receptor KILLER/DR5 in p53-dependent apoptosis but not growth arrest." Oncogene 18(47): 6411-8.

279. Wu, H. and G. Lozano (1994). "NF-kappa B activation of p53. A potential mechanism for suppressing cell growth in response to stress." J Biol Chem 269(31): 20067-74.

280. Wunderlich, M. and S. J. Berberich (2002). "Mdm2 inhibition of p53 induces E2F1 transactivation via p21." Oncogene 21(28): 4414-21.

281. Wyllie, F., M. Haughton, et al. (2003). "Mutant p53 can delay growth arrest and loss of CDK2 activity in senescing human fibroblasts without reducing p21(WAFl) expression." Exp Cell Res 285(2): 236-42.

282. Xiao, H., A. Pearson, et al. (1994). "Binding of basal transcription factor TFIIH to the acidic activation domains of VP16 and p53." Mol Cell Biol 14(10): 7013-24.

283. Xiao, Z. X., J. Chen, et al. (1995). "Interaction between the retinoblastoma protein and the oncoprotein MDM2." Nature 375(6533): 694-8.

284. Xiong, Y., G. J. Hannon, et al. (1993). "p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases." Nature 366(6456): 701-4.

285. Xirodimas, D., M. K. Saville, et al. (2001). "Different effects of pl4ARF on the levels of ubiquitinated p53 and Mdm2 in vivo." Oncogene 20(36): 4972-83.

286. Xu, D., T. J. Wilson, et al. (2002). "Etsl is required for p53 transcriptional activity in UV-induced apoptosis in embryonic stem cells." Embo J 21(15): 4081-93.

287. Xu, S. Q. and W. S. El-Deiry (2000). "p21(WAFl/CIPl) inhibits initiator caspase cleavage by TRAIL death receptor DR4." Biochem Biophys Res Commun 269(1): 179-90.

288. Yanamoto, S., G. Kawasaki, et al. (2002). "p53, mdm2, and p21 expression in oral squamous cell carcinomas: relationship with clinicopathologic factors." Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 94(5): 593-600.

289. Yang, H. Y., Y. Y. Wen, et al. (2003). "14-3-3 sigma positively regulates p53 and suppresses tumor growth." Mol Cell Biol 23(20): 7096-107.

290. Yu, S. F., T. von Ruden, et al. (1986). "Self-inactivating retroviral vectors designed for transfer of whole genes into mammalian cells. " Proc Natl Acad Sci U S A 83(10): 3194-8.

291. Yuan, Z. M., Y. Huang, et al. (1999). "Role for p300 in stabilization of p53 in the response to DNA damage." J Biol Chem 274(4): 1883-6.

292. Yun, J., H. D. Chae, et al. (2003). "Cdk2-dependent phosphorylation of the NF-Ytranscription factor and its involvement in the p53-p21 signaling pathway." J Biol Chem 278(38): 36966-72.

293. Zacchi, P., M. Gostissa, et al. (2002). "The prolyl isomerase Pinl reveals a mechanism to control p53 functions after genotoxic insults." Nature 419(6909): 853-7.

294. Zeng, S. X., Y. Jin, et al. (2003). "The acetylase activity of p300 is dispensable for MDM2 stabilization." J Biol Chem 278(9): 7453-8.

295. Zhai, W. and L. Comai (2000). "Repression of RNA polymerase I transcription by the tumor suppressor p53." Mol Cell Biol 20(16): 5930-8.

296. Zhan, Q., I. T. Chen, et al. (1998). "Tumor suppressor p53 can participate in transcriptional induction of the GADD45 promoter in the absence of direct DNA binding." Mol Cell Biol 18(5): 2768-78.

297. Zhang, C., C. Gao, et al. (2002). "Transcriptional activation of the human stress-inducible transcriptional repressor ATF3 gene promoter by p53." Biochem Biophys Res Commun 297(5): 1302-10.

298. Zhang, H., Y. Xiong, et al. (1993). "Proliferating cell nuclear antigen and p21 are components of multiple cell cycle kinase complexes." Mol Biol Cell 4(9): 897-906.

299. Zhang, W. W., S. Labrecque, et al. (2001). "Development of a p53 responsive GFP reporter; identification of live cells with p53 activity." J Biotechnol 84(1): 79-86.

300. Zhang, Y. and Y. Xiong (2001). "A p53 amino-terminal nuclear export signal inhibited by DNA damage-induced phosphorylation." Science 292(5523): 1910-5.

301. Zhao, L. Y., Y. Liu, et al. (2003). "PCAF is a coactivator for p73-mediated transactivation." Oncogene 22(51): 8316-29.

302. Zhao, R., K. Gish, et al. (2000). "Analysis of p53-regulated gene expression patterns using oligonucleotide arrays." Genes Dev 14(8): 981-93.

303. Zhou, M., L. Gu, et al. (2003). "Transfection of a dominant-negative mutant NF-kB inhibitor (IkBm) represses p53-dependent apoptosis in acute lymphoblastic leukemia cells: interaction of IkBm and p53." Oncogene 22(50): 8137-44.

304. Zhu, J., S. Zhang, et al. (2000). "Definition of the p53 functional domains necessary for inducing apoptosis." J Biol Chem 275(51): 39927-34.

305. Zindy, F., C. M. Eischen, et al. (1998). "Myc signaling via the ARF tumor suppressorregulates p53-dependent apoptosis and immortalization." Genes Dev 12(15): 2424-33.

Информация о работе

Струнина, Светлана Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы