Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Моргункова, Анна Алексеевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Молекулярная организация и эволюция семейства генов р53.
Глава 2. Регуляция экспрессии гена р53.
Глава 3. Доменная организация белка р53.
N-концевой трансактивационный домен
- 8НЗ-пролиновый домен
- ДНК-связывающий домен Олигомеризационный домен С-кощевой регуляторный
Глава 4. Функции белка р53.
- р53-зависимая трансактивация
- р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия
- р53-зависимый контроль клеточного цикла
- р53-зависимый апоптоз
Выбор пути: остановка клеточного цикла или апоптоз?
- р53 в процессах репарации и репликации ДНК
- р53 в процессах клеточной дифференцировки и развития организма
- р53 и ангиогенез
- р53 и старение
Глава 5. Регуляция функций р53.
- Механизмы регуляции функций р
- Регуляция стабильности р
- Регуляция активности р
- Регуляция субклеточной локализации р
Глава 6. Роль р53 в онкогенезе.
Gain of function "-мутации р
- Доминантно-негативные или транс-доминантные мутации р
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение компетентных клеток Escherichia coli и трансформация.
2. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
3. Обработка ДНКрестрицирующими эндонуклеазами.
4. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
5. Реакция лигирования.
6. Полимеразная цепная реакция и экстракция РНК из эукариотических клеток.
7. Клеточные линии и их культивирование.
8. Лизис клеток и измерение концентрации белка по методу Бредфорда.
9. Иммунопреципитация белков и ковалентное соединение моноклональных антител с белком А на сефарозе.
10. Фракционирование белков в полиакриламидном геле.
11. Перенос белков на фильтры и иммунодетекция.
12. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструкций методом кальций-фосфатной преципитации.
13. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами и селекция на антибиотике устойчивых культур.
14. Анализ активности /3-галактозидазы (X-gal-peакция).
15. Иммунофлуоресцентный анализ содержания белков в клетках.
16. Детекция апоптотической клеточной смерти (TUNEL-реакция, обработка клеток аннексином/флуоресцеином и хехстом 33258).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53"
Ген р53 - один из наиболее ярких и интенсивно исследуемых представителей генов-супрессоров опухолевого роста. Он (или его аналог) присутствует не только в геномах всех позвоночных, но также, по-видимому, в геномах всех многоклеточных организмов, что подчеркивает его значимость. Продукт гена - тетрамерный белок р53 является одним из важнейших транскрипционных факторов и регуляторов клеточного цикла и апоптоза. В нормально пролиферирующих клетках р53 - короткоживущий белок с быстрой оборачиваемостью: время его жизни не превышает 20 минут. При генотоксических и цитотоксических стрессах р53 быстро стабилизируется за счет посттрансляционных ковалентных модификаций, сопровождающихся прекращением его деградации, что приводит к резкому повышению концентрации белка в клетке. Белок сосредотачивается в клеточном ядре, переходит в активированную для сайт-специфического связывания с ДНК форму, и за счет активации или репрессии транскрипции генов-мишеней "включает" программы: 1) остановки клеточного цикла на время репарации возникших повреждений ДНК, 2) клеточной смерти по типу апоптоза или 3) необратимого клеточного старения. В итоге многоклеточный организм избавляется от клеток с повреждениями генетического аппарата, способными к опухолевой трансформации. В связи с этой охранной функцией р53 был назван хранителем целостности и стабильности генома. Помимо своих основных функций р53 участвует также в процессах репарации и репликации ДНК, развития и старения организма, клеточной дифференцировки и ангиогенеза, оказывая, таким образом, плейотропное воздействие на организм. Функции р53 в клетке тонко регулируются на всех уровнях контроля генной экспрессии, но основным уровнем является посттрансляционный, что позволяет клетке очень быстро менять экспрессию р53 в ситуации стресса.
В процессе опухолевой прогрессии р53 дикого типа является мощным антипролиферативным фактором, сдерживающим развитие рака. Поэтому давление естественного отбора в процессе клональной селекции трансформированных клеток направлено в первую очередь на устранение р53, причем инактивация одного аллеля р53, как правило, оказывается недостаточной, и за ней быстро следует устранение второй копии гена. Мутации р53 зарегистрированы в 50% раковых опухолей человека. Однако дисфункция р53 при раке может быть обусловлена не только изменениями гена, но и нарушениями регуляции процессов стабилизации, субклеточной локализации и активации белка; а также поражением индукторов и эффекторов р53.
Данные молекулярной эпидемиологии рака показывают, что около 80% мутаций гена р53, обнаруженных в раковых клетках человека, представлены миссенс-мутациями, приводящими к продукции полноразмерных мутантных белков, остальные 20% составляют мутации, прекращающие синтез белка: делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания, мутации, приводящие к нарушению сплайсинга мРНК. Столь высокий процент миссенс-мутаций нехарактерен для других генов-супрессоров опухолевого роста, это предполагает особую роль мутаций такого рода в канцерогенезе, возможно, связанную с приобретением мутантным р53 новых, несвойственных белку дикого типа, функций. Подавляющее большинство миссенс-мутаций сосредоточено в зоне, кодирующей ДНК-связывающий домен белка в нескольких горячих точках: R175, G245, R248, R249, R273, R282. Миссенс-мутации, "отбираемые" раковыми опухолями, по этим ко донам, лишают р53 способности связываться с ДНК генов-мишеней и вследствие этого блокируют их транскрипцию. Эти мутации условно делят на три класса: 1) "loss of function" - мутации, приводящие к отмене всех функций р53; 2) "gain of function" - мутации, вследствие которых р53 приобретает новые функции, стимулирующие онкогенез и по сути становится онкогеном; 3) доминантно-негативные, или «транс-доминантные, мутации, при которых, как предполагается, мутантный р53 функционально инактивирует продукт неповрежденного аллеля гена. Представленная работа посвящена изучению именно последнего класса функциональных повреждений р53. В клеточных системах с регулируемой экспрессией кДНК р53 дикого типа и кДНК его доминантно-негативного ингибитора изучено влияние трансдоминантных ингибиторов и процесса гетероолигомеризации, как основного механизма доминантно негативного эффекта, на функциональную активность р53 дикого типа.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ СЕМЕЙСТВА ГЕНОВ р53
Ген р53 человека картирован на коротком плече хромосомы 17 в локусе р13.1 (Benchimol et al., 1985). Он состоит из 11 экзонов и 10 разделяющих их интронов, в общей сложности занимая 20303 bp. Открытая рамка считывания р53 составляет 1317 bp, а протяженность мРНК - 2629 bp, на 5' и 3'- концах которой располагаются нетранслируемые области. Перед полностью нетранслирующимся первым экзоном, расположен палиндромный элемент, образующий шпильку (Bienz-Tadmor В. et al., 1985) на 3'- конце которой находится стартовый сайт инициации транскрипции р53 (Tuck S.P. et al., 1989). Предполагается, что 5'- нетранслирумая область участвует в контроле трансляции через структурные взаимодействия с другим участком мРНК (Mokdad-Gargouri R. et al., 2001). В 3'- нетранслируемой последовательности 11-го экзона идентифицированы: ^4/и-элемент, сигнал полиаденилирования и урацил-богатый репрессорный элемент, подавляющий трансляцию р53 (Fu L. et al., 1999). Промотор р53 распологается "upstream" от первого экзона (Reisman D. et al., 1988) и не содержит характерных для эукариот консенсусов типа ТАТА-бокса, СААТ-бокса и G/C- богатых последовательностей. Экзонон-интронная структура р53 отличается необычной протяженностью первого интрона - 10739 bp, что составляет более половины длины всего гена р53. На 5'- конце этого интрона, примерно на 1000 bp "downstream" от экзона 1, находится сильный промотор, дающий еще слабо изученный транскрипт (Hp53intl), который имеет область высокой гомологии с ДНК-связывающим доменом NF-kappaB (Reisman D. et al., 1996).
Геномная организация p53 организмов, стоящих на разных ступенях филогенетической лестницы, имеет те же характерные особенности, что и организация р53 человека: присутствие очень большого интрона на 5'- конце гена, некодирующий первый экзон, промотор необычного типа. Человеческий и мышиный геномы содержат по одной копии функционального гена р53 на гаплоидный геном (р53 мыши расположен на хромосоме 11), однако у мыши есть еще неактивный псевдоген на хромосоме 14 (Czosnek Н. et al., 1984). У лягушки Xenopus laevis обнаружено два активных гена р53: ее предок Xenopus tropicalis дупликацировал свой геном 30 миллионов лет назад, что привело к возникновению нескольких видов Xenopus, в том числе и к появлению тетраплоидного вида Xenopus laevis (Tymowska J.et al., 1973). Экзон-интронная структура p53 разных позвоночных в подавляющем большинстве случаев идентична: 11 экзонов прерываются 10 интронами в гомологичных положениях, хотя интроны могут варьировать по длине (Soussi Т. et al., 1990). Первоначальное предположение о том, что ген р53 характерен только для позвоночных, оказалось ошибочным - р53 обнаружен у моллюсков (кальмары, двустворчатые моллюски) (Seung-Wook С. et al., 1999), насекомых (Drozophila melanogaster) (Jin S. et al., 2000) и червей (Caenorhabditis elegans) (Derry, W. et al., 2001).
Белковые продукты p53 животных, стоящих на разных ступенях филогенеза, также обнаруживают явную гомологию. Во-первых, она проявляется в поддержании характерных для р53 человека пяти функциональных белковых доменов: N-концевого трансактивационного, 8НЗ-пролинового, ДНК-связывающего, олигомеризационного и С-кондевого регуляторного. Во-вторых, сохранением пяти высококонсервативных в эволюции модульных блоков: блок I расположен в С-концевом трансактивационном домене (экзон 2), блоки II, III, IV и V - в ДНК-связывающем (экзоны: 4+5, 5, 7 и 8 соответственно). Степень гомологии между р53 разных видов в этих зонах часто достигает 100% (Soussi Т. et al., 1990). Установлено, что блок I соответствует зоне р53, отвечающей за активацию транскрипции р53-респонсивных генов; а блоки II-V - за связывание р53 со специфическими последовательностями ДНК этих генов. ДНК-связывающий домен р53 образует сложную пространственную структуру, состоящую из трех петель (LI, L2, L3), (3-листа (S) и а-спирали (Н), при этом высококонсервативный блок II содержит L1 и S, блок III - L2, блок IV - L3, а блок V -Н (May P. et al., 1999). Горячие точки мутаций р53 разных видов расположены именно в этих высококонсервативных кластерах.
Открытие гомологов р53, рбЗ и р73, образующих вместе с ним одно генное семейство, оказалось важным этапом изучения функций и эволюции р53. У человека рбЗ картирован в локусе 3q27 (Yang A. et al., 1998),р73 - в локусе 1р36 (Yang A. et al., 2002). Ген рбЗ включает 15 экзонов, р73 - 14. Первые 11 экзонов прерываются интронами в гомологичных с р53 позициях, экзон 1, как и у р53 - полностью некодирующий, "upstream" от него расположен промотор. Геномные структуры рбЗ и р73 между собой обладают все же большим сходством, чем со структурой р53 (Yang A. et al., 2002). Оба гена имеют огромные первый интрон (>30kb) и третий интрон (>15kb), в котором расположен альтернативный промотор, продуцирующий транскрипт, который кодирует оборванные (AN) белковые продукты без N-концевого трансактивационного домена. Для этих генов, в отличие от р53, характерны альтернативный сплайсинг и альтернативная терминация, что приводит к продукции множества изоформ рбЗ и р73 с трансактивационным доменом (ТАр63/р73а, ТАр63/р73р, ТАр63/р73у, ТАр73б, ТАр73е, ТАр73х, ТАр73л) и без него (ANp63/p73a,ANp63/p73p, ANp63/p73y) (Ishimoto О. et al., 2002). Таким образом в отличие от р53, рбЗ и р73 содержат два независимых промотора, которые управляют экспрессией двух фундаментально различающихся классов белков (ТА и AN). Альфа-изоформы белков рбЗ и р73 кроме характерных для р53 функциональных доменов на С-конце несут еще SAM-домен (sterile alpha motif), который состоит из пяти а-спиралей и отвечает за белок-белковые взаимодействия (Thanos С. et al., 1999). Белки р53, рбЗ и р73 имеют сходную организацию функциональных и высококонсервативных доменов, однако аминокислотные последовательности рбЗ и р73 более гомологичны друг другу, чем каждая из них - р53. Оба белка как и р53 функционируют в форме гомотетрамера, причем олигомеризационные домены рбЗ и р73 способны к слабому взаимодействию друг с другом. Об образовании гетерокомплексов р53/р63 и р53/р73 имеется противоречивая информация, но преобладает мнение, что олигомеризационный домен р53 не ассоциирует ни с рбЗ, ни с р73 (Timothy Т. et al., 1999; Pozniak С. et al., 2000).
Вопрос о функциональном сходстве между р53 и его гомологами до сих пор остается открытым: обладают ли рбЗ и р73 онкосупрессорными функциями или нет? Показано, что рбЗ и р73 взаимодействуют через ДНК-связывающий домен с консенсусной последовательностью р53-респонсивных генов, а ТА-изоформы активируют транскрипцию этих генов, правда все в разной степени, которая во всех случаях уступает трансактивационной способности р53 (Kaelin W., 1999; Ishimoto О. et al., 2002). Предполагается, что AN-изоформы оказывают доминантно-негативный эффект на р53 либо через конкуренцию с р53 за ДНК-консенсус, либо через образование неактивных гетерокомплексов через олигомеризационные домены белков (Yang A. et al., 2002). В соответствии с этим, разные ТА и AN-изоформы рбЗ и р73 могут иметь как р53-подобные антипролиферативные и проапоптотические функции, так и функции, выключающие р53, т.е. антиапоптотические и способствующие клеточной пролиферации. Каким образом в клетке устанавливается координация транскрипции, трансляции и белковой стабильности р53, рбЗ и р73 неизвестно. Есть данные, что экспрессия разных изоформ рбЗ и р73 тканеспецифична. Так, например, в эпителиальных стволовых клетках экспрессируются преимущественно AN-p63 изоформы с внутреннего промотора, которые необходимы для выживания этих клеток и поддержания их "иммортальности" (Yang A. et al., 2002). В данном случае высокие уровни AN-рбЗ делают клетку функционально р53-дефицитной, и стимулируют пролиферацию. Возможно, что подобный механизм р53-инактивации работает в опухолях, т.к. высокие уровни рбЗ-экспрессии обнаружены в карциномах с амплификацией локуса 3q26-28 (Hibi К. et al., 2000). Показано, что в кератиноцитах AN-рбЗ присутствует в пятикратном избытке по отношению к р53, но в ответ на ультрафиолет соотношение белков резко изменяется через стабилизацию р53 и деградацию AN-рбЗ. Установлено, что рбЗ-изоформы необходимы для развития разных эпителиальных структур (кожи, простаты, молочных желез и др.) и конечностей (Mills A. et al., 1999). Функции р73 в разных тканях также зависят от типа экспрессирующихся изоформ и включают ответ на у-облучение, Т-клеточный апоптоз, выживание симпатических нейронов, нейрогенез гиппокампа, гомеостаз цереброспинальной жидкости, воспалительную реакцию, детекцию феромонов (Yang A. et al., 2000). Судя по всему, р73 улавливает внутриклеточные и экстраклеточные сигналы и координирует ответы клетки на них.
Как известно, в геномах ныне живущих организмов записана значительная часть их эволюционной истории. Понимание эволюционных взаимосвязей между членами /?55-семейства может помочь прояснить функции этих генов, а также степень их физиологических взаимодействий. Эволюция семейства генов р53 могла проходить по альтернативным путям: от /?53-предкового гена к рбЗ и р73, или от рб3/р73 к р53. Тот факт, что ^55-подобный ген дрозофилы dp53 выполняет антипролиферативные функции р53 позвоночных и при этом не имеет SAM домена, характерного для рбЗ и р73 позвоночных, может рассматриваться как аргумент в пользу того, что р53 - это ген-предок (Jin S. et al., 2000). С другой стороны, BLAST-поиск с использование генов р53 дрозофилы и нематоды обнаружил градиент сходства, направленный от р53 кальмаров и двустворчатых моллюсков, через рбЗ и р73 млекопитающих к р53 (Yang A. et al., 2002). Р53 моллюсков содержит SAM домен и во многом похож на рбЗ теплокровных. Филогенетический анализ семейства генов р53 беспозвоночных и позвоночных показал, что предок р53 обладал SAM доменом, похожим на этот домен в генах рбЗ и р73 млекопитающих (Aguinaldo A. et al., 1997). Из этого можно сделать вывод, что р53 - новый продукт эволюции, а не ген-предок. Возможно, переломным этапом эволюционного процесса р53-генного семейства по направлению к появлению р53 был переход от беспозвоночных к позвоночным, когда возник внутренний промотор, породивший ТА и AN изоформы, и произошла дупликация гена-предка (вероятно рбЗ) с появлением его гомологов (Yang A. et al., 2002).
ГЛАВА2
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА р53
Особенностью контроля экспрессии гена р53 является то, что он преимущественно осуществляется на посттрансляционном уровне. Несмотря на то, что ген р53 постоянно транскрибируется и транслируется во всех клетках организма, уровень его белкового продукта в клетках большинства тканей остается чрезвычайно низким. Это достигается за счет короткого времени жизни белка р53 (5 - 20 мин.) с его быстрой убикитин-зависимой деградацией в протеосомах (Giaccia A J. et al., 1998). Главным регулятором стабильности р53 считается р53-респонсивный ген mdm2, который действует по принципу отрицательной обратной связи: р53 трансактивирует mdm2, белковый продукт которого связывается с р53 и способствует его разрушению в протеосомах, поддерживая в клетке постоянный "фоновый" уровень р53. При генотоксическом стрессе время жизни р53 резко возрастает за счет посттрансляционных модификаций как р53, так и mdm2 (фосфорилирования и ацетилирования), которые разрушают комплекс p53/mdm2. Это приводит к ускользанию р53 от mdm2-зависимой деградации, его быстрому накоплению в клетке и "включению" р53-зависимых механизмов контроля клеточного цикла и апоптоза (Ashcroft М.А. et al., 1999). Выраженных изменений интенсивности транскрипции гена р53 при этом обычно не наблюдается. Контроль экспрессии гена р53 на посттрансляционном уровне позволяет очень быстро и тонко регулировать количество белка в клетках, подвергшихся стрессу. Более подробно эти процессы будут рассмотрены в разделе, посвященном регуляции стабильности р53.
Существуют противоречивые данные о влиянии ингибиторов белкового синтеза на уровень накопления белка р53 в клетке. В большинстве случаев резкое повышение концентрации р53 в ответ на стресс происходит даже в их присутствии. Тем не менее, показано, что трансляция мРНК р53 может протекать с разной скоростью, и это также, вероятно, вносит вклад в определение уровня экспрессии р53. Установлено, что в управлении скоростью трансляции в клетке задействованы 5' и З'-нетранслируемые зоны (5' и З'-UTR - untranslated regions) мРНК р53. Как уже упоминалось, предполагается, что 5'- UTR участвует в контроле трансляции через структурные взаимодействия с каким-то другим участком мРНК (Mokdad-Gargouri R. et al., 2001), а в 3'- UTR обнаружен урацил-богатый репрессорный элемент, подавляющий трансляцию р53 (Fu L. et al., 1999). Показано, что ионизирующее облучение активирует трансляцию мРНК р53 с помощью определенной регуляторной зоны в З'-UTR (Fu L. et al., 1997). Есть также данные, что белок р53 может негативно авторегулироваться, ингибируя трансляцию своей собственной мРНК (Mosner J. et al., 1995).
Вопрос о регуляции р53 на стадии транскрипции гена до недавнего времени считался закрытым, ввиду представления о том, что этот тип контроля генной экспрессии совсем нехарактерен для р53. Однако анализ уровня мРНК в клетках разных тканей организма показал, что он может существенно варьировать (как и уровень белка р53). Замечено, что быстро пролиферирующие и радиочувствительные ткани (селезенки, тимуса, тонкого кишечника, семенников и др.) экспрессируют во много раз больше мРНК р53, чем медленно пролиферирующие и радиоустойчивые ткани (мозга, печени, мышц и др.) (Комарова Е.А., 2000). Механизмы, поддерживающие такую тканеспецифическую дифференциальную экспрессию мРНК р53, неизвестны. Каким образом скоординированы механизмы регуляции р53 на уровне белка и мРНК - также предстоит установить. По-видимому, концентрация мРНК в ткани в какой-то мере определяет эффективность накопления стабилизированного в ответ на стресс белка р53. Возможно, для каждой ткани многоклеточного организма в зависимости от ее пролиферативного потенциала характерен "свой" базальный уровень экспрессии мРНК р53, а "тонкая" и "экстренная" настройка экспрессии р53 в клетке определяется уже на уровне белка.
Показано, что интенсивность транскрипции р53 зависит не только от типа ткани, но также и от стадии развития организма в процессе онтогенеза. Все клетки эмбрионов нематоды и дрозофилы интенсивно экспрессируют р53-подобного ген (cepl и dp53 соответственно), но аналогичный уровень его экспрессии во взрослом организме детектируется лишь в некоторых органах и в клетках зародышевой линии (Derry, W. et al., 2001; Jin S. et al., 2000). У мышей высокий уровень экспрессии р53 наблюдается только в ранних эмбрионах, в эмбрионах второй половины беременности он уже значительно ниже. Эти данные находятся в явном противоречии с утвердившимся представлением о незначительной роли р53 в процессе развития зародыша и плода. Неоднократно демонстрировалось, что р5Ъ~'~ - мыши рождаются нормальными" и лишь после рождения у них начинают развиваться раковые опухоли (Donehower L.A. et al., 1992). Однако более тщательное обследование таких мышей показало, что, во-первых, многие из них вообще не рождаются, погибая еще на стадии эмбриона, во-вторых, из родившихся мышей очень большой процент имеет многочисленные дефекты развития, в первую очередь поражающие нервную ткань (Sah V.P. et al., 1995; Nicol C.J. et al., 1995). Все эти данные указывают на то, что в процессе индивидуального развития р53 может играть роль тератогенного супрессора, это побудило его назвать "хранителем младенцев" (Hall P.A. et al., 1997).
ГЛАВА 3
ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКА р53
Белок р53 функционирует в клетке в форме гомоолигомера: четыре р53-мономера соединяются друг с другом через свои олигомеризационный домены. Считается, что р53 активен только в форме такого тетрамера. Хотя р53-мономеры организмов разных видов варьируют по длине, все они включают пять функциональных доменов: N-концевой трансактивационный, SH3 -пролиновый, ДНК-связывающий, олигомеризационный и С-концевой регуляторный. Концевые домены р53 ("кислый" N-концевой и "основный" С-концевой) имеют развернутую форму, а центральный ДНК-связывающий домен образует устойчивый к протеолизису кор белка со сложной третичной структурой. Далее доменная организация р53 будет рассмотрена на примере р53-мономера человека, состоящего из 393 аминокислот.
N-концевой трансактивационный домен (1-57 а.о.) необходим для активации транскрипции р53-респонсивных генов мишеней. В нем расположен один из пяти эволюционно высококонсервативных блоков р53 (13-23 а.о.). Этот домен взаимодействует с компонентами транскрипционной машины клетки: ТАТА-бокс связывающим белком (ТВР) транскрипционного фактора TFIID (Horikoshi N. et al., 1995) и с ТВР-ассоциированными факторами (TAFs), включая TAF-40, TAF60 (Thut С. et al., 1995), TAF70 и TAF31 (Lu Н. et al., 1995); с р62-субъединицей фактора транскрипции/репарации TFIIH (Leveillard Т. et al., 1996); со связывающим одноцепочечную ДНК белком RP-A (Dutta A. et al., 1993). Критичными для взаимодействия с этими факторами и, соответственно, для трансактивации генов-мишеней являются аминокислотные остатки 22 и 23: двойные мутанты р53 по этим кодонам, в отличие от всех прочих N-концевых мутантов р53, перестают активировать транскрипцию (Lin J. et al., 1994). Эти же аминокислоты (а также область 17-23 а.о.) играют ключевую роль в связывании р53 с его негативными регуляторами: клеточным белком mdm2 и некоторыми вирусными онкобелками (AdElB 55kD, HPVE6, НВХ).
Sro-пролиновый домен (63-97 а.о.) богат пролином и содержит пять повторов SH3- (src-homology) связывающего мотива - РХХР, где "Р" - пролин, а "X" - любая аминокислота. На основании такого строения домена предполагается, что он вовлечен в физические взаимодействия с клеточными элементами путей сигнальной трансдукции, например с с-abl, который содержит SH3-связывающий домен и образует комплекс с р53. (Walker К.К. 1996). Есть данные о том, что пролиновый домен необходим для целого ряда процессов: р53-зависимой трансактивации проапоптического гена PIG3 (p53-induced gene) (Venot К. et al., 1998), остановки роста раковых клеток (Walker К.К. 1996), активности HPVE6 (Li X. et al., 1996), р53-зависимой трансрепрессии (Venot К. et al., 1998), внутримолекулярных белок-белковых взаимодействий р53 (Muller-Tiemann B.F. et al., 1998), кооперации с антираковыми агентами, вызывающими апоптоз (Baptist N. et al., 2002). Делеция SH3-домена не влияет на трансактивацию "классических" р53-респонсивных генов (mdm2, p21/wafl, bax и др.) Для пролинового домена характерен полиморфизм: кодон 72 может кодировать пролин или аргинин. Замена пролина на аргинин разрушает один из пяти мотивов РХХР. Замечено, что p53/Arg72 более чувствителен к деградации, вызванной белком Е6 HPV, чем р53/Рго72, а люди-гомозиготы по аргинину-72 чаще заболевают раком, индуцированным HPV, чем гетерозиготы (Storey A. et al., 1998).
ДНК-связывающий домен (102-292 а.о.) распознает в промоторной зоне р53-респонсивных генов специфическую консенсусную последовательность ДНК и связывается с ней (Bargonetty J. et al., 1993). Консенсусная последовательность содержит два тандемных декамерных элемента, каждый из которых состоит из двух пентамерных инвертированных повторов: 5'-PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy.N(0
13).PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy-3' (El-Deiry W.S. et al., 1992). Между декамерами может находиться от 0 до 13 промежуточных нуклеотидов. Теоретически инвертированные повторы позволяют консенсусу образовывать крестообразные структуры, если спаривание комплементарных оснований происходит между соседними пентамерами. Предполагается, что р53 образует тетрамер еще до связывания с консенсусной ДНК, причем каждый димер тетрамера связывает две соседние «четвертинки» консенсуса.
Кристаллическая структура ДНК-связывающего домена, соединенного с консенсусной ДНК, состоит из большого р-"сэндвича" (S), трех петель (LI, L2, L3) и а-спирали (Н) (Cho Y. et al., 1994). р-"сэндвич" поддерживает петли подобно лесам: первая петля (L1) связывается с ДНК внутри большой бороздки, вторая петля (L2) -внутри малой бороздки, а третья петля (L3) располагается напротив первой и стабилизирует ее. Петли L2 и L3 соединяются атомом цинка через аминокислоты Cys176, His179, Cys238 и Cys242. Таким образом, цинк оказывается внутри тетраэдрической структуры, которую он стабилизирует. Агенты хелатирующие металлы подавляют сайт-специфическое связывание ДНК и изменяют конформацию домена (Hainaut P. et al., (1993).
Как уже упоминалось, четыре из пяти высококонсервативных блоков р53 располагаются в зоне ДНК-связывающего домена. Блок II (117-142 а.о.) содержит L1 и S, блок III (171-181 а.о.) - L2, блок IV (234-258 а.о.) - L3, а блок V (270-286 а.о.) - Н (May P. et al., 1999). Около 80% мутаций р53, обнаруженных в опухолях, локализуются именно в этих участках; здесь же расположены горячие точки мутаций р53 (в кодонах 175, 245, 248, 249, 273, 282) (Hollstein М. et al., 1994). Миссенс-мутации корового домена р53 делят на два класса: "контактные" - мутации, которые заменяют аминокислоты, непосредственно контактирующие с ДНК (Arg248, Arg273), и "конформационные" - заменяют аминокислоты не контактирующие с ДНК, но сильно
1 ПС стабилизирующие всю пространственную структуру домена (Arg ), так что замена этих аминокислот приводит к его конформационным перестройкам (May P. et al., 1999). Оба класса мутаций подавляют связывание р53 с ДНК-консенсусом генов-мишеней и дают мощное селективное преимущество раковым клеткам в процессе опухолевой прогрессии.
Установлено, что ДНК-связывающий домен является мишенью для большого Т-антигена вируса SV40, который связывается с ним и блокирует контакт р53 с ДНК, останавливая онкосупрессорную работу белка (Jenkins J.R. et al., 1988). Показано также, что с коровым доменом взаимодействуют клеточные белки 53ВР1 и 53ВР2 (Ruppert J.M. et al., 1993).
Олигомеризационный домен, он же тетрамеризационный, (323-356 а.о.) отвечает за образование гомотетрамера р53. Между ним и ДНК-связывающим доменом расположен короткий гибкий линкер (300-318 а.о.) Методами Х-лучевой кристаллографии (Jeffrey P.D. et al., 1995) и ядерного магнитного резонанса (Lee W. et al., 1994; Clore G.M. et al., 1995) было показано, что тетрамеризационный домен образует высокосимметричный тетрамер необычной топологии, который не обнаружена в других многомерных белках. Домен каждого р53 мономера состоит из р-изгиба (324-325 а.о.), р-структуры (326-333 а.о.), второго р-изгиба (334 а.о.) и а-спирали (335-356 а.о.), причем а-спираль и р-структура антипараллельны и образуют
У»-образную фигуру. Каждый мономер образует димер через антипараллельные взаимодействия их р-слоев. Затем два димера взаимодействуют друг с другом через гидрофобные и электростатические контакты их альфа-спиралей, образуя тетрамер. В тетрамере р-слои димеров лежат снаружи с противоположных сторон, а а-спирали -внутри. По сути тетрамер является симметричным димером димеров.
Установлено, что в клетках большинства позвоночных р53 активен только в форме тетрамера (Wang Y. et al., 1995). Подавление олигомеризации приводит к резкому снижению эффективности трансактивации р53-респонсивных генов. Возможно, это связано с тем, что р53 не может оперативно связаться с ДНК-консенсусом. Самосборка тетрамера тонко регулируется клеткой, замечено, что она активируется в ответ на стресс-сигналы и связана с конформационными изменениями р53. Замены некоторых аминокислот домена нарушают процессы олигомеризации; миссенс-мутации р53, приводящие к таким заменам, обнаружены в ряде раковых опухолей (Lomax М.Е. et al., 1998).
Внутри олигомеризационного домена находится NES (nuclear export signal) -сигнал ядерного экспорта р53 (340-351 а.о.) (Stommel J.M. et al., 1999); а на границе линкера и олигомеризационного домена - NLS1 (nuclear localization signal) — один из трех сигналов ядерного импорта р53 (316-325 а.о.) - остальные расположены в С-концевом домене (Dang C.V. et al.,1989).
С-концевой регуляторный домен (363-393 а.о.) является негативным регулятором сайт-специфического связывания р53 с ДНК-консенсусами генов-мишеней и, следовательно, транскрипционной активности р53. Установлено, что связывание р53 с консенсусной ДНК может быть активировано делецией или протеолитическим удалением домена (Hupp T.R. et al., 1992), модификациями (фосфорилированием, дефосфорилированием и ацетилированием) (Takenaka I. et al., 1995), взаимодействием с антителами РАЬ421 (эпитоп 371-380 а.о.) (Balkalkin G. et al., 1995), а также со специфическими активирующими пептидами, аминокислотные последовательности которых частично совпадают с последовательностью эпитопа РАЬ421 (Hupp T.R. et al., 1995). Предполагается, что С-концевой домен контактирует с р53 в зоне SH3- или ДНК-связывающего домена, "запирая" молекулу в "латентной" конформации; а стресс-индуцируемые модификации домена разрушают этот контакт и переводят белок в "активную" конформацию, компетентную для сайт-специфического связывания с ДНК (Muller-Tiemann B.F. et al., 1998).
Из 30 аминокислот домена 9 имеют свойства основания. Вероятно, за счет этих аминокислотных остатков домен может также неспецифически связываться с одноцепочечной ДНК и РНК, с ДНК-разрывами и мисматчами, образующими выпячивания ДНК, возможно, участвуя в процессах репарации (Lee S. et al., 1995). Показано, что с доменом взаимодействуют некоторые клеточные и вирусные белки: субъединицы транскрипционного фактора TFIIH геликазы ХР-В и XP-D (Wang X.W. et al., 1994; Wang X.W. et al., 1995), геликаза CSB (Levine A.J. 1997), ТАТА-бокс связывающий белок (TBP) транскрипционного фактора TFIID (Horikoshi N. et al., 1995), гистоновые ацетилтрансферазы (рЗОО/СВР, pCAF) и деацетилазы (HDAC1, hSir2) (Prives С. et al., 2001), X белок вируса гепатита В (НВХ) (Wang X.W. et al., 1994).
Внутри домена находятся два сигнала ядерного импорта р53: NLS2 (369-375 а.о.) и NLS3 (379-384 а.о.) (Dang C.V. et al., 1989). Есть данные, что домен участвует в процессах р53-зависимого апоптоза (Wang X.W. et al., 1996; Lassus P. et al., 1999).
ГЛАВА 4 ФУНКЦИИ БЕЛКА p53
Белок p53, как и белковые продукты других генов-супрессоров опухолевого роста, участвует в социальном контроле клеточных делений, главная цель которого — не допустить размножение клеток с повреждениями ДНК, способных к автономному росту вне зависимости от потребностей организма как целого. Т.е. р53 удерживает геном клетки в состоянии подчинения интересам всего многоклеточного организма и устраняет клетки с повреждениями ДНК, способные к опухолевой трансформации. Это достигается р53 с помощью включения двух альтернативных механизмов: 1) остановки клеточного цикла пораженной клетки с последующей репарацией ДНК или 2) ее смерти по типу апоптоза (Ко L.J. et al., 1996). Кроме того, что р53 участвует в поддержании стабильности генома, он также играет существенную роль в процессах: репарации и репликации ДНК, развития и старения организма, а также клеточной дифференцировки и ангиогенеза.
Ключевым стимулом, приводящим к быстрому накоплению р53 в клетке и "включению" р53-зависимых механизмов контроля клеточного цикла и апоптоза, может быть любой стресс, повреждающий ДНК или потенциально угрожающий ее повреждением. Спектр стрессов включает ионизирующее или ультрафиолетовое облучение клеток, их обработку цитотоксическими ДНК-повреждающими препаратами, гипоксию, блокаду клеточной адгезии, истощение пула рибонуклеотидов, вирусную инфекцию, активацию онкогенов, теломерное истощение, прекращение поступления сигналов роста и др. (Giaccia A.J. et al., 1998)
Активированный стрессом р53 реализует свои функции прежде всего как транскрипционный фактор - через активацию (главный путь регуляции) или репрессию транскрипции р53-респонсивных генов-мишеней. Кроме того, существуют еще мало изученные активности р53, которые не влияют на транскрипцию генов, но, тем не менее, вызывают некоторые его "downstream" эффекты, в частности -индукцию апоптоза. р53-зависимая трансактивация. р53 трансактивирует гены, промоторы которых содержат р53-респонсивный консенсус (см. раздел "ДНК-связывающий домен" в главе "Доменная организация белка р53"). р53 в форме тетрамера соединяется через ДНК-связывающий домен со своим консенсусом на ДНК гена-мишени и привлекает через N-концевой трансактивационный домен к промоторной зоне этого гена транскрипционные факторы (см. раздел "N-концевой трансактивационный домен" в гл. 3). Список транскрипционных мишеней р53 постоянно увеличивается. Он включает гены:
- GADD45 (Kastan М.В. et al., 1992),
- RGC (Scharer E. et al., 1992),
- mdm2 (Wu X. et al., 1993; Barak Y. et al., 1993),
- p21/WAFl/Cipl (El-Diery et al., 1993),
- циклин G (Okamoto K. et al., 1994),
- Tsp-1 (Dameron K.M. et al., 1994),
- A4X(Miyashita T. et al., 1995),
- IGF-BP3 (Buckbinder L. et al., 1995),
- 14-3-3a(Hermeking H. et al., 1997),
- BAI1 (Nishimori H. et al., 1997),
- PIG3 (Polyak K. et al., 1997; Venot K. et al., 1998),
- B99 (Utrera R. et al., 1998)
- PCNA (Xu J. et al., 1999),
- FOS (Elkeles A. et al., 1999),
- PA26 (Velasco-Miguel S. et al., 1999),
- p53AIPl (Oda K. et al., 2000),
- PERP (Attardy L.D. et al., 2000),
- PIDD (Lin Y. et al., 2000),
- p53R2 (Nakano K. et al., 2000),
- FAS (Munsch D. et al., 2000),
- NOXA (Oda E. et al., 2000),
- PUMA (Nakano K. et al., 2001),
- PTEN (Stambolic V. et al., 2001),
- p53DINPl (Okamura S. et al., 2001),
- Apaf-1 (Moroni M.C. et al., 2001),
- REDD1 (Ellisen L.W. et al., 2002),
Кроме того, обнаружен ряд р5 3 -индуцибильных генов, в том числе KILLER/DR5 (Wu G.S. et al., 1997), PAG608 (Israeli D. et al., 1997), p85 (Yin Y. et al., 1998), которые, возможно, тоже являются прямыми транскрипционными мишенями р53, хотя р53-респонсивный ДНК-консенсус в них пока не идентифицирован.
Существует значительная разница в степени трансактивации этих генов в ответ на экспрессию р53. Предполагается, что в дифференциальную трансактивацию р53-респонсивных генов могут вносить вклад разные факторы: индивидуальные особенности р53-респонсивных элементов (RE - response element) генов-мишеней, количество RE, расположение RE по отношению стартовому сайту транскрипции, количество р53 в ядре клетки, регуляция ДНК-связывающей способности р53, состояние хроматина гена-мишени, доступность коактиваторов транскрипции, тип клетки и др. (El-Diery W.S., 1998; Resnick-Silverman L. et al., 1998)
Изучение трансактивационной способности нескольких p53-RE в изогенном окружении позволило выстроить их в функциональный ряд по мере убывания активности: р21-5\ P53R2, m-FAS, GADD45, h-FAS, 14-3-3<т, PCNA, AIP1, PUMA, циклин G, NOXA, p21-3', mdm2-REl, PA26, BAX-B, mdm2-RE2, c-FOS, IGF-BP3-A, PIG3, BAX-A, IGF-BP3-B (Inga A. et al., 2002). Количественно трансактивационная способность респонсивных элементов, находящихся на дистальных концах ряда различается примерно в 1000 раз. Респонсивные элементы с RE р21-5' до RE циклима G эффективно связываются с р53 и запускают транскрипцию репортерного гена даже при очень низких концентрациях р53 в клетке. Группа RES с NOXA до mdm2-RE2 проявляет умеренную активность, a RES с c-FOS до IGF-BP3-B проявляют очень слабую активность даже при высочайших концентрациях р53. Обнаружено, что RE, которые имеют нуклеотидную последовательность CATG между консенсусными сайтами связывания р53-димеров (RES р21-5', p53R2, m-FAS, GADD45), обладают большей афинностью к р53, чем RE без этой последовательности (Inga A. et al., 2002). Возможно, это объясняется тем, что гибкость этой структуры позволяет ДНК принять необходимую конформацию для эффективного взаимодействия с р53-тетрамером. Не исключено, что трансактивация генов, содержащих сразу несколько RE (например mdm2, ВАХ, IGF-BP3), повышается за счет их количества. р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия. р53 подавляет транскрипцию ряда генов, которые не имеют р53-респонсивного консенсуса, в том числе: c-fos, c-jun, с-тус, hsp70, IL-6, Rb, bcl-2, ген /?-актина, MDR1, MAP4, pl4-ARF (Ко L.J. et al., 1996; May P., et al., 1999, Чумаков П.М., 2000). О механизмах р53-зависимой трансрепрессии известно намного меньше, чем о трансактивации. Считается, что в отличие от трансактивации для трансрепрессии р53 обычно не требуется взаимодействие с ДНК репрессируемых генов. Замечено, что р53 часто репрессирует гены, которые не имеют не только р53-респонсивного ДНК-консенсуса, но и никаких других регуляторных элементов инициации транскрипции кроме ТАТА-бокса (Mack D.H. et al., 1993). Поэтому предполагается, что механизмом трансрепрессии этих генов является "squelching": р53 "концентрирует" на своих N- и С-концевых доменах транскрипционные факторы ТВР и TAFS, в результате в промоторах, имеющих только ТАТА-бокс, образуется их дефицит (Seto Е. et al., 1992; Mack D.H. et al., 1993).
В то же время установлено, что в ряде случаев трансрепрессия обусловлена другими механизмами. Так, подавление транскрипции bcl-2, возможно, связано с существованием в 5'-нетранслируемой области гена негативного р53-респонсивного элемента (Miyashita Т. et al., 1994), а инактивация промотора hsp70, имеющего сайт ССААТ, происходит за счет взаимодействия р53 с активатором транскрипции CBF (ССААТ binding factor) (Agoff S.N. et al., 1993). Появляется все больше данных свидетельствующих о том, что р53 за счет белок-белковых взаимодействий может инактивировать разные транскрипционные факторы, в их числе: Spl (Bargonetti J. et al., 1997), HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) (Blagosklonny M.V. et al., 1998), TRS (thyroid hormone nuclear receptors) (Bhat M.K. et al., 1997), ER (estrogen receptor) (Yu C.L. et al., 1997), Stat5 (signal transducers and activators of transcription) (Fritsche M. et al., 1998), RelA/NF-kB (Ravi R. et al., 1998). Причем при образовании комплексов р53 с HIF-1 и RelA посредником является ацетилаза рЗОО/СВР. Есть данные о связи р53 с гистоновыми дезацетилазами, участвующими в подавлении транскрипции генов (см. раздел "Механизмы регуляции функций р53" в гл. 5). р53-зависимые эффекты, в частности индукция апоптоза, иногда наблюдаются в присутствии ингибиторов транскрипции (актиномицина D) и трансляции (циклогексимида), что исключает возможность трансактивации р53респонсивных генов и появления в клетке новых белков (Caelles С. et al., 1994; Wagner A.J. et al., 1994). Механизмы, лежащие в основе такой активности р53, не ясны. Возможно, р53 способен включить программу клеточной смерти, просто подавляя транскрипцию генов, которые в активном состоянии защищают клетку от апоптоза, например Ьс12. Однако, более вероятно, что в данном случае р53-зависимые эффекты сохраняются за счет белок-белковых взаимодействий между р53 и какими-то неизвестными лигандами, запускающими программу апоптоза. Обнаружено, что в ответ на стресс небольшая фракция р53 клетки с помощью hsp70 очень быстро проникает в митохондрии, располагаясь на их мембранах, после чего происходит падение трансмембранного потенциала митохондрий, освобождение цитохрома С и активация прокаспазы-3 (Marchenko N. et al., 2000). Кроме того, есть данные, что р53 участвует в транспорте рецепторов смерти, в частности FAS/CD95, из аппарата Гольджи на поверхность цитоплазматической мембраны (Bennett М. et al., 1998).
Показано, что р53 может регулировать трансляцию мРНК некоторых генов, непосредственно связываясь с 5'-нетранс лируемой областью мРНК. Так, взаимодействие С-концевого домена р53 с 5'-UTR мРНК гена циклин-зависимой киназы cdk4, необходимой для фосфорилирования pRb и прохождения клетки через Gl-фазу клеточного цикла, блокирует ее трансляцию (Miller S.J. et al., 2000). р53-зависимый контроль клеточного цикла (остановка клеточного цикла). р53 может останавливать продвижение клетки по циклу в трех контрольных точках: в G1- и 02-фазах интерфазы, а также во время митоза на стадии сборки веретена деления. При этом р53 действует как трансактиватор ряда респонсивных генов, участвующих в контроле клеточного цикла: p21/WAFl/Cipl, GADD45, РА26, циклин G, 14-3-3<т, В99. Считается, что р53-индуцированная остановка клеточного цикла может быть необратимой, что ведет к старению клетки и исключению ее из оборота, и обратимой, когда клетка "арестовывается" на время, необходимое для репарации ДНК.
Остановка клеточного цикла в фазе G1.
В норме генетический аппарат не допускает вхождение в S-фазу клеток с разрывами ДНК, а также с нарушением числа или структуры хромосом, обратимо или необратимо останавливая такие клетки в точке рестрикции G1. Одним из наиболее чувствительных сенсоров такого контроля является р53.
Главным эффектором р53 является белок p21Wafl/Cipl, который активно связывает и ингибирует комплексы циклин-циклинзависимых киназ, ответственных за продвижение клетки через фазу G1: циклин D-cdk4/6 и циклин E-cdk2 (cyclin-dependent kinase) (Harper J.Y. et al., 1993). Это предотвращает фосфорилирование белка pRb, который в гипофосфорилированном состоянии связывает и выводит из оборота транскрипционный фактор E2F, необходимый для входа клетки в S-фазу (Slebos R.J.C. et al., 1994; Копнин Б.П. 2000). Так образуется сигнальный путь: р53 -p21Wafl/Cipl - циклин/cdk - pRb - E2F, приводящий к Gl-''аресту". Возможно, что pRb-подобные белки р107 и р130, которые в гипофосфорилированном состоянии тоже образуют комплекс с E2F, также задействованы в этом процессе (Levine A.J. 1997).
Кроме того, p21Wafl/Cipl ассоциирует с белком PCNA (proliferating cell nuclear antigene), подавляя только его репликативные, но не репаративные функции (Li R. et al., 1994). По-видимому, белок GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage inducible gene 45) останавливает клетку, тоже через инактивацию PCNA (Smith M.L. et al., 1994). He исключено, что аналогично останавливает клеточный цикл и другой член GADD-семейства - белок РА26 (р53-activated gene 26) (Velasco-Miguel S. et al., 1999).
Есть данные, что экспрессия циклина G также сопровождается остановкой в фазе G1 (Okamoto К. et al., 1994).
Вероятно, р53 может останавливать клеточный цикл, используя транскрипционно-независимые механизмы. Уже упоминалось, что он блокирует трансляцию гена cdk4, взаимодействуя с 5'-UTR ее мРНК (Miller S J. et al., 2000).
Остановка клеточного цикла в фазе G2.
В фазе G2 осуществляется контроль не только повреждений ДНК, но и полнота ее репликации: клетки с недореплицированной ДНК не входят в митоз. Главным регуляторным фактором, отвечающим за переход из С2-фазы в профазу митоза, считается комплекс циклин Bl-cdc2(cdkl) (Elledge S.J., 1996; O'Connor P.M., 1997). Поэтому предполагается что, его инактивация, уменьшение экспрессии циклина В1 или ингибиторное фосфорилирование cdc2 - главные медиаторы G2-"apecTa". Поскольку p2lWafl/Cipl слабо взаимодействует с этим комплексом, его активное участие в этом процессе неочевидно, хотя есть данные, что сверхэкспрессия p2iWafl/ClP1 аккумулирует клетки не только в G1-, но и в 02-фазах (Medema R.H. et al., 1998). Однако в фазе G2 более активными посредниками между р53 и циклином Bl-cdc2, вероятно, являются белки GADD45 и 14-3-За.
GADD45 разрушает комплекс: циклин Bl-cdc2. Показано, что при этом он изменяет субклеточную локализацию циклина В1, уменьшая его ядерное содержание, которое является критическим фактором комплексобразования и перехода клетки в митоз (Jin S. et ak., 2002). Не исключено также, что GADD45 связывает и ингибирует cdc2 (Zhan Q. et al., 1999).
14-3-3<y связывает и выводит из оборота фосфорилированную форму фосфатазы cdc25c, что предотвращает дефосфорилирование cdc2 и активацию комплекса циклин Bl-cdc2 (Peng C.Y. et al., 1997). Кроме того, 14-З-За может связывать и задерживать cdc2 в цитоплазме (Hermeking Н. et al., 1997).
Установлено, что 02-задержку может вызывать белок В99, который детектируется только в 02(02/М)-фракции клеточной популяции и локализуется на микротрубочках (Utrera R. et al., 1998).
Остановка клеточного цикла на стадии сборки веретена деления.
Чтобы не допустить неправильное распределение хромосом в процессе митоза, клетка задерживается в метафазе до тех пор, пока все кинетохоры не будут прикреплены к микротрубочкам. Клетки, обработанные ингибиторами сборки веретена деления, останавливаются на ранних стадиях митоза, однако р53 -/- мышиные эмбриональные фибробласты продолжают движение по циклу, проходят повторные раунды репликации без расхождения хромосом, и образуют тетраплоидные и октаплоидные клетки (Cross S.M. et al., 1995). Такие фибробласты в процессе одного клеточного цикла часто продуцируют множественные копии функционально компетентных центросом, которые инициируют сборку веретена деления сразу с трех или четырех полюсов клетки, что приводит к анеуплоидии (Fukasawa К. et al., 1996). При разрушении микротрубочек, отсутствии сегрегации хромосом или ее неправильном завершении наблюдается активация р53 (Lanni J.S. et al., 1998; Sablina A.A. et al., 1998). Показано, что p53 может непосредственно связываться с микротрубочками и контролировать их состояние (Giannakakou P. et al., 2000), но этот контроль скорее сопряжен с индукцией апоптоза, а не с остановкой клеточного цикла (см. следующий раздел).
Таким образом, р53, по-видимому, контролирует процессы сборки микротрубочек, дупликации центросом и правильного расхождения хромосом в клетке, однако механизмы контроля неизвестны. Есть мнение, что р53 не останавливает клетку в процессе митоза, а позволяет ей дойти до фазы G1, где она уже "арестовывается" (Sablina А.А. et al., 1999; Giannakakou P. et al., 2001).
Остановка клеточного цикла в фазе GO.
Белок цитоплазматической мембраны Gasl (growth-arrest-specific gene 1) блокирует клеточную пролиферацию и удерживает клетки в фазе GO через активацию р53 (Del S. et al., 1995). Причем р53 в данном случае вызывает остановку цикла с помощью SH3 -пролинового домена за счет белок-белковых взаимодействий без трансактивации генов-мишеней (Ruaro Е.М. et al., 1997). р53-зависимый апоптоз. р53 индуцирует апоптоз, активируя или подавляя транскрипцию эффекторных генов, а также используя транскрипционно-независимые механизмы. Количество обнаруженных медиаторов р53-зависимого апоптоза намного превосходит количество р53-респонсивных генов, задействованных в контроле клеточного цикла, хотя ни один из этих медиаторов не обладает выраженными преимуществами по отношению к другим. "Критический" индуктор р53-зависимого апоптоза, подобный "критическому" индуктору р53-зависимой остановки клеточного цикла p21Wafl/Cipl, не выявлен. Вероятно, его и не существует, а р53-зависимый апоптоз - есть результат суммарного действия нескольких р53-регулируемых проапоптотических генов и белков. р53 использует разные стратегии включения механизмов клеточной смерти: воздействие на митохондриальные белки, участвующие в апоптозе,
- регуляцию образования радикалов активного кислорода, активацию Apaf-1 (apoptosis protease-activating factor 1),
- воздействие на "рецепторы смерти", активацию транспорта проапоптотических белков из аппарата Гольджи, подавление машины клеточного выживания,
- активацию киназ, фосфорилирующих проапоптотические белки, и др. р53 активирует транскрипцию ряда генов, белковые продукты которых располагаются на митохондриях и способствуют выбросу из них цитохрома С, стимулирующего образование апоптосомы Apaf-1/каспаза 9, которая запускает каспазный каскад. К таким генам относят: ВАХ (Miyashita Т. et al., 1995), PUMA (Nakano К. et al., 2001), NOXA (Oda E. et al., 2000), p53AIPl (Oda K. et al., 2000). Проапоптотическое действие белка Bax заключается не только в том, что он встраивается в мембраны митохондрий и способствует открыванию каналов для секреции цитохрома С в цитоплазму, но также в его гетеродимеризации через ВНЗ
Bcl2-homology 3) домен с антиапоптотическим Bcl-2 и его инактивации (Reed J.C., 1998). Белки PUMA (р53 upregulated modulator of apoptosis) и NOXA — тоже члены семейства белков Вс1-2, но в отличие от Вах, они содержат только домен ВНЗ, необходимый для олигомеризации. Через этот домен PUMA и NOXA взаимодействуют с проапоптотическими членами Вс1-2-семейства (Bcl-2, Bc1-Xl), локализованными на митохондриях, ингибируют их и активируют быструю индукцию апоптоза. Установлено, что р53-зависимая трансактивация генаp53AIPl (р53-regulated apoptosis-inducing protein 1), белковый продукт которого во время стресса тоже располагается в митохондриях и вызывает падение их трансмембранного потенциала, происходит только когда р53 фосфорилирован по Ser-46 (Oda К. et al., 2000). Предполагается, что Ser-46 на р53 регулирует промоторную селективность через изменение сайт-специфического ДНК-связывания. Показано, что в фосфорилировании р53 по Ser-46 участвует другой р53-респонсивный ген - p53DINPl (р53-dependent damage-inducible nuclear protein 1), белковый продукт которого, по-видимому, является кофактором киназы, фосфорилирующей Ser-46 р53 (Okamura S. et al., 2001). Так образуется фрагмент сигнального пути: р53 -p53DINPl+Kiraa3a-p53/Ser-46p-p53AIPl. р53, видимо, участвует также в регуляции активности серин-треониновой киназы LKB1, активация которой происходит при обработке клеток агентами, разрушающими микротрубочки (Karuman P. et al., 2001). Установлено, что р53 соединяется с N-терминальным киназным доменом LKB1, после чего киназа проникает в митохондрии, и происходит индукция апоптоза. Уже говорилось о том, что р53 способен проникать в митохондрии (см. раздел "р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия" в гл. 4). Кроме того, есть данные, что фракция цитоплазматического р53 может связываться с тубулином микротрубочек, транспортироваться вдоль них динеином и отслеживать динамику их полимеризации-деполимеризаци (Giannakakou P. et al., 2000). Поэтому можно предположить, что LKB1 - компонент р53-зависимого контроля состояния микротрубочек.
Воздействие р53 на митохондрии может осуществляться косвенно - через контроль индукции радикалов активного кислорода - ROS (reactive oxygen species), которые повреждают мембраны митохондрий или вызывают колебания трансмембранного потенциала, что также сопровождается включением каспазного каскада. р53 индуцирует транскрипцию генов, белковые продукты которых генерируют оксидативный стресс и/или отвечают на него. К ним относят прямые транскрипционные мишени р53 - гены PIG3 (Venot К. et al., 1998) и REDD1 (Ellisen L.W. et al., 2002), а также р53-индуцибельные гены - p85 (Yin Y. et al., 1998) и большинство генов группы PIG (Polyak К. et al., 1997). Белок PIG3 (p53-induced gene 3) отвечает за продукцию ROS, он во многом гомологичен NADPH-хинон-оксидоредуктазе, активной при апоптозе растительных меристем. Показано, что для трансактивации PIG3 р53 строго необходима интактность его БИЗ-пролинового домена, который, по-видимому, как-то влияет на соединение ДНК-связывающего домена с р53-респонсивным элементом PIG3 (Venot К. et al., 1998). Предполагается, что белок REDD1 (regulated in development and DNA damage responses) регулирует уровни ROS в клетке и ее чувствительность к оксидативному стрессу. Ген REDD1 был также открыт как отвечающий на гипоксию RTP801 (Shoshani Т. et al., 2002). Подавление его экспрессии сопровождается снижением концентрации ROS и устойчивостью клетки к оксидативному стрессу. Белок р85, содержащий SH2/SH3 домены, индуцируется р53-зависимо в ответ на оксидативный стресс, вызванный перекисью водорода. Несмотря на то, что р85 является регулятором фосфатидилинозитол-З-ОН киназы (Р1(3)К), его роль в апоптозе, видимо, не связана с ее активностью. Считается, что р85 является одним из белков сигнальной трансдукции (Yin Y. et al., 1998). р53 может непосредственно понижать апоптотический порог клетки, активируя транскрипцию Apaf-1, в промоторе которого обнаружено два р53-респонсивных консенсуса (Moroni М.С. et al., 2001). р53 активирует не только "митохондриальный" сигнальный путь апоптоза, но также путь, начинающийся от "рецепторов смерти" на цитоплазматической мембране. Связывание киллерных рецепторов со своими лигандами вызывает изменение конформации их цитоплазматических доменов, связывание с ними внутриклеточных адаптерных белков и прокаспазы 8, созревание которой далее запускает каспазный каскад. р53 "ир"-регулирует эксперссию генов KILLER/DR5 (Wu G.S. et al., 1997), FAS/APO-1/CD95 (Munsch D. et al., 2000) и PIDD (Lin Y. et al., 2000), которые кодируют киллерные рецепторы, содержащие внутриклеточный "домен смерти". Последние два являются прямыми транскрипционными мишенями р53, вероятно, что и KILLER/DR5 имеет р53-респонсивный консенсус, который пока не идентифицирован. Белки KILLER/DR5 и FAS/APO-1/CD95 - члены семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR); первый активируется TRAIL-лигандом, второй - Fas-лигандом (Baker S.J. et al.,1998). Белок PIDD (p53-induced protein with a death domain) кроме "домена смерти" содержит семь тандемных лейцин-богатых повторов LRR (leucine-rich repeats). Лиганды, взаимодействующие с LRR и "доменом смерти" PIDD, пока не установлены.
Уже говорилось о том, что р53 может воздействовать на "рецеторы смерти" транскрипционно-независимым способом, транспортируя их, в частности FAS/APO-1/CD95, из аппарата Гольджи на цитоплазматическую мембрану (Bennett М. et al., 1998). Не исключено, что в этом процессе задействован белок PERP (р53 apoptosis effector related to PMP-22), ген которого трансактивируется р53 (Attardy L.D. et al., 2000). PERP - новый член семейства трансмембранных белков PMP-22/gas3, которые играют двойную роль: являются структурными компонентами миелина и регуляторами клеточного роста (Naef R. et al., 1999). Белок PERP локализуется в клетке на отдельных везикулярных структурах цитоплазмы, в том числе на митохондриях, на цитоплазматической мембране и на мембранах аппарата Гольджи. Показано, что экспрессия PERP сопровождается апоптозом. Возможно, существует два механизма PERP-зависимого апоптоза. Во-первых, его сходство с у-субъединицей кальциевых каналов предполагает наличие поро-образующей или канал-обращующей активности, способствующей выходу из цитоплазматических хранилищ молекул, критичных для индукции апоптоза. Во-вторых, не исключено, что PERP аналогично белкам KILLER/DR5 и FAS/APO-1/CD95 является "рецептором смерти", принимающим аутокринные или паракринные сигналы (Attardy L.D. et al., 2000). p53 индуцирует апоптоз не только за счет активации путей, ведущих к клеточной смерти, но также за счет подавления механизмов, способствующих клеточному выживанию. Так, р53 активирует транскрипцию генов PTEN (Stambolic V. et al., 2001) и IGF-BP3 (Buckbinder L . et al., 1995). Белок PTEN дефосфорилирует фофатидилинозитол-3,4,5-трифосфат - продукт фосфатидилинозитол-3-киназной активности - и вследствие этого негативно регулирует сигнальный путь клеточного выживания, связанный с активностью киназы PKB/Akt (Maehama Т. et al., 1998). Белок IGF-BP3 (insulin-like growth factor-binding protein 3) связывает инсулиноподобные факторы роста IGFS, блокируя передачу митогенных сигналов через IGF-рецепторы (Buckbinder L. et al., 1995; Neuberg M. et al., 1997). Есть данные, что р53 может также понижать концентрацию самих рецепторов к IGFS (Neuberg М. et al., 1997; Prisco M. et al., 1997). p53 подавляет транскрипцию ряда генов, способствующих выживанию и пролиферации клеток, в том числе гены антиапоптотического Вс1-2 и фактора роста лимфоцитов - интерлейкина 6 (см. раздел "р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия" в этой главе).
Функции р53-индуцибильного гена PAG608 (Israeli D. et al., 1997), сверхэкспрессия которого также сопровождается апоптозом, пока неясны. Поскольку белок PAG608 содержит "цинковые пальцы" и локализуется преимущественно в ядрышке, предполагается, что он связывается с нуклеиновыми кислотами, хотя не исключается возможность белок-белковых взаимодействий (Israeli D. et al., 1997).
Выбор пути: остановка клеточного цикла или апоптоз?
Поскольку р53 может стимулировать альтернативные механизмы реакции клетки на генотоксический стресс - апоптоз или остановку цикла, должны существовать дополнительные факторы, направляющие клетку по тому или иному пути. На выбор пути большое влияние оказывает тип клетки. Так, при у-облучении клетки гематопоэтичекого происхождения (лимфоциты и миелоциты) быстро апоптируют, тогда как соединительнотканного (фибробласты) - останавливаются в контрольных точках цикла (Amundson S.A. et al., 1998). Причем замечено, что в первом случае р53 активирует транскрипцию проапоптотичесткого Box, а во втором - нет. Механизм, объясняющий тканеспецифическую зависимость ответа клетки на стресс, до конца не исследован.
Предполагается, что ключевыми факторами "переключения" апоптоз//арест являются белки семейства Bcl-2, а также соотношение белков pRb и E2F в клетке в момент стресса (Ко L.J. et al., 1996; Amundson S.A. et al., 1998). К модуляторам p53-зависимого ответа клетки на стресс, влияющим на эти факторы, относят цитокины и вирусные онкобелки. Показано, что аденовирусный белок Е1А, блокирующий функции pRb, модулирует р53-зависимый ответ первичных клеток грызунов в ответ на у-облучение: клетки, не экспрессирующие Е1А останавливаются в фазе Gl, а экспрессирующие - апоптируют (Debbas М. et al., 1993). Интрлейкин 3 модулирует р53-зависимый ответ на у-лучи В-лимфоцитов: в присутствии интерлейкина наблюдается остановка клеточного цикла, в отсутствие - апоптоз (Canman С.Е. et al., 1995). pRb и E2F вызывают в клетке противоположные эффекты: pRb стимулирует клетку к G1 -"аресту", a E2F - к пролиферации в нормальных условиях или - к апоптозу в условиях генотоксического стресса. Сверхэкспрессия E2F рассматривается как функциональный эквивалент потери функции pRb и тоже сопровождается апоптозом (Ко L.J. et al., 1996). Возможно, это объясняется Е2Р-зависимой трансактивацией гена Apaf-1, который является его прямой транскрипционной мишенью (Moroni М.С. et al., 2001).
Есть данные, что цитокины "обрывают" р53-зависимый сигнальный путь, ведущий к апоптозу, на уровне митохондриальных мембран через "ир"-регуляцию антиапоптотических белков семейства Bcl-2 (Heinrichs S. et al., 2003).
Не исключено, что в выборе альтернативных путей клетки при стрессе участвуют также белки семейства р53 (рбЗ и р73) и клеточные онкогены (Amundson S.A. et al., 1998; Yang A. et al., 2002). p53 в процессах репарации и репликации ДНК. р53 обладает рядом биохимических активностей, которые могут быть связаны с распознаванием и репарацией структурных и топологических повреждений ДНК. Показано, что С-концевой регуляторный домен р53 неспецифически связывается с одноцепочечной и двухцепочечной ДНК (Steinmeyer К. et al., 1988), с одноцепочечными разрывами (Bakalkin G. et al., 1995) и образующими выпячивания мисматчами ДНК (Lee S. et al., 1995), с образующимися в процессе гомологичной рекомбинации структурами Холлидея (Lee S. et al., 1997). Центральный ДНК-связывающий домен проявляет 3' - 5'-экзонуклеазную активность (Mummenbrauer Т. etal., 1996).
Установлено, что р53 непосредственно взаимодействует с некоторыми ключевыми компонентами системы репарации. Через С-концевой домен р53 соединяется:
- с субъединицами фактора транскрипции/репарации TFIIH - геликазами синдрома пигментной ксеродермы ХР-В и XP-D (xeroderma pigmentation - complementation groups В and D) (Wang X.W. et al., 1995),
- с геликазой кокаинового синдрома CSB (Cockayne syndrome -complementation group B) (Wang X.W. et al., 1995), геликазой/экзонуклеазой синдрома Вернера (синдром преждевременного старения) - WRN (Werner syndrome) (Blander G. et al., 1999),
- с белком RPA (replication protein А), связывающим одноцепочечную ДНК (Dutta A. et al., 1993; Yu A. et al., 2000).
Через N-концевой домен p53 ассоциирует с RPA и субъединицей TFIIH - белком р62 (Dutta A. et al., 1993; Wang X.W. et al., 1995). Геликазы XPS (В и D) и CSB, терминальные мутации белок-кодирующих областей которых сопутствуют аутосомно-рецессивным заболеваниям, связанным с гиперчувствительностью к солнечному свету, соответствено, пигментной ксеродерме (предрасположенностью к раку кожи) и какаиновому синдрому (умственная отсталость), являются компонентами tcNER (transcription-coupled nucleotide excision repair), что свидетельствует о связи р53 с процессами репарации повреждений активных генов. Показано, что р53 может ингибировать геликазную активность ХР-В, XP-D и CSB, останавливая движение транскрипционного комплекса; возможно, это связано с р53-зависимой ренатурацией ДНК (Wang X.W. et al., 1995; Yu A. et al., 2000). p53 напрямую активирует транскрипцию генов, задействованных в процессах репарации и репликации ДНК: PCNA (Xu J. et al., 1999) и p53R2 (Nakano К. et al., 2000). О регуляторных взаимосвязях между р53 и PCNA через p21Wafl/Cipl и GADD45 уже было сказано (см. раздел "р53-зависимый контроль клеточного цикла" в этой главе). PCNA определяет судьбу клетки в зависимости от состояния р53: если PCNA присутствует в клетке в изобилии в отсутствие р53, происходит репликация ДНК и клетка делится, в присутствии р53 - начинается репарация ДНК и клетка останавливается, если же PCNA нет в клетке или он нефункционален - то она апоптирует (Paunesku Т. et al., 2001). Ген p53R2 кодирует фермент рибонуклеотидредуктазу, необходимую для продукции дезоксирибонуклеотидов в процессе репарации и репликации ДНК. Кроме того, есть данные, что in vitro р53 связывается с промотором гена ХР-С, в котором обнаружен р53-респонсивный элемент, так что, вероятно, этот ген также является прямой транскрипционной мишенью р53 (Adimoolam S. et al., 2002). Белок ХР-С важный компонент ggNER (global genome nucleotide excision repair), в комплексе с HR23B он распознает и устраняет повреждения, не связанные с процессами транскрипции, которые могут возникнуть в любой части генома (Sugasawa К. et al., 1998). Показано также, что р53 в ответ на ультрафиолет "ир"-регулирует транскрипцию гена DDB2 (UV-damaged DNA-binding protein 2), мутации которого обнаружены у лиц с пигментной ксеродермой группы комплементации Е (ХР-Е) (Tang J. et al., 2002). Белок DDB2 связывается с циклобутановыми пиримидиновыми димерами и другими ДНК-повреждениями, возникающими при ультрафиолетовом облучении, и устраняет их. Поскольку ХР-Е, как и ХР-С, является компонентом ggNER, это предполагает участие р53 в процессах глобальной геномной эксцизионной репарации ДНК. На это указывает также тот факт, что р53 оказался необходимым фактором "доступности" хроматина - глобальная релаксация хроматина, необходимая для доступности зон повреждения ДНК компонентам ggNER, происходит р53-зависимо (Rubbi С.Р. et al., 2003). р53 в процессах клеточной дифференцировки и развития организма.
Представления о роли р53 в процессах развития организма претерпели быструю эволюцию, начиная с работ Доноувера (Donehower L.A. et al., 1992), отрицавших какое-либо участие р53 в росте, дифференцировке и эмбриональном развитии, и кончая утверждением Холла (Hall P.A. et al., 1997), что р53 является "хранителем младенцев" и "тератогенным супрессором" (см. гл. 2). Непосредственное участие р53, а также рбЗ и р73, в процессах дифференцировки продемонстрировано, в частности, на клетках крови, нервной системы, эпителия, и гаметах (сперматозоидах). Так, известно, что дифференцировка предшественников В-лимфоцитов с индукцией синтеза /и и л: цепей иммуноглобулинов (Rotter V. et al., 1994), а также экспрессия гена гемоглобина (Johnson P. et al., 1993) в предшественниках эритроцитов происходят р53-зависимо.
Критична роль р53 в формировании центральной нервной системы. На определенных этапах развития нейроны подвергаются массивному апоптозу. Обнаружено, что этот процесс, как и дифференцировка нервных клеток, регулируется р53 (Eizenberg О. et al., 1996; Feirrera A. et al., 1996). In vitro показано, что в процессе развития в нейронах и клетках глии изменяется субклеточная локализация р53: во время дифференцировки р53 находится в ядре, а в созревших дифференцированных клетках - в цитоплазме (Eizenberg О. et al., 1996). Вероятно, получая соответствующий сигнал, р53 проникает в ядро первичных нейронов и глиальных клеток, направляя их на соответствующий путь развития. Функциональная инактивация р53 трансдоминантными ингибиторами подавляет дифференцировку олигодендроцитов и защищает нейроны от апоптоза (Eizenberg О. et al., 1996). Эти данные коррелируют с опытами in vivo на р5Ъ~'~ трансгенных мышах, эмбрионы которых часто обнаруживают эксэнцефалию с разрастанием нервной ткани (Sah V.P. et al., 1995). На выживание симпатических нейронов и нейрогенез гиппокампа оказывает влияние также уровень экспрессии р73 (Yang A. et al., 2000) (см. гл. 1).
Для нормального развития структур эпителия и поддержания "иммортальности" эпителиальных стволовых клеток необходима экспрессия рбЗ, с определенным балансом разных рбЗ-изоформ и р53 (Mills A. et al., 1999; Yang A. et al., 2002) (см. главу "Молекулярная организация и эволюция семейства генов р53"). Установлено, что в рбЗ-опосредованной регуляции эпителиальной дифференцировки задействован р53- и рбЗ-респонсивный ген REDD1 (Ellisen L.W. et al., 2002), определяющий уровни ROS в клетке и ее чувствительность к оксидативному стрессу (см. раздел " р53-зависимый апоптоз " в гл. 4).
В процессе сперматогенеза р53 регулирует пролиферацию и апоптоз сперматогоний; он необходим для индукции апоптоза премейотических клеток в ответ на генотоксический стресс и удаления поврежденных клеток. (Вешпег T.L. et al., 1998). Степень влияния р53 на сперматогенез зависит от уровня его экспрессии (Allemand I. et al., 1999). Трансгенные мыши, экспрессирующие высокие уровни р53, продуцируют мало сперматозоидов, поскольку большинство развивающихся сперматид подвергается апотозу. У субфертильных самцов, экспрессирующих промежуточные уровни р53, из-за изменений терминальной дифференцировки постмейотических клеток наблюдается тератозооспермия. Самцы с низким уровнем экспрессии р53 сохраняют нормальный фенотип (Allemand I. et al., 1999).
Уже говорилось о том, что у трансгенных мышей с гомозиготной делецией р53 отмечается высокий процент летальности и аномалии развития эмбрионов (Sah V.P. et al., 1995; Nicol C.J. et al., 1995). К такому же эффекту приводит сверхэкспрессия р53: микроинъекцией мРНК р53 в ранние эмбрионы Xenopus laevis сопровождается остановкой или замедлением дробления клеток с последующим искажением клеточных движений, процессов эмбриональной индукции и тканевой дифференцировки (Hoever М. et al., 1994). При этом часть эмбрионов погибает, а выжившие имеют грубые изменения фенотипа. К ранней эмбриональной летальности приводит также гомозиготная делеция mdm2, контролирующего уровень р53 (Jones S.N. et al., 1995). Очевидно, что для нормального развития экспрессия р53 должна четко контролироваться в процессе эмбрио- и органогенеза. Вероятно, этот контроль тканеспецифичен и осуществляется на разных уровнях, возможно, включая функциональную инактивацию р53 белками рбЗ и р73 (см. гл. 2).
Показано, что в процессе развития р53 отвечает на разного рода генотоксические стрессы, включая тепловой шок, хемо- и Х-лучевое воздействие, значительно сокращая число дефектных эмбрионов/плодов (Norimura Т. et al., 1996; Wang В., 2001; Boreham D.R. et al., 2002). Таким образом, предполагается, что р53 в развитии организма выполняет двоякую функцию: во-первых, участвует в дифференцировке, во-вторых, координирует клеточные ответы на стрессы, действуя как тератогенный супрессор (Hall P.A. et al., 1997). р53 и ангиогенез
Онкосупрессорные функции р53 связаны не только с контролем клеточного цикла и апоптоза, но также с его способностью подавлять неоангиогенез, необходимый для опухолевой прогрессии. Антиангиогенные функции р53 обусловлены позитивной регуляцией ингибиторов ангиогенеза - Tsp-1 (Dameron К.М. et al., 1994), BAI1 (Nishimori Н. et al., 1997), GD-AIF (Van Meir E.G. et al., 1994); и негативной регуляцией стимуляторов ангиогенеза - HIF-la и VEGF (Ravi R. et al., 2000). Гены Tsp-1 (thrombospondin-1) и В All (brain-specific angiogenesis inhibitor 1) прямые транскрипционные мишени р53. Механизм р53-зависимой "ир"-регуляции GD-AIF (glioma-derived angiogenesis inhibitory factor) пока не установлен. "Down"-регуляция H1F-1 a (hypoxia-inducible f actor 1 а) и VEGF (vascular е ndothelial g rowth factor) осуществляется с помощью mdm2: р53 активирует транскрипцию mdm2, его белковый продукт опосредует убикитинирование и протеасомную деградацию HIF-la, в результате чего HIF-la перестает трансактивировать VEGF (Ravi R. et al., 2000). р53 и старение
Старение организма связывают в первую очередь с репликативным старением клеток, подчиняющихся "лимиту Хейфлика". Возможно, что старение связано также с состоянием системы репарации, не справляющейся с накоплением ДНК-повреждений, с оксидативным стрессом, и с градуальным истощением функций стволовых клеток.
Дисфункция теломер, обуславливающая репликативное старение, связана с критическим укорочением теломер в процессе репликаций ДНК, с дефектами белков, ассоциированных с теломерами и защищающих их одноцепочечный 3'-"хвост", или с прямым повреждением теломер. Показано, что клетка, в зависимости от состояния генетического аппарата, может ответить на эти события по-разному: состариться, умереть или выжить, приобретая геномную нестабильность, порождающую раковые клетки. Поэтому очевидно, что сама по себе дисфункция теломер - это лишь пусковой механизм процессов, зависящих от эффекторных генов и белков, определяющих дальнейшую судьбу клетки. Установлено, что важнейшими эффекторами, реагирующими на теломерную дисфункцию, являются компоненты р53- и pRb-сигнальных путей (Kim S. et al., 2002). Нормальные клетки с р53 и pRb дикого типа отвечают на дисфункцию теломер необратимой остановкой клеточного цикла, т.е. старением. Клетки, в которых pRb-путь поврежден, подвергаются р53-зависимому апоптозу. Те же клетки, в которых не работают ни р53, ни pRb-зависимые пути регуляции, выживают, преодолевают "лимит Хейфлика", доходят до "кризиса", т.е. полного истощения теломер, и либо умирают (р53-независимо), либо находят пути поддержания теломер, "иммортализуются", и, сохраняя геномную нестабильность, порождают раковые клоны (Kim S. et al., 2002). Поэтому считается, что старение -плата многоклеточных организмов за поддержание стабильности генома. С этой точки зрения старение - защитный механизм организма от развития рака, а р53 - основной "'экзекутор" старения, и в этом состоит "неприятная" сторона его работы (Donehower L.A., 2002; Kirkwood Т.В., 2002; Sharpless N.E. et al., 2002).
Есть данные, что с помощью р53 можно управлять процессами старения: инактивация р53 в стареющих мышиных эмбриональных фибробластах быстро возвращает их в клеточный цикл (Dirac A.M. et al., 2003), напротив, восстановление функций р53 в р53-нулевых иммортализованных раковых клеточных линиях заставляет их остановиться и "состариться" (Sugrue М. et al., 1997). Интересно, что в клетках мыши и человека сигнальные пути, идущие от дисфункции теломер, не идентичны: у мышей р16/р11Ь-зависимый ответ неактивен, поэтому для ликвидации G1-"ареста" клеточного цикла им достаточно потерять функции р53 (Smogorzewska А. et al., 2002). Считается, что стабилизация р53 в ответ на теломерную дисфункцию происходит вследствие накопления в клетке нарушений структуры ДНК и хромосом, которые детектируются клеточной машиной, распознающей ДНК-повреждения и включающей р53. К таким нарушениям относят: укорочение теломер с аккумуляцией в клетке G-богатых одноцепочечных фрагментов ДНК "TTAGGG", "обнажение" теломер вследствие удаления связанных с ними белков (в особенности это относится к белку TRF2), и слипание концов хромосом, что приводит к аномалиям их сегрегации в процессе митоза (Saretzki G. et al., 1999; Karlseder J. et al., 2002; Smogorzewska A. et al., 2002).
Кроме репликативного клеточного старения в процесс старения целого организма существенный вклад вносит, очевидно, система репарации ДНК, которая, вероятно, в какой-то момент жизни организма перестает справляться с аккумуляцией ДНК-повреждений и/или в ней самой происходят изменения, провоцирующие ускоренное старение. О связи р53 с системой репарации уже было сказано (см. раздел "р53 в процессах репарации и репликации ДНК" в гл. 4), особого внимания здесь заслуживает факт взаимодействия р53 с белком WRN, относящимся к семейству геликаз RecQ (Shen J. et al., 2001). Белок WRN уникален в семействе, поскольку он одновременно является экзонуклеазой, и в дополнение к раскручиванию двойной спирали устраняет сложные топологические аберрантные структуры ДНК. Установлено, что WRN высокогомологичен белку Xenopus laevis FFA-1, который раскручивает ДНК в сайтах инициации репликации (Blander G. et al., 1999). Терминальные мутации гена WRN связаны с аутосомно-рецессивным синдромом Вернера - синдромом преждевременного старения, для которого характерна геномная нестабильность с повышенным риском развития рака. Если нормальные фибробласты человека в культуре делятся не более 60 раз, то фибробласты пациентов с синдромом Вернера необратимо останавливаются уже после 20-ти делений. Установлено, что р53 и WRN дикого типа взаимодействуют друг с другом через их С-концевые домены
Blander G. et al., 1999). Но, мутации, связанные с синдромом Вернера, разрушают р53-связывающий домен WRN. Сверхэкспрессия WRN дикого типа повышает трансактивацию р53-респонсивных генов. Однако пока точно не установлено, к каким последствиям приводит образование комплекса между р53 и WRN. Предполагается, в таком комплексе р53 в ответ на ДНК-повреждение привлекается к сайтам инициации репликации и останавливает синтез поврежденной ДНК. Существует и противоположное мнение, что цель p53/WER-B3aHMOдействия - не активировать, а инактивировать р53, чтобы избежать р53-зависимого старения (Blander G. et al., 1999).
Старение также связывают с оксидативным стрессом - одним из "триггеров" р53-зависимого апоптоза (см. раздел "р53-зависимый апоптоз" в этой главе) (Sharpless N.E. et al., 2002). Оригинальный опыт подтвердил роль митохондрий в регуляции продолжительности жизни. Было показано, что повышение метаболизма культивируемых фибробластов человека простым повышением экстраклеточной концентрации пирувата, провоцирует их ускоренное старение с повышением уровней р53, р21, р16 и митохондриальных оксидантов и падением уровня внутриклеточного глутатиона. Повышение числа митохондрий в клетках с помощью митохондриального регулятора PGC-1 также сопровождалось прекращением роста клеток и их ускоренным старением (Xu D. et al., 2002).
ГЛАВА 5 РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ р53
Механизмы регуляции функций р53.
Поскольку р53 является ингибитором клеточного роста и индуктором апоптоза его функции должны тонко контролироваться, чтобы не допустить неадекватной активности белка в отсутствие стресса. Как уже отмечалось, хотя экспрессия р53 регулируется в процессе транскрипции и трансляции (см. главу 2), основной контроль экспрессии осуществляется на посттрансляционном уровне через управление стабильностью, субклеточной локализацией и активностью белка (Ryan К.М. et al., 2001). Чтобы в ответ на стресс р53 мог включить программы апоптоза или остановки клеточного цикла, время его жизни должно многократно возрасти, он должен локализоваться в ядре клетки и перейти в активированную, т.е. компетентную для сайт-специфического связывания респонсивных генов, форму. После завершения стресса, если клетка не пошла по пути апоптоза или старения, а успешно репарировала повреждения ДНК, р53 должен быстро деградировать и перейти в "фоновый" режим работы, чтобы позволить клетке дальше продвигаться по циклу. Считается, что главными механизмами регуляции функций р53 являются посттрансляционные ковалентные модификации белка и белок-белковые взаимодействия, модулирующие функциональную активность р53 (Meek D.W., 1999). Предполагается, что тип и аминокислотный сайт модификации р53, а также сигнальный путь и способ передачи стресс-сигнала на р53, зависят от характера этого сигнала (Giaccia A.J. et al., 1998). Например, активация онкогенов "включает" р53 преимущественно через его взаимодействия с белком ARF, а облучение - через ковалентные модификации N- и С-концевых доменов р53, причем ионизирующие и ультрафиолетовые лучи задействуют разные сигнальные пути и/или модифицируют разные аминокислотные остатки р53 (Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999). Ковалентные модификации р53 включают: фосфорилирование (дефосфорилирование), ацетилирование (деацетилирование), рибозилирование, О-гликозилирование, убикитинирование и модификации убикитин-родственным белком - SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier 1) - "сумойалирование".
Фосфорилирование р53.
In vitro показано, что существует множество потенциальных сайтов фосфорилирования р53, причем они сконцентрированы на N- и С-концевых доменах белка. У человека это серины 9, 15, 20, 33, 37, 315, 376, 371, 378, 392 и треонин 18; у мыши серины 4, 6, 9, 15, 18, 34, 309, 386 и треонины 73, 83. Множество протеинкиназ задействовано in vitro в этом процессе: CKI и CKII (casein kinase I and II), Cdks (cyclin dependent kinases), CAK (Cdk-activating kinase), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ATM (ataxia-teleangiextasia mutated), ATR (ATM and Rad3 related), JNK (Jun amino-terminal kinase), МАРК (mitogen-activated protein kinases): ERK1 и ERK2 (extracellular signal regulated kinase 1 and 2), PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), PKR (protein kinase activated by double-stranded RNA), Raf. In vivo, однако, достоверно пока показано участие в фосфорилировании р53 человека лишь трех киназ PIKK (phosphoinositide 3 kinase related kinases)-ceMeftcTBa: ATM, ATR и DNA-PK (Jimines G.S. et al., 1999; Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999).
Терминальные мутации гена ATM связаны с мультисистемным аутосомно-рецессивным заболеванием - атаксией-телеангиэктазией, сопровождающейся прогрессирующим разрушением мозжечка, телеангиэктазией, преждевременным старением, иммунологическими нарушениями, хромосомной нестабильностью и повышенной чувствительностью к ионизирующему облучение - риск развития рака при этом возрастает в 100 раз. Установлено, что протеинкиназа ATM активируется в ответ на ионизирующее (ИО), но не ультрафиолетовое (УФ) облучение (Khanna К.К. et al., 1993). Она ответственна за фосфорилирвание серинов 15 и 20, а также дефосфорилирование серина 376 р53 (все данные приводятся по р53 человека) (Lakin N.D. et al., 1999; Abraham R.T., 2001). Серин 15 ATM фосфорилирует непосредственно, а серин 20 через протеинкиназу hChk2/hCdsl (Caspari Т., 2000). Основным физиологическим последствием фосфорилирования этих сайтов считается освобождение р53 от негативной регуляции через mdm2, что ведет к стабилизации белка (см. раздел "Регуляция стабильности р53" в гл. 5). Есть данные, что ATM in vivo в ответ на ИО может также фосфорилировать серины 9, 33, 37 и 46 (Turenne G.A. et al., 2001; Saito S. et al., 2002). Предполагается, что дефосфорилирование серина 376 осуществляется через активацию пока неизвестной ATM-зависимой фосфатазы, это ведет к ассоциации р53 с белком 14-3-3 и его активации (Waterman M.J., 1998). Протеинкиназа ATR фосфорилирует in vivo серин 15 р53 (a in vitro - еще и серин 37) как при ионизирующем, так и при ультрафиолетовом облучении, однако кинетика ATR-зависимого ответа примерно на порядок медленнее в сравнении с АТМ-зависимым (Lakin N.D. et al., 1999; Abraham R.T., 2001). Показано, что ATM и ATR фосфорилируют p53 не только в ответ на ДНК-повреждающий стресс, вызванный облучением, но также в ответ на гипоксию (Hammond Е.М., 2002; Hammond Е.М., 2003), тепловой шок (Guan J., 2002; Miyakoda М., 2002) и повреждения ДНК химическими агентами (Adamson A.W., 2002). Главной мишенью DNA-PK также является серин 15 (in vitro еще серин 37), модификация которого происходит как следствие ДНК-разрывов и повреждений (Lakin N.D. et al., 1999). Другими вероятными кандидатами в киназы, фосфорилирующие р53 in vivo, являются NBS1 (р95 или нибрин) (Nijmegen breakage syndrom) - активируется при ИО (Tauchi Н., 2000), и протеинкиназа CKII, которая фосфорилирует серин 392 только в ответ на УФ (но не ИО) (Kapoor М., et al., 1998).
Наиболее "темное" звено в передаче стресс-сигнала на р53 через протеинкиназы - это "сенсор" повреждения. В отношении DNA-PK ситуация более-менее ясная - протеинкиназа работает в комплексе с гетеродимером Ku70/Ku80, который имеет высокую афинность к концам ДНК; он распознает и связывает одно- и двухцепочечные ДНК-разрывы, петли ДНК ("шпильки") и незащищенные концы теломер (Tuteja R. et al., 2000). Связывание Ku70/Ku80 с ДНК активирует каталитическую субъединицу DNA-PK. Есть также данные, что DNA-PK может образовывать сенсорный комплекс с р53, DNA-PK/Kus и р53 часто коиммунопреципитируются (Achanta G., 2001). Возможно, ATR является прямым сенсором ДНК-повреждений - установлено, что ATR непосредственно связывается с
ДНК, поврежденной ультрафиолетом, и это повышает ее активность (Unsal-Ka§maz К. et al., 2002). Каков механизм детекции первичного повреждения ДНК для ATM — пока неясно. По одной из версий аппаратом, воспринимающим ДНК-повреждения и передающим стресс-сигнал, вероятно, через серию посредников на ATM, являются члены Rad-группы белков: Radl7 , Rad 1, Rad9, Rad 26 и Husl (Abraham R.T., 2001). Белки Rad 1, Rad9 и Husl обладают структурным сходством с PCNA, как и PCNA они формируют трехмерный комплекс, который, возможно, окружает ДНК в области повреждения и образует "зажим". Белок Rad 17 гомологичен субъединице RFC (replication factor С), он ассоциирует с ней и, вероятно, участвует в управлении комплексом Rad 1/Rad9/Husl (Abraham R.T., 2001).
Другим "темным" местом в понимании того, как передается стресс-сигнал через протеинкиназы на р53, является сама природа клеточного стресса. Известно, что ИО вызывает образование в клетке активных радикалов кислорода (ROS), которые и приводят к появлению разрывов ДНК. УФ-облучение индуцирует образование в ДНК циклобутановых пиримидиновых димеров (80-90% повреждений) и других фотопродуктов, которые узнаются и исправляются системой эксцизионной репарации, ответственной в данном случае за появление ДНК-разрывов (Giaccia A.J. et al., 1998). Гипоксия, по-видимому, не связана с непосредственными повреждениями ДНК, хотя есть сведения, что в условиях кислородного голодания возрастает активность эндонуклеаз (Staler D.L. et al., 1992). Известно, что в ответ на экстремальную гипоксию ([02] < 0,02%), а также реоксигенацию ATM и ATR фосфорилируют р53 по серину 15, однако, что именно запускает цепь реакций, приводящих к активации этих киназ -неизвестно (Hammond Е.М., 2003). Неясен также механизм стимуляции ATM и DNA-РК, фосфорилирующих серии 15 при гипертермии (Guan J., 2002; Miyakoda М., 2002).
Ацетилирование р53.
In vitro и in vivo р53 ацетилируется в ответ на разные стрессы гистоновыми ацетилтрансферазами (HATS - histone acetyltransferases): р300/СВР и pCAF ацетилируют лизины 372, 373, 381 и 382 С- концевого домена р53, a pCAF - лизин 320 в области линкера, соединяющего ДНК-связывающий и тетрамеризационный домены (Lakin N.D. et al., 1999; Prives С. et al., 2001). Замечено, что ацетилирование стимулируется фосфорилированием N-конца р53 и подавляется негативным регулятором р53 - mdm2. Есть несколько гипотез функционального значения ацетилирования. Во-первых, традиционно считается, что подобные модификации С-конца и линкера р53 стимулируют ДНК-связывающую активность белка (Sakaguchi К., et al., 1998), хотя в последнее время появились данные, противоречащие этому мнению см. раздел "Регуляция активности р53"). Во-вторых, возможно ацетилирование повышает трансактивационную способность р53, рекрутируя гистоновые ацетилтрансферазы в промоторных областях р53-респонсивных генов (Barlev N.A. et al., 2001). Это облегчает ацетилирование гистонов и увеличивает доступность хроматина для аппарата транскрипции. В-третьих, предполагается, что ацетилирование может влиять на субклеточную локализацию р53, повышая концентрацию р53 в ядре клетки (см. раздел "Регуляция субклеточной локализации р53" в гл. 5) (Nakamura S. et al., 2000).
Ацетилирование р53 происходит в ответ на разные стрессы (чаще в ответ на ИО- или УФ-облучение). Показано, что даже экспрессия онкогенов, обычно активирующая р53 без ковалентных модификаций белка, иногда сопровождается ацетилированием р53. Так, экспрессия онкогена Ras индуцирует колокализацию р53 и СВР-ацетилтрансферазы в ядерных телах PML (promyelocytic leukemia protein), что приводит к ацетилированию р53 по лизину 382 (а также фосфорилированию по серину 46) и преждевременному старению клетки (Pearson М. et al., 2000).
По-видимому, ацетилирование р53 обратимо: р53 ассоциирует с дезацетилазами (HDACS - histone desacetylases) HDAC1 (через корепрессор mSin3A или PID) и hSir2 (Prives С. et al., 2001). Известно, что комплексы HDAC1 с корепресорами, как и hSir2, задействованы в трансрепресси ряда генов, hSir2 кроме того еще играет роль в определении продолжительности жизни и связан с "хроматиновым молчанием" теломер. Установлено, что hSir2 дезацетилирует р53 и является антагонистом PML/p53-индуцированного клеточного старения (Langley Е. et al., 2002). Предполагается, что дезацетилазы подавляют р53-зависимую транскрипцию. Возможно, это происходит благодаря тому, что ацетилированный р53, связанный с ДНК гена-мишени, "привлекает" к нему дезацетилазы, которые переводят хроматин в репрессированное состояние. Если это так, то ацетилирование можно рассматривать как маркер р53-активированных промоторов для их последующей инактивации (Prives С. et al., 2001). Не исключено, что это один из путей "выключения" р53 после прекращения клеточного стресса.
Рибозилирование,О-гликозилирование,"сумойалирование"и убикитинирование. р5 3.
Вероятно, поли(-АДФ-рибоз-)полимераза PARP-1 (poly-ADF-ribose-polimerase 1) также участвует в ковалентных модификациях р53 в ответ на повреждения ДНК. Обнаружено, например, что р53 рибозилируется по множеству аминокислотных остатков при обработке нейронов токсином МРТР, индуцирующим болезнь Паркинсона. При этом отмечается стабилизация и активация р53. Возможно, подобная индукция р53-ответа лежит в основе паркинсонизма и других видов нейрональной смерти (Mandir A.S. et al., 2002).
Показано, что энзиматическое О-гликозилирование in vitro и in vivo активирует р53. Сахарные остатки могут маскировать эпитоп к антителам РАЬ421 на С-конце белка, что сопровождается конститутивной активацией р53 (Shaw P. et al., 1996). Возможно, это происходит из-за подавления внутримолекулярных взаимодействий р53, удерживающих его в латентном (неактивном) состоянии (см. раздел "Регуляция активности р53"). Обнаружено также, что диабетическая гипергликемия связана с гликозилированием р53 и развитием р53-зависимого апоптоза (Fiordaliso F. et al., 2001).
Если значение модификаций р53 убикитином в регуляции стабильности и субклеточной локализации белка давно признано (см. раздел "Регуляция стабильности р53"), то роль модификаций р53 убикитин-подобным белком - SUMO-1 (в частности, по лизину 386) еще предстоит установить, т.к. полученные данные пока очень противоречивы (Kwek S.S. et al., 2001; Melchior F. et al., 2002).
В целом, считается привлекательной упрощенная модель, согласно которой индуцированные стрессом ковалентные модификации N-конца р53 стабилизируют белок, защищая его от деградации, а С-конца - направляют в ядро и активируют, переводя латентный р53 в ДНК-связывающую конформацию. Тот факт что, что мутации основных сайтов фосфорилирования и ацетилирования р53 редко обнаруживаются в опухолях человека, а также то, что полученные in vitro такие мутанты р53 продолжают "включаться" при повреждениях ДНК, наводит на мысль, что ковалентные модификации не столь существенный или не единственный путь индукции р53 при ДНК-повреждениях. Тем не менее, эта точка зрения постепенно теряет свой вес, т.к. уточняются все новые и новые типы и сайты модификаций, которые, вероятно, создают параллельные пути "включения" белка.
До сих пор не установлены ранние этапы сигнальных путей, ведущих к р53 от множества стрессов, которые не связаны напрямую с повреждениями ДНК (блокада клеточной адгезии, истощение пула рибонуклеотидов и др.). Известно, что кроме ковалентных модификаций существенное влияние на функции р53 оказывают белок-белковые взаимодействия. Активация клеточных и вирусных онкогенов (Ras, туе, Е1А) задействует в первую очередь сигнальный путь, ведущий к стабилизации р53 через его взаимодействие с белком ARF (alternative reading frame), который является продуктом альтернативной рамки считывания антионкогена INK4A (Meek D.W., 1999). Этот ген кодирует два онкосупрессорных белка: р 16INK4A и pl4ARF (у человека) или p^ARF мьшш) если pl6INK4A останавливает клеточную пролиферацию, ингибируя активность комплексов циклин D/CDK4(6), что предотвращает фосфорилирование pRb и вход клетки в S-фазу цикла, то ARF связывает негативный регулятор р53 - mdm2, образуя тройной комплекс ARF/mdm2/p53 (Zhang Y. et al., 1998). Это ингибирует шёт2-зависимую деградацию р53 и его транспорт из ядра в цитоплазму, что приводит к стабилизации белка и его сосредоточению в ядре клетки. По-видимому, ARF может связывать р53 и в отсутствие mdm2, что указывает на его способность разрушать комплекс p53/mdm2 через механическое вытеснение mdm2 (Kamijo Т. et al., 1998). Показано, что активированные онкогены через разные сигнальные пути индуцируют экспрессию ARF, белковый продукт которого многократно повышает уровень р53 в клетке. Например, туе селективно индуцирует экспрессию мРНК ARF, не влияя на уровень мРНК pl6INK4A, следствием чего является десятикратное повышение концентрации р53 в ядре клетки (Zindy F. et al., 1998). Число белков, взаимодействующих с р53 и влияющих на его стабилизацию, активность и субклеточную локализацию, постоянно растет. Так, пи!т2-независимая стабилизация р53 может осуществляться через взаимодействие р53 с JNK (см. раздел "Регуляция стабильности р53" в гл. 5). ДНК-связывающая и транскрипционная активность р53 модулируется белками, связывающими коровый (53ВР1, 53ВР2, ASPP и др.) и полипролиновый (с-АЫ) домены р53 (Ruppert J.M. et al., 1993; Walker K.K. 1996; Rappoldl. et al., 2001; Samuels-Lev I. et al., 2001). Примечательно, что активность белков, контактирующих с р53, тоже, по-видимому, управляется с помощью ковалентных модификаций этих белков, причем часто этим "модификатором" оказывается протеинкиназа ATM, в частности, это касается mdm2, 53ВР1 и с-АЫ. Очевидно, что к изменению р53-зависимой регуляции клеточного цикла и апоптоза приведут любые повреждения сигнальных путей, лежащих "выше" и "ниже" уровня р53 - т.е. повреждения индукторов и эффекторов р53.
Регуляция стабильности р53. р53 относят к группе короткоживущих белков с быстрым циклом оборачиваемости. В нормальной клетке время его жизни колеблется в интервале 5-20 минут (Giaccia A.J. et al., 1998). При цитотоксическом и ДНК-повреждающем стрессах время жизни белка многократно возрастает за счет прекращения его деградации, т.е. происходит стабилизация р53, что приводит к быстрому повышению концентрации белка в клетке. Главным модулятором времени жизни р53 является белок mdm2 (mouse double minute clone 2), или hdm2 (human double minute clone 2). Ген mdm2 является прямой транскрипционной мишенью р53. Белки р53 и mdm2 вместе образуют авторегуляторную петлю отрицательной обратной связи: р53 активирует транскрипцию mdm2, белковый продукт которого связывает N-концевой трансактивационый домен р53 в зоне 17-23 аминокислотных остатков, образуя белок-белковый комплекс p53/mdm2. Это, во-первых, блокирует трансактивационную деятельность р53, во-вторых, стимулирует деградацию р53 и его экспорт из ядра в цитоплазму (Ashcroft М. et al., 1999). Mdm2-опосредованное подавление трансактивационных способностей р53 связано с маскировкой основного сайта связывания с р53 главных транскрипционных факторов (см. раздел "N-концевой трансактивационный домен" в гл. 3). Mdm2-HHfly4npoBam^ деградация р53 обусловлена тем, что mdm2 работает как ЕЗ-убикитиновая лигаза, присоединяющая убикитин к аминокислотным остаткам лизина на С-конце р53, что делает его мишенью протеасом. А тс!т2-зависимый транспорт р53 из ядра, по-видимому, связан с активностью сигнала ядерного экспорта mdm2 (см. раздел "Регуляция субклеточной локализации р53" в гл. 5). Стабилизация р53 в ответ на стрессы связана главным образом с защитой р53 от mdm2 через разрушение комплекса p53/mdm2. В зависимости от типа стресса это достигается разными путями: посттрансляционными модификациями р53 (фосфорилированием N-конца белка - серинов 15 и 20) и mdm2, экспрессией белков, которые ингибируют функции mdm2 (например, ARF), а также прямым подавлением экспрессии mdm2 (Ryan К .М. et al., 2001). Установлено, что mdm2, как и р53 является мишенью протеинкиназы ATM, которая фосфорилирует его, в частности, по серину 395, что подавляет транспортную активность белка, предотвращая пк1т2-зависимый экспорт р53 из ядра (Maya R. et al., 2001). По-видимому, mdm2 фосфорилируется также и по другим сайтам, что препятствует его взаимодействию с р53.
Обнаружено, что тс!т2-независимое убикитинирование р53 может индуцироваться протеинкиназой JNK (Jun-N-(amino)-terminal kinase). В отсутствие стресса JNK ассоциирует с центральным ДНК-связывающим доменом р53 (аминокислоты 97-155) и подобно mdm2 функционирует как ЕЗ-убикитиновая лигаза, направляя р53 на деградацию в протеасомах. Индуцированная стрессом активация JNK через МЕКК1 приводит к JNK-опосредованному фосфорилированию р53, разрушающему комплексы p53/JNK и p53/mdm2, вследствие чего убикитинирование р53 подавляется, и белок стабилизируется (Fuchs S.Y. et al., (1998).
Регуляция активности р53.
Считается, что р53 может находиться в клетке в двух функциональных состояниях: латентном (не взаимодействует с ДНК-консенсусом) и активированном (высокоафинно связывается с ДНК-консенсусом респонсивных генов). Предполагается, что изменение сродства р53 к консенсусной ДНК связано с аллостерической регуляцией белка: латентный р53 находится в Т ^епзе)-конформации, а активированный в R (ге1ахес1)-конформации. Существует модель'Т - R" перехода, согласно которой переход из одной конформации в другую регулируется С-концевым доменом р53 (см. раздел "С-концевой регуляторный домен " в гл. 3). В Т-конформации взаимодействие С-концевого регуляторного домена с другим участком р53-тетрамера закрывает ДНК-связывающий домен и "запирают" молекулу в неактивном для связывания с ДНК состоянии. При стрессе ковалентные модификации С-концевого домена разрушают этот внутримолекулярный контакт, ДНК-связывающий домен открывается и р53 переходит в R-конформацию. Предполагается, что внутримолекулярный контакт происходит между зонами эпитопа к антителам РАЬ421 (аминокислоты 371 - 380) и участком пролинового или ДНК-связывающего доменов (Muller-Tiemann B.F. et al., 1998). К ковалентным модификациям стимулирующим "Т -R" переход относят: дефосфорилирование серина 376, фосфорилирование серина 392, ацетилирование лизинов 320, 372, 373, 381 и 382, О-гликозилирование РАЬ421-эпитопа и модификации лизина 386 белком SUMO-1 (см. раздел "Механизмы регуляции функций р53" в гл. 5). Несмотря на привлекательность этой модели ряд данных не подтверждает автоингибиторную роль С-концевого домена р53 и, в частности, роль ацетилирования в стимуляции сайт-специфического связывания р53 с ДНК. Например, in vitro показано, что ацетилирование р53 стимулирует его связывание только с короткими олигонуклеотидами, содержащими р53-респонсивный консенсус гена р21 Wafl/CiP\ Но никак не влияет на его связывание с тем же консенсусом в составе длинных молекул ДНК (Espinosa J.M. et al., 2001). Более того, обнаружено, что р53 с делецией С-концевого домена, обычно стимулирующей в экспериментах связывание белка с ДНК, на самом деле менее эффективно взаимодействует с промотором p21WafJ/Cipl, находящимся в голой или хроматинизированной ДНК. Поэтому, не исключается, что ацетилирование С-конца р53 нужно не столько для перевода белка в ДНК-связывающую конформацию, сколько для привлечения коактиваторов транскрипции рЗОО/СВР и pCAF к промоторам р53-респонсивных генов, что стимулирует трансактивацию генов-мишеней (Prives С. et al., 2001).
Регуляция субклеточной локализации р53.
В отсутствие стресса субклеточная локализация р53 варьирует в зависимости от фазы клеточного цикла: примерно с середины фазы G1 до входа в S-фазу белок преимущественно сосредоточен в ядре, затем, по мере прохождения по циклу, ядерно-цитоплазматический баланс р53 все больше сдвигается в сторону цитоплазмы. При стрессе происходит быстрая концентрация р53 в ядре клетки (Jimenes G.S. et al., 1999). Теоретически это может достигаться как за счет блокады ядерного экспорта, так и за счет стимуляции ядерного импорта. р53 транспортируется в цитозоле к ядру по сетям микротрубочек помощью динеина, а вход в ядро контролируется тремя сигналами ядерного импорта р53: NLS1 (nuclear localization signal) (316-325 а.о.), NLS2 (369-375 а.о.) и NLS3 (379-384 а.о.) (Dang C.V. et al., 1989). Их них NLS1, по-видимому, основной, т.к. мутации в нем полностью блокируют ядерный импорт, тогда как мутации в NLS2 и NLS3 способны лишь усилить эффект мутаций в NLS1. р53 имеет также собственный сигнал ядерного экспорта - NES (nuclear export signal) (340-351 а.о.), он богат лейцином и чувствителен к лептомицину В, который подавляет экспорт р53 из ядра и стабилизирует белок, из чего можно заключить, что для деградации р53 в протеасомах необходима его предварительная транспортировка в цитоплазму (Stommel J.M. et al., 1999). О механизмах экспорта р53 накопленная информация противоречива. Преобладает точка зрения, согласно которой активный транспорт р53 в цитоплазму осуществляется с помощью mdm2, который как и р53 имеет NLS и NES и мигрирует из цитозоля в ядро и обратно (Jimenes G.S. et al., 1999; Ryan K.M. et al., 2001). Считается, что, во-первых, mdm2, образуя комплекс с р53, выводит его из ядра и направляет в протеасомы цитоплазмы, где оба белка подвергаются убикитин-зависимой деградации. Во-вторых, mdm2, сам обладающий убикитин-лигазной активностью, присоединяет убикитины к С-концу р53 (к лизинам 370, 372, 373, 381, 382, 386), и это не только способствует деградации р53, но и каким-то образом инициирует экспорт белка (Gu J. et al., 2001). Возможно, это связано с тем, что убикитинирование С-конца р53 приводит к конформационным изменениям р53-тетрамера и демаскирует его NES. Обнаружено, что mdm2 эффективно связывает и убикитинирует р53, только если р53 находится в форме тетрамера. Трехмерный анализ тетрамеризационного домена р53 показал, что NESs располагаются на внутренней стороне димеров, соединяющихся в тетрамер. Поскольку NES открыт только в мономерной или димерной форме р53, рецептор ядерного экспорта не узнает р53 в форме тетрамера (Stommel J.M. et al., 1999). По-видимому, тетрамеризация р53 способствует его накоплению в ядре и блокаде экспорта. Хотя по некоторым данным демаскировка NES р53 может происходить и без разрушения терамера (Gu J. et al., 2001). Вероятнее, что убикитинированный р53 покидает ядро в форме мономера, однако экспортируется ли он только за счет собственного NES или за счет NES mdm2 - вопрос спорный.
Замечено, что ацетилирование влияет на субклеточную локализацию р53, повышая его концентрацию в ядре, и что mdm2 подавляет ацетилирование белка (Prives С. et al., 2001). Возможно, это объясняется конкуренцией ацетилтрансфераз и mdm2 за лизиновые аминокислотные остатки С-конца р53, которые являются общими мишенями для ацетилирования и убикитинирования (например, лизины 372, 373, 381, 382).
Таким образом, при клеточном стрессе аккумуляция р53 в ядре происходит за счет его ускользания от тс1т2-зависимого убикитинирования (см. раздел "Регуляция стабильности р53" в гл. 5) и подавления пк!т2-или NESp53 -зависимого экспорта, а не за счет стимуляции ядерного импорта (Jimenes G.S. et al., 1999).
ГЛАВА6 РОЛЬ р53 В ОНКОГЕНЕЗЕ
Процессы канцерогенеза сопряжены с активацией онкогенов и инактивацией генов-супрессоров опухолевого роста. Установлено, что потеря функций р53 дикого типа в клетке, вступившей на путь опухолевой прогрессии, дает ей значительные селективные преимущества и является мощным толчком к дальнейшей трансформации. Инактивация р53 происходит как на ранних, так и на поздних этапах развития раковой опухоли в зависимости от типа рака, и сопровождается повышением туморогенности, инвазивности и метастатической активности клеток (Ко L.J. et al., 1996; Levine A.J., 1997). Изменения функций р53 обнаружены в подавляющем большинстве раковых опухолей человека. В 50% случаев они связаны с мутациями гена р53, кроме того, в опухолях, сохраняющих р53 дикого типа, его функции часто нарушены дефектами путей стабилизации р53 (сверхэкспрессией hdm2, инактивацией ARF, экспрессией Еб HPV.), изменением субклеточной локализации белка ("заякориванием" на цитоплазматических структурах: рибосомах, элементах цитоскелета, на hsp70; нарушением ядерно-цитоплазматического баланса), поражением эффекторов р53 (р21, pRb, bax и др.) или его индукторов (Ashcroft М. et al.,1999; Jimenes G .S. et al., 1999). Известно, что p53 - одна из главных мишеней вирусных онкогенов, поскольку размножение вирусов, использующих репликативный аппарат пораженной клетки, возможно лишь при активной клеточной пролиферации; р53, детектирующий вирусную инфекцию и включающий защитные механизмы апоптоза и остановки клеточного цикла, тем самым подавляет их размножение. Поэтому многие вирусы (SV40, вирус гепатита В, аденовирусы, папилломавирусы, вирусы Эпштейн-Барра и др.), используя различные механизмы, ингибируют р53. Так, например, большой Т антиген SV40, связываясь с центральным доменом р53, подавляет его ДНК-связывающую активность (Jenkins J.R. et al., 1988); папилломавирусный белок Е6, связываясь с N-концом р53, стимулирует его убикитин-зависимую деградацию в протеасомах (Thomas М. et al., 1999); Х-белок вируса гепатита В удерживает р53 в цитоплазме, не позволяя ему войти в ядро клетки (Wang X.W. et al., 1994).
Данные молекулярной эпидемиологии рака показывают, что 50% раковых опухолей человека содержат мутации гена р53, из них 74% представлены миссенс-мутациями, приводящими к продукции полноразмерных мутантных белков, остальные 26% составляют мутации, прекращающие синтез белка: делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания, мутации, приводящие к нарушению сплайсинга мРНК (Hollstein М. et al., 1994; Hollstein М. et al., 1997; Hainaut P. et al., 1997; Hussain S.P. et al., 1998). Столь высокий процент миссенс-мутаций нехарактерен для других генов-супрессоров опухолевого роста. Обнаружено, что большая часть этих мутаций группируется в центральном ДНК-связывающем домене р53, с максимальной частотой возникновения в нескольких горячих точках: R175, G245, R248, R249, R273, R282. После тщательного исследования кристаллической структуры ДНК-связывающего домена, соединенного с консенсусной ДНК (Cho Y. et al., 1994), прояснились молекулярные основы этого феномена (см. раздел "ДНК-связывающий домен р53" в гл. 3). Оказалось, что мутации р53 в горячих точках корового домена либо непосредственно разрушают зоны контакта р53 с ДНК-консенсусом ("контактные" мутации, или мутации первого класса). Либо приводят к конформационным изменениям ДНК-связывающего домена, в результате которых он опять-таки теряет способность ассоциировать с ДНК ("конформационные" мутации, или мутации второго класса) (May P. et al., 1999). И в том и в другом случаях результатом является подавление транскрипционной активности р53, причем разные р53-мутанты сильно различаются по своему трансформирующему потенциалу. Иммунохимический анализ р53 показал, что р53 дикого типа, как и миссенс-мутанты р53 первого класса, сохраняющие конформацию белка дикого типа, узнаются атителами РАЫ620 (человек) и РАЬ246 (мышь). Эти антитела, в отличие от большинства моноклональных антител к р53, распознающих линейные эпитопы на N- и С-концах белка, связывают специфические конформационные эпитопы, разрушающиеся при денатурации белка. Миссенс-мутанты второго класса связываются с антителами РАЬ240 (человек), которые узнают эпитоп корового домена р53, скрытый в белке дикого типа. Соответственно, в первом случае р53 имеет фенотип РАЫ620+/ РАЬ240-, а во втором -РАЫ620-/ РАЬ240+ (May P. et al., 1999).
Необычно высокий процент именно миссенс-мутаций р53 в раковых опухолях человека, и тот факт, что опухоли, экспрессирующие мутантный р53, более агрессивны и труднее поддаются лечению, чем те, в которых, р53 просто отсутствует, возможно объясняется тем, что некоторые миссенс-мутанты р53 не просто теряют свои антипролиферативные онкосупрессорные функции ("loss of fimction''-мутанты), но приобретают новые активности, несвойственные белку дикого типа ("gain of function"-мутанты) (Sigal A. et al., 2000). Активные исследования in vitro и in vivo миссенс-мутантов p53, показали, что многие из них способны при коэкспрессии с белком дикого типа подавлять его функции и олигомеризоваться с р53 дикого типа. Это позволило обнаружить третий тип миссенс-мутаций р53 - доминантно-негативных, или трансдоминантных, белковые продукты которых ответственны за инактивацию р53 дикого типа (Blagosklonny M.V., 2000).
Gain of function''-мутации р53.
Обнаружено, что некоторые мутантные р53 с аминокислотными заменами в "горячих точках" ДНК-связывающего домена белка способны повышать транскрипцию ряда генов, не являющихся транскрипционными мишенями р53 дикого типа. К ним относятся гены, белковые продукты которых стимулируют клеточную пролиферацию:
- EGFR (epidermal growth factor receptor) (Ludes-Meyers J.H. et al., 1996),
- MDR-1 (multiple drug resistance 1) (Lin J. et al., 1995),
- hIL6 (human interleukin 6) (Margulies L. et al., 1993),
- hHSP70 (human heat shock protein 70) (Tsutsumi-Ishii Y. et al., 1995),
- c-myc (Frazier M.W. et al., 1998) (Frazier M.W. et al., 1998),
- PCNA (proliferating cell nuclear antigene) (Deb S. et al., 1992),
- IGF2 (insulin-like growth factor 2) (Lee Y.I. et al., 2000),
- HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) ( Subler M.A. et al., 1994), ген dUTF-азы (Pugacheva E.N. et al., 2002).
Другая группа "gain of function"-мутантов, подавляет транскрипцию некоторых генов, например, ген ингибитора ангиогенеза Tspl (thrombospondin-1), который в норме, напротив, трансактивируется р53 дикого типа (Grant S.W., 1998). Вследствие мощного онкогенного потенциала миссенс-мутанты р53, приводящие к появлению "gain of function''-фенотипа, были названы "демонами хранителя генома", в противовес р53 дикого типа - "хранителя целостности генома" (Sigal A. et al., 2000). Однако, каков на самом деле механизм, обуславливающий появление новых функций мутантных р53 - вопрос спорный. По этому вопросу существует несколько гипотез. Во-первых, "gain of function''-мутанты могут действовать через доминантно-негативную инактивацию других белков р53-семейста: разных изоформ рбЗ и р73 (см. главу 1). Во-вторых, возможно, они действительно приобретают способность трансактивировать некоторые промоторы, поскольку, показано, что миссенс-мутанты с дополнительной двойной мутацией в ко донах 22/23, критичных для трансактивации, теряют эту способность (в частности, это относиться к трансактивации MDR-ltt с-тус) (Sigal A. et al., 2000). Причем, установлено, что для активации транскрипции таким р53-мутантам, как и р53 дикого типа, необходим тетрамеризационный домен: подавление олигомеризации блокирует их активность (Lanyi A. et al., 1998; Chene P. et al., 1999; Atema A. et al., 2002). Однако, одним из наиболее простых объяснений "доминантно-позитивного" эффекта может быть потеря некоторых, но не всех функций р53 дикого типа (Blagosklonny М.У., 2000). Например, переставая активировать транскрипцию низкоаффинных р53-респонсивных промоторов (Вах), мутант может продолжать трансактивировать высокоаффинные промоторы это неизбежно приводит к дисбалансу функций в клетке. Если мутантный р53 теряет лишь часть своих функций и аккумулируется в клетке за счет стабилизации, не исключено, что "gain of function"- фенотип есть просто следствие значительного преувеличения оставшихся функций р53 (Blagosklonny M.V., 2000). Изучение новых активностей мутантных р53 осложняется тем, что эффекты "gain of function''-мутаций часто осложняются эффектами доминантно-негативных мутаций р53, проявляющимися в клетке одновременно. Эти эффекты могут быть аддитивными, и их трудно, отделить друг от друга (Roemer К. et al., 1999; Sigal A. et al., 2000).
Доминантно-негативные, или транс-доминантные, мутации р53.
Термин "доминантно-негативная" мутация первоначально был предложен в связи с появлением новой стратегии инактивации генов на белковом уровне с целью идентификации их функций: клонированный ген специально изменялся таким образом, чтобы его мутантный продукт при сверхэкспрессии ингибировал белок дикого типа (Herskowitz I., 1987). Такие мутации были названы "доминантными", поскольку их фенотип должен был проявляться в присутствии гена дикого типа, и "негативными" - из-за подавления функций нормального гена. Подобный механизм инактивации генов на белковом уровне существует и в природе. Для некоторых генов верно представление о том, что доминантно-негативная мутация - это трансдоминантная мутация, т. е. мутация, которая возникает в одном из аллелей гена и ингибирует функцию аллеля дикого типа (в отличие от цис-доминантных "loss of function''-мутаций, которые не влияют на продукт аллеля дикого типа). Существует общая теоретическая модель ингибиторного влияния доминантно-негативных мутаций, т.е. модель доминантно-негативного механизма. Если речь идет о мономерных белках, считается, что мутантный белок конкурирует с белком дикого типа за молекулярные мишени. В мультимерных белках более вероятна гетероолигомеризация мономеров дикого типа и транс доминантного мутанта, которая сопровождается образованием неактивных мультимерных комплексов (Herskowitz I., 1987). Предполагается, что гетероолигомеризация может сопровождаться "наведением" мутантной конформации на белок дикого типа.
В отношении р53 обычно считается, что доминантно-негативная (или т/?анс-доминантная) мутация - это миссенс-мутация центрального ДНК-связывающего домена, которая делает невозможным взаимодействие р53 с ДНК-консенсусом и вследствие этого блокирует транскрипционную активность белка (Branchmann R.K. et al., 1996; Epstein C.B. et al., 1998; Blagosklonny M.V., 2000). Доминантно-негативный (или трансдоминантный) эффект обычно подразумевает олигомеризацию мутантного белка с белком дикого типа, что приводит к появлению функционально неактивных тетрамерных комплексов (Milner J. et al., 1991a) (рис. 1). Замечено, что для выраженного доминантно-негативного эффекта обычно требуется сверхэкспрессия мутанта (Sun Y. et al., 1993; Park D.J., et al., 1994).
Обнаружено, что разные трансдоминантные мутанты корового домена р53 обладают различной аффинностью к ДНК и могут иметь как мутантную конформацию, так и конформацию белка дикого типа (Chene P. et al., 1998). При этом чем слабее мутантный белок связывает р53-респонсивный консенсус, тем более выражен его трансдоминантный потенциал. Вместе с тем, показано, что выраженность доминантно-негативного эффекта зависит не только от природы мутации, но и от природы р53-респонсивного элемента: связывание р53 дикого типа с низкоаффинными ДНК-консенсусами легче ингибируется доминантно-негативными мутантами, чем
Механизм инактивации р53 дикого типа его трансдоминантными ингибиторами
Доменная организация р53-мономера:
Трансакти-вацнонный
Проли-новый
Тетрамеры р53:
ДНК-связывающий 1 >'■ р.1МГ|<||ч. irfllHIIIIIIIIII
Регуля-торный
- мономер р53 дикого типа
- мономер мутантного р53
88 81
Нефункциональные гомо- и гетероолигомеры р53 связывание с высокоаффинными консенсусами (Zacharatos P.V. et al., 1999; Blagosklonny M.V. et al., 2001). Т.е. существует, видимо, "континуум" трансдоминантных мутантов р53, различающихся по способности ассоциировать с ДНК, начиная от незначительного ослабления ДНК-связывания, и кончая полной невозможностью контакта, и "континуум" р53 респонсивных элементов, также различающихся по своей силе (см. раздел "р53-зависимая трансактивация" в гл. 4). Интересно, что у человека природа по какой-то причине отобрала не самую эффективную последовательность ДНК-связывающего домена: эксперименты, проведенные в дрожжах показали возможность существования не только доминантно-негативных р53-мутантов, но также и "супертранс'-мутантов, связывающих р53-респонсивные элементы и активирующих транскрипцию с большей силой, чем нативный р53 дикого типа (Inga A. et al., 2001).
Показано, что трансдоминантной активностью по отношению к р53 дикого типа обладают не только миссенс-мутанты р53, но также фрагменты полноразмерного р53: р53 без N-концевого трансактивационного домена, р53 без N-концевого и ДНК-связывающего доменов, а также изолированный олигомеризационный домен белка (Shaulian Е. et al., 1992; Waddel S. et al., 2001) (рис. 2). Во всех трех случаях происходит угнетение транскрипционной активности полноразмерного р53 дикого типа, коэкспрессирующегося с этими трансдоминантными ингибиторами. Возможно, что транс доминантные фрагменты р53 действуют аналогично AN-изоформам рбЗ и р73 (см. гл.1). Установлено, что олигомеризационный домен р53 необходим и достаточен для проявления доминантно-негативной инактивации р53 дикого типа и таким образом он, по-видимому, является минимальным трансформирующим доменом белка (Shaulian Е. et al., 1992).
In vitro возможность олигомеризации белков р53 мутантного и дикого типа показана неоднократно. Более того, обнаружено, что при котрансляции матриц мутантной и "дикой" форм белка образуются гетерокомплексы, обладающие мутантной конформацией, т.е. трансдоминантный мутант р53 действует на р53 дикого типа подобно прионам, переводя белок в аномальную конформацию (Milner J. et al., 1991a; Milner J., 1995; Blagosklonny M.V., 2000). Однако замечено, что подобный эффект наблюдается только при котрансляции белков, а при смешивании мутантного и "дикого" р53, синтезированных отдельно друг от друга, гетерокомплексы не образуются. Также показано, что в условиях, разрешающих быструю олигомеризацию, мутантный р53 не обладает сродством к р53 дикого типа (Milner J. et al., 1991b).
Трансдоминантные ингибиторы р53
1. In vivo - р53 раковых клеток с миссенс-мутациями в зоне ДНК-связывающего домена, которые подавляют взаимодействие белка с ДНК р53-респонсивных генов-мишеней.
Трансакти-вационный
Проли-новый
ДНК-связывающий
Ггт рямсри- ч Регуля
IIIIIIII4III ми торный tttltrttlt rt tl
Миссенс-мутации 2. In vitro - фрагменты полноразмерного р53 дикого типа: b) c)
Проли-иовый
ДНК-связывающий
Iripil4l'|lll-|
-.III HUH HIIHj
Регуля-торный
ДНК-связывающий
Гораисри-jaiiHiiiiiiMii
Регуля-торнын li'i|iiiiii|)ii-laiiHOinibiii
Регуля-торный ф "Минимальный трансформирующий домен р53"
Детальное исследование биогенеза р53-тетрамера показало, что димеры р53 образуются еще в процессе трансляции на полисомах, а тетрамеры посттрансляционно через димеризацию димеров уже в растворе (Nicholls C.D. et al., 2002). Это значит, что потенциально возможно существование только одного типа гетеротетрамеров: "димер дикого типа//трансдоминантный димер". Причем в данном случае гетеротетрамер теряет ДНК-связывающую способность без конформационных изменений димера дикого типа, а просто из-за присутствия в его составе "некомпетентного партнера", мешающего ассоциации тетрамера с ДНК (Nicholls C.D. et al., 2002).
Таким образом, существуют определенные противоречия как в объяснении механистического аспекта гетероолигомеризации, так и в представлениях о степени сродства доминантно-негативного мутанта к белку дикого типа. Конформационная модель доминантно-негативного эффекта предполагает "прионо-подобное" поведение мутантов р53, хотя в действительности мутантные р53 не обладают характеристиками инфекционного белка и не могут "размножаться". Кроме того, "прионо-подобная" модель не может объяснить три факта: №1) обычно для достижения доминантно-негативного эффекта требуется значительный избыток мутантного белка по отношению к белку типа; №2) р53-мутанты, сохраняющие конформацию белка дикого типа тем не менее способны вызывать доминантно-негативный эффект (Chene P. et al., 1998); №3) гетероолигомеризация вообще не всегда нужна для проявления доминантно-негативного эффекта (Joers, A. etal., 1998), например, трансактивация р53-респонсивного промотора олигамеризационно-дефектным мутантом может быть подавлена трансдоминантным мутантом R175H (Subler М. et al., 1994).
Модель, "некомпетентного партнера" (Nicholls C.D. et al., 2002) объясняет факт №2, но также не объясняет факта №3. Предполагается, что в некоторых случаях доминантно-негативный эффект связан не с процессами олигомеризации, а с трансрепрессирующей активностью мутантных р53, вызванной конкуренцией с транскрипционными факторами за кофакторы, например р300/СВР (см. раздел "Механизмы регуляции функций р53" в гл. 5) (Lill N. et al., 1997; Ryan K.M. et al., 1998).
Факт №1 обычно объясняют аномальной стабилизацией эндогенного трансдоминантного мутанта за счет его ускользания от тс!т2-зависимой деградации, приводящей к сверхэкспрессии (см. раздел "Регуляция стабильности р53" в гл. 5). Но есть мнение, что в гетерозиготах, несущих т/ганс-доминантный аллель и аллель дикого типа р53, стабилизация мутантного р53 невозможна, поскольку активность р53 дикого типа заставляет mdm2 направлять на деградацию оба белка (Blagosklonny M.Y., 2000). Если это так, то стабилизация мутантного р53 не произойдет до тех пор, пока аллель дикого типа не будет утрачен. Например, клетки гетерозигот с синдромом Ли-Фраумени, несущие терминальную мутацию р53 по кодону 248, содержат равные количества р53 дикого типа и мутанта, но при инактивации аллеля дикого типа наблюдается стабилизация мутанта (Srivastava, S. et al., 1992; Bhatia, К. et al., 1993).
В связи с этим возникает наиболее фундаментальный вопрос: доминантны ли на самом деле доминантно-негативные мутации р53 (рис. 3)? Подавляющее большинство опытов, в которых не контролируются дозы генов р53 дикого типа и мутанта (Chen P-L. et al., 1990), в том числе многочисленные опыты с эктопической экспрессией трансдоминантных мутантов р53 в клетки с эндогенным р53 дикого типа, демонстрируют подавление функциональной активности р53 дикого типа. Это, казалось бы, подтверждает доминантную природу этого класса миссенс-мутаций р53 (Biron С.Н. et al., 1995; Hegi M.E. et al., 2000; De Yries A. et al., 2002). Однако, тот факт, что для достижения доминантно-негативного эффекта обычно требуется сверхэкспрессия мутанта, заставляет в этом усомниться. До сих пор преобладает мнение, что в двухаллельной конфигурации р53 "дикий тип//мутант" необходимый для доминирования избыток мутанта достигается за счет большего времени его жизни. Но использование бицистронных и двунаправленных векторов, обеспечивающих равную транскрипцию кДНК доминантно-негативного мутанта и р53 дикого типа, подтверждает доминирование фенотипа дикого типа р53 (Frebourg Т. et al., 1994; Aurelio O.N. et al., 2000). Причем, количественное отношение мутаного белка к белку дикого типа в условиях равных доз генов колеблется в диапазоне 1,50 - 1,91 (Aurelio O.N. et al., 2000). Есть также данные, что при коэкспрессии трансдоминантного и дикого типа р53 происходит лишь частичная утрата функций р53 дикого типа. Например, обнаружено, что некоторые трансдоминантные р53-мутанты рецессивны для трансактивации p21Wafl/Cipl, но доминантны для трансактивации В ах; это приводит к избирательному угнетению только проапоптотических функций р53 дикого типа, и, возможно, объясняется разной степенью сродства мутанта к ДНК-связывающим консенсусам p21Wafl/Ci-pl и Box (Friedlander P. et al., 1996; Ryan K.M. et al., 1998; Aurelio O.N. et al., 2000).
Представление о том, что доминантно-негативные мутации р53 доминантны, а не рецессивны, настолько укоренилось, что экспериментальные факты, отрицающие эту теорию, рассматриваются очень критично. Хотя о рецессивности "транс-доминантных" мутаций р53 может свидетельствовать факт потери
Клональная эволюция клеточных популяций в процессе опухолевой прогрессии и фенотип />55-гетерозигот г» ~. . « о Хромосомный локус р53 о Два аллеля дикого типа р53
Фенотип дикого типа рецессивная мутация)
•Доминантно-негативная мутация одного из аллелей р53
Доминантно-негативный фенотип доминантная мутация) V t
Потеря гетерозиготности": делеция или независимая мутация # второго аллеля р53
Промежуточный фенотип кодом ин ирован ие аллелей) гетерозиготности: в подавляющем большинстве раковых опухолей человека миссенс-мутация (в том числе и доминантно-негативная) одного аллеля р53 сопровождается независимой мутацией или делецией второго аллеля, т.е. давление естественного отбора в процессе опухолевой прогрессии ведет к полной утрате функций обеих аллелей р53 (рис. 3). О рецессивности также говорит жизнеспособность пациентов с синдромом Ли-Фраумени, причем даже тех, все клетки тела которых в одном из аллелей р53 несут мутацию R175H, обладающую очень высоким трансдоминантным потенциалом (Srivastava S. et al., 1992; Varley J.M. et al., 1995). Рецессивность мутации R175H также показана в клеточной системе, поддерживающей равную транскрипцию двух аллелей р53 (Aurelio O.N. et al., 2000).
Согласно общепризнанной "двух-ударной" ("two-hit") модели для развития рака необходима инактивация обеих аллелей гена-супрессора опухолевого роста (Knudson A.G.J. et al., 1975). Антионкоген р53 долгое время считался исключением из этого правила, но, по-видимому, накопившиеся факты показывают необоснованность этого вывода (Blagosklonny M.V., 2000).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Моргункова, Анна Алексеевна
ВЫВОДЫ
На основе р53-негативных клеточных линий мыши и человека получены клеточные культуры коэкспрессирующие кДНК р53 дикого типа (нативного или химерного) и его трансдоминантного ингибитора (GSE22 или R175Н). В этих клеточных системах установлено, что:
1) Трансдоминантный ингибитор GSE22 олигомеризуется с нативным р53 человека, но не олигомеризуется с химерным р53, содержащим олигомеризационный домен птицы. Из этого можно сделать вывод, что нативный и химерный р53 не должны образовывать гетерокомплексы между собой. Химерный р53 сохраняет антипролиферативные и проапоптотические функции нативного р53 дикого типа и даже несколько более активен. Эта активность сохраняется при любой концентрации в клетке трансдоминантного ингибитора.
2) р53-фенотип клеточных культур, коэкспрессирующих кДНК нативного р53 дикого типа и его трансдоминантного ингибитора, определяется количественными соотношениями их белковых продуктов. Доминантно-негативный фенотип с инактивацией антипролиферативных функций р53 проявляется только при многократном стехиометрическом избытке ингибитора по отношению к р53. При их сопоставимых количествах клетки сохраняют фенотип дикого типа. Это может рассматриваться как свидетельство рецессивности "доминантно-негативных" мутаций генар53.
3) Апоптоз, индуцированный введением р53 дикого типа в р53-негативную клеточную линию Saos-2, может быть частично подавлен трансдоминантным ингибитором только в ситуации многократного стехиометрического избытка этого ингибитора по отношению к р53, что также говорит о рецессивности "трансдоминантных" мутаций р53.
4) Трансдоминантные ингибиторы р53, такие как GSE22, могут быть использованы для полного и обратимого выключения активности р53 дикого типа в индуцибельных системах. Ни одна из существующих индуцибельных систем не обеспечивает отсутствия "протечки" экспрессии в отсутствие индуктора. Это существенно в случае экспрессии генов токсичных белков, каким является р53. Дополнительная конститутивная экспрессия GSE22 может обеспечить полную функциональную инактивацию р53 на нужное время, чтобы защитить клетки от негативной селекции против wt-p53. Данный прием может быть использован также для выключения активности других токсичных белков, для которых известны трансдоминантные ингибиторы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моргункова, Анна Алексеевна, Москва
1. Abraham R.T., (2001) Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes & Dev., 15,2177-2196
2. Adimoolam S. & Ford J.M., (2002) p53 and DNA damage-inducible expression of the xeroderma pigmentosum group С gene. PNAS, 99,12985-12990
3. Agoff S.N. et al., (1993) Regulation of the human hsp70 promoter by p53. Science, 259, 84-87 Aguinaldo A. et al., (1997) Evidence for a clade of nematodes, arthropods and other moulting animals. Nature, 387, 489-493
4. Allemand I. et al., (1999) Testicular wild-type p53 expression in transgenic mice induces spermiogenesis alterations ranging from differentiation defects to aoptosis. Oncogene, 18, 65216530
5. Amundson S.A. et al., (1998) Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. Oncogene, 17, 3287-3299
6. Ashcroft M. & Vousden K.H., (1999) Regulation of p53 stability. Oncogene, 18, 7637-7643 Atema A. & Chene P., (2002) The gain offunction of the p53 mutant Asp281Gly is dependent on its ability to form tetramers. Cancer Lett., 185, 103-109
7. Attardy L.D. et al., (2000) PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family. Genes & Dev., 14, 704-718
8. Bargonetti J. et al., (1997) p53 represses Spl DNA binding and HIV-LTR directed transcription. Cell. Mol. Biol., 43, 935-949
9. Bargonetty J. et al., (1993) A proteolytic fragment from the central region of p53 has marked sequence-specific DNA-binding activity when generated from wild-type but not from oncogenic mutantp53 protein. Genes & Dev., 7, 2565-2574
10. Barlev N.A. et al., (2001) Acetylation of p53 activates transcription through recruitment of coactivators/histone acetyltransferases. Mol. Cell, 8,1243-1254
11. Benchimol S. et al., (1985) Transformation associated p53 protein is encoded by a gene on human chromosome 17, Somatic Cell. Mol. Genet., 11, 505-510
12. Bennett M. et al., (1998) Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53 mediated apoptosis. Science, 282, 290-293
13. Beumer T.L. et al., (1998) The role of the tumor suppressor p53 in spermatogenesis. Cell. Death Differ., 5, 669-677
14. Bhat M.K. et al., (1997) Tumor suppressor p53 is a negative regulator in thyroid hormone receptor signaling pathways. J. Biol. Chem., 272,28989-28993
15. Biron C.H. & Lane D.P. (1995) The dominating effect of mutant p53. Nature Genetics, 9, 221-222
16. Blagosklonny M.V. et al., (1998) p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription. J. Biol. Chem., 273,11995-11998
17. Blagosklonny M.V. et al., (2001) Inhibition of HIF-1- and wild-type p53-stimulated transcription by codon Argl 75 p53 mutants with selective loss of functions. Carcinogenesis, 22, 861-867
18. Blagosklonny M.V., (2000) p53 from complexity to simplicity: mutantp53 stabilization, gain-of-function, and dominant-negative effect. PASEB J., 14, 1901-1907
19. Blander G. et al., (1999) Physical and functional interaction between p53 and the Werner's syndrome protein. J. Biol. Chem., 274, 29463-29469
20. Boreham D.R. et al., (2002) Teratogenic effects of mild heat stress during mouse embryogenesis: effect of Trp53. Radiat. Res., 158, 443-448
21. Bradford M.M. (1976) The coomassiebrilliant blue G-250 dye-binding technique. Anal. Biochem.,72, 248-254.
22. Branchmann R.K. et al., (1996) Dominant-negative p53 mutations selected in yearst hit cancer hot spots. PNAS, 93, 4091-4095.
23. Buckbinder L. et al., (1995) Induction of the growth inhibitor IGF-binding protein 3 by p53. Nature, 377, 646-649
24. Caelles C. et al., (1994) p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-target genes. Nature, 370,220-223
25. Canman C.E. et al., (1995) Growth factore modulation of p53-mediated growth arrest versus apoptosis. Genes & Dev., 9, 600-611
26. Caspari Т., (2000) How to activate p53. Curr. Biol., 10, 315-317
27. Chen P-L. et al., (1990) Genetic mechanisms of tumor suppression by the human p53 gene. Science, 250,1576- 1579.
28. Chene P. & Bechter E., (1999) p53 mutants without a functional tetramerisation domain are not oncogenic. J. Mol. Biol., 286, 1269-1274
29. Chene P. et al., (1998) In vitro analysis of the dominant negative effect of p53 mutants. J. Mol. Biol., 281,205-209
30. Cho Y. et al., (1994) Crystal structure of a p53 tumore suppressor-DNA complex: Understanding tumorogenic mutations. Science, 265, 346-355
31. Clore G.M. et al., (1995) Refined solution structure of the oligomerization domain of the tumor suppressorp53. Struct Biol., 2, 321-332
32. Cross S.M. et al., (1995) A p53-dependent mouse spindle checkpoint. Science, 267,1353-1356 Czosnek H. et al., (1984) The gene and the pseudogene for mouse p53 cellular tumor antigen are located on different chromosomes. Mol. Cell. Biol., 4, 1636-1640
33. Dameron K.M. et al., (1994) Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science, 265, 1582-1584
34. Deb S. et al., (1992) Modulation of cellular and viral promoters by mutant human p53 proteins found in tumor cells. J. Virol., 66, 6164-6170
35. Debbas M. & White E., (1993) Wild-type p53 mediates apoptosis by E1A, which is inhibited by E1B. Gene & Dev., 7, 546-554
36. Del S. et al., (1995) GasI-induced growth suppression requires a transactivation-independent p53 function. Mol. Cell. Biol., 15, 7152-7160
37. Deny, W. et al. (2001) Caenorhabditis elegansp53: role in apoptosis, meiosis and stress resistance. Science 294, 591-595
38. Dirac A.M. & Bernards R., (2003) Reversal of senescence in mouse fibroblasts through lentiviral suppression of p53. J. Biol. Chem. (в печати)
39. Donehower L.A. et al., (1992) Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature, 356, 215-221
40. El-Deiry W.S. et al., (1992) Definition a consensus binding site for p53. Nature Genet., 1, 4549
41. Elledge S.J., (1996) Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science, 274, 16641672
42. Fiordaliso F. et al., (2001) Hyperglycemia activates p53 and p53-regulated genes leading to myocyte cell death. Diabetes, 50, 2363-2375
43. Friedlander P. et al., (1996) A mutant p53 that discriminates between p53-responsive genes cannot induce apoptosis. Mol. Cell. Biol. 16,4961-4971
44. Fritsche M. et al., (1998) p53 suppresses cytokine induced, StatS mediated activation of transcription. Mol. Cell. Endocrinol., 143, 143-154
45. Fu L. & Benchimol S. (1997) Participation of the human p53 3' UTR translation repression and activation following gamma-irradiation. EMBO J., 16, 4117-4125
46. Fu L. et al., (1999) A translation repressor element resides in the 3' untranslated region of human p53 mRNA. Oncogene, 18, 6419-6424
47. Fuchs S.Y. et al., (1998) JNK targets p53 ubiquitination and degradation in nonstressed cells. Genes & Dev., 12,2658-2663
48. Fukasawa K. et al., (1996) Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science, 271,1744-1747
49. Giaccia A J. & Kastan M.B., (1998) The complexity ofp53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes & Dev, 12, 2973-2983
50. Giannakakou P. et al., (2000) p53 is assotiated with cellular microtubules and is transported to the nucleus by dynein. Nat. Cell Biol., 2, 709-717
51. Giannakakou P. et al., (2001) Low concentrations of paclitaxel induce cell type-dependent p53, p21 and G1/G2 arrest instead of mitotic arrest: molecular determinants of paclitaxel-induced cytotoxicity. Oncogene, 20, 3806-3813
52. Grant S.W., (1998) Mutant p53 correlates with reduced expression of thrombospondin-1, increased angiogenesis, and metastatic progression in melanoma. Cancer Detect. Prev., 22, 185194
53. Grignani F. et al., (1998) High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58, 14-19.
54. Gu J. et al., (2001) Identification of p53 sequence elements that are required for MDM2-mediated nuclear export. Mol. Cell. Biol., 21, 2001
55. Guan J., (2002) Effects of hyperthermia on p53 protein expression and activity. J. Cell. Physiol., 190, 365-374
56. Hainaut P. & Milner J. (1993) Redox modulation of p53 conformation and sequence-specific DNA binding in vitro. Cancer Res., 53, 4469-4473
57. Hainaut P. et al., (1997) Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and celllines: undated compilation and future prospects. Nucleic Acids Res. 1, 151-157.
58. Hall P.A. & Lane D.P. (1997) Tumor suppressors: a developing role for p53? Curr. Biol., 7,144.147
59. Hammond E.M., (2002) Hypoxia links ATR andp53 through replication arrest. Mol. Cell. Biol., 22, 1834-1843
60. Hammond E.M., (2003) ATR/ATM targets are phosphorylated by ATR in response to hypoxia and ATM in response to re-oxygenation. J. Biol. Chem., (в печати)
61. Harper J.V. et al., (1993) The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 75, 805-816.
62. Hegi M.E. et al., (2000) P53 transdominance but no gain of function in mous brain tumor model. Cancer Res. 60,3019-3024.
63. Heinrichs S. & Deppert W., (2003) Apoptosis or growth arrest: modulation of the cellular response to p53 by proliferative signals. Oncogene, 22, 555-571
64. Hermeking H. et al., (1997) 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol. Cell, 1, 3-11
65. Hermeking H. et al., (1997) 14-3-3 sigma is ap53-regulated inhibitor of G2/Mprogression. Mol. Cell., 1, 3-11
66. Herskowitz I., (1987) Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature. 329, 219-222.
67. Hibi K. et al., (2000) AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinima. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5462-5467
68. Hoever M. et al., (1994) Overexpression of wild-type p53 interferes with normal development in Xenopus laevis embryos. Oncogene, 9, 109-120
69. Hollstein M. et al., (1994) Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell line. Nucleic Acid Res., 22, 3551-3555
70. Hollstein M. et al., (1997).P53 gene alterations in human tumors: perspectives for cancer control. Recent Results Cancer Res. 143, 369-389.
71. Horikoshi N. et al., (1995) Two domains of p53 interactwith the TATA-bindingprotein, and the adenovirus 13S El A protein disruptsthe association, relieving p53-mediated transcriptional repression. Mol. Cell. Biol., 15, 227-234
72. Hupp T.R. et al., (1992) Regulation of the specific DNA binding function ofp53. Cell, 71, 875886
73. Hupp T.R. et al., (1995) Small peptides activated the latent sequence-specific DNA binding function of p53. Cell, 83, 237-245
74. Jenkins J.R. et al., (1988) Two distinct regions of the murine p53 primary amino acid sequence are implicated in stable complex formation with simian virus 40 T antigen. J. Virol., 62, 39033906
75. Jimenes G.S. et al., (1999) p53 regulation by posttranslational modification and nuclear retensionin response to divers stresses. Oncogene, 18, 7656-7665
76. Joers, A. et al., (1998) Tumour associated mutants of p53 can inhibit transcriptional activity ofp53 without heterooligomerization. Oncogene, 17,2351-2358
77. Johnson P. et al., (1991) Expression of wild-type p53 is not compatible with continued growth of p53-negative tumor cells. Mol. Cell. Biol., 11,1-11.
78. Johnson P. et al., (1993) Growth suppression of Friend virus-transformed erythroleuhemia cells by p53 protein is accompanied by hemoglobin production and is sensitive to erythropoietin. Mol. Cell. Biol., 13,1456-1463
79. Jones S.N. et al., (1995) Rescue of embryonic lethalityin Mdm2-deficient mice by absence ofp53. Nature, 378,206-208
80. Kaelin W. (1999) The p53 gene family. Oncogene, 18,7701-7705
81. Kamijo T. et al., (1998) Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. PNAS, 95, 8292-8297
82. Kapoor M. & Lozano G., (1998) Functional activation of p53 via phosphorylation following DNA damage by UV but not gamma radiation. PNAS, 95, 2834-2837
83. Karlseder J. et al., (2002) Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science, 295,2446-2449
84. Karuman P. et al., (2001) The Peutz-Jegher gene product LKB1 is a mediator of p53-dependent cell death. Mol. Cell, 7,1307-1319
85. Kastan M.B. et al., (1992) A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell, 71, 587-597
86. Khanna K.K. & Lavine M.F., (1993) Ionizing radiation and UV induction of p53 protein bydifferent pathways in ataxia telangiectasia cells. Oncogene, 8, 3307-3312
87. Kim S. et al., (2002) Telomeres, aging and cancer: in search of a happy ending. Oncogene, 21,503.511
88. Kirkwood T.B., (2002) p53 and ageing: too much of a good thing? Bioessays, 24, 577-579 Knudson A.G.J, et al., (1975) Mutation and childhood cancer: a probabilistic model for the incidence of retinoblastoma. PNAS, 72,5116-5120
89. Ко L.J. & Prives C. (1996) p53: Puzzle and paradigm. Genes & Dev., 10,1054-1072
90. Kwek S.S. et al., (2001) Functional analysis and intracellular localization of p53 modified by
91. Maehama T. & Dixon J.E., (1998) The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messeger, phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate. J. Biol. Chem., 273, 1337513338
92. Mandir A.S. et al., (2002) A novel in vivo post-translational modification of p53 by PARP-I in MPTP-inducedparkinsonism. J. Neurochem., 83,186-192
93. Marchenko N. et al., (2000) Death signal-induced localization of p53 protein to mitochondria. J. Biol. Chem., 275,16202-16212
94. May P. & May E. (1999) Twenty years ofp53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene, 18, 7621-7636
95. Maya R. et al., (2001) ATM-dependent phosphorylation of Mdm2 on serine 395: role in p53 activation by DNA damage. Genes & Dev., 15, 1067-1077
96. Mills A. et al., (1999) p53 is a p53 gomologue required for limb and epidermal morphogenesis. Nature, 398, 714-718
97. Milner J. et al., (1991a) Cotranslation of activated mutant p53 with wild type drives the wild-type p53 protein into the mutant conformation. Cell, 65, 765-774.
98. Milner J. et al., (1991b) The tumor suppressor p53: analysis of wild type and mytant p53 complexes. Mol. Cell. Biol., 11,12-19
99. Milner J., (1995) Flexibility: the key top53 function? Trends Biochem. Sci., 20,49-51 Miyakoda M., (2002) Activation of ATM and phosphorylation ofp53 by heat shock Oncogene, 21, 1090-1096
100. Miyashita T. & Reed J.C. (1995) Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell, 80, 293-299
101. Miyashita T. et al., (1994) Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene. Cancer Res. 54, 3131 -3135
102. Mokdad-Gargouri R. et al., (2001) Translational control of human p53 expression in yeast mediated by 5'-UTR-ORF structural interaction.Nucleic Acids Res., 29,1222-1227
103. Moroni M.C. et al., (2001) Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53. Nat. Cell Biol., 3, 552-558
104. Mosner J. et al., (1995) Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. EMBO J., 14, 4442-4449
105. Muller-Tiemann B.F. et al., (1998) Identification of an additional negative regulatory region for p53 sequence-specific DNA binding. PNAS, 95, 6079-6084
106. Muller-Tiemann B.F. et al., (1998) Identification of an additional negative regulatory region for p53 sequence-specific DNA binding. PNAS, 95, 6079-6084
107. Mummenbrauer T. et al., (1996) p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease activity. Cell, 85, 1089-1099
108. Munsch D. et al., (2000) Human and mouse Fas (APO-l/CD95)death receptor genes each contain a p53-responsive element that is activated by p53 mutants unable to induce apoptosis. J. Biol. Chem., 275, 3867-3872
109. Naef R. & Suter U., (1999) Many facets of the peripheral myelin protein PMP22 in myelination and disease. Micr. Res. Tech., 41, 359-371
110. Nakano K. et al., (2000) A ribonucleotide reductase gene is a transcriptional target of p53 and p73. Oncogene, 19, 4283-4289
111. Neuberg M. et al., (1997) The p53/IGF-I receptor axis in the regulation of programmed cell death. Endocrine, 7,107-109
112. Nicholls C.D. et al., (2002) Biogenesis of p53 involves cotranslational dimerization of monomers and posttranslational dimerization of dimers. Implications on the dominant negative effect. J. Biol. Chem., 277,12937-12945
113. Nicol C.J. et al., (1995) A teratologic suppressor role for p53 in benzofajpyrene-treated transgenicp53-deficient mice. Nature Genet., 10, 181-187
114. O'Connor P.M., (1997) Mammalian G1 and G2phase checkpoints. Cancer Surv., 29, 151-182 Oda E. et al., (2000) Noxa, a ВНЗ-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-indiced apoptosis. Science, 288, 1053-1058
115. Oda К. et al., (2000) p53AIPl, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylatedp53. Cell, 102, 849-862
116. Okamoto K. & Beach D. (1994) Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. EMBO J., 13,4816-4822
117. Okamura S. et al., (2001) p53DINPl, a p53-inducible gene, regulates p53-dependent apoptosis. Mol. Cell, 8, 85-94
118. Ossovskaya V.S. et al., (1996) Use of genetic suppressor elements to dissect distinct biological effects of separate p53 domains. PNAS, 93,10309-10314.
119. Park D.J., et al., (1994) Transactivational and DNA binding abilities of endogenous p53 in p53 mutant cell lines. Oncogene, 9,1899-1906
120. Paunesku T. et al., (2001) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): ringmaster of the genome. Int. J. Radiat. Biol., 77, 1007-1021
121. Pearson M. et al., (2000) PML regulates p53 acetylation and premature senescence induced by oncogenic Ras. Nature, 406, 207-210
122. Peng C.Y. et al., (1997) Mitotic and G2 checkpoint control: regulation of 14-3-3 protein bindingby phosphorylation of Cdc25C on serine-216. Science, 277, 1501-1505
123. Polyak K. et al., (1997) A model for p53-induced apoptosis. Nature, 389, 300-305
124. Pozniak C. et al. (2000) An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, duringdevelopmental neuron death. Science 289, 304-306
125. Ravi R. et al., (1998) p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integratorp300. Cancer Res., 58, 4531-4536
126. Ravi R. et al., (2000) Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxiainducible factor 1 a Gebes & Dev., 14, 34-44
127. Reed J.C., (1998) Bcl-2 family proteins. Oncogene, 17, 3225-3236
128. Reisman D. et al., (1988) Human p53 oncogene contains one promoter upstream of exon 1 and a second, stronger promoter within intron 1. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5146-5150
129. Reisman D. et al., (1996) A novel transcript encoded within the 10-kb first intron of the human p53 tumor suppressor gene (D17S2179E) is induced during differentiation of myeloid leukemia cells. Genomics, 38, 364-370
130. Resnick-Silverman L. et al., (1998) Identification of a novel class genomic DNA-binding sites suggests a mechanism for selectivity in target gene activation by the tumor suppressor protein p53. Genes & Dev., 12, 2102-2107
131. Roemer K. et al., (1999) Mutant p53: gain-of-function oncoproteins and wild-type p53 inactivators. Biol. Chem. 380,879-887.
132. Rotter V. et al., (1994) Does wile-typep53play a role in normal cell differentiation? Semin. Cancer Biol., 5,229-236
133. Ruaro E.M. et al., (1997) A proline-rich motif in p53 is required for transactivation-independent growth arrest as induced by Gasl. PNAS, 94,4675-4680
134. Rubbi C.P. & Milner J. (2003) p53 is a chromatin accessibility factor for nucleotide excision repair of DNA damage. EMBO J., 22, 975-986
135. Ruppert J.M. & Stillman B. (1993) Analysis of a protein-binding domain of p53. Mol. Cell. Biol., 13,3811-3820
136. Sablina A.A. et al., (1998) Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation. J. Cell. Sci., Ill, 977-984
137. Saito S. et al., (2002) ATM mediates phosphorylation at multiple p53 sites, including Ser(46), in response to ionizing radiation. J. Biol. Chem., 277, 12491-12494
138. Sakaguchi K. et al., (1998) DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade. Genes & Dev., 12,2831-2841
139. Samuels-Lev I. et al., (2001) ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53. Mol. Cell, 8, 781-794
140. Saretzki G. et al., (1999) Telomere shortening triggers a p53-dependent cell cycle arrest via accumulation of G-rich single stranded DNA fragments. Oncogene, 18, 5148-5158
141. Scharer E. & Iggo R. (1992) Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Res., 20, 1539-1545
142. Seto E. et al., (1992) Wild-type p53 binds to the TATA-binding protein and represses transcription. PNAC, 89,12028-12032
143. Shoshani T. et al., (2002) Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene, RTP801, involved in apoptosis. Mol. Cell. Biol., 22, 2283-2293
144. Sigal Аю & Rotter V. (2000) Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome. Cancer Res., 60, 6788-6793
145. Smogorzewska A. & de Lange Т., (2002) Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells. EMBO J., 21, 4338-4348
146. Soussi T. et al., (1990) Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution. Oncogene, 5, 945-952
147. Srivastava S. et al., (1992) Detection of both mutant and wild-type p53 protein in normal skin fibroblasts and demonstration of shared 'second hit' on p53 in tumors from a cancer-prone family with Li-Fraumeni syndrome. Oncogene 7,987-991
148. Stambolic V. et al., (2001) Regulation of PTEN transcription by J.Mol. Cell, 8, 317-325 Steinmeyer K. & Deppert W., (1988) DNA binding properties of murine p53. Oncogene, 3, 501507.
149. Stoler D.L. et al., (1992) Anoxia-inducible endonuclease activity as a potential basis of the genomic instability of cancer cells. Cancer Res., 52, 4372-4378
150. Stommel J.M. et al., (1999) A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellelar localization andp53 activity by NES masking. EMBO J., 18, 1660-1672
151. Storey A. et al., (1998) Role of a p53 polymorphism in the development of human papillomavirus-associated cancer, Nature, 393,229-234
152. Subler M. et al., (1994) Overlapping domains on the p53 protein regulate its transcriptional activation and repression functions. Oncogene 9,1351-1359
153. Subler M.A. et al., (1994) Activation of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat by transforming mutants of human p53. J. Virol., 68, 103-110
154. Sugasawa K. et al., (1998) Xeroderma pigmentosum group С protein complex is the initiator of global genome nucleotide excision repair. Mol. Cell, 2, 223-232
155. Sugrue M. et al., (1997) Wild-type p53 triggers a rapid senescence program in human tumor cells lacking functional p53. PNAS, 94, 9648-9653
156. Sun Y. et al., (1993) Dosage-dependent dominance over wild-type p53 of a mutant p53 isolatedfrom nasopharyngeal carcinoma. FASEB J., 7,944-950
157. Tauchi H., (2000) Positional cloning and functional analysis of the gene responsible for Nijmegen breakage syndrome, NBS1. J. Radiat. Res., 41, 9-17
158. Thanos C. & Bowie J.U. (1999) p53 family members p63 andp73 are SAM domain-containing proteins. Protein Science, 8, 1701-1710
159. Thomas M. et al., (1999) The role of the E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV. Oncogene, 18,7690-7700
160. Thut C. et al., (1995) p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFI160. Science, 267,100-104
161. Timothy T. et al. (1999) p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interacrions with each other but not with p53. The Journal of biological chemistry, 274, 18709-18714
162. Tsutsumi-Ishii Y. et al., (1995) Response of heat shock element within the human HSP70 promoter to mutatedp53 genes. . Cell Growth Differ., 6,1-8
163. Tuck S. & Crawford L (1989) Characterization of the human p53 gene promoter. Mol Cell Biol., 9,2163-2172
164. Tymowska J. & Fischberg M. (1973) Chromosome complements of the genus Xenopus, Chromosoma, 44, 335-342
165. Unsal-Ka?maz K. et al., (2002) Preferential binding of ATR protein to UV-damaged DNA. PNAS, 99, 6673-6678
166. Utrera R. et al., (1998) A novel p53-inducible gene coding for a microtubule-localized protein with G2-phase-specific expression. EMBO, 17, 5015-5025
167. Van Meir E.G. et al., (1994) Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat. Genet., 8,171-176
168. Varley J.M. et al., (1995) An extended Li-Fraumeni kindred with gastric carcinoma and a codon 175 mutation in TP53. J. Clin. Genet. 32, 942-945.
169. Walker K.K. & Levine A.J. (1996) Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. PNAS, 93, 15335-15340
170. Wang В., (2001) Involvement of p53-dependent apoptosis in radiation teratogenesis and in theradioadaptive response in the late organogenesis of mice. J. Radiat. Res., 42, 1-10
171. Wang X.W. et al., (1994) Hepatitis В virus X protein inhibits p53 sequence-specific DNAbinding, transcriptional activity, and association with transcription factor ERCC3. PNAS, 91,2230-2234
172. Wang X.W. et al., (1995) p53 modulation of TFIIH-associated nucleotide excision repair activity. Nature Genet., 10,188-193
173. Wang X.W. et al., (1996) The XPB and XPD DNA helicases are components of the p53-mediated apoptosis pathway. Genes Dev., 10,1219-1232
174. Wang Y. et al., (1995) Xenopus laevis p53 protein: sequence-specific DNA binding, transcriptional regulation and oligomerization are evolutionary conserved. Oncogene, 10, 779784
175. Waterman M.J., (1998) ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat. Genet., 19,175-178
176. Wu G.S. et al., (1997) KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat. Genet., 17, 141-147
177. Wu X. et al., (1993) The p53-mdm2 autoregulatory feedback loop. Genes & Dev., 7, 1126-1132 Xu D. & Finkel Т., (2002) A role for mitochondria as potential regulators of cellular life span. Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, 245-248
178. Xu J. et al., (1999) p53-mediated regulation of proliferating cell nuclear antigen expression in cells exposed to ionizing radiation. Mol. Cell. Biol., 19,12-20
179. Yang A. et al., (2002) On the shoulders of giants: p63, p73 and the rise of p53. Trends in Genetics, 18,90-95
180. Yin Y. et al., (1998) Involvement of p85 in p53-dependent apoptotic response to oxidative stress. Nature, 391, 707-710
181. Zhan Q. et al., (1999) Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin Bl kinase activity by the p53-regulatedprotein Gadd45. Oncogene, 18, 2892-2900
182. Zhang Y. et al., (1998) ARFpromotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb andp53 tumor suppression pathways. Cell, 92, 725-734
183. Zindy F. et al., (1998) Мус signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes & Dev., 12, 2424-2333
184. Алмазов В.П. и др., (2002) Создание химерной молекулы опухолевого супрессора р53, устойчивой к доминантно-негативным воздействиям. Молекуляр. биология. 36, 664671
185. Чумаков П.М., (2000) Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 65, 34-47
-
Моргункова, Анна Алексеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2003
-
ВАК 03.00.03
- Анализ ДНК-связывающих свойств белка Р53
- Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы
- Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53
- Роль конститувного андростанового рецептора в регуляции ингибитора клеточного цикла p21
- Изучение биологических активностей мутантных форм белка р53
