Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль конститувного андростанового рецептора в регуляции ингибитора клеточного цикла p21

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль конститувного андростанового рецептора в регуляции ингибитора клеточного цикла p21"

На правах рукописи

Казанцева Юлия Александровна

РОЛЬ КОНСТИТУТИВНОГО АНДРОСТАНОВОГО РЕЦЕПТОРА В РЕГУЛЯЦИИ ИНГИБИТОРА КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА р21

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ИЮН 2015

Новосибирск - 2015

005569605

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» г. Новосибирск, Россия

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Пустыльняк Владимир Олегович

Официальные оппоненты: Меркулова Татьяна Ивановна

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии и генетики» Сибирского отделения Российской академии наук, заведующая лабораторией регуляции экспрессии генов

Попова Нэлли Александровна

кандидат биологических наук, доцент, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», факультет естественных наук, кафедра цитологии и генетики, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт молекулярной и клеточной биологии» Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится ¿-¿ ^¿¿^ 2015 г. в иа заседании диссертационного

совета Д001.034.01 в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» по адресу: http://www.niibch.ru

Автореферат разослан 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Конститутивный андростановый рецептор (CAR) принадлежит к суперсемейству ядерных рецепторов. На сегодняшний день утвердилось представление о нем как о ксенобиотик-чувствительном ядерном рецепторе, который регулирует экспрессию ферментов метаболизма и элиминации как эндогенных, так и экзогенных соединений (Wei et al., 2000; Sugatani et al., 2001). Показано также, что экспрессируясь преимущественно в печени, рецептор CAR вовлечен во множество физиологических и патологических процессов в организме, таких как метаболизм углеводов и жиров, регуляция клеточного деления, рост и дифференцировка клеток (Banerjee et al., 2014). Существуют данные свидетельствующие о том, что активация CAR может являться одним из ключевых моментов при формировании опухоли печени грызунов. Длительное введение активаторов рецептора мышам и крысам приводит к развитию гепатоцеллюлярной карциномы (Yamamoto et al., 2004; Deguchi et al., 2009). Однако механизм возникновения опухоли под действием рецептора CAR остается неясным.

Показано, что активация рецептора CAR в клетках печени мышей ассоциирована с сильным пролиферирующим эффектом. Введение мощного прямого активатора CAR мыши ТСРОВОР приводит к развитию гиперплазии печени грызунов (Costa et al., 2005). Потеря способности печени соблюдать баланс между индуцирующими и ингибирующими рост сигналами является онкогенным событием и связана, в первую очередь, с нарушением регуляции клеточных процессов, ответственных за контроль клеточного цикла. Клеточный цикл состоит из нескольких фаз. Закономерная последовательность смены фаз клеточного цикла строго контролируется специальными регуляторными белками, которые обеспечивают как прохождение клетки по определенному периоду, так и переход из одной фазы клеточного цикла в другую. G1 фаза является критическим периодом

С

клеточного цикла, когда под влиянием разных факторов принимается решение: вступает клетка в митотический цикл или нет. И с некоторого момента времени выбранный путь становится необратимым. Активация рецептора CAR является митогенным стимулом в клетках печени мышей. Рецептор стимулирует экспрессию ключевого регулятора G1 фазы клеточного цикла белка циклина D1 (Ledda-Columbano et al., 2000). Однако за счет ингибирующего влияния белка р21 на циклин D1 может произойти остановка клеточного деления в G1 фазе митотического цикла (Ball et al., 1997). В настоящей работе для того, чтобы подойти ближе к пониманию механизмов индукции пролиферативных процессов при активации CAR, было исследовано влияние ядерного рецептора на уровень белка р21 в клетках печени мышей.

Целью данного исследования является изучение роли ядерного рецептора CAR в регуляции ингибитора клеточного цикла р21 в клетках печени.

В связи с поставленной целью решались следующие основные задачи:

1) Оценить влияние активированного ядерного рецептора CAR на изменение массы печени лабораторных животных и сопоставить данный показатель с уровнем экспрессии маркерного белка циклина D1, ответственного за вхождение клетки в клеточный цикл.

2) Оценить изменение экспрессии универсального ингибитора клеточного цикла белка р21 при хроническом введении известного митогена ТСРОВОР, обладающего активирующим эффектом на CAR в печени мышей.

3) Установить молекулярный механизм изменения содержания белка р21 в клетках печени лабораторных животных с участием рецептора CAR.

4) Проанализировать изменение уровня белков-регуляторов клеточного цикла pRb, Cdk4, сМус, E2F1 после длительного применения активатора CAR.

Научная новизна

Показано, что при хроническом введении активатора CAR ТСРОВОР происходит снижение экспрессии белка-ингибитора клеточного цикла р21 в печени мышей.

Продемонстрировано, что активация рецептора CAR ТСРОВОР сопряжена со значительным снижением функциональной активности онкосупрессоров р53 и FoxOl в качестве транскрипционных факторов, что приводит к подавлению экспрессии гена Cdkrtla (р21).

В опытах in vivo показано прямое взаимодействие белков CAR и FoxOl.

Выявлены особенности молекулярных процессов, протекающих в печени экспериментальных животных, подтверждающие, что активация CAR может приводить к прогрессии клеточного цикла.

Научно-практическая значимость

По своему содержанию данная работа имеет преимущественно

фундаментальный характер и представляет собой исследование

молекулярных механизмов нарушения регуляции клеточного цикла с

участием ядерного рецептора CAR. Активируясь под действием различных

структурно-несвязанных соединений, рецептор вовлечен во множество

физиологических процессов, протекающих в печени. Следствием этого

является потенциальная возможность использования активаторов CAR для

коррекции различных патологических состояний органа (Banerjee et al.,

2014). Однако данные, свидетельствующие о том, что активация CAR

приводит к формированию гепатоцеллюлярной карциномы у грызунов,

ставят под сомнение использование агонистов CAR в терапевтической

практике. Неотъемлемым признаком опухолевой трансформации клетки

является неограниченная пролиферативная активность. В настоящем

исследовании показано, что активация ядерного рецептора CAR приводит к

подавлению содержания универсального ингибитора клеточного цикла р21 в

5

печени экспериментальных животных на уровне транскрипции гена, через подавление функциональной активности регуляторов его экспрессии р53 и FoxOl. Результаты работы имеют значение, прежде всего, для понимания механизмов активации клеточного деления и могут быть полезны в борьбе с нерегулируемой пролиферацией клеток печени.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Активация ядерного рецептора CAR у мышей приводит к снижению уровня универсального ингибитора клеточного цикла р21.

2) В основе снижения уровня белка р21 с участием рецептора CAR лежит подавление функциональной активности транскрипционных факторов, регулирующих активность гена Cdknla (р21), р53 и FoxOl.

Апробация работы

Результаты работы обсуждались на следующих конференциях: ЕМВО Conference Nuclear receptors: Linking molecules, genomes & physiology (r. Сорренто, Италия, 2013); 20th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (г. Штутгарт, Германия, 2014).

Публикации

По результатам исследований, представленных в диссертации, опубликовано 6 публикаций, из которых 4 в рецензируемых научных изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков. Библиография включает 221 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обработка животных соединениями. Для исследования влияния активации рецептора CAR на регуляцию клеточного цикла использовали самцов мышей линии С57В1 (20-25 г), полученных из питомника Института клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск). Экспериментальным животным в качестве активатора рецептора CAR вводили ТСРОВОР (3 мг/кг веса животного), в качестве ингибитора рецептора - андростенол (30 мг/кг веса животного). В ходе проведения исследования оценивали влияние однократной инъекции ТСРОВОР и хронического введения соединения мышам (в течение 2-х месяцев) на регуляцию клеточного цикла. Животных содержали группами по 5 особей в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище.

Выделение микросомальной фракции печени животных производили при температуре +4 °С общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Образцы печени гомогенизировали в растворе, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7,4), 1,15% К.С1. В результате двух последовательных центрифугирований гомогената печени при 10000 об/мин и 32000 об/мин получали осадок микросомальной фракции.

Определение каталитической активности сур2Ь. Скорость деалкилирования 7-пентоксирезоруфина (PROD) (субстрата, специфичного для сур2Ь) определяли флюориметрическим методом по скорости образования резоруфина (Burke et al., 1985).

Вестерн-блот анализ. Лизис гомогената печени мышей проводили с использованием буфера RIPA. Выделение ядерных экстрактов проводили с помощью набора реагентов ProteoJET™ Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit («Fermentas») согласно рекомендациям производителя. Концентрацию белка в лизатах/ядерных экстрактах определяли методом Брэдфорд с использованием готового реагента «Bradford reagent, ready-to-use» («Fermentas») согласно рекомендациям производителя. Разделение

белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в денатурирующих условиях. После электрофоретического разделения белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 цм) методом полусухого переноса. Для блокировки центров неспецифического связывания нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в растворе BSA (либо в растворе обезжиренного сухого молока). Далее мембрану последовательно инкубировали со специфичными и вторичными антителами, меченными пероксидазой. Визуализацию иммунореактивных полос проводили с использованием набора реагентов для люминесцентной детекции.

Иммунопреципитация хроматина. К гомогенату печени добавляли формальдегид до 1 % для образования ковалентных связей между ДНК и близкорасположенными белками. Далее проводили лизис клеток буфером, содержащим ингибиторы протеаз. Для получения фрагментов ДНК, размером 500-1000 п.н., лизат клеток подвергался озвучиванию на ультразвуковом дезинтеграторе. Часть полученного лизата использовалась для контроля Input. Очищенный лизат инкубировали с антителами против специфического белка или нормальной сыворотки кролика (IgG), а потом с суспензией агарозы. Далее после серии очисток иммунокомплекс разрушали добавлением 4M NaCl. .Полученные фрагменты ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Анализ полученной ДНК проводили методом ПЦР.

ПЦР с детекцией в реальном времени. Выделение суммарной РНК из образцов печени мышей проводили с использованием набора Rneasy® Mini Kit (50) («Qiagen») согласно рекомендациям производителя. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию с помощью набора ¡Script cDNA Synthesis Kit («BioRad») в соответствии с протоколом производителя. В реакции использовали гексануклеотидные случайные праймеры. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов проводили ПЦР с детекцией в реальном времени с использованием iTaq SYBR Green Supermix

with ROX («BioRad»). Относительный уровень экспрессии генов оценивали с использованием значений пороговых циклов Ct по методу 2ACt.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде средней величины и стандартного отклонения (М± SD). Достоверность отличий оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента и однофакторного анализа ANOVA. Р<0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Активация рецептора CAR введением ТСРОВОР приводит к увеличению массы печени грызунов.

Информативным признаком развития патологии печени является изменение ее массы. Поэтому в ходе настоящего исследования были оценены массовые показатели печени и тела лабораторных животных после длительного введения активатора CAR ТСРОВОР (в течение 2-ух месяцев). В результате проведенных измерений выявлено увеличение массы печени мышей, которым длительное время вводился ТСРОВОР, по сравнению с группой контрольных животных (Рис. 1). При этом средняя масса печени грызунов, подверженных длительному введению соединения составила 10% от общего показателя массы тела, что в 2 раза превышает норму.

Cont ТСРОВОР Cont ТСРОВОР

Рис. 1. Изменение показателей массы печени мышей после введения ТСРОВОР мышам в течение 2-ух месяцев. Приведены средние значения ± 80 (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05.

На основании литературных данных, свидетельствующих о том, что введение ТСРОВОР мышам приводит к гиперплазии печени (Costa et al., 2005), было сделано предположение, что наблюдаемое изменение массы печени грызунов также признак избыточного деления гепатоцитов. Для исследования митогенного эффекта ТСРОВОР был оценен уровень экспрессии белка циклина D1, запускающего клеточный цикл. Исследование транскрипции гена Ccndl (циклин D1) методом ОТ-ПЦР продемонстрировало, что при длительном введении активатора CAR в течение 2-ух месяцев происходит увеличение относительного уровня мРНК циклина, а, в ходе проведения иммуноблот анализа, было показано увеличение относительного содержания самого белка (Рис. 2А, Б).

Ccndl

3.8

Cyclin D1 p-actin

Cont ТСРОВОР

Cont

ТСРОВОР

Рис. 2. Эффект влияния введения ТСРОВОР мышам в течение 2-ух месяцев на экспрессию регулятора клеточного цикла циклин D1. (А) Относительное содержание мРНК Ccndl в печени мышей анализировали методом ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» /5-актин. Приведены средние значения ± SD (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05. (Б) Иммуноблот анализ содержания белка циклина D1 в печеночных лизатах мышей. Уровень белка |3-актина использовали в качестве контроля.

Таким образом, следствием длительного введения активатора CAR мышам может быть перманентное повышение экспрессии циклина Dl, что приводит к постоянной стимуляции клеточного деления, и, в конечном счете, такое развитие событий может стать причиной развития опухоли.

Следствием активации рецептора CAR является снижение содержания ингибитора клеточного цикла белка р21 в клетках печени.

Для ограничения нерегулируемой пролиферативной активности клеток существуют особые белки - ингибиторы циклинов и циклин-зависимых киназ (Sherr and Roberts, 1995). Существуют данные о том, что повышенный уровень циклина D1 не всегда коррелирует с усиленной пролиферацией клеток, и причиной этому может быть резкое увеличение уровня ингибитора циклин-зависимых киназ p21(Ullmannova et al., 2003). Известно, что белок избирательно связывает и инактивирует комплекс циклин D-Cdk4, способствуя задержке клеток в фазе G1 (Ball et al., 1997). Для определения влияния длительного введения активатора CAR ТСРОВОР мышам в течение 2-ух месяцев на содержание ингибитора р21 в клетках печени лабораторных животных, был исследован уровень экспрессии гена, кодирующего данный белок - Cdknla, а также количество его белкового продукта. Длительное введение ТСРОВОР грызунам привело к статистически значимому снижению экспрессии гена Cdknla (Рис. ЗА).

А

1,2

Cdknla

Cont TCPOBOP

0.3

p-actin

p21

Cont TCPOBOP

Рис. 3. Эффект влияния введения TCPOBOP мышам в течение 2-ух месяцев на экспрессию ингибитора клеточного цикла р21. (А) Относительное содержание мРНК Cdknla оценивали методом ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» /З-актин. Приведены средние значения ± SD (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05. (Б) Иммуноблот анализ содержания белка р21 в печеночных лизатах. Уровень белка (3-актина использовали в качестве контроля.

Результаты иммуноблот анализа согласуются с результатами, полученными при исследовании экспрессии гена - при введении TCPOBOP наблюдается падение относительного уровня белка р21 (Рис. ЗБ).

Для того чтобы установить по какому механизму введение активатора CAR TCPOBOP приводит к снижению уровня ингибитора клеточного цикла р21 был проведен ряд экспериментов.

Снижение функциональной активности транскрипционного фактора р53 при активации рецептора CAR.

Известно, что белок р21 является одной из основных мишеней трансактивационного действия белка-онкосупрессора р53 (el-Deiry et al., 1993). В настоящем исследовании для оценки транскрипционной активности белка р53 после введения активатора CAR TCPOBOP была оценена способность транскрипционного фактора взаимодействовать с промоторной

областью его целевого гена Cdknla (р21) методом иммунопреципитации хроматина. Были получены результаты, свидетельствующие о снижении аккумуляции р53 на промоторном участке гена Cdknla при введении активатора CAR (Рис. 4А).

-* Б

Cdknla

1 0.5 —--— Р53

-- ß-actin

Cont ТСРОВОР

Рис.4. Эффект влияния введения ТСРОВОР мышам на функциональную активность, а также содержание транскрипционного фактора р53 в клетках печени мышей. (А) Иммунопреципитация хроматина после однократного введения ТСРОВОР с применением антител против р53 и нормальных IgG кролика в качестве контроля на специфичность связывания. ПЦР преципитированных фрагментов проводили, используя праймеры специфичные к промотору гена Cdknla. (Б) Иммуноблот анализ печеночных лизатов. после однократного введения ТСРОВОР с применением антител против р53. Уровень белка ß-актина использовали в качестве контроля.

В ходе проведения иммуноблот анализа было показано, что снижение связывания транскрипционного фактора р53 с регуляторной областью промотора гена Cdknla обусловлено падением уровня белка р53 в клетках печени мышей (Рис. 4Б).

Из литературы известно, что снижение содержания р53 в клетке осуществляется за счет усиления его распада. Основной лигазой, стимулирующей деградацию р53 является белок Mdm2 (Haupt et al., 1997). В связи с этим в ходе дальнейшего исследования был также оценен уровень экспрессии гена Mdm2 и количество его белкового продукта.

А

9 8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -О -

Mdm2

1

Mdm2

P-actin

Cont TCPOBOP

Cont TCPOBOP

Рис. 5. Эффект влияния введения TCPOBOP мышам на экспрессию белка Mdm2. (А) Относительное содержание мРНК Mdm2 анализировали методом ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» Р-актин. Приведены средние значения ± SD (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05. (Б) Иммуноблот анализ содержания белка Mdm2 в печеночных лизатах. Уровень белка Р-актина использовали в качестве контроля.

При введении активатора CAR TCPOBOP мышам в клетках печени лабораторных животных происходит увеличение относительного содержания мРНК Mdm2 по сравнению с контролем в 8 раз (Рис. 5А). Результаты анализа транскрипции гена Mdm2 были подтверждены определением его белкового продукта иммунохимическим методом с помощью антител. В клетках печени мышей наблюдается увеличение количества белка Mdm2, негативного регулятора онкосупрессора р53, в 4,5 раза по сравнению с контролем (Рис. 5Б).

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что рецептор CAR предотвращает накопление р53 в клетках печени лабораторных животных за счет увеличения экспрессии его негативного регулятора Mdm2, способствуя снижению содержания опухолевого супрессора р21.

Подавление функциональной активности транскрипционного фактора Foxol под действием активированного введением TCPOBOP

рецептора CAR.

Осуществляя контроль соблюдения баланса между пролиферативными сигналами и доступностью питательных веществ, существенную роль в

14

регуляции экспрессии гена Cdknla (р21) играет также белок FoxOl. В ходе проведения исследования было показано, что длительное введение агониста CAR ТСРОВОР сопровождается достоверным снижением экспрессии гена FoxOl, а также падением относительного уровня самого белка - как в общем лизате клеток, так и в ядерных экстрактах (Рис. 6А, Б).

А

* 1.5 FoxOl

I

о.

§ 1 Г"ГН

!: j й

Cont ТСРОВОР

Рис. 6. Эффект влияния введения ТСРОВОР мышам в течение 2-ух месяцев на экспрессию белка FoxOl. (А) Относительное содержание мРНК FoxOl анализировали методом ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» /З-актин. Приведены средние значения ± SD (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05. (Б) Иммуноблот анализ содержания белка FoxO I в печеночных лизатах, а также в ядерных экстрактах. В общем лизате клеток в качестве контроля использовали сигнал на (3-актина, в ядерных экстрактах на ТВР.

Анализ транскрипционной активности FoxOl проводили методом иммунопреципитации хроматина с использованием антител против FoxOl и праймеров, ограничивающих сайт связывания транскрипционного фактора на промоторе его генов-мишеней Cdknla и FoxOl. Для подтверждения участия CAR в регуляции активности FoxOl, лабораторным животным вводили, помимо активатора ТСРОВОР, обратный агонист рецептора - андростенол. Полученные результаты свидетельствуют о снижении ДНК-связывающей способности белка FoxOl после однократной инъекции ТСРОВОР. Наблюдается снижение аккумуляции транскрипционного фактора на регуляторной области промотора генов-мишеней: Cdknla и FoxOl (Рис. 7).

I

0.4

Foxol

p-actin

о. Q

(В fe

Foxol

ТВР

Cont ТСРОВОР

Введение обратного агониста CAR ингибирующее влияние активатора CAR.

андростенола предотвратило

Foxol

Cdkn1a(p21)

Foxol

Foxol

Anti-Foxo1 Anti-CAR IgG Input

^_

/ /

f//

£

'f /

Anti-Foxo1 Anti-CAR IgG Input

& «

Рис. 7. Эффект введения TCPOBOP мышам на способность транскрипционного фактора FoxOl взаимодействовать с регуляторной областью генов-мишеней Cdknla и FoxOl. Иммунопреципитация хроматина из образцов печени мышей после однократного введения ТСРОВОР с применением антител против FoxOl и нормальных IgG кролика в качестве контроля на специфичность связывания. ПЦР преципитированных фрагментов проводили, используя праймеры специфичные к промотору генов Cdknla и FoxOl.

Падение способности транскрипционного фактора FoxOl взаимодействовать с регуляторной областью промотора собственного гена под влиянием рецептора CAR объясняет факт снижения экспрессии белка FoxOl при введении мышам ТСРОВОР (Рис. 6А, Б).

На основании литературных данных, предполагается, что наблюдаемое подавление трансактивационной функции FoxOl обусловлено способностью CAR напрямую связывать и ингибировать белок FoxOl. Анализ взаимодействия белков проводили с помощью иммунопреципитации белкового комплекса из гомогената печени лабораторных животных, используя антитела против CAR или FoxOl. Затем проводили электрофорез и иммуноблоттинг белков, полученных в результате ко-иммуноперципитации.

0£ <

О

О х О UL

о. с

О

О)

CAR

Foxol

Foxol CAR

Foxol CAR

Foxol CAR

£

Рис. 8. Исследование взаимодействия белков CAR и FoxOl после введения ТСРОВОР. Иммунопреципитация белкового комплекса CAR-FoxOl из гомогената печени мышей с использованием антител против CAR/FoxOl. Иммуноблот анализ преципитированного белкового комплекса.

Из полученных результатов, следует, что введение ТСРОВОР приводит к увеличению взаимодействия CAR и FoxOl, в то время как введение ингибитора рецептора андростенола предотвращает образование белкового комплекса (Рис. 8). Таким образом, было установлено, что рецептор CAR, образуя в ядре гетеродимерный комплекс с FoxOl, выступает в роли корепрессора транскрипционного фактора. Полученные результаты позволяют говорить о способности CAR подавлять содержание р21 в клетке за счет снижения активности белка FoxOl, регулирующего экспрессию гена Cdknla (р21).

Следствием активации CAR является увеличении экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла.

Известно, что в пресинтетической фазе клеточного цикла р21 блокирует ингибирующее фосфорилирование комплексом циклин D-Cdk4 белка Rb, который, в свою очередь, связывает и дезактивирует транскрипционный фактор E2F1, необходимый для перехода из G1 фазы в фазу синтеза ДНК. В ходе настоящей работы для оценки эффективности действия комплекса циклин D-Cdk4 с помощью иммуноблот анализа было исследовано содержание фосфорилированной формы Rb в клетках печени мышей. Результаты анализа, представленные на рисунке 9А, свидетельствуют о накоплении фосфорилированной формы Rb в гепатоцитах грызунов, которые подвергались воздействию ТСРОВОР. Более того, введение активатора CAR привело к усилению экспрессии транскрипционного фактора E2F1. Наблюдается увеличение относительного содержания мРНК гена E2F1, а также его белкового продукта (Рис. 9А).

А

3.8

2.9

4.4

2.7

pRB

E2F1

P-actin

сМус Cdk4

i 2 s

I 1,5

Ш

0 Cl

1 1

J] X

| 0,5

S

О

о

f 0

E2F1

Ни ■_я__

Cont

TCPOBOP

Cont TCPOBOP

0,5 0

сМус *

1

А • «¡¡щ ¡ЗКр?

11 Н

Cont

TCPOBOP

Рис. 9. Эффект введения TCPOBOP мышам на экспрессию белков-регуляторов клеточного цикла E2F1, сМус, pRb, Cdk4. (А), (Б) Иммуноблот анализ содержания белков E2F1, сМус, pRb, Cdk4 в печеночных лизатах после введения TCPOBOP. Уровень белка (3-актина использовали в качестве контроля. Относительное содержание мРНК генов E2F1 и сМус после введения TCPOBOP в печени мышей анализировали методом ОТ-ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» fi-актин. Приведены средние значения ± SD (п=5). * Значимость различий по сравнению с контролем р < 0,05.

В дополнение к этому, было показано, что при длительном введении активатора CAR наблюдается накопление ключевого позитивного регулятора клеточного цикла белка сМус в печени мышей (Рис. 9Б). Также было установлено, что увеличению уровня белка предшествовало усиление транскрипции гена сМус. В образцах печени мышей, подверженных влиянию TCPOBOP наблюдается увеличение относительного уровня мРНК гена сМус (Рис. 9Б). Более того, наблюдается увеличение уровня продукта его гена-мишени Cdk4 (Рис. 9Б).

Известно, что сМус способен ингибировать транскрипцию гена Cdknla, кодирующего белок p21 (Gartel et al., 2001; Wu et al., 2003). Таким образом, дополнительным механизмом участия CAR в подавлении содержания р21 в клетке может быть стимулирование экспрессии его репрессора сМус.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Активация ядерного рецептора CAR является митогенным стимулом в клетках печени мышей. Вмешиваясь в регуляцию G1 фазы клеточного цикла, усиливая экспрессию белка циклина D1, рецептор запускает клеточное деление. В настоящем исследовании впервые показано, что индукция пролиферации клеток печени под воздействием рецептора CAR ассоциирована со снижением содержания белка р21. В результате проведенных экспериментов было идентифицированно два пути подавления уровня ингибитора клеточного цикла р21: через блокирование функциональной активности регуляторов экспрессии кодирующего его гена {Cdknla), транскрипционных факторов FoxOl и р53 (Рис. 20).

Наблюдаемые при активации CAR угнетение экспрессии р21, а также гиперэкспрессия циклина D1 приводят к активации Cdk-сигнального пути. В клетках печени мышей происходит накопление неактивной фосфорилированной формы белка Rb, а также транскрипционных факторов E2F1 и сМус (Рис. 20). Такое развитие событий приводит к индукции клеточного деления, и обуславливает повышенную пролиферацию клеток печени лабораторных животных.

Рис. 20. Схематическое изображение участия ядерного рецептора CAR в профессии клеточного цикла посредством ингибирования белка р21.

Таким образом, результаты, полученные в ходе выполнения настоящего исследования, помогли подойти ближе к пониманию механизмов индукции пролиферативных процессов под воздействием ядерного рецептора CAR в клетках печени грызунов. Знание механизмов активации пролиферации имеет большое значение для разработки способов коррекции различных патологических состояний.

выводы

1) Введение в течение 2-х месяцев активатора CAR (ТСРОВОР) экспериментальным животным сопровождается увеличением массы печени мышей. Увеличение массы органа ассоциировано с накоплением циклина D1 в клетках печени.

2) Введение мышам ТСРОВОР приводит к снижению экспрессии белка р21 за счет активации рецептора CAR по двум молекулярным механизмам:

а) активированный рецептор CAR предотвращает накопление транскрипционного фактора р53 в печени мышей за счет увеличения экспрессии его негативного регулятора Mdm2;

б) активированный рецептор CAR взаимодействует с транскрипционным фактором FoxOl, блокируя его функциональную активность, при этом подавление транскрипционной активности FoxOl сопровождается снижением уровня самого белка.

3) Введение ТСРОВОР мышам приводит к увеличению уровня белков-регуляторов клеточного цикла pRb, сМус, E2F1, Cdk4 в печени мышей.

Основные результаты изложены в следующих работах

Статьи в рецензируемых журналах

Kazantseva Y.A., Yarushkin А.А., Pustylnyak V.O. CAR-mediated repression of Foxol transcriptional activity regulates the cell cycle inhibitor p21 in mouse livers. Toxicology, 2014;321:73-9.

Kazantseva Y.A., Yarushkin A.A, Pustylnyak V.O. Dichlorodiphenyltrichloroethane technical mixture regulates cell cycle and apoptosis genes through the activation of CAR and ERa in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology, 2013; 271:137-143.

Ярушкин А.А., Казакова Ю.А., Дёмин Д.С., Пустыльняк В.О., Гуляева Л.Ф. Экспрессия генов-мишеней рецепторов CAR и ERa в печени мышей под действием ДДТ. Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина, 2012; Т. 10. № 4. С. 5-13.

Pustylnyak V., Kazakova Y., Yarushkin A., Slynko N., Gulyaeva L. Effect of several analogs of 2,4,6-triphenyldioxane-l,3 on CYP2B induction in mouse liver. Chem Biol Interact, 2011; 194(2-3): 134-8.

Тезисы в сборниках международных конференций Kazantseva Y.A., Yarushkin А.А., Pustylnyak V.O. DDT technical mixture regulates cell cycle and apoptosis genes through the activation of CAR and ERa in mouse livers // EMBO Conference: Nuclear receptors. Linking molecules, genomes & physiology. - Sorrento, Italy, 2013. - P. 123

Kazantseva Y.A., Yarushkin A.A., Pustylnyak V.O. Xenosensor CAR-Mediated Repression of FOXOl Transcriptional Activity Regulates the Cell Cycle Inhibitor p21 in Mouse Livers. // 20th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. - Stuttgart, Germany, 2014. - P. 188.

Подписано в печать 15.05.2015 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 264

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07