Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATРазой

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATРазой"

московским государственный университет

имени м.в. ломоносова биологический факультет

На правах рукописи

Климанова Елизавета Андреевна

СВЯЗЫВАНИЕ УАБАИНА И МАРИНОБУФАГЕНИНА С №,К-АТРазой

03.01.04 - биохимия

11 НОЯ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2015

005564480

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Лопина Ольга Дмитриевна кандидат физико-математических наук Петрушанко Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации Федерального государственного учреждения науки «Институт биофизики клетки Российской академии наук» Зинченко Валерий Петрович

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории ангиогенеза НИИ экспериментальной кардиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации Меньшиков Михаил Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук».

Защита диссертации состоится 21 декабря 2015 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при биологическом факультете Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: Ленинские горы, д.1, строение 12, Москва, ГСП-1, 119234, ауд. ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте http://www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан « » ноября 2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Д.Б. Киселевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Na,K-ATPa3a (Na-Hacoc) - это фермент, встроенный в плазматическую мембрану, который обеспечивает перенос ионов Na+ через плазматическую мембрану из клетки наружу, а К+ - в противоположном направлении. Оба катиона перемещаются против электрохимического градиента, для чего используется энергия, освобождающаяся при гидролизе АТР до ADP и неорганического фосфата.

Иа,К-АТРаза поддерживает градиент ионов Na+ и К+ через плазматическую мембрану во всех типах клеток животных. Этот градиент имеет существенное значение для передачи сигналов и обеспечения вторичного транспорта различных веществ, поддержания клеточного объема, осмотической активности, он также играет важную роль в процессе генерации потенциала действия. Na,K-ATPa3a - один из первых открытых мембранных ферментов, относящихся к семейству АТРаз Р-типа, которое включает в себя не только натриевый, кальциевый и протонный насосы, но и насосы, обеспечивающие транспорт тяжелых металлов, а также липидные флиппазы. Специфическими ингибиторами этого фермента являются уабаин и маринобуфагенин -соединения, относящиеся к классу так называемых кардиотонических стероидов (КТС), которые являются производными холестерина. За последние годы появилось множество работ, свидетельствующих о том, что Na,K-ATPa3a выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов, способного участвовать в регуляции пролиферации и смерти клеток. Существует две гипотезы, которые объясняют функцию КТС в генерации клеточных сигналов.

Одна из них предполагает, что в результате взаимодействия Иа.К-АТРазы с кардиотоническими стероидами происходит ингибирование фермента, вследствие чего наблюдается локальное увеличение концентрации ионов Na+ внутри клетки. Это, в свою очередь, приводит к активации Ма+/Са2+-обменника и последующему локальному увеличению концентрации ионов Са2+, который и оказывает влияние на метаболизм клетки.

Вторая гипотеза рассматривает Na,K-ATPa3y в качестве компонента так называемой сигналосомы, в состав которой входит ряд белков, взаимодействие с которыми обусловлено конформационными перестройками молекулы фермента, вследствие чего с ферментом связывается ряд белков, обеспечивающих передачу сигнала вглубь клетки и последующее изменение метаболизма.

Таким образом, можно полагать, что механизмом запуска некоторых сигнальных каскадов является не только ингибирование Na.K-АТРазы под действием КТС, но и изменение конформации этого фермента при их связывании.

В данной работе проведено сравнительное изучение особенностей связывания уабаина и маринобуфагенина с ИаД-АТРазой, с особым вниманием к изменению конформации фермента под действием этих двух КТС.

Цель и задачи работы

Основной целью данной работы было выявление изменений конформаций Na,K-ATPa3bi под действием уабаина и маринобуфагенина и исследование связывания этих кардиотонических стероидов на различных стадиях каталитического цикла.

Перед нами стояли следующие задачи:

1. Получить препараты высокоочищенной активной Na,K-ATPa3bi (а 1 ,р 1 -изофермент).

2. Исследовать связывание уабаина и маринобуфагенина с ферментом, находящимся в различных конформациях.

3. Исследовать различия в конформации фермента после связывания уабаина и маринобуфагенина.

4. Изучить влияние адениновых нуклеотидов (AMP, ADP, ATP) на конформацию фермента и на связывание уабаина и маринобуфагенина в присутствии этих нуклеотидов.

Научная новизна

В работе впервые с помощью различных методов (путем использования флуоресцентных меток и метода изотермической калориметрии титрования) проведено сравнительное исследование связывания уабаина и маринобуфагенина с различными конформационными состояниями Na,K-АТРазы, имитирующими каталитический цикл фермента. Было показано, что оба кардиотонических стероида обладают одинаковыми ингибирующими свойствами и связываются с одним и тем же участком а-субъединицы Na,K-АТРазы, при этом сродство уабаина к ферменту, находящемуся в конформации Е2Р, почти в 17 раз выше, чем сродство к маринобуфагенину. Установлено, что сродство Na.K-АТРазы к уабаину существенно зависит от конформации фермента, в то время как сродство маринобуфагенина почти не изменяется при изменении конформации ИаД-АТРазы. С помощью метода изотермической калориметрии титрования установлено, что связывание АТР инициирует образование «закрытой» Е1-конформации, хотя ранее предполагалось, что подобное состояние характерно только для Е2-формы Na,K-ATPa3bi. Выявлено, что взаимодействие фермента с ADP или АТР не сказывается на связывании уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией фермента.

Практическая ценность

Ранее было установлено, что уабаин вызывает смерть злокачественных клеток эпителия почек и кишечника (линии клеток MDCK и Сасо-2 соответственно). При лечении злокачественных опухолей эпителия использование уабаина в качестве лекарственного препарата позволяет существенно снизить дозу радиоактивности, необходимой для уничтожения опухоли, что позволяет уменьшить неблагоприятные эффекты радиотерапии. Хотя результаты работы имеют в основном теоретическое значение, понимание механизмов передачи сигнала, инициирующего смерть клеток эпителия, которое будет основано на результатах нашей работы, позволит начать разработку лекарственных препаратов, необходимых для лечения злокачественных новообразований эпителия. Кроме того, результаты

настоящего исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на нескольких научных конференциях: 10lh International Congress «Cell Volume Régulation: Novel Therapeutic Targets & Pharmacological Approaches» (Россия, Москва,

2013); 14th International Conférence «Na,K-ATPase and related transport ATPases: Structure, mechanism, cell biology, health and disease» (Нидерланды, Люнтерен,

2014); 40л FEBS Congress «The Biochemical Basis Of Life» (Германия, Берлин,

2015), a также на заседаниях кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Публикации

По результатам работы опубликовано 2 статьи и 3 тезисов.

Структура и объем работы

Диссертация имеет стандартную структуру и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, заключение, список литературы, содержащий 198 ссылок. Работа объемом 110 страниц проиллюстрирована 29 рисунками и 5 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы приведены данные о строении и функциях Na,K-АТРазы, а также приведен подробный анализ данных по связыванию с ферментом двух его специфических ингибиторов - уабаина и маринобуфагенина. Особое внимание в обзоре уделяется рецепторным свойствам Na,K-ATPa3bi.

Материалы и методы исследования

Материалы

Уабаин был куплен в фирме Fluka (UK), маринобуфагенин любезно предоставлен профессором Багровым А. Я. (Санкт-Петербург). Моноклональные антитела против al-субъединицы Na,K-ATPa3bi (клон С 464,6) были приобретены в фирме Millipore (Temecula, СА). В работе использован додецилсульфат натрия производства МР Biomedicals (California, USA), дезоксихолат натрия был куплен у AppliChem (Germany), раствор БСА с концентрацией 2 мг/мл - у BioRad (California, USA). Антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой из хрена (клон RG-96), и остальные реактивы были приобретены в фирме Sigma-Aldrich (Missouri, USA).

Получение очищенного препарата Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки проводили путем солюбилизации примесных белков из препаратов микросом с использованием додецилсульфата натрия с последующим центрифугированием солюбилизированного материала в прерывистом градиенте плотности сахарозы по методу Jorgensen.

Определение концентрации белка осуществляли по методу Lowry с использованием 0,1% раствора дезоксихолата натрия для солюбилизации

мембранных фракций белка. В качестве стандарта использовали коммерческий раствор БСА с концентрацией 2 мг/мл (Bio-Rad).

Определение активности Na,К-А ТРазы осуществляли, измеряя концентрацию продукта реакции неорганического фосфата (Pi) по методу Rathbun и Betlach, или используя систему сопряженных ферментов (пируваткиназа-лактатдегидрогеназа), которые обеспечивали окисление NADH до NAD+ в количестве, эквимолярном ADP, образующемуся в результате Na,K-АТРазной реакции.

Одномерный электрофорез в ПААГ по методу Laemmli применяли для анализа белкового состава полученных в работе фракций микросом и очищенного белка. В работе использовали 6% концентрирующий и 10% разделяющий гели. Окрашивали белки раствором Кумасси G-250.

Вестерн-блоттинг. Белковые препараты подвергали одномерному электрофорезу в ПААГ по методу Laemmli в гелях толщиной 0,75 мм. Затем осуществляли электроперенос белков на PVDF мембрану, после чего проводили блокировку мембраны 5% раствором обезжиренного молока с последующей инкубацией в растворе антител против al-субъединицы Na,K-АТРазы. Визуализацию комплексов антиген-антитело проводили с помощью раствора 3,3'-диаминобензидина (ДАБ).

Включение флуоресцентных меток 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ) и флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Na,K-ATPa3bi, полученные из солевых желез утки.

Очищенные препараты Na,K-ATPa3bi подвергали диализу в течение ночи при +4° С против буфера следующего состава: 50 мМ имидазол, 0,2 мМ ЭДТА, pH 7,5. Белок с концентрацией 1 мг/мл инкубировали в растворе следующего состава: 5 мкМ ФИТЦ, 50 мМ трис, 2 мМ ЭДТА, pH 9,0 в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре. Для включения в Na,K-ATPa3y 5-ИАФ белок с концентрацией 1,5 мг/мл инкубировали в растворе 100 мкМ 5-ИАФ, 50 мМ имидазол-НС1, 20 мМ KCl, pH 7,5 в течение 36 часов при +4°С. От избытка метки в обоих случаях избавлялись центрифугированием в течение 1 ч при 94500 g (Beckman Optima L-90K Ultracentrifiige). Полученные осадки суспендировали в минимальном объеме (~50 мкл) раствора 25 мМ имидазола, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5, 250 мМ сахарозы.

Измерение флуоресценции ФИТЦ- и 5-ИАФ-меченных препаратов Na,K-ATPa3bi, полученных из солевых желез утки проводили на спектрофлуориметре Vanan Сагу Eclipse в растворах 10 мМ имидазол-НС1, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5 и 10 мМ имидазол-НС1, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ Pi/трис, 3 мМ MgCl2, pH 7,5 в пробах объемом 3 мл при температуре 25°С. Концентрация белка в пробе составляла 0,1 мкМ. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 495 нм, эмиссию регистрировали при длине волны 520 нм.

Регистрацию термодинамических параметров связывании лигандов методом изотермической калориметрии титрования осуществляли с использованием прибора MicroCal VP-ITC (США). Метод позволяет проводить измерение тепла, которое поглощается или выделяется в ходе химической реакции. Благодаря этому можно охарактеризовать межмолекулярные

взаимодействия и напрямую определить параметры связывания: энтальпию, стехиометрию реакции и константу связывания. Эксперименты по связыванию уабаина и маринобуфагенина проводили в растворах: 1)10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ MgCl2, 3 мМ трис/Р„ рН 7,5 (Е2Р-конфор.\юция)\ 2) 10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 130 мМ NaCl, 20 мМ КС1, рН 7,5 (.Е1/Е2-конформация); 3) 10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ NaCl, рН 7,5 (Е1-конформация); 4) 10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ NaCl, 200 мкМ ADP, рН 7,5 (Е1-конформация в присутствии ADP); 5) 10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ NaCl, 200 мкМ АТР, рН 7,5 (Е1-конформация в присутствии АТР). Термодинамические параметры связывания AMP, ADP и АТР с Ыа,К-АТРазой были определены при температурах 10, 25, 30 и 37° С в буфере следующего состава: 25 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 250 мМ сахароза, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ NaCl или 3 мМ КС1, рН 7,5. Теплоту разбавления, определенную титрованием буферного раствора лигандом, вычитали из теплоты реакции для получения значения эффективной теплоты связывания. Затем определяли константу связывания (Ка), энтальпию и стехиометрию связывания, а энтропию связывания вычисляли с помощью стандартного термодинамического соотношения AG=-RxTxlnKa=AH-TAS.

Компьютерный анализ данных проводили с помощью программного пакета MicroCal Origin 7.0.

Молекулярное моделирование проводила кандидат физико-математических наук Анашкина А.А. (Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН).

Трехмерная структура а-субъединицы Na,K-ATPa3bi в комплексе с маринобуфагенином была создана на основе ранее опубликованных данных рентгеноструктурного анализа (структура комплекса а-субъединицы фермента из почек свиньи и уабаина с разрешением 3,4 A, PDB код 4HYT).

Трехмерная модель а-субъединицы фермента в Е1 «открытом» и «закрытом» состояниях также была создана на основе имеющихся данных рентгеноструктурного анализа а-субъединицы из почек свиньи в [Na3]ElP-ADP-состоянии с разрешением 2,8 A (PDB код 3wgu).

Сравнение первичной структуры Na,K-ATPa3bi из утки (Q7ZYV1) и свиньи (Р05024) в базе данных UNIPROT (www.uniprot.org1 показало, что аминокислотные остатки, обеспечивающие связывание КТС, в обоих случаях идентичны.

Результаты

Характеристика препаратов Ш,К-АТРазы, полученных из солевых желез утки. Очищенный фермент выделяли из фракции микросом, полученных из солевых желез 40-дневных уток, выдержанных в течение 10 дней на диете с 0,2 М NaCl (12 г/л), посредством их обработки додецилсульфатом натрия и последующего центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Додецилсульфат натрия экстрагирует из мембраны примесные белки, оставляя в ней лишь Na,K-ATPa3y.

Белковый состав фракций анализировали с помощью метода одномерного SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 1А) и Вестерн-блоттинга

(рис. 1Б). В полученных препаратах обнаруживается главным образом белок с кажущейся молекулярной массой 100 кДа, который взаимодействует с антителами против а 1-субъединицы №,К-АТРазы (рис. 1Б). Полоса, соответствующая белку с кажущейся молекулярной массой 55 кДа ((31-субъединица), очень сильно «размыта» вследствие гликозилирования белка.

кДа А Б

12 3 2 3

Рис. 1. Анализ белкового состава фракции микросом и очищенного препарата Na.K-АТРазы из солевых желез утки. А - электрофореграмма, полученная в результате проведения электрофореза в ПААГ по методу Laemmli. Б - PVDF-мембрана, полученная после проведения Вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител против а 1-субъединицы Na,K-ATPa3bi. 1 - маркеры для определения молекулярных масс; 2 - фракция микросом, полученная из солевых желез утки; 3 - очищенный препарат Na,K-АТРазы из солевых желез утки.

Ингибирование Na,K-ATPa3bi уабаином и маринобуфагенином. Na,K-АТРаза в процессе каталитического цикла проходит через два различных конформационных состояниях - Е1 и Е2, которые различаются в том числе и характером связывания уабаина. Известно, что в случае взаимодействия с Е1-конформацией Na,K-ATPa3bi уабаин связывается с ферментом с очень низким сродством. При отсутствии в среде ионов Na+ и К+ большая часть фермента (от 70 до 90% в зависимости от источника фермента, рН и природы буфера) находится в Е1-конформации. В связи с этим мы добавляли ингибитор к ферменту в среду измерения активности, инкубировали в течение 5 мин, после этого начинали реакцию внесением АТР. Предварительно нами было показано, что в среде с Na+ , К+ и АТР уабаин и маринобуфагенин являются обратимыми ингибиторами, а при связывании с Na,K-ATPa3oft в Е2Р-конформации оба КТС действуют как необратимые ингибиторы. На рисунке 3 приведены кривые, описывающие ингибирование Ыа,К-АТРазы этими КТС.

Рис. 2. Структурные формулы уабаина (слева) и маринобуфагенина (справа).

100-

80-

60-

£ <

40-

20-

0-

4 6 8

Концентрация КТС, мкМ

10

Рис. 3. Зависимость активности №,К-АТРазы, полученной из солевых желез утки, от концентрации уабаина (•) и маринобуфагенина (о). За 100% взята активность фермента в отсутствие кардиотонических стероидов.

Ингибирование гидролитической активности Иа,К-АТРазы уабаином и маринобуфагенином характеризуется схожими значениями 1С50 (1,3 и 0,6 мкМ соответственно), формы кривых мало различаются между собой и в обоих случаях представляют собой гиперболу. Кроме того, практически полное подавление ферментативной активности наступало при концентрации обоих ингибиторов, равной 5-6 мкМ. Таким образом, мы не обнаружили различий в ингибирующем действии уабаина и маринобуфагенина.

Изучение взаимодействия Ш,К-АТРазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток. Включение флуоресцентной метки (флуоресцеинизотиоцианата и 5-иодацетамидфлуоресцеина) осуществляли в

очищенные препараты Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки. Известно, что включение ФИТЦ (в отличие от 5-ИАФ) приводит к полному ингибированию ферментативной активности №,К-АТРазы, поскольку он связывается с остатком лизина, расположенном рядом с центром связывания АТР.

Регистрацию изменения уровня флуоресценции в ответ на связывание Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином мы проводили в присутствии ионов Mg2+ и Pi, переводя тем самым фермент в Е2Р-конформацию, характеризующуюся высоким сродством к уабаину.

Кривая, отражающая увеличение флуоресцентного ответа в зависимости от концентрации обоих КТС, представляет собой гиперболу (рис. 4).

КТС, мкМ

Рис. 4. Зависимость изменения флуоресценции ФИТЦ-меченного препарата №,К-АТРазы из солевых желез утки от концентрации уабаина (•) и маринобуфагенина (о) при длине волны 520 нм. Проба содержит 67 нМ белка в 3 мл 10 мМ имидазола, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ Pi/трис, 3 мМ MgCl2, рН 7,5. Температура в кюветном отделении 25 °С.

Максимальное изменение уровня флуоресценции ([Fi-Fo]/Fo><100%) в случае титрования фермента уабаином составило 14%, тогда как с маринобуфагенином эта величина была равной 25%. При этом значения концентрации уабаина и маринобуфагенина, обеспечивающие полумаксимальный флуоресцентный ответ (150), составили 0,24 и 0,25 мкМ соответственно.

Изменения флуоресценции ФИТЦ-меченной Na,K-ATPa3bi отражают конформационные перестройки белка в районе метки. Остаток Lys501, с которым связывается ФИТЦ, находится в цитоплазматическом домене вблизи АТР-связывающего центра, располагаясь между трансмембранными фрагментами М4 и М5. В конформации Е2Р этот участок молекулы частично экранирован от растворителя. При связывании молекулы уабаина с а-субъединицей фермента наибольшие структурные изменения происходят в

части трансмембранных фрагментов, которые приближены к внешней части мембраны: М4-цепь отодвигается от Мб-сегмента, что приводит в движение М1-М2 -цепи. В результате образуется своеобразная впадина, окруженная М1-М2 и М4-М6-фрагментами и открытая в сторону внеклеточного пространства. Подобный характер изменения флуоресценции ФИТЦ-меченной Ма,К-АТРазы наблюдается также в присутствии ионов т.е. при переходе фермента в Е1-состояние.

Аналогичные эксперименты мы проводили с использованием другой флуоресцентной метки - 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ), которая связывается с СуБ457 и в отличие от ФИТЦ не ингибирует ферментативную активность. Уровень флуоресценции 5-ИАФ-меченной ИаД-АТРазы в присутствии уабаина или маринобуфагенина падает (рис. 5). Максимальное изменение флуоресценции в случае уабаина составило 3,7%, а в случае маринобуфагенина - 7,1%. Концентрации, при которых наблюдается полумаксимальное изменение интенсивности флуоресценции, равны 1,7 и 2,7 мкМ для уабаина и маринобуфагенина соответственно.

Таким образом, данные, полученные в экспериментах по изучению флуоресценции, позволяют заключить: различия в значения 150 при связывании уабаина и маринобуфагенина с 5-ИАФ- и ФИТЦ-меченными препаратами Ыа,К-АТРазы могут быть обусловлены тем, что данные метки находятся в различном микроокружении. Тот факт, что при связывании уабаина и маринобуфагенина флуоресценция меченых препаратов белка изменяется в разной степени, можно объяснить различными структурными изменениями в молекуле белка, вызываемыми этим связыванием.

КТО, мкМ

Рис. 5. Зависимость изменения флуоресценции 5-ИАФ-меченного препарата Ма,К-АТРазы из солевых желез утки от концентрации уабаина (•) и маринобуфагенина (о) при длине волны 520 нм. Проба содержит 67 нМ белка в 3 мл 10 мМ имидазола, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ Р^трис, 3 мМ М£С12, рН 7,5. Температура в кюветном отделении 25 "С.

Изучение взаимодействия 1Ча,К-АТРазы с уабаином и маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования.

Для оценки термодинамических параметров реакции (изменение энтальпии АН, изменение энтропии АЯ) и констант связывания Ка с помощью метода изотермической калориметрии титрования мы проводили изучение взаимодействия уабаина и маринобуфагенина с ИаД-АТРазой, находящейся в трех различных состояниях: Е2Р, Е1/Е2 и Е1. Типичная экспериментальная 1ТС-кривая для связывания уабаина с №,К-АТРазой в конформации Е2Р приведена на рисунке 6.

Реакция связывания №,К-АТРазы из солевых желез утки, находящейся в конформации Е2Р, с уабаином при температуре 25°С характеризуется следующими термодинамическими параметрами: изменение энтальпии АН = -11,5 ккал/моль, изменение энтропии ТАБ = -2 ккал/моль, константа диссоциации К^ = 0,1 мкМ. Основной вклад в изменение энергии Гиббса АО вносит изменение энтальпии АН. Отрицательная величина изменения энтальпии свидетельствует об образовании большого количества водородных связей или Ван-дер-Ваальсовских взаимодействий между ферментом и уабаином.

Время, мин

0 10 20 30

Молярное отношение

Рис. 6. Анализ взаимодействия Е2Р-конформации Na.K-АТРазы с уабаином методом изотермической калориметрии титрования (ITC). Верхняя панель - ITC-кривая, полученная при титровании №,К-АТРазы из солевых желез утки уабаином при pH 7,5 и температуре 25 °С; нижняя панель - изотерма связывания, полученная путем интегрирования ITC-кривой, и оптимизированная аппроксимация изотермы связывания с помощью модели с одним типом участков связывания (сплошная линия).

Аналогичным образом мы исследовали особенности взаимодействия Е2Р-конформации Na,K-ATPa3bi с другим кардиотоническим стероидом -маринобуфагенином (рис. 7). Термодинамические характеристики этой реакции следующие: изменение энтальпии АН = -1,3 ккал/моль, изменение энтропии TAS = 6,6 ккал/моль, константа диссоциации Kj = 1,7 мкМ. Эта реакция характеризуется значительным положительным изменением энтропии, т.е. в процессе связывания маринобуфагенина доминируют два фактора: перегруппировка молекул растворителя и гидрофобные взаимодействия. Положительная величина изменения энтропии говорит о том, что в результате взаимодействия фермента с маринобуфагенином происходит снижение количества гидрофобных групп, экспонированных в раствор.

Время, мин

О 10 20 30

Молярное отношение

Рис. 7. Анализ взаимодействия Е2Р-конформации Na,K-ATPa3bi с маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования (ГГС). Верхняя панель - ITC-кривая, полученная при титровании Na.K-АТРазы из солевых желез утки маринобуфагенином при pH 7,5 и температуре 25°С; нижняя панель - изотерма связывания, полученная путем интегрирования ITC-кривой, и оптимизированная аппроксимация изотермы связывания с помощью модели одного типа участков связывания (сплошная линия).

Кроме того, были проведены эксперименты с использованием модели конкурентного связывания, в которых маринобуфагенин вытеснялся из комплекса с Иа,К-АТРазой уабаином. При этом были получены термодинамические параметры данной реакции. С использованием данной модели для уабаина мы получили значение константы связывания К^ (0,08

мкМ), близкое тому значению, которое было получено в экспериментах с использованием модели с одним типом участков связывания (таблица 3). Были проведены также эксперименты по вытеснению уабаина из комплекса с Na,K-АТРазой маринобуфагенином. Однако при титровании комплекса Na,K-ATPa3bi с уабаином маринобуфагенином мы не смогли детектировать связывания, что объясняется тем, что в Е2Р-конформации константа диссоциации с маринобуфагенином на порядок выше, чем с уабаином. Таким образом, можно заключить, что связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATPa3oft происходит в одном и том же участке белка.

При связывании уабаина с ИаД-АТРазой, находящейся в равновесии между El и Е2 конформациями (Е1/Е2-состояние), происходило уменьшение сродства почти на порядок (значение Kd составило 0,77 мкМ) и изменение термодинамического профиля: из энтальпийно выгодного (в Е2Р-состоянии) этот процесс становился энтропийно выгодным. Связывание уабаина с Е1-конформацией Na.K-АТРазы в данных экспериментах зарегистрировать не удалось. Это означает, что связывание либо отсутствует, либо константа диссоциации Kd>10 мкМ. В то же время сродство маринобуфагенина к трем вышеописанным конформациям фермента практически не меняется, однако термодинамические профили этих трех реакций различны. При переходе от Е2-к El-состоянию происходит уменьшение энтропийной составляющей и увеличение энтальпийного вклада.

Наши данные свидетельствуют о том, что сродство маринобуфагенина к Na,K-ATPa3e незначительно зависит от конформации, в то время как сродство уабаина к Na,K-ATPa3e резко снижается при переходе к El-состоянию. При этом значение концентраций, обеспечивающих полумаксимальное ингибирование ферментативной активности Na.K-АТРазы уабаином и маринобуфагенином, имеют близкие значения. Таким образом, когда фермент осциллирует между El- и Е2-состояниями (при измерении ферментативной активности в том числе), его сродство к различным кардиотоническим стероидам практически одинаково, что подтверждается данными наших экспериментов (таблица 3).

Моделирование участка а-субъединицы Na,K-ATPa3bi, связанного с молекулой маринобуфагенина. Ранее было установлено, что с а-субъединицей Na,K-ATPa3bi из почек свиньи (PDB code 4HYT) уабаин формирует пять водородных связей (с остатками Gin111, Glu117, Asn122, Glu312, Thr797) и образует шесть гидрофобных контактов с остатками Leu125, Ile315, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, расположенными в трансмембранных спиралях Ml, М2, М5 и Мб а-субъединицы фермента. При моделировании в структуре 4HYT была проведена замена уабаина на маринобуфагенин и минимизация энергии данного комплекса; оказалось, что стероидное ядро маринобуфагенина располагается на ~ 5 Â ближе к выходу из полости участка связывания по сравнению с уабаином. В комплексе с №,К-АТРазой маринобуфагенин образует одну водородную связь с остатком Glu312 и пять гидрофобных контактов с теми же аминокислотными остатками, что и уабаин, - Ile315, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793. Однако данные аминокислотные остатки взаимодействуют с другими атомами

лиганда (КТС). Минимизация энергии комплекса уабаин-Иа, К-АТРаза (4НУТ) не приводила к изменению положения молекулы гликозида в участке связывания (рис. 8).

Деформация полости, в которой происходит связывание КТС, в результате конформационных изменений молекулы белка может приводить к ослаблению этого связывания. Вероятно, это является причиной уменьшения сродства Иа,К-АТРазы к уабаину при переходе к Е1-состоянию. Тот факт, что молекула маринобуфагенина располагается в данной полости менее глубоко и образует меньше связей с аминокислотными остатками а-субъединицы фермента, объясняет, по всей видимости, несущественное изменение сродства к данному КТС при переходе к Е1-состоянию.

Рис. 8. Моделирование участка а-субъединицы Na,K-ATPa3bi, связанного с молекулами уабаина (А) и маринобуфагенина (В). Суперпозиция уабаина (голубой) и маринобуфагенина (фиолетовый) в комплексе с Na,K-ATPa3oft (С). Участки связывания уабаина (D) и маринобуфагенина (Е). Структурные элементы Na,K-ATPa3bi, вовлеченные в образование комплекса с уабаином (серый) и маринобуфагенином (розовый). Суперпозиция уабаина (голубой) и маринобуфагенина (фиолетовый) в комплексе с ЫаД-АТРазой (F). Расстояние между С17-атомами уабаина и маринобуфагенина 5,12 А.

Данные молекулярного моделирования позволяют предположить, что связывание уабаина и маринобуфагенина приводит к различным изменениям в расположении трансмембранных сегментов ИаД-АТРазы, образующих участок связывания (рис. 8F), что, в свою очередь, является причиной различных структурных изменений в цитозольной части молекулы белка, зарегистрированных нами с использованием флуоресцентных зондов.

Изучение взаимодействия Ш,К-АТРазы с AMP, ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования. Связывание ионов Na+

индуцирует переход Na,K-ATPa3bi в Е1-конформацию. Из литературы также известно, что данный переход возможен под действием АТР и его аналогов. ADP и АТР имеют схожее сродство к Na,K-ATPa3e, однако оказывают различное влияние на фермент.

В данной работе мы использовали метод изотермической калориметрии титрования для того, чтобы установить значения констант связывания Na,K-АТРазы в Е1 -конформации для AMP, ADP и АТР при различных температурах. Данные по изменению теплоемкости системы, вычисленной из зависимости изменения энтальпии от температуры (АСР = dAH/dT), позволяют оценить конформационные изменения молекулы белка при связывании лиганда. При постановке экспериментов мы предотвратили гидролиз АТР и образование фосфорилированного интермедиата фермента путем исключения из среды ионов Mg2+. Типичные ГГС-кривые титрования Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки AMP, ADP и АТР при рН 7,5 и температуре 25 °С представлены на рисунке 9.

Согласно полученным нами данным, сродство ADP и АТР к Na,K-АТРазе в присутствии 3 мМ NaCl (Е1-конформация) на порядок выше по сравнению с AMP. При этом значительных различий в значениях констант связывания для ADP и АТР мы не наблюдали (таблица 1). Таким образом, можно говорить о том, что р-фосфат вовлечен в образование комплекса адениновых нуклеотидов с Ыа,К-АТРазой. Его появление в молекуле аденинового нуклеотида приводит к увеличению константы связывания в 10 раз, тогда как у-фосфат подобной роли не играет. Эти данные хорошо коррелируют с ранее полученными значениями констант связывания для ADP и АТР и подтверждают ранее выдвигаемые предположения о ключевой роли (3-фосфата при образовании вышеупомянутых комплексов. В присутствии 3 мМ КО (Е2-конформация) нам не удалось зарегистрировать связывания ADP и АТР с ИаД-АТРазой, что также согласуется с данными литературы.

Помимо непосредственного определения констант связывания AMP, ADP и АТР с Иа,К-АТРазой мы также оценили изменение теплоемкости системы (АСР), вычисленной из зависимости изменения энтальпии от температуры (таблица 2, рис. 10). Изменения теплоемкости системы отражают изменения поверхности белка, доступной растворителю (SAA). Мы обнаружили, что при связывании №,К-АТРазы с АТР происходит значительное уменьшение ДСР, что свидетельствует об уменьшении поверхности, доступной растворителю (SAA). Используя эмпирическую формулу, мы оценили изменение поверхности в А2 (таблица 2):

ДСР = kxAAtot, где к - коэффициент, значение которого по разным данным колеблется от 0,129 до 0,189 кал/(Кхмоль*А2); AA,ot - изменение поверхности белка, доступной растворителю (A2), AAlol min и AAtot гаах рассчитаны для минимального и максимального значения коэффициентов к.

Бремя, мин

.'UJ'IUU 1Д

дш теш/

у

Молярное отношение

Время, мин

Время, мин

и

Молярное отношение

Молярное отношение

Рис. 9. Анализ взаимодействия №,К-АТРазы с AMP (A), ADP (В) и АТР (С) методом ITC. Верхние панели - ITC-кривые титрования Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки AMP, ADP и АТР при pH 7,5 и температуре 37°С; нижние панели - изотермы связывания, полученные интегрированием ITC-кривой, и оптимизированные аппроксимации изотермы связывания с использованием модели одного типа участков связывания (сплошная линия).

Таблица 1. Термодинамические параметры реакций связывания AMP, ADP и АТР с Na,K-АТРазой из солевых желез утки при рН 7,5

Лиганд T, °c Kd, mkM AH, ккал/моль TAS, ккал/моль AG, ккал/моль

AMP 25 0,91 -1,4 6,8 -8,2

AMP 30 0,56 -1,8 6,9 -8,7

AMP 37 0,59 -2,2 6,7 -8,8

ADP 25 0,07 -5,7 4,1 -9,7

ADP 30 0,04 -6,0 4,2 -10,2

ADP 37 0,04 -6,2 4,3 -10,5

ATP 10 0,08 7,7 16,9 -9,2

ATP 25 0,06 -4,0 5,8 -9,8

ATP 37 0,05 -12,8 -2,4 -10,4

.о

с; о

с; со

S*:

х" <

10 15 20 25 30 35 40 Температура, °С

Рнс. 10. Зависимость изменения энтальпии образования комплексов Na,K-АТРазы из солевых желез утки с AMP, ADP и АТР от температуры.

Сотрудником ИМБ РАН кандидатом физико-математических наук Анашкиной АА. была создана модель Иа,К-АТРазы, отражающая структурные изменения молекулы фермента при связывании АТР, на основе структуры Na,K-ATPa3bi из почек свиньи (PDB код 3wgu). Она демонстрирует фермент в двух состояниях: Е1 «открытом» и Е1 «закрытом», связанным с молекулой АТР (рис. 11). В «открытом» Е1-состоянии нуклеотидсвязывающий (N) и фосфорилируемый (Р) домены разведены друг от друга в пространстве. При переходе в «закрытое» состояние происходит сближение нуклеотидсвязывающего (N) домена с актуаторным (А) и фосфорилируемым (Р), при этом у-фосфат молекулы АТР, располагающейся в N-домене, приближается к Asp36, который находится на Р-домене. Была рассчитана площадь поверхности белка, доступная растворителю, в «открытой» и «закрытой» конформациях, эти значения составили 39436 А2 и 34687 А2 соответственно. Таким образом, изменение поверхности, доступной растворителю, при связывании АТР составляет 4749 А2, что довольно хорошо согласуется с данными, полученными методом ITC (таблица 2).

Таблица 2. Изменения теплоемкости и поверхности, доступной растворителю (SAA), при

связывании №,К-АТРазы из солевых желез утки с нуклеотидами

Лнганд АСР, кал/Кхмоль AAt0(_miin А AA,tot_max» ^

AMP -66 349 551

ADP -43 228 333

АТР -760 4021 5891

Связывание AMP и ADP с №,К-АТРазой сопровождается небольшими изменениями энтальпийной (АН) и энтропийной (AS) составляющих при различных значениях температуры, что говорит об отсутствии структурных изменений в молекуле белка. В то же время при связывании АТР с ферментом мы наблюдали значительное изменение энтропийной (AS) составляющей в зависимости от температуры, уменьшение энтальпийного (АН) фактора при увеличении температуры и существенное снижение АСР при образовании комплекса Na,K-ATPa3bi с нуклеотидом (таблица 1, 2). Это позволяет нам предположить, что при связывании АТР с молекулой фермента происходят его перестройки, приводящие к переходу части поверхности белка из доступной растворителя области в недоступную. Таким образом, у-фосфат является триггером структурных изменений Na,K-ATPa3bi, подготавливающих фермент к фосфорилированию. По всей видимости, подобное изменение конформации обусловлено сближением N- и Р-доменов Na,K-ATPa3bi.

Рис. 11. Модель Na,K-ATPa3bi, отражающая структурные изменения молекулы фермента при связывании АТР.

Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином в присутствии ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования. Мы показали, что связывание ADP и АТР с El-формой Na,K-ATPa3bi индуцирует образование двух различных конформаций фермента. В связи с этим перед нами возникла задача изучить связывание уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией Na.K-АТРазы в присутствии ADP и АТР.

В наших экспериментах связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-АТРазой в присутствии ионов Na+ и ADP зарегистрировать не удалось, так же как и связывание уабаина с Ыа,К-АТРазой в присутствии Na+ и АТР. Это может быть связано с тем, что константа диссоциации Kd КТС в данных условиях больше 10 мкМ. Однако связывание маринобуфагенина с ферментом в присутствии Na+ и АТР характеризуется константой диссоциации Kd = 3,6 мкМ; изменение энергии Гиббса AG составило -5,2 ккал/моль, изменение энтальпии АН = -5,0 ккал/моль, изменение энтропии TAS = -1,6 ккал/моль (рис. 11). Таким образом, связывание уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией Na,K-АТРазы и с ElATP-конформацией фермента, по всей видимости, происходит одинаково (таблица 3). Термодинамические профили реакций связывания с разными состояниями фермента, имитирующими каталитический цикл Na,K-АТРазы, представлены на рисунке 13. Параметры этих реакций приведены в таблице 3.

N-домен

Время, мин

О 10 20 30

CL CD £

-2.00 -I-г-,-,-,-,-,-,-,_,_,_,_

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Молярное отношение

Рис. 12. Анализ взаимодействия Е1-кон формации Na,K-ATPa3bi с маринобуфагенином в присутствии АТР методом изотермической калориметрии титрования (ITC). Верхняя панель - ITC-кривая титрования Na,K-ATPa3bi из солевых желез утки уабаином при рН 7,5 и температуре 25 °С; нижняя панель - изотерма связывания, полученная интегрированием ITC-кривой, и аппроксимация изотермы связывания с помощью модели одного типа участков связывания (сплошная линия).

4

I Iуабаин RrvB маринобуфагенин

dG dl+TdS - dG dH-TdS -- dG dB-TdS - dG dl+TdS - dG dH-TdS

Рис. 13. Термодинамические профили реакций связывания уабаина (серым цветом) и маринобуфагенина (черным цветом) с El- (1), Е1- в присутствии АТР (2), Е1- в присутствии A DP (3), Е1/Е2- (4) и Е2Р-конформациями (5) №,К-АТРазы из солевых желез утки при рН 7,5 и температуре 25°С.

Таблица 3. Термодинамические параметры реакций связывания уабаина и маринобуфагенина с различными конформациями №,К-АТРазы из солевых желез утки при рН 7,5 и температуре 25 "С. ОиА - уабаин, МВб - маринобуфагенин, н/д -недетектируемое связывание. Все измерения были проведены 3-4 раза. Стандартное отклонение для Ка ~ ±20%, для ДН ~ ±10%

ЖА Лиганд Ка, мкМ АН, ТА8, Ав,

ккал/моль ккал/моль ккал/моль

Е1 ОЦТА н/д - - -

мвв 3,6 -5,0 2,4 -7,4

Е1+АТР ОЕТА н/д - - -

мвв 3,6 -5,0 1,6 -5,2

Е1+АОР 01ГА н/д - - -

мвв н/д - - -

Е1/Е2 ОИА 0,77 -0,6 7,7 -8,3

мвв 1,5 -2,9 5,0 -7,9

Е2Р ОиА 0,1 -11,5 -2,0 -9,5

мвв 1,7 -1,3 6,6 -7,9

Е2Р+МВО 01ГА 0,08 - - -

Е2Р+ОиА мвв н/д - - -

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа была посвящена изучению взаимодействия Ма,К-АТРазы из солевых желез утки с двумя кардиотоническими стероидами -уабаином и маринобуфагенином, которые принадлежат к двум разным классам этой группы соединений. На сегодняшний день достоверно известно, что Иа,К-АТРаза - это не только насос, обеспечивающий градиент ионов и К+ через плазматическую мембрану, но и рецептор, при связывании которого с КТС в некоторых типах клеток индуцируются различные сигнальные каскады. Известно, что единственным рецептором для КТС является ИаД-АТРаза.

Мы показали, что уабаин и маринобуфагенин обладают схожими ингибирующими свойствами в отношении ИаД-АТРазы: кривая ингибирования носит гиперболический характер; значения концентрации КТС, при которых наблюдается полумаксимальное ингибирование ферментативной активности Ыа,К-АТРазы, равны 1,3 мкМ для уабаина и 0,6 мкМ для маринобуфагенина. Полное ингибирование наступает при почти равных концентрациях обоих стероидов (5-6 мкМ).

В экспериментах с использованием ковалентно связанных с ферментом флуоресцентных меток (ФИТЦ и 5-ИАФ) нам удалось зарегистрировать различия в ответах, возникающих при связывании уабаина и маринобуфагенина с №,К-АТРазой. В обоих случаях маринобуфагенин обеспечивал больший флуоресцентный ответ. Возможно, это связано с тем, что маринобуфагенин вызывает более значительные или иные структурные изменения молекулы фермента по сравнению с уабаином.

Поскольку использование флуоресцентных меток не позволяет нам с большой достоверностью определить параметры, характеризующие реакции связывания Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином, то на последующих этапах работы мы изучали взаимодействие фермента с лигандами с помощью метода изотермической калориметрии титрования. Мы показали, что связывание уабаина и маринобуфагенина происходит в одном и том же участке белка. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что сродство Na,K-ATPa3bi к маринобуфагенину в отличие от уабаина почти не зависит от того, в какой конформации пребывает фермент. Сродство же Na,K-АТРазы к уабаину больше у Е2Р-формы. В Е2Р-конформации сродство Na,K-АТРазы к уабаину в 17 раз больше, чем сродство к маринобуфагенину. Интересен тот факт, что, пребывая в осциллирующем между El - и Е2-формами состоянии, №,К-АТРаза обладает практически одинаковым сродством как к уабаину, так и к маринобуфагенину. Связывание уабаина с El-формой Na,K-АТРазы зарегистрировать не удалось (либо это связывание отсутствует, либо характеризуется константой диссоциации К^>10 мкМ), сродство же маринобуфагенина к трем различным конформациям фермента (Е2Р, Е1/Е2, El) почти одинаково. Термодинамический профиль реакций связывания Na,K-АТРазы с уабаином меняется следующим образом: при переходе от Е2- к El-формам вклад энтальпийной составляющей уменьшается, в то время как значение энтропийной компоненты возрастает; изменения термодинамического профиля реакций связывания фермента с маринобуфагенином носят противоположный характер.

Полученные нами методом молекулярного моделирования данные демонстрируют, что в комплексе с маринобуфагенином образуется одна водородная связь с остатком Glu312 и пять гидрофобных связей с остатками Ile315, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793. Таким образом, мы видим, что в обоих случаях связывание фермента с молекулами лигандов происходит с теми же гидрофобными остатками фермента, но в случае маринобуфагенина происходит уменьшение количества водородных связей, образованных им с Na,K-ATPa3ofl, при этом данное связывание осуществляется разными атомами кардиотонических стероидов. Моделирование связывания уабаина и маринобуфагенина с №,К-АТРазой показывает, что стероидное ядро маринобуфагенина располагается на ~ 5 Â ближе к выходу из полости участка связывания по сравнению с уабаином.

Переход Na,K-ATPa3bi в El-состояние можно индуцировать не только ионами Na+, но также с помощью АТР и его аналогов. В данной работе нам удалось установить, что при образовании адениновых комплексов с ферментом (на примере AMP, ADP и АТР) важное значение имеет р-фосфат молекулы. Появление у аденинового нуклеотида у-фосфата обеспечивает структурные изменения молекулы фермента, подготавливающие его к фосфорилированию. Также мы показали, что присутствие ADP или АТР не оказывает влияния на связывание уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией Na,K-ATPa3bi.

Взаимодействие Na,K-ATPa3bi с кардиотоническими стероидами - очень важная и актуальная проблема. Помимо фундаментальных аспектов, ее

решение имеет ряд значимых практических перспектив. Лечение сердечной недостаточности карденелидами на данный момент является хорошо изученным вопросом. Однако существует еще несколько направлений применения КТС, актуальных в настоящее время. Известно, например, что использование сердечных гликозидов увеличивает эффективность противоопухолевой терапии, также они обеспечивают снижение роста ряда злокачественных образований и их регрессию. Кроме того, было обнаружено, что дигоксин подавляет репликацию ВИЧ-1, что позволяет рассматривать КТС в качестве потенциальных элементов антиретровирусной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Уабаин и маринобуфагенин обратимо ингибируют Na,K-ATPa3y в присутствии ионов Na+ и К+. Зависимость ингибирования от концентрации этих КТС описывается гиперболической кривой с близкими значениями 1С5о-

2. Обнаружено, что при связывании Ыа,К-АТРазы, меченной ФИТЦ и 5-ИАФ, с уабаином и маринобуфагенином больший флуоресцентный ответ наблюдается в присутствии маринобуфагенина.

3. Методом ITC установлено, что связывание уабаина с Ыа,К-АТРазой -энтальпийно выгодный процесс, а при связывании маринобуфагенина с ферментом определяющий вклад в свободную энергию комплексообразования дает энтропийная составляющая.

4. Взаимодействие обоих ингибиторов с Ыа,К-АТРазой в конформации Е2Р происходит в одном и том же участке фермента. Сродство ИаД-АТРазы к уабаину в 17 раз выше по сравнению с маринобуфагенином.

5. При связывании адениновых нуклеотидов с Na,K-ATPa3oft в Е1-конформации ß-фосфат отвечает за сродство нуклеотидов к ферменту, а у-фосфат является триггером структурных изменений Na,K-ATPa3bi, подготавливающих фермент к фосфорилированию.

6. В процессе перехода от конформации El к конформации Е2Р, имитирующего каталитический цикл фермента, сродство Na,K-ATPa3bi к уабаину, в отличие от маринобуфагенина, меняется существенно.

7. АТР и ADP не оказывают влияния на связывание уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией фермента.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Petrushanko I.Yu., Mitkevich V.A., Anashkina A.A., Klimanova E.A., Dergousova E.A., Lopina O.D., Makarov A.A. Critical role of y-phosphate in structural transition of Na,K-ATPase upon ATP binding. Scientific Reports, 2014,4:5165

2. Klimanova E.A., Petrushanko I.Yu., Mitkevich V.A., Anashkina A.A., Orlov S.N., Makarov A.A., Lopina O.D. Binding of ouabain and marinobufagenin leads to different structural changes in Na,K-ATPase and depends on the enzyme conformation. FEBS Letters, 2015,589 (19 Pt B): 2668-2674

Тезисы докладов

1. Климанова E.A., Петрушанко И.Ю., Митькевич В.А., Акимова О.А., Орлов С.Н., Лопииа О.Д. Различные конформации Na.K-АТРазы при связывании уабаина и маринобуфагенина. Бюллетень сибирской медицины, 2013, том 12, №4: 41-42

2. Klimanova Е.А., Petrushanko I.Yu., Mitkevich V.A., Akimova O.A., Orlov S.N., Lopina O.D. Ouabain and marinobufagenin possibly induce different Na,K-ATPase conformation that could be due to by different peculiarities of these steroids binding. ASBMB Special Symposia Series «Na,K-ATPase and related transport ATPases: structure, mechanism, cell biology, health and disease», 2014

3. Klimanova E.A., Petrushanko I.Yu., Mitkevich V.A., Anashkina A.A., Orlov S.N., Lopina O.D., Makarov A.A. Ouabain and marinobufagenin binding induce different conformations of Na,K-ATPase. Special issue: 40th FEBS Congress «The biochemical basis of life», 2015

Подписано в печать 19.10.2015 Бумага офсетная. Формат 60*90 1\16.Усл.печ.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ №1608 ФГБУ «Российская государственная библиотека» 119019, Москва, ул.Воздвиженка 3/5