Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение глутатионилирования Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение глутатионилирования Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона"

На правах рукописи

Мэн Сяньюй

ИЗУЧЕНИЕ ПЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЯ >'а,К-ЛТРа1ы ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОКИСЛЕННОГО ЕЛУТАТИОНА

03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

31 0;(Г 2013

005536789

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова» и в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Лопина Ольга Дмитриевна кандидат физико-математических наук Петрушанко Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Капрельянц Арсений Сумбатович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией

Хапчаев Аскер Юсуфович

кандидат биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Институт

экспериментальной кардиологии, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита диссертации состоится » У/^ 2013 года в / 3* часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан <р у у 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Na,K-ATPa3a - это фермент плазматической мембраны

клеток животных, который гидролизует АТР и использует освобождающуюся энергию для

переноса ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента. В состав

Na,K-ATPa3bi входит минимум 2 субъединицы: каталитическая а- и регуляторная

гаикозилированная ß-субъединица. Каждая из субъединиц представлена несколькими

изоформами (al - a4 и ßl - ß3), кодируемыми различными генами. Изоформы могут

сочетаться друг с другом в любых комбинациях, al-Субъединица встречается почти во

всех тканях, но является основной в эпителии почек и солевых желез, а2 характерна для

нервной ткани, сердца, адипоцитов, является основной в скелетных мышцах.

В результате функционирования Na,K-ATPa3bi на плазматической мембране

возникает потенциал покоя, а в возбудимых тканях может происходить генерация

потенциала действия (Glitsch, H.G., 2001). Na,K-ATPa3a принимает участие в регуляции

клеточного объема, транспорте некоторых ионов, глюкозы и аминокислот, сопряженных с

переносом натрия. Кроме того, Na,K-ATPa3a является рецептором для сердечных

гликозидов, которые, связываясь с ферментом, «включают» различные сигнальные

каскады (Xie, Z., et al., 1999; Xie, Z., Askari, A„ 2002).

Внутриклеточный трипептид глутатион (y-Glu-Cys-Gly) - это самый

распространенный низкомолекулярный тиол в клетке. Глутатион существует в двух

формах: восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG). Длительное время считалось, что

функция глутатиона сводится к защите клетки от токсичных ксенобиотиков, поддержанию

внутриклеточного редокс-статуса (Schafer, F., Buettner, G, 2001) и антиоксидантному

действию. В настоящее время появляется все больше данных о том, что связывание

глутатиона с SH-группами цистеиновых остатков с образованием S-S-связи

(S-глутатионилирование) может являться таким же важным механизмом регуляции

функции белков, как и фосфорилирование (Mieyal, J., et al., 2008). Поскольку соотношение

GSH/GSSG, определяющее редокс-статус клетки, изменяется при различных

внутриклеточных процессах и существенно падает при развитии окислительного стресса,

глутатионилирование является редокс-чувствительной модификацией, которая может

играть не только защитную, но и регуляторную роль (Schafer, F.Q., Buettner, GR., 2001).

з

Установлено, например, что глугатионилированию подвергается Са-АТРаза саркоплазматического ретикупума, родственная Na,K-ATPa3e. В результате гаутатионилирования Са-АТРаза активируется (Adachi, Т., et al., 2004). Показано также, что под действием GSH и ONOO' глугатионилированию подвергается р-субъединица Na,K-ATPa3bi, что снижает активность фермента на 20% (Figtree, G, et al., 2009), однако пгугатионилирование а-субъединицы этого фермента до настоящего времени не обнаружено.

Каталитическая а 1-субъединица Na,K-ATPa3bi содержит 23 остатка цистеина, 15 из которых располагаются в цитозоле клетки и могут быть доступны для окисленного шутатиона. Поочередная замена остатков цистеина на аланин сохраняет фермент в функционирующем состоянии, хотя в некоторых случаях наблюдается снижение числа оборотов фермента (Shi, Н. G, et al., 2000). В связи с этим возникает вопрос о роли SH-групп а-субъединицы Na,K-ATPa3bi и состоянии этих групп при изменении соотношения GSH/GSSG, особенно при повышении концентрации окисленного птутатиона.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы: исследовать глутатионилирование Ка,К-АТРазы под действием окисленного глутатиона.

Задачи:

1. Выяснить, происходит ли глутатионилирование каталитической а-субъединицы Na,K-ATPa3H в клетке («базовое» глутатионилирование).

2. Установить, происходит ли глутатионилирование Na,K-ATPa3bi под действием окисленного глутатиона in vitro, и определить, влияет ли глутатионилирование на активность фермента.

3. Определить, какие изоформы а-субъединицы Na,K-ATPa3bi подвергаются гаутатионилированию.

4. Выяснить, какие SH-группы а-субъединицы подвергаются базовому глугатионилированию, а какие гаутатионилируются под действием GSSG in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что

а 1-субъединица Na,K-ATPa3u, выделенная из трех видов ткани (солевые железы птиц,

4

почки кролика и сердце крысы) содержит связанный глугатион («базовое» глутатионилирование). Впервые установлено, что в препарате Na,K-ATPa3t>i, полученном из сердца крысы, глутатион связан и с а2-субъединицей. Показано, что глутатионилирование al-, но не а2-субъединицы, устраняется при выделении фермента в присутствии дитиотреитола.

Добавление окисленного шутатиона in vitro приводит к дополнительному глутатионилированию a 1-субъединицы, что сопровождается инактивацией фермента. Впервые проведен кинетический анализ инактивации Na,K-ATPa3bi окисленным глутатионом и показано, что процесс ингибирования фермента двухфазный, определены константы скоростей для быстрой и медленной фазы ингибирования.

Впервые показано, что адениновые нуклеотиды (ATP, ADP и AMP) защищают Na,K-ATPa3y от инактивации окисленным глутатионом. Впервые установлено также, что глутатионилирование фермента под действием GSSG, приводящее к инактивации фермента, полностью предотвращает связывание ADP с Na,K-AT"Pa3oii.

Впервые с использованием метода масс-спектрометрии проанализированы протеолитические фрагменты а 1-субъединицы Ыа,К-АТРазы и идентифицированы остатки цистеина, которые подвергаются базовому и дополнительному глутатионилированию. Установлено, что после обработки фермента смесью восстановленного/окисленного глутатиона в концентрациях, которые характерны для клетки в состоянии гипоксии (1,7 мМ/170 мкМ), увеличивается связывание глутатиона с 3 остатками цистеина (454, 458 и 459) а 1-субъединицы Na,K-ATPa3bi, расположенными в большой цитозольной петле, а также с остатком цистеина 244, расположенным в малой цитозольной петле. Из 15 цитозольных остатков цистеина al-субъединицы Ка,К-АТРазы идентифицировано 13. Все они, за исключением остатка цистеина 423, способны взаимодействовать с глутатионом.

На основе опубликованных данных по трехмерной структуре a-1 субъединицы

Na,K-ATPa3bi из почек свиньи совместно с сотрудниками Института молекулярной

биологии имени В.А. Энгельгардта РАН создана модель, позволяющая оценить площадь

контактов аминокислот, участвующих в связывании АТР, и глутатиона, связанного с

цитозольными остатками цистеина. В результате анализа наших экспериментальных

5

данных и данных, полученных на основе модели, впервые сделан вывод, что глутатионилирование остатков цистеина 454, 458 и 459 предотвращает доступ АТР к активному центру фермента, и наоборот, связывание АТР предотвращает глутатионилирование этих остатков.

Полученные результаты показывают, что при концентрациях окисленного глутатиона, которые существует in vivo при окислительном стрессе и гипоксии, происходит глутатионилирование SH-rpynn а-субъединицы Кта,К-АТРазы, что предотвращает окисление этих SH-групп. При этом важные для ферментативной активности SH-группы Na,K-ATPa3bi защищены от глутатионилирования за счет связывания с активным центром адениновых нуклеотидов, в первую очередь, АТР. Глутатионилирование частично устраняется под действием дитиотреитола, и полностью под действием соответствующих ферментных систем (например, глутаредоксина в присутствии NADPH). Таким образом, глутатионилирование в состоянии гипоксии защищает существенные для активности SH-группы каталитической субъединицы Na,K-ATPa3bi от необратимого окисления, одновременно снижая активность фермента, потребляющего в норме значительное количество АТР. Полученные результаты могут оказаться полезными при разработке новых подходов к лечению ишемии, гипоксии, а также устранению последствий окислительного стресса.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010), Международной конференции по Na,K-ATPa3e и родственным АТРазам (Асимолар, США, 2011), на 10-м Международном конгрессе "Регуляция клеточного объема" (Москва, 2013), а также на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010,2011,2013).

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ, и 3 тезиса докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы:

«Введение», «Обзор литературы», «Цель и задачи исследования» «Материалы и методы»,

«Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа

изложена на страницах 108 машинописного текста, иллюстрирована 35 рисунками и 3

6

таблицами. Список цитированной литературы включает 224 печатных и Web-исгочников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Очищенные препараты Na,K-ATPa3bi получали из солевых желёз утки (Smith, Т., 1988) и почек кролика (Jorgensen, Р., 1988) методом дифференциального центрифугирования.

Частично очищенную микросомальную фракцию, обогащенную активностью Na,K-ATPa3bi, получали из сердца крысы методом дифференциального центрифугирования (Schwartz, A., et al., 1969; Harigaya, S., Schwartz, A., 1969).

Концентрацию белка в препаратах Na,K-ATPa3u определяли по методу Лоури и соавторов (Lowry, О.Н., et al., 1951), в качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина.

Активность Na,K-ATPa3bi определяли путём измерения продукта реакции Pi методом Ратбуна и Бетлах (Rathbun, W.B., Betlach, M.V., 1969). В реакционную среду, содержащую 130 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТР и имидазол 30 мМ (рН = 7,4), вносили 0,5-2 мкг препарата Na,K-ATPa3bi из почек кролика или солевых желез уток или 20-30 мкг препарата Na,K-ATPa3bi из сердца крысы. Смесь инкубировали 5-10 мин при 37°С. Предварительно было показано, что накопление Pi в этот промежуток времени происходит линейно. Накопление Pi линейно зависело и от концентрации белка во всем диапазоне концентраций, использованных для оценки активности.

Активность Na,K-ATPa3bi в препарате из сердца крысы определяли как разность скорости гидролиза АТР в отсутствие и в присутствии 5 мМ уабаина. Анализ кривой ингибирования Na,K-ATPa3Hofi активности уабаином, необходимый для определения гидролиза АТР al- и а2-изоформами фермента, проводили с использованием программы Origin 7.0, используя модель одного или двух типов участков связывания.

Кинетический анализ ингибирования Na,K-ATPa3bi проводили, преинкубируя фермент в течение различного времени (1-30 минут) в среде с окисленным птутатионом (25-150 мкМ). Затем аликвоты смеси переносили в среду инкубации, разводя при этом среду преинкубации в 50-100 раз. Определение активности проводили, как описано выше.

Полученные кривые анализировали, аппроксимируя зависимость активности от

7

концентрации окисленного гаугатиона в среде преинкубации суммой двух экспонент с использованием программы Origin 7.0.

Защитный эффект адениновых нуклеотидов исследовали, добавляя в среду преинкубации, содержащую 1 мМ глутатион, ATP, ADP или AMP в различных концентрациях. Через 20 минут аликвоты смеси переносили в среду инкубации и измеряли активность, как описано выше.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, U.K., 1970), используя 5% концентрирующий гель и 7,5% разделяющий гель (или 8%-20% градиентный разделяющий гель).

Вестерн-блот анализ проводили после переноса белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin, Н. et al., 1979), иммунохимическое окрашивание белков осуществляли с использованием первичных антител, специфичных к глутатиону, связанному с белком (МАВ5310, «Millipore», США), а 1-субъединице (05-369, «Sigma-Aldrich», США) и а2-субъединице Na,K-ATPa3u (АВ9094, «Sigma-Aldrich», США). Для визуализации белковых полос пользовались вторичными антителами, специфичными к иммуноглобулинам мышей (А0168, «Sigma-Aldrich», США) и иммуноглобулинам кроликов (А0545, «Sigma-Aldrich», США), конъюгированными с пероксидазой.

Изотермическая калориметрия титрования (ITC) была использована для оценки термодинамических параметров связывания ADP с Ыа,К-АТРазой. Эксперименты проводили на приборе MicroCal ITC 200 (MicroCal, Northapton, MA). Полученные кривые анализировали с помощью программы MicroCal Origin 7.0, используя модель одного участка связывания. Из экспериментальных кривых определяли константу связывания (Ка) и изменение энтальпии (АН), изменение энергии Гиббса и изменение энтропии (AS) вычисляли по формуле: AG= —R71 т\Ка=АН-TAS.

Масс-спектрометрия. Цистеиновые остатки а-субъединицы Ка,К-АТРазы,

подвергающиеся глутатионилированию, были определены с помощью метода

времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи

матрицы - MALDI-TOF MS (Shevchenko, А., 2006). Фермент инкубировали с 1,7 мМ

GSH/170 мкМ GSSG в течение 30 минут при комнатной температуре, затем часть пробы

отбирали на измерение ферментативной активности, а остальную часть пробы

8

инкубировали с додецилсульфатом натрия (SDS) в течение 5 минут при 37 °С для проведения последующего электрофореза с целью разделения а- и р-субъединиц Na,K-ATPa3bi. После окончания времени инкубации с SDS проводили электрофорез по Лэммли в 7,5% полиакриламидном геле. Чтобы не допустить восстановления тиоловых групп и дегаутатионилирования белка электрофорез проводили в отсутствие Р-меркаптоэтанола. Полосу геля с al-субъединицей вырезали и проводили ее расщепление с помощью трипсина или химотрипсина. MALDI-TOF MS анализ полученных пептидных фрагментов проводили на масс-спектрометре Ultraflex IITOF/ (Bruker Daltonics, Германия). Относительная интенсивность пиков фрагментов была рассчитана как интенсивность пиков фрагментов, нормированная на интенсивность максимального пика, что выражалось в процентах. Возможность оценки изменения количества глутатионилированных фрагментов по относительной интенсивности пиков обеспечивалась следующими факторами: матрицей, позволяющей получить однородное распределение образца, и большим количеством импульсов, суммированных для каждого спектра (4000 лазерных импульсов по 200 импульсов для различных 20 точек одного участка). Полученные масс-спектрометрические данные были проанализированы с помощью программы Bruker Daltonics Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия), точность определения масс пептидов была не менее 100 ррт. Детектирование пиков осуществляли с помощью алгоритма SNAP программы Flex Analysis. Соответствие данных масс-спектра аминокислотной последовательности белка было установлено с помощью программы Brucker Daltonics BioTools 3.0. Эксперименты были повторены три раза.

Моделирование взаимодействия связанного глутатиона с аминокислотами, участвующими в формировании участка связывания АТР проводили в поле MMFF94x с использованием программы МОЕ версии 2009.10. Трехмерные модели каталитической субъединицы S-глутатионилированной Na,K-ATPa3bi были созданы на основе ранее опубликованной структуры (с разрешением 3,5 A, PDB code ЗЬ8е) а 1-субъединицы из почек свиньи (Morth, et al., 2007). Эта работа проводилась совместно с сотрудниками ИМБ РАН А.А. Анашкиной и И.Ю. Петрушанко.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика препаратов На,К-АТРазы из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы. Работа выполнена с использованием трех видов препаратов Ма,К-АТРазы:

1. Высокоочищенные (по методу Йоргенсена) препараты Ка,К-АТРазы из почек кролика, содержащие а1-изоформу.

2. Высокоочищенные препараты Ка,К-АТРазы из солевых желез утки, содержащие аЬизоформу.

3. Выделенные по методу Джонса и соавторов частично очищенные препараты из сердца крысы, содержащие а1- и а2-изоформы каталитической субъединицы.

На рис.1 представлен типичный результат, полученный после проведения электрофореза исследованных препаратов. Видно, что наиболее чистыми являются препараты из солевых желез утки и почек кролика, где присутствуют в основном а- и Р-субъединицы (полоса, соответствующая р-субъединице очень размыта, поскольку она сильно гликозилирована). В препарате из сердца крысы видно несколько примесных белков. В области, где должна располагаться а-субъединица, видны две полосы (по-видимому, а1 и а2-субъединицы).

В препаратах Ыа,К-АТРазы из почек кролика и солевых желез утки не было другой АТРазной активности (образование Р1 в присутствии ионов № и К полностью подавлялось в среде с 1 мМ уабаина). Активность Ка,К-АТРазы составила 600-1200 и 2000 мкмоль/мг белка в ч соответственно (или 10-20 и 33,3 мкмоль/мг белка в мин).Активность Ыа,К-АТРазы в препарате из сердца крысы составила около 20 мкмоль/мг белка в ч (~ 0.33 мкмоль/мг белка в мин), активность Mg-ATPaзы в этом препарате была около 15% от общей АТРазной активности.

Рис. I. Белковый состав препаратов >.'а,К-АТРа:ы, определенный методом электрофореза в ПЛАГ. Слева направо: белки-маркеры, препараты Ыа,К-АТРазы из почек кролика (1), солевых желез утки (2) и сердца крысы (3).

Для установления природы а-субъсднницы препараты анализировали с помощью Всстерн-блоггинга, проводя окрашивание специфическими антителами. Нммуноблопинг препаратов с использованием антител прот>в а1- и а2-с>€ъслиниц показал, что в препаратах \а,К-АТРазы из почек кролика и солевых желез утки присутствует только а I-субъединица, а в препарате из сердца крысы - а1- и а2-субъединнцы (рис. 2).

яре»* а1 прошв а!

1 2 3 1 2 3

а| 117 кД* а-48 кД»

МкД»

Рис. 2. Результаты Вестерн-блоттинга препаратов Ка,К-АТРазы: слева направо препараты фермента из почки кролика (1), солевых желез утки (2) и сердца крысы (3). Окрашено антителами против а1-субъеднницы (слева), и антителами против а2-субъеднннцы (справа).

Ингибирование \»,К-АТРа1ы уабаиноч в препаратах, выделенных из солевых желез утки н сердца крысы. Уабаин - специфический ингибитор Ка,К-АТРазы, относящийся к кардиостероидам, чувствнтелшость \а.К-АТРазы к этому ингибитору характеризуется тканевой и видовой изменчивостью Фермент, содержащий различные и »формы а-субъединицы \а.К-АТРазы. имеет различную чувствительность к уабаииу, а у представителей разных видов в одной и той же изоформе присутствуют мутации, влияющие на эту чувствительность.

Изучение зависимости ннгибировамия Ма,К-АТРазы уабаином показало, что в препаратах и] соленых желез утки есть одни участок связывания уабаина, связывание уабаина с которым вызывает ингибирова»ие с величиной I» (концентрация, при которой достигается 50% ингнбирование) около 2« 10'' М (рис. 3). В тоже время зависимость ннгибироаання уабаином Na.K-ATP.nu из сердца крысы свидетельствует о наличии двух типов центров связывания со значениями 1$« 10! М и около 10°* М (рис. 4). Согласно литературным данным в сердце присутствует два типа иэоформ а-субьединицы (ol и а2) (Mercer, R.W., 1993), методом иммуноблогтинга мы также показали, что в препаратах из сердца крысы, использованных в наших Экспериментах, присутствуют две изоформы: al и о2 (рис.2). Анализ кривой, представлен «ой на рис. 4, показал, что активность более чувствительной к уабаииу изоформы (о2-). составляет около 20% от обшей активности Na.K-ATPa3u, а активность менее чувстви-ельиой (al) - около 80%.

|>абаин|, М

Рис. 3. Зависимость активности Na.K-АТРазы из сазевых желез утки от кониентрацин уабаина, 1,«,., = (1,8±0,1 )* 10 7 М (п - 3).

|>ЫЬии|. Ч

Рис. 4. Зависимость активности №.К-АТРазы из сердца крысы от концентрации уабанна.

1м К(1.0>±«.1)10-*М. 1я«- (6.7±2.2)10 9М(П-3).

Глутатионилирование Ка.К-АТРазы » препаратах, выделенных н> солевых желе! утки, почек кролика и сгр.иш крысы. С пользованием антител на тутатиои в составе белков (-850) мы установили, что а1-:убъединнца Ка,К-АТРазы, выделенной из солевых желез утаи, уже содержит связанный глутатион (рис. 5, слева вверху), однако инкубация фермента с 0580 приводит к дополнительному включению глутлгнона в а 1 -субъелнницу (рис. 5 вверху справа). Количественный анализ денситограмм, полученных с использованием трех препаратов фермента, приведен ниже.

Рис. 5. Глутатионнлнро ванное состояние а1-субъсдииици Ха,К-АТРазы, выделенной из солевых желез утки (вверху слева), и увеличение уровня нутатиоиилнроеания после инкубации с 1 мМ 0550 (вверху справа). Нормирование проведено путем окрашивания а] -субъединнцы специфическими антителами (две нижние полосы слсиа и спреи«). Вннчу — результаты количественной ленситографни (п - 3).

С использованием тех же антител мь установили, что (Н-субъеднницл ^К-АТРазы из солевых желез утки также глутатиони.тирована (на рис. 6 слева вверху), однако при обработке фермента I мМ 0Б50 в течгнне 30 минут уровень глутатионнлирования практически не увеличивается. Количественный анализ демситограмм, полученных с использованием трех препаратов фермента, приведен ниже.

Рис 6 Глутатионилиро ванное состояние 01-субъсдиницы Na.K-ATPa3bi. выделенной из солевых желез утки (вверху слева), и отсутствие долэлнительмого глутатнонилирования

Р-субъедииииы после инкубации с I мМ GSSG Внизу - результаты количественной денситографнн (п-3).

В препарате ЫаЖ-АТРази из почек кролика al-субъеднница также содержит связанный глугатнон. Мы обнаружили, что при выделении препарата фермента в присутствии 100 мкМ дитиотреитола (ДТТ) глутггионилирование al-субъединнцы Na.K-ATPa3u почти полностью устраняете». Однако глутггионилирование. полученное с использованием GSSG (I мМ). устраняется под действием ДТТ в меньшей степени (рис.

7).

Рис. 7. Влияние дитиотреитола (100 мкМ) на базовое глутатионилированне al-субъеднницы NaJt-АТРазы.

выделенной из почек кролика, и на дополнительное глутатионнлироваиие, происходящее в присутствии GSSG in vitro. Вверху: результаты

иммуноблоттинга al-субъединицы, полученные при окрашивании антителами против -SSG; внизу: результаты иммуноблоттинга при окрашивании антителами против al-субъединицы. 1 - базовое глутатионнлироваиие a 1-субъслинины. 2 - глутатионилнрованзе al-субъединнцы препарата, выделенного в присутствии дитиотреитола, 3 -дополнительное глутатионнлироваиие под действием GSSG, 4 - дополнительное глутатиоиилирование под действием GSSG препарата, который был выделен в среде с дитиотреитолом.

12 3 4

а1 ДТТ —- — «М»

GSSG + +

При исследовании препаратов Na.K-ATPa3u. выделенных из сердца крысы, мы обнаружили, что базовому глутатионилироваиню подвергаете* не только al-, но н а2-субьединица Ка,К-АТРазы (рис. 8). Глутатионилирование а1-с>Фьелиницы почти полностью устранялось, если препарат фермента получали в присутствии 100 мкМ дитиотреитола, тогда как а2-субьединица Ка,К-АТРазы, выделенная в присутствии ДТТ. оставалась существенно глутатионилированной (рис. 8).

Рис. 8. Иммуноблоттннг препаратов \а,К-АТРазы из сердца крысы, которые содержат al и а2-субъелиницы. Окрашивание проведено антителами против al-субъединицы (1,2). против а2-субъединицы (3, 4) и антителами против -SSG (5, 6). Na.K-ATPaîa была выделена в присутствии (1. 3, 5) и в отсутствие 100 мкМ дитиотреитола (2. 4.6).

Окисленный глутатиои (GSSG) ииактивнрует N«,K-ATP*iy и npeiiapaïax, выделенных и) почек кролика и еердиа крысы.

Мы преннкубнровали фермент из почек кролика с GSSG, после чего добавляли небольшие аликвоты в среду инкубации и определяли его активность. Мы обнаружили, что в некоторых случаях активность Na.K-ATPa3iu уменьшалась. Однако если фермент выделяли в среде с днтиотреитолом, то инактивация наблюдалась всегда. Это связано, по-видимому, с тем, что в случае окисления тиоловых групп (в отсутствие ДТТ), они не способны подвергаться глутатионилированию под действием GSSG Скорость инактивации зависела от времени преинкубации с GSSG и от его концентрации. Через 30 минут преинкубации при концентрации GSSG 150 мкМ активность фермента почти полностью подавлялась (рис. 9). Полученная в присутствии значительного избытка GSSG по сравнению с SH-группами фермента (около 500 раз) зависимость активности от времени преннкубаиин хорошо апроксимнровалась суммой двух экспонент. Таким образом, инактивация была двухфазной: сначала происходило быстрое падение активности, посте чего процесс инактивации замедлялся. Кинетика инактивации Ка,К-АТФазы окисленным глутатноном описывается уравнением А, - Aoi exp{-*i[GSSG)} + Ав: expî-*:[GSSG)f}, где А, - измеряемая активность фермента, к\ и - константы скорости инактивации, [GSSG] - концентрация окисленного глутатиоиа.

Расчет констант скорости инактивации (константы скорости второго порядка

1 2 3 4 5 6

130 кЛа •

« m» * f 1

100 кЛа • ■ ы 9|

ДТТ + + . + .

получены ■ результате деления констант скорости псевдопервого порядка на концентрацию GSSG) при концентрации GSSG ISO мкМ дал значения констант инактивацни 3650 ± 340 М'1 мин"' для быстрой фазы и 270 ± 20 М'мии'1 для медленной фазы (рис. 10).

• • 1« It п м м

Время п|мми*,\6аимм, мим

Рис.9. Зависимость активности Ма,К-АТФазы из почек кролика от времени преинкубации с различными концентрациями GSSG (0; 25; 50; 100; 150 мкМ. п - 4).

Рис.10. Зависимость активности Na,K-ATPa?u из почек кролика от времени мреиикубации с GSSG (150 мкМ) в полулогарифмических координатах,

определение констант скоростей инактивацни (*, - 3650 * 340 М'мин ' и к: -270±20М 'мин ').

Поскольку в сердце есть 2 иэоформы каталитической субъединицы Ка.К-АТРазы (о1 и а2). мы измеряли активность фермента в присутствии 10 М уабаина, который полностью ингибирует высокочувствительную к уабаину Ма.К-АТРазу, содержащую а2-изоформу (около 20% активности, см. рис. 4). Процесс инактивации Ма,К-АТРазы сердца крысы, содержащей а1-иэофор<чу. тоже является двухфазным. Константы скорости инактивации составили - 3750 ± 360 М 'мин 1 и *2 » 246 ± 18 М'мии'1 (рис. 12), что

близко к величинам, полученным для препарата Ыа,К-АТРазы из почек кролика (с al-изоформой.

Рис. 11. Зависимость активности Na.K - АТФа ш из сердца крысы, содержащей а 1 -нзоформу. от времени преинкубации с различными концентрациями GSSG (0; 25; 50; 100; 150 мкМ. п

-4).

Рис. 12. Зависимость активности \а,К-АТФазы из сердца крысы, содержащей al-субьединицу, в полулогарифмических координатах от времени преинкубации со 150 мкМ GSSG н расчет констант скорости инактивации - 3745* 360 М 'мин' и к2 - 246 ± 18 М 'мин1.

Вуни ми

Адениновыс нуклеотиды (ATP, ADP и AMP) мшишаю! Na.K-AT Ра ly от

инактиваиии GSSG Мм установили, что предварительное выдерживание NaJC-ATPasu. полученной из сердца крысы, в среде инкубации, содержащей АТР. защищает ее от инактивации под действием окисленного глутатиона.

Затем мы преинкубировали Na,K-ATPa3y в течение 20 мин с I мМ GSSG и различными концентрациями АТР (0-ЗмМ) при комнатной температуре, после чего определяли активность фермента. Результаты представлены на рис. 13. Видно, что при концентрации АТР выше 0,8 мМ наблюдается почти полная защита активности,

полумаксимальный эффект ATP оказывает при концентрации 0.54 мМ.

III

IM

1«

/ " i w Г г

i " t /

{ M ; « < » / /

» I

I«

• 1

1 U 1 LI 1 U ) U

Кмшсягрияа >)к.мпш. мМ

Рис. 13. Зависимость активности Ка,К-АТРазы, проинкубированной в течение 20 мин в присутствии I мМ GSSG при комнатной температуре, от концентраций АТР (♦). ADP (■). AMP (а) в среде преинкубацин. На оси ординат активность в % по отношению к контролю. Контроль - преинкубация фермента в среде без GSSG с различными концентрациями АТР. ADP, AMP.

Подобные эксперименты были проведены также с АОР и AMP. Результаты представлены на рис. 13. ADP и AMP обеспечивают полную защиту активности от инастивацни 1 мМ GSSG при концентрациях 3 и около 4 ыМ соответственно, полумаксимальиая зашита наблюдается при концентрациях ADP и AMP 0,7 и 1,75 мМ. Таким образом, сродство адениновых иуклеотидов к центру, заполнение которого предотвращает инактивацию NaJC-АТРазы. уменьшается в ряду: АТР. A DP. AMP.

Глутатионнлирование предотвращает связывание ADP с Na.K-АТРвюй. Для оценки термодинамических параметров связывания нуклеотидов с глутагионилированной и неглутатитоннлиро ванной формой Na.K-АГРазы из почек кролика была использована изотермическая калориметрия титрования (ITC). Эксперименты по ГГС были проведены в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Выделение тепла, связанное с взаимодействием АОР и фермента из почек кролика, было измерено в присутствии днтиотреитола (100 мкМ) или окисленного глутатнона (1 мМ). Ал и квоты л и ганда (2.6-3.8 мкл. 20-35 мкМ) добавляли в ячейку, содержащую 2-18 мкМ >ч'а,К-АТРазы. до достижения полной изотермы связывания. Чтобы оценить эффективную теплоту связывания, из теплоты реакции вычитали теплоту разбавления. Типичная экспериментальная кривая ГГС для связывания ADP с \'а,К-АТРаэой из почек кролика

приведена на рис. 14. На верхней панели рисунка приведена кривая титрования Na,K-ATPa3u из почек кролика ADP при рН-?,5 и 25 "С, на нижней панели - изотерма связывания, полученная интегрированием I ГС кривой и аппроксимированная с помощью модели одного участка связывания. Связывание ADP с Ха.К-АТРазоЙ является знгалышйно выгодным процессом (ЛН= - 8,2 ± 0,3 ккал моль'1, 7"Л£«1,1 ккал мать'1) с константой связывания Кл " (6,8 ± 1.4) * 10® М'1 (константа диссоциации 15 мкМ). Стехиометрия связывания ADP с Na,K-ATPa3ort составляла около 0,8. Из представленных данных видно, что S-глутатионилироваиие фермента окисленным глутатионом полностью предотвращает связывание АОР с Na,K-ATPaîoi.

И peu*, мни 0 10 20

0 04000-

м

S

5 -ow-ï

* -0 08-

0 00-S -2 00 I -4 0fr

I

* -90СУ

*TtTtTffîr л/

1 II III

* * А OSSG контролиу А А А л а___А - ^эИгТ ■

00 05 10 15 20 Молярное отношение

Рис. 14. Анализ взаимодействия Мх,К-АТРазы с АОР методом изотермической калориметрии титрования, ингибирующий эффект

$-глутатионилнрования на связывание АОР с \'1,К-АТРаэой. Кривая титрования (выделение тепла в ответ на добавление АОР (юрхняя панель) и изотерма связывания (нижняя панель) АОР с \а,К-АТРазой в отсутствие (черная кривая) или присутствии (красная кривая) окисленного глугагиона (I мМ) при 25 °С.

Идентификация глутатионнлированных цистеиновых остатков (||<\бмлннииы \*,К-АТРа1Ы. Идентификацию цистеиновых остатков Ка,К-АТРазы из солевых желез утки, которые имеют баювлс глутатионилирование и подвергаются дополнительному гпутатионнлированию в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона, проводили с использованием метода масс-спектрометрии. Очищенную ^К-АТРазу инкубировали в присутствии 1,7 мМ ОвН и 170 мкМ С$$0 Это те

концентрации, которые характерны для сердца в состоянии гипоксии. Параллельно

1»

оценивали активность Ка,К-АТРазы в контроле и после обработки 1,7 мМ ввН и 170 мкМ СввЦ чтобы убедиться в наличии инактивации. Затем брали по два образца из контроля и опытных проб и подвергали обработке трипсином или химотрипсином. Масс-спектрометрический анализ проводили в лаборатории Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. В результате проведения анализа протеолитических фрагментов а 1-субъединицы ^К-АТРазы методом МА1Х)1-ТОР МЭ было получено покрытие сиквенса 70-80% в случае химотрипсина и 50-60% для триптических фрагментов. Данные по модификации цитозольных остатков цистеина привены в таблице 1.

Таблица 1. МА1Л}1-ТОР-М8 анализ Б-плутатионилированных пептидов а-субъединицы Na,K-ATPaзы из солевых желез утки (т-трипсиновый, хт-химотрипсиновый фрагмент).

Номер Фраг- Экспериментальное Рассчитанное Модифик Относите-

остатка мент значение m/z значение m/z ация льная

Cys Контроль GSH/GSSG Немодиф. Модифиц. интенсив-

ность

Контроль

GSH/GSSG

206 194-207 т 1798,82 1798,89 1493,82 1798,89 SG 0,72 0,77

244 236-250 т 1934,95 1934,86 1629,75 1934,84 SG 0,08 0,47

338,351 336-353 хт 2326,19 2326,19 2021,14 2326,21 SG.SH 0,14 0,21

351-369 350-272 т 3035,49 3035,48 2425,19 3035,33 SG.SG 0,03 0,03

454,458,459 454-468 т 2671,20 2671,19 1755,79 2671,01 SG, SG, SG 0,05 0,13

458,459 456-462 гг 1015,34 1015,34 710,28 101535 SG.SH 0,28 0,49

513 502-516 хт 1981,0 1981,01 16,74,86 1980,93 SG 2,98 2,62

551 549-554 гг 2097,96 2097,95 1792,79 209737 SG 1,88 2,13

658 640-660 хт 2526,24 2526,36 2221,22 2526,29 SG 0,19 0,13

700 694-702 т 1335,65 1335,65 1030,56 1335,64 SG 0,58 0,78

В таблице показаны триптические и химотриптические фрагменты, содержащие глутатионилированные остатки цистеина, для каждого фрагмента приведены экспериментальные и расчетные значения m/z (отношение массы фрагмента к его заряду, z=l), а также относительная интенсивность пиков с данными значениями m/z. Расчетные значения m/z приведены для фрагментов, в которых все цистеины находятся в немодифицированной (восстановленной-SH) форме, а также для модифицированных (глутатионилированных-SG) форм фрагментов. Модификации цистеинов были оценены путем сравнения экспериментальных значений m/z с расчетными, так как связывание глутатиона (-SG) увеличивает массу фрагмента на 305 Да. Детектирование пиков осуществляли с помощью алгоритма SNAP программы Flex Analysis (Bruker Daltonics, Германия). Эксперименты были повторены три раза.

20

Из 15 цитозольных цистеиновых остатков а 1-субъеднницы успешно былн идентифицированы 13, почти все они подвергают» базовому птутатионилированию. Обработка фермента смесью 05НУ058С приводит к достоверному увеличению глутатионилированных форм остатков цистеина 454, 458 459, расположенных в большой цнтозольной петле, и остатка цистеина 244, находящеюся в малой цитозольиой петле (рис. 1$). Цистеин 423 никогда не был обнаружен в глутатионилнрованном виде.

Цитоплазма

Рис. IS. Локализация глутатионилированных цистеинов а|- субъеднницы Na.K-АТРазы по отношению к центру связывания АТР. Мембранные домены показаны как цилиндры н обозначены M1-MI0. Цитозольные и внеклеточные домены показаны линиями, на которых участок связывания уабаина обозначен синим цветом, а участок связывания АТР - красным цветом. Синим цветом указаны остатки цистеина, красным - те из них, гдугатионилирование которых возрастает при инкубации со смесью GSH/GSSCL зеленым, остаток цистеина, которого нет в al-субъедннице, но который присутствует в а?-субъединице

Моделирование взаимодействия связанного глутатиоиа с аминокислотами АТР-свя1ываюшего центра. Для оценки возможного взаимодействия глутатиоиа, связанного с остатками цистеина а I-субъединицы, с аминокислотными остатками АТР-связываюшего центра, была создана трехмерная модель глутатионилиро ванной аI-субъеднницы \а,К-АТРазы на основе ранее опубликованных данных о структуре а!-субъеднницы Ыа,К-АТРазы из почек свиньи (РОВ код ЗЬ8с). Сравнение аминокислотной последовательности а-субъединицы из свиньи (Р05024, ишРгсйКВ

(ЫаЬахе). утки (07гУ\М), кролика <09М026) и крысы (Р06685) показало, что локализация

21

остатков цистсина консервативна во всех перечисленных вилах. Моделирование и расчеты были проведены в Институте молекулярной биологин им. В.А. Энгельгардта РАН.

Полученные данные свидетельствуют, что связывание глутатиона с остатками цистсина 452, 456 н 457 al -субъединицы почек свиньи, которые соответствуют остаткам цистенна 454, 458 459 в а 1-субъединице утки, кролика и крысы, может влиять на связывание адениновых нуклеотидов с участком связывания АТР.

В соответствии с моделью расстояние между терминальным отрицательно заряженным остатком АТР и карбоксильной группой глутатиона, связанного с цистеином 452 al-субъединицы Na,K-ATPaibi из почек свиньи, несушей отрицательный заряд, составляет менее 8 А. Силы электростатического отталкивания между двумя этими отрицательными зарядами будет препятствовать связыванию АТР с активным центром. Электростатическое отталкивание будет усиливаться при глутатионилировании остатков цистенна 456 и 457. Результаты этого наблюдения находятся в соответствии с нашими данными, согласно которым связывание адениновых нуклеотидов с активным центром и глутатиоиилнрование взаимно исключают друг друга. Моделирование показывает, что глутатионилированис остатка цистенна 242 (244 для al-субъединицы утки, кролика и крысы) не будет влиять на доступность активного центра для молекулы АТР.

Рис. 16. Наложение трехмерной структуры нуклеотид-связывающего домена al-субъединицы NaJC-АТРазы из почек свиньи (от Arg-378 до Arg-589) с АТР (А) или глутатноиом (В), связанным с остатками Cys-452, -456 и -457. Модель создана на основе 3,5 А структуры Na,K-ATPaiH из почек свиньи (PDB код ЗЬ8е). Структурное выравнивание проведено с помощью программы МОЕ.

А

I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют, что S-глутатионилирование а-субъединицы Ка,К-АТРазы может приводить к ее инактивации за счет предотвращения доступа АТР к активному центру. Такое глутатионилирование и связанное с ним падение активности осуществляется при снижении концентрации АТР до определенной величины (50% падения активности под действием глугатионилирования, так же как и 50% защита от инактивации GSSG под действием АТР, наблюдаются при концентрации нуклеотида около 0,5 мМ). Известно, что в некоторых органах, таких как мозг, диафрагма, сердечная мышца, почки, Na,K-ATPa3a может потреблять существенное количество от общего запаса АТР в клетке (см., например, Soltoff, S., and Mandel, L., 1984). В сердце при гипоксии вслед за снижением запасов Ог наблюдается быстрое исчерпание запасов АТР (Kominski, М. et al., 2011). Таким образом, глутатионилирование а-субьединицы Na,K-ATPa3bi может предотвратить падение концентрации АТР в условиях гипоксии, когда митохондрии теряют способность производить ее. Характерно, что при такой концентрации АТР (0,5 мМ) Na,K-ATPa3a ингибируется не полностью (теряется лишь около 50% активности) (Lopina, O.D., 2000), таким образом, необходимые для жизнедеятельности клетки функции фермента сохраняются. Более того, S-глутатионилирование каталитической субъединицы устраняется под действием глутаредоксина и NADPH, таким образом, при переходе ткани в состояние с нормальной концентрацией кислорода функция фермента может полностью восстановиться.

Na,K-ATPa3a может быть S-глутатионилирована в результате реакции тиол-дисульфидного обмена, при этом ее частичная инактивация наблюдается уже при концентрации GSSG 25 мкМ, становясь почти максимальным при его концентрации 150 мкМ, которая достигается в сердце при гипоксии. Глутатионилирование под действием таких концентраций GSSG происходит и при относительно высокой концентрации GSH (1,7 мМ).

Двухфазная кинетика инактивации Na,K-ATPa3bi GSSG может означать

существование двух классов SH-групп, модификация которых приводит к падению

активности фермента, как было обнаружено для фермента, устраняющего разветвления в

молекуле гликогена (Cappel, R., et al., 1986). С другой стороны, это может отражать

23

наличие двух конформаций Na,K-ATPa3u (El и Е2), в которых SH-группы имеют разную доступность для GSSG

Мы обнаружили также, что а 1 -субъединица Na,K-ATPa3bi, выделенная из трех видов ткани (солевые железы, почки и сердце) уже содержит связанный глутагион. Более того, а2-субъединица Na,K-ATPa3bi, как и а 1-субъединица также выделяется в глутатионилированном виде. Роль такого базового шутатионилирования пока не выяснена, однако оно описано и для других белков, например, для Са-АТРазы (SERCA 2А) (Lancel, S., et al., 2009) и рианодинового рецептора (Aracena-Parks, P., et al., 2006).

а2-субъединица Ыа,К-АТРазы из сердца гпутатионилируется в большей степени. Это интересный факт, поскольку а2-изоформа Na,K-ATPa3bi выполняет несколько иные функции, чем al-изоформа: в плазматической мембране кардиомиоцитов этот изофермент находится в области триад, где он ассоциирован с Na/Ca-обменником (Despa, S., Bers, D., 2007). Таким образом, а2р-изофермент, более чувствительный к глутатионилированию, будет защищен от необратимого окисления при высоком уровне Ог. Известно, что сильный окислительный стресс приводит к необратимому окислению SH-групп белков до -S02 и -S03, после чего эти группы уже не могут подвергаться S-гпутагионилированию. Это означает, что гаутатионилирование защищает фермент от необратимой инактивации.

Мы показали, что глутатионилированию могут подвергаться почти все цитозольные SH-группы а-субъединицы фермента, за исключением цистеина 423. Однако in vitro в присутствии характерных для гипоксии концентраций окисленного и восстановленного глутатиона увеличивается его связывание с остатками цистеина 244 малой цитозольной петли, а также с остатками цистеина 454, 458 и 459 большой цитозольной петли а 1-субъединицы фермента. Построение трехмерной модели участка связывания АТР показало, что глутатионилирование трех последних остатков может закрывать доступ АТР в активный центр, вызывая инактивацию №,К-АТРазы.

Можно полагать, что S-глутатионилирование Na,K-ATPa3bi имеет физиологическое значение, снижая активность фермента, потребляющего значительное количество АТР. В то же время глутатионилирование предотвращает необратимое окисление фермента, что позволяет восстановить его активность с использованием, например, гаутаредоксина и

NADPH после перехода ткани в состояние с нормальной концентрацией кислорода.

24

выводы

1. Установлено, что al-субъединица Кта,К-АТРазы, выделенной из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы, содержит связанный глутатион. В препарате №,К-АТРазы, полученном из сердца крысы, глутатион связан и с а2-субъединицей. Глутатионилирование al - (но не а2-) субъединицы в значительной степени устраняется в присутствии дитиотреитола.

2. Окисленный глутатион вызывает протекающую во времени инактивацию Na,K-ATPa3bi почек кролика и сердца крысы in vitro; одновременно возрастает и уровень глутатионилирования al-субъединицы. Кинетика инактивации №,К-АТРазы под действием окисленного глутатиона является двухфазной, константы скорости инактивации для быстрой и медленной фаз различаются более чем в 10 раз.

3. Адениновые нуклеотиды защищают Na,K-ATPa3y от инактивации окисленным глугатионом; защитное действие нуклеотидов снижается в ряду: ATP > ADP > AMP. Методом изотермической калориметрии титрования показано, что глутатионилирование фермента предотвращает связывание с ним ADP.

4. Методом масс-спектрометрии (с перекрыванием 70-80% последовательности al-субъединицы при обработке химотрипсином и 50-60% при обработке трипсином) установлено, что из 15 остатков цистеина al-субъединицы Na,K-ATPa3bi, локализованных в цитозольном домене, глутатион может модифицировать 12. Остаток цистеина 423 никогда не глутатионилируется.

5. Инкубация Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки со смесью восстановленный/окисленный глутатион (1,7 мМ/170 мкМ) приводит к полной инактивации фермента. При этом увеличивается связывание глутатиона с остатками цистеина 244,454,458,459.

6. Сравнение набора остатков цистеина, подвергающихся глутатионилированию, и результаты моделирования связывания глутатиона и АТР с №,К-АТРазой, позволяют заключить, что для инактивации фермента необходимо глутатионилирование остатков цистеина 454,458,459 al-субъединицы из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы. Модификация этих остатков препятствует связыванию АТР, а связывание нуклеотида предотвращает модификацию указанных остатков цистеина.

7. Полученные результаты позволяют предположить, что физиологическое значение глутатионилирования al-субъединицы заключается, во-первых, в том, что связанный

ппутатион защищает SH-группы от необратимого окисления, а во-вторых, позволяет за счет инактивации ИаД-АТРазы предотвратить снижение концентрации АТР в клетке.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. I.Yu. Petrushanko, S. Yakushev, V.A. Mitkevich, Y. V. Kamanina, R.H. Ziganshin, Xianyu Meng, A.A. Anashkina, A. Makhro, O. D. Lopina, M. Gassmann, A. A. Makarov, A. Bogdanova. S-glutationilation of the Na,K-ATPase catalytic a-subunit is a determinant of the enzyme redox sensitivity. J. Biol. Chem. (2012), 287 (38), 32195-32205.

2. O.D. Lopina, Xianyu Meng, A.V. Graf, N.A. Sokolova Effect of hypoxia on the activity of Na,K-ATPase isoforms in rat heart. Biological motility. From fundamental achievments to nanotechnologies. Pushchino, 2010, стр. 153.

3. I.Yu. Petrushanko, V.A. Mitkevich, Y.V. Kamanina, X. Meng, R.H. Ziganshin, A.A. Anashkina, O.D. Lopina, A.A. Makarov. S-glutathionylation of the Na,K-ATPase catalytic alpha-subunit as a new regulator of the enzyme redox-sensitivity. Theses of The 13th International ATPase Conference «Na,K-ATPase and Related P-type Transport ATPases: Structure, Biology, and Medicine», Asilomar Conference Grounds Pacific Grove, California, USA, September 27-October 2,2011, p.121.

4. Meng, X., Petrushanko, I.Yu, Klimanova, E.A., Dergousova, E.A., Lopina, O.D. Glutationylation of a-subunit of Na,K-ATPase from rat heart results in the enzyme inhibition. Thesis of 10th International Conference "Cell volume regulation". Moscow, August 26-29, 2013, p.109.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495) 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 22.10.2013

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мэн Сяньюй, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ

М.В.ЛОМОНОСОВА»

На правах рукописи

04201363795

Мэн Сяныой

ИЗУЧЕНИЕ ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЯ ^,К-АТРазы ПОД ДЕЙСТВИЕМ

ОКИСЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА

03.01.04 - Биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Лопина О. Д.

кандидат физико-математических наук Петрушанко И. Ю.

Москва - 2013

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

(ХУ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ATP - аденозинтрифосфат

ADP - аденозиндифосфат

AMP - аденозинмонофосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотреитол

Е - фермент

ЕР - фосфорилированный фермент ИАФ - 5'-йодацетамидфлуоресцеин кДа - килодальтон

кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

Ml,...MIO - трансмембранные сегменты

NADH - никотинамиддинуклеотид восстановленный

NADPH- никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный

ГТААГ - полиакриламидный гель

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - протеинкиназа С

CP - саркоплазматический ретикулум

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБТ - фосфатно-солевой буфер (содержащий Твин-20)

цАМР - циклический аденозин-3',5'-монофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

ITC — изотермическая калориметрия титрования

MDCK - клеточная линия эпителия почек собаки

PBS - фосфатно-солевой буфер

PMSF - фенилметансулфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

Tris - трис(гидроксиметил)аминомета

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................7

1. Ыа,К-зависимая аденозинтрифосфатаза......................................................................................7

1.1. Общая характеристика Ыа,К-АТРазы как АТРазы Р-типа...................................................7

1. 2. Структура К-АТРазы..................................................................................................9

1.2. 1. Субъединичный состав К-АТРазы........................................................................9

1. 2. 2. а-Субъединица К-АТРазы.................................................................................. 10

1. 2. 3. Основные конформационные состояния К-АТРазы......................................... 12

1. 2. 4. Третичная структура а-субъединицы.......................................................................13

1. 2. 5. Доменная организация а-субъединицы Ыа,К-АТРазы...........................................15

1. 2. 6. Участки связывания катионов...................................................................................17

1. 2. 7. р-Субъединица Ыа,К-АТРазы................................................................................... 19

1. 2. 8. у-Субъединица Ыа,К-АТРазы....................................................................................21

1. 2. 9. Четвертичная структура Ыа,К-АТРазы....................................................................22

2.1. Уабаин - ингибитор К-АТРазы........................................................................................23

2.2. Изоформы субъединиц Иа,К-АТРазы..................................................................................26

3.1. Механизм функционирования Ыа,К-АТРазы.......................................................................28

4. Глутатионилирование белков ................................................................................................... 33

4. 1. Окислительный стресс ................................................................................................. 33

4. 2. Глутатион........................................................................................................................ 35

4. 3. Окислительная модификация БН-групп белков..........................................................39

4. 4. Механизм глутатионилирования белков......................................................................42

4. 5. Специфичность глутатионилирования белков............................................................44

4. 6. Цистеиновые остатки N8,К-АТРазы..............................................................................47

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧА ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................................49

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ..........................................................................................................50

5.1. Получение фракции микросом из и почек кролика.............................................................50

5.2. Получение фракции микросом из солевых желез уток.......................................................50

5.3. Очистка Ыа,К-АТРазы из микросом солевых желёз утки и почек кролика......................51

5.4. Получение фракции микросом из сердца крысы.................................................................52

з

5.5. Определение концентрации белка.........................................................................................52

5.6. Определение активности Ыа,К-АТРазы................................................................................53

5.7. Электрофорез в полиакриламидном геле..............................................................................53

5.8. Окрашивание белков на геле Кумасси голубым G-250 ....................................................... 54

5.9. Иммуноблоттинг......................................................................................................................54

5.10. Стриппинг- освобождение мембраны от антител............................................................55

5.11. Изотермическая калориметрия титрования (ITC)..............................................................55

5.12. Масс-спектрометрия..............................................................................................................56

5.13. Математическая обработка полученных результатов.......................................................57

5.14. Материалы..............................................................................................................................58

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................................60

6.1 Характеристика препаратов Na,K-ATPa3bi из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы................................................................................................................................................ 60

6.2 Ингибирование Na,K-ATPa3bi уабаином в препаратах, выделенных из солевых желез утки

и сердца крысы...............................................................................................................................62

6.3 Глутатионилирование Na,K-ATPa3bi в препаратах, выделенных из солевых желез утки, почек кролика и сердца крысы......................................................................................................64

6.4 Окисленный глутатион (GSSG) инактивирует Na,K-ATPa3y в препаратах, выделенных из почек кролика и сердца крысы............................................................................ 6 8

6.5 Адениновые нуклеотиды (ATP, ADP и AMP) защищают Na,K-ATPa3y от инактивации GSSG................................................................................................................................................71

6.6 Глутатионилирование предотвращает связывание ADP с №,К-АТРазой.........................74

6.7 Идентификация глутатионилированных цистеиновых остатков а 1-субъединицы Ыа,К-АТРазы...................................................................................................................................76

6.8 Моделирование взаимодействия связанного глутатиона с аминокислотами,

участвующими в формировании участка связывания АТР........................................................82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................................. 85

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................88

ВВЕДЕНИЕ

Na,K-ATPa3a - фермент, входящий в состав плазматической мембраны клеток животных. Он гидролизует АТР до ADP и Pi, используя освобождающуюся энергию для переноса ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента. В состав фермента входит минимум 2 типа субъединиц: каталитическая а- и регуляторная ß-субъединица, причем в различных тканях эти субъединицы представлены разными изоформами (Kaplan, J.H., 2002).

В результате функционирования Na,K-ATPa3bi на плазматической мембране возникает потенциал покоя, в возбудимых тканях возможна генерация потенциала действия (Glitsch, H.G., 2001). За счет поддержания определенной внутриклеточной концентрации Na+ и К+ Na,K-ATPa3a обеспечивает регуляцию клеточного объема, вторично-активный транспорт некоторых ионов (например, Са2+ и Н+), а также метаболитов, сопряженный с переносом натрия по градиенту концентраций. Кроме того, Na,K-ATPa3a является рецептором для сердечных гликозидов, таких как уабаин и дигоксин, которые, связываясь с ферментом, инициируют передачу сигнала через различные сигнальные каскады (Xie, Z., Askari, А., 2002).

Многообразие физиологических функций Na,K-ATPa3bi и наличие различных изоформ предполагает, что этот важный для клетки фермент в разных тканях должен подвергаться регуляции с использованием разнообразных механизмов. В частности, показано, что фосфорилирование Ыа,К-АТРазы некоторыми протеинкиназами по-разному влияет на ее активность и распределение в разных типах клеток.

Внутриклеточный трипептид глутатион (y-Glu-Cys-Gly) - самый распространенный

низкомолекулярный тиол цитоплазмы. Он существует в двух формах: восстановленной (GSH)

и окисленной (GSSG). Ранее считалось, что функция глутатиона - это защита клеток от

токсичных ксенобиотиков, поддержание внутриклеточного редокс-статуса (Schafer, F.Q.,

Buettner, G.R., 2001), а также антиоксидантное действие. Связывание глутатиона с

SH-группами белка (S-глутатионилирование) препятствует необратимому окислению

SH-групп до -SO2H и -SO3H, поскольку глутатион может быть легко удален с белка с

помощью различных внутриклеточных систем, в частности, глутаредоксина. В настоящее

время появляются данные о том, что связывание глутатиона с SH-группами белков с

образованием S-S-связи (S-глутатионилирование) может быть механизмом регуляции

5

функции их, таким же, например, как фосфорилирование (Mieyal, J., et al., 2008). Поскольку соотношение GSH/GSSG, определяющее редокс-статус клетки, значительно снижается при развитии окислительного стресса, глутатионилирование является редокс-чувствительной модификацией, которая может играть регуляторную роль (Schafer, F., Buettner, G.R., 2001). Установлено, что глутатионилированию подвергается Са-АТРаза саркоплазматического ретикулума, родственная Na,K-ATPa3e. В результате этого Са-АТРаза активируется (Adachi, Т., et al., 2004). Показано также, что под действием GSH и ONOO" глутатионилируется ß-субъединица Na,K-ATPa3bi, что снижает активность фермента примерно на 20% (Figtree, G.A., et al., 2009), однако глутатионилирования а-субъединицы до сих пор обнаружено не было.

Каталитическая а 1-субъединица Na,K-ATPa3bi содержит 23 остатка цистеина, 15 из которых находятся в цитозольной области, причем не выявлено существования дисульфидных связей между этими цистеиновыми остатками. При поочередной замене всех остатков цистеина а-субъединицы Na,K-ATPa3bi на аланин она сохраняет свою активность, хотя при такой замене аминокислот в некоторых позициях наблюдается снижение числа оборотов фермента (Shi, H.G., et al., 2000). В связи с этим возникает вопрос о состоянии SH-групп а-субъединицы Na,K-ATPa3bi и о влиянии этих групп на ферментативную активность при изменении соотношения GSH/GSSG, особенно при повышении концентрации окисленного глутатиона, которое характерно для гипоксии. Решению этой проблемы посвящена настоящая работа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Na,K-3aBiiciiMaH аденозинтрифосфатаза

1.1. Общая характеристика Na,K-ATPa3bi как АТРазы Р-типа

Для клеток характерна способность поддерживать в цитоплазме концентрацию некоторых катионов, отличающуюся от их концентрации вне клетки. Это возможно, с одной стороны, за счет ограниченной проницаемости мембран для ионов. Кроме того, в мембранах клетки находятся ионные насосы, компенсирующие пассивные потоки катионов. Насосы представляют собой ферменты, обеспечивающие трансмембранный перенос катионов против электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТР. Эти ферменты называются ион-транспортирующими АТРазами. Среди них выделяют семейство АТРаз Р-типа, сходных между собой по структуре и механизму функционирования (Carafoli, Е., 1991; Inesi, G., Kirley, M.R., 1992; Moller, J., etal., 1996).

Первый представитель семейства, Na,K-ATPa3a, была открыта в 1957 году Йенсом Скоу (Skou, J.С., 1957). Затем была обнаружена Са-АТРаза CP у животных (Hasselbach, W., Makinose, М., 1961), позднее Са-АТРаза плазматических мембран у животных и растений. И, наконец, появилась информация о существовании АТРаз Р-типа у микроорганизмов.

Методами генной инженерии к концу 80-х годов 20-го века была установлена первичная структура АТРаз Р-типа. Они объединяются в семейство гомологичных белков, которые обнаружены у эукариот и прокариот. Эукариотические АТРазы Р-типа животных включают: Na,K-ATPa3y, Н,К-АТРазу, ответственную за секрецию Н+ в желудке, и, по-видимому, за реабсорбцию К+ в тонком кишечнике и собирательных трубочках почек, Са-АТРазы плазматических мембран и сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA АТРазы), участвующие в регуляции концентрации Ca внутри клетки (эти АТРазы есть также у растений). У растений и дрожжей идентифицирована Н-АТРаза, необходимая для поддержания потенциала на мембране и участвующая в Независимом поглощении метаболитов. Представителями прокариотических АТРаз Р-типа являются Kdp-АТРаза кишечной палочки (Esherichia coli), обеспечивающая аккумуляцию

К+, Mg2+-ATPa3a,

Cd2+-ATPa3a и Си+-АТРаза, которые участвуют в транспорте этих катионов у прокариот (Moller, J., et al., 1996). Си+-АТРаза присутствует и у эукариот.

Основной структурной и функциональной единицей АТРаз Р-типа является интегральный мембранный белок, который у эукариот имеет молекулярную массу около 110 кДа (исключение - Са-АТРаза плазматических мембран с молекулярной массой около 140 кДа). Молекулярная масса прокариотических АТРаз Р-типа составляет около 70 кДа (Hicks, B.W., Parsons, S.M., 1992).

Полипептидная цепь АТРаз Р-типа, переносящих ионы тяжелых металлов, образует 8 трансмембранных фрагментов, из них 6 расположены в N-концевой части молекулы (рис. 1, А). По-видимому, отделение этих АТРаз от общей ветви произошло на ранней стадии эволюции. Их относят к подтипу I, остальные АТРазы этого типа представляют подтип II.

Полипептидная цепь АТРаз Р-типа подтипа II эукариот расположена в мембране так, что ее N- и С-концевые фрагменты находятся в цитоплазме (рис. 1, Б). Она пересекает мембрану 10 раз, формируя трансмембранные фрагменты в виде а-спиралей. 4 таких фрагмента располагаются в N-концевой половине цепи и 6 - в С-концевой. Контактирующие между собой трансмембранные фрагменты образуют канал, через который проходят катионы. Большая петля между трансмембранными фрагментами М4 и М5 образует цитоплазматический домен (он содержит примерно 50% аминокислотных остатков белка). Здесь расположен активный центр, обеспечивающий гидролиз АТР, за счет чего происходит изменение конформации белка, в том числе в области трансмембранного домена, образующего канал.

Основное свойство АТРаз Р-типа, благодаря которому они отличаются от других мембранных АТРаз (V- и Fl/FO-типов), - это образование в каталитическом цикле фосфорилированного фермента (фосфорилированного интермедиата, ЕР). Интермедиат ЕР появляется в результате переноса терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты в активном центре фермента. Помимо этого, в процессе каталитического цикла АТРазы Р-типа находятся в двух основных различных конформациях, El и Е2. Каталитический цикл АТРаз Р-типа - это комбинация процессов фосфорилирования-дефосфорилирования фермента и конформационных переходов Е1~*Е2 —-Е1. Цикл можно описать схемой: El —El-P—Е2-Р—Е2—El. Гидролиз АТР в соответствии с этой схемой сопряжен с переносом ионов через мембрану (Olesen, С., et al., 2007).

Na,K-ATPa3a - наиболее изученная АТРаза Р-типа. Фермент гидролизует АТР и осуществляет сопряженный с ним перенос ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента: 3 иона Na выходят из клетки, а 2 иона К перемещаются из внеклеточной среды в клетку (Post, R.L., et al., 1965; Garrahan, P.J., Glynn, I.M., 1967a).

связывание металла

фосфорилпрование ATP

фосфорилирование 'ATP

цитоплазма

мембрана м а

СООН

СООН

Рис. 1. Структура АТРаз Р-типа эукариот (Moller, J., et al., 1996). Слева (А)- АТРазы, переносящие ионы тяжелых металлов, справа (Б) - АТРазы, переносящие Na+, К+, Н+, Са2+.

С работой этого фермента связано выполнение важных физиологических функций: поддержание потенциала покоя, генерация потенциала действия в возбудимых клетках (Glitsch, H.G., 2001), сопряженный с переносом Na+ транспорт ионов и метаболитов. Na,K-ATPa3a является единственным рецептором для кардиостероидов (Xie, Z., Askari, А., 2002), связывание которых с ферментом приводит к различным физиологическим эффектам: к смерти клеток (эпителий почек), остановке апоптоза (гладкие мышцы сосудов) или гипертрофии клеток (кардиомиоциты).

1. 2. Структура Na,K-ATPa3bi

1. 2. 1. Субъединичный состав Na,K-ATPa3bi

Na,K-ATPa3a состоит, как минимум, из двух типов субъединиц, каталитической а- и регуляторной ß-субъединицы (Forbush, В., et al., 1978). В некоторых тканях в состав фермента входит небольшая у-субъединица, член белков семейства FXYD, которые могут существовать отдельно от Na,K-ATPa3bi и выполнять самостоятельные функции.

Молекулярная масса а-субъединицы составляет 110 кДа (ЭФ подвижность этой цепи соответствует молекулярной массе 100 кДа) (Yamaguchi, М., Tonomura, Y., 1979). Р-Субъединица Na,K-ATPa3bi - гликопротеид с молекулярной массой белковой части 35 кДа, углеводный фрагмент увеличивает её до 55-65 кДа (Yamaguchi, М., Tonomura, Y., 1979).

Как и у всех АТРаз этого подтипа полипептидная �