Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК

Суворова, Ирина Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК"

На праврхвукописи

Суворова Ирина Игоревна

Активация АТМ/АТК-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК

03.03.04

Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МАЙ 2014 005548229

Санкт-Петербург 2014

005548229

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: Дыбан Павел Андреевич

доктор медицинских наук, профессор Институт экспериментальной медицины РАН

Гордеева Ольга Федоровна

кандидат биологических наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «30» мая 2014 года в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 Сайт института: vvvvvv.cvtspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru Факс института: (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «33» апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют болыцой научно-практический интерес, так как они могут быть использованы для получения дифференцированных производных - клеток и тканей, необходимых для целей регенеративной медицины и клеточной терапии. Дополнительной мощной поддержкой для исследования ЭСК явилась разработка принципиально новых методов, направленных на получение индуцированных плюрипотентных клеток (iPSCs) из обычных соматических клеток, которые имеют много общих свойств с ЭСК. Использование ЭСК в развитии биомедицинских технологиях возможно благодаря их уникальным свойствам — плюрипотентности и самообновлению. Однако главной проблемой терапевтического применения ЭСК остается проблема генетической стабильности популяции этих клеток. На фоне неограниченной пролиферативной активности ЭСК, когда большая часть (60-70%) популяции находится в фазе синтеза, возникающие, в том числе и при репликации ДНК, повреждения ДНК могут накапливаться в виде мутаций. Поскольку возникающие мутации несут серьезную угрозу для всех дифференцированных клеточных потомков, в ЭСК должны функционировать механизмы, которые минимизировали бы последствия различных генотоксических воздействий.

В соматических клетках поддержание стабильности и целостности генома происходит через активацию ATM/ATR-сигнального каскада, который координирует общий клеточный ответ на повреждение ДНК, вовлекая сигнальные пути, ответственные за остановку клеточного цикла (чекпойнт-контроль), репарацию, индукцию апоптоза и старения. Клеточный ответ на повреждение ДНК начинается с активации сенсорных киназ ATM и ATR, которые распознают повреждения ДНК и в свою очередь активируют нижележащие сигнальные пути. Киназы ATM и ATR участвуют в фосфорилировании гистона Н2АХ по Serl39 в области разрывов ДНК с образованием фокусов уН2АХ - обязательный этап для формирования репаративных фокусов. К местам фокусов у112АХ привлекается множество белков, среди которых комплекс Mrel 1/Nbsl/Rad50, MDC1, BRCA-1, адапторный белок 53ВР1, репаративные белки Rad51, киназы DNA-PK и Ки70/80 и другие (Pauli et al., 2000; Fernandez-Capetillo et al., 2003). Параллельно ATM и ATR фосфорилируют нижележащие киназы Chk2 и Chkl и совместно с ними участвуют в активации (фосфорилироваии) и стабилизации опухолевого супрессора р53. Белок р53 является транскрипционным фактором и транс-активирует множество генов-мишеней, в частности ген p21/Wafl, белковый продукт которого ингибирует циклин-зависимые киназные комплексы и опосредует остановку клеточного цикла на границе фаз G(/S при действии генотоксического стресса.

ЭСК не останавливаются в контрольной точке Gj/S клеточного цикла, в которой клетки с поврежденной ДНК не допускаются до процесса репликации и подвергаются только временному блоку G2/M (Малашичева и др., 2002; Becker et al., 2006; Chuykin et al., 2008). Поэтому можно предположить, что в ЭСК реализуются особые механизмы

клеточного ответа на повреждение ДНК, которые строго скоординированы с их главными свойствами - плюрипотентностью и самообновлением - и (в значительной степени) могут отличаться от ответа соматических клеток. Исследование активации ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК при действии генотоксических факторов расширит наше понимание фундаментальных механизмов, лежащих в основе поддержания стабильности и целостности генома этих клеток.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование особенностей активации ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК мыши и человека (мЭСК, чЭСК) после повреждения ДНК. Были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать способность ЭСК к активации сенсорных киназ ATM, ATR и последующему формированию репаративных фокусов в местах повреждений ДНК после облучения.

2. Выявить вклад киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в распределение ЭСК по клеточному циклу, в частности в реализацию временного блока G2/M, и выживаемость после облучения.

3. Проанализировать функциональный статус сигнального пути p53-p21AVafl в ЭСК после повреждения ДНК.

4. Провести сравнительное изучение последствий активации сигнального пути p53-p21/Wan в клетках при действии облучения и при действии нутлина -специфического блокатора протеасомной деградации белка р53 на структуру клеточного цикла и плюрипотентные свойства мЭСК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ингибирование сигнального каскада ATR-Chkl в большей степени, чем ATM-Chk2, оказывает влияние на параметры клеточного цикла мЭСК и выживаемость в норме и после облучения. Киназы ATM, Chk2 и Chkl вовлечены в реализацию блока G2/M после облучения ЭСК человека.

2. В ответ на генотоксическое воздействие ЭСК способны распознавать повреждения ДНК, активируя ключевые киназы ATM и ATR, с последующим формированием репаративных фокусов в местах разрывов ДНК.

3. Несмотря на активацию р53 в ЭСК на ранних сроках после облучения, накопления белка-мишени p21/Wafl не происходит по причине его протеасомной деградации. При этом часть клеток погибает апоптозом, а оставшиеся в живых клетки способны экспрессировать белок p21/Wafl, благодаря чему восстанавливается контрольная точка Gj/S и запускается дифференцировка.

4. Запуск экспрессии p21/Wafl, вызванный действием ингибитора гистон-деацетилаз бутиратом натрия (NaBut) по р53-независимому механизму, также сопровождается восстановлением контрольной точки G]/S.

5. Активация транскрипционного фактора р53, индуцированная как облучением, так и нутлином, сопровождается апоптотической гибелью клеток, а также

приводит к изменению параметров клеточного цикла, снижению экспрессии плюрипотентных маркеров и индукции дифференцировки в выживших клетках.

6. Нутлин-зависимая активация р53 в мЭСК сопровождается накоплением белка p21/Wafl, восстановлением контрольной точки G^S и индукцией дифференцировки. Таким образом, независимо от механизма действия использованных агентов, снижение уровня пролиферативной активности мЭСК, сопровождаемое накоплением белка p21/Wafl, предшествует дифференцировке.

Научная новизна работы

Впервые был продемонстрирован различный вклад киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 киназ в распределение по клеточному циклу и выживаемость ЭСК. Были найдены основные отличия в участии этих киназ в клеточной прогрессии ЭСК человека и мыши. Так, сигнальный каскад ATR-Chkl, но не ATM-Chk2, вносит значительный вклад в распределение мЭСК по клеточному циклу и выживаемость. В отличие от мЭСК, профиль клеточного цикла чЭСК в значительной степени зависит от активности киназы ATM, ее мишени Chk2, а также киназы Chkl, которые участвуют в реализации временного блока Ci2/M после облучения.

Полученные результаты также открывают новые функции р53 в регуляции плюрипотентности и самообновления ЭСК. Мы выявили функциональную значимость исследованной дисфункции сигнального пути p53-p21/Wafl в мЭСК. Так, впервые было показано, что клеточный ответ мЭСК на повреждение ДНК сопровождается не только апоптотичекой гибелью, но и сопутствует индукции программы дифференцировки. Так, активация р53 приводит к подавлению экспрессии плюрипотентных маркеров Oct3/4 и Nanog и последующему запуску дифференцировки после облучения. Кроме того, впервые были исследованы последствия активации белка р53 с помощью агента нутлина на пролиферацию, плюрипотентность и индукцию дифференцировки в мЭСК. Были получены новые данные, что, несмотря на некоторые отличия в р53-зависимом действии облучения и нутлина на экспрессию факторов плюрипотентности Oct3/4 и Nanog, общий механизм подавления плюрипотентного состояния мЭСК обусловлен повышением уровня белка p21/Wafl. Таким образом, частичная дисфункция сигнального пути р53-p21/Wafl, ограничивающая продолжительность фазы Gb способствует подержанию недифференцированного состояния и плюрипотентности ЭСК.

Личный вклад автора

Все экспериментальные части работы были выполнены автором лично. Анализ подготовленных автором проб для проточной цитофлуориметрии осуществлял Аксенов Н.Д. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались с соавторами и научным руководителем.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов, ответственных за сохранение стабильности и целостности генома ЭСК. Нарушения в регуляции

клеточного ответа на повреждение ДНК играют центральную роль в процессах опухолеобразования. Знания о механизмах, участвующих в ответе ЭСК, которые по свойствам во многом сходны с раковыми, на повреждения ДНК могут быть использованы в развитии новых подходов в противоопухолевой терапии.

Кроме того, полученные результаты данного исследования могут быть использованы для повышения эффективности получения аналогов ЭСК -индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPSCs), так как на пути их репрограммирования барьером выступает сигнальный путь p53-p21/Wafl.

Материалы диссертации могут быть включены в лекционные курсы по клеточной биологии.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 1 обзор. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: международной конференции Cell Science and Stem Cell Research (Балтимор, США, 20-22 ноября, 2013 г., устный доклад), международной конференции 1 lft ISSCR (International Society for Stem Cell Research) Annual Meeting 2013 (Бостон, США, 12-15 июня 2013 г., постер), III съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 16-18 октября 2012 г., постер), III конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 15-16 мая 2012 г., устный доклад), II конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г., устный доклад).

Объем и структура диссертации

Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и содержат 9\ схемы и

IЯ рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток, м ЭСК линии IOUD2 культивировали при 37 °С и 5 % С02 в пластиковых чашках Петри (Corning, США), покрытых 0.2%-ным раствором желатина (Sigma, США) в среде DMEM/F12 (Биолот, Россия), содержащей 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.1 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата (Gibco, США,), 10 % сыворотки (Hyclone, США), 50 ед/мл фактора LIF (Sigma, США) или 1000 ед/мл рекомбинантного LIF. Последний был экспрессирован E.coli при использовании конструкции pGEX-2T-hLIF и очищен на глутатион-сефарозе (конструкция любезно предоставлена Томилиным А.Н., Институт цитологии РАН).

чЭСК линии 910 были получены Кожухаровой И.В. в Институте цитологии РАН. Источником для получения чЭСК линии 910 служили избыточные бластоцисты, не использованные в процессе экстракорпорального оплодотворения. Получали чЭСК из

бластоцисты согласно протоколу, описанному Кожухаровой и др. (Кожухарова и др., 2009). Линия чЭСК была адаптирована к бесфидерному культивированию с использованием матригеля (BD Bioscience, США). Культивирование проводили в среде mTeSR (Stemcell Technologies, Канада) при 37 °С в атмосфере 6% С02. Через каждые 5-6 сут колонии чЭСК механически разделяли и пересевали в соотношении 1:2. Среду для культивирования меняли ежедневно.

Клетки линии NIH3T3 культивировали в среде DMEM (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, США) и 0.1 мг/мл гентамицина (Биолот) в атмосфере 5% С02 при 37 °С.

В работе использовали следующие ингибиторы (Calbiochem, Германия): ингибитор киназ ATM/ATR (CGK733, 4 мкМ и 10 мкм), ингибитор только киназы ATM (KU55933, 10 мкМ), ингибитор киназы Chk2 (2-(4-(4-Chlorophenoxy)phenyl)-lH-benzimidazole-5-carboxamide, 8 мкМ), ингибитор киназы Chkl (4-(2-Phenyl)-9-hydroxypyrrolo[3,4-c]carbazole-l,3-(2H,6H)-dione, 2 мкМ).

Культивируемые клетки подвергали рентгеновскому облучению в дозах 1 Гр, 3 Гр и 6 Гр на установках РУМ-17 и РАП-150/300-14.

МТТ-тест. Оценку жизнеспособности клеток производили колориметрическим методом с использованием метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma, США). Метод основан на том, что митохондриальные оксидоредуктазы живых клеток восстанавливают желтый МТТ до пурпурного формазана. Количество образующегося формазана коррелирует с численностью жизнеспособных клеток в популяции. Клеткам заменяли среду на раствор PBS, содержащий 0.5 мг/мл МТТ, и инкубировали 1 ч при 37 °С в атмосфере 5 % С02. Образовавшийся осадок формазана растворяли в ДМСО (Sigma). Оптическую плотность измеряли при длине волны 570 нм против раствора МТТ с ДМСО на спектрофотометре Multiskan EX (Thermo Electron, США). Для каждой экспериментальной точки проводили 6 повторений и подсчитывали стандартную ошибку среднего.

Проточная цитофлуориметрия. Клетки снимали с чашек и промывали PBS. Пермеабилизацию клеток проводили в 0.01%-ном растворе сапонина в PBS и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Затем пробы дважды промывали PBS и инкубировали в растворе РНКазы А (100 мкг/мл) и йодистого пропидия (40 мкг/мл) 15 мин при 37 °С. Пробы подвергали анализу на содержание ДНК на проточном цитофлуориметре Coulter Epics XL (Beckman Coulter). Полученные данные обрабатывали с помощью программы Modfit LT 3.0 (Verity Software House).

Анализ активности каспаз in vitro. Клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ HEPES (ICN) рН 7.4, 0.1 % CHAPS (Sigma), 0.5 % IGEPAL-100 (ICN), 5 мМ DTT (Sigma, США), 30 мин при 4 °С. В реакционную смесь (40 мМ HEPES рН 7.4, 0.1 % CHAPS, 1 мМ DTT и 40 мкМ флуорогенного субстрата AcDEVD-AMC, Sigma) добавляли 40 мкг белка из лизатов, инкубировали 1 ч при 37 °С. Флуоресценцию измеряли на флуориметре GloMax®-Multi Jr. Для подтверждения специфической активации каспаз применялся ингибитор каспаз ZVAD (50 мкМ, Biomol). Подсчет среднего и его стандартной ошибки производили по трем независимым повторениям.

Иммунофлуоресценция. Клетки промывали раствором PBS, фиксировали 4 %-ным параформальдегидом 15 мин и пермеабилизовали 0.2 %-ным тритоном Х-100 в PBS 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки промывали 3 раза по 5 мин в PBS и инкубировали в блокирующем растворе (PBS, 5 % БСА, 0.01 % Tween-20) 1 ч при комнатной температуре. Первые и вторые антитела разводили в блокирующем растворе. В качестве первых антител использовали мышиные антитела против фосфорилированной по Serl981 киназы ATM (Millipore, США), против фосфорилированной по Ser428 киназы ATR (Santa Cruz, США), против фосфорилированного по Serl39 гистона Н2АХ (уН2АХ) (Cell Signaling, США), кроличьи антитела против 53ВР1, Rad51 (Santa Cruz, США), против каталитической субъединицы киназы DNA-PK, фосфорилированной по Ser2056 (Abeam, Англия), против фосфорилированного по Serl5 белка р53 (Cell Signaling). В качестве вторых антител использовали антитела против иммуноглобулинов кролика или иммуноглобулинов мыши, коньюгированные с флуорохромом GAM/GAR-Alexa488 или GAM/GAR-А1еха568; ядра окрашивали То-ргоЗ или DAPI (Invitrogen, США). Препараты исследовали на конфокальных микроскопах Leica TCS SL и Leica TCS SP5.

Электорофорез и иммуноблоттинг. Для экстракции тотального белка использовали буфер на основе PBS, содержащем 1% NP-40, 0.5% дезоксихолата натрия, 0.1% SDS, ингибиторы протеаз и фосфатаз. Лизис проводили 30 мин на льду и далее центрифугировали 14000 g. Количество белка в пробах измеряли по методу Брэдфорд, на гель наносили равное количество белка в каждой пробе (50 мкг). После диск-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях белки переносили на мембрану PVDF (Amersham, Англия). В качестве первых антител использовали антитела против фосфорилированного по Serl5 белка р53, ацетилированного по Lys379 белка р53, против тотальной формы р53, GAPDH (Cell Signaling, США), p21/Wafl, а-tubulin (Sigma, США). В качестве вторых антител использовали антитела кролика против иммуноглобулинов мыши и антитела козы против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с пероксидазой хрена. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham, Англия).

Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol® (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили согласно протоколу производителя (Fermentas), используя ревертазу MMLV (Moloney-murine leukaemia virus), 2 мкг РНК и 1 мкг случайных гексапраймеров (Promega, США).

Количественная ОТ-ПЦР проводилась с использованием набора для ПЦР в реальном времени, содержащего краситель SYBR Green и референсный краситель ROX (Синтол, Россия) на приборе 7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems) в лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН (рук. A.B. Кропотов). Параметры реакции были заданы в соответствии с рекомендациями фирмы Синтол. Были использованы следующие праймеры: oct3/4-F, CAAGTTGGCGTGGAGACT; oct3/4-R, TTCATGTCCTGGGACTCCTC; nanog-F, GATGCAAGAACTCTCCTCCA; nanog-R, CAATGGATGCTGGGATACTC; sox2-F, -

ACATGAACGGCTGGAGCAACG, sox2-R, CATGTAGGTCTGCGAGCTGGTC; gapdh-F, TGTGTCCGTCGTGGATCTGA; gapdh-R, TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG. Уровень экспрессии генов нормализовали относительно gapdh. Каждая экспериментальная точка включала три повторения, для которых рассчитывалась ошибка среднего. Результаты повторяли в независимых экспериментах.

Для обычной ПЦР использовали полимеразу Taq (Fermentas) и следовали протоколу производителя. Концентрация MgCl2 в реакционной смеси составляла 2.5 мкМ. Использовали следующие праймеры: p21/Wafl-F, AAAGCCTCCTCATCCCGTGTT С; p21/Wafl-R, GTCACCCTGCCCAACCTTAGAG; p53-F,

GAGAGACCGCCGTACAGAAG; p53-R, CTTCAGGTAGCTGGAGTGAGC. Праймеры для гена gapdh были те же, что и для количественной ПЦР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активация киназ ATM и ATR в ЭСК после облучения.

В ответ на облучение в дозе 6 Гр киназы ATM и ATR фосфорилируются по Ser 1981 и Ser428, соответственно, и накапливаются в области одно- и двунитевых разрывов ДНК, где фосфорилируют различные белки. На рис. 1 (А, Б) видно, что облучение индуцирует активацию киназ ATM и ATR по сайтам фосфорилирования и их накопление в ядрах мЭСК. В чЭСК также выявляются фосфорилированные по Serl 98 i и Ser428 формы киназ ATM и ATR после повреждения ДF[K (данные не показаны).

Контр оль

Облучение

КОН1|1 оль

Рис. 1. Облучение активирует киназы ATM и ATR в мЭСК.

А - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами

против фосфорилированной по Serl981 формы киназы ATM (зеленый) в контроле и через 30 мин после облучения (6 Гр), ядра окрашены То-ргоЗ (синий);

Б - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами

против фосфорилированной по 5ег428 формы киназы АТЯ (зеленый) в контроле и через 30 мин после облучения (6 Гр), ядра окрашены То-ргоЗ (синий). Масштабная линейка 15 мкм (А, Б).

2. Колокализация фокусов уН2АХ с белками RAD51, DNA-PK и 53ВР1 после облучения в ЭСК.

Через 30 мин после облучения активация киназ ATM и ATR сопровождается фосфорилированием гистона Н2АХ по Serl39 с образованием фокусов уН2АХ -ключевым этапом в сборке репаративных фокусов (рис. 2А, Б, В). Мы исследовали, привлекаются ли к индуцированным облучением фокусам уН2АХ такие репарационные белки как Rad51, DNA-PK и 53ВР1. Было показано, что ключевой белок процесса репарации по типу гомологичной рекомбинации (Homologous Recombination, HR) Rad51 локализуется совместно с фокусами уН2АХ через 30 мин после облучения (рис. 2А). Используя антитела к фосфорилированной по Ser2056 каталитической субъединице комплекса DNA-PK. который участвует в репарации по типу негомологичного воссоединения концов (Non-homologous end joining, NHEJ), мы также обнаружили колокализацию киназы DNA-PK с фокусами уН2АХ в мЭСК через 30 мин после облучения (рис. 2Б). Белок 53ВР1. который является адапторным белком для опухолевого супрессора р53 и одним из центральных участников в создании репаративных фокусов, был также обнаружен с фокусами уИ2АХ через 30 мин после облучения (рис. 2В). Интересно, что в контрольных мЭСК присутствуют неиндуцированные облучением фокусы уН2АХ, которые колокализуются с белком Rad51, в то время как белки DNA-PK и 53ВР1 обнаруживаются с фокусами уН2АХ только в облученных клетках (рис. 2А-В). По всей видимости, высокая пролиферативная активность мЭСК сопровождается различными репликативными коллапсами, устранение которых обеспечивает точная и менее подверженная ошибкам репарация HR.

Мы также исследовали способность чЭСК формировать репаративные фокусы в местах индуцированных повреждений ДНК. Было показано, что в облученных чЭСК также образуются фокусы уН2АХ, которые колокализуются с белками 53ВР1 и с Rad51 (данные не показаны).

3. Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение мЭСК по фазам клеточного цикла и выживаемость.

Киназы ATM и ATR играют ключевую роль не только в формировании репаративных фокусов, но и в активации контрольных точек клеточного цикла при повреждении ДНК через фосфорилирование своих субстратов Chk2 и Chkl, соответственно (Helt et al., 2005). Мы проанализировали эффект ингибиторов киназ ATM/ATR и их мишеней киназ Chk2/Chkl на распределение мЭСК по фазам клеточного цикла до и после облучения. Согласно нашим и литературным данным, облученные мЭСК не останавливаются в контрольной точке G^S клеточного цикла и реализуют лишь временную задержку на границе фаз G2/M (рис. ЗА, Б) (Малашичева и др.. 2002; Hong et al., 2004; Chuykin et al.. 2008; Momcilovic et al., 2009). Мы обнаружили существенное снижение доли S-фазных клеток (с 72 до 56 %) через 20 ч культивирования в присутствии ингибитора киназ ATM/ATR, который в сочетании с облучением вызывал еще большее снижение числа S-фазных клеток и накопление клеток на границе фаз G2/M (рис. ЗА, Б). Ингибитор только киназы ATM слабо влиял на распределение мЭСК по фазам клеточного цикла как в норме, так и после облучения по сравнению с ингибитором обеих киназ ATM и ATR.

Рис. 2. Облучение индуцирует формирование фокусов уН2АХ, колокалимшанных с белками 1<ас151, DNA-PK и 53ВР1 в мЭСК. А - иммунофлуоресцентное окрашивание белков Яас)51 (зеленый) и уН2АХ (красный), ДНК (То-ргоЗ, синий) в норме и через 30 мин после облучения (6 Гр); Б - окраска мЭСК на фосфорилированную по 8ег2056 каталитическую субъединицу киназы ЭЫА-РК. (зеленый), уН2АХ (красный) и ДНК (БАР!, синий) в норме и через 30 мин после облучения (6 Гр); В - окраска на уН2АХ (зеленый), 53ВР1 (красный) и ДНК (То-ргоЗ, синий) в норме и через 30 мин после облучения (6 Гр). Масштабная линейка 3.75 мкм (А), 5 мкм (Б), 6 мкм (В).

Ингибитор киназы Chkl незначительно влиял на параметры распределения мЭСК по клеточному циклу, но при совместном действии с облучением вызывал значительное накопление мЭСК в фазе G[ и их уменьшение на границе фаз G2/M. Мы не обнаружили эффекта подавления активности киназы Chk2 на распределение мЭСК по клеточному циклу, как в норме, так и после облучения, что согласуется с данными литературы о локализации этой киназы на цетросомах и ее функциональном ограничении (Hong et al., 2004).

Eil

71 1?

Контр Ингнб. Ilinnf Ингнб. Ингнб. ATM ATMATR Chkl C'hk2

Облуч Ингнб. Ингиб. Ингиб Ингнб ATM ATM AIR Clikl Chk2

Рис. 3. Сигнальный путь ATR-Chkl вносит вклад в распределение мЭСК по фазам клеточного цикла. Данные проточной цитофлуориметрии представлены в виде диаграмм (доли клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, представлены в %). Обработка мЭСК ингибиторами киназ ATM/ATR (4 мкМ), ATM (10 мкМ), Chkl (2 мкМ), Chk2 (8 мкМ) в норме (А) и после облучения (Б). Ингибиторы добавляли за 1 ч до облучения (6 Гр) и далее оставляли на 20 часов.

Используя МТТ-тест, мы проанализировали выживаемость мЭСК через 20 ч после обработки клеток теми же ингибиторами киназ в норме и после облучения (рис. 4А, Б). В соответствии с данными проточной цитофлуориметрии, в норме ингибитор ATM/ATR вызывает значительную гибель клеток через 20 ч после обработки, и особенно в сочетании с облучением усиливает этот эффект, снижая жизнеспособность до 20 % (рис. 4А). Ингибитор киназы Chkl также приводил к существенной гибели клеточной популяции после облучения, хотя сам по себе незначительно влиял на выживаемость мЭСК в норме (рис. 4А). Ингибирование только киназы ATM и ее мишени Chk2 незначительно влияло на жизнеспособность клеток, как в норме, так и после облучения (рис. 4А, Б). Таким образом, мы выявили преобладающую роль киназы ATR по сравнению с ATM в регуляции распределения мЭСК по клеточному циклу и в выживаемости после облучения, а также существенную роль ее нижележащей мишени Chkl. Согласно данным иммунофлуоресценции (рис. 1Б), контрольные мЭСК окрашиваются антителами против фосфорилированной формы киназы ATR (Ser428), что может свидетельствовать о пороговом уровне активности этой киназы, который необходим для исправления дефектов, возникающих в процессе репликации ДНК. Нокаут гена atm у мышей не является летальным, хотя животные характеризуются отсталостью в росте и ослабленной фертильностью, то время как нокаут гена atr ведет к эмбриональной летальности (de Klein et al., 2000). Более того, бластоцисты, полученные

от мышей atr-/-, умирали в культуре по механизму митотической катастрофы (Banuelos et al.. 2008). Кроме того, полученные результаты согласуются с данными литературы, что Chkl("/") вызывает летальность у эмбрионов мышей, в то время как Chk2("'~> мыши являются жизнеспособными, предполагая важную роль киназы Chkl в поддержании стабильности генома (Liu et al., 2000; Lam et al., 2004). По всей видимости, менее заметная роль киназы ATM в наблюдаемом ответе мЭСК на повреждение ДНК может быть связана с функциональными ограничениями ее субстрата киназы Chk2. которая локализована на центросомах.

« I : I

8 5 ?

Контр Ингнб ][ншб Ингиб. ATMATR Clikl CUM

I? 20

Контр Ингпб

ATM

Рис. 4. Сигнальный путь ATR-Chkl вносит вклад в выживаемость мЭСК (МТТ-тест).

Влияние ингибиторов киназ ATM/ATR (4 мкМ), Chk2 (8 мкМ), Chkl (2 мкМ) (А) и ATM (10 мкМ) (Б) на жизнеспособность мЭСК в контроле (белые столбг/ы) и через 20 ч после облучения (6 Гр) (черные столбцы).

4. Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение чЭСК по фазам клеточного цикла.

Чтобы исследовать вклад киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в регуляцию клеточного цикла чЭСК. мы проанализировали результат действия соответствующих ингибиторов киназ на распределение ЧЭСК по клеточному циклу с помощью проточной цитофлуориметрии (рис. 5А, Б). В норме ингибиторы киназ ATM, ATM/ATR и (в меньшей степени). Chkl, Chk2 вызывают накопление клеток в фазе G), но не влияют на долю клеток, находящихся в фазах G2/M (рис. 5А). При действии облучения на фоне ингибиторов киназ доля аккумулированных чЭСК на границе G2/M становится значительно меньше, чем в случае облучения без ингибиторов киназ, и происходит накопление клеток в фазе Gj. Интересно, что действия ингибитора только ATM и ингибитора ATM/ATR не различаются, то есть нет ожидаемого дополнительного ингибирования ATR в чЭСК. Таким образом, ингибитор киназы ATM практически полностью отменял 02/М-блок клеточного цикла в чЭСК после облучения, что соответствует данным литературы о непосредственной вовлеченности ATM в реализацию этого блока в чЭСК (Momcilovic et al., 2009). А киназа ATR, по-видимому, не участвует в активации чекпойнт-отвега в чЭСК. в частности в осуществлении G2/M-блока клеточного цикла, но может играть ключевую роль в процессах репарации (Adams et al., 2010).

— ш т 31 т L 29 Г ш

40 35 ЭБ 30 j аН 72 _J В 2D 23

50 _| 46 _! 56 53 _ 19 39 51 49 51 51

Контр Ига,..-. Ннгпи цнгпи Инги» Облуч. 1[нт6. ]1нг1гб. Ннгпй Ннгпб

ATM ATMATR Clikl С'],к2 ATM ATMATR Chkl C'hkJ

Рис. 5. Кииазы ATM, Chkl и Chk2 влияют на распределение чЭСК но фазам клеточного цикла. Данные проточной цитофлуориметрии представлены в виде диаграмм (доли клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, представлены в %). Обработка чЭСК ингибиторами киназ ATM/ATR (10 мкМ), ATM (10 мкМ), Chkl (2 мкМ), Chk2 (8 мкМ) в норме (А) и после облучения (Б). Ингибиторы добавляли за 1 ч до облучения (6 Гр) и далее оставляли на 20 часов.

5. Активация сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК.

Активация контрольной точки G)/S клеточного цикла лежит через активацию канонического сигнального пути p53-p21/Wafl. Так как ЭСК не останавливаются в своей прогрессии на границе фаз G,/S в ответ на повреждение ДНК, мы проанализировали функциональный статус сигнального пути p53-p21/Wafl в мЭСК после облучения. В ответ на повреждение ДНК белок р53 фосфорилируется по Serl 5 киназами ATM и ATR, что освобождает его от взаимодействия с негативным регулятором Mdm2. Активированный р53 стабилизируется и аккумулируется в ядре, где функционирует как транскрипционный фактор (Riley et al., 2008). С помощью антител против фосфорилированной по Serl 5 формы р53 мы показали, что облучение

(S«15)

ДНК С овмещ ение

О 2 ч 4 ч 8 ч

Контр ОЛЬ

2 ч v <э ш

6ч % * ш « *v г » « * г •j

24 ч А; ¿9

р53 (Sel l?) р53 (Lys3 75>) р53

a tub и tin

Рис. 6. Белок 53 активируется после облучения в мЭСК и локализуется в ядре. А — иммунофлуоресцентное окрашивание мЭСК в норме и через 2, 6, 24 ч после облучения на фосфорилированную по Бег15 форму р53 (зеленый) и ДНК (ОАР1, синий). Масштабная линейка — 25 мкм. Б — Вестерн-блот лизатов, полученных из мЭСК в норме и через 2, 4, 8 ч после облучения, окраска на фосфо-р53 (5ег15), ацетил-р53 (Ьуэ379), тотальный р53 и альфа-тубулин.

индуцирует активацию р53, максимум которой наблюдается через 2 ч после облучения (рис. 6А. Б). Согласно данным иммунофлуоресценции фосфорилирование р53 по вег 15 поддерживается на протяжении 24 ч, и все это время активированный белок локализуется в ядре, что необходимо для осуществления его транскрипционных функций (рис. 6А). Ацетилирование р53 по Ьуз-379 в мЭСК свидетельствует о его полноценной ДНК-связывающей активности и транс-активационном потенциале (рис. 6Б).

Белок р53 способен транс-активировать множество генов-мишеней, среди которых особую роль играет ген р21/И/а/1 (сс1кп1а), так как его белковый продукт ингибирует циклин-зависимые киназные комплексы и запрещает клеточную прогрессию при переходе из фазы в фазу в после повреждения ДНК. Методом ОТ-ПЦР мы обнаружили, что при действии ДНК-повреждающих агентов запускается транскрипция гена однако накопления его белкового продукта не происходит в отличие от

клеток линии МНЗТЗ (рис. 7А. Б).

мЭСК

тттз

о s.

20 ч 0 S ч 20 ч

p2VWafl gapdh

I с MGB2

pllWafl i GAPDH ['

p21AVafl * I u-hibulm

Рис. 7. Ингибиторы протеасомной деградации вызывают накопление белка р21Л\/аП в мЭСК. А - результаты ОТ-ПЦР транскриптов гена р21/\¥а/1 в мЭСК в норме и через 6 ч после облучения (6 Гр). Б - Вестерн-блот лизатов, полученных из мЭСК и клеток линии Ы1НЗТЗ, в норме и через 8, 20 ч после облучения (6 Гр). В - Вестерн-блот лизатов мЭСК в норме и после 4 ч обработки протеасомными ингибиторами - лактацистином (Ьс, 10 мкМ) и [УЮ132 (10 мкМ). Окраска на р21АУаП и вАРОИ

Чтобы исследовать, связано ли отсутствие белка p21/Wafl в мЭСК с его негативной регуляцией на посттраисляционном уровне, мы использовали ингибиторы протеасомной деградации лактацистин (Lc) и MG-132. Было показано, что оба ингибитора вызывают накопление белка p21/Wafl в мЭСК (Рис. 7В), при этом обработанные лактацистином клетки накапливаются в Gb что может свидетельствовать об удлинении фазы Gi (данные проточной цитофлуориметрии не показаны). Таким образом, накопления белка p21/Wafl в мЭСК после облучения не происходит по причине его протеасомной деградации, что вероятно определяет отсутствие контрольной точки G|/S в этих клетках.

Итак, р53-зависимая экспрессия p21/Wafl в соматических клетках является одним из ключевых событий в клеточном ответе на повреждение ДНК, так как индуцируется арест клеточного цикла в фазах G,/S или G2/M (Bartek et al.. 2001; Taylor and Stark. 2001). Как уже было сказано выше, дисфункция сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК. вероятно, связана с поддержанием их недифференцированного состояния, а отсутствие p21/Wafl в этих клетках способствует их быстрой пролиферации. Ранее было

обнаружено, что транс-активация гена p21/Wafl и последующее накопление его белкового продукта в клетках может происходить независимо от белка р53 (Macleod et al., 1995; Garte! et al„ 2000). Мы решили разобщить путь p53-21/Wafl в ЭСК и индуцировать р53-независимую транскрипцию гена p21/Wafl. используя ингибитор гистоновых деацетилаз (HDAC1. histone-deacetylase inhibitor) бутират натрия (NaBut). Мы обнаружили, что через 24 ч после обработки NaBut наблюдается транс-активация гена p21/Wafl и накопление его белкового продукта, что сопровождается накоплением клеток в фазе G| и свидетельствует о понижении пролиферативной активности мЭСК (Рис. 8А, Б). Интересно, что белок р21/Wafl, аккумулированный в клетках, обработанных NaBut. не подвергается протеасомной деградации, что свидетельствует о снятии его негативной пост-трансляционной регуляции. Таким образом, экспрессия p21/Wafl в ЭСК может происходить независимо от белка р53, задействуя совершенно другие механизмы, отличные от клеточного ответа на повреждение ДНК. Можно предположить, что эти механизмы, приводящие к аккумуляции p21/Wafl, в ЭСК могут использоваться для запуска дифференцировки.

Контроль

NaBut

G,: 53% G2/M 19«'. S: 28°'Ь

NaBut

p21/]¥afl gapelh

NaBut

pZlAVafl GAFDH

Рис. 8. Ингибитор IIDAC NaBut вызывает накопление белка p21/Wafl и индуцирует блок G1/S в мЭСК. А - Проточная цитофлуориметрия мЭСК в норме и через 24 ч после обработки NaBut (4 мМ). Б - ОТ-ПЦР транскриптов гена p21/Waf I в мЭСК в контроле и через 6 ч после облучения (6 Гр). В - Вестерн-блот лизатов, полученных из мЭСК, в контрольной пробе и после обработки NaBut (24 ч, 4 мМ).

6. Функциональные последствия активации р53, вызванной облучением, на плюрипотентные свойства мЭСК.

Ранее уже было показано участие белка р53 в индуцируемой ретиноевой кислотой дифференцировке ЭСК (Jain et al., 2012). Кроме того, р53 способен прямо супрессировать транскрипцию гена nanog в мЭСК после повреждения ДНК, тем самым способствуя дифференцировке (Lin et al.. 2005). Можно предположить, что для ограничения функций белка р53 и его влияния на плюрипотентные свойства в мЭСК реализуются механизмы негативной регуляции его белка-мишени р21/Wafl. Соответственно, активность белка р53 в ЭСК может быть преимущественно связана с инициацией апоптотической гибели (Sabapathy et al., 1997; Corbet et al.. 1999). Так, в соответствии с данными МТТ-теста. через одни сутки после облучения в дозе 6 Гр

наблюдается гибель около 50% популяции мЭСК, что корелирует с высоким уровнем активности каспазы-3 в этих клетках (рис. ЗА; рис. 9). С другой стороны, опираясь на полученые данные и данные литературы, можно предположить, что в ходе ответа мЭСК на повреждение ДНК активация белка р53 может вовлекать не только запуск апоптоза. а также индукцию программы дифференцировки. Чтобы проверить это предположение, мы снизили дозу облучения до 3 Гр, уменьшив цитотоксический эффект радиации (рис. 9), и проанализировали последствия детектированной нами активности белка р53 на плюригютентное состояние выживших мЭСК после облучения.

; в

1 д

6 Гр

лд

«Гр

1 д

ЗГр

зд згр

| д 6 гр

+ZVAD

Рис. 9. Облучение индуцирует высокий уровень апоптоза в мЭСК.

Активность каспазы-3 in vitro в контрольных клетках и через 1 и 3 дней после облучения в дозах 6 Гр и 3 Гр. Негативный контроль - каспазная активность при добавлении в реакцию ингибитора ZVAD.

Мы исследовали динамику активации р53 на 1 и 3 дни после облучения, а также динамику транскрипции rz.wA.p2l/Wafl и накопление его белкового продукта в мЭСК. В соответствии с данными иммунофлуоресценции (рис. 6А и рис. 10А, верхняя панель), активность р53 наблюдается в течение суток после облучения, а на 3-й день падает, что может быть связано с осцилляционными особенностями этого белка в клетках (Zhang et al., 2011). Интересно, что на 3-й день после облучения мы детектировали усиление транскрипции гена p2l/Wafl и накопление его белкового продукта (рис. 10А, средняя и нижняя панели). Используя метод проточной цитофлуориметрии, мы обнаружили, что накопление белка p21/Wafl на 3-й день после облучения коррелирует с аккумуляцией мЭСК в фазе G] клеточного цикла и уменьшением числа пролиферирующих клеток (рис. 10Б). Таким образом, на 3-й день после облучения происходит отмена деградации белка p21/Wafl и восстановливается функционально-активный p53-p21/Wafl путь.

А Б

К 1 д Зд _ —т |p53Serl5 j.

Р53

a-tubuhn

К 1 д Зд

Ip2l/Wafl gapdh

К 1л Зд

p21/Wafl CL-tubulin

Контроль

1 Зд

О,: 38%

S: 51 %

G2M: 11 %

Рис. 10. Активация р53-р21/\\'аП пути при облучении мЭСК увеличивает долю С1-фашых клеток и снижает долю клеток в 8-фа)е. А - Вестерн-блот лизатов мЭСК в норме и через 1, 3 дней после облучения (3 Гр) (верхняя панель); ОТ-ПЦР транскриптов гена р21/\Уа/1 в тех же временных точках (средняя панель); Иммуноблоттинг белка р21Л¥аП в тех же временных точках (нижняя панель). Б — Проточная цитофлуориметрия контрольных мЭСК и через 1, 3 дней после облучения (3 Гр).

Используя метод количественной ОТ-ПЦР, мы проанализировали уровень РНК-транскриптов генов плюрипотентности nanog, ос13/4 и 50x2 на 1-й, 3-й и 5-й дни после облучения в мЭСК (рис. ПА). Согласно полученным данным, активация р53 в облуче нных мЭСК приводит к постепенному снижению транскрипции генов nanog и ос13/4 и коррелирует с уменьшением их экспрессии на уровне белка (рис. 11А. Б). Интересно, что уровень экспресии 8ох2 остается практически постоянным как на уровне РНК, так и на уровне белка в облученных мЭСК.

. I ril

Ö гт.

ocß/4

1д Зд

?Д 5д

rin

1 д

Зд 5 д

2 т J. 5 -

1 -

0,5

о L

sox2

-Т±т

ГЁ

rfi

1 д 3 д 5 д

Рис. 11. Активация р53 снижает экспрессию Ос13/4 и Nanog после облучения мЭСК. А - Результаты количественной ОТ-ПЦР транскриптов генов nanog, ОС13/4, 8ох2 в контрольных мЭСК и через 1, 3 и 5 дней после облучения (3 Гр). Значения нормализованы относительно экспрессии гена ga^?a'Л. Указаны ошибки среднего по трем повторениям. В - Иммуноблоттинг белков, полученных из контрольных мЭСК и через 1, 3 и 5 дней после облучения (3 Гр).

Мы обнаружили, что снижение экспресии плюрипотентных факторов Oct3/4 и Nanog сопровождается запуском транскрипции генов дифференцировки эндодермапьного направления soxl7 и afp на 5-й день после облучения в мЭСК (рис. 12А). Кроме того, мы обратили внимание на морфологические изменения мЭСК на 5-й день культивирования после облучения, которые сопровождались появлением обособленных от колоний клеток (рис. 12Б). Окрашивание щелочной фосфатазы в этих клетках вывило пониженную активность фермента по сравнению с колониями мЭСК. что может свидетельствовать о более дифференцированном фенотипе (данные не показаны).

А Б

К 1д Зд 5 д

Контрольные

Рис. 12. Индуцированная облучением активация р53 сопровождается запуском дифференцировки после облучения мЭСК. А - ОТ-ПЦР транскриптов генов sox!7 и afp: Б - общий вид колоний мЭСК в норме и через 5 дней после облучения (3 Гр), проходящий свет.

7. Последствия нутлин-зависимой активации белка р53 на плюрипотентные свойства мЭСК.

Чтобы подтвердить зависимость наблюдаемых последствий облучения на плюрипотентные свойства мЭСК от активации белка р53, мы использовали специфичный фармакологический агент нутлин. Нутлин специфично ингибирует взаимодействие р53 с его негативным регулятором убиквитин-лигазой Mdm2, что способствует стабилизации р53. Согласно полученным данным, в нутлин-обработанных мЭСК диссоциация комплекса p53-Mdm2 приводит к фосфорилированию р53 по Ser15. который функционирует как транскрипционный фактор, запуская транскрипцию гена p21/Wafl (рис. 13А, верхняя и средняя панели). Интересно, что накопление p21/Wafl в мЭСК происходит уже через сутки после обработки нутлином, в то время как после облучения аккумуляция этого белка детектируется только на 3-й день (рис. 10А). Согласно результатам проточной цитофлуориметрии, нутлин-зависимая активация сигнального пути p53-p21/Wafl сопровождается постепенным увеличением доли клеток в Gl фазе и снижением их числа в фазе S как результат индукции блока G1/S (рис. 13Б).

Рис. 13. Нутлин-зависимая активация р53 сопровождается накоплением белка p21/Wafl и увеличением доли клеток, находящихся в фазе Gl. А - Вестерн-блот лизатов из необработанных мЭСК и через I и 3 дней после обработки нутлином (10 мкМ) (верхняя панель); ОТ-ПЦР транскриптов гена p21/Wafl в тех же временных точках (средняя панель); Вестерн-блот лизатов в тех же временных точках (нижняя панель). Б - Проточная цитофлуоримегрия контрольных мЭСК и через 1 и 3 дней после обработки нутлином (10 мкМ).

Стоит отметить, что мы также зафиксировали около 30% гибель популяции мЭСК через 1 сутки обработки нутлином, что связано с запуском апоптоза (данные каспазного анализа in vitro и МТТ не показаны). Иначе говоря, другим ответом мЭСК на нутлин-зависимую активацию р53 является индуцированная клеточная гибель. Стоит также отметить, что нутлин-зависимая активация р53, в отличие от облучения, по-видимому, не сопровождается активацией клеточного ответа на повреждение ДНК. так как мы не зафиксировали активной формы ATM (Ser 1981) (данные не показаны).

Неожиданно для нас результаты количественной ОТ-ПЦР показали, что нутлин-опосредованная активация р53 приводит к значительному снижению экспрессии только гена oct3/4, в то время как уровни транскрипции генов nanog и sox2 практически не меняются (рис. I4A). На уровне белка мы также детектировали снижение только Oct3/4

Нутлин к 1 д Зд

р53 Serl5 р53

o.-tubulin

Нут

К 1 д Зд

p2UWa.fi gapdh

Нутлин К 1д Зд

G,: 20% S: 60% G2/M 20%

Gj: 24% S: 44% G2/M: 32%

p21/Waf 1 a-tubulm

Нутлин

Зд Gj: 40%

S: 42% , G2/M: 18%

на 5-й день обработки нутлином в отличие от остальных маркеров плюрипотентности, уровень которых не менялся. Интересно, что в облученных мЭСК активация р53 приводит к снижению транскрипции как гена ос13/4. так и nanog. Можно предположить, что в нутлин-обработанных мЭСК р53 не претерпевает всех пост-трансляционных модификаций, необходимых для подавления экспрессии nanog1 как, например, в облученных мЭСК.

nanog

oct3/4

т : г Зй

sox2

1 Д 3 д 5 д

1Д Зд 5 д

Рис. 14. Нутлин-зависимая активация р53 снижает экспрессию Ос13/4 в мЭСК. А - Результаты количественной ОТ-ПЦР на продукты генов nanog, омЗ/4, 50x2 в контрольных мЭСК и через 1, 3 и 5 дней обработки нутлином (10 мкМ). Значения нормализованы относительно экспрессии gapdh. Указаны ошибки среднего по трем повторениям. В -Иммуноблоттинг белков в контрольных мЭСК и через I. 3 и 5 дней обработки нутлином (10 мкМ).

Снижение экспрессии Oct3/4 в нутлин-обработанных клетках было достаточно для активации генов дифференцировки эндодермального и мезодермального направлений (рис. 15А). С помощью ОТ-ПЦР были обнаружены РНК-транскрипты генов soxl7,gata6, afp (рис. 15А). По сравнению с облучеными мЭСК, экспрессия генов дифференцировки наблюдается уже через 1 день обработки клеток нутлином, что свидетельствует о более быстром запуске программы дифференцировки. Мы также обнаружили морфологические изменения в нутлин-обработанных мЭСК, сходные с облученными клетками: появление одиночных теряющих контакты с колонией клеток (рис. 15Б). Окрашивание щелочной фосфатазой также показало дифференцированный фенотип этих клеток (данные не показаны).

Б Контроль Нутлин, 5 д

Нутлин

gарак , , .. «га ■■ „

Г ' ■■ Г s < •ЫЯЯ

Рис. 15. Нутлин-зависимая активация р53 индуцирует днффереицировку в мЭСК. А -ОТ-ПЦР транскриптов маркеров дифференцировки soxl 7, gataö, afp. Б - общий вид колоний мЭСК в норме и спустя 5 дней обработки нутлином (10 мкМ), проходящий свет.

Заключение

Итак, согласно нашим данным, несмотря на высокую скорость пролиферации и отсутствие Gj/S контрольной точки ЭСК мыши способны распознавать повреждение ДНК и активировать сенсорные киназы ATM, ATR с последующим фосфорилированием гистона Н2АХ по Serl39 (уН2АХ) и формированием репаративных фокусов. Мы выявили, что в местах индуцированных ДНК-повреждений с фокусами уН2АХ ко-локализуются белки 53ВР1, Rad51 и DNA-PK. Белок 53ВР1 является адапторным белком для р53, а также может координировать процессы репарации, и его наличие в местах повреждений свидетельствует об активации чекпойнт-ответа в ЭСК после облучения. Колокализация фокусов уГОАХ с белком Rad51 отражает процесс репарации по типу гомологичной рекомбинации, который исключает появление ошибок, используя в качестве матрицы сестринскую хроматиду. А колокализация уН2АХ с белком Rad51 как в норме, так и после облучения, свидетельствует о предпочтении этими клетками HRR-пути независимо от источника повреждений. Кроме того, после облучения с фокусами уН2АХ в мЭСК мыши колокализуется киназа DNA-PK, которая, в свою очередь, активирует процессы репарации по механизму негомологичного воссоединения концов. По всей видимости, мЭСК демонстрируют уникальную репарационную стратегию с использованием обоих типов репараций поврежденной ДНК, а также их возможного переключения.

При анализе вклада ATM, ATR и их мишеней Chk2 и Chkl в распределение мЭСК по клеточному циклу и выживаемость после облучения было установлено, что ингибирование киназы ATR в значительной степени усиливает цитотоксическое действие облучения, снижая долю клеток в S-фазе, а ее мишень киназа Chkl участвует в осуществлении временного блока G2/M. По-видимому, ATR играет важную роль в репарации дефектов, возникающих в процессе репликации. Интересно, что в чЭСК получены другие результаты: мы не выявили большой роли киназы ATR в регуляции клеточной прогрессии в отличие от киназ ATM, Chkl и Chk2, которые участвуют в реализации блока G2/M.

Мы исследовали функциональный статус сигнального пути p53-p21/Wafl, который необходим для реализации контрольной точки G1/S. Мы показали, что после облучения р53 активируется и аккумулируется в ядре, где выполняет свои транскрипционные функции, в частности транс-активирует один из своих главных генов мишеней -p21AVafl. Однако, несмотря на запуск экспрессии гена p21/Wafl, накопления самого белка не происходит по причине его деградации. Также показано, что экспрессия p21/Wafl в мЭСК может регулироваться через р53-независимые механизмы и сопровождается удлинением фазы Gl. Таким образом, каноническая роль р53 в соматических клетках как активатора блока G1/S в ЭСК не реализуется вследствие низкого уровня белка p21/Wafl. Соответственно, накопление белка p21/Wafl наблюдается в дифференцирующихся ЭСК и предшествует восстановлению контрольной точки G1/S. Об этом свидетельствуют полученные данные о том, что индуцированная облучением активация р53, а также его стабилизация при действии

нутлина, снижают плюрипотентные свойства мЭСК и индуцируют программу дифференцировки. Таким образом, один из механизмов поддержания плюрипотентного состояния ЭСК заключается в ослаблении функции р53-зависимого чекпойнта G1/S. По этой причине активация ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК, что необходимо для инициации репарации ДНК, не приводит к остановке клеток в контрольной точке G[/S из-за дисфункции сигнального пути p53-p21/Wafl.

Выводы

1. Ингибирование ATR-Chkl сигнального пути, но не ATM-Chk2, влияет на распределение мЭСК по фазам клеточного цикла и выживаемость, в то время как в ЭСК человека сигнальный путь ATM-Chk2 при участии Chkl играет важную роль в реализации блока G2/M после облучения.

2. Облучение ЭСК индуцирует активацию киназ ATM, ATR с последующим формированием фокусов уП2АХ, колокализованных с белками репарации ДНК 53ВР1, Rad51 и DNA-PK.

3. Облучение активирует транскрипционный фактор р53 в мЭСК, который запускает транскрипцию гена-мишени p21/Wafl. Однако накопления белка p21/Wafl не наблюдается вплоть до 24 ч после облучения вследствие его протеасомной деградации.

4. Большая часть облученных мЭСК погибают по механизму апоптотической гибели, тогда как оставшиеся клетки после некоторого лаг-периода претерпевают изменения в структуре клеточного цикла: запускается экспрессия p21/Wafl, увеличивается доля клеток в фазе Gi восстановается функционирование контрольной точки Gi/S, а также снижается содержание факторов плюрипотентности Oct3/4 и Nanog и инициируется программа дифференцировки.

5. Нутлин-зависимая активация р53 в мЭСК также сопровождается аккумуляцией белка p21/Wafl, восстановлением контрольной точки G¡/S и индукцией дифференцировки. Таким образом, независимо от механизма действия использованных агентов, вызывающих накопление белка p21/Wafl, это снижает темпы пролиферации и направляет мЭСК в дифференцировку.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Суворова II.IL, Поспелов В.А. Исследование репаративных фокусов в эмбриональных стволовых клетках мыши после повреждения ДНК // Цитология, 2014. Т.56(5), С.340-345.

2. Суворова II.IL, Кожухарова И.В., Никольский H.H., Поспелов В.А. Активация ATM/ATR - киназного сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках человека после повреждения ДНК // Цитология, 2013. Т.55(12), С.841-851.

3. Suvorova I.I., Katolikova N.V., Pospelov V.A. New insights into cell-cycle regulation and DNA damage response in embryonic stem cells// Int Rev Cell Mol Biol. 2012. V.299. P. 161—198.

4. Suvorova I.I., Grigorash B.B., Pospelov V.A. DNA damaged-induced activation of ATM/ATR is not accompanied by Gl/S cell cycle arrest in mouse embryonic stem cells// J

Cell SciTher. 2013. V.4.P. 86.

5. Suvorova I.I., Pospelov V.A. Analysis DNA damage response in mouse embryonic stem cells // Материалы 11th ISSCR (International Society for Stem Cell Research) Annual Meeting 2013, Бостон, США, 12-15 июня 2013 г. Poster abstracts. W-2298

6. Григораш Б.Б., Суворова Н.И., Поспелов В.Л. Последствия реактивации р53 в эмбриональных стволовых клетках мыши // Материалы 17 Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 21-26 апреля 2013 г. Сборник тезисов. С. 190.

7. Суворова И.И., Магнес О.Г., Поспелов В.А. Активация р53 в эмбриональных стволовых клетках ведет к уменьшению их плюрипотентных свойств и апоптозу // Материалы III съезда общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 16-18 октября 2012 г., Цитология. 2012. Т.54. №9. С.708

8. Суворова II.II. Активация ATM/ATR сигнального пути при действии ДНК-повреждающих агентов не сопровождается блоком G1/S клеточного цикла в ЭСК человека и мыши // Материалы III конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 мая 2012 г, Цитология. 2012. Т.52. №6. С.720.

9. Суворова И.И., В.А. Поспелов. Анализ сигнальных путей, участвующих в ответе ЭСК на повреждение ДНК // Материалы II конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г., Цитология. 2010. Т.52. №6. С.508.

Список цитируемой литературы.

Кожухарова И.В., Фридлянская И.И., Ковалева З.В., Пуговкина Н.А., Алексеенко JI.JL, Зенин В.В., Иванцов К.М., Леонтьева O.K., Гринчук Т.М., Никольский Н.Н. Новые линии эмбриональных стволовых клеток человека С612 и С910// Цитология. 2009. Т. 51. №7. С. 551-557.

Малашичева А.Б., Кислякова Т.В., Саватьер П., Поспелов В.А. Эмбриональные стволовые клетки не останавливаются в клеточном цикле при действии повреждающих факторов// Цитология. 2002. Т. 44. №7. С. 643-648.

Adams B.R., Golding S.E., Rao R.R., Valerie К. Dynamic dependence on ATR and ATM for double-strand break repair in human embryonic stem cells and neural descendants// PLoS One. 2010. V.5. №4. P.e 10001.

Banuelos C.A., Banath J.P., MacPhail S.H., Zhao J., Eaves C.A., O'Connor M.D., Lansdorp P.M., Olive P.L. Mouse but not human embryonic stem cells are deficient in rejoining of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks// DNA Repair. 2008. V.7. №9. P.1471-1483.

Bartek J., Lukas J. Pathways governing Gl/S transition and their response to DNA damage//FEBS Lett. 2001. V.490. №3. P. 117-22.

Becker K.A., Ghule P.N., Therrien J.A., Lian J.B., Stein J.L., van Wijnen A.J., Stein G.S. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G, cell cycle phase// J Cell Physiol. 2006. V.209. №3. P.883--893.

Chuykin I.A., Lianguzova M.S., Pospelova T.V., Pospelov V.A.. Activation of DNA damage response signaling in mouse embryonic stem cells// Cell Cycle. 2008. V.7. №18. P.2922-2928.

Corbet S.W., Clarke AR, Gledhill S., Wyllie A.H. P53-dependent and -independent links between DNA-damage, apoptosis and mutation frequency in ES cells// Oncogene. 1999. V.18. №8. P.1537-1544.

De Klein A., Muijtjens M., van Os R., Verhoeven Y., Smit B., Carr A.M., Lehmann

A.R., Hoeijmakers J.H. Targeted disruption of the cell-cycle checkpoint gene ATR leads to early embryonic lethality in mice// Curr. Biol. 2000. V.10. №8. P.479-482.

Fernandez-Capetillo O., Celeste A., Nussenzweig A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors// Cell Cycle. 2003. V.2. №5. P.426-427.

Helt C.E., Cliby W.A., Keng P.C., Bambara R.A., O'Reilly M.A. Ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ATM and Rad3-related protein exhibit selective target specificities in response to different forms of DNA damage// J. Biol. Chem. 2005. V.280. №2. P.l 186-1192.

Hong Y., Stambrook P.J. Restoration of an absent G1 arrest and protection from apoptosis in embryonic stem cells after ionizing radiation// Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. №40. P.14443-14448.

Gartel A.L., Goufman E.,Najmabadi F., Tyner A.L. Spl and Sp3 activate p21 (WAF1/CIP1) gene transcription in the Caco-2 colon adenocarcinoma cell line// Oncogene. 2000.V.19. №45. P.5182-5188.

Jain A.K., Allton K., lacovino M., Mahen E., Milczarek R.J., Zvvaka T.P., Kyba M., Barton M.C. p53 regulates cell cycle and microRNAs to promote differentiation of human embryonic stem cells// PLoS Biol. 2012. V.10. №2. P.e 1001268.

Macleod K.F., Sherry N., Hannon G., Beach D., Tokino T., Kinzler K., Vogelstein

B., Jacks T. p53-dependent and independent expression of p21 during cell growth, differentiation, and DNA damage// Genes Dev. 1995. V.9. №8. P.935-944.

Lam M.H., Liu Q., Elledge S.J., Rosen J.M. Chkl is haploinsufficient for multiple functions critical to tumor suppression// Cancer Cell. 2004. V.6. №1. P.45-59.

Lin T., Chao C., Saito S., Mazur S.J., Murphy M.E., Appella E., Xu Y. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression// Nat Cell Biol. 2005. V.7. №2. P.165-171.

Liu Q., Guntuku S., Cui X.S., Matsuoka S., Cortex D., Tamai K., Luo G., Carattini-Rivera S., DeMayo F., Bradley A., Donehower L.A., Elledge S. Chkl is essential kinase that is regulated by ATR and required for the G2/M DNA damage checkpoint// Genes and Dev. 2000. V.14. №12. P.1448-1459.

Momcilovic O., Choi S., Varum S., Bakkenist C., Schatten G., Navara C. Ionizing radiation induces ataxia telangiectasia mutated-dependent checkpoint signaling and G(2) but not G(l) cell cycle arrest in pluripotent human embryonic stem cells// Stem Cells. 2009. V.27. №8. P.1822-1835.

Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Gellert M., Bonner W.M. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage//Curr Biol. 2000. V.10. №15. P.886-895.

Riley T., Sontag E., Chen P., Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes//Nat Rev Mol Cell Biol. 2008. V.9. №5. P.402-412.

Sabapathy K., Klemm M., Jaenisch R., Wagner E.F. Regulation of ES cell differentiation by functional and conformational modulation of p53// EMBO J. 1997. V.16. №20. P.6217-6229.

Taylor W.R, Stark GR. Regulation of the G2/M transition by p53// Oncogene. 2001. V.20. №15. P.1803-1815.

Zhang X.P., Liu F., Wang W. Two-phase dynamics of p53 in the DNA damage response// Proc Natl Acad Sci USA. 2011.V.108. №22. P.8990-8995.

Подписано в печать «26» апреля 2014 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3- Тираж 100 экз. Заказ № 304652

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суворова, Ирина Игоревна, Санкт-Петербург

российская академия наук институт цитологии

Суворова Ирина Игоревна

04201459156

Активация АТМ/АТИ-сигнального пути в эмбриональных стволовых

клетках после повреждения ДНК

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2014

Оглавление

Список используемых сокращений.............................................................................................3

Актуальность проблемы...........................................................................................................5

Цели и задачи исследования.....................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................8

1. Эмбриональные стволовые клетки......................................................................................8

1.1 Происхождение и основные свойства ЭСК..................................................................8

1.2 Сигнальные пути, участвующие в регуляции самообновления и

плюрипотентности ЭСК......................................................................................................12

1.3 Транскрипционные маркеры плюрипотентности......................................................17

1.4 Структура клеточного цикла ЭСК...............................................................................21

2. Активация ATM/ATR-сигнального пути в клетках после повреждения ДНК..............27

2.1. Общая схема активации ATM/ATR-сигнального каскада........................................27

2.2. Распознавание повреждений ДНК и формирование репаративных фокусов.........31

2.3. Активация контрольных точек клеточного цикла в фазах G]/S, S и G2/M после

повреждения ДНК...............................................................................................................34

2.4. Регуляция белка р53 и его роль в клеточном ответе на повреждение ДНК...........36

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................................42

Культивирование клеток.........................................................................................................42

МТТ-тест..................................................................................................................................43

Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК............................................................43

Анализ активности каспаз in vitro..........................................................................................44

Иммунофлуоресценция...........................................................................................................44

Электрофорез и иммуноблоттинг..........................................................................................45

Выделение РНК и ОТ-ПЦР.....................................................................................................45

РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................................................47

Активация киназ ATM и ATR в ЭСК после повреждения ДНК.........................................47

Колокализация фокусов уН2АХ с белками RAD51, DNA-PK и 53ВР1 после облучения в

ЭСК...........................................................................................................................................47

Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение мЭСК по фазам

клеточного цикла и выживаемость клеток............................................................................49

Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение чЭСК по фазам

клеточного цикла.....................................................................................................................55

Активация сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК..................58

Функциональные последствия активации белка р53, вызванной облучением, на

плюрипотентные свойства мЭСК..........................................................................................62

Последствия нутлин-зависимой активации белка р53 на плюрипотентные свойства

мЭСК.........................................................................................................................................68

ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................................................................................76

Активация киназ ATM и ATR и последующее формирование репаративных фокусов в

ЭСК после повреждения ДНК................................................................................................76

Роль киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в распределении ЭСК человека и мыши по фазам

клеточного цикла.....................................................................................................................78

Функциональный статус сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения

ДНК...........................................................................................................................................80

Функциональные последствия активации р53 на плюрипотентные свойства мЭСК.......82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................85

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................87

Список работ, опубликованных по теме диссертации.............................................................88

Список цитированной литературы............................................................................................90

Список используемых сокращений

ATM ataxia telangiectasia mutated

ATR ataxia telangiectasia and Rad3-related protein

ASK1 apoptosis signal-regulating kinase 1

ВМР4 bone morphogenetic protein 4

BRCA breast cancer

53ВР1 p53-Binding Protein 1

BRCT BRCA-1 C-terminus

CDK cyclin-dependent kinase

Chkl checkpoint kinase 1

Chk2 checkpoint kinase 2

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMSO dimethylsulfoxide

DNA-PK DNA-dependent protein kinase

ERK extracellular signal-regulated kinase

FGF fibroblast growth factor

GAPDH rjiHLi,epajibAerH/i,-3-(J)Oc4)aTflerHflporeHa3a

GDF growth differentiation factor

HDAC hystone deacetylase

Hdm2 human double minute 2

HR homologous recombination

IL6 interleukin 6

JAK Janus-associated kinase

Klf Kriippel like factor

LIF leukemia inhibitory factor

LIFR LIF receptor

МАРК mitogen-activated protein kinase

MDC1 mediator of Damage Checkpoint protein 1

Mdm2 mouse double minute 2

МЕК mitogen activated protein kinase kinase 1

Mrell meiotic recombination 11

Mytl myelin transcription factor 1

NBS1 nijmegen Breakage Syndrome 1

NHEJ non-homologous end joining

p-TEFb positive transcription elongation factor b

PBS phosphate buffer solution

PIKK phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PI3K phosphoinositide 3-kinase

Rb retinoblastoma protein

RPA replication protein A

Sox2 SRY-related high-mobility group (HMG)-box-2

STAT signal transducer and activator of transcription

Tbx3 T-box transcription factor3

Tcf T cell-factor

Tell T-cell leukemia oncogene 1

TGFP transforming growth factor (3

Trim28 Tripartite motif-containing 28

XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein 4

BKM внутренняя клеточная масса

MTT метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромид

ЭКК эмбриональные карциномные клетки

мЭСК эмбриональные стволовые клетки мыши

чЭСК эмбриональные стволовые клетки человека

ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей полимеразной

цепной реакцией

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют большой научно-практический интерес, так как они могут быть использованы для получения дифференцированных производных - клеток и тканей, необходимых для целей регенеративной медицины и клеточной терапии. Дополнительной мощной поддержкой для исследования ЭСК явилась разработка принципиально новых методов, направленных на получение индуцированных плюрипотентных клеток (iPSCs) из обычных соматических клеток, которые имеют много общих свойств с ЭСК. Использование ЭСК в развитии биомедицинских технологиях возможно благодаря их уникальным свойствам - плюрипотентности и самообновлению. Однако главной проблемой терапевтического применения ЭСК остается проблема генетической стабильности популяции этих клеток. На фоне неограниченной пролиферативной активности ЭСК, когда большая часть (60-70%) популяции находится в фазе синтеза, возникающие, в том числе и при репликации ДНК, повреждения ДНК могут накапливаться в виде мутаций. Поскольку возникающие мутации несут серьезную угрозу для всех дифференцированных клеточных потомков, в ЭСК должны

функционировать механизмы, которые минимизировали бы последствия различных генотоксических воздействий.

В соматических клетках поддержание стабильности и целостности

генома происходит через активацию ATM/ATR-сигнального каскада,

который координирует общий клеточный ответ на повреждение ДНК,

вовлекая сигнальные пути, ответственные за остановку клеточного цикла

(чекпойнт-контроль), репарацию, индукцию апоптоза и старения. Клеточный

ответ на повреждение ДНК начинается с активации сенсорных киназ ATM и

ATR, которые распознают повреждения ДНК и в свою очередь активируют

нижележащие сигнальные пути. Киназы ATM и ATR участвуют в фосфорилировании гистона ШАХ по Serl39 в области разрывов ДНК с образованием фокусов уШАХ - обязательный этап для формирования репаративных фокусов. К местам фокусов уН2АХ привлекается множество белков, среди которых комплекс Mrel 1/Nbsl/Rad50, MDC1, BRCA-1, адапторный белок 53ВР1, репаративные белки Rad51, киназы DNA-PK и Ки70/80 и другие (Pauli et al., 2000; Fernandez-Capetillo et al., 2003). Параллельно ATM и ATR фосфорилируют нижележащие киназы Chk2 и Chkl и совместно с ними участвуют в активации (фосфорилироваии) и стабилизации опухолевого супрессора р53. Белок р53 является транскрипционным фактором и транс-активирует множество генов-мишеней, в частности ген p21/Wafl, белковый продукт которого ингибирует циклин-зависимые киназные комплексы и опосредует остановку клеточного цикла на границе фаз Gt/S при действии генотоксического стресса.

ЭСК не останавливаются в контрольной точке Gi/S клеточного цикла, в которой клетки с поврежденной ДНК не допускаются до процесса репликации, и подвергаются только временному блоку G2/M (Малашичева и др., 2002; Becker et al., 2006; Chuykin et al., 2008). Поэтому можно предположить, что в ЭСК реализуются особые механизмы клеточного ответа на повреждение ДНК, которые строго скоординированы с их главными свойствами — плюрипотентностью и самообновлением - и (в значительной степени) могут отличаться от ответа соматических клеток. Исследование активации ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК при действии генотоксических факторов расширит наше понимание фундаментальных механизмов, лежащих в основе поддержания стабильности и целостности генома этих клеток.

Цели и задачи исследования

3. Проанализировать функциональный статус сигнального пути р53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК.

4. Провести сравнительное изучение последствий активации сигнального пути p53-p21/Wafl в клетках при действии облучения и при действии нутлина - специфического блокатора протеасомной деградации белка р53, на структуру клеточного цикла и плюрипотентные свойства мЭСК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эмбриональные стволовые клетки

1.1 Происхождение и основные свойства ЭСК

Эмбрион млекопитающих на стадии преимплантационной бластоцисты (3.5-4-й день эмбриональной стадии у мышей, и 8-й день у человека) состоит из двух различных клеточных популяций, различающихся по морфологии и на молекулярной уровне: наружного слоя клеток - трофоэктодермы и клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) (схема 1). В то время как клетки трофобласта дают начало зародышевой части плаценты, ВКМ являются источником образования всех типов тканей взрослого организма, а также внезародышевых тканей. В постимплантационной стадии эмбриогенеза ВКМ разделяются на эпибласт (первичную эктодерму) и гипобласт (первичную эндодерму). Впоследствии из гипобласта образуется внезародышевая эндодерма (выстилке желточного мешка), а из клеток эпибласта образуются все производные трех зародышевых листков (эктодерма, мезодерма, эндодерма) и внезародышевые структуры (амнион, аллантоис, мезодерма желточного мешка) (Niwa et al., 2007).

Клетки на пре- и постимплантационных стадиях эмбриона представляют собой источник различных линий стволовых клеток, среди которых особый интерес представляют эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые наряду с клетками эпибласта обладают свойством плюрипотентности - способностью образовывать все типы клеток взрослого организма. Их широкий дифференцировочный потенциал выявляется в опытах in vivo, когда ЭСК, пересаженные в ткани взрослых мышей, способны формировать тератомы. Кроме того, клеточные потомки инъецированной бластоцисты обнаруживаются во всех взрослых тканях

Морула

Рапная бпасто циста

Внутренняя

-► ошга

(ВКМ)

Поздняя бпастоциста

Полос» бвспцкш

Постимплантационный зародыш

Нфычние

половые кжстен

Соштачсяис

ПрофоЭЕГОДфШ

ЭшраэнЁршх

ЗЕГОДфШ

Эдвдфм Мезодфша Эцдэдфм

Проишхоппнха полость

Схема 1. Схематическое изображение эмбрионального развития мыши на ранней стадии. Рисунок взят из обзора Nrwa et al., 2007, Development. Подробное описание в тексте.

химерного животного, а также в клетках зародышевой линии (Bradley et al., 1984).

В 1998 году из избыточных бластоцист, которые были не использованы

в процессе экстракорпорального оплодотворения, была выделена линия

плюрипотентных стволовых клеток человека (Thompson et al., 1995).

Основываясь на источнике их происхождения и способности формировать

тератомы, эти клетки были определены как чЭСК. Однако при более

подробном их исследовании выяснилось, что чЭСК по своим особенностям в

значительной степени отличаются от мЭСК (Chia et al., 2010). Например, для

поддержания недифференцированного состояния чЭСК не требуется фактор.

LIF, в то время как факторы FGF и Activin необходимы для самообновления

и плюрипотентности. Конечно, эти различия в первую очередь могут быть

объяснены видоспецифическими особенностями. Однако с другой стороны,

выделение эпибластных стволовых клеток из постимплантационного

зародыша мыши позволило предположить, что чЭСК могут соответствовать

более поздней стадии эмбриогенеза, чем мЭСК (Smith et al., 2001; Tesar et al.,

2007). Интересно, что выделение мЭСК происходит из эмбрионов в

состоянии диапаузы (Evans and Kaufman, 1981). Диапауза - состояние, так

называемого, эмбрионального «ареста» в преимплантационной стадии

бластоцисты. Такой «арест» возникает при нехватке эстрогенов и длится до

тех пор, пока не восстановятся условия, необходимые для имплантации

бластоцисты в стенку матки. Таким образом, наличие такого феномена у

мышей способствует получению ЭСК из эмбрионального зародыша (Smith et

al., 2001). В настоящее время отсутствуют прямые свидетельства наличия

диапаузы в ходе эмбрионального развития человека, что дает возможность

некоторым исследователям предполагать, что процесс выделения чЭСК

сопровождается их одновременной прогрессией в более позднюю стадию

эмбриогенеза (De los Angeles et al., 2012; Smith et al., 2001). Можно отметить,

что если культивировать бластоцисты мыши в присутствии факторов FGF и

Activin, то преимущественно будут формироваться эпибластные стволовые

клетки, а не обычные ЭСК (Najm et al., 2011). Таким образом, у чЭСК намного больше общих особенностей с мЭпиСК, чем с мЭСК, хотя с другой стороны имеются и некоторые различия, что также делает сложным их сравнение.

Состояние плюрипотентности in vivo является преходящим, но при соблюдении строго определенных условий культивирования возможно поддержание полученных из бластоцисты ЭСК в этом состоянии in vitro достаточно долго, что характеризует их еще одно их важное свойство -самообновление. Самообновление можно определить как состояние, при котором ЭСК активно пролиферируют, претерпевая симметричные деления с сохранением исходных свойств (Smith, 2001). Поддержание плюрипотентности достигается через самообновление, и в связи с этим ЭСК характеризуются целым рядом особенностей. Во-первых, ЭСК имеют уникальную структуру клеточного цикла: укороченную фазу G] и отсутствие контрольной точки Gi/S, и соответственно большая часть клеточной популяции (около 60% мЭСК и 40% чЭСК) находятся в фазе синтеза ДНК (Becker et al., 2006; Chuykin et al., 2008). Известно, что в начале фазы Gi клетка коммитирована на восприятие сигналов извне - митогенные стимулы или ростовые факторы, от которых зависит дальнейшая прогрессия или остановка клеточного цикла. Вероятно, функциональное значение отсутствия митоген-чувствительного периода фазы Gi в ЭСК заключается в том, чтобы избежать стимулирующего действия сигналов, запускающих дифференцировку.

Кроме того, ЭСК имеют определенные эпигенетические особенности.

Так, структура хроматина ЭСК находится в «открытой конформации», что

способствует быстрой регуляции генов, и характеризуется повсеместным

присутствием маркера транскрипционно-активного хроматина НЗК4теЗ

(Azuara et al., 2006). Этот гистоновый маркер ко-локализуется в особых

участках, которые были обозначены как «бивалентные домены» (Bernstein et

al., 2006). Эти домены состоят из коротких маркированных НЗК4теЗ

хроматиновых элементов, которые фланкированы участками хроматина, содержащих транскрипционно-репрессирующий НЗК27шеЗ. Такая «бивалентная» организация хроматина позволяет быстро регулировать гены в процессе эмбрионального развития. Таким способом регулируется большинство ткане-специфичных генов, которые находятся в подавленном состоянии в плюрипотентных ЭСК и быстро активируются при дифференцировке.

Одним из хорошо изученных эпигенетических феноменов в контексте плюрипотентности является активация и инактивация Х-хромосомы, статус которой часто используется как маркер состояния плюрипотентных ЭСК. Получение стабильных линий мЭСК из женских бластоцист бывает иногда проблематично из-за потери (инактивации) одной из двух X хромосом, что обычно происходит при дифференцировке, однако такие линии получены (Nichols and Smith, 2009; Zvetkova et al., 2005). В отличие от мЭСК, недифф

Информация о работе

Суворова, Ирина Игоревна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.03.04

Диссертация

Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы